Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Применение низкоселективных биосенсоров для определения биохимического потребления кислорода и анализа многокомпонентных смесей

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Применение низкоселективных биосенсоров для определения биохимического потребления кислорода и анализа многокомпонентных смесей"

На правах рукописи

АРЛЯПОВ ВЯЧЕСЛАВ АЛЕКСЕЕВИЧ

ПРИМЕНЕНИЕ НИЗКОСЕЛЕКТИВНЫХ БИОСЕНСОРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКОГО ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА И АНАЛИЗА МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ СМЕСЕЙ

03.00.23 - биотехнология

. □□3482755

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-2009

003482755

Работа выполнена на кафедре химии естественно-научного факультета Тульско] государственного университета.

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент

Алферов Валерий Анатольевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Офицеров Евгений Николаевич

кандидат биологических наук, старший

научный сотрудник

Жердев Анатолий Витальевич

Ведущая организация: Липецкий государственный технический

университет

Защита диссертации состоится «}0» 1(/Я£Р9 2009 г. в ч на заседани Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской Государственной Академи тонкой химической технологии имени М.В Ломоносова по адресу 119571 Москв; пр. Вернадского 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.ВЛомоносова по адресу: 119571 Москва, пр. Вернадского 86. С авторефератом диссертации можн ознакомиться на сайте wMrw.mitht.ru

Автореферат разослан «2£» СКЗЯбРф 2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

кандидат химических наук, и

старший научный сотрудник '' - А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы:

Экспресс-оценка степени загрязнения объектов окружающей среды органическими соединениями является необходимым компонентом экологического контроля. Учитывая постоянно растущий перечень веществ, поступающих как загрязнители в окружающую среду, эффективным инструментом анализа оказываются методы, основанные на интегральной оценке органических компонентов, а не только на определении содержания индивидуальных веществ. В этой связи значительное внимание уделяется разработке биосенсорных экспресс-методов контроля, значительно повышающих оперативность анализа, снижающих его стоимость и позволяющих выполнить как интегральную оценку загрязненности, так и проводить селективный анализ.

Важной характеристикой степени загрязненности воды легкоокисляемыми органическими веществами является индекс биохимического потребления кислорода (БПК). Традиционная методика определения БПК требует инкубирования насыщенной кислородом пробы в течение 5, 10 или 20 суток (БПК5, БПКю или БПК20, соответственно). Отсутствие оперативности существенно снижает ценность традиционной методики. Для оперативного анализа разрабатываются методы оценки БПК, основанные на использовании биосенсорных анализаторов. Биосенсорные анализаторы БПК представляют собой надежные, простые и дешевые аналитические инструменты и с успехом используются для контроля водных экосистем (наряду с традиционными методами определения БПК) за рубежом. В России аналогичные анализаторы в настоящее время промышленно не выпускаются. В мире при создании БПК-сенсоров наиболее часто используют биосенсоры на основе кислородного электрода Кларка и целых клеток микроорганизмов.

Одной из важных проблем в экологии является очистка сточных вод биотехнологических производств, в том числе спиртовых производств. Сточные воды спиртовых заводов характеризуются высоким содержанием органических загрязнений, что приводит к гибели естественных экосистем вокруг них. Для таких предприятий не только практически сложно, но и нерационально стремиться к созданию универсального БПК-сенсора. Напротив, целесообразно производить разработку биосенсоров и выбор соответствующих микроорганизмов, которые обеспечивали бы наиболее эффективную детекцию БПК в соответствии с конкретным типом сточных вод, т.е. разрабатывать специализированные БПК-биосенсоры.

К преимуществам биосенсоров можно отнести: короткое время ответа, портативность, удобство в работе, а также отсутствие специальных требований к приготовлению исследуемого образца. Микроорганизмы - доступный биологический материал. Клетки микроорганизмов легко воспроизводятся, культивируются и поддерживаются в чистой культуре. В некоторых случаях они обеспечивают жизнеспособность и активность ферментных систем в течение нескольких лет. Вместе с тем, для микробных сенсоров характерна низкая субстратная специфичность - чувствительность к большому количеству веществ, что является преимуществом для интегральной оценки степени загрязнения, но недостатком для селективного анализа.

Наряду с определением интегральных показателей качества воды важным является одновременное определение содержания отдельных компонентов в водных средах. Существует несколько подходов повышения селективности биосенсоров. Один из способов селективной детекции компонентов может заключаться в получении интегральных характеристик смеси с помощью низкоселективных анализаторов и использовании математических методов обработки данных с целью определения вклада, вносимого отдельными компонентами. Различные хемометрические методы, включая применение искусственных нейронных сетей (ИНС), успешно используются в аналитической химии для обработки сигналов химических сенсоров. Однако для применения в области биосенсорики данные методы не развиты. Следует отметить, что биосенсоры, предназначенные для экологического контроля стоков биотехнологических производств, можно использовать и для мониторинга ферментационных процессов на этих производствах. Это позволит сократить затраты на оборудование и увеличить экономическую отдачу предприятия. Так, дифференциальная оценка содержания нескольких компонентов на различных стадиях позволяет оптимизировать технологический процесс брожения и снижать материальные затраты, приводя в соответствие качество исходного сырья с качеством применяемых ферментов и дрожжевой биомассы. Одновременно снизится экологическая нагрузка на окружающую среду. Следует отметить, что существующие методы определения содержания спиртов и углеводов эффективно применяются для контроля качества готовой продукции, но не могут быть использованы для экспресс-оценки содержания указанных компонентов в ферментационных средах. Одной из важнейших особенностей биосенсоров, обеспечивающейся сменой рецепторных элементов, является возможность применения одного анализатора для различных аналитических целей. Таким образом, создание универсального биосенсорного анализатора со сменными биорецепторными элементами для определения БПК и анализа многокомпонентных смесей в современных условиях является важной задачей для биотехнологических производств.

Работа выполнялась при частичной поддержке гранта Федерального агентства по образованию РНП 2.1.1.7789. и ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 гг.», госконтракт № 02.512.11.2010. Автор работы является победителем конкурса программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса», реализуемой Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в 2008 г. (г. Пущино).

Цель работы:

Разработка химико-биологических основ применения низкоселективных микробных биосенсоров для экспресс-оценки БПК и мониторинга биотехнологических процессов и создание на этой базе макета универсального биосенсорного анализатора.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи: • Разработать стабильные и воспроизводимые биорецепторные элементы биосенсоров на основе различных способов иммобилизации клеток микроорганизмов.

• Охарактеризовать биокатализаторы на основе целых клеток микроорганизмов по их субстратной специфичности для использования в качестве основы рецепторного элемента биосенсора.

• Разработать модификацию макета биосенсора проточно-инжекциониого типа для экспресс-анализа БПК. Определить его аналитические и метрологические характеристики.

• Оптимизировать конфигурации искусственных нейронных сетей для снижения ошибки определения компонентов при анализе двух-, трех- и четырехкомпонентных смесей.

• Разработать модификацию макета многоканального биосенсора проточно-инжекционного типа на основе неселективных клеток микроорганизмов для селективного анализа многокомпонентных смесей.

Научная новизна

Впервые показан эффект изменения субстратной специфичности уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans при иммобилизации в различные носители, что имеет существенное значение при создании биосенсорных систем для анализа многокомпонентных смесей.

Показано, что применение уксуснокислых бактерий G. oxydans и метилотрофных дрожжей P. angusta как основы рецепторного элемента биосенсора для определения БПК стоков пищевых и ликероводочных производств позволяет получать данные с высокой корреляцией к стандартному методу.

Расширена возможность применения технологии искусственных нейронных сетей для обработки сигналов биологических сенсоров. Разработана методика применения ИНС в решении задачи селективной детекции модельных двух-, трех- и четырехкомпонентных систем, содержащих метанол, этанол, фруктозу и глюкозу, выполняемой низкоселективными микробными сенсорами.

Впервые показана возможность применения дрожжевого штамма Saccharomyces bayanus ВКМ Y-349, характеризующегося активным транспортом фруктозы, как основы одного из рецепторных элементов многоканального биосенсора для селективного определения данного вещества в водных средах.

Практическая значимость

Разработан и апробирован макет многоканального биосенсора проточно-инжекционного типа для определения содержания глюкозы, фруктозы, метанола, этанола и индекса БПК в водных средах. Метод анализа с использованием разработанного макета биосенсора характеризуется высокой экспрессностью и высокой чувствительностью. Макет многоканального биосенсора может быть использован в научных исследованиях, в учебном процессе и как прототип опытного образца прибора для серийного выпуска.

Работа вносит практический вклад в разработку высокоэффективных аналитических систем на основе биосенсоров. Предложенные методы анализа сигналов биосенсоров значительно повышают селективность анализа при использовании биосенсоров на основе целых клеток микроорганизмов и позволяют в перспективе разрабатывать недорогие и эффективные анализаторы.

Апробация работы и публикации

Результаты работы докладывались на Тульском молодежном инновационном конвенте (г. Тула), 2009 г. (диплом победителя); Международной школе-

конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (г. Москва, г. Пущино), 2008 г (диплом победителя); 2-ой Биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех - 2008» (г. Москва), 2008 г. (медаль выставки); XII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии», 2008 г. {диплом за 3 место); Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в 2007 г. (медаль конкурса)-, XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (г. Москва), 2007 г.; IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (г. Томск) в 2006 г.; Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология - современные биоаналитические системы, методы и технологии» (г. Пущино), 2006 г. (диплом лауреата конкурса)-, Международной молодёжной научной конференции «XIV Туполевские чтения» (г. Казань), 2006 г. (диплом за 3 место).

По теме диссертации опубликовано 8 статей, 7 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций.

Структура и объем работы

Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, анализа результатов исследований, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа изложена на 189 страницах, содержит 79 рисунков и 30 таблиц. Список литературы включает 150 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. В первой главе дается анализ научно-технической литературы, посвященной исследованиям в области иммобилизации микроорганизмов и аналитического применения микробных сенсоров.

Глава 2. Во второй главе дано описание методов исследования. В работе использованы: штаммы бактерий Gluconobacter oxydans sbsp. industrius B-1280 и дрожжей Pichia augusta ВКМ Y-2518, Arxula adeninovorans ВГИ (78)-6 и Saccharomyces bayanus BKM Y-349 (Всероссийская коллекция микроорганизмов ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН).

В работе применяли высокочувствительный электрохимический метод регистрации окислительной активности биологического материала, позволяющий производить высокоточные измерения в наноамперном диапазоне токов, что дает возможность исследовать свойства микрограммовых количеств биомассы. Дыхательную активность микроорганизмов регистрировали с помощью кислородного электрода, на рабочей поверхности которого фиксировали иммобилизованные клетки. Электрохимические измерения проводили с помощью гальваностата-потенциостата «IPC 2L» (ЗАО «Кронас», Россия) (кюветный тип) и многоканального биосенсорного анализатора «Мультибио-01» (ЗАО «Кронас», Россия) (проточно-инжекционный тип), интегрированных с персональным компьютером. Ток регистрировали в интервале 0,1 нА - 50 нА, в качестве измеряемого параметра использовали максимальную скорость изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении субстратов. Обработку данных проводили с помощью компьютерных программ «Microsoft Excel» и «SigmaPlot 9.0». Для создания искусственных нейронных сетей и последующей обработки данных с их помощью использовали программу Java Neural Network Simulator 1.1 (SNNS Group, IPVR, University of Stuttgart).

Определение содержания углеводов в образцах проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе марки «HP 1100» (Hewlett Packard) в соответствии со стандартными методиками. Условия хроматографирования: колонка типа НРХР, 300x7,8 мм (Bio-Rad); в качестве подвижной фазы применяли дистиллированную воду; температура колонки составляла 80°С; скорость протока равнялась 0,7 см3/мин; использовали рефрактометрический тип детектора.

Определение содержания спиртов и других летучих полярных соединений проводили методом газовой хроматографии на хроматографе марки «Кристалл 5000.2» (СКБ Хроматэк) в соответствии со стандартными методиками. Условия хроматографирования: колонка DB-FFAP (США) 50мх0,32ммх0,50мкм; газ-носитель — гелий; температура термостата — 75 °С; температура испарителя (инжектора) — 200 °С.; детектор ионизации в пламени (ДИП), температура детектора 250 °С; скорость потока газа-носителя — 0,144 дм3/ч.

Глава 3. В третьей главе приведены основные результаты работы и их обсуждение.

Иммобилизация микроорганизмов для получения рецепторных элементов биосенсоров

Одной из важнейших задач является разработка распознающих элементов биосенсоров с заданными свойствами. Для формирования рецепторных элементов биосенсора, характеризующихся максимальной долговременной стабильностью, необходимо выбрать такой способ иммобилизации, при котором организмы будут функционировать длительный период времени, не теряя своей активности. С целью увеличения долговременной стабильности биорецепторного элемента проведены работы по подбору условий иммобилизации микроорганизмов в различных матрицах.

В работе формирование рецепторного элемента проводили путем включения клеток микроорганизмов в агаровый и полиакриламидный (ПААГ) гели, гель на основе поперечно-сшитого бычьего сывороточного альбумина (БСА), гель поливинилового спирта (ПВС) и адсорбции на стекловолоконном фильтре Whatman GF/A. Для изучения влияния метода иммобилизации на свойства биорецепторного элемента в качестве модельных микроорганизмов были использованы уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans sbsp. industrius B-1280. Бактерии Gluconobacter oxydans обладают уникальной организацией метаболической системы, характеризующейся поверхностной локализацией ряда основных окислительных ферментов и высокой оперативностью электрон-транспортной цепи, что обеспечивает быстрый ответ биосенсора. Они широко используются в биотехнологии для производства аскорбиновой, уксусной и других кислот.

Способ иммобилизации является одним из факторов, который влияет на специфичность биорецепторных элементов. Для определения субстратной специфичности биорецепторных элементов использовали лабораторную модель биосенсора кюветного типа (рис 1).

Гапьвако-

потенциостат

а б

Рис 1. а) Схема биосенсора кюветного типа; б) внешний вид лабораторной модели микробного биосенсора кюветного типа.

Кислородный ■ К JDL электрод I ■ ^

Ремепторный

эпемент Буферный

раствор

Измерительная

В качестве преобразователя использовали гальваностат-потенциостат IPC 2L, представляющий собой блок регистрации и обработки данных и позволяющий производить непрерывную регистрацию сигнала, его обработку, оценку начальной скорости изменения сигнала.

При введении аналита в измерительную ячейку микроорганизмы окисляют его. При этом возрастает дыхательная активность клеток, и в приэлектродном пространстве снижается концентрация кислорода, что регистрируется с помощью электрода Кларка. На монитор выводится графическое отображение изменения силы тока, протекающего в системе, во времени (рис 2). По полученному отклику вычисляется ответ сенсора как максимальная скорость изменения силы тока от времени.

ij.»:-...

: v.

/ а

/

dt

Рис 2. Ответ сенсора кюветного типа с биорецептором на основе бактерии Gluconobacter oxydans иммобилизованных адсорбцией на стекловолоконном фильтре Whatman GF/A на добавление раствора глюкозы (Концентрация в кювете 1мМ).

На рис 3. приведены данные по субстратной специфичности рецепторных элементов полученных при иммобилизации бактерий ЫисопоЬасгег охусЬт в различные матрицы.

адсорбция включение s включение в включение s включение в включение в криогель ПВО гель ПВС гель БСА агаровый гель ПААГ

Рис 3. Субстратная специфичность рецепторных элементов биосенсоров на основе микроорганизмов Gluconobacter oxydans

Субстратная специфичность биорецепторов на основе бактерий G. oxydans в матрице ПВС, полученной УФ облучением, криогеле ПВС и в агаровом геле аналогична субстратной специфичности адсорбированных на носителе микроорганизмов.

При иммобилизации G. oxydans в матрицу БСА происходит снижение откликов на: пропанол-1, бутанол-1 и этанол по сравнению с клетками, адсорбированными на стекловолоконном фильтре. Это влияние может быть обусловлено воздействием химических агентов (глутарового альдегида) на ферментативные системы бактерий в ходе иммобилизации.

При использовании матрицы из полиакриламидного геля наблюдается полное угнетение окислительной активности клеток по отношению к этанолу, пропанолу-1 и бутанолу-1. Известно, что алкоголь- и глюкоздегидрогеназы (АДГ и ГДГ) локализованы в цитоплазматической мембране бактерий G. oxydans. Именно эти ферменты отвечают за окисление этанола и глюкозы соответственно. Пространственное строение этих ферментов имеет общие закономерности, но у ГДГ отсутствуют характерные для АДГ дисульфидные связи, образуемые цистеинами, и их место занимает гистидин. Акриламид вызывает S-алкилирование тиольных групп в белках и пептидах, что может являться одной из причин ингибирования активности фермента АДГ в клетках G. oxydans при иммобилизации в ПААГ.

Способ иммобилизации также оказывает влияние на аналитические и метрологические характеристики биосенсора, поэтому следующим этапом работы стало определение параметров биосенсоров на основе разработанных рецепторных элементов. В качестве модельной использовали смесь глюкозы и глютаминовой кислоты (ГГС), которую применяют в качестве стандарта в Российской Федерации и в международной практике при определении БПК5. Полученные данные приведены в таблице 1.

Таблица 1. Характеристики рецепторных элементов.

Вид иммобилиза ции Относительное стандартное отклонение, % (по 15 измерениям) Долговременная стабильность, сутки Чувствительность нА-дм3/ мин-мг Нижняя граница определяемых концентраций ГГС, мг/дм3 Длительность одиночного измерения, мин

Адсорбция на вР/А 5,4 10 2,69 0,22 7-10

Включение вПААГ 8,7 6 0,08 7,05 21-30

Включение в гель ПВС, сшитый УФ 9,6 7 0,57 1,00 12-18

Включение криогель ПВС 12,3 17 1,13 0,51 12-18

Включение в гель из сшитого БСА 5,9 30 1,53 0,37 10-13

Включение в агаровый гель 5,8 15 0,21 2,73 18-21

Лучшие результаты по чувствительности, нижней границе определяемых концентраций и экспрессности показал рецепторный элемент на основе адсорбированных микроорганизмов. Однако данный рецептор обладает низкой долговременной стабильностью, что существенно затрудняет его использование. Лучшей долговременной стабильностью обладает рецептор на основе микроорганизмов, включенных в поперечно-сшитый БСА. Этот элемент обладает также лучшей чувствительностью и самой низкой нижней границей определяемых концентраций среди рецепторных элементов, полученных включением в гель. В дальнейшей работе этот метод иммобилизации применяли для создания рецепторных элементов на основе других микроорганизмов.

Разработка макета биосенсорного анализатора, модифицированного для экспресс-определения БПК

Макет биосенсора проточно-инжекционного типа, модифицированный для экспресс-определения БПК в водных средах был разработан на базе прибора «Мультибио-01». Разработчиками прибора являются: ТулГУ, ИБФМ РАН (г. Пущино) и ЗАО «Кронас» (Г. Москва) (рис 4). Прибор «Мультибио-01» имеет возможность анализировать до 4 параметров одновременно. Использование анализатора проточно-инжекционного типа позволяет понизить определяемый минимум концентраций компонентов за счет отсутствия разбавления анализируемой пробы буфером и уменьшить время между анализами за счет быстрого удаления

остатка субстрата и продуктов его окисления из измерительной кюветы протоком буфера.

Принцип работы такой системы заключается в следующем: в проточно-инжекционной системе биосенсорный элемент (кислородный электрод, модифицированный биорецептором) встроен в канал, по которому постоянно прокачивается буферный раствор. Проба впрыскивается в поток и через определенное время поступает в зону измерительного электрода, где иммобилизованные микроорганизмы окисляют субстрат, содержащийся в пробе. При этом в приэлектродном пространстве снижается концентрация кислорода, что регистрируется с помощью электрода Кларка, сопряженного с гальваностатом-потенциостатом (рис 4). На монитор компьютера, интегрированного с биосенсорной системой, выводится графическое отображение изменения силы тока, протекающего в системе, во времени.

Кислородные электроды 0000

Гальванопотен циостат

Измерительная кювета

Рецепторные элементы

а 6

Рис 4. а) Схема работы проточно-иижекционного многоканального биосенсора; б) внешний вид многоканального анализатора «Мулътибио-01».

Сточные и технические воды бродильных производств содержат в основном углеводы, спирты и аминокислоты, что является ориентирующим при выборе соответствующих культур микроорганизмов для создания биорецепторного элемента. Для исследования были выбраны следующие штаммы микроорганизмов: бактерии С1исопоЬас!ег охуйат эЬвр. ¡п&аШиз В-1280, дрожжи Р'кЫа ап%и$1а ВКМ У-2518 и Агхи1а а<1етпо\огат ВГИ (78)-6. Выбор биоматериала для формирования биорецепторных элементов основывался на спектре утилизируемых субстратов и устойчивости микроорганизмов по отношению к вредным факторам окружающей среды. Известно, что дрожжевые штаммы Агхи1а аЛетпо\огат способны окислять широкий круг органических веществ: спирты и углеводы, карбоновые кислоты, многие аминокислоты и другие вещества. Штамм Агхи1а ас!етпо\огат ВГИ (78)-6 используется в качестве производственной культуры на гидролизных заводах, это солетолерантный микроорганизм и стабилен при очень высоких концентрациях солей - до 2,5 М. Рецепторный элемент, сформированный на основе этих дрожжей, можно считать универсальным. Метилотрофные дрожжи Р1сЫа ап%и$1а применяют в молекулярной биотехнологии для получения биологически-активных белков, а в биосенсорной технологии их используют (лучше так) при создании датчиков для определения содержания метилового и этилового спиртов. В зависимости от ростовых условий они могут менять свою специфичность, поэтому их можно

использовать при создании специализированных рецепторных элементов, например для анализа стоков спиртовых производств.

Определение характеристик разработанного макета биосенсора

Важной характеристикой анализа является его селективность, т.е. возможность определения каждого компонента анализируемого объекта независимого от других. В случае биосенсорного анализа селективность определяется субстратной специфичностью биоматериала, используемого для формирования рецепторного элемента сенсора. При определении БПК в качестве рецепторного элемента предпочтительно использовать целые клетки микроорганизмов, обладающих широкой субстратной специфичностью (низкой селективностью). Широкая субстратная специфичность при этом является преимуществом, так как приводит к повышению правильности результатов анализа.

Субстратная специфичность микроорганизмов Агхи1а а<Иетпо\огат, РгсЫа ш^гта и (3!исопоЬас!ег охуйагк, иммобилизованных включением в БСА, приведена на рис 5. В качестве субстратов были выбраны легко окисляемые органические вещества, наиболее часто встречающиеся в стоках и технологических водах бродильных производств.

®Агхи1а adвninovorans ВГИ (78)-6 Ш6!исолоЬас4ег охуаапв зЬзр. В-128С

□ Р)сЫа ап9Ц5Ь| ВКМ У-2518

Л4 > Ъ > Л 3 ^ & & А Л Л ф ^ # # # #

Рис 5. Субстратная специфичность рецепторных элементов на основе применяемых микроорганизмов (концентрация каждого субстрата 2 мМ).

Анализ портретов субстратной специфичности, приведенных на рис 5, позволяет сделать вывод о том, что микроорганизмы Агхи1а ас1ептол>ога№ обладают наибольшей чувствительностью к глюкозе, способны окислять первичные спирты, большинство углеводов и аминокислот, за исключением ксилозы, метанола, глицерина и вторичных спиртов. Величина отклика на спирты уменьшается по мере увеличения углеводородного радикала. Сенсор на основе дрожжей Агхи1а ас1етпохогат наиболее активен по отношению к спиртам с неразветвленной углеродной цепью, глюкозе и фруктозе. Ценным с практической точки зрения является факт наличия ответов на додецилсульфат натрия (ДСН) и

додецилбензосульфат натрия (ДБСН) (компоненты моющих средств), а также отсутствие токсического действия данных субстратов на клетки в составе биорецептора при коротковременном контакте.

В целом, тенденции, выявленные для Arxula adeninovorans, сохраняются и для метилотрофных дрожжей Pichia angusta. Характерной особенностью данного штамма является способность окислять вторичные и разветвленные спирты, что позволяет использовать биосенсор на его основе для анализа БПК сточных вод предприятий ликеро-водочной и химической промышленности, в стоках которых могут содержаться данные вещества.

Рецептор на основе бактерий Gluconobacter oxydans характеризуется высокими ответами на углеводы. Максимальный ответ биосенсора был получен на глюкозу, остальные моносахариды (галактоза, ксилоза) также окислялись бактериями. Высокие ответы сенсора на основе бактериальных клеток были получены при добавлении в измерительную кювету одноатомных спиртов нормального строения (кроме метанола). При переходе от первичных спиртов к вторичным и третичным скорость потребления кислорода бактериями уменьшалась.

Таким образом, все три культуры способны метаболизировать широкий круг субстратов, которые могут быть обнаружены в стоках пищевых производств, и могут быть рекомендованы для дальнейших исследований по созданию БПК-биосенсора.

Градуировочная зависимость ответа от концентрации определяемого вещества является важнейшей метрологической характеристикой сенсора. Для биосенсоров на основе каждого рецепторного элемента были получены градуировочные зависимости отклика биосенсора от концентрации ГТС в измерительной кювете (рис 6).

so

50 100 150 200 Концентрация ITC, мг/дм3

бактерии GluconobactaroxydaiM

дрожжи Arxuia adenlnovonma

домки Р£Па wguata 10 19 20 25

Концентрация ГГС, мг/ди^

БПКа, ыг/ди3

Рис б. а) Зависимости ответов от концентрации анапита для биосенсоров на основе разработанных рецепторных элементов; б) линейные участки зависимости ответов биосенсоров от концентрации субстрата.

Биорецепторы на основе целых клеток микроорганизмов являются биорецепторами каталитического типа, т.е. биологический ответ в таких системах

обеспечивается ферментативными реакциями микроорганизмов. Поэтому зависимости приведенные на рис. 6-а хорошо описываются уравнением типа

И [51

Михаэлиса-Ментен: Я =--,

К и

где Кгаах - максимальная скорость потребления кислорода иммобилизованными микроорганизмами, достигаемая при [Б]—►<», Км -эффективная константа Михаэлиса, т.е. концентрация субстрата, при которой

К=Ктах/2.

Согласно этому уравнению, концентрация аналита будет пропорциональна отклику биосенсора только при концентрациях меньших Км. Тогда уравнение

« » к - ^ приобретает следующий вид: «----.

км

Верхняя граница определяемых концентраций субстрата ограничена константой Км, так как при концентрации субстрата много большей Км отклик не зависит от концентрации субстрата.

Параметры уравнения, описывающего градуировочные зависимости для биосенсора на основе используемых биорецепторных элементов, приведены в таблице 2.

Таблица 2. Параметры уравнения, описывающего градуировочные зависимости биосенсора. __

Рецепторный элемент Эффективная константа Михаэлиса Км, мг/дм3 Максимальная скорость потребления кислорода Rmax, нА/мИН

G. oxydans, включенные в гель БСА 13±1 44±2

A. adeninovorans, включенные в гель БСА 23±4 40±2

P. angusta, включенные в гель БСА 24±3 27±1

Таким образом, наибольшей эффективностью как по максимальной скорости окисления, так и по константе Км обладает рецепторный элемент на основе бактерий Gluconobacter oxydans, включенных в гель БСА

Для снижения ошибок анализа, как правило, ограничиваются использованием линейного участка градуировочной зависимости (рис 6-6). Была рассчитана зависимость БПК5 от ответа биосенсоров (R) для линейного участка градуировочных зависимостей. Для биосенсора на основе клеток Gluconobacter oxydans, включенных в гель БСА, полученное уравнение зависимости БПК5 от сигналов сенсора R имеет вид: БПК5 = 0,44R - 0,15, для биосенсора на основе культуры Arxula adeninovorans, включенной в гель БСА: БПК5 = 0,83R - 1,34, для биосенсора на основе культуры Pichia angusta, включенной в гель БСА: БПК5 = 1,39R - 2,40.

Было проведено определение аналитических и метрологических характеристик БПК-биосенсоров на основе разработанных рецепторных элементов. В качестве модельной использовалась глюкозо-глутаматная смесь. Полученные данные приведены в таблице 3.

Таблица 3. Характеристики БПК-биосенсоров на основе различных клеток микроорганизмов. _____

Рецепторный элемент Относительное стандартное отклонение %- Долговременная стабильность, сутки Чувствительность нА-дм3/ мин-мг Длительность одиночного измерения, мин Линейный диапазон зависимости ответа биосенсора от БПК5 мг/дм3

О. oxydans, включенные в гель БСА 5,9 30 2,25 8-12 0,5-8,8

А. adenmovorans, включенные в гель БСА 6,5 <40 1,21 10-14 1,0-15,6

Р. включенные в гель БСА 6,1 26 0,72 10-14 1,6-16,3

Биосенсоры с разработанными рецепторными элементами характеризуются близким уровнем операционной стабильности и параметров экспрессности. Наибольшей чувствительностью и, соответственно, минимальным значением нижней границы линейного диапазона обладает биосенсор на основе микробных клеток G. oxydans. В то же время, использование в качестве биорецептора включенных в гель дрожжей A. adeninovorans позволяет значительно увеличить долговременную стабильность биосенсорной системы и при этом даёт возможность определять достаточно низкие значения БПК5.

Разработанные биосенсоры по аналитическим и метрологическим характеристикам не уступают зарубежным аналогам.

Анализ образцов сточных вод

Был проведен анализ образцов сточных вод ОАО «ГПК Ефремовский» (Тульская обл., г. Ефремов), образцов сточных вод муниципальных очистных сооружений г. Пущино (Московская обл., г. Пущино) и полупродуктов брожения пшеничной муки, имитирующих состав сточных вод бродильных производств с использованием разработанного макета БПК-биосенсора и стандартным методом разбавления. Определение БПК5 стоков стандартным методом разбавления проводилось согласно действующим в РФ нормативным документам. Содержание растворенного кислорода до и после пятидневной инкубации определялось йодометричсским методом Винклера. Измерения проводились в аккредитованной лаборатории в Центре гигиены и санитарно-эпидемиологического надзора по Тульской области (таблица 4).

Таблица 4. Результаты определения БПКз реальных проб методом с использованием биосенсора.___

Пробы Полученные значения БПК, мг/дм3

Биосенсор на основе Arxula adeninovorans Биосенсор на основе Р1сЫа ап^(а Биосенсор на основе Gluconobacter oxydons Стандартный метод разбавления

Стоки ОАО «ГПК Ефремовский» 1 1010 ±70 840 ±80 860 ±70 900 ±100

2 1100 ±100 940 ±70 910 ± 80 1000±100

3 840 ± 60 730 ±50 770 ± 40 800 ±100

4 1100 ±100 860 ±50 830 ±40 1100±100

5 890 ±40 810 ±80 750 ± 50 900 ±100

Полупродукты брожения 1 1400 ±100 1500 ±100 1400 ± 100 1500± 100

2 1200 ±100 1300± 100 1300±100 1300±100

Сточные воды муниципальных очистных сооружений г. Пущино 1 110 ±20 100 ±20 100 ± 10 120 ±20

2 570 ±50 510 ± 40 520 ±30 620 ± 70

3 160 ±20 120 ±20 140 ± 10 150 ±20

4 100 ±20 90 ±10 100 ±10 100 ±10

5 150 ±20 150 ±20 140 ± 10 150 ±20

6 100 ± 10 100 ± 10 90 ± 8 96 ±9

7 140 ±20 130 ±20 130 ±10 140 ±20

8 100 ±20 100 ±20 95 ±8 90 ±10

Высокая ошибка обнаруживается при анализе образца № 4 стока ОАО «ГПК Ефремовский» биосенсорами на основе бактерий &исопоЬа&ег охуйаш и дрожжей РкЫа ап^1а и при анализе образца № 5 стока ОАО «ГПК Ефремовский» биосенсором на основе бактерий 01исопоЪас1ег охус1ат.

Для определения причины ошибки пробы сточных вод ОАО «ГПК Ефремовский» были проанализированы методами высокоэффективной жидкостной и газовой хроматографии (таблицы 5,6).

Таблица 5. Результаты высокоэффективной жидкостной хроматографии исследуемых стоков.___

Компонент, г/дм3 Стоки ОАО «ГПК Ефремовский»

1 2 3 4 5

Глюкоза 1,411 0,106 0,272 0,204 0,289

Фруктоза 0,000 0,000 0,011 0,012 0,016

Мальтоза 0,111 1,139 0,935 0,165 0,255

Триозы 0,051 0,289 0,170 0,155 0,177

Высшие сахара 0,107 0,170 0,289 1,139 0,680

Таблица 6. Результаты газовой хроматографии исследуемых стоков.

Компонент, % Стоки ОАО «ГПК Ефремовский»

1 | 2 | 3 | 4 | 5

Метанол Отсутствует

Этанол Отсутствует

Пропанол-1 Отсутствует

Бутанол-1 Отсутствует

Бутанол-2 Отсутствует

Уксусный альдегид Отсутствует

Изоамиловый спирт Отсутствует

Этиловый эфир уксусной кислоты Отсутствует

По результатам проведенного хроматографического анализа видно, что основными компонентами стока ОАО «ГПК Ефремовский» являются легкоутилизируемые микроорганизмами углеводы, а основным компонентом продуктов брожения - этиловый спирт. Ошибка при определении БПК с использованием биосенсора может быть обусловлена высоким содержанием высших Сахаров в пробах № 4 и 5, которые медленно окисляются микроорганизмами.

Таким образом, значения БПК5, определённые с помощью биосенсоров на основе микроорганизмов трех видов, в большинстве случаев совпадают со значениями БПК5 полученными по стандартной методике, с учётом доверительного интервала. Полученные результаты показывают возможность применения действующего макета биосенсорного анализатора как прототипа опытных образцов приборов для серийного освоения и применения.

Применение низкоселективных микробных биосенсоров для определения содержания компонентов в многокомпонентных водных средах

Для биотехнологических производств, к которым относятся и спиртовые производства, важно не только определение суммарного содержания органических веществ в стоках, но и определение отдельных компонентов бродильных производств, таких как этиловый спирт, глюкоза и др. Применение низкоселективных микробных сенсоров для задач селективного определения веществ является экономически целесообразным и позволило бы разработать недорогой экспресс-метод определения индивидуальных компонентов в ферментационных средах бродильных производств.

Для решения этой задачи был использован макет многоканального биосенсора проточно-инжекционного типа, модифицированный для селективного определения компонентов в водных средах. В качестве рецепторных элементов многоканального биосенсора использовались иммобилизованные различными способами бактерии Gluconobacter oxydans, а также дрожжевые микроорганизмы Pichia angusta и Saccharomyces bayanus (рис 7).

100

а во

О

о

X

о

о 60

X

о

о 40

ш

5

20 0

в. оху<Зап5 на О. охуйапв в в. охуйапэ в Р. апдив1а на Б. Ьауапде на вР/А БСА ПААГ вР/А

Рецепторные элементы

Рис 7. Относительная субстратная специфичность используемых рецепторных элементов (концентрация субстратов в кювете 3 мМ).

Каждый из биорецепторов проявляет различную окислительную активность по отношению к исследуемым субстратам, что позволяет использовать систему биосенсоров для селективного анализа смеси этих веществ.

Для повышения селективности анализа с использованием многоканального биосенсора применяли математическую обработку данных и в частности метод ИНС. Для анализа были использованы модельные смеси с концентрацией компонентов от 0 до 5 мМ. Были получены ответы биосенсоров с разработанными рецепторными элементами на модельные смеси. Полученные экспериментальные данные были обработаны с помощью искусственных нейронных сетей. При создании нейронных сетей были использованы многослойные модели, содержащие 2-100 нейронов в 1-5 скрытых слоях. На вход каждой сети подавались значения ответов биосенсоров с различными рецепторными элементами, сигнал разбивался в скрытых слоях, и на выходе выдавалась концентрация аналитов в модельной смеси. Топология простейшей сети, построенной для анализа, имеет вид, представленный на рисунке 8.

Внутренние спои

внутренних слоях.

0 Метанол

Разработка подхода для анализа многокомпонентных смесей была проведена поэтапно. На первом этапе был осуществлен анализ двухкомпонентных смесей глюкоза-этанол и метанол-этанол. Выбор состава смесей был обусловлен возможностью применения данных систем для анализа реальных образцов. Анализ смеси глюкоза-этанол был проведен как с использованием системы с одним селективным сенсором, так и системой из двух неселективных сенсоров. Далее был осуществлен анализ трех- и четырехкомпонентных смесей: глюкоза-метанол-этанол и глюкоза-метанол-этанол-фруктоза.

Для снижения ошибок определения отдельных компонентов в смеси была проведена оптимизация конфигураций сетей, используемых для анализа. Параметрами оптимизации являлись топология сети, метод обучения, модуль инициализации (полуширина диапазона начальных весов связей) и длительность обучения. Критерием оптимизации во всех случаях служила сумма квадратов

ошибок обучающей функции (СКО). СКО определяется по формуле:

р j

где tpj - обучающий выход (требуемое значение выходного сигнала) нейрона j для образца р, a opj - действительное значение. ИНС с оптимальной конфигурацией использовали для анализа модельных смесей.

Для определения зависимости СКО от топологии и метода обучения сети были созданы ИНС различной топологии, каждая из которых была обучена четырьмя алгоритмами. Для обучения ИНС использовали алгоритмы Batch Back Propagation (пакетное обратное распространение ошибки), Resilient propagation (эластичное распространение ошибки) и Quick Propagation (быстрое распространение ошибки). Это позволило проследить некоторые закономерности, касающиеся обучения, а также определить сочетание структуры сети и обучающего метода, дающее наилучший результат.

Следующим шагом оптимизации являлось выявление зависимости качества аппроксимации ИНС от ширины диапазона весов связей, используемого при инициализации сети. При инициализации сети всем связям присваивались случайные веса, распределенные в диапазоне с полушириной от 0,05 до 3.

Для определения количества циклов обучения, необходимых для достижения минимальной ошибки работы сети построили зависимость суммы квадратов ошибок обучающей функции от количества циклов обучения. Результаты по оптимизации ИНС и анализу модельных смесей различного состава представлены в таблице 7.

Для количественного анализа смеси, содержащей N веществ, минимально необходимо иметь систему из N сенсоров, таким образом, для анализа бинарной смеси глюкоза - этанол достаточно иметь систему двух сенсоров. Для повышения эффективности анализа используемые сенсоры должны обладать максимально различающейся чувствительностью по отношению к компонентам смеси. Либо, как крайний случай, один или несколько сенсоров могут обладать чувствительностью только к какому-либо одному компоненту смеси, т.е. являться селективными. Применение селективных сенсоров в многокомпонентном анализе может значительно снизить ошибку определения веществ в смеси, однако, при использовании математических процедур обработки данных стабильность и воспроизводимость показаний сенсоров более важны, чем селективность.

Используемый в работе рецепторный элемент на основе клеток G. oxydans, включенных в полиакриламидный гель, в данном случае является селективным по отношению к глюкозе, однако по своим характеристикам значительно уступает сенсору на основе клеток G. oxydans, включенных в гель из бычьего сывороточного альбумина. Таким образом, селективный анализ смеси глюкоза - этанол был проведен с использованием двух различных систем из двух сенсоров.

Таблица 7. Данные по оптимизации и относительным ошибкам определения компонентов в модельных смесях ___ _

Смесь Система биосенсоров Оптимальные параметры ИНС Относительные ошибки определения концентраций компонентов, %

Топология Метод обучения Длительность обучения, циклов Диапазон весов

А с S 3 G. oxydans на GF/A G. oxydans в ПААГ 2-15-1515-2 Resilient propagation 15000 0,5 Глюкоза: 0-3,6 Этанол: 1,2-12,5

2 а .ч S G. oxydans на GF/A G. oxydans в БСА Глюкоза: 0-0,7 Этанол: 1,2-6,3

! Этанол- I метанол. G. oxydans на GF/A P. angusta на GF/A Этанол: 2-10 Метанол: 2-13

1 Глюкоза-метанол-этанол j G. oxydans на GF/A G. oxydans в БСА P. angusta на GF/A 3-70-7070-70-3 Quick Propagation 7500 0,5 Глюкоза: 8-15 Метанол: 11-15 Этанол: 3-14

3-37-1 BackpropBa tch 5000 0,5 Глюкоза: 9-13

3-50-50-1 Quick Propagation 5000 0,5 Метанол: 3-13

3-45-45-1 BackpropBa tch 5000 0,5 Этанол: 0-10

га С ^ 2 о g к M га о С Ш § я 2 J 5 S G. oxydans на GF/A G. oxydans в БСА P. angusta на GF/A S. bayanus на GF/A 5-90-1 Quick Propagation 21000 0,18 Глюкоза: 4-16

5-45-4545-1 Quick Propagation 500 0,71 Фруктоза: 4-18

5-90-1 Resilient Propagation 250 2,00 Метанол: 0-12

5-25-25-1 Quick Propagation 6600 0,5 Этанол: 4-16

Из полученных данных видно, что, как в случае использования системы из двух неселективных биосенсоров, так и в случае системы с одним селективным и одним неселективным биосенсором, ошибка определения компонентов смеси мала и лежит в пределах ошибки метода с использованием биосенсора (= 15%). Однако система с одним селективным сенсором показывает худшие результаты по сравнению с системой из двух неселективных сенсоров. Это, скорее всего, связано с

18

низкой операционной стабильностью сенсора на основе й. охуёат, включенных в ПААГ.

Даже если сеть с оптимальной конфигурацией хорошо предсказывает значение концентраций некоторых компонентов, то остальные компоненты могут рассчитываться со значительной ошибкой. Подбор сетевой конфигурации, обеспечивающей правильное предсказание всего вектора целиком, зачастую является длительным и ресурсоемким процессом, который может не увенчаться успехом. В работе произведена попытка использования системы из трех нейронных сетей, с одним выходом каждая, для интерпретации сигналов биосенсоров. Каждая из сетей рассчитывала концентрацию одного из веществ модельных растворов. Оптимизация ИНС производилась отдельно для каждого из определяемых веществ.

Относительные ошибки расчетов концентраций компонентов с помощью одной сети лежат в интервале 3-15%, а при использовании системы из трех независимых сетей ошибка составляла 3-13%. Это показывает возможность применения системы неселективных микробных сенсоров для анализа смесей метанол-этанол. Применение ИНС с одним выходом показывает лучшие результаты по сравнению с использованием ИНС с несколькими выходами.

Для анализа четырехкомпонентной смеси были использованы изученные ранее биорецепторы, а также рецепторный элемент на основе дрожжей 5. Ьауапш. Согласно литературным данным, микроорганизмы 5. Ьауапиз характеризуются облегченным транспортом фруктозы. Данные микроорганизмы проявляют наибольшую чувствительность к этанолу и глюкозе, однако рецептор на их основе единственный дает ответ на фруктозу, что позволяет его использовать для анализа данного вещества.

Как показано, при анализе смеси глюкоза-метанол-этанол, использование сетей с выходом, отвечающим за концентрацию одного вещества, дает хорошие результаты. Особенно эффективен данный подход при использовании ИНС с большим числом входных нейронов. Поэтому обработка данных по четырехкомпонентной модельной смеси была проведена с использованием нейронных сетей с одним выходом. В работе каждая созданная нейронная сеть содержала 4 входными нейрона и 1 выходной. Оптимизированные сети были применены для анализа модельных растворов. Относительные ошибки определения компонентов в модельных растворах лежат в интервале 0-16%, что позволяет применить разработанную методику для анализа образцов алкогольной продукции и продуктов сбраживания.

Определение состава образцов алкогольной продукции и продуктов сбраживания

В работе был проведен анализ образцов алкогольной продукции, а также продуктов сбраживания пшеничной муки, имитирующей состав ферментационных сред при производстве этилового спирта. Анализ был проведен при помощи системы из четырех сенсоров, описанной выше. Для определения состава реальных смесей в качестве референтных были использованы методы высокоэффективной жидкостной и газовой хроматографии.

Для расчета концентраций веществ в реальных образцах неизвестного состава использовалась ИНС оптимальной конфигурации. В таблице 8 представлены

сравнительные данные о составе реальных образцов, полученные при помощи разработанной методики и при помощи методов газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Таблица 8. Сравнение данных, полученных при помощи системы биосенсоров с данными ГХ и ВЭЖХ.

Образец Компоненты Содержание по данным биосенсора, моль/дм3 Содержание по данным хроматографии, моль/дм3 Ошибка определения, %

Вино столовое полусладкое красное «Ламбада» метанол 0 <0,01 не определена

глюкоза 0,15±0,01 0,13 15

этанол 1,6±0,1 1,70 6

фруктоза 0,11±0,01 0,09 22

Вино столовое сухое белое «Рислинг» метанол 0 <0,01 не определена

глюкоза 0 0 не определена

этанол 1,6±0,1 1,78 ' 10

фруктоза 0,02±0,02 0 не определена

Портвейн «333» метанол 0 <0,01 не определена

глюкоза 0,13±0,05 0,17 23

этанол 2,9±0,2 3,09 6

фруктоза 0,16±0,02 0,14 14

Продукт неполного сбраживания пшеничной муки (5 часов) метанол 0 <0,01 не определена

глюкоза 0,05±0,01 0,07 28

этанол 1,12±0,09 1,29 13

фруктоза 0,01±0,01 0 не определена

Продукт неполного сбраживания пшеничной муки (10 часов) метанол 0 <0,01 не определена

глюкоза 0 0 не определена

этанол 1,93±0,07 2,08 7

фруктоза 0 0 не определена

Ошибки определения компонентов в образцах лежат в пределах от 6 до 28 %. Такая ошибка может быть обусловлена высокой концентрацией этанола, превышающей на порядок концентрации остальных компонентов в анализируемых образцах. Тем не менее разработанный макет многоканального биосенсора может быть использован для экспресс-анализа глюкозы, фруктозы, метанола и этанола при совместном присутствии в водных средах.

Выводы

Разработана химическая и биологическая база для создания универсального биосенсорного анализатора как для экспресс-оценки интегрального показателя качества сточных вод, так и для анализа многокомпонентных ферментационных сред биотехнологических производств, что вносит практический вклад в разработку современных высокоэффективных аналитических систем.

На основании сравнительного анализа характеристик распознающих элементов биосенсора на основе иммобилизованных различными способами микроорганизмов выявлено, что лучшим способом получения рецепторных элементов микробного биосенсора является включение в матрицу БСА, сшитого глутаровым альдегидом. Впервые показан эффект изменения субстратной специфичности уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans при иммобилизации в различные матрицы, который имеет существенное значение при создании биосенсорных систем для анализа многокомпонентных смесей.

Охарактеризованы биокатализаторы на основе целых клеток микроорганизмов для использования в качестве основы рецепторного элемента биосенсора. Установлено, что применение бактерий Gluconobacter oxydans и дрожжей Pichia angusta как основы рецепторного элемента биосенсора для определения БПК стоков биотехнологических производств позволяет получать данные с высокой корреляцией к стандартному методу.

На основании проведенного анализа многокомпонентных смесей расширена возможность применения технологии искусственных нейронных сетей для обработки сигналов биологических сенсоров на примере двух-, трех- и четырехкомпонентных систем, содержащих метанол, этанол, фруктозу и глюкозу. Впервые показана возможность применения дрожжей Saccharomyces bayanus как основы рецепторного элемента многоканального биосенсора для селективного определения фруктозы в водных средах.

Разработан макет биосенсора проточно-инжекционного типа для экспресс-определения БПК5 на основе рецепторных элементов, полученных с использованием дрожжевых микроорганизмов Arxuîa adeninovorans, Pichia angusta и бактерий Gluconobacter oxydans. По своим характеристикам биосенсор не уступает зарубежным аналогам. Разработана модификация макета многоканального биосенсора, позволяющая проводить селективную оценку содержания глюкозы, фруктозы, метанола и этанола в диапазоне концентраций от 1,00 до 5,00 мМ по каждому из компонентов с ошибкой не более 18 %. Разработанный биосенсор может служить прототипом для создания опытных образцов приборов для серийного освоения и применения.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Арляпов В.А., Понаморева О.Н., Алферов В.А. Многоканальная биосенсорная система для определения содержания глюкозы, метанола и этанола при их совместном присутствии. // Биотехнология. 2008. №5. С. 84-91.

2. Арляпов В.А., Асулян Л.Д., Власова Ю.А., Ануфриев М.А., Блохин И.В., Карташова Т.Д. Иммобилизация клеток Gluconobacter oxydans для создания стабильных рецепторных элементов биосенсоров. // Известия ТулГУ. Серия Химия. Тула: Изд-во ТулГУ. 2006. Вып. 6. С. 137 - 144.

3. Арляпов В.А., Понаморева О.Н., Алферов В.А., Рогова Т.В., Блохин И.В., Решетилов А.Н., Чепкова И.Ф., Егорова И.Н. Экспресс - метод определения БПК с помощью биосенсора. // Известия ТулГУ. Серия «Химия». Тула: Изд-во ТулГУ. 2006. Вып. 6. С. 131 - 136.

4. Петров АЛ., Арляпов В.А., Понаморева О.Н., Асулян Л.Д., Алферов В.А. Анализ модельных бинарных смесей глюкоза-этанол с использованием биосенсорного подхода и применением нейросетевых технологий. // Известия ТулГУ. Серия «Химия». Тула: Изд-во ТулГУ. 2006. Вып. 6. С. 144 -153.

5. Arlyapov V.A., Ponamoreva O.N., Asulijan L.D., Alferov VA., Reshetilov A.N. Quantitative estimation of glucose and ethanol contents in mixture using biosensor

' approach and neuronet technologies. // Biotechnology: state of art and prospects for development /Editor: G.E. Zaikov. 2008. P. 11-21.

6. Arlyapov V.A., Chigrinova E. Yu., Ponamoreva O.N., Reshetilov A. N. Express detection of BOD in wastewaters of starch-processing industry. // Starch science and technology / Editor: G.E. Zaikov. 2008. P. 43 - 50.

7. Арляпов B.A., Исайчев Д.Н., Понаморева O.H., Решетилов А.Н., Алферов В А. Применение технологии искусственных нейронных сетей для определения содержания компонентов в смеси гшокоза-этанол-метанол при помощи микробных биосенсоров. // Известия ТулГУ. Естественные науки. Тула: Изд-во ТулГУ. 2007. Вып. 1. С. 209 - 218.

8. Арляпов В.А., Понаморева О.Н., Алферов В.А., Рогова Т.В., Блохин И.В., Чепкова И.Ф., Решетилов А.Н. Микробные биосенсоры для экспресс-определения БПК сточных вод предприятий пищевой промышленности. // Вода: Химия и Экология. 2008. №3, С. 20 - 22.

9. Арляпов В.А., Понаморева О.Н., Решетилов А.Н., Алферов В.А., Блохин И.В. Микробный биосенсор для экспресс-определения БПК сточных вод промышленных предприятий. // Материалы IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий». 2006. Томск: изд-во ТПУ. Т. 2. С. 329 - 331.

Ю.Арляпов В.А., Егорова И.Н., Чепкова И.Ф., Иськив E.H. Экспресс-определение БПК сточных вод предприятий пищевой промышленности. // XIV Туполевские чтения: Международная молодёжная научная конференция, 10 -11 ноября 2006 года: Материалы конференции. 2006. Казань: Изд-во Казан, гос. техн. ун-та. Т. II. С. 84 - 85.

11. Арляпов В. А., Власова Ю.А., Петров A.A., Ануфриев М.А. Иммобилизованные клетки микроорганизмов как основа рецепторных элементов биосенсоров для мониторинга биотехнологических процессов. // XIV Туполевские чтения: Международная молодёжная научная конференция,

10-11 ноября 2006 года: Материалы конференции. 2006. Казань: Изд-во Казан, гос. техн. ун-та. Т. III. С. 9 - 11.

12.Арляпов В.А., Власова Ю.А., Иськив E.H., Рогова Т.В., Асулян Л.Д. Влияние способа иммобилизации микроорганизмов, используемых для формирования биорецепторных элементов на характеристики БПК - биосенсора. // Современные проблемы экологии. Доклады Всероссийской научно-технической конференции в двух книгах. Книга 1./ Под общей редакцией чл,-корр. Российской академии наук В.П. Мешалкина. 2006. Москва - Тула: Изд-во ТулГУ. С. 174-176.

13.Арляпов В.А., Понаморева О.Н., Асулян Л.Д., Алферов В.А., Решетилов А.Н. Многоканальная биосенсорная установка для раздельного определения содержания глюкозы и этанола при их совместном присутствии. // Тезисы докладов XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии: В 5 т. 2007. М.: Граница. Т. 4. С. 74.

14.Арляпов В.А., Алферов В.А. Применение технологии искусственных нейронных сетей для определения содержания компонентов в смеси глюкоза-метанол-этанол при помощи системы микробных биосенсоров. // Наукоемкие химические технологии-2008: Тезисы докладов XII Международной научно-технической конференции. 2008. Волгоград: ВолгГТУ. С. 117 - 118.

15.Каманин С.С., Юдина НЛО., Арляпов В.А., Разработка макета БПК-биосенсора проточно-инжекционного типа на основе дрожжевых штаммов Candida maltosa, Candida blankii и Debaryomyces hansenii. II Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова. Сборник тезисов. 2009. Москва - Пущино: Изд-во ИБХ РАН. Т. 2. С. 91-92.

Подписано в печать:

22.10.2009

Заказ № 2817 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Арляпов, Вячеслав Алексеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Биосенсоры на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов.

1.1.1. Современная концепция биосенсоров.

1.1.2. Биосенсоры па основе микробных клеток.

1.1.3. Особенности строения и метаболизма бактерий Gluconobacter oxydans и перспективы их применения в микробных сенсорах.

1.1.4. Особенности биохимии дрожжевых клеток.

1.1.4.1. Обитая характеристика метилотрофных дрожжей Pichia augusta и метилотрофного обмена.

1.1.4.2. Характеристика дрожжей Arxula adeninovorans.

1.1.5. Методы иммобилизации клеток микроорганизмов.

1.1.5.1. Физические и химические методы иммобилизации клеток.

1.1.5.2. Иммобилизация клеток путем включения клеток в массу носителя.

1.2. Бпосенсоры для определения биохимического потребления кислорода.

1.2.1. Методы анализа БПК.

1.2.2. Метод определения БПК с использованием биосенсора.

1.3. Обработка данных систем биосенсоров.

1.3.1. Методы, применяемые для обработки экспериментальных данных систем биосснсоров.

1.3.2. Искусственные нейронные сети.

1.3.2.1. История развития теории нейронных сетей.

1.3.2.2. Структура, свойства и виды ИНС.

1.3.2.3. Обучение ИНС.

1.3.2.4. Применение ИНС для решения задач, связанных с исследованием и разработкой сенсорных систем.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Применение низкоселективных биосенсоров для определения биохимического потребления кислорода и анализа многокомпонентных смесей"

Экспресс-оценка степени загрязнения объектов окружающей среды органическими соединениями является необходимым компонентом экологического контроля. Учитывая постоянно растущий перечень веществ, поступающих как загрязнители в окружающую среду, эффективным инструментом анализа оказываются методы, основанные на интегральной оценке органических компонентов, а не только на определении содержания индивидуальных веществ. В этой связи значительное внимание уделяется разработке биосенсорных экспресс-методов контроля, значительно повышающих оперативность анализа, снижающих его стоимость и позволяющих выполнить как интегральную оценку загрязненности, так и проводить селективный анализ.

Важной характеристикой степени загрязненности воды легкоокисляемыми органическими веществами является индекс биохимического потребления кислорода (БПК). Традиционная методика определения ВПК требует инкубирования насыщенной кислородом пробы в течение 5, 10 или 20 суток (БПК5, БПКю или БПК?о, соответственно). Отсутствие оперативности существенно снижает ценность традиционной методики. Для оперативного анализа разрабатываются методы оценки БПК, основанные на использовании биосенсорных анализаторов. Биосенсорные анализаторы БПК представляют собой падежные, простые и дешевые аналитические инструменты и с успехом используются для контроля водных экосистем (наряду с традиционными методами определения БПК) за рубежом. В России аналогичные анализаторы в настоящее время промышленно не выпускаются. В мире при создании БПК-сенсоров наиболее часто используют биосенсоры на основе кислородного электрода Кларка и целых клеток микроорганизмов.

Одной из важных проблем в экологии является очистка сгочных вод биотехпологичеекпх производств, в том числе спиртовых производств. Сточные воды спиртовых заводов характеризуются высоким содержанием органических загрязнений, что приводит к гибели естественных экосистем вокруг них. Для таких предприятий не только практически сложно, по и нерационально стремиться к созданию универсального БПК-сенсора. Напротив, целесообразно производить разработку биосенсоров и выбор соответствующих микроорганизмов, которые обеспечивали бы наиболее эффективную детекцию БПК в соответствии с конкретным типом сточных вод, т.е. разрабатывать специализированные БПК-биосенсоры.

К преимуществам биосенсоров можно отнести: короткое время ответа, портативность, удобство в работе, а также отсутствие специальных требований к приготовлению исследуемого образца. Микроорганизмы - доступный биологический материал. Клетки микроорганизмов легко воспроизводятся, культивируются и поддерживаются в чистой культуре. В некоторых случаях они обеспечивают жизнеспособность и активность ферментных систем в течение нескольких лет. Вместе с тем, для микробных сенсоров характерна низкая субстратная специфичность — чувствительность к большому количеству веществ, что является преимуществом для интегральной оценки степени загрязнения, но недостатком для селективного анализа.

Наряду с определением интегральных показателей качества воды важным является одновременное определение содержания отдельных компонентов в водных средах. Существует несколько подходов повышения селективности биосенсоров. Один из способов селективной детекции компонентов может заключаться в получении интегральных характеристик смеси с помощью низкоселективных анализаторов и использовании математических методов обработки данных с целью определения вклада, вносимого отдельными компонентами. Различные хемометрические методы, включая применение искусственных нейронных сетей (ИНС), успешно используются в аналитической химии для обработки сигналов химических сенсоров. Однако для применения в области биосенсорики данные методы не развиты. Следует отметить, что биосенсоры, предназначенные для экологического контроля стоков биотехнологических производств, можно использовать и для мониторинга ферментационных процессов на этих производствах. Это позволит сократить затраты на оборудование и увеличить экономическую отдачу предприятия. Так, дифференциальная оценка содержания нескольких компонентов на различных стадиях позволяет оптимизировать технологический процесс брожения и снижать материальные затраты, приводя в соответствие качество исходного сырья с качеством применяемых ферментов и дрожжевой биомассы. Одновременно снизится экологическая нагрузка на окружающую среду. Следует отметить, что существующие методы определения содержания спиртов и углеводов эффективно применяются для контроля качества готовой продукции, но не могут быть использованы для экспресс-оценки содержания указанных компонентов в ферментационных средах. Одной из важнейших особенностей биосенсоров, обеспечивающейся сменой рецепторных элементов, является возможность применения одного анализатора для различных аналитических целей. Таким образом, создание универсального биосенсорного анализатора со сменными биорецепторными элементами для определения БПК и анализа многокомпонентных смесей в современных условиях является важной задачей для биотехнологических производств.

Работа выполнялась при частичной поддерэ/ске гранта Федерального агентства по образованию РНП 2.1.1.7789. и ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 гг.», госконтракт № 02.512.11.2010. Автор работы является победителем конкурса программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса», реализуемой Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в 2008 г. (г. Пущино).

Цель работы:

Разработка химико-биологических основ применения низкоселективных микробных биосенсоров для экспресс-оценки БПК и мониторинга биотехнологических процессов и создание на этой базе макета универсального биосенсорного анализатора.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:

• Разработать стабильные и воспроизводимые биорецепторные элементы биосенсоров на основе различных способов иммобилизации клеток микроорганизмов.

• Охарактеризовать биокатализаторы на основе целых клеток микроорганизмов по их субстратной специфичности для использования в качестве основы рецепторного элемента биосенсора.

• Разработать модификацию макета биосенсора гфоточно-инжекционного типа для экспресс-анализа БПК. Определить его аналитические и метрологические характеристики.

• Оптимизировать конфигурации искусственных нейронных сетей для снижения ошибки определения компонентов при анализе двух-, трех- и четырехкомпонентных смесей.

• Разработать модификацию макета многоканального биосенсора проточно-инжекционного типа на основе неселективных клеток микроорганизмов для селективного анализа многокомпонентных смесей.

Научная новизна

Впервые показан эффект изменения субстратной специфичности уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans при иммобилизации в различные носители, что имеет существенное значение при создании биосенсорных систем для анализа многокомпонентных смесей.

Показано, что применение уксуснокислых бактерий G. oxydans и метилотрофных дрожжей Р. augusta как основы рецепторного элемента биосенсора для определения БПК стоков пищевых и ликероводочных производств позволяет получать данные с высокой корреляцией к стандартному методу.

Расширена возможность применения технологии искусственных неГфонных сетей для обработки сигналов биологических сенсоров. Разработана методика применения ИНС в решении задачи селективной детекции модельных двух-, трех- и четырехкомпонентных систем, содержащих метанол, этанол, фруктозу и глюкозу, выполняемой низкоселективными микробными сенсорами.

Впервые показана возможность применения дрожжевого штамма ЗассИаготусея Ьауапиь ВКМ У-349, характеризующегося активным транспортом фруктозы, как основы одного из рецепторных элементов многоканального биосенсора для селективного определения данного вещества в водных средах.

Практическая значимость

Разработан и апробирован макет многоканального биосенсора проточно-ипжекционного типа для определения содержания глюкозы, фруктозы, метанола, этанола и индекса БПК в водных средах. Метод анализа с использованием разработанного макета биосенсора характеризуется высокой экспрессностью и высокой чувствительностью. Макет многоканального биосенсора может быть использован в научных исследованиях, в учебном процессе и как прототип опытного образца прибора для серийного выпуска.

Работа вносит практический вклад в разработку высокоэффективных аналитических систем на основе биосенсоров. Предложенные методы анализа сигналов биосенсоров значительно повышают селективность анализа при использовании биосепсоров на основе целых клеток микроорганизмов и позволяют в перспективе разрабатывать недорогие и эффективные анализаторы.

Апробация работы и публикации

Результаты работы докладывались на Тульском молодежном инновационном конвенте (г. Тула), 2009 г. (диплом победителя)-, Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (г. Москва, г. Пущпно), 2008 г {диплом победителя); 2-ой Биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех - 2008» (г. Москва), 2008 г. (медаль выставки)', XII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии», 2008 г. (диплом за 3 место)-, Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в 2007 г. (медаль конкурса)-, XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (г. Москва), 2007 г.; IV Международной научной конференции

Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (г. Томск) в 2006 г.; Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология — современные биоаналитические системы, методы и технологии» (г. Пущино), 2006 г. (|диплом лауреата конкурса)', Международной молодёжной научной конференции «XIV Туполевские чтения» (г. Казань), 2006 г. {диплом за 3 место).

По теме диссертации опубликовано 8 статей, 7 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Арляпов, Вячеслав Алексеевич

ВЫВОДЫ

Разработана химическая и биологическая база для создания универсального биосенсорного анализатора как для экспресс-оценки интегрального показателя качества сточных вод, так и для анализа многокомпонентных ферментационных сред биотехнологических производств, что вносит практический вклад в разработку современных высокоэффективных аналитических систем.

На основании сравнительного анализа характеристик распознающих элементов бносенсора на основе иммобилизованных различными способами микроорганизмов выявлено, что лучшим способом получения рецепторных элементов микробного биосенсора является включение в матрицу БСА, сшитого глутаровым альдегидом. Впервые показан эффект изменения субстратной специфичности уксуснокислых бактерий С1исопоЬас{ег охуйат при иммобилизации в различные матрицы, который имеет существенное значение при создании биосенсорных систем для анализа многокомпонентных смесей.

Охарактеризованы биокатализаторы на основе целых клеток микроорганизмов для использования в качестве основы рецепторного элемента биосенсора. Установлено, что применение бактерий 01исопоЪа&ег охуЛат и дрожжей Р1сЫа angusta как основы рецепторного элемента биосенсора для определения БПК стоков биотехнологических производств позволяет получать данные с высокой корреляцией к стандартному методу.

На основании проведенного анализа многокомпонентных смесей расширена возможность применения технологии искусственных нейронных сетей для обработки сигналов биологических сенсоров на примере двух-, трех- и четырехкомпонентных систем, содержащих метанол, этанол, фруктозу и глюкозу. Впервые показана возможность применения дрожжей Засс/гаготусея Ьауапт как основы рецепторного элемента многоканального биосенсора для селективного определения фруктозы в водных средах.

Разработан макет биосенсора проточно-инжекционного типа для экспресс-определения БПК5 па основе рецепторных элементов, полученных с использованием дрожжевых микроорганизмов Агхи/а асЗетпоуогат, РШиа angusta и бактерий С1исопоЬас1ег охуЛат. По своим характеристикам биосенсор не уступает зарубежным аналогам. Разработана модификация макета многоканального биосенсора, позволяющая проводить селективную оценку содержания глюкозы, фруктозы, метанола и этанола в диапазоне концентраций от 1,00 до 5,00 мМ по каждому из компонентов с ошибкой не более 18 %. Разработанный биосенсор может служить прототипом для создания опытных образцов приборов для серийного освоения и применения.

3.1.7. Заключение

В таблице 6 приведены сводные данные по параметрам разработанных рецепторных элементов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Арляпов, Вячеслав Алексеевич, Москва

1. Тернер Э., Карубе И., Уилсон Д. Биосенсоры: основы и приложения. М.: Мир. 1992. -614 с.

2. Эггинс Б. Химические и биологические сенсоры. М.: Техносфера. 2005. 336с.

3. Hendry S. P., Higgins I. J., Bannister J. V. Amperometric biosensors // J Biotechnol. 1990 V. 15. №3. P. 229-266.

4. D'Souza S.F. Microbial biosensors // Biosens Bioelectron. 2001. V. 16. P. 337-353.

5. Karube I. Microbial sensor//J Biotechnol. 1990. V. 15. № 3. P. 255-320.

6. Racek J. Cell-based biosensors. Lancaster. Technomic: Publishing Company, Inc. 1995. 107 p.

7. Gilchrist К. H., Barker V. N., Fletcher L. E., DeBusschere B. D., Ghanouni P., Giovangramdi L. L., Kovacs G. T. A. General purpose, field-portable cell-based biosensor platform // Biosens Bioelectron. 2001. V. 16. P. 557-564.

8. Gray S. A., Shaffer К. M., Shubin Y. S., Stenger D. A., Pancrazio J. J. Design and demonstration of an automated cell-based biosensor // Biosens Bioelectron. 2001. V. 16. P. 535-542.

9. De Ley J., Frateur J. Bergey's manual of determinative bacteriology. Eds. Buchanan H.B., Gibson V.K. Baltimor: Williams and Wilkins Co. 1974. P. 251-253; 276-278.

10. Asai K. Acetic acid bacteria: classification and biochemical activities. Baltimore: Univ. Park Press. 1968. 343 p.

11. Pasteur L. Compt. Rend. Sean. Acad. Sci. 1862. V.54. P. 265.

12. Adachi O., Tayama K., Shinagawa E., Matsushita K., Ameyama M. Purification and characterization of particulate alcohol dehydrogenase from Gluconobacter suboxydans // Agric Biol Chem. 1978. V. 42. № 11. P. 2045-2056.

13. Adachi O., Tayama K., Shinagawa E. Purifi cation and characterization of membrane-bound aldehyde dehydrogenase from Gluconobacter suboxydans II Agric. Biol. Chem. 1980. V.44.N3. P. 503-515.

14. Лойцянская M.C. //Успехи микробиологии. 1966. Т.З. С. 47-73.

15. Buchert J. A xylose-oxidizing membrane-bound aldose dehydrogenase of Gluconobacter oxydans ATTC 621 //Journal of Biotechnology 1991. V. 18. P. 103-114.

16. Kulhanek M. //Adv. Appl. Microbiol. 1989. V. 34. P. 141-181.

17. Kulhanek M., Tadra M. // Folia Microbiol. 1977. V. 25. №. 5. P. 373-376.

18. Buchert J., Viikari L. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1988. V. 29. P. 375- 379.

19. Успенская, C.H., Лойцянская M.C. // Микробиология. 1979. Т. 48. № 3. С. 400-405.20