Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосенсоры на основе модифицированных печатных электродов для контроля биотехнологических процессов и экологического мониторинга

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биосенсоры на основе модифицированных печатных электродов для контроля биотехнологических процессов и экологического мониторинга"

На правах рукописи

КАМАНИН СТАНИСЛАВ СЕРГЕЕВИЧ

ВНОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПЕЧАТНЫХ ЭЛЕКТРОДОВ ДЛЯ КОНТРОЛЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ И ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

3 МАР 2015

005559724

Москва - 2015

005559724

Работа выполнена на кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор,

заведующий лабораторией биосенсоров РЕШЕТИЛОВ Анатолий Николаевич (ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г. К. Скрябина Российской академии наук)

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, ведущий научный сотрудник кафедры химической этимология химического факультета ЕРЕМИН Сергей Александрович (ФГБОУ ВПО Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова)

доктор химических наук, ведущий научный

сотрудник лаборатории межфазных границ и

электрокатализа

ЕМЕЦ Виктор Владимирович

(ФГБУН Институт физической химии и электрохимии

имени А. Н. Фрумкипа Российской академии наук)

Ведущая организация: ФГБУН Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук

Защита диссертации состоится 20 апреля 2015 года в 15:00 на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет топких химических технологий им. М. В. Ломоносова» но адресу 119571, Москва, пр-т Вернадского, д. 86, аудитория М-119.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М. В. Ломоносова» и на интернет-сайте МИТХТ им. М. В. Ломоносова http://www.mitht.ru. С авторефератом можно ознакомиться на интернет-сайтах ВАК РФ http://vak.ed.gov.ru и МИТХТ им. М. В. Ломоносова http://vvww.mitht.ru

Автореферат разослан « (%» февраля 2015 г. Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.120.01, кандидат химических наук, старший научный сотрудник

т/А^и—- л-и-лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Разнообразие инструментальных методов анализа привело к значительной конкуренции среди них. В результате у каждого метода появилась своя ниша на рынке лабораторного оборудования, которая ограничивает целесообразность применения конкретного аналитического метода для определения содержания веществ различных классов в смесях различной сложности. Это привело к тому, что производственные лаборатории, контролирующие на предприятии процесс производства нескольких продуктов одной категории, должны иметь значительное количество аналитического оборудования, не только основанного на различных аналитических методах, но и предъявляющих различные требования к пробоподготовке объекта исследования и квалификации сотрудников. Возьмем для примера контроль протекания такого распространенного и играющего немалую роль в жизни человека процесса, как брожение. Если рассматривать спиртовое брожение, то упрощенно его можно свести к следующей схеме: крахмалсодержащее сырье расщепляется до низкомолекулярных углеводов, служащих субстратом для микроорганизмов, которые, метаболизируя субстрат, выделяют этанол (Ковалевский, 2004). В случае молочнокислого брожения идет процесс окисления лактозы до молочной кислоты. Для всех этих веществ, присутствующих в процессе брожения одновременно в одной смеси, имеются нормативно-закрепленные методы определения, основанные на различных физико-химических закономерностях. Таким образом, для контроля качества сырья, продуктов и мониторинга самого процесса брожения производственная лаборатория должна пользоваться широким спектром методов инструментального анализа. Однако изменить сложившуюся ситуацию могут биохимические методы анализа. В частности, анализ с использованием биосенсоров, в котором доступность физико-химического преобразователя сигнала сочетается с селективностью биологического компонента (Понаморева, 2007).

В качестве биологического материала в конструкции биосенсоров чаще всего используются ферменты, которые обладают высокой специфичностью и катализируют реакции при комнатной температуре. К снижению итоговой стоимости и повышению чувствительности биосенсоров ведет новая тенденция в области биосенсорики, наблюдающаяся в последние десятилетия - миниатюризация датчиков, входящих в состав биосенсора. Немалый вклад в это внесла технология трафаретной печати (Dominguez-Renedo, 2007), адаптация которой к нуждам биосенсорного анализа дала возможность печатания биологического компонента и вспомогательных компонентов на поверхности электрода прямо в процессе его производства, что позволило создавать недорогие одноразовые датчики для применения в медицинской практике. Использование методов модификации, надежно закрепляющих биологический компонент на электроде, позволяет создавать стабильные датчики для многоразового использования. Модифицируя такие печатные электроды ферментами, обладающими нужной специфичностью, можно определять содержание различных компонентов в смеси с использованием одного и того же аналитического оборудования, лишь подбирая модифицированные печатные электроды, селективные по отношению к выбранным соединениям (Bäcker, 2013). Возвращаясь к анализу бродильных сред, при использовании биосенсоров отпадает необходимость использования многочисленного аналитического оборудования. Для определения содержания веществ, относящихся к различным классам, достаточно наличие потенциостата, интегрированного с персональным компьютером, и набора печатных электродов, модифицированных ферментами, селективными по отношению к определяемым веществам (Monoäik,

2013). Таким образом, биосенсоры на основе модифицированных печатных электродов могут служить основой для разработки унифицированного метода определения содержания различных классов веществ, как в бинарных растворах, так и в сложных смесях.

Цель работы

Выявление закономерностей функционирования печатных электродов, модифицированных ферментами и клетками микроорганизмов, как основы при разработке биосенсоров для селективного определения содержания крахмала, глюкозы, лактата, этанола и интегрального показателя присутствия легкоутилизируемых веществ.

В рамках указанной цели решались следующие задачи:

• Разработка биосенсоров на основе печатных электродов, покрытых Берлинской лазурью и модифицированных глюкозооксидазой, у-амилазой, лактатоксидазой и алкогольоксидазой и их характеристика.

• Изучение влияния медиаторов электронного транспорта на кинетические особенности процесса переноса электронов в системе «этанол -иммобилизованные уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans - медиатор электронного транспорта - графитовый печатный электрод».

• Разработка биосенсора на основе микробных медиаторных электродов для определения биохимического потребления кислорода.

• Апробация разработанных биосенсоров на основе ферментов и целых клеток на образцах биотехнологического сырья, бродильных и ферментационных сред.

Научная новизна

Исследованы особенности механизма генерации сигналов биосенсоров, связанные с использованием метода иммобилизации в гидрогель поперечно-сшитого бычьего сывороточного альбумина (БСА) и медиаторов электронного транспорта. Так, впервые определены индексы эффективности медиаторов электронного транспорта ферроценового и феназинового ряда в биоэлектрохимических системах на основе целых клеток бактерий Gluconobacter oxydans, иммобилизованных в гидрогель БСА, и графитовых печатных электродов.

Впервые показано, что механизм переноса электронов в рассматриваемой системе с медиаторами электронного транспорта ферроценового ряда сохраняется при изменении типа иммобилизации и подчиняется модели «пинг-понг», предложенной для описания двухсубстратной ферментативной реакции.

Впервые для иммобилизации биологического материала предложено использовать белковый гидрогель на основе модифицированного ферроценальдегидом БСА, который обеспечивает перенос электронов от ферментов и ферментных систем бактерий на электрод.

Практическая значимость

По результатам работы подана заявка № 2014150683 от 16.12.2014 на полезную модель «Устройство для определения содержания компонентов бродильных и ферментационных сред».

Работа вносит практический вклад в создание высокоэффективных и надежно работающих аналитических систем на основе амперометрических биосенсоров, содержащих в качестве преобразователя печатные электроды с Берлинской лазурью.

Разработан и апробирован набор биосенсоров на основе модифицированных печатных электродов для экспресс-определения компонентов ферментационных сред (крахмал, глюкоза, лактат, этиловый спирт) и экологического мониторинга (оценка индекса БПК), которые могут служить основой универсального аналитического метода для определения содержания веществ различных классов в смеси с минимальной пробоподготовкой.

Биосенсоры на основе печатных электродов в настоящее время широко используются только для анализа глюкозы в крови и являются одноразовыми. Результаты, полученные в работе, позволят расширить возможности применения многоразовых печатных электродов и дают толчок к развитию современной аналитической биотехнологии.

Необходимо отметить, что анализаторы, подобные биосенсорам на основе печатных электродов, модифицированных целыми клетками, для контроля биотехнологических процессов и экологического мониторинга, в настоящее время промышленно не выпускаются. Результаты данной работы могут использоваться для создания многоканальной биосенсорной установки для одновременного определения содержания компонентов в смеси. Использование такой установки для контроля качества продукции позволит значительно ускорить процедуру анализа и повысить эффективность и экономическую отдачу производства.

Апробация работы и публикации

Результаты работы докладывались на VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 19-22 марта 2013 г.) (медаль конкурса); Всероссийских конференциях с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология» (Тула, 2011, 2012, 2013 гг. (диплом победителя конкурса))-, 16-й и 17-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2012, 2013 гг. (диплом победителя конкурса)); международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 24 мая, 2012 г); I Конгрессе молодых ученых (Санкт-Петербург, 10-13 апреля 2012 г.); II Международной научно-практической конференции «Биотехнология — перспективы развития» (Уфа 12-13 ноября 2012 г.). По теме диссертации опубликовано 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК, 18 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций.

Положения, выносимые на защиту

Выявлена высокая эффективность печатных электродов, содержащих Берлинскую лазурь и модифицированных ферментами, иммобилизованными единым образом, при определении содержания крахмала, глюкозы, лактата, этанола в единых условиях при их совместном присутствии в растворе, что является основой для создания многоканальной биосенсорной установки для одновременного определения содержания компонентов в бродильной массе.

Для модели "микробная клетка - печатный электрод" установлено, что кинетика процесса переноса электронов от клеток уксуснокислых бактерий к электроду медиаторами ферроценового ряда подчиняется механизму «пинг-понг» и может рассматриваться, как двухсубстратная ферментативная реакция. Тип иммобилизации биологического материала не влияет на относительную эффективность медиаторов ферроценового ряда.

Установлена возможность сопряжения окислительно-восстановительных реакций в клетках бактерий С1исопоЬас1ег охус!ат с электрохимическими процессами на электроде с помощью белкового гидрогеля, модифицированного ферроценальдегидом.

5

Место проведения работы

Работа выполнялась на кафедре химии Естественнонаучного факультета Тульского государственного университета при поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы», соглашение № 14.574.21.0062, гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых - кандидатов наук, договор № 14.Z56.14.330-MK. Автор работы является победителем конкурса Программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса», реализуемой Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в 2013 г. (г. Тула), договор № 2095ГУ1/2014.

Структура и объем работы

Работа состоит из Введения, Литературного обзора, Экспериментальной части, Обсуждения результатов, Выводов и Списка литературы. Диссертационная работа изложена на 120 страницах, содержит 41 рисунок и 16 таблиц. Список литературы включает 198 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложены актуальность темы, научная новизна и практическая значимость работы, сформулированы цель и задачи исследования.

Глава 1

В первой главе приводится анализ научно-технической литературы, посвященной исследованиям по аналитическому применению биосенсоров на основе печатных электродов для определения содержания компонентов ферментационных сред.

Глава 2

Во второй главе дано описание методов исследования. В качестве биологического материала работе использовались: штаммы бактерий Gluconobacter oxydans sbsp. industrius BKM В-1280 и дрожжей Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 (Всероссийская коллекция микроорганизмов ИБФМ им. Г. К. Скрябина РАН), коммерчески доступные препараты глюкозооксидазы (выделенной из Aspergillus niger (Sigma)), алкогольоксидазы (выделенной из Pichia pastoris (Sigma)), лактатоксидазы (выделенной из Pediococcus sp. (Sigma)), у-амилазы (выделенной из Aspergillus niger (Sigma)).

Иммобилизацию биологического материала проводили включением его в гели различной природы: перфторсульфонат Nafion-117 (Sigma, США); сополимер поливинилового спирта (ПВС, марка 16/1) и N-винилпирролидона (Sigma); агар-агар бактериологический (Диаэм); бычий сывороточный альбумин (БСА, Sigma), поперечно-сшитый глутаровым альдегидом (Sigma); гибридную кремнийорганическую золь-гель матрицу тетраэтоксисилана (Sigma) и ПВС (марка 16/1).

Ферментный биосенсор включал в себя графитопастовый печатный электрод, (Русенс), на рабочий электрод которого нанесены нанослои Берлинской лазури и фермент в иммобилизующем геле. Измерения проводились при потенциале 0 В относительно хлоридсеребряного электрода сравнения. Микробный биосенсор

6

Референтным методом при определении содержания крахмала являлась поляриметрический метод с использованием поляриметра кругового СМ-3 (ЗОМЗ). При определении концентрации глюкозы референтным методом являлась высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), которая проводилась на хроматографе HP 1100 (Hewlett Packard) с детектором рефрактометрического типа. Референтным методом при определении концентрации этанола являлась газовая хроматография с использованием хроматографа Кристал-5000.2 (Хроматэк). При определении концентрации лактата референтным методом являлся капиллярный электрофорез с использоанием системы Капель (Люмэкс). Референтным методом при определении уровня БПК являлся стандартный метод разбавления.

Синтез ферроценмодифицированного белка проводили путем нуклеофильного присоединения ферроценальдегида по карбонильным группам с последующим восстановлением боргидридом натрия (схемы 1, 2).

(1)

(2)

Использовали недостаток ферроценальдегида по отношению к количеству аминогрупп бычьего сывороточного альбумина.

|

включал в себя графитопастовый печатный электрод (Русенс), на рабочий электрод которого наносили слой медиатора и биомассу микроорганизмов в иммобилизующем геле. Потенциал измерения выбирался для каждого медиатора индивидуально на основе вольтамперных зависимостей модифицированных печатных электродов. Измерения проводили в кювете с натрий-калиевым фосфатным буферным раствором, содержащим КС1 при помощи потенциостата Ет81а1 (Ра1ш8епз), интегрированного с персональным компьютером (рисунок 1).

- Схема биосенсорной установки на основе печатных электродов

Рисунок 1

печатный

рецепторный

Глава 3

В третьей главе приведены основные результаты работы и их обсуждение.

Выбор методов иммобилизации биологического материала

Для стабильной работы биосенсора необходимо закрепить (иммобилизовать) биологический материал на поверхности электрода. С целью выявления наиболее подходящей для иммобилизации матрицы проведено сравнение долговременной стабильности печатных электродов, модифицированных глюкозооксидазой (ГО), иммобилизованной в гидрогели различной природы (таблица 1).

Таблица 1 Долговременная стабильность биосенсора на основе печатных

электродов, модифицированных ГО, иммобилизованной в различные гидрогели

Основа гидрогеля Количество измерений

Перфторсульфонат ЫаГюп 5

Бычий сывороточный альбумин, поперечно-сшитый глутаровым альдегидом 55

Поливиниловый спирт, поперечно-сшитый Ы-винилпирролидоном 2

Гибридная органосиликатная матрица 52

Агар-агар 60

Из-за малого количесгва измерений, которые можно провести с помощью печатных электродов на основе ГО. иммобилизованной в гидрогели перфторсульфоната и поливинилового спирта, данные электроды могут рассматриваться только как одноразовые, и в этом они уступают печатным электродам на основе ГО, иммобилизованной в агаровый гидрогель, белковый гидрогель и гибридную органосиликатную матрицу, поэтому далее проводили более детальное сравнение электродов, модифицированных ГО, иммобилизованной в агаровый гидрогель, белковый гидрогель и гибридную органосиликатную матрицу. Биосенсор на основе ГО, иммобилизованной в белковый гидрогель, имеет лучшую операционную стабильность (относительное стандартное отклонение при проведении 15 измерений составило 3% против 14% при иммобилизации ГО в агаровый гель и 11% при включении в органосиликатную полимерную матрицу), поэтому в дальнейшей работе для иммобилизации биологического материала использовали включение в белковый гидрогель. На рисунке 2 представлены микрофотографии поверхности электродов на различных этапах модификации, полученные методом СЭМ.

Рисунок 2 - СЭМ изображение поверхности графитового рабочего электрода: А - до

модификации. Длина масштабной линейки 10 мкм.; Б - после модификации Берлинской лазурью. Стрелками обозначены микрочастицы Берлинской лазури. Длина масштабной линейки 10 мкм.; В - после нанесения белковой мембраны. Длина масштабной линейки 10 мкм

Графитовый рабочий электрод имеет высокоразвитую поверхность (рисунок 2 А, Б), что обеспечивает большую площадь контакта фермента и Берлинской лазури с

проводящим материалом и позволяет добиться высокой чувствительности разработанных печатных электродов. Гидрогель равномерно покрывает поверхность рабочего электрода (рисунок 2 В). Белковый гидрогель имеет поры, сопоставимые с размерами используемых ферментов, что обеспечивает хорошую диффузию субстратов и продуктов и формирует благоприятное для иммобилизованных ферментов белковое окружение (Арляпов, 2011; Вгепа, 2006). Кроме того, используемый для иммобилизации гидрогель обеспечивает высокую прочность удерживания биологического материала за счет образования ковапентных связей между БСА и ферментом путем поперечной сшивки глутаровым альдегидом. Таким образом, на основании результатов проведенного исследования для иммобилизации биологического компонента на поверхности печатных электродов в дальнейшей работе использовался метод включения биологического компонента в белковый гидрогель на основе бычьего сывороточного альбумина, поперечно сшитого глутаровым альдегидом.

Биосенсоры на основе печатных электродов, модифицированных ферментами

Чаще всего в амперометрических биосенсорах в качестве распознающих элементов используют ферменты класса оксидаз, которые катализируют окисление субстратов с переносом электронов на кислород с образованием окисленной формы субстрата и пероксида водорода. Согласно уравнению реакции (3) информацию о содержании анализируемого вещества можно получать по изменению концентрации растворенного кислорода или пероксида водорода. Применительно к печатным электродам наиболее активно используется метод, основанный на детекции пероксида водорода, так как он образуется в стехиометрическом соотношении по отношению к субстрате ферментативной реакции, в то время как концентрация растворенного кислорода может изменяться не только за счет протекания биохимической реакции, но и в зависимости от внешних факторов - температуры, давления и т. д. В работе для получения аналитического сигнала использовали печатные электроды с нанесенным на рабочий электрод слоем Берлинской лазури (ООО Русенс, Россия). Берлинская лазурь является катализатором разложения пероксида водорода и позволяет снизить рабочий потенциал до 0 В относительно хлоридсеребряного электрода сравнения, чтобы нивелировать влияние примесей на результаты анализа (Karyakin, 1999).

В качестве основы биосенсора для определения содержания глюкозы, этанола и лактата использовали соответственно глюкозооксидазу (ГО), алкогольоксидазу (АО) и лактатоксидазу (JIO) которые катализируют реакции окисления своих субстратов, протекающие по общей схеме (3).

5 + 02->? + ЯА,ГДе (3)

S— субстрат, Р - продукт реакции.

Для определения содержания крахмала печатные электроды модифицировали смесью двух ферментов: у-амилазы и ГО (Ам+ГО). Под действием у-амилазы происходит отщепление р-глюкозы от нередуцирующего конца амилозы и амилопектина крахмала и расщепление а-1,4, а-1,6 и а-1,3-гликозидных связей. Образующаяся в результате гидролиза глюкоза окисляется до глюконолактона с выделением пероксида водорода по уравнению (3).

Характеристики ферментных модифицированных печатных электродов

Градуировочные зависимости ответа биосенсора от содержания определяемого вещества в измерительной кювете представлены на Рисунок 3. За ответ биосенсора принимали амплитуду изменения силы тока после введения определяемого вещества в измерительную кювету. Биорецепторы на основе ферментов являются биорецепторами

9

каталитического типа, т.е. биологический ответ в таких системах обеспечивается ферментативными реакциями. Полученные градуировочные зависимости (рисунок 3) описываются уравнением Михаэлиса-Ментен, за исключением градуировочной зависимости ответа биосенсора от содержания крахмала, которая описывается уравнением сигмоидальной зависимости, так как в этом случае биосенсор включает в себя смесь двух ферментов.

Рисунок 3 - Градуировочные зависимости ответа биосенсора от содержания определяемого вещества для биосенсоров на основе печатных электродов, модифицированных ферментами (а-АО; б-ГО; в-ЛО; г-Ам+ГО)

На основании полученных данных проведен расчет основных параметров функционирования разработанных модифицированных печатных электродов -чувствительности, диапазона определяемых концентраций и операционной стабильности (таблица 2).

В целом характеристики биосенсоров на основе печатных электродов, описанных в работе, мало отличаются от таковых для биосенсоров, описанных в современной научной печати, однако разработанные биосенсоры способны функционировать в единой системе, которая, как показывает сравнение с аналогами, оптимальна не для каждого фермента, но может использоваться для параллельного определения содержания нескольких компонентов в смеси.

Таблица 2 Основные характеристики полученных рецепторных элементов

Биологический компонент АО ГО ло Ам+ГО

Коэффициент чувствительности, мкА-М"1 469±9 316±5 8,2±0,3 670±20 нА-л/г

Нижняя граница определяемых концентраций, мМ 0,09 0,05 1 0,03 г/л

Верхняя граница определяемых концентраций (Ки), мМ 1,5±0,1 1,3±0,1 94±7 0,59±0,02 г/л

Операционная стабильность (отн. стандартное отклонение), % 2 3 13 6

Длительность одиночного измерения, мин 2 1 1 3

Для подтверждения способности биосенсоров на основе разработанных печатных электродов определять содержание глюкозы, этанола, лактата и крахмала в сложных смесях, проводили анализ образцов, в которых эти четыре компонента могут находиться одновременно.

Апробация ферментных печатных электродов

Апробацию разработанных электродов проводили на образцах соков, вин и бродильных масс, отобранных на разных этапах модельного процесса брожения (2-72 ч.). В качестве референтных методов использовались поляриметрия, высокоэффективная жидкостная хроматография, газовая хроматография и капиллярный электрофорез. Статистический анализ полученных результатов с использованием теста Фишера показал, что дисперсии концентраций компонентов, определяемые с помощью разработанных ферментных биосенсоров на основе печатных электродов, и полученные референтными методами, незначимо различаются между собой. Результаты модифицированного теста Стьюдента показали, что систематическая погрешность между результатами анализа с использованием биосенсоров и референтными методами отсутствует. Однако применение системы разработанных ферментных биосенсоров для анализа продуктов и полупродуктов брожения позволяет значительно упростить процедуру анализа. Полученные результаты расширяют возможность применения технологии трафаретной печати электродов для решения задачи селективного определения содержания компонентов систем, содержащих глюкозу, этанол, лактат и крахмал.

Биосенсоры на основе печатных электродов, модифицированных целыми клетками бактерий Gluconobacter oxydans

Поскольку большинство ферментов, применяемых в биосенсорах, выделяют из микроорганизмов, вполне логично рассматривать и сами микроорганизмы как потенциальные биокатализаторы. Gluconobacter oxydans часто используются в биосенсорике. Ранее было показано, что эти бактерии могут быть эффективными биокатализаторами биосенсора (Svitel, 2009). Однако ранее в биосенсорах на основе этих бактерий в качестве преобразователя выступали кислородные, стеклоуглеродные и графитопастовые электроды, а работы, посвященные разработке биосенсоров на основе G. oxydans и графитовых печатных электродов, отсутствуют.

Выбор медиатора электронного транспорта

Ферментные печатные биосенсоры имели в своей основе электроды, модифицированные Берлинской лазурью, но уксуснокислые бактерии не продуцируют во внешнюю среду пероксид водорода при окислении субстратов, поэтому эти электроды не могут быть использованы в системе с целыми клетками, и необходимо

11

использовать другой принцип формирования аналитического сигнала. При использовании бактериальных клеток аналитический сигнал формировался за счёт переноса электронов от ферментных систем бактерий к электроду с использованием специальных низкомолекулярных переносчиков электронов - медиаторов электронного транспорта. Известно, что G. oxydans способны функционировать в электрохимических системах в сочетании с медиаторами ферроценового ряда (Babkina, 2006; Yilmaz, 2012) и некоторыми медиаторами феназинового ряда (Svitel, 2006). Для выявления общих закономерностей эффективности переноса заряда на рабочую поверхность печатных электродов, характеризующуюся небольшой площадью, необходимо выявить, какие медиаторы можно использовать в таких системах. Поэтому на первом этапе работы с целыми клетками было проведено выявление работоспособности медиаторов феназинового ряда: нейтрального красного (НК), метиленового синего (МС), тионина (ТН), и ферроценового ряда: 1,1'-ферроцендиметанол (Fc-(CHjOH)2), 1,1'-диметилферроцен (Рс-(СНз)з), этилферроцен (Fc-CîHj), ферроцен (Fc). Для оценки эффективности медиаторов электронного транспорта, процесс формирования аналитического сигнала биосенсора рассматривали в рамках ранее предложенной модели (Ikeda, 1996), в которой данный процесс представляется как двухсубстратная ферментативная реакция, протекающая по механизму «пинг-понг». Применимость данной модели к медиаторным биосенсорам на основе иммобилизованных клеток бактерий Gluconobacter oxydans была подтверждена в предыдущих работах (Бабкина, 2006). Согласно данной модели процессы, протекающие на электроде, можно описать уравнениями (4-6).

к к

S + E0K<UES-Xp + EB (4)

МОК +Ев£> ЕМ X M в + Еок (5)

*-э

- *!

Мв—пе —*Мок

(б)

По сравнению с константами скорости ферментативных реакций (2, 3), константа скорости реакции окисления медиатора велика и не лимитирует скорость процесса окисления субстрата, поэтому общее уравнение скорости ферментативной реакции имеет вид (7).

и =-—-, где (7)

l + Ks/[S] + fCM/[M]'

[S] - концентрация субстрата;

[М] - концентрация медиатора электронного транспорта;

Ks - эффективная константа Михаэлиса, отражающая распределение субстрата между цитоплазмой клетки и внешней средой;

Км - эффективная константа Михаэлиса, отражающая распределение медиатора между цитоплазмой клетки и внешней средой.

В случае использования электродов, модифицированных целыми клетками, за аналитический сигнал (R) принимали максимальный тангенс угла наклона начального участка амперометрической кривой после добавления субстрата (определяемого вещества) в кювету. Аналитический сигнал (R) прямо пропорционален скорости ферментативной реакции. Уравнение для расчета аналитического сигнала, генерируемого в результате окисления субстрата ферментными системами бактерий, принимает вид (8).

1 + Л^/[5] + К„/[А/]

При условии избытка медиатора или субстрата в системе данное уравнение можно упростить и привести к выражениям (9, 10), из которых можно рассчитать параметры биоэлектрохимического окисления субстратов.

Д =

Д =

1 + К,

я

1+ /:,/[«]

при ^-«1

[5]

при^(( 1

[Л/]

избыток субстратаJ (9)

избыток медиатора^ (10)

Значения констант К5 и Км могут быть рассчитаны из градуировочных зависимостей ответа биосенсора от концентрации субстрата и медиатора электронного транспорта в присутствии избытка медиатора и субстрата соответственно (рисунки 4, 5).

2.5

«

8 1'5 О)

I 1.0

Ю %

в

6 0.5

• нейтральный красный

а метиленовый синий

□ тионин

—г 1

10 20 30 40 50 Концентрация этанола, мМ

а

нейтральный красный метиленовый синий тионин

10 20 30 40 Концентрация медиатора, мкМ б

Рисунок 4-а- зависимость ответа биосенсора от концентрации этанола в условиях избытка медиатора феназинового ряда; б - зависимость ответа биосенсора от концентрации медиатора в условиях избытка этанола

8 . ю 4

6 2

1,1'-диметилферроцен 1,1'-ферроцендиметанол этипферроцен ферроцен_

0 50 100 150 200 0 2 4 в 8 10

Концентрация этанола в юовете, Ш Когочество медиатора на электроде, нмоль

а б

Рисунок 5-а- зависимость ответа биосенсора от концентрации этанола в условиях избытка медиатора при использовании соединений ферроценового ряда; б - зависимость ответа биосенсора от количества медиатора на электроде в условиях избытка субстрата

Из полученных градуировочных зависимостей рассчитали параметры биоэлектрокаталитического окисления этанола при участии медиатора: максимальный аналитический сигнал биосенсора Яши, и эффективную константу Михаэлиса для медиатора Км (таблица 3).

Таблица 3 Параметры биоэлектрохимического окисления этанола бактериями _ (?. охуёат в присутствии растворимых медиаторов_

Медиатор Избыток медиатора Избыток субст зата

Rmax, нА-с"1 Ks, мМ Rmax/Ks, HA'C''-ММ"1 Rmax, нА-с"1 Км, мкМ Rmax/Км, н А-с' '•мкМ"1

НК 2,21±0,02 6,3±0,2 0,35 1,67±0,02 6±0,2 0,28

МС 0,719±0,006 2,18±0,08 0,33 0,67±0,01 3±0,2 0,22

ТН 0.1100±0.0006 1,10±0,04 0,1 0,139±0,002 6±0,2 0,023

Медиатор Rmax, нА-с"1 Ks, мМ Rmax/Ks, нА-с'-мМ"1 Rmax, НА'С"1 Км, нмоль Rmax/Км, нА-с"1-нмоль"1

FC-(CH2OH)2 12,1±0,2 37,8±0,2 0,32 10,6±0,1 0,31±0,02 34

Fc 6,9±0,1 23±2 0,30 7,00±0,07 0,41±0,02 17,1

FC-(CH3)2 4,06±0,04 12,1±0,5 0,34 3,84±0,06 0,45±0,03 8,6

Fc-CzHs 10,0±0,1 32,0±0,9 0,31 12,7±0,3 2,б±0,2 4,9

В таблице 3 показано, что отношение Rmax/Ks» которое характеризует бимолекулярное взаимодействие фермента с субстратом, различается при использовании медиаторов феназинового ряда. Таким образом, полученные данные не позволяют сделать вывод о том, что биоэлектрохимическая система, включающая в себя медиатор феназинового ряда, подчиняется механизму «пинг-понг». Это может объясняться недостаточной устойчивостью феназиновых производных в растворе. Несмотря на это, отношение Rmax/Км может использоваться для оценки эффективности медиаторов, так как учитывает и максимальный ответ биосенсора, который можно получить с использованием определенного медиатора, и количество медиатора, которое для этого необходимо использовать (по аналогии с константой Михаэлиса, Км — концентрация медиатора, при которой ответ биосенсора будет равен половине от максимального). Соответственно, чем выше значение Rmax/Км, тем больший аналитический сигнал способен генерировать биосенсор при использовании меньших количеств медиатора. Наибольшим отношением Rmax/Км, которое является индексом эффективности медиатора электронного транспорта и характеризует взаимодействие медиатора с ферментом, обладает нейтральный красный, наименьшим - тионин. Поэтому среди медиаторов феназинового ряда для использования в дальнейшей работе был выбран нейтральный красный.

Величины Rmax/Ks для медиаторов ферроценового ряда приблизительно одинаковы (таблица 3), что подтверждает применимость модели «пинг-понг» к данной биоэлектрохимической системе и согласуется с данными, полученными ранее для биосенсоров на основе графитопастовых электродов, содержащих медиаторы ферроценового ряда и целые клетки G. oxydans, иммобилизованные на поверхности электрода. При сравнении индексов эффективности Rmax/Км (таблица 3) видно, что эффективность медиаторов при окислении этанола бактериями G. oxydans увеличивается в ряду: этилферроцен —> 1,1'-диметилферроцен —» ферроцен —> 1,1'-ферроцендиметанол. Таким образом, наиболее эффективным медиатором является 1,1'-ферроцендиметанол. Данный ряд эффективности медиаторов ферроценового ряда

подтверждает сформулированные в более ранних работах (Babkina, 2006; Чигринова, 2007) выводы о том, что электроноакцепторные заместители (гидроксиметильные группы) повышают активность ферроценового ядра и, следовательно, индекс эффективности, а электронодонорные (алкильные группы) заместители, напротив, снижают активность и, как следствие, эффективность медиатора. Таким образом, процесс биоэлектрокаталитического окисления этанола более эффективно протекает при участии 1,1'-ферроцендиметанола. Однако 1,1'-ферроцендиметанол имеет большую растворимость, чем ферроцен, что негативно сказывается на воспроизводимости ответов биосенсора (операционной стабильности биосенсора), поэтому в дальнейшей работе использовали ферроцен.

Основные характеристики биосенсоров на основе бактерий G. oxvdans и медиаторов: нейтрального красного и ферроцена

На рисунках б, 7 представлены градуировочные зависимости ответов биосенсора от концентрации глюкозы и этанола при использовании иммобилизованных клеток G. oxydans и медиаторов: нейтрального красного и ферроцена.

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 Концентрация глюкозы, мМ

а

2 4 6

Концентрация этанола, мМ б

Рисунок 6 - Градуировочная зависимость ответа биосенсора от концентрации определяемого вещества (а - глюкозы; б - этанола) при использовании медиатора

нейтрачьного красного

10 20 30 40 50 Концентрация глюкозы, ьМ

5 10 15 20 25 Концентрация этанола, i.i.1

а б

Рисунок 7 • Градуировочная зависимость ответа биосенсора от концентрации определяемого вещества (а - глюкозы; б - этанола) при использовании ферроцена

На основании полученных экспериментальных данных было проведено сравнение характеристик биосенсора на основе иммобилизованных бактерий

G. oxydans по отношению к различным определяемым веществам (таблица 4). Сравнение характеристик биосенсора на основе печатного электрода, модифицированного бактериями G. oxydans и ферроценом, с аналогами (Алферов, 2011; Yilmaz, 2012; Арляпов, 2008; Svitel, 2009) показывает, что разработанный биосенсор уступает им по значению коэффициента чувствительности, но превосходит по ширине диапазона определяемых концентраций и значению нижней границы определяемых концентраций. Биосенсор на основе печатных электродов, модифицированных бактериями G. oxydans, позволяет определять более низкие концентрации глюкозы и этанола, чем аналогичные разработки (Yilmaz, 2012; Tkac, 2003), использующие различные медиаторы электронного транспорта, но в то же время уступает им в ширине диапазона определяемых концентраций. Однако технология трафаретной печати позволяет создавать миниатюрные модифицированные микроорганизмами электроды, удобные в использовании и отличающиеся низкой себестоимостью.

Таблица 4 Характеристики биосенсорных систем на основе бактерий G. oxydans

Медиатор Нейтральный красный Ферроцен

Определяемое вещество Глюкоза Этанол Глюкоза Этанол

Чувствительность, нА-с'-М"1 1040±60 153±9 38±1 114±8

Нижняя граница определяемых концентраций, мМ 0,17 1,2 62 83

Верхняя граница определяемых концентраций (Км), мМ 0,222±0,007 6,2±0,2 44±1 26±2

Операционная стабильность (относительное стандартное отклонение, 10 измерений), % 5 13

Экспрессность, мин 5 2-3

Биосенсор на основе печатных электродов, модифицированных бактериями G. oxydans и ферроценом, по ширине диапазона определяемых концентраций превосходит свой аналог на основе нейтрального красного, описанный в данной работе, однако по величине коэффициента чувствительности уступает ему. Диапазон определяемых концентраций у биосенсора на основе печатных электродов, модифицированных ферроценом и иммобилизованными клетками G. oxydans, выше, чем у печатных электродов, модифицированных ферментами, описанных в работе. Бактерии G. oxydans способны окислять широкий спектр субстратов, которые могут находиться в стоках бродильных производств, поэтому далее рассматривали возможность применения электродов, модифицированных бактериальными клетками для определения уровня БПК.

Определение уровня ВПК с помощью биосенсора на основе печатного электрода, модифицированного бактериями G. oxydans и ферроиеном

В бродильных стоках содержатся легкоутилизируемые вещества, которые являются субстратами для G. oxydans, что позволяет использовать биосенсоры на основе этих микроорганизмов для интегральной оценки загрязненности исследуемых образцов сточных вод.

i 1

140% •s S. 120%

5 о

x u 100% S § 80% g | 60% ? S 40%

о s 20% 0%

Рисунок 8 - Диаграмма селективности биосенсора на основе печатного электрода, модифицированного клетками бактерий и ферроценом

Диаграмма селективности биосенсора на основе G. oxydans, представленная на рисунке 8, показывает, что бактерии G. oxydans наиболее активно окисляют низшие спирты и глюкозу, которые являются основными компонентами бродильной массы, кроме того наблюдается активность по отношению к другим углеводам и некоторым аминокислотам. Одним из интегральных показателей загрязненности сточных вод является индекс биохимического потребления кислорода (БПК), поэтому далее были построены градуировочные зависимости ответа биосенсора от уровня БПК и концентрации этанола и глюкозы в измерительной кювете (рисунок 9).

Рисунок 9 - Градуировочная зависимость ответа биосенсора на основе печатных электродов, модифицированных клетками & охуЫат и ферроценом, от уровня БПК

Коэффициент чувствительности составил 9,30± 0,02 пА-л с"'-(мг Ог)"1. Диапазон определяемых значений БПК составил 11 - 180 мг Ог/л, что позволяет проводить определение уровня БПК непосредственно в сточных водах без разбавления.

Биосенсоры на основе печатных электродов, в которых бактерии G. oxydans иммобилизованы в гидрогель БСА. модифицированного ферроценальдегидом

Несмотря на высокие аналитические характеристики разработанных печатных электродов на основе G. oxydans и ферроцена, у них наблюдается существенный недостаток - постепенное снижение ответов сенсора из-за повышенной растворимости заряженной формы ферроцена, которая образуется в ходе электрохимической реакции окисления. Избежать потери медиатора предлагается путем получения проводящего электроны гидрогеля на основе поперечно-сшитого бычьего сывороточного альбумина, ковалентно связанного с ферроценальдегидом. Данный гидрогель при использовании его в качестве иммобилизующей матрицы, надежно закрепляет клетки микроорганизмов на поверхности электрода, обеспечивает взаимную диффузию

17

F

5

□ = 0 О.п _ ft

50 100 150

Уровень БПК в кювете, w 02/л

субстратов и метаболитов по всему объему матрицы, и, самое главное - делает возможным транспорт электронов от ферментных систем бактерий к поверхности электрода, что формирует аналитический сигнал биосенсора. На рисунке 10 приведены градуировочные зависимости ответа биосенсора от концентрации этанола при использовании в качестве медиатора проводящего гидрогеля и адсорбированного ферроцена.

3.0

6 5 2,5

1

4 Cl 2,0

о

3 X 0) о 1,5

2 ю 1.0

m

1 IlX 5 0,5

ÏP о БСА, модифицированный ферроцена/ъде гидом

й • адсорбироважыйферроцен 0,0

0

20 40 60 80 100 120 Концентрация этанола, мМ

а

• адсорбированн=|йферроцен о БСА, модифицированной ферроцегагъдегидом

5 10 15

Порядковый номер измерения б

Рисунок 10 -а - Градуировочные зависимости ответа биосенсора от концентрации этанола при использовании печатных электродов, модифицированных клетками бактерий G. oxydans, и содержащих адсорбированный ферроцен и БСА, модифицированный ферроценальдегидом; б — операционная стабильность

соответствующих модифицированных печатных электродов При использовании гидрогеля, в состав белковой матрицы которого вшиты молекулы производного ферроцена, для иммобилизации уксуснокислых бактерий на поверхности рабочего электрода, наблюдается перенос электронов от ферментных систем бактерий на электрод, при этом скорость изменения силы тока прямо пропорциональна содержанию определяемого вещества в кювете. Уровень максимального ответа биосенсора при использовании проводящего гидрогеля все же ниже по сравнению с адсорбированным ферроценом, что закономерно, так как для ферментных систем бактерий доступность медиатора, ковалентно связанного с полимерной матрицей, ниже, чем доступность ферроцена, находящегося в растворе, но тем не менее, использование проводящего гидрогеля позволяет избежать постепенной десорбции медиатора с поверхности электрода и связанного с ней постепенного снижения величины ответа биосенсора. В таблице 5 представлены основные характеристики печатных электродов, модифицированных клетками уксуснокислых бактерий и медиаторами: ферроценом, адсорбированным на электроде и проводящим белковым гидрогелем.

Таблица 5 Основные харктеристики биосенсоров на основе клеток уксуснокислых бактерий и медиаторов: ферроцена, адсорбированного на электроде и

Медиатор Ферроцен Проводящий гидрогель

Чувствительность, нА-с'-М"' 114 ± 8 80 ±4

Нижняя граница определяемых концентраций, мкМ 83 162

Верхняя граница определяемых концентраций, мМ 26 ±2 23 ± 1

Максимальный ответ сенсора, нА с"1 6,6 ±0,1 3,33 ±0,06

Операционная стабильность, % 13 5

В работе (Yilmaz, 2012) говорится о преимуществах биосенсора на основе бактерий G. oxydans, иммобилизованных в гидрогель хитозана, модифицированного ферроценальдегидом, перед аналогичными биосенсорами на основе адсорбированного на электроде ферроцена и бактерий, иммобилизованных в матрицу хитозана. При сравнении же характеристик биосенсора на основе G. oxydans, иммобилизованных в проводящий белковый гидрогель, с биосенсором на основе адсорбированного ферроцена и бактерий, иммобилизованных в гидрогель БСА, наблюдается снижение основных характеристик биосенсора, что может быть вызвано недостаточной плотностью ферроценальдегидных групп, ковалентно связанных с матрицей гидрогеля, так как количество аминогрупп, по которым может присоединяться ферроценальдегид, на единицу массы у БСА значительно меньше, чем у хитозана.

Таким образом, иммобилизация медиатора ковалентной сшивкой приводит к снижению большинства аналитических характеристик биосенсора, в то же время повышается стабильность микробных печатных электродов, что позволит их использовать при разработке биосенсоров проточно-инжекционного типа.

Апробация печатных электродов, модифицированных целыми клетками

Апробацию печатных электродов, модифицированных бактериями G. oxydans и медиаторами: нейтральным красным и ферроценом, проводили на образцах соков «Любимый сад» (апельсиновый и яблочный), водок: «Журавли», «Славянская» и «Зеленая марка» и сточных вод ОАО «ГПК Ефремовский» (Тульская обл., г. Ефремов). В результате проведения статистического анализа результатов измерений с использованием модифицированного теста Стьюдента выявлено, что значения концентраций определяемых веществ, полученные с помощью биосенсора на основе печатных электродов, модифицированных бактериями G. oxydans и ферроценом, и полученные референтными методами, незначимо различаются между собой.

Выводы

1. Разработан макет установки, имеющий в своем составе потенциостат и набор печатных электродов, содержащих Берлинскую лазурь и модифицированных ферментами: у-амилазой совместно с глюкозооксидазой (определяемое вещество -крахмал, диапазон определяемых содержаний - 0,03-0,59 г/л), глюкозооксидазой (глюкоза, 0,05-1,3 мМ), алкогольоксидазой (этанол, 0,09-1,5 мМ), лактатоксидазой (лактат, диапазон 1-94 мМ), иммобилизованными единым образом, для определения содержания компонентов ферментационных сред в единых условиях анализа. Макет может служить прототипом для создания опытных образцов приборов для серийного применения.

2. Впервые разработаны модифицированные печатные электроды, содержащие бактерии Gluconobacter oxydans и медиаторы: нейтральный красный и ферроцен. Определены основные характеристики и показана возможность использования их для определения содержания глюкозы, этанола и уровня БПК. Для образцов бродильной массы, отобранных в разное время от начала процесса брожения, показано, что корреляция данных биосенсора по оценке уровня БПК с данными стандартного метода разбавления составляет 0,9832.

3. Впервые определены индексы эффективности медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда в биоэлектрокаталитических системах [субстрат -клетки G. oxydans - медиатор - печатный электрод]. Показано, что эффективность увеличивается в ряду: этилферроцен —» 1,1'-диметилферроцен —» ферроцен —> 1,Г-ферроцендиметанол, и составляют 4,9 нА-с'Чшоль"1, 8,6 hA-с''нмоль"1, 17,1 нА-с'-нмоль'1 и 34 hA-c''-нмоль"1 соответственно. Установлено, что механизм переноса электронов в системе сохраняется при изменении метода иммобилизации и подчиняется модели «пинг-понг».

4. Установлена возможность сопряжения окислительно-восстановительных реакций в клетках бактерий Gluconobacter oxydans с электрохимическими процессами на электроде с помощью гидрогеля поперечно-сшитого бычьего сывороточного альбумина, ковалентно связанного с ферроценальдегидом. Для печатных электродов на основе бактерий G. oxydans и БСА, ковалентно связанного с ферроценальдегидом, получены основные характеристики и проведено их сравнение с аналогичными параметрами печатных электродов на основе БСА и адсорбированного ферроцена. Показано увеличение стабильности биосенсоров, что открывает перспективу их практического применения.

Благодарности

Автор благодарен коллективам кафедр химии и биотехнологии Тульского государственного университета за неоценимую помощь в проведении исследований и интерпретации полученных результатов. Особую признательность автор выражает научному руководителю - д.х.н., проф. Решетилову А. Н., и научным консультантам: к.х.н., доц. Арляпову В. А., д.х.н. доц. Понаморевой О. Н. и к.х.н., проф. Алферову В. А.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ:

1. Каманин С. С., Арляпов В. А. Разработка модифицированных печатных электродов на основе глюкозоксидазы для анализа глюкозы // Известия ТулГУ. Естественные науки. Вып. 2. - Тула: Изд-во ТулГУ. - 2012. -С. 226-236.

2. Arlyapov V., Kamanin S„ Ponamoreva O., Reshetilov A. Biosensor analyzer for BOD index express control on the basis of the yeast microorganisms Candida maltosa, Candida blankii, and Debaryomyces hansenii // Enzyme and Microbial Technology. -2012. -V. 50,1. 4-5.-P. 215-220.

3. Каманин С. С., Скворцова Л. С., Арляпов В. А. Печатные электроды, модифицированные глюкозооксидазой и у-амилазой для определения глюкозы и крахмала в бродильных средах // Известия ТулГУ. Естественные науки. Вып. 3. - Тула: Изд-во ТулГУ. - 2013. - С. 265-275.

4. Каманин С. С., Арляпов В. А., Рогова Т. В., Решетилов А. Н. Модифицированные печатные электроды на основе глюкозооксидазы, иммобилизованной в гибридной кремнийорганической золь-гель-матрице // Биотехнология. - 2014. - Т. 2. - С. 80-87.

Материалы конференций в тезисной Фопме:

1. Каманин С. С., Арляпов В. А. Печатные электроды, как основа амперометрического биосенсора для анализа бродильных сред // Сборник тезисов докладов конгресса молодых ученых, Выпуск О. - СПб: НИУ ИТМО, ОМЮ. - С. 208-209

2. Каманин С. С., Арляпов В. А. Модифицированные печатные электроды для анализа глюкозы // Биология - Наука XXI века: 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 16-21 апреля 2012 года). Сборник тезисов. - С. 228-229

3. Каманин С. С., Арляпов В. А. Печатные электроды, модифицированные глюкозоксидазой для анализа бродильных сред // Биология - наука XXI века: Материалы Международной конференции. Москва, 24 мая 2012 г. / Ред. Р.Г. Василов. -М.: МАКС Пресс. - С. 336-338.

4. Каманин С. С., Арляпов В. А. Амперометрический биосенсор на основе печатных электродов для анализа бродильных сред // Materiaty VIII Miijdzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji «Dynamika naukovvych badañ - 2012» Volume 19. Nauk biologicznych. Ekologia.: Przemysl. Nauka I studia.-S. 8-11

5. Каманин С. С., Балахонова А. И., Арляпов В. А. Печатные электроды на основе иммобилизованной глюкозоксидазы для анализа глюкозы // Акутальные проблемы биохимии и бионанотехнологии. Сборник трудов III международной Интернет-конференции. Казань, 19-22 ноября 2012 г. / Редактор Изотова Е. Д. - Казань: Изд-во "Казанский университет", 2013. -С. 137-138.

6. Каманин С. С., Арляпов В. А., Алферов В. А. Модифицированные печатные электроды для многоканального анализа полупродуктов брожения // Материалы VII Московского Международного Конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития" 19-22 марта 2013 г. М.: ЗАО "Экспо- биохим-технологии", РХТУ им. Д. И. Менделеева, 2013. -С. 284-285.

7. Каманин С. С., Балахонова А. П., Арляпов В. А. Печатные электроды, модифицированные бактериальными клетками, как основа амперометрического биосенсора // Биология - наука XXI века: 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 21-26 апреля 2013 г.). Сборник тезисов. - С. 319.

8. Каманин С. С., Арляпов В. A. The modified screen-printed electrodes based on glucose oxidase immobilized by different methods // Materialy IX Miedzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji "Aktualne problemy nowoczesnych nauk - 2013" Volume 26. Nauk biologicznych.: Przemysl. Nauka i studia. - S. 37-39.

9. Каманин С. С., Арляпов В. А. Многоканальный ферментный биосенсорный анализатор на основе модифицированных печатных электродов для определения содержания полупродуктов брожения // «Экотоксикология-2013»: Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи / под ред. канд. хим. наук В. А. Алферова. - Тула: Изд-во ТулГУ, 2013. - С. 17.

Подписано в печать:

16.02.2015

Заказ № 10547 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru