Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимическая диагностика загрязнения объектов окружающей среды

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Ризаева, Елена Петровна, Казань



МИНИСТЕРСТВО РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ОБЩЕМУ И ПРОФЕССИОНАЛЬНОМУ ОБРАЗОВАНИЮ

КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

РИЗАЕВА ЕЛЕНА ПЕТРОВНА

БИОХИМИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОБЪЕКТОВ

ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

03.00.16 - Экология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель:

Кандидат химических наук, доцент Евтюгин Г.А. Научный консультант:

Доктор химических наук, профессор Латыпова В.З.

Казань - 1998

ВВЕДЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ

5

Глава 1. ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ С

ПОМОЩЬЮ БИОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ

(Литературный обзор)................................................................................................13

1.1. Использование холинэстераз .для диагностики загрязнения окружающей среды .............................................................................................................. 13

1.1.1. Общая характеристика холинэстераз................................................ 13

1.1.2. Ингибиторы холинэстераз.................................................................. 22

1.1.3. Холинэстеразные биосенсоры для определения загрязнителей окружающей среды............................................................................. 31

1.2. Экологический контроль загрязнения водной среды................................ 44

1.2.1. Биологический анализ вод.................................................................44

1.2.2. Система ПДК.......................................................................................46

1.2.3. Методы биотестирования................................................................... 53

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ......................................................... 58

2.1. Материалы и реагенты................................................................................... 58

2.2. Приборы и методы эксперимента................................................................ 61

Глава 3. ИЗУЧЕНИЕ ПОВЕДЕНИЯ ХОЛИНЭСЛГЕРАЗНОГО БИОСЕНСОРА В МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ СРЕДАХ..............................................................67

3.1. Определение специфических ингибиторов холинэстеразы.......................67

3.2. Влияние поверхностных факторов на поведение биосенсора.................. 74

3.3. Поведение биосенсоров в многокомпонентных растворах....................... 88

Глава 4. ЭКСПЕРТНАЯ ОЦЕНКА ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПРОМЫШЛЕННЫХ СТОЧНЫХ ВОД......................................................................................................102

4.1. Общая характеристика сточных вод, использованных при разработке экспертной системы..........................................................................................102

4.2. Оценка токсических свойств сточных вод с помощью парамеций и холи-нэстеразного биосенсора............................................................................106

4.3. Экспертная оценка загрязнения сточных вод........................................... ПО

ВЫВОДЫ................................................................................................................. 132

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ.......................................................................................................134

ПРИЛОЖЕНИЕ

150

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

АХЭ - ацетилхолинэстераза;

БПК - биохимическое потребление кислорода, мг 02/л БХИ - бутирилхолин иодад; БуХЭ - бутирилхолинэстераза; ДДВФ - дихлордиметилвинилфосфат;

ПДК - предельно допустимая концентраций загрязнителя, мг/л; СПАВ - синтетическое поверхностно-активное вещество; ХПК - химическое потребление кислорода, змгО/л; ХЭ - холинэстераза; I - ингибитор;

к - константа скорости реакции;

кц - бимолекулярная константа скорости необратимого ингибирования

(мольХл^мтг1; 8 - субстрат ферментативной реакции; г - коэффициент регрессии;

ВВЕДЕНИЕ

Экспресс-оценка загрязнения объектов окружающей среды является необходимым компонентом экологических исследований, включая мониторинг, экологическое нормирование сбросов и выбросов загрязняющих веществ, опенку последствий загрязнения и другие задачи экологического прогнозирования.

В отличие от традиционных методов химического анализа, системы предварительного контроля опасных уровней загрязнения не ориентированы на количественное определение индивидуальных компонентов. Они решают задачу быстрого качественного обнаружения опасного загрязнения объекта тестирования веществом или группой веществ, в некоторых случаях позволяют провести групповую идентификацию загрязнителей и источника его поступления в окружающую среду. Подобный подход реализуется прежде всего, в методах биотестирования {1,21, отличающихся высокой чувствительностью и принятых для оценки токсичности водной среды, почв, осадков сточных вод. В отличие от химических методов экоаналитического контроля, биологические методы более трудоемки, требуют квалифицированного персонала, с трудом поддаются более аппаратурному оформлению. Это сдерживает их широкое внедрение в практику работы природоохранных органов. За исключением некоторых юстированных методик, методы биотестирования остаются в основном средством научных исследований.

Биохимическая диагностика состояния окружающей среды, основанная на изучении воздействия объекта тестирования на скорость ферментативной реакции in vitro, занимает промежуточное положение между химическими и биологическими тест-методами. С одной стороны, так же, как и традиционные методы биотестирования, ферментные диагностикумы имеют четкое токсикологи-

ческое обоснование и достаточно чувствительны к специфическим токсикантам (пределы обнаружения до 10~12 моль/л {3}). Изучение ферментативных реакций позволяет моделировать процессы токсикащш организма на молекулярном уровне, что особенно важно при исследовании новых химических соединений перед юс промышленным производством. С другой стороны, биохимические методы опираются на надежную аппаратурную базу, позволяющую количественно выражать ответные реакции систем. Они легко формализуются и могут быть реализованы в автономном режиме (например, в составе автоматической станции контроля). Соответствующие средства измерения - биосенсоры - при промышленном производстве достаточно дешевы и могут применяться неквалифицированными пользователями, в том числе в быту.

Работы в области биохимических методов экологического мониторинга ведутся, начиная с 70-х годов. Прежде всего, это методики и средства измерения, предназначенные для определения ингибиторов холинэстераз |3]. К ним относятся фосфорорганические и карбаматные пестициды и некоторые фармацевтические препараты. Основная проблема практического использования хо~ лйнэстеразных методов состоит в низкой специфичности отклика. Фермент позволяет диагностировать групповое содержание пестицидов, иншбирующий эффект зависит от многих факторов, таких, как присутствие обратимых ингибиторов холинэстеразы, минерализации и буферной емкости образца и т.д. В результате, несмотря на высокую чувствительность фермента, требуется предварительное концентрирование пробы путем экстракции или препаративного хрома-тографирования, что нивелирует основное преимущество использования фермента - простоту и экспрессность теста.

Альтернативным подходом является применение фермента для общей оценки загрязнения окружающей среды, когда любое изменение ферментатив-

ной активности (активация, ингибирование) является свидетельством изменения компонентного состава, а следовательно, самого факта загрязнения. При этом наблюдаемый отклик не соотносится с качественным и количественным составом образца, а является его обобщенной оценкой, выражением токсичности, как в методах биотетстировання.

Развитие такого подхода опирается на многообразие соединений и факторов, влияющих на активность холинэстеразы, и требует широкого изучения области применения ферментного диагностикума и способов направленного изменения его чувствительности и селективности для решения конкретных задач экологического мониторинга.

Вышесказанное определяет «ель настоящей работы, которая состоит в изучении аналитических и операционных характеристик хояинэстеразного биосенсора для контроля объектов окружающей среды, выявлении экспериментальных факторов, определяющих чувствительность определения специфических ингибиторов в многокомпонентных средах, а также возможность экспертной оценки загрязненности (токсичности) сточных вод на основе обобщенных показателей, включающих антихолинэстеразную активность образца.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи;

- выявить экспериментальные факторы, влияющие На чувствительность и селективность детектирования специфических ингибиторов холинэстеразы -фосфорорганических пестицидов, фторидов, солей тяжелых металлов, в том числе в многокомпонентных средах;

- выявить механизм формирования отклика биосенсора к ингибитору, в том числе влияние природы носителя фермента, сорбции веществ на аналити-

ческие характеристики определения ингибиторов различного механизма действия;

- установить влияние макрокомпонентов тестируемого образца, в том числе органических растворителей, на чувствительность определения специфических ингибиторов, определить способы дифференциации отклика биосенсора на ингибиторы различного механизма действия при их совместном присутствии в растворе;

- произвести скрининг антихолинэетеразной активности промышленных сточных вод и на этой основе разработать экспертную систему оценки загрязненности (токсичности) вод, оценить эффективность статистических методов построения экспертных систем, базирующихся на результатах биохимического тестирования с привлечением других обобщенных физико-химических показателей.

В работе использовали выпускаемые отечественной промышленностью препараты бутирилхолинэстеразы, устойчивые при хранении и иммобилизации и обладающие достаточно высокой чувствительностью к ингибиторам. Для детектирования ферментативной реакции использовался потенци©метрический сенсор - плоский стеклянный рН-метрический электрод.

Актуальность работы обусловлена как растущей потребностью природоохранных служб в методах обобщенной оценки загрязненности (токсичности) объектов окружающей среды, так и необходимостью дальнейшего методического и приборного оснащения биохимических методов экологического мониторинга, внедрения новейших методов биохимической диагностики в Единую государственную систему мониторинга (ЕГСМ) Российской Федерации и Татарстана. Разработка экспрессных, чувствительных и простых в обслуживании ферментных тестов позволит существенно расширить сферу приложения эколо-

гического мониторинга, снизить риск неконтролируемого поступления токсических веществ в биосферу.

Научная новизна и практическая значимость работы заключаются в том, что:

- проведена сравнительная оценка аналитических и операционных характеристик определения обратимых и необратимых ингибиторов с помощью холинэ-стеразы, иммобилизованной на различных носителях;

- на основе изучения влияния различных экспериментальных факторов (условия измерения, присутствие эффекторов, присутствие органического растворителя, материал мембраны) установлен вклад поверхностных процессов (сорбция, массоперенос реагентов) в формирование отклика холинэстеразного биосенсора к ингибиторам различного механизма действия, показана возможность расчета кинетических параметров ингибирования;

- определены пути повышения чувствительности и селективности определения ингибиторов различного механизма действия за счет регулирования гидрофобных свойств ферментсодержащнх мембран и подавления "защитного" эффекта обратимых ингибиторов холинэстераз;

- впервые построена экспертная система оценки загрязненности сточных вод на основе обобщенных показателей, включающих биохимическое тестирование, проведена сравнительная оценка методов построения экспертной системы с помощью традиционных (дискриминантный анализ) и нетрадиционных (нейронные сети прямого распространения и Fuzzy ART Map) статистических методов,

Диссертация выполнена в Лаборатории экологического контроля Казанского государственного университета в рамках выполнения исследований по основному научному направлению "развитие теоретических и прикладных основ экологического мониторинга (рег.№ 0/980006937) при поддержке грантов

РФФИ № 97-03-33210 "Разработка тестовых методов определения ингибиторов гидролитических ферментов с помощью электрохимических биосенсоров", Санкт-Петербургского конкурсного центра N2 97-0-9.5-238 "Методы групповой оценки загрязнителей окружающей среды на основе биохимических тестов и биосенсоров" и программы ФЦНТП "Новые принципы и методы получения химических веществ и материалов", тема 30.05 "Теоретические и практические основы изменения избирательности биоспецифических методов анализа для решения конкретных аналитических задач".

Часть экспериментальных результатов и выводы на их основе использованы в учебном процессе в Казанском государственном университете при чтении общего курса "Экологический мониторинг".

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Международном симпозиуме НАТО "Применение биосенсоров для прямого определения загрязнителей окружающей среды в полевых условиях" (Смояенице, Словакия, 1997 г.), международном симпозиуме ШСО-Сорепцсш "Применение биосенсоров для анализа загрязнителей окружающей среды" (Коимбра, Португалия, 1998), 9 Европейской конференции по электроаналитической химии (Коимбра, Португалия, 1998) на научных конференциях Казанского государственного университета в 1997, 1998 гг.

Основные результаты изложены в 2 статьях и 4 тезисах докладов.

Структура и объем диссертаций. Диссертационная работа изложена на 157 страницах машинописного текста, включает 23 рисунка и 26 таблиц. Состоит из Введения, 4 глав, Заключения, Выводов, Списка использованных библиографических источников, включающего 151 ссылку на отечественные и зарубежные работы, и Приложения.

Положения, выносимые на защиту:

- исследование особенностей функционирования потенциометрического холинэстеразного биосенсора в различных экспериментальных условиях, подбор рабочих условий определения специфических ингибиторов в модельных водных растворах;

- выявление влияния гетерогенных факторов на формирование отклика потенциометрического биосенсора и методы его дифференциации в зависимости от механизма действия ингибиторов холинэстераз;

- оценка кинетических параметров необратимого ингибирования по результатам измерения с помощью потенциометрического биосенсора с накладными холинэстеразными мембранами на основе промышленно выпускаемых носителей;

- оценка аналитических характеристик определения ингибиторов в многокомпонентных средах, включая реальные образцы промышленных сточных вод;

- построение экспертной системы оценки загрязнения сточных вод на основе обобщенных показателей качества вод, токсичности и антихолинэсте-разной активности;

- сравнительная оценка эффективности статистических методов построения экспертной системы с помощью дискриминантного анализа и искусственных нейронных сетей.

Автор выражает признательность начальнику Центральной специализированной инспекции аналитического контроля (ЦСИАК) Минприроды РТ Шаги-дуллину P.P. за возможность проведения исследований в области экспертной оценки загрязнения промышленных сточных вод, сотрудникам сектора биотестирования ЦСИАК Минприроды РТ Н.Ю.Степановой и к.б.н. А.М.Петрову за

помощь в проведении экспериментов по биотестированию сточных вод и доценту кафедры моделирования экосистем КГУ к.ф.-м.н.А.А.Савельеву за предоставленные программы построения экспертных систем на базе нейрокомпью-терных технологий.

Глава 1» ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ С ПОМОЩЬЮ БИОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ

(Литературный обзор) $

1.1. Использование холинэстераз для диагностики загрязнения окружающей среды

1.1.1. Общая характеристика холинэстераз

Ферменты - катализаторы белковой природы - обеспечивают протекание всех биохимических реакций в живых организмах [4]. Уникальность ферментов как катализаторов состоит прежде всего в их высокой каталитической активности. Например, добавки незначительных количеств (10~8-Ю~9 моль/л) уреазы или ацетилхоли н эстеразы (АХЭ) вызывают увеличение скорости превращения субстрата (мочевины и ацетилхол и на) в 101 1011 раз, причем катализ осуществляется при достаточно низких температурах, обычно в диапазоне 20-40°С [5,6].

Другое важное свойство ферментов - избирательность действия (специфичность) в отношении структуры субстрата. Некоторые ферменты обладают абсолютной специфичностью, катализируя превращение только одного соединения (например, уреаза - гидролиз мочевины) и не реагируя с его производными (другими амидами). В других случаях специфичность проявляется в отношении условий реакции. Так, химотрипсин осуществляет гидролиз амид-ной связи в пептидах в нейтральной среде, тогда как пепсин - только в кислой, щелочная фосфатаза катализирует расщепление органофосфатов при рН 8-10, а кислая фосфатаза - при рН 3-4. Эти и ряд других свойств ферментов обусловлены весьма сложным ме