Электрохимические биосенсоры на основе иммобилизованной алкогольоксидазы и целых клеток метилотрофных дрожжей для определения содержания низших спиртов

Зайцев, Максим Геннадьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Электрохимические биосенсоры на основе иммобилизованной алкогольоксидазы и целых клеток метилотрофных дрожжей для определения содержания низших спиртов
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Электрохимические биосенсоры на основе иммобилизованной алкогольоксидазы и целых клеток метилотрофных дрожжей для определения содержания низших спиртов"

Па правах рукописи

ЗАЙЦЕВ МАКСИМ ГЕННАДЬЕВИЧ

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ АЛКОГОЛЬОКСИДАЗЫ И ЦЕЛЫХ КЛЕТОК МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ Д ЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ

НИЗШИХ СПИРТОВ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

3 ОКТ 2013

Москва - 2013

005533858

Работа выполнена на кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета и в лаборатории биосенсоров Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН)

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент Тульского государственного университета Понаморева Ольга Николаевна

Официальные доктор биологических наук, профессор, главный

оппоненты: научный сотрудник лаборатории

функциональной гистохимии Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Буданцев Аркадий Юстнанович

доктор химических наук, доцент, старший научный сотрудник лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН

Демидюк Илья Валерьевич

Ведущая организация: Белгородский государственный национальный

исследовательский университет

Защита диссертации состоится «21» октября 2013 года в 16 часов 30 минут на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова (МИТХТ им. М.В. Ломоносова) по адресу 119571 Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.ВЛомоносова по адресу: г. Москва, пр. Вернадского, д.86

Автореферат разослан «19» сентября 2013 г. Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник /' А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

При производстве и хранении вин, пива, осуществлении контроля биотехнологических процессов возникает необходимость экспресс-анализа содержания спиртов в спиртосодержащих жидкостях и ферментационных средах. Традиционно этанол в пищевой и водочной продукции определяют ареометрическим, пикнометрическим и рефрактометрическим методами. Эти методы имеют ограничения в применении к спиртосодержащим жидкостям, в состав которых входят другие вещества. Для определения микроколичеств спирта применяют методы газо-жидкостной и газовой хроматографии с капиллярными или насадочными колонками с использованием пламенно-ионизационного детектора или катарометра. Однако, несмотря на низкие пределы обнаружения спиртов, общими недостатками хроматографических методов являются сложность применяемого оборудования, в некоторых случаях - пробоподготовки, а также длительность анализа. Следует отметить, что метод газовой хроматографии применяют для определения содержания примесей в этиловом спирте. Для определения спиртов успешно разрабатываются ферментативные методы, имеющие высокую чувствительность (пределы обнаружения спиртов 1 х 1С6 - 1 х КГ* М) и селективность. При разработке экспрессных методов биоанализа перспективным направлением является применение биосенсоров, которые характеризуются доступностью, простотой аппаратурного и методического оформления, удовлетворительными уровнями чувствительности и избирательности, экспрессностыо и экономичностью, а также возможностью миниатюризации подобных биоаналитических устройств.

В биосенсорах для экспресс-определения содержания спиртов наиболее часто используют фермент алкогольоксидазу (АО) (КФ 1.1.3.13). В последние годы разработке и применению биосенсоров на основе АО посвящено значительное число публикаций, что свидетельствует об актуальности данного направления биоаналитической химии. Среди всех сенсоров на основе иммобилизованной АО для определения этанола наибольшее развитие получили электрохимические биосенсоры, в которых определение проводится по изменению содержания кислорода в приэлектродном пространстве или по образованию пероксида водорода. Проводимые исследования направлены на разработку портативных и удобных для потребителя биоаналитических устройств, совершенствование аналитических параметров биосенсоров, которые часто определяются свойствами гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных алкогольоксидаз.

Основным источником алкогольоксидазы являются метилотрофные дрожжи. Метилотрофные дрожжи могут содержать до 30-40 % АО от общего содержания белков в клетке, поэтому наряду с использованием АО в качестве биорецепторных элементов биосенсоров можно использовать целые клетки микроорганизмов. Их применение имеет ряд преимуществ, к которым относятся технологически простая процедура изготовления этих элементов и

существенное сокращение стоимости анализа. В некоторых случаях важно определять суммарное содержание легко утилизируемых соединений. Так, одной из важных проблем является мониторинг сточных вод спиртовых производств, которые характеризуются высоким содержанием органических загрязнений, что приводит к гибели естественных, экосистем вокруг таких предприятий. Поэтому для экспресс-анализа в некоторых случаях целесообразно использовать биосенсоры, биораспознающие элементы которых содержат целые клетки микроорганизмов. Следует отметить, что биосенсоры, предназначенные для экологического контроля стоков спиртовых заводов, можно использовать и для мониторинга ферментационных процессов на этих производствах. Создание биосенсорного анализатора со сменными биораспознающими элементами является актуальной задачей.

Таким образом, несмотря на интенсивно проводящиеся исследования по разработке биосенсоров для спиртовых производств существуют научные и научно-технические проблемы, которые необходимо решать, чтобы упростить и удешевить процедуру определения спиртов без потери точности и специфичности, а также обеспечить возможность их постоянного мониторинга. Актуальными задачами при разработке биосенсоров для анализа низших спиртов, в частности, этилового, являются увеличение времени функционирования иммобилизованного биокатализатора в

распознающих/рецепторных элементах биосенсора, вопросы чувствительности и повышение стабильности работы биосенсора, которые в конечном счете определяются стабильностью биорецепторного элемента. Решение описанных проблем может осуществляться, с одной стороны, выбором наиболее эффективных биокатализаторов - штаммов микроорганизмов или выделенных из них белков - алкогольоксидаз, с другой стороны разработкой новых методик иммобилизации биоматериала, обеспечивающих длительное время функционирование биосенсора при сохранении высокой активности биокатализатора.

Цель работы:

Разработка биотехнологических и химико-аналитических основ создания электрохимических биосенсоров на основе целых клеток метилотрофных дрожжей и выделенной из них алкогольоксидазы для определения содержания низших спиртов.

В рамках указанной цели решались следующие задачи:

- На основе содержания белка и удельной активности алкогольоксидазы в биомассе метилотрофных дрожжей различных штаммов провести выбор наиболее эффективного источника для получения целевого фермента.

- Получить биочувствительные элементы для модификации электрода электрохимических биосенсоров на основе иммобилизованных дрожжевой алкогольоксидазы и целых клеток метилотрофных дрожжей.

- Провести сравнительный анализ метрологических и аналитических характеристик биосенсоров на основе выделенных в работе и коммерчески доступных алкоголъоксидаз.

- Сравнить эксплуатационные и аналитические характеристики биосенсоров для определения содержания этанола в кюветном и проточно-инжекционном форматах анализа

- Апробировать разработанные макет!,I электрохимических биосенсоров на спиртосодержащих образцах в сравнении с референтными методами.

Научпая новизна

Разработаны способы получения чувствительных биораспознающих элементов сенсоров для определения содержания спиртов путем иммобилизации фермента алкогольоксидазы на нитроцеллюлозной мембране, модифицированной бензохиноном или бензохиноном с ДЭАЭ-декстраном. Взаимодействие фермента с поверхностью обусловлено, в первом случае, образованием ковалентных связей между функциональными группами на поверхности белка, и, во втором случае, электростатическим взаимодействием отрицательно заряженной белковой молекулы фермента с положительно заряженной поверхностью мембраны

Впервые установлено, что возможно взаимодействие между положительно заряженной мембраной, модифицированной ДЭАЭ-декстраном, и поверхностью клеток метилотрофных дрожжей. Время функционирования полученных на основе такого взаимодействия гетерогенных биокатализаторов составляет 14 суток.

Впервые выполнен сравнительный анализ метрологических и аналитических характеристик биосенсоров на основе выделенных в работе и коммерчески доступных алкогольоксидаз. Выделенная из Н. ро1утогрИа ЫСУС 495 1п алкогольоксидаза характеризуется наибольшей удельной активностью (50 Е/мг), а биосенсор на ее основе характеризуется лучшими аналитическими параметрами. Выявлено, что чувствительность биораспознающих элементов, полученных иммобилизацией фермента на положительно заряженной мембране, в первую очередь, зависит от активности используемой алкогольоксидазы.

Сравнительный анализ эксплуатационных и аналитических характеристик биосенсорного определения содержания этанола двумя способами с применением кюветного и проточно-инжекционного макетов биосенсора показал, что проточно-инжекционный формат анализа позволяет повысить селективность, расширить линейный диапазон определения и снизить время единичного анализа.

Практическая значимость

Отработанная методика лабораторного выделения дрожжевой алкогольоксидазы с использованием полуавтоматической хроматографической установки может использоваться как основа при производстве дрожжевой алкогольоксидазы Н. ро1утогрка МСУС 495 1п.

Разработанная методика иммобилизации биокатализатора (фермента алкогольоксидазы и целых клеток метилотрофных дрожжей) на нитроцеллюлозной мембране, модифицированной ДЭАЭ-декстраном, позволяет получать стабильные биочувствительные поверхности, которые можно использовать для тиражирования стандартных биораспознающих элементов сенсоров.

Разработаны и апробированы макеты биосенсора кюветного и проточно-инжекционного типа для определения содержания низших спиртов - метанола и этанола в водных средах. Методика анализа с использованием разработанных макетов биосенсора характеризуется быстротой, высокой чувствительностью, низкой стоимостью и позволяет проводить мониторинг содержания спирта в процессе брожения, его остатков в барде, и выполнять анализы не только в специализированных лабораториях, что особенно важно при очистке сточных вод ферментационных производств.

Работа вносит практический вклад в разработку быстрых методов анализа на основе биосенсоров и позволяет в перспективе производить недорогие и эффективные анализаторы. Макеты биосенсоров могут быть использованы в научных исследованиях, в учебном процессе и как прототипы опытных образцов приборов для серийного выпуска на базе гальванопотенциостатов, внесенных в Государственный реестр средств измерений.

Апробация работы и публикации

Результаты работы докладывались на VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 19-22 марта 2013 г.) (медаль конкурса); Всероссийских конференциях с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология» (Тула, 2010, 2011 и 2012 гг. (диплом победителя конкурса)); 14-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века». (Пущино, 19-23 апреля 2010 года); Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Биология будущего: традиции и новации» (Екатеринбург, 1-5 октября, 2012 г), Международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск, МГУ им. Н.П. Огарева, 3-5 октября 2012 г.). Московская международная научно-практическая конференция «БИОТЕХНОЛОГИЯ: экология крупных городов» (Москва 15-17 марта 2010 г.) (диплом, медаль конкурса). По теме диссертации опубликовано 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК, 10 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций.

Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнялась на кафедре Химии ЕНФ «ТулГУ», а так же в лаборатории биосенсоров Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) в рамках проектов ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (ГК № 16.740.11.0766, и ГК № 14.В37.21.0561). Автор работы является победителем конкурса Программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса», реализуемой Фондом содействия развитию малых форм

предприятий в научно-технической сфере в 2012 г. (г. Тула), госконтракт № 11419р/17125.

Благодарности. Автор благодарен коллективам кафедр химии и биотехнологии Тульского государственного университета за неоценимую помощь в проведении исследований и интерпретации полученных результатов. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям -к.х.н., проф. Алферову В.А., к.х.н., доц. Понаморевой О.Н. и д.х.н., проф. Решетилову А.Н.

Структура и объем работы

Работа состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Результатов и их обсуждения, Выводов и Списка использованной литературы. Диссертационная работа изложена на 122 страницах, содержит 41 рисунок и 27 таблиц. Список литературы включает 134 источника.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложены актуальность темы, научная новизна и практическая значимость работы, сформулированы цель и задачи исследования.

Глава 1. В первой главе приводится анализ научно-технической литературы, посвященной исследованиям по аналитическому применению биосенсоров для определения содержания низших спиртов.

Глава 2. Во второй главе дано описание методов исследования. В работе использованы: штаммы метилотрофных дрожжей Candida boidinii ВКМ Y-2356, Pichia angusta ВКМ Y-2559, Pichia angusta ВКМ Y-2518, Pichia angusta В KM Y-1397 (Всероссийская коллекция микроорганизмов ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН), Hansemila polymorpha NCYC 495 In. (предоставлен для исследований Решетиловым А.Н., зав. лабораторией биосенсоров ИБФМ РАН), ферментные препараты алкогольоксидазы, выделенные из перечисленных выше микроорганизмов, коммерчески доступные препараты алкогольоксидазы: АО (Candida boidiini (Sigma)), АО (Hansenula sp. (Sigma)), AO (Pichia pastoris (Sigma))

Культнвирование микроорганизмов

Метилотрофные дрожжи культивировали на минеральной среде следующего состава: (NH4)2S04(2.5r.), MgS04 (0.2г.), К2НР04(0.7г.), NaH2P04 (Зг.), дрожжевой экстракт (Тип д) (0.5 г.), DL Лейцин (0.17г.), глицерин (8.3мл), микроэлементы(1мл), все количества приведены на 1 литр питательной среды. Микроорганизмы выращивали методом периодического культивирования в колбах Эрленмейера объёмом 750мл. Длительность единичного цикла составляла 30-40 часов (получение максимального количества активных клеток с последующей индукцией метанолом). Выращенные до поздней логарифмической фазы микроорганизмы центрифугировали (10 минут, 8000g), трижды промывали фосфатным буферным раствором. Биомассу микроорганизмов хранили при -20°С.

Выделение фермента алкогольоксидазы

В качестве источника АО в работе использовали метилотрофные дрожжи С. boidinii ВКМ Y-2356 P. angusta ВКМ Y-2518, Р. augusta ВКМ Y-1397, Р. augusta ВКМ Y-2559, Н. polymorpha NCYC 495 In. Методика выделения фермента включала следующие этапы: разрушение дрожжевых клеток на ультразвуковом дезинтеграторе, ступенчатое осаждение белков сульфатом аммония, ионообменная хроматография на ДЭАЭ-сефарозе с использованием полуавтоматической установки для препаративного разделения белков Biologic LP (BIO-RAD), концентрирование АО. Характеристики биопрепарата на всех стадиях очистки проводили методом электрофореза в ПААГ.

Клетки разрушали на ультразвуковом диспергаторе, отделяли нерастворимые клеточные остатки центрифугированием (8000g). Супернатант ступенчато фракционировали сульфатом аммония в диапазоне концентрации сульфата аммония 20-100% от насыщения. На всех стадиях высаливания определяли удельную активность ферментных препаратов и содержание белка в супернатанте и осадке. Последующую очистку АО от сторонних белков проводили с использованием ионообменной хроматографии. Десорбцию АО проводили фосфатным буферным раствором, содержащим хлорид калия (1М), с линейно возрастающим процентным содержанием KCl в конечной смеси (0100%).

Активность алкогольоксидазы

Активность алкогольоксидазы определяли спектрофотометрическим методом. Методика основана на реакции взаимодействия красителя ABTS(2,2'-азинобис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота)) с пероксидом водорода, образующимся при окислении метанола кислородом под действием алкогольоксидазы. За единицу активности фермента принимается такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата (1 мкмоль = 10"6 моль) за 1 мин при 25°С в оптимальных условиях действия фермента.

Иммобилизация биоматериала

Для иммобилизации АО использовали следующие методики:

1) Иммобилизация АО с помощью бензохинона

Нитроцеллюлозную мембрану инкубировали в водном растворе бензохинона (0.5 М) в течение 24ч, при 20°С в отсутствие доступа света. Мембрану тщательно отмывали бОмМ фосфатньм буферным раствором pH 7.6. Между измерениями ферментсодержащие мембраны хранили при 4°С в фосфатном буферном растворе pH 7.6.

2) Иммобилизация АО с помощью ДЭАЭ-декстрана

Для увеличения площади поверхности основы биорецепторного элемента, отмытую активированную бензохиноном мембрану инкубировали при 20°С в течение 24ч в 1М растворе Na2C03, содержащем Ю^М водорастворимого диэтиламиноэтилдекстрана (ДЭАЭ-декстран) (50мг/мл, Мг = 500 кДа, Диа-М, Россия). Затем мембрану последовательно отмывали 1М раствором Na2C03, IM раствором NaCl и дистиллированной водой. Обработанные таким образом мембраны инкубировали в течение 24 ч при 40°С с раствором АО (0.2 мл

фосфатного буферного раствора рН 7.6; 5 мг фермента). Мембрану тщательно отмывали бОмМ фосфатным буфером рН 7.6. Между измерениями фермент-содержащие мембраны хранили при 4°С в фосфатном буферном растворе рН 7.6.

3) Иммобилизация дрожжевых клеток адсорбцией па стекловолокоиные фильтры GF/A

Дрожжевые клетки ресуспендировали в фосфатном буферном растворе рН=7.6, затем отбирали небольшое количество клеток (50 - 100 мг осажденной биомассы) и разбавляли этим же буферным раствором в соотношении 1:16 (по массе). Получившуюся суспензию наносили в количестве 5 мкл на фрагмент стекловолоконного фильтра GF/A (Whatman, Великобритания) размером 3*3 мм2 и высушивали в течении 5-10 мин на открытом воздухе. Содержание осажденной биомассы клеток в конечном биорецепторном элементе составляло -30 мкг исходной биомассы /мм2. Полученный биорецептор закрепляли на мембране кислородного электрода защитным нейлоновым колпачком.

4) Иммобилизация микроорганизмов с помощью ДЭАЭ-декстрана на нитроцсллюлозной мембране. 200 мкл раствора бензохинона (0.5 М) смешивали с 10 мг ДЭАЭ-декстрана, при этом бензохинон присоединялся к гидроксильной группе мономера ДЭАЭ-декстрана. Для дальнейшей работы отделяли систему ДЭАЭ-декстран-бензохинон (система А) от свободного бензохинона. Для этого использовали колонку с сорбентом (сефадекс G-25). 400 мкл системы А смешивали со 100 мг биомассы метилотрофных дрожжей. После перемешивания в систему помещали несколько фрагментов нитроцелшолозной мембраны размером 3Х3 мм2 и оставляли в холодильнике при +4°С на 24 ч. Фрагменты мембраны с иммобилизованными микроорганизмами промывали фосфатным буферным раствором (рН = 7.6) и закрепляли па поверхности электрода.

Бносенсорный анализ

Кюветный способ регистрации сигнала. Измерения проводили с помощью кислородного электрода типа Кларка (Кронас, Россия) и гальванопотенциостата IPC2L (Вольта, Россия), интегрированного с персональным компьютером. Средняя величина тока, соответствующая содержанию кислорода в дистиллированной воде составляла 30 нА при шуме ±0.25 нА. Измерительную ячейку заполняли 4 мл фосфатного буферного раствора рН=7.6, концентрация солей составляла 60 мМ. Перемешивание производили магнитной мешалкой с частотой 200 об/мин. Измеряемым параметром являлась максимальная скорость изменения сигнала биосенсора. Определение содержания этанола в полупродуктах брожения определяли с использованием портативного кислородного анализатора кюветного типа Эксперт -001 (Эконикс-ЭКСПЕРТ). Измерительную ячейку заполняли 3 мл фосфатного буферного раствора рН=7.6, концентрация солей составляла 60 мМ. Перемешивание производили магнитной мешалкой с частотой 200 об/мин. Измеряемым параметром являлась амплитуда изменения содержания растворенного кислорода в кювете (Дмг/л).

Проточио-инжекциоиный (ПИ) способ регистрации сигнала. Макет биосенсора проточно-инжекционного типа для определения содержания спиртов в водных средах был разработан на базе анализатора растворенного кислорода «Биолан», созданного в рамках программы РАН и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере. Время анализа составляет 300 с, котором}' предшествовала фаза введения системы в режим измерения (100 с). Измерение завершается фазой промывки (100 с). В работы использовали калий натрий фосфатный буферный раствор рН=7.6 с концентрацией солей 60 мМ. Измеряемым параметром (откликом биосенсора) является максимальная скорость изменения сигнала. Обработка результатов проводилась с помощью встроенной программы «Biolan 1010».

Обработку экспериментальных данных проводили с помощью компьютерных программ «Microsoft Excel» и «Sigma Plot 11.0».

Определение содержания спиртов референтным методом

Определение содержания спиртов и других летучих полярных соединений проводили методом газовой хроматографии на хроматографе марки «Кристалл 5000.2» (СКБ Хроматэк) в соответствии со стандартными методиками. Условия проведения анализа: колонка DB-FFAP (США) 50м><0,32ммх0,50мкм; газ-носитель — гелий; температура термостата — 75 °С; температура испарителя (инжектора) -— 200 °С.; детектор ионизации в пламени (ДИП), температура детектора 250 °С; скорость потока газа-носителя — 0,144 дм3/ч.

Глава 3. В третьей главе приведены основные результаты работы и их обсуждение.

Выбор штамма — продуцента АО и выделение фермента АО из метилотрофных дрожжей

Ранее показано, что от условий культивирования метилотрофных дрожжей зависит экспрессия изоформ АО, каталитическая активность которых различается. Для коммерческого применения АО предпочтительны ферментные препараты, выделенные из биомассы дрожжей, полученных на поздней логарифмической фазе роста на метаноле в условиях периодического культивирования, при этом у дрожжей доминирует экспрессия изоформы АО с наибольшим сродством к метанолу. Однако метанол является неэффективным субстратом для культивирования биомассы, поэтому было предложено использовать другой субстрат как источник углерода и энергии с последующей индукцией метанолом. Известно, что АО метилотрофных дрожжей содержит минорный белок х-АОР, который выделяется в комплексе с основным ферментом. Комплекс основного АО и минорного х-АОР белков способен окислять глюкозу наряду со спиртами, что необходимо учитывать при разработке алкобиосенсоров. Применение глюкозы в качестве ростового субстрата приводит интенсивному накоплению биомассы дрожжей, но глюкоза является репрессором как х-АОР, так и АО. Изучение индукции этих ферментов, проведенное ранее нашими коллегами, показало, что глицерин препятствует экспрессии х-АОР, но не АО. Они предложили использовать в

качестве источника АО без х-АОР выращенные на глюкозе клетки дрожжей после их индукции глицерином. Нами было предложено использовать глицерин в качестве источника углерода и энергии с последующей индукцией АО метанолом.

Таблица 1. Характеристика ферментных препаратов, выделенных из биомассы дрожжей Р. angusta У-2559, выращенных на глицерине с индукцией метанолом

и без индукции метанолом (1% об)

№ образца Дрожжевая алкогольоксидаза Содержание белка, мг/мл Удельная активность, мкмоль/с-л-мг

1 с индукцией метанолом 329 38

2 без индукции метанолом 173 19

Индукция дрожжей метанолом приводит к увеличению содержания белка в биомассе и удельной активности АО в ферментном препарате. Известно, что дрожжи родов Pichia и Hansenula и некоторых других являются наиболее эффективными источниками АО. Для выбора конкретного штамма использовали метилотрофные дрожжи С. boidinii ВКМ Y-2356, Pichia angusta, представленные во Всероссийской коллекции микроорганизмов РАН (Р. angusta ВКМ Y-2518, P. angusta ВКМ Y-1397, P. angusta ВКМ Y-2559), и Я. polymorpha NCYC 495 In.

Выделение АО осуществляли с использованием фракционного высаливания белков и последующей очистки ферментного препарата с помощью метода ионообменной хроматографии, которую модифицировали в ходе выполнения исследований. При проведении высаливания белкового препарата необходимо было подобрать диапазон концентраций сульфата аммония, позволяющий осадить АО. Для этого проводили последовательное увеличение концентрации сульфата аммония в растворе (интервал: 10-20% от насыщения). Образующийся осадок отделяли центрифугированием (8000g, Юмин.). На каждом этапе определяли содержание и удельную активность фермента как в супернатанте, так и в белковом осадке. На рисунке 1 представлена зависимость общего содержания белка и удельной активности ферментного препарата на каждой стадии высаливания.

Наибольшая удельная активность АО соответствует фракции осажденных белков при концентрации сульфата натрия 50% и 70% от насыщения. Подобное распределение наблюдалось при выделении АО из всех используемых в работе штаммов метилотрофных дрожжей. Фракции с максимальной удельной активностью АО были объединены и использовались на окончательном этапе очистки. Удаление сопутствующих белков проводили с использованием полуавтоматической установки для препаративной хроматографии Biologie LP с колонкой (10см* 2см) заполненной ионообменным сорбентом анионообменного типа ДЭАЭ-сефарозой. Применение такой системы позволяет автоматизировать и оптимизировать процедуру очистки целевого фермента, а также дает возможность увеличения масштабов получения АО. Это важно для практического применения получаемого фермента.

500 450 400 350 300 250 200 -150 100 50 -0 0 масса белка, мг В Удельная активность, Е/мг

- Т"!"

- 1 Щ Ш

ЕЯ .......... ■V Ни i.. EÍLbL.--..............сэ_

СН 20% Осадок СН 50% Осадок СН 70% Осадок СН Осадок 20% 50% 70% 100% 100%

Рисунок 1 Общее содержание белка и удельная активность АО на разных стадиях высаливания.

В ходе проведения хроматографии были подобраны условия, позволяющие наиболее полно провести процесс ионообменной очистки АО от сторонних белков: время хроматографии - 120 минут, скорость подачи раствора - 0.5мл/мин. В этих условиях белки полностью удаляются с носителя в виде отдельных компонентов. Следует отметить, что молекулярная масса АО составляет примерно бООкДа, что позволяет концентрировать очищенный ферментный препарат с использованием концентрирующих центриконов (фильтр на 100 кДа).

По отработанной методике АО была выделена из всех штаммов метилотрофных дрожжей, выбранных для исследования (табл. 2)

Таблица 2 Значения удельной активности и содержание белка в ферментных препаратах АО, выделенной из различных штаммов метилотрофных дрожжей___

Название штамма-продуцента АО Содержание белка, мг/мл Удельная активность фермента, Е/мг белка

Р. augusta В KM Y-2518 42 46

Р. augusta ВКМ Y-2559 25 38

Р. augusta ВКМ Y-1397 35 15

Н. polymorpha NCYC 495 In 50 55

С. boidinii Y-2356 15 2

Удельная активность АО, выделенной из штамма Н. polymorpha NCYC 495 In выше удельной активности АО, выделенной из других исследуемых штаммов, значительное содержание белка и высокая активность выделенного фермента свидетельствуют о перспективности использования данного штамма для получения препарата алкогольоксидазы. АО, выделенную из Н. polymorpha NCYC 495 In, использовали как основу биорецепторных элементов биосенсора для определения содержания спиртов.

Для установления степени чистоты ферментных препаратов АО из различных штаммов мегилотрофных дрожжей использовали нативный электрофорез в ПААГ. В качестве фермента сравнения представлен коммерческий препарат АО из дрожжей Candida boidinii. Небольшое отклонение пробега белка можно объяснить тем, что коммерческий препарат АО выделен из дрожжей Candida boidinii, а молекулярная масса может

отличаться для АО, выделенной из различных штаммов._

1) препарат АО из P. angusta ВКМ Y-2559

! 2) препарат АО из P. angusta ВКМ Y-

I ?97

3) препарат АО из

1 " Н. polymorpha NCYC 4951п

" i 4) препарат АО из P. angusta ВКМ Y-

ЦЗ 2518 после стадии осаждения белков

¿Jf , сульфатом аммония (70% от насыщения)

5) препарат АО из P. angusta ВКМ Y-2518

6) препарат АО изС. Boidinii ВКМ Y-2356

7) коммерческий препарат АО из Candida boidinii

Рисунок 2 Электрофореграмма ферментных препаратов АО из пяти штаммов метилотрофных дрожжей.

Образец под номером 4 представляет собой белковую фракцию осаждённую сульфатом аммония на начальной стадии очистки. На электрофореграмме для этого препарата помимо полосы, соответствующей АО, наблюдается белковый след на всем протяжении пробега, что свидетельствует о необходимости проведения ионообменной хроматографии. В качестве белка для сравнения использовали представлен коммерческий препарат АО. Стоит отметить, что ферментные препараты АО после проведения ионообменной

хроматографии и последующего концентрирования на представленном рисунке 2 характеризуются четкой одиночной белковой полосой и, следовательно, не содержат значимого количества посторонних белковых включений.

Иммобилизация АО для получения биораснознающих элементов биосенсоров для определения низших спиртов

Одной из важнейших задач исследования являлась разработка биораспознающих элементов, отличающихся высокими уровнями чувствительности, операционной и долговременной стабильностью, необходимым уровнем селективности. Следует отметить, что основным методом очистки АО от других белков является ионообменная хроматография с применением ДЭАЭ-сефарозы в качестве неподвижной фазы. Это обусловлено высокой степенью взаимодействия положительно заряженного сорбента с анионными группами белка. В работе использовали эту особенность для получения биочувствительных поверхностей с иммобилизованной АО. Активацию поверхности проводили двумя способами — бензохиноном и бензохиноном с последующей обработкой ДЭАЭ-декстраном. Взаимодействие безохинона с гидроксильными группами нитроцеллюлозной мембраны приводит к появлению на ее поверхности активированных функциональных групп, способных взаимодействовать с аминогруппами белков или гидроксильными группами декстрана. Для иммобилизации на активированные поверхности мембраны использовали АО из Н.ро1утогрИа ЫСУС 4951п.

А Б

Рисунок 3 Иммобилизация алкогольоксидазы на нитроцеллюлозную мембрану с использованием бензозинона. На рисунке К'-МН2 молекула АО. А -активация поверхности мембраны бензохиноном; Б - ковалентное взаимодействие белка с активированной мембраной

А Б

Рисунок 4 Иммобилизация АО с помощью ДЭАЭ-декстрана. А-активация мембраны ДЭАЭ-декстраном; Б — присоединение белка к активированной мембране

Для выявления наиболее подходящего способа иммобилизации проводили сравнение величины ответа биосенсора кюветного типа с различными рецепторными элементами при внесении в кювету метанола (0.25мМ) в качестве анализируемого вещества. Для каждого биорецепторного элемента проводили по 10 параллельных измерений. Величина ответа для биорецепторного элемента с АО, иммобилизованной с помощью бензохинона, составила 0.83±0.04нА/с, а для элемента с АО, иммобилизованной с помощью бензохинона и ДЭАЭ декстрана 1.87±0.07 нА/с. Следует отметить, что величина ответа для второго рецепторного элемента в 2 раза превышает значение для рецепторного элемента с АО, иммобилизованной с помощью бензохинона, при этом величины ошибки сопоставимы и не превышают 5%. На основании полученных результатов для дальнейшей работы был выбран рецепторный элемент на основе АО, иммобилизованный с помощью бензохинона и ДЭАЭ декстрана.

Влияние формата проведения анализа на селективность биосенсорного определения низкомолекулярных спиртов

Важной характеристикой анализа является его селективность. В случае биосенсорного анализа селективность определяется субстратной специфичностью фермента, способом иммобилизации биоматериала, форматом проведения анализа. Биосенсорные анализаторы кюветного типа характеризуются более простым аппаратурным оформлением, что позволяет использовать подобные устройства в полевых условиях. В то же время,

использование проточной системы дает возможность проводить постоянный мониторинг содержания определяемых веществ. Кюветный и ПИ формат анализа различаются как по объему вносимого вещества, так и временем контакта рецепторного элемента с определяемым веществом, поэтому необходимо было оценить влияние формата проведения анализа на селективность разработанных рецепторных элементов биосенсора. Для оценки селективности определения низкомолекулярных спиртов была определена специфичность биосенсорных систем при использовании двух форматов анализа (рис. 5).

кюветный формат анализа ® ПН-формат анализа

............¿А........................аЬь............

Л»

¿г

«г

Рис. 5. Специфичность биосенсоров на основе иммобилизованной АО: при использовании юоветного и проточно-инжекционных форматов анализа

При проведении анализа в ПИ формате селективность биосенсорного определения метанола и этанола увеличивается. Вероятно, что при снижении времени контакта биорецепторного элемента с пробой в проточной системе транспорт субстрата к активным центрам иммобилизованного фермента становится одним из определяющих факторов и вносит вклад в величину ответа биосенсора. В то же время, необходимо отметить, что селективное определение этанола с помощью алкогольоксидазных сенсоров невозможно в присутствии метанола и формальдегида.

Для определения диапазона определяемых концентраций этанола при использовании биосенсорных систем кюветного и ТТИ типа необходимо было построить градуировочные зависимости величины ответов биосенсора от концентрации определяемого вещества. Градуировочные зависимости биосенсоров кюветного и проточно-инжекционного типа имеют гиперболический вид в широком диапазоне концентраций (0,015 - 8 мМ), их аппроксимацию проводили с помощью уравнения типа Михаэлиса-Ментен, описывающего экспериментальную зависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата. Для снижения ошибок анализа предпочтительно использовать линейные участки градуировочных зависимостей (рис. 6). Аналитические и метрологические характеристики биосенсорных систем кюветного и ПИ типов приведены в таблице 3.

2,5

Ответ биосенсора, нА/с

• 1 сутки

7 сутки

♦ 12 сутки

13 28 сутки

5 6

Концентрация этанола, мМ

Рис. 6 Линейные участки градуировочных зависимостей ответа биосенсора от концентрации этанола при различном времени хранения рецепторного элемента с иммобилизованной АО. Биосеисорная система ПИ типа.

Таблица 3. Аналитические и метрологические характеристики

Характеристика биосенсора Способ подачи пробы

ПИ кюветный

предел обнаружения, мМ 0.014 ±0.002 0.015 ±0.003

Верхняя граница линейного диапазона определяемых концентраций, мМ 8±1 0.38 ±0.01

Коэффициент чувствительности, нА/смМ 0.34±0.05 2.14±0.03

Время отклика, концентрация субстрата равна 1мМ, с 85-95 130-150

Период измерения, с 200 340

Повторяемость, отклонение от среднего значения за 15 измерений, % 6 4.5

Предел обнаружения и сходимость результатов сопоставимы для двух форматов анализа, однако, линейный интервал определяемых концентраций больше при выполнении анализа в проточно-инжекционном формате. Временные затраты метода, то есть показатель экспрессности, определяются в первую очередь длительностью единичного измерения. Время отклика в проточно-инжекционной системе составляет 85-95 секунд; время восстановления активности рецепторного элемента после измерения составляет около 110 с. В кюветной системе время единичного измерения составляет 130150 с; восстановление активности рецепторного элемента после измерения требует около 200 с. Полный цикл анализа для биосенсоров двух типов не превышает 6 минут.

Полученные результаты показывают возможность применения действующих макетов биосенсоров как прототипов опытных образцов приборов для серийного освоения и применения.

Сравнительная эффективность биорецепторных элементов на основе выделенной АО и коммерчески доступных препаратов.

Дрожжевая АО является коммерческим препаратом с достаточно высокой стоимостью. Поэтому необходимо провести сравнительный анализ характеристик биорецепторных элементов полученных на основе выделенной и коммерчески доступной АО, решить вопрос о целесообразности собственного производства АО и биорецепторных элементов на ее основе. Для этого использовали выделенный и очищенный препарат АО, из дрожжей H.polymorpha NCYC 4951п, и коммерчески доступные препараты АО: АО из Candida boidiini (Sigma), АО из Hansenula sp. (Sigma), AO из Pichia pastoris (Sigma).

Из всех используемых препаратов АО готовили раствор с одинаковым конечным содержанием белка (25 мг/мл). Удельная активность АО из Hansenula polymorpha NCYC 495 In, выделенной в лаборатории составляла 50 ед/мг. Для коммерчески доступных препаратов производителем были указанны следующие значения удельной активности: АО из Candida boidiini (Sigma) - 13,5 ед/мг; АО из Hansenula sp. (Sigma) - 22 ед/мг ; АО из Pichia pastoris (Sigma) - 28 ед/мг.

Для проведения сравнительного анализа различных АО использовали биосенсорную установку проточного типа с распознающими элементами, полученными по описанной выше методике с использованием ДЭАЭ декстрапа. В качестве изучаемых характеристик были выбраны долговременная и операционная стабильность, коэффициент чувствительности.

После 28 суток хранения биорецептора на основе АО из Я polymorpha NCYC 495 In, выделенной в лаборатории, ответ биосенсора уменьшился в 2,5 раза (на 60%). Для биорецептора на основе коммерческого препарата АО из Hansenula sp. за первые семь суток ответ сенсора снизился на 75 %, для биорецептора на основе препарата АО из P. postons величина ответа уменьшилась на 67%. Биорецептор на основе коммерческого препарата АО из Candida boidinii на 6 сутки полностью потерял активность.

Для сенсора с биорецептором на основе АО из Hansenula sp. и Pichia pastoris наибольшая активность наблюдается на 7 сутки хранения рецептора, в отличие от биорецептора на основе АО, выделенной в лаборатории, для которой наибольшая активность проявляется в 1 день использования рецептора. Это можно объяснить тем, что коммерческие препараты АО хранятся в лиофилизированном виде. Биорецептор на основе АО из Н. polymorpha NCYC 495 In, выделенной в лаборатории, является наиболее стабильным. Для биорецептора на основе АО из дрожжей Я. polymorpha NCYC 945 In, среднее значение для полученных ответов составило 1.4±0.1 нА/с (7%); для биорецептора на основе коммерческого препарата АО из Hansenula sp. -0.76±0.04 нА/с(5.3%).; а для биорецептора на основе коммерческого препарата АО из P. pastoris - 0.12±0.01нА/с (8%) Таким образом, операционная стабильность биорецептора на основе выделенной в лаборатории алкогольоксидазы сопоставима со стабильностью биорецепторов на основе коммерчески доступных препаратов АО.

Кинетические свойства ферментов разного происхождения также похожи, хотя прослеживается некоторое различие в параметрах, в частности в значениях констант Михаэлиса (Км по метанолу в условиях гомогенного ферментативного катализа составляют величины 2.15мМ, ЗмМ и 3.1мМ соответственно Я. polymorpha, C.boidinii и P. pastoris). Полученные значения Км для иммобилизованного фермента несколько выше приведенных в литературе данных, что является закономерным результатом. Следует отметить, что эти значения так же увеличиваются в ряду Hansenula polymorpha NCYC 495 In, C.boidinii, Pichia pastoris (Км 3.7мМ, 4.2мМ, 5.6мМ соответственно). Наибольшей чувствительностью к метанолу обладает биорецептор на основе АО из Hansenula polymorpha NCYC 945 In, выделенной в лаборатории. Если принять значение коэффициента чувствительности этого биорецептора за 100% (0.96±0.05нА/с), то чувствительность биорецептора на основе коммерческих препаратов АО составляет: 50%-для АО из Hansenula sp; 26% - для АО из Pichia pastoris-, 10% - для АО из Candida boidinii.

На основе определённых аналитических и метрологических характеристик биосенсоров с разработанными биорецепторными элементами можно сделать вывод, что АО, выделенная из H.polymorpha NCYC 495 In, не уступает коммерческим препаратам АО, и может успешно использоваться при разработке биораспознающих элементов биосенсорных систем для определения содержания низших спиртов.

Воспроизводимость методики иммобилизации оценивали путем сравнения операционной стабильности трех биорецепторных элементов, полученных на основе одного и того же ферментного препарата АО. Проведённый анализ показал, что для всех трех биорецепторов наблюдаются близкие значения величин ответов биосенсора, ошибка составляет не более 8%. Таким образом, разработанная методика иммобилизации позволяет получать рецепторные элементы близкие по своим свойствам и характеристикам.

Разработка биорецепторных элементов на основе клеток метилотрофных дрожжей

В качестве основы распознающих элементов нередко используют целые клетки микроорганизмов. Естественным источником АО являются дрожжи родов РгМа и Натепи1а, поэтому необходимо было оценить возможность использования в качестве биоматериала распознающих элементов биосенсора целых дрожжевых клеток. Провели оценку субстратной специфичности четырех штаммов метилотрофных дрожжей: Р. ап^ияга ВКМ У-2519, Р. ап&Ма ВКМ У-1397, Р. а^шт ВКМ У-2559, Я ро1утогрИа ИСУС 495 1п. Дрожжевые клетки иммобилизовали адсорбцией на стекловолоконном фильтре вР/А и использовали в качестве биораспознающих элементов сенсора. Полученные результаты для четырех штаммов метилотрофных дрожжей представлены на рисунке. 7.

Рис. 7. Субстратная специфичность. Приведены средние значения величины ответов биосенсора для трех последовательных измерений. 1-метанол, Ii-этанол, Ш-пропанол-1, IV-бутанол-!, V- метаналь, VI-глицерин, VII-глюкоза, VIII-фруктоза. 1 -Р. angusta ВКМ У-2518, 2- Р. angusta ВКМ Y-1397, 3- Р. angusta ВКМ У-2559, 4- Я polymorpha NCYC 495 In

Биорецепторные элементы характеризуются меньшей специфичностью по сравнению с ферментными, так как дрожжевые клетки, являясь сложным организмом с наличием множества разнообразных ферментов, способны окислять широкий спектр субстратов. Наиболее подходящим для разработки биорецепторного элемента биосенсора является штамм Н. ро!утогрИа МСУС 495 1п, так как он характеризовался наиболее высоким ответом на присутствие в среде как метанола, так и этанола.

Выше был описан способ изготовления биораспознающих элементов путем иммобилизации алкогольоксидазы на модифицированную ДЭАЭ-декстраном нитроцеллюлозную мембрану. Полученные таким образом биораспознающие элементы отличались высокой стабильностью и чувствительностью. Наличие отрицательно заряженных групп на поверхности клеток позволяет использовать подобную методику для создания биораспознающих элементов на основе целых клеток метилотрофных дрожжей. В таблице 4 суммированы основные характеристики биосенсоров с биорецепторными элементами на основе метилотрофных дрожжей, полученными двумя разными способами иммобилизации.

Таблица 4. Параметры биосенсоров на основе метилотрофных дрожжей

Характеристика биосенсора Биосенсо] КЛ( адсорби стеклово фильт ), на основе ;ток, эованных локонном ре GF/A Биосенсор, на основе клеток, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране

Метанол Этанол Метанол Этанол

Предел обнаружения, мМ 0.03 0.05 0.1 0.2

Верхняя граница линейного диапазона определяемых концентраций, мМ 1.5 1.18 1.73 1.53

Коэффициент чувствительности, нА/с*мМ 1.79 1.01 0.42 0.319

Повторяемость, отклонение от среднего значения за 14 измерений, % 2 3 3 3

Время отклика, сек 15-20 10-15

Время единичного измерения, сек. 350-400 250-300

Биосенсор на основе клеток, иммобилизованных с помощью ДЭАЭ-декстрана, обладает более низкой чувствительностью, но, в то же время, характеризуется меньшим временем отклика и единичного измерения, по сравнению с биосенсором на основе адсорбированных клеток. Биорецепторный элемент на нитроцеллюлозной мембране обладал большей механической прочностью, что важно для длительного хранения приготовленных к использованию сменных биорецепторных элементов. Такая особенность метода

иммобилизации с использованием нитроцеллюлозной мембраны дает возможность поставлять пользователям готовые биораспознающие элементы.

Определение содержания этилового спирта в коммерческих образцах алкогольной продукции, с использованием разработанных биосенсорных систем

Для апробации разработанных ферментных и микробных биосенсоров проводили определение содержания этилового спирта в ряде коммерческих образцов спиртосодержащей продукции. В качестве ферментного биосенсора использовали модель биосенсора ПИ типа с биорецепторным элементом на основе АО, иммобилизованной с помощью ДЭАЭ-декстрана. Микробный биосенсор представлял собой установку кюветного типа с рецепторным элементом на основе адсорбированных дрожжевых клеток. В качестве референтного использовали метод газожидкостной хроматографии. Установленный ранее характер субстратной специфичности рецепторных элементов позволяет с достаточной точностью определять этиловый спирт при условии отсутствия в растворе значительного количества короткоцепочечных спиртов линейного строения. Все исследуемые образы были проанализированы с использованием метода газожидкостной хроматографии, полученные результаты показывают, что содержание прочих низших спиртов значительно ниже, чем концентрация этилового спирта и не может оказать существенного влияния на величины ответов как ферментного, так и микробного биосенсора.

Для определения концентрации этанола использовали линейный участок градуировочных зависимостей величины ответа сенсора от концентрации этанола. Линейный диапазон определяемых концентраций составил 0.04 - 8мМ (биосенсор на основе АО) и 0.05-1.2мМ (биосенсор на основе иммобилизованных дрожжевых клеток).

Используя уравнения зависимости линейных участков градуировочных зависимостей величин ответа биосенсора от концентрации этилового спирта в растворе, определяли содержание этанола в анализируемых образцах и выражали содержание спирта в объемных процентах, результаты представлены в таблице 5

Таблица 5 Сравнительная таблица значений концентраций этанола в реальных образцах, определенных биосенсорным методом и методом газовой хроматографии _

№ и название образца Концентрация спирта, %об

Заявленное содержание Биосенсор на основе АО Микробный биосенсор Газовая хроматография

1. Вино "Рислинг" 10.5 12±4 12±2 11±2

2. Вино "Ламбада" 10.0 10±1 11±1 10.0±0.5

3. Портвейн "333" 18 18±1 18±2 18±2

i1?0^ „ 40 40±8 46 + 8 38±5 "Мягокькая_____|

Значения содержаний, полученных биосенсорным методом и методом газовой хроматографии, хорошо коррелируют между собой. Таким образом, разработанные модели биосенсоров на основе АО и целых клеток метилотрофных дрожжей позволяют с достаточной точностью определять содержание этанола в спиртосодержащих жидкостях.

Определение содержания этилового спирта в полупродуктах процесса спиртового брожения

Для определения содержания этилового спирта на разных этапах процесса спиртового брожения использовали макет биосеисора кюветного типа на базе кислородного анализатора Эксперт -001 (Эконикс ЭКСПЕРТ) с рецепторным элементом на основе иммобилизованной АО. В настоящей работе бродильную массу получали следующим образом: исходное картофельное сырье растворяли его в тёплой дистиллированной воде, после чего колбу нагревали в термостате до 90°С. К полученной массе добавляли ферментный препарат Termamy- термостабильную - а-амилазу и помещали в термостат (Т=90°С) при периодическом перемешивании на 2 часа. Затем колбу охлаждали до 60°С и добавляли фермент SAN Super 360L а-амилазу, и термостатировали при перемешивании 2 часа. После охлаждения до 30°С, добавляли дрожжи Sacharomyces cerevisiae и ставили в термостат. Через определенные промежутки времени из колбы отбирали образцы для определения содержания этилового спирта (Табл. 6).

Таблица 6 Концентрация этилового спирта на разных этапах процесса спиртового брожения. Биосенсорный и газохроматографический метода

Время отбора пробы, ч Концентрация спирта, %об

Биосенсор на основе АО Газохроматографический метод

0 0 0

24 0.61±0.06 0.63±0.06

48 0.77±0.1 0.86± 0.07

72 1.2±0.2 1.3±Ю.1

Следует отмстить, что результаты определения содержания этилового спирта биосенсорным методом и методом газожидкостной хроматографии хорошо коррелируют между собой. Предложенная методика позволяет с достаточной точностью определять концентрацию анализируемого компонента на разных стадиях спиртового брожения.

Выводы

• Сравнительный анализ содержания белка и активности алкогольоксидазы в биомассе метилотрофных дрожжей: С. boidinii Y-2356, Р. angusta Y-2518, P.angusta Y-1397, Р. augusta Y-2559, Я. polymorpha NCYC 495 ln. показал, что наиболее подходящим источником фермента являются дрожжи Я. polymorpha NCYC 495ln. Отработанная методика лабораторного выделения дрожжевой алкогольоксидазы с использованием полуавтоматической хроматографической установки может использоваться как основа при увеличении масштабов производства дрожжевой алкогольоксидазы Я. polymorpha NCYC 495 ln, необходимой для изготовления расходных материалов биосенсоров.

• Разработаны способы получения отличающихся высокой стабильностью и воспроизводимостью биочувствительных элементов сенсоров для определения содержания спиртов путем иммобилизации алкогольоксидазы и целых клеток метилотрофных дрожжей на нитроцеллюлозной мембране, модифицированной бензохиноном и ДЭАЭ-декстраном. Установлено, что взаимодействие между модифицированной ДЭАЭ-декстраном положительно заряженной мембраной и поверхностью позволяет существенно увеличить время функционирования микробного сенсора.

• Выполнен сравнительный анализ метрологических и аналитических характеристик биосенсоров на основе выделенных в работе и коммерчески доступных алкогольоксидаз. Выделенная в работе из Я. polymorpha NCYC 495 ln алкогольоксидаза характеризуется наибольшей удельной активностью (50 Е/мг), а биораспознающий элемент на ее основе характеризуется наилучшими аналитическими параметрами.

• Разработаны и апробированы макеты биосенсора юоветного и проточно-инжекционного типа для определения содержания метанола и этанола в водных средах. Сравнение эксплуатационных и аналитических характеристик биосенсоров показало, что при проточно-инжекционном формате проведения анализа повышается селективность, расширяется линейный диапазон определения и снижается время единичного анализа.

• Методика анализа с использованием разработанных макетов биосенсоров характеризуется быстротой, высокой чувствительностью, низкой стоимостью и позволяет проводить мониторинг содержания спирта в процессе брожения, а также его остатков в барде. Для определения содержания этилового спирта в спиртовой продукции целесообразно использовать ферментные и целоклеточные биораспознающие элементы, при этом селективность ферментных биосенсоров существенно выше.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Зайцев М. Г., Арляпов В. А., Алфёров В. А., Решетилов А. Н.

Характеристика рецепторных элементов биосенсоров при двух способах

иммобилизации метилотрофных дрожжей. // ПРИКЛАДНАЯ

БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 48, № 5, с. 570-576

2. Зайцев М.Г., Арляпов В А., Алферов В А., Решетилов А.Н., Леденев В.П. Экспресс-определение содержания крахмала, глюкозы, этанола и БПК биосенсорным методом при ферментации этанола. Ликероводочное производство и виноделие, 2012, № 11-12 (155), с 31 - 35.

3. М.Г. Зайцев, В.И. Владимиров, Е.М. Журикова, М.Ю. Ильницкий. Выделение фермента алкогольоксидазы из клеток метилотрофных дрожжей родов Pichia, Hansenula, Candida. // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2012. Вып. 2. С. 219-225

4. Алферов В. А., Зайцев М. Г., Понаморева О. Н., Кузнецова Т. А., Рогова Т. В., Решетилов А. Н. Электрохимический сенсор на основе алкогольоксидазы для экспресс-определения содержания низших спиртов. // ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2011, том 66, № 12, с. 1322-1329

5. Понаморева О.Н., Зайцев М.Г., Кузнецова Т.А., Горячева A.A., Алферов В. А. Сравнительная характеристика биосенсоров проточно-инжекционного и кюветного типа на основе алкогольоксидазы для экспресс определения содержания спирта. // Известия ТулГУ. Естественные науки. Вып. l.-Тула: Изд-во ТулГУ, 2009. с. 158-165

6. Зайцев М.Г., Алферов В.А., Кузнецова Т.А., Рогова Т.В., Горячева A.A., Понаморев К.А., Решетилов А.Н. Характеристика биокатализаторов на основе иммобилизованных дрожжевых алкогольоксидаз как основы рецепторных элементов биосенсоров для определения содержания спиртов. // Известия ТулГУ. Естественные науки. Вып. 2. - Тула: Изд-во ТулГУ, 2008. с. 200-207

Материалы конференций в тезисной форме:

1. Zaytcev M., Isolation of the alcohol oxidase from the methylotrophic yeast cells genera Pichia, Hansenula Materiály IX mezinárodní vëdecko -praktická konference «Aktuální vymozenosti vêdy - 2013». - Dil 16. Biologické vëdy. Ekologie. Zemëpis a geologie. Zverolékarství: Praha. Publishing House «Education and Science» s.r.o - 35-37 stran.

2. Зайцев М.Г., Ильницкий М.Ю. Биосенсор на основе иммобилизованных клеток метилотрофных дрожжей для определения содержания этилового спирта Материалы VII Московского Международного Конгресса «Биотехнология: Состояние и Перспективы Развития» 19-22 Марта 2013 г. М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2013 - с. 166.

3. Зайцев М.Г., Ильницкий М.Ю. Выделение и очистка фермента алкогольоксидазы из клеток метилотрофных дрожжей родов Hansenula, Pichia,Candida. Достижения и перспективы развития биотехнологии: Материалы междунар. науч. конф. (Саранск, МГУ им. Н.П. Огарева, 3-5 октября 2012 г.) - Саранск: Типография ООО «Мордовия — Экспо», 2012. - с. 25

4. Зайцев М.Г., Ильницкий М.Ю. Биосенсор на основе иммобилизованных клеток метилотрофных дрожжей для определения содержания этилового спирта. Биология будущего: традиции и новации: Материалы II Всероссийской с международным участием школы-конференции молодых ученых. Екатеринбург, 1-5 октября, 2012 г. - Екатеринбург: Изд-во Урал, ун-та, 2012. - с. 108-111

5. Зайцев М.Г. Разработка биосенсорных систем на основе иммобилизованной алкогольоксидазы и целых клеток метилотрофных дрожжей для экспресс определения этанола. Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2012» - Тула, 2012 - С.9

6. Владимиров В.И., Зайцев М.Г., Решетилов А.Н. Биосенсорные системы на основе целых клеток метилотрофных дрожжей для экспресс-определения содержания низших спиртов. Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2011» — Тула - 2011 — С.8

7. Зайцев М.Г., Ильницкий М.Ю. Разработка биосенсорных систем на основе ферментных и микробных препаратов для экспресс-определения спиртов. «Экотоксикология-2010». Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи. - Тула: Тульский государственный университет, 2010 -С.12

8. Зайцев М.Г., Кузнецова Т.А., Алферов В.А. Создание биокаталитических препаратов и разработка на их основе биосенсорных систем для экспресс-определения спиртов. Материалы Московской международной научно-практической конференции «БИОТЕХНОЛОГИЯ: экология крупных городов», проводимой в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» — Москва — 15-17 марта — 2010 —С. 439-440.

Подписано в печать:

18.09.2013

Заказ № 8751 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 vvww.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Зайцев, Максим Геннадьевич, Москва

ФГБОУ ВПО «Тульский государственный университет»

На правах рукописи

04201362514

ЗАЙЦЕВ МАКСИМ ГЕННАДЬЕВИЧ

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ АЛКОГОЛЬОКСИДАЗЫ И ЦЕЛЫХ КЛЕТОК МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ НИЗШИХ СПИРТОВ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ на соисканиё-ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель кандидат химических наук, доцент Понаморева Ольга Николаевна

МОСКВА - 2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................6

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР........................................................................10

1.1. Методы определения содержания низших спиртов........................10

1.2. Общая концепция биосенсоров..........................................................13

1.3. Метилотрофные дрожжи как биокатализаторы окисления спиртов 15

1.4. Биосенсоры на основе микробных клеток для определения спиртов...............................................................................................................18

1.5. Ферментативные методы анализа метанола и этанола...............21

1.5.1. Биохимические методы определения спиртов.................................21

1.5.2. Ферментные биосенсоры с электрохимическим принципом детекции..........................................................................................................27

1.5.3. Биосенсоры с оптическим принципом регистрации сигнала..........34

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.........................................................39

2.1. Дрожжевые штаммы..............................................................................39

2.2. Условия культивирования...................................................................39

2.3. Индукция дрожжей на метаноле........................................................39

2.4. Изучение роста метилотрофных дрожжей........................................39

2.5. Выделение фермента АО из метилотрофных дрожжей...................40

2.5.1. Разрушение клеток..............................................................................40

2.5.2. Ступенчатое высаливание.................................................................40

2.5.3. Анионообменная хроматография на ДЭАЭ-сефарозе.....................40

2.5.4. Концентрирование АО........................................................................41

2.6. Активность алкогольоксидазы..........................................................41

2.7. Концентрация белка..............................................................................42

2.8. Иммобилизация биоматериала...........................................................42

2.8.1. Иммобилизация АО с использованием бензохинона.........................42

2.8.2. Иммобилизация АО с использованием ДЭАЭ-декстрана................42

2.8.3. Иммобилизация дрожжевых клеток адсорбцией на стекловолоконные фильтры ОБ/А...............................................................43

2.8.4. Иммобилизация микроорганизмов с использованием ДЭАЭ-декстрана на нитроцеллюлозной мембране................................................43

2.9. Биосенсорный анализ...........................................................................43

2.9.1. Кюветный формат проведения биосенсорного анализа.................43

2.9.2. Проточно - инжекционный формат проведения биосенсорного анализа.............................................................................................................45

2.10. Хроматографическое определение содержания спиртов..............46

2.11. Моделирование процесса спиртового брожения............................46

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.............................................................47

3.1. Биотехнологические аспекты получения биомассы

метилотрофных дрожжей для выделения алкогольоксидазы.................48

3.1.1. Выделение алкогольоксидазы из метилотрофных дрожжей........53

3.1.1.1. Очистка препарата АО с использованием ионообменной

хроматографии............................................................................................57

3.2. Выбор способа иммобилизации алкогольоксидазы при разработке

биораспознающих элементов биосенсора.................................................60

3.3. Аналитические и метрологические характеристики биосенсоров на основе алкогольоксидазы........................................................................64

3.3.1. Характеристики биосенсора на основе алкогольоксидазы в проточно-инжекционном формате анализа..............................................64

3.3.1.1. рН рабочего буферного раствора................................................66

3.3.1.2. Операционная стабильность биорецепторных элементов биосенсора проточно-инжекционного типа.............................................68

3.3.1.3. Долговременная стабильность биорецептора............................69

3.3.1.4. Градуировочные зависимости биосенсора с биорецептором на основе алкогольоксидазы...........................................................................70

3.3.2. Сравнительный анализ функционирования биорецепторных элементов на основе выделенных дрожжевых алкоголъоксидаз коммерчески доступных препаратов..........................................................75

3.3.3. Влияние формата проведения анализа на селективность биосенсорного определения низкомолекулярных спиртов.........................85

3.4. Характеристики биосенсора на основе иммобилизованных метилотрофных дрожжей................................................................................87

3.4.1. Выбор штамма метилотрофных дрожжей для разработки микробного биосенсора..................................................................................87

3.4.2. Аналитические характеристики биосенсора с рецепторным элементом на основе метилотрофных дрожжей, адсорбированных на стекловолоконном фильтре..........................................................................90

3.4.3. Биосенсор с рецепторным элементом на основе метилотрофных дрожжей, иммобилизованных с использованием ДЭАЭ-декстрана и бензохинона на нитроцеллюлозной мембране.............................................95

3.4.4. Иммобилизация с использованием ДЭАЭ-декстрана и бензохинона на нитроцеллюлозной мембране...................................................................95

3.4.5. Субстратная специфичность метилотрофных дрожжей, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране.................................97

3.4.6. Градуировочные зависимости сенсора для определения содержания метанола и этанола.......................................................................................98

3.4.7. Долговременная стабильность биорецептора на основе клеток, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране...............................101

3.5. Определение содержания этилового спирта в коммерческих

образцах алкогольной продукции, с использованием разработанных

биосенсорных систем...................................................................................104

3.6. определение содержания этилового спирта в полупродуктах процесса спиртового брожения...................................................................105

ВЫВОДЫ............................................................................................................109

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:..............................................................................110

БЛАГОДАРНОСТИ..........................................................................................122

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АО - алкогольоксидаза

ДЭАЭ - диэтиламиноэтил

ГХ - газовая хроматография

ПИД - пламенно-ионизационный детектор

MC - масс - спектроскопия

ВЭЖХ - Высокоэффективная жидкостная хроматография

ФП - Фурье преобразование

БИК - ближневолновая инфракрасная область

БХП - биохимический преобразователь

АДГ - алкогольдегидрогеназа

ФАД - флавинадениндинуклеотид

КАТ - катал аза

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

PQQ - Пирролохинолинохинон

ФАД - флавинадениндинуклеотид

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Км - константа Михаэлиса

ГОД - глюкозооксидаза

ABTS - 2,2'-азинобис-3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота

СН - супернатант

ПААГ - полиакриламидный гель

Vmax - Максимальная скорость развития сигнала.

ВВЕДЕНИЕ

Экспресс-анализ содержания спиртов в спиртосодержащих жидкостях и ферментационных средах необходим при производстве и хранении вин, пива, осуществлении контроля биотехнологических процессов. Традиционно этанол в пищевой и водочной продукции определяют низкоселективными ареометрическим, пикнометрическим и рефрактометрическим методами. Для детекции микроколичеств спирта наиболее распространенными являются методы газо-жидкостной и газовой хроматографии, которые, несмотря на низкие пределы обнаружения, характеризуются сложностью оборудования, в некоторых случаях - пробоподготовки, а также длительность анализа.

Альтернативой хроматографическим, являются успешно применяемые ферментативные методы, имеющие высокую чувствительность и селективность. При разработке экспрессных методов биоанализа перспективным является использование биосенсоров, которые характеризуются доступностью, простотой аппаратурного и методического оформления, удовлетворительными уровнями чувствительности и избирательности, экспрессностью и экономичностью, а также возможностью миниатюризации. В последние годы разработке ферментных биосенсоров для экспресс-определения содержания спиртов посвящено значительное число публикаций, что свидетельствует об актуальности данного направления биоаналитической химии. Наибольшее развитие получили электрохимические биосенсоры на основе иммобилизованного фермента алкогольоксидазы (АО) (КФ 1.1.3.13), принцип работы которых заключается в измерении концентрации кислорода или образующегося пероксида водорода в приэлектродном пространстве. Проводимые исследования направлены на разработку портативных биоаналитических устройств, совершенствование аналитических параметров биосенсоров.

Основным источником АО являются метилотрофные дрожжи, содержание фермента в которых может достигать 30-40 % от общего количества белков в клетке. В связи с этим, наряду с АО в качестве биокатализаторов при создании амперометрических биосенсоров возможно применение целых клетки микроорганизмов. Их использование имеет ряд преимуществ, к которым относятся технологически простая процедура изготовления биораспознающих элементов для биосенсора и существенное сокращение стоимости анализа.

Одной из важных проблем является мониторинг сточных вод спиртовых

производств, которые характеризуются высоким содержанием органических загрязнений,

приводящих к гибели естественных экосистем вокруг таких предприятий. Для экспресс-

анализа сточных вод спиртовых производств целесообразно использовать целоклеточные биосенсоры, которые позволяют определять суммарное содержание легко утилизируемых соединений. Следует отметить, что биосенсоры,, предназначенные для экологического контроля стоков спиртовых заводов, можно использовать и для мониторинга ферментационных процессов на этих производствах. Поэтому создание биосенсорного анализатора со сменными биораспознающими элементами является актуальной задачей для данной технологической отрасли.

Несмотря на интенсивное развитие исследований в данной области существует необходимость решать некоторые научные и научно-технические проблемы, чтобы упростить и удешевить процедуру определения спиртов без потери точности и специфичности метода, а также обеспечить возможность их постоянного мониторинга в реальных объектах. Актуальными задачами при разработке биосенсоров для определения содержания низших спиртов, в частности, этилового, являются увеличение времени функционирования иммобилизованного биокатализатора в распознающих элементах биосенсора, повышение чувствительности и стабильности работы биосенсора, что, определяются стабильностью биорецепторного элемента. Решение описанных проблем может осуществляться, с одной стороны, выбором наиболее эффективных биокатализаторов - штаммов микроорганизмов или выделенных из них алкогольоксидаз, с другой стороны - разработкой новых методик иммобилизации биоматериала, обеспечивающих длительное время функционирование биосенсора при сохранении высокой активности биокатализатора.

Цель работы:

В рамках указанной цели решались следующие задачи:

1. На основе содержания белка и удельной активности алкогольоксидазы в биомассе метилотрофных дрожжей различных штаммов провести выбор наиболее эффективного источника для получения целевого фермента.

2. Получить биочувствительные элементы для модификации электрода электрохимических биосенсоров на основе иммобилизованных дрожжевой алкогольоксидазы и целых клеток метилотрофных дрожжей.

3. Провести сравнительный анализ метрологических и аналитических характеристик биосенсоров на основе выделенных в работе и коммерчески доступных алкогольоксидаз.

4. Сравнить эксплуатационные и аналитические характеристики биосенсоров для определения содержания этанола в кюветном и проточно-инжекционном форматах анализа

5. Апробировать разработанные макеты электрохимических биосенсоров на спиртосодержащих образцах в сравнении с референтными методами.

Научная новизна

Практическая значимость

Отработанная методика лабораторного выделения дрожжевой алкогольоксидазы с использованием полуавтоматической хроматографической установки может

использоваться как основа при производстве дрожжевой алкогольоксидазы Н. ро1утогр/га КСУС 495 1п.

Работа вносит практический вклад в разработку быстрых методов анализа на основе биосенсоров и позволяют в перспективе производить недорогие и эффективные анализаторы. Макеты биосенсоров могут быть использованы в научных исследованиях, в учебном процессе и как прототипы опытных образцов приборов для серийного выпуска на базе гальванопотенциостатов, внесенных в Государственный реестр средств измерений.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Методы определения содержания низших спиртов.

Количественное определение этилового спирта с высокой чувствительностью, селективностью и точностью требуется во многих различных областях анализа. Точное и быстрое измерение содержания этанола является очень важным в клинической и судебно-медицинской экспертизах для анализа жидкостей организма человека. Пищевая промышленность, производство напитков (вино, пиво и спиртные напитки) и целлюлозно-бумажная промышленность требуют простой, быстрого и экономичного аналитического метода контроля процессов брожения и анализа качества готовых изделий [1,2]. Контроль отходов спиртовых производств дает возможность значительно снизить экологическую нагрузку на окружающую среду, предотвратив выброс легкоокисляемых органических веществ, таких как остаточный этиловый спирт, попадание которых в водоемы приводит к их существенному загрязнению и опасной трансфор

Информация о работе

Зайцев, Максим Геннадьевич
кандидата химических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.06

Диссертация

Электрохимические биосенсоры на основе иммобилизованной алкогольоксидазы и целых клеток метилотрофных дрожжей для определения содержания низших спиртов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы