Разработка новых методов анализа спиртов и альдегидов и конструирование продуцентов этанола с использованием нетрадиционных дрожжей Hansenula polymorpha и Pichia stipitis

Сибирный, Владимир Андреевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка новых методов анализа спиртов и альдегидов и конструирование продуцентов этанола с использованием нетрадиционных дрожжей Hansenula polymorpha и Pichia stipitis
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка новых методов анализа спиртов и альдегидов и конструирование продуцентов этанола с использованием нетрадиционных дрожжей Hansenula polymorpha и Pichia stipitis"

на правах рукописи

СИБИРНЫЙ ВЛАДИМИР АНДРЕЕВИЧ

Разработка новых методов анализа спиртов и альдегидов и конструирование продуцентов этанола с использованием нетрадиционных дрожжей Напзепи/аро!утогрИа и ПсЫа зИрШБ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 - микробиология

7 ноя г0)3

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 2013

005537629

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и микробиологии биолого-почвенного факультета Жешовского университета (Жешов, Польша)

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Нетрусов Александр Иванович

Официальные оппоненты:

Азизбекян Рудольф Рубенович,

доктор биологических наук, профессор., зав. лабораторией биологически активных соединений Федерального государственного унитарного предприятия Государственный НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Мартыненко Николай Николаевич,

доктор биологических наук, Московский государственный университет пищевых производств, кафедра биотехнологии, профессор кафедры

Тишков Владимир Иванович,

доктор химических наук, профессор, Московский государственный университет имени М.В Ломоносова, кафедра химической энзимоогии, профессор кафедры

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН

Защита состоится «29» октября 2013 г. в 15:30 на заседании диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп. 12, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. Автореферат разослан 13 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Пискункова Нина Федоровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Загрязнение окружающей среды наряду с исчерпанием нефти ставит перед биотехнологией задачи разработки современных методов анализа токсичных продуктов и поиска возобновляемых источников энергии. Все процессы биотехнологии, химической технологии, мониторинга окружающей среды и многих пищевых технологий базируются на методах анализа хода процесса и качества конечного продукта. Эти проблемы во многом могут быть решены с использованием нетрадиционных дрожжей Hansenula polymorpha и Pichia stipitis.

Мониторинг среды, включающий контроль воздуха, сточных вод, пищевых продуктов, почвы и питьевой воды, приобретает все большее значение в программах улучшения условий жизни и питания человека. Среди множества методов все большее внимание уделяется новейшим биоаналитическим методам (Reshetilov et al., 2010; Троценко, Торгонская, 2011). В них используются высокоспецифичные ферменты, а также биосенсоры на основе ферментов, микробных клеток, либо иных биоэлементов. Для внедрения биосснсорных методов анализа в широкую практику необходимы исследования по конструированию биоэлементов с оптимальными параметрами, включая создание ферментных и микробных сенсорных элементов с необходимыми биоаналитическими характеристиками.

Современный этап развития цивилизации в значительной степени зависит от успешной разработки новых технологий производства биотоплива, особенно, топливного этанола из непищевыых источников. В настоящее время этанол производится в больших количествах (79 млрд. л в 2009 г.), причем около 75% этого вещества используется в качестве топлива для двигателей внутреннего сгорания и лишь 15% - для приготовления крепких спиртных напитков. Бензин в настоящее время зачастую используется в смесях с этанолом, который может быть получен из биомассы растений, причем в странах ЕС с 2010 г. введено требование, согласно которому бензин должен содержать не менее 5,5% этанола (Monique et al., 2003). Известно также положительное влияние биотехнологического производства этанола на глобальный парниковый эффект. Сжигание такого этанола не приводит к дополнительной эмиссии С02 в атмосферу (Lynd, 1996). В настоящее время топливный этанол получают из пищевого и кормового сырья (крахмал, сахароза). Поэтому конструирование штаммов, способных к эффективной конверсии в этанол гидролизатов растительной биомассы, состоящих, в основном, из глюкозы и ксилозы, имеет первостепенное значение для увеличения производства этого биотоплива. Важной задачей является также усовершенствование методов анализа этанола.

Метанол играет важную роль в качестве исходного сырья для химического синтеза. Значительная его часть используется в процессе получения формальдегида, а также для производства синтетических смол и лавсана, биотоплива, а также в качестве добавки к бензину. Случайное потребление метанола приводит к слепоте, необратимым неврологическим нарушениям и даже к смерти (Medinsky et al., 1997; Skrzydlewska, 1999). В связи с высокой токсичностью метанола (Skrzydlewska, Farbiszewski, 1997; Andrews et al., 1998) важное значение имеет определение его содержания в алкогольных напитках, биологических жидкостях, при контроле промышленных отходов.

высокий уровень формальдегида, как натурального метаболита, в ряде рыбных продуктов семейства тресковых (Sotelo et al., 1995), содержание которого в процессе хранения в замороженном состоянии его содержание может достигать от 210 до 780 мг на 1 кг сырой биомассы, что представляет собой серьезную токсикологическую проблему (Rehbein, 1995).

Большинство известных методов определения этанола, метанола и формальдегида недостаточно селективны и чувствительны, либо слишком дорогостоящие. Блдее перспективн энзиматические методы с использованием алкогольоксидазы, выделенной из штаммов-сверхпродуцентов Н. polymorpha. Алкогольоксидаза, способная in vitro окислять метанол, алифатические спирты, включая этанол, имеет важное биотехнологическое значение. Другим ферментом Н. polymorpha, имеющим биоаналитичесое значение, является формальдегиддегидрогеназа. Этот фермент также использовался в диссертационной работе.

Для эффективного производства биоэтанола необходим поиск и генно-инженерное улучшение дрожжей, способных сбраживать до этилового спирта гидролизаты лигноцеллюлозы. Важнейшее значение имеет исследование метилотрофных дрожжей Н. polymorpha, которые могут сбраживать как глюкозу, так и ксилозу, а также P. stipilis, дикие штаммы которых по характеристикам ферментации ксилозы не уступают лучшим рекомбинантным штаммам Saccharomyces cerevisiae. Такие дрожжи представляют интерес для разработки процесса одновременного энзиматического гидролиза лигноцеллюлозы с последующей ферментацией образуемых Сахаров до этанола. Штаммы с улучшенными параметрами ферментации лигноцеллюлозного сырья могут сделать этот процесс более рентабельным (Дмитрук и др., 2010).

Цель и задачи исследования. Целью работы было использование нетрадиционных дрожжей Hansenula polymorpha для разработки новых ферментативных и биосенсорных методов анализа формальдегида, метанола и этанола в окружающей среде, продуктах питания, сыворотках крови, а также конструирование штаммов Н. polymorpha и Pichia stipitis с увеличенной продукцией этанола. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Использование высокоочищенного фермента алкогольоксидазы (АО), полученного из клеток бескаталазного штамма метилотрофных дрожжей //. polymorpha С-105 [gcrl catX) с нарушенной катаболитной глюкозной репрессией синтеза АО для разработки ферментных фотометрических методов анализа этанола, метанола и формальдегида.

2. Анализ этанола в алкогольных и безалкогольных напитках и соках при помощи разработанного алкогольоксидазно-пероксидазного (АОП) метода.

3. Использование АОП-метода и препарата рекомбинантной формальдегиддегидрогеназы (ФАДГ) для определения содержания формальдегида в рыбных продуктах, метанола и формальдегида в модельных растворах и промышленных сточных водах.

4. Разработка нового энзимо-химического метода определения одновременного содержания формальдегида и метанола для анализа стоков.

5. Конструирование элементов биосенсоров, селективно реагирующих на метанол, этанол и формальдегид, с применением ферментных препаратов, выделенных из селекционированных штаммов нетрадиционных дрожжей.

6. Получение мутантных форм АО Н. polymorpha с пониженным сродством к этанолу, разработка амперометрических биосенсоров на основе природных и мутантных форм АО Н. polymorpha.

7. Биоаналитическое использование ФАДГ Я. polymorpha в разработке ферментативных и клеточных биосенсоров для анализа формальдегида в вакцинах.

8. Конструирование рекомбинантных штаммов Pichia stipitis с увеличенной продукцией этанола при алкогольной ферментации лигноцеллюлозного сырья.

9. Изучение взаимосвязи между внутриклеточным пулом GSH, повышением продукции этанола и устойчивости к этанолу у рекомбинантных штаммов пекарских дрожжей S. cerevisiae и метилотрофных дрожжей Н. polymorpha.

Научная новизна исследования. В работе представлены примеры использования нетрадиционных дрожжей Я. polymorpha и их мутантов - сверхпродуцентов ферментов (АО - алкогольоксидазы, ФАДГ - формальдегиддегидрогеназы), мутантных форм АО с уменьшенным сродством к субстратам, выделение ферментов и их биоаналитическое применение в ферментно-химических и биосенсорных методах анализа формальдегида, метанола и этанола в промышленных сточных водах, продуктах питания и вакцинах. Представлены примеры конструирования рекомбинантных штаммов дрожжей Pichia stipitis и Я. polymorpha с улучшенными параметрами алкогольной ферментации.

Разработан новый ферментно-химический метод одновременного анализа формальдегида и метанола в их смесях, в котором определение метанола осуществляется с участием АО в условиях химического «маскирования» формальдегида в реакционной смеси (добавление веществ, связывающих молекулы формальдегида, делает невозможным его реакцию с АО). Метод использован для анализа промышленных сточных вод и коммерческих препаратов формалина. Порог чувствительности метода для обоих аналитов составляет 1 мкМ, что в 3,2 раза выше по сравнению с традиционным химическим методом.

Показана возможность применения АО, пероксидазы хрена (ПО) и ФАДГ при анализе этанола в спиртосодержащих напитках, метанола и формальдегида в модельных растворах и промышленных сточных водах, а также формальдегида в рыбных продуктах. Использование таких методов значительно упроститло процедуру анализа этанола, метанола и формальдегида по сравнению с традиционными способами.

Сконструирован новый прототип двухферментного амперометрического биосенсора с применением АО метилотрофных дрожжей и ПО, способного к анализу этанола, метанола и формальдегида. Биоселективный элемент создан путем электроосаждения двух ферментов в различных слоях с использованием катионных и анионных полимеров. Эффективная коммуникация между окисленной формой ПО и поверхностью рабочего электрода достигнута путем введения во внутренний слой, контактирующий с электродом, полимера, содержащего осмиевый комплекс. Преимуществами биосенсора являются быстрый ответ на аналит, высокая чувствительность и стабильность. Это дает возможность примениеия разработанной конструкции биосенсора также в исследованиях других ферментов (ФдДГ, мутантной АО), а также для практического использования биосенсоров в анализах соответствующих аналитов.

На основе селекции в среде с аллиловым спиртом впервые получены мутантные штаммы Я. polymorpha СА2 и СА4 с пониженным сродством АО к этанолу. Проведено секвенирование мутантных аллелей структурных генов АО из мутантов Я. polymorpha СА2 и СА4, идентифицированы точечные мутации в гене А ОХ, которые приводят к уменьшению сродства фермента к субстрату. Изучены некоторые структурно-функциональные свойства мутантных форм АО. Разработана технология иммобилизации ферментов на поверхности рабочего электрода биосенсора. Показано, что биосенсор на основе мутантной формы АО

обладает расширенным спектром линейного ответа на аналиты по сравнению с сенсором на основе АО дикого типа.

Оптимизированы условия культивирования рекомбинантного штамма Н. polymorpha с повышенным синтезом термостабильной ФАДГ, выделен фермент из рекомбинантных клеток, изучены некоторые свойства очищенной ФАДГ. Удельная активность очищенных препаратов ФАДГ превышала активность коммерческих препаратов ФдДГ из Ps. putida. Разработан ФАДГ-метод анализа формальдегида и показана возможность его использования в анализе сточных вод. Ферментативный метод на основе ФАДГ рекомендован к практическому использованию вместо химических методов, которые трудоемки, требуют дистилляции проб или дополнительных исследований (в случае содержания фенола).

Разработаны два типа селективных к формальдегиду амперометрических биосенсоров (ферментный и клеточный) с использованием зависимой от НАД* и глутатиона ФАДГ, выделенной из рекомбинантных клеток дрожжей Н. polymorpha, с высоким содержанием ФАДГ. Сконструированные биосенсоры использованы для анализа содержания формальдегида в промстоках и вакцинах (АДТ-М, антигеморрагическая вакцина кроликов, вакцина [movax Polio). Установлена корреляция между результатами биосенсорного и химического определения.

Сконструирован рекомбинантный штамм дрожжей Р. síipitis XYLlm9 с увеличенной продукцией этанола при ферментации ксилозы. В полупромышленной среде на основе кислотных гидролизатов опилок и отрубей штамм характеризовался существенным улучшением параметров алкогольной ферментации. Так, при ферментации гидролизатов пшеничных отрубей штамм продуцировал в 1,5 раза больше этанола по сравнению с дрожжами S. cerevisiae дикого типа. Использование смеси рекомбинантного штамма Р. stipiíis и штамма дикого типа S. cerevisiae увеличивало синтез этанола в 1,6 раза по сравнению с параметрами ферментации рекомбинанта.

Рекомбинанты Н. polymorpha с повышенным пулом внутриклеточного GSH в связи с гиперэкспрессией первого гена биосинтеза GSH, гамма-глутамилцистеинсинтетазы, или центрального регуляторного гена метаболизма серы МЕТ4 (мультикопийная интеграция генов GSH2 и МЕТ4) накапливали почти в два раза больше этанола при сбраживаении глюкозы по сравнению со штаммом дикого типа, тогда как штамм S. cerevisiae с повышенным внутриклеточным пулом GSH не увеличивал продукцию спирта. Трансформанты S. cerevisiae, и Н. polymorpha с повышенным пулом GSH более чувствительны к экзогенному этанолу, чем соответствующие штаммы дикого типа.

Практическое значение полученных результатов. Предложенные модификации ферментных фотометрических методов анализа этанола, метанола и формальдегида с использованием АО и ФАДГ из мутантов - сверхпродуцентов этих ферментов использованы для анализа содержания этанола в винах, формальдегида и метанола в промышленных сточных водах, формальдегида - в рыбных продуктах. Показаны их преимущества по сравнению с традиционными химическими методами. Сконструированный биосенсор на основе АО использован для определения содержания метанола в промстоках.

Разработан новый ферментно-химический метод позволяющий определять метанол и формальдегид в смесях этих веществ и, в отличие от химических методов, не требует использования агрессивных химических веществ, прост в реализации и используется для контроля аналитов в промстоках и различных продуктах, содержащих формальдегид и метанол.

Показана возможность применения сконструированного двухферментного ампсрометрического биосенсора, содержащего АО и ПО с использованием раздельного электроосаждения двух ферментов в различных слоях, применением катионных и анионных полимеров для анализа метанола, этанола и формальдегида.

С использованием предложенного нами метода селекции мутантов дрожжей Я ро1утогрИа получены препараты АО с пониженным сродством к субстратам, которые иммобилизованы на поверхности транедукторов амперометрических биосенсоров и показана возможность их применения для анализа этанола в широком диапазоне концентраций.

Сконструированные на основе рекомбинантного штамма Я. ро1утогр!ш со сверхпродукцией термостабильной ФАДГ энзиматические и клеточные биосенсоры для анализа формальдегида использованы для определения содержания формальдегида в промышленных сточных водах и в сыворотках.

Рекомбинантные штаммы дрожжей Р'юЫа хИрШх ХУит9 с повышенной продуктивностью алкогольной ферментации ксилозы и Я. ро1утогр/га с увеличенным внутриклеточным содержанием глутатиона перспективны для получения этанола из гидролизатов растительной биомассы и традиционного сырья.

Предложенные нами методы используются при анализе метанола и формальдегида в сточных водах фабрики по производству пластмасс в Пусткове (Польша), в учебном процессе на практических занятиях по биотехнологии и при выполнении дипломных работ во Львовском университете им. Ивана Франко (Украина) и Жешовском университете (Польша).

Основные положения, выносимые на защиту

• Нетрадиционные дрожжи Я ро1утогрИа и их мутанты - сверхпродуценты АО и ФАДГ впервые использованы для анализа этанола и метанола в биогенных пробах (вино, пиво, соки, безалкогольные напитки), метанола и формальдегида в модельных растворах и промстоках, а также формальдегида - в пищевых рыбных продуктах.

• Разработан и использован в аналитической практике новый ферментно-химический метод определения метанола и формальдегида в смесях этих веществ, основанный на применении химического анализа формальдегида с гидразоном З-метил-2-бензотиазолина без АО и последующей реакции с участием АО, что позволяет определять общее содержание метанола и формальдегида в промстоках.

• Разработаны новые типы амперометрических биосенсоров с использованием ферментов дрожжей Я. ро1утогрИа (АО, мугантная АО, ФАДГ) и осмий-содержащих катионных и анионных полимеров для получения быстрого отклика на аналит при высокой чувствительности и стабильности биосенсора. Сконструированные биосенсоры использованы для анализа метанола, этанола и формальдегида.

• Сконструирован рекомбинантный штамм дрожжей ХУЫт9 Р. .чИрШя с повышенной продуктивностью алкогольной ферментации ксилозы и гидролизатов растительного сырья. Обнаружена способность рекомбинантных штаммов Я. ро1утогрка с увеличенным внутриклеточным содержанием глутатиона к сверхсинтезу этанола в среде с глюкозой.

Работа выполнялась на кафедре Биотехнологии и микробиологии Биолого-почвенного факультета Жешовского университета (Жешов, Польша). Часть исследований проведена на основе Отдела молекулярной генетики и биотехнологии и Отдела аналитической

биотехнологии Института биологии клетки НАН Украины (Львов, Украина), Института инжинерии окружающей среды Ченстоховского Технологического университета (Ченстохова, Польша), кафедры Технологии воды и сточных вод Свентокшыского Технологического университета (Кельне, Польша), Лаборатории аналитической химии -электроаналитики и сенсорики Рурского Университета (Бохум, Германия), кафедры Экологии микроорганизмов Брюссельского свободного университета (Брюссель, Бельгия).

Исследования выполнялись также в рамках международных научных грантов: KBN 3 Р04В 003 23 «Новые ферментативные и биосенсорные методы анализа формальдегида, метанола и этанола в окружающей среде и клеточные системы детоксикации формальдегида», KBN N N302 1385 33 «Мутанты дрожжей Hansenula polymorpha с нарушенной катаболитной репрессией и их использование с целью конструирования сверхпродуцентов собственных и чужих белков с биотехнологическим значением», P-W CG „Interaction between glutathione and alcoholic fermentation in Saccharomyces cerevisiae and non-conventional yeasts".

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на Международном экологическом конгрессе «Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности» (Санкт-Петербург, Россия, 2000), на XXI Международном специализированном симпозиуме по дрожжам «Биохимия, Генетика, биотехнология и экология ннетрадиционных дрожжей» (Львов, Украина, 2001), на XXII Международном специализированном симпозиуме по дрожжам „Yeast Fermentations and other Yeast Bioprocesses" (Пиланесбург, ЮАР, 2002), на II Конгрессе по биотехнологии (Лодзь, Польша, 2003), на VI Международной конференции „Rôle of Formaldehyde in Biological Systems" (Печ, Венгрия, 2003), на Первом (Инаугурационном) Украинском Конгрессе по биологии клетки (Львов, Украина, 2004), на Украинско-Германском Симпозиуме по нанобиотехнологии "Current State and Prospects for Future Coopération" (Киев, Украина, 2006), на II Украинско-Польской Вайглевской конференции "Microbiology of the XXI century" (Варшава, Польша, 2007), на XII Международном Конгрессе по дрожжам (Киев, Украина, 2008), на III Украинско-Польской Вайглевской конференции «Микробиология на службе человека» (Одесса, Украина, 2009), на X Международной научной конференции "Risk factors of food chain" (Нитра, Словакия, 2010), на XXVIII Международном специализированном симпозиуме по дрожжам „Metabolic and Bioprocess Engineering for Sustainable Development" (Бангкок, Таиланд, 2010), на IV Украинско-Польской Вайглевской конференции "От микробиологии к синтетической биологии" (Вроцлав, Польша, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 45 работ, среди которых 17 статей, в российских журналах, рекомендуемых ВАК, и в приравниваемых к ним периодических изданиях, входящих хотя бы в одну из библиографических баз цитирования (PubMed, Scopus, Web of Knowellege и др.), в том числе с международным импакт-фактором (IF); 2 монографии; 10 статей в других журналах и сборниках, а также 16 тезисов докладов на международных конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 7 глав результатов исследований, выводов, списка литературы (361 источник). Основной текст диссертации изложен на 279 страницах, включая 69 рисунков и 13 таблиц.

Вклад автора. Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в формулировании проблемы, постановке целей и задач, планировании и проведении экспериментов, в обобщении и

интерпретации полученных результатов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

В работе использовали следующие штаммы дрожжей:

Hansenula polymorpha 22 (leu 10) - штамм дикого типа.

Hansenula polymorpha 33 (leu 10 gcrl) - штамм, неспособный к конститутивному синтезу АО в среде с глюкозой.

Hansenula polymorpha 7-4А (GCRI ЕАО) - штамм с нарушенной катаболитной глюкозной репрессией и увеличенным конститутивным синтезом АО, полученный из Hansenula polymorpha 33 (leu 10 gcrl).

Hansenula polymorpha C-105 {gcrl catX) - лишенный каталазной активности мутант метилотрофных дрожжей с нарушенной катаболитной глюкозной репрессией (конститутивный синтез АО при росте на среде с глюкозой).

Hansenula polymorpha NCYC 495 - исходный штамм для получения зависимого от НАД+ и глутатиона сверхпродуцента ФдДГ.

Hansenula polymorpha 356 (линия DL!) — штамм дикого типа, исходный штамм для получения мутантов СА2 и СА4.

Hansenula polymorpha СА2 и СА4 - штаммы с уменьшенным сродством продуцируемой АО к субстратам (этанолу).

Hansenula polymorpha Tf 11-6 - сверхпродуцент ФАДГ.

Pichia stipitis PLU20 (игаЗ Ieu2) - штамм, использованный в исследованиях по конструированию продуцента этанола.

Saccharomyces cerevisiae BY4742 (hinЗА !eu2A lysA игаЗА) (Euroscarf, Frankfurt) - штамм, использованный в исследованиях по конструированию продуцента этанола.

Перечень штаммов H.polymorpha и S. cerevisiae дикого типа и рекомбинантов с увеличенным уровнем внутриклеточного глутатиона представлен в соответствующих главах «Результатов исследований».

Условия культивирования. Клетки Н. polymorpha C-105 {gcrl catX) культивировали до средней логарифмической фазы роста на качалке при постоянной аэрации в минеральной среде (г/л): КН2Р04 - 1; (NH4)2S04 - 3,5; MgS04 х 7Н20 - 0,5; СаСЬ - 0,1. Среда содержала дрожжевой экстракт „Difco" (0,2%) в качестве источника микроэлементов и витаминов. Источником углерода служила 1% (в/о) глюкоза. Подробные условия культивирования микроорганизмов и среды приведены в соответствующих разделах работы.

Определение биомассы клеток. Биомассу клеток дрожжей (в мг/мл суспензии) определяли, измеряя оптическую плотность разведенных суспензий при 540 нм в 3 мм кювете.

Пермеабилизация клеток. Клетки дрожжей суспендировали в 50 мМ К, Na-фосфатном буфере, pH 7,5, содержащем 2 мМ ЭДТА (20-50 мг клеток/мл). К суспензии добавляли такой же объем дигитонина или цетилтриметиламмоний бромида (2 мг/мл). Смесь инкубировали на водяной бане при 30 °С в течение 15 мин. с встряхиванием через каждые 2-3 мин. По окончании пермеабилизации клетки трижды промывали соответствующим буфером.

Получение бесклеточного экстракта (БЭ). Выращенные клетки дрожжей промывали водой и К, Na-фосфатным буфером, pH 7,0. К осадку добавляли 50 мМ К, Na- фосфатный

буфер с 2 мМ ЭДТА до получения конечной концентрации клеток 90- 100 мг/л и ингибитор протеиназ 0,4 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF). К полученной суспензии в гомогенизационных стаканчиках добавляли стеклянные шарики (диаметром 0,45 - 0,50 мм) в количестве 3/4 выходного объема суспензии и замораживали. Клетки разрушали на планетарном гомогенизаторе в течение 5 мин. (1000 об./мин.) при +4 "С. Гомогенизат центрифугировали (20 мин, 15000 об./мин, +5 °С). Супернатант использовали для дальнейших определений.

Определение содержания белка. Концентрацию белка в бесклеточных экстрактах определяли методом Лоури (Lowry et al., 1951).

Определение активности оксидаз. Активность оксидаз определяли на основе количества перекиси водорода, образуемого в течение 1 мин. в пересчете на 1 мг белка или клеток. Перекись водорода анализировали фотометрически, измеряя количество окрашенного продукта окисления о-дианизидина в присутствии пероксидазы (Сибирный и др., 1987).

Определение активности алкогольдегидрогеназы (АдГ). Активность алкогольдегидрогеназы определяли по продукции НАДН, измеряя прирост оптической плотности при длине волны 340 нм (Steinman, Jakoby. 1967).

Определение активности формальдегиддегидрогеназы (ФАДГ). Активность глутатион-зависимой ФАДГ определяли спектрофотометрически на основе скорости образования НАДН при длине волны 340 нм (Schutte et al., 1976).

Определение активности пероксидазы (ПО). Активность ПО определяли путем измерения количества образованного окрашенного продукта окисления о-дианизидина при длине волны 525 нм.

Единицы определения активности ферментов, формула расчетов. Удельная активность ферментов приведена в микромолях субстрата (продукта) использованного (образованного) в течение 1 мин в перерасчете на 1 мг белка или сухой массы клеток в стандартных условиях реакции (мкмоль мин" мг"'). Если не указаны другие, специальные условия, инкубацию реакционной смеси проводили при 30 °С в водяной бане или в термостатированной кювете спектрофотометра.

Определение формальдегида и метанола в промышленных стоках с использованием АО и 4-амино-5-гидразино-3- меркапто-1,2,4-триазола (АГМТ). В опытах использовали АГМТ и параформ „Sigma". Препарат АО получали из БЭ H. polymorpha С-105. Образцовый раствор формальдегида (1 моль/дм3) получали путем гидролиза параформа в течение 4 часов при 105 °С в герметично запаянных ампулах. В качестве стандартного раствора метанола использовали реактив фирмы „Merck" с концентрацией 0,25 мМ. Анализ формальдегида проводили в соответствии с предложенной нами методикой (Bien et al., 1999).

Одновременное определение содержания метанола и формальдегида с использованием АО и гидразона З-метил-2-бензотиазолинона (МБТГ) проводили в соответствии с разработанным нами методом (Sibimy et al., 2008).

Анализ содержания этанола с использованием АдГ проводили в соответствии с методикой фирмы „Boehringer Mannheim".

Определение содержания этанола в алкогольных напитках проводили, добавляя вместо раствора этанола 0,1 мл пробы алкогольного напитка в соответствующем разведении.

Анализ содержания этанола с алкогольоксидазой и пероксидазой (метод АОП). Содержание этанола АОП-методом проводили согласно методике Гончара (Гончар и др., 1994а).

Определение содержания этанола в соках н плодово-ягодных винах проводили с использованием аналитического набора «Алкотсст» по методу (Gonchar et al., 2001; Sibimy et al., 2010).

Биосенсорные методы анализа этанола.

Разработка амперометрического биосенсора на основе алкогольоксидазы.

Ферментативный биосенсор конструировали на основе стандартного амперометрического потенциостата с использованием трех электродов: серебряно-хлорсеребряного электрода сравнения Ag/AgCl/KCl (3 M), дополнительного электрода и рабочего электрода. Амперометрические исследования проводили с использованием биопотенциостата (ЕЗ 30, „Biometra", Геттинген, Германия), соединенного с компьютером для регистрации и обработки результатов. Рабочим электродом служил графитовый стержень (RW001 диаметром 3,05 мм, „Ringsdorff Werke", Бонн, Германия), находящийся в стеклянной трубке, герметично залитый эпоксидной смолой.

Формирование чувствительной мембраны. Чувствительную мембрану формировали путем иммобилизации АО Я. polymorpha С-105 (geri catX) в слое катодного полимера CP59, синтезированного в Лаборатории аналитической химии - электроаналитики и сенсорики Рурского университета (Бохум, Германия. На поверхность рабочего электрода наносили 1 мкл суспензии АО (200 Ед./мл с удельной активностью 25 Ед./мл), рН 7,6. После высыхания суспензии АО наносили 40 мкл раствора полимера СР59 методом электроосаждения. Иммобилизация происходила в результате копреципитации молекул белка и полимера СР59.

Формирование амперометрического АОП биосенсора. Двухслойный биферментный элемент биосенсора формировали как описано (Гончар и др., 2006).

Ферментативное определение формальдегида.

Определение формальдегида методом АОП. Образцовый раствор формальдегида получали путем гидролиза параформа. В дальнейшем анализ проводили в соответствии с методикой определения этанола с той разницей, что добавляли 5-кратную концентрацию ферментов.

Определение содержания формальдегида в рыбе проводили в соответствии с описанными методами (Sibirny et al., 2011).

Использование электрохимического биосенсора для определения метанола в промышленных сточных водах осуществляли согласно разработанной нами методике (Bien et al., 1999).

Выделение из мутантов дрожжей Hansenula polymorpha АО с пониженным сродством к субстратам проводили по предложенному методу (Dmytruk et al., 2007).

Определение аминокислотных последовательностей проводили с применением программ MultAlin и BOXSHADE 3.21. Последовательности нуклеотидов АО штамма дикого типа Я. polymorpha (DL-1-356), мугантных аллелей СА2 и СА4 депонированы в базе данных GenBank Национального центра биотехнологической информации США под номерами АМ690088. АМ690089 и АМ690090.

Выделение, очистку и биотехнологическое использование ФАДГ осуществляли в соответствии с нашими разработками (Demkiv et al., 2007).

Конструирование рекомбинантного штамма дрожжей Pichia stipitis с улучшеной алкогольной ферментацией ксилозы и изучение его свойств проводили по описанным методикам в (Дмитрук и др., 2010).

Изучение алкогольной ферментации у диких и рекомбинантных штаммов Н. ро1утогрНа и 51. cerevisiae и методы их конструирвания проводили в соответствии с нашими методиками (СгаЬс1с-Ье]ко е1 а!., 2011).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка ферментативных фотометрических методов анализа этанола, метанола н формальдегида.

Наряду с химическими и физико-химическими методами все большее значение приобретают ферментативные методы определения спиртов и альдегидов. Ферментативный метод определения этанола был известен еще в пятидесятых годах прошлого века. Этот метод основан на окислении этанола до уксусного альдегида при помощи алкогольдегидрогеназы (АДГ). В этой реакции образуется НАДН, который определяется фотометрически при 340 нм:

СН3СН2ОН + НАД' СН3СНО + НАДН(1Г)

Применяемые до сих пор методы, использующие другой фермент -альдегиддегидрогеназу (АдДГ), имеют ряд недостатков, которые были частично устранены в наших исследованиях. Альтернативой методу дегидрогеназного анализа этанола является использование алкогольоксидазы (АО) метилотрофных дрожжей, которая в качестве кофермента содержит крепко связанный с белком ФАД. Катализируемая АО реакция необратима. Способность АО к образованию перекиси водорода в присутствии спиртов, в том числе этанола, используется для количественного определения спиртов:

СН3СН2ОН + о2 — СН3СН=0 + н2о2.

На этой реакции основано аналитическое использование АО в наборах по определению этанола и других спиртов, в которых анализируется количество образуемой перекиси водорода. Существуют различные колориметрические методы определения этанола с использованием АО. В Институте биологии клетки АН Украины разработаны и запатентованы новые, чувствительные методы количественного определения перекиси водорода (метод АОП), что послужило основой для использования в диагностическом наборе «Алкотест»:

Оксидаза

АН2 + 02 -> А + Н202

Субстрат оксидазы Окисленный субстрат

Пероксидаза

5Н2 + Н202 ->• 8 + 2 Н20.

Хромоген Свободная или генерированная Краситель

В наши задачи входила оптимизация методики АОП определения этанола в пробах алкогольных и безалкогольных напитков, разработка новых методов анализа формальдегида, метанола, а также смеси различных аналитов с использованием АО Н. ро1утогрИа.

1.1. Анализ этанола в плодово-ягодных винах, напитках и соках. Использован АОП-метод на основе аналитического набора «Алкотест» и его модификация в виде метода стандартных добавок для количественного определения этанола в ряде плодово-ягодных вин, безалкогольных напитков и соков. В опытах использовали АО, полученную из мутанта Н. ро!утогрИа С-105 (хсг! са1Х). Набор «Алкотест» был ранее применен для анализа содержания этанола в пиве, вине, крепких напитках. Анализ содержания этанола проведенный тремя методами: газо-жидкостной хроматографией, методом с

Вино земляничное .Special"

Вино вишневое ..Special"

Вино вишневое ..Cazar"

Вино земляничное ..Waldwein"

Вино клубничное ..Boczka truskawkowa"

алкогольдегидрогеназой (набор фирмы "Sigma", США) и алкогольоксидазой (набор „Алкотсст") показал высокую корреляцию всех трех методов (г>0,98).

На рис. 1 и рис. 2. представлено содержание алкоголя в плодово-ягодных красных и белых винах, соответственно, в зависимости от их разведения. Как видно из этих данных, не выявлено существенного отрицательного влияния химического состава вина на расчитанное

содержание алкоголя, так как в случае меньшего разведения, когда можно было ожидать наибольшего отрицательного влияния компонентов напитков на ход ферментативного определения, эти концентрации почти не уменьшаются во всех исследованных пробах. Наоборот,

наблюдается уменьшение рассчитанного количества этанола по мере разведения.

Рис. 1. Определяемая концентрация этанола в красных плодово-ягодных винах в зависимости от разведения проб

600 800 1000 1200 Разведение

Это может быть следствием ошибки при малых значениях оптической плотности в разведенных пробах с очень низким содержанием этанола.

і— Вино „NaJewka babuni" {Бабушкина наливка]

— Вино персиковое „СалеНі"

— Вино .Upa х mlodem" (Липа с иодом)

Ю-

Рис. 2. Определяемая концентрация этанола в белых плодово-ягодных винах в зависимости от разведения проб

Разведение

В дальнейшем был проведен анализ содержания алкоголя в изучаемых пробах газовой хроматографией (ГХ), которая показала незначительные различия данных о концентрации этанола по сравнению с результатами, полученными ферментативным методом. Содержание этанола, определенное ГХ, в пробах плодово-ягодного красного и белого вин составляло, соответственно, 8,52% и 9,02 %, тогда как в модификации Метода стандартных добавок (МСД) для красного вина составляло 9,94%, а для белого - 8,63% (таблица 1). В таблице I

приведены все использованные методы определения концентрации этанола в красных и белых плодово-ягодных винах.

Таблица 1. Определение этанола в плодово-ягодных винах различными методами

Вино /— Метод Содержание этанола, % Разница

Стандартный метод АОП Метод стандартных добавок (МСД) Газовая хроматография (гЗс) Стандартный АОП-ГХ МСД-ГХ

Вино персиковое „СапеШ" 9,80+0,50 8,63+0,43 9,02+0,11 +0,72 -0,39

Вино земляничное „Эре^а!" 9,22+0,46 9,94+0,53 8,52+0,11 +0,70 +1,42

Для определения содержания этанола в соках и безалкогольных напитках с целью увеличения чувствительности метода проводили анализ с применением 5-кратно увеличенного содержания ферментов. При использовании классического варианта метода АОП, линейность калибровочной кривой сохранялась до концентрации аналита 0,9 г/л. При 5-кратном увеличении содержания ферментов (АО и ПО) в реакционной смеси отмечалось также 5-кратное увеличение наклона калибровочной кривой (8,02 по сравнению с 1,61), что можно было ожидать на основании прекращения ферментной реакции на этапе 5 - 10% аналита. При использовании такого варианта метода обнаруживались следовые количества алкоголя, что не представляется возможным при использовании стандартной методики. Следовательно, этот вариант метода, несмотря на использование большего количества ферментов, в 5 раз более чувствителен (таблица 2).

Таблица 2. Содержание этанола в соках и безалкогольных напитках, определенное стандартным методом АОП и с использованием 5-кратной концентрации ферментов

Соки и безалкогольные напитки

Клубничный напиток „Сарру" Яблочный сок „Fortuna" Малиновый сок „Karmi" Пиво безалкогольное „TESCO"

Содержание этанола — стандартный метод АОП (%) 0,035+0,003 0,024+0,002 0,009+0,001 0,005+0,0005

Содержание этанола с 5-кратной концентрацией ферментов (%) 0,068+0,004 0,043+0,003 0,022+0,002 0,049+0,003

Представленные результаты свидетельствуют о возможности использования метода АОП для анализа этанола в алкогольных и безалкогольных напитках, соках и вине. Использование этого метода облегчает анализ этанола по сравнению с традиционными методами -рефрактометрическим и ареометрическим.

2. Энзиматическое определение формальдегида (ФА) в рыбных продуктах с использованием АО и ФАДГ.

Высокая токсичность ФА вызывает необходимость его контроля в окружающей среде, промышленных продуктах, медицинских препаратах, а также в некоторых продуктах питания. Особенно высок уровень ФА в некоторых рыбных продуктах. В тканях мороженной морской рыбы определенных видов при неглубокой заморозке (1° < -30 °С) в результате эндогенных метаболических реакций образуются высокие конце[гграции формальдегида, что приводит к ухудшению вкусовых качеств пищевых продуктов и даже к отравлению. Мясо рыбы становится сухим, жестким, что объясняется денатурацией белков мышц. Такие процессы наиболеее характерны для рыб семейства тресковых (СасИс1ае) -трески (вш/их тоНгиа), сайды (С. у/геял), пикши (С. аефГиш5\ мерлана (С. тег1ап%ш), хека (МегЫсЫиз 5/7.) или мерлузы (Мег1иссш V/).). Содержание ФА в такой рыбе может достигать 210 и даже 780 мг на 1 кг массы. ФА наряду с диметиламином (ДМА) являются продуктами одной и той же реакции энзиматического разложения природного компонента многих видов рыбы - 1\Г-окиеь триметиламина (ТМАО):

(СНз)зМ+-0- -(СН3)2МН + СН20.

ТМАО ДМА ФА

ТМАО вместе с бетаином (СНз)зЫ+-СН2-СОО" играют важную роль в регуляции осмотического давления в клетках морских рыб. Следует отметить, что потребление замороженных рыбных продуктов, в частности, рыбы семейства тресковых (СасННае) с высоким уровнем ФА приводит не только к быстрому снижению пищевых и органолептических качеств рыбной продукции, но и к токсическому влиянию ФА на организм человека.

Ниже представлены результаты применения двух разработанных ферментных методов для анализа ФА в рыбных пищевых продуктах. В обоих методах использованы сконструированные продуценты ферментов. Один из методов основан на использовании АО и пероксидазы (метод АОП) тогда как во втором методе используется рекомбинантная дрожжевая КАО+ - и глутатион-зависимая формальдегиддегидрогеназа (ФАДГ). Оба фермента выделены из клеток Н. ро1утогра: мутанта С-105 (¡¡сг! са1Х) со сверхпродукций АО и рекомбинантного штамма Т-11-6 гипсрэкспрессией гена /У./)/, кодирующего ФАДГ.

Также была показана возможность использования АО для ферментативного анализа ФА в сточных водах даже в присутствии природного субстрата АО - метанола. Изучали возможность использования обоих ферментов, АО (с пероксидазой) и ФдДГ для анализа ФА в рыбных продуктах. В опытах использовали образцы мороженной рыбы семейства тресковых (Са<1Шае) (хек, треска), которые чаще всего продаются на европейском рынке, а также свежего (немороженного) карпа. Полученные результаты сравнивали с данными четырех химических методов: Нэша и методов с использованием хромотроповой кислоты, 4-амино-3-гидразино-5-меркапто-1 ,2,4-триазола (РиграШ) и МБТГ.

На рис. 3 представлены калибровочные кривые для двух энзиматических методов по сравнению с лучшими химическими методами. Из данных следует, что АОП-метод имеет максимальную чувствительность: наклон соответствующей калибровочной кривой равен 59,3, что соответствует милимолярной экстинкции образованного окрашенного продукта (в мМ см- ). Действительно, наблюдаемое значение наклона - это мшшмолярная экстинкция исчезновения (Емм), умноженная на коэффициент преобразования для ферментативной реакции (к): наклон = е„м * к. Величина е„м для окисленного ТМБ равна 81,7 мМ"1 см"1. Таким образом, коэффициент преобразования аналита для АОП-метода при использованных экспериментальных условиях составляет 72,6%. Для ФАДГ- метода, коэффициент

преобразования аналита составляет 32,9%, предполагаемая милимолярная экстинкция для НБТ-формазана равна 10,2 мМ-1 см"' при 570 нм в кислой среде (собственные данные).

Рис. 3. Сравнительный анализ различных методов определения ФА: АО-пероксидазный (АОП), метод с использованием «Пурпальда», метод Нэша, метод с использованием МБТГ (гидрохлорид З-метил-2-бензо-тиазолин гидразона), метод с использованием хромотроповой кислоты и формальдегид-дегидрогеназный метод (ФАДГ). Наклон калибровочных кривых характеризует чувствительность методов. Значения наклона и коэффициенты линейной

регрессии показаны для каждой калибровочной кривой.

Линейность калибровочной кривой для АОП-метода сохранялась даже при высокой оптической плотности - до 0,9 что соответствует 15 мкМ ФА в реакционной смеси (15 нмоль на 1 мл), и порог чувствительности метода составлял около 0,8 нмоль/мл. Эти аналитические параметры наилучшие по сравнению с четырьмя химическими методами, даже с использованием МБТГ или Пурпальда.

Метод на основе ФАДГ показывает линейность (при ферментативной конверсии более 33%), по крайней мере до 100 мкМ ФА, и его чувствительность, близкую к методу Нэша (наклоны 3,36 и 4,46, соответственно). Метод на основе использования ФдЦГ почти в 18 раз менее чувствителен по сравнению с АОП-методом. Аналитические параметры предлагаемых ферментативных методов и известным* химических методов представлены в таблице 3.

На основании анализа данных можно сделать вывод о том, что АОП-метод и метод с использованием МБТГ имеют наилучшие характеристики. АО может катализировать окисление только ФА, хотя распознает первичные спирты, в первую очередь, метанол и этанол. Принимая во внимание отсутствие спиртов в тканях рыб, можно заключить, что лучше всего для определения ФА в рыбных продуктах подходит АОП-метод по сравнению с анализом этого альдегида методом с использованием МБТГ. Чтобы проверить обоснованность предлагаемых энзиматических методов для анализа ФА в рыбных продуктах, была проанализирована мышечная ткань образцов, взятых из замороженного хека и трески.

Полученные результаты представлены в таблицах 4 и 5. Было выявлено, что проанализированные образцы хека и трески, содержат высокие концентрации токсичного ФА, до 100 мг/кг влажной массы ткани. Как можно было предвидеть, содержание ФА в мышцах карпа ничтожно мало. Данные, представленные в таблице 4, показывают существенное различие между содержанием ФА при его определении различными методами. Для сравнения надежности действия обоих ферментных методов и оценки возможного интерферирующего влияния химического фона реальных образцов на результаты анализов, было проанализировано содержание ФА в ТХУ-экстрактах с помощью

Концентрация ФА в реакционной смеси, мМ

традиционной методики (с внешней калибровкой), а также с использованием метода стандартных добавок (МСД). Одновременно, содержание ФА было проанализировано двумя химическими методами (с использованием хромотроповой кислоты и МБТГ).

Таблица 3. Биоаналитические характеристики различных методов анализа формальдегида

Метод ^-ІШХ, нм е. , , мМ см Лимит определения, мкМ Диапазон линейности, мМ Стабильность цвета, ч Время анализа, мин

>я § о и МБТГ 670 65,0 0,9 0,0025-0,015 >40 30

Хромотроповая кислота 578 15,7 2,5 0,005-0,05 >24 30

я г к Пурпальд 548 28,2 1,5 до 0,025 - 20

* Метод Нэша 400 4,4 6,9 до 0,110 >5 5

>я 10,2 (3,36 8,9

в м Я Й На основе ФАДГ 570 при неполной конверсии) 0,01-0,06 >8 15

н я ш ФАДГ и Диафораза 500 11,0 1,7 до 0,1 - 21

о. <и е На основе АОП 450 59.3 0,80 0,001-0,015 >5 20

Как видно из таблицы 4, существует хорошая корреляция между всеми аналитическими данными, полученными в МСД-варианте методики, в отличие от результатов, полученных в традиционном варианте с внешней калибровкой. Это явление можно объяснить интерферирующим влиянием некоторых компонентов, которые совместно экстрагировались ТХУ из тканей рыб. Данное предположение подтверждается данными, полученными методом на основе ФАДГ (рис. 4).

Таблица 4. Результаты определения ФА (в мг на 1 кг влажной массы мышечной ткани) в безбелковых экстрактах рыбы с использованием трех различных методов: на основе АО, метода Нэша и реактива «Пурпальд»

Хек Треска Карп

На основе АО М±м 90,0±2,6 74,1±1,1 0,0

Нэш М±м 121,6+0,9 96,8±3.1 0,0

«Пурпальд» М±м 100,6+1,6 59,7+3,1 0,0

0,25 т

0,20

0,15

0,10 -

0,05

Разведение: 20 А=0.056 +/- 0.001 В=1.821 4-0.012 И=0.999 +/- 0.001

-0,01 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 Добавленный ФА, мМ

Разведение: 60 А=0.020 +1- 0.009 В-1.942+/- 0.208 №0.999 «/-0.006

Рис. 4. Метод стандартных добавок для определения ФА с использованием ФдДГ- метода. Кривая 1 соответствует калибровочному методу, проведенному для водных растворов ФА (внешняя обычная калибровка); кривые 2 и 3 соответствуют методу стандартных добвок (ФА добавляли концентрациях к анализируемых проб), представлены статистические данные: линейной регрессии (коэффициенты уравнения У=А+ВХ, где У -оптическая плотность, X — концентрация ФА (мМ), А -оптическая плотность для проб без

различных растворам На рисунке некоторые параметры

добавления экзогенного ФА, и В - значение наклона); Я - коэффициент линейной регрессии.

Наклон калибровочных кривых, выполненных при анализе экстрактов ткани рыбы, зависит от фактора разведения: чем больше разведение, тем сильнее наклон (меньше интерферирующее влияние). Для внешней калибровки (без наличия фона реального образца, что соответствует бесконечному разбавлению), наклон был наибольшим: 2,95 по сравнению с 1,94 (60-кратное разведение образца) и 1,82 (20-кратное разведение). Для АОП-метода, подобно как и для химических вариантов, не выявлена существенная разница между традиционным и МСД-вариантом анализа.

Рыбные продукты являются важным источником пищевого белка. Рыба семейства тресковых (СаШ(1ае) занимает в рейтинге второе место по размеру промышленного улова после семейства сельдевых рыб (СЫреШае), занимающих первое место, но последние чаще используются в сельском хозяйстве и промышленности, тогда как тресковые более предпочтительны в качестве продуктов питания.

Таблица 5. Результаты определения ФА (в мг на 1 кг влажной массы мышечной ткани) в безбелковых экстрактах рыбы хек при использовании четырех различных методов: на основе ФдДГ, АО, МБТГ и хромотроповой кислоты

Метод Метод стандартных добавок (МСД) Стандартная методика

На основе ФдДГ М±м 101,8±3,2 (р<0,05)* 64,3+8,6

На основе АО М+м 95,3±3,7 (р>0,05)** 98,0+3,5

МБТГ Мім 104,3±5,6 (р>0,05)** 106,4±7,9

Хромотроповая кислота М+м 100,5±1,2 (р>0,05)** 102,8+7,3

•Разница между стандартной методикой и МСД статистически достоверна; "Разница между стандартной методикой и МСД статистически недостоверна.

Итак, показана возможность успешного применения ферментных методов анализа ФА (с использованием АО и ФАДГ) в пищевых рыбных продуктах. Были разработаны

оптимальные методики для проведения определений, а аналитические параметры ферментных методов сравнивали с соответствующими параметрами нескольких химических методов. Показана корреляция результатов анализа для обоих ферментных методов по сравнению с химическими методиками, хотя анализ на основе АО более предпочтителен благодаря его высокой чувствительности, хорошей линейности, устойчивости к интерферирующему влиянию компонентов анализируемых проб и возможности использования без предварительной обработки образцов, а также отсутствию агрессивных реагентов.

АОП метод может быть использован для определения формальдегида в замороженной рыбе семейства тресковых - треска, хек, и другие. Полученные результаты свидетельствуют о высоком содержании данного токсиканта в исследованных образцах рыбы, что указывает на необходимость постоянного мониторинга этого параметра при оценке качества пищевых продуктов.

3. Использование энзимо-химического метода для определения содержания формальдегида и метанола в промышленных сточных водах.

В данном разделе описан новый ферментно-химический метод для одновременного определения метанола и формальдегида в смеси обоих соединений, основанный на окислении метанола в формальдегид, опосредованного алкогольоксидазой (АО), с последующим определением образованного формальдегида при помощи З-метил-2-бензотиазолидингидразона (МБТГ). Содержание ранее присутствовавшего в пробе ФА определяется без воздействия АО на исследуемые образцы.

В аэробных условиях при 20 "С для разложения формальдегида требуется около 30 часов, в анаэробных - 48 часов. ФА конденсируется с аминами в воде, образуя уротропин. ФА классифицирован в качестве токсичного, едкого и канцерогенного вещества (категория 3). Среди новых аналитических подходов предложены ферментативные и биосенсорные методы, которые могут получить широкое распространение при наличии доступных, стабильных и дешевых ферментов с требуемой селективностью.

Использование АО для ферментного определения метанола и формальдегида (в пробах, содержащих оба вещества) не создает проблем для образцов, которые не содержат других субстратов АО, например, таких как этанол. Однако, стандартное использование такого метода для проб, содержащих как метанол, так и формальдегид, невозможно, так как АО окисляет оба субстрата. Для предотвращения спонтанной полимеризации ФА, в промышленности применяется метанол, содержание которого в техническом формалине составляет 4—8%. Мы показали возможность использования АО для ферментативного анализа ФА в сточных водах и даже в присутствии природного субстрата АО - метанола.

Для одновременного анализа метанола и формальдегида разработан оксидазно-химический метод с использованием АО и селективного реагента для альдегида - МБТГ. Метод основан на окислении метанола в ФА, катализируемого АО и на последующей колориметрической реакции полученного продукта - ФА с использованием селективного реагента для альдегида (МБТГ). Формальдегид, присутствующий в образце, определяется посредством колориметрической реакции с МБТГ, без воздействия АО на исследуемые пробы (СО0) в реакции:

РеС13

[СН2О]0 + МБТГ -> [МБТГ-СН20]о -> цианиновый краситель, (СОо), азин (/„„„-670 нм)

а содержание метанола определяется по образованию окрашенного продукта (СОд) после предшествующей реакции окисления метанола с участием АО: АО МБТГ РеС1}

СН3ОН + О2 -> [С!ЬО]Л — [МБТГ-СН20]Л -> СЭд.

-н2о2

Метанол в присутствии АО окисляется до формальдегида: АО

СН3ОН + о2 н2с=о + н2о2.

В присутствии МБТГ и АО, формальдегид вступает в реакцию с МБТГ образуя азиновый аддукт, что предотвращает окисление формальдегида АО. Таким образом, МБТГ в предложенном методе играет двойную роль: действуя как химическая ловушка - агент, маскирующий наличие формальдегида, а также в качестве субстрата для следующей реакции формальдегида с Ее (III), в которой образовавшийся азиновый аддукт преобразуется в цианиновый краситель тетраазопентаметиновой природы.

С целью доказательства надежности предлагаемого ферментно-химического метода одновременного определения метанола и формальдегида в смеси, были подготовлены образцовые растворы, содержащие анализируемые соединения отдельно и в смеси. Проверена способность образования цветных продуктов с МБТГ в присутствии ионов Ре3+ без добавления АО, а также в присутствии этого фермента на первом этапе реакции. На рис. 5 показана связь между оптической плотностью реакционной смеси и концентрацией аналитов без добавления АО.

На основании этих данных можно сделать вывод, что только формальдегид (кривая А) образует окрашенный продукт с МБТГ в отсутствие АО, но ни метанол, ни муравьиная кислота не образуют (кривые В и С, соответственно). Добавление этого фермента в первой стадии реакции, в присутствии МБТГ, приводит к окислению метанола в формальдегид, который образует окрашенный продукт (рис. 6). Очень схожие результаты этих значений указывают на практически полное окисление метанола до формальдегида в реакции, катализируемой АО. Как видно, АО может окислять, кроме метанола, также формальдегид с образованием муравьиной кислоты, которая не образует окрашенного продукта в реакции с ионами железа (III) (см. рис. 4.14, кривая С).

■ - формальдегид (А) • - метэнол (В) А- формиат (С)

В, С

Рис. 5. Зависимость оптической плотности от концентрации аналитов (без добавления АО).

Положительную реакцию в системе

цветную метанол + МБТГ+ АО" + -> Ре'*" (рис. 6) можно рассматривать как свидетельство

формирования в

[Анагшт], мкМ

ферментной реакции формальдегида, который затем не окисляется АО до муравьиной кислоты. Этот факт может быть объяснен образованием на первом этапе реакции азинового

аддукта формальдегида с МБТГ который, в отличие от свободного формальдегида, не может быть окислен АО, но принимает участие в последующей колориметрической реакции с ионами железа в кислой среде.

Рис. 6. Зависимость между концентрацией метанола и оптической плотностью проб (в присутствии АО).

Этот вывод подтвержден следующих опытов:

полностью сравнением 1 - инкубация

5 ю 15 го формальдегида с АО в течение 30

[Метанол], мкМ мин. в присутствии МБТГ вариант

"формальдегид + АО +МБТГ —► Ге3+" (рис. 7, кривая А); 2 - инкубация формальдегида с АО в буферным растворе, а затем добавление смеси МБТГ с ионами железа, вариант "формальдегид + АО —► МБТГ + Ре3+ (рис. 7, кривая В). Как показано на рис. 7, реакция положительная (формирование цветного продукта) для варианта № 1 и отрицательная для варианта № 2. Такие же реакции наблюдали для метанола: для варианта "метанол + АО +МБТГ —> Ре " (рис. 7, кривая С), реакция образования цветного соединения

положительная, тогда как при втором варианте -"метанол + АО —► МБТГ + Бе

кривая О) - реакция отрицательная.

(рис. 7,

Рис. 7. Зависимость между оптической плотностью и концентрацией аналитов в пробе (в присутствии АО) в зависимости от этапа добавления МБТГ. А, С - МБТГ вместе с АО добавлен на первом этапе реакции; В, О -МБТГ добавлен на втором этапе реакции (в растворе с КеС1}) после предварительной инкубации пробы с АО

На основании полученных результатов сделан вывод о том, что МБТГ на первом этапе реакции выступает как соединение, связывающее формальдегид и тем самым предотвращающее окисление формальдегида с участием АО. МБТГ также используется в качестве субстрата для этого аналита в последующей колориметрической реакции с ионами железа. Это означает, что добавление АО к смеси МБТГ не влияет на результаты определения формальдегида, уже присутствующего в тестируемых пробах. Эти выводы подтверждает анализ содержания метанола и формальдегида в модельных растворах (общая концентрация обоих аналитов - 10 мкМ) без добавления АО и в присутствии этого фермента (рис. 8, кривые А и В, соответственно).

15 20

[Аналит], мкМ

Из полученных результатов следует: во-первых, в отсутствие АО, увеличение концентрации метанола не влияет на результаты определения формальдегида, во-вторых, в присутствии АО наблюдали практически те же значения оптической плотности смеси этих двух аналитов в различных молярных соотношениях, но в той же суммарной концентрации. Об этом свидетельствует увеличение оптической плотности, возникающее при анализе формальдегида уже присутствующего в пробе и формальдегида, вновь образованного из метанола в реакции, катализируемой АО.

Рис. 8. Зависимость между оптической плотностью проб и реальным содержанием формальдегида и метанола в 10 мкМ смеси этих аналитов (в молярных процентах). А - без добавления АО; В - с добавлением АО. В обоих случаях МБТГ добавляли на первом этапе реакции.

100 % формальдепиа

во 60 40 20 0 % метанола

Относительное содержание аналитов, молярные %

Разработанный ферментно-

химический метод определения формальдегида и метанола в смеси был использован для определения этих соединений в образцах различного происхождения -промышленных сточных водах (после кислотной дистилляции) и коммерческом продукте -формалине, который содержит формальдегид и метанол (как стабилизатор для предотвращения полимеризации формальдегида). Результаты определений в сточных водах показаны в таблице 6. На основании этих данных можно утверждать, что результаты, полученные ферментативно-химическим методом аналогичны результатам, полученным с помощью химических методов и ГХ.

Таблица 6. Определение метанола и формальдегида в разбавленных промышленных стоках после кислотной дистилляции, а также в техническом формалине

Образцы Содержание метанола (МеОН) и формальдегида (ФА), мг/л (М±т, п=4)

Ферментативно-химический метод Газовая хроматография Химический метод (хромотроповая кислота)

МеОН ФА МеОН МеОН ФА

I 2,59±0,19 4,36±0,23 3,30±0.5 2,70±0,13 4,62±0,11

II 4,61 ±0,34 7,15±0,37 5,39±0,5 4,72±0,27 7,27±0,20

III 3,29±0,38 6,$5±0,23 3,40±0,5 3,01±0,08 6,49±0,28

IV 2,80±0,32 6,23±0,25 3,53±0,5 2,70±0,05 6,58±0,33

V 0 1,72±0,20 0 0 1,85±0,10

VI 0 1,48±0,13 0 0 1,73±0,08

VII 3,77±0,30 2,66±0,16 3,13±0,2 3,79±0,12 3,82±0,15

VIII 4,15±0,32 2,14±0,27 3,06±0,5 3,93±0,31 4,11±0,13

Технический формалин (37,2% ФА; 48% МеОН) 60,24±6,88 или 5,59±0,64% 417,6±29,5 или 38,72±2,74% 53,8±5,35 или 5,0±0,5% 56,5±4,95 или 5,25±0,46% 391±40 или 36,3 ±3,7%

Новый метод дает возможность реализации отдельных определений метанола и формальдегида в смсси и может быть использован для определения как в модельных растворах, так и в промышленных стоках и в коммерческих препаратах формалина. Порог чувствительность этого метода для обоих аналитов составляет 1 мкМ, что соответствует 3032 иг аналита в 1 мл реакционной смеси, что в 3,2 раза выше по сравнению с химическим методом с использованием перманганата калия и хромотроповой кислоты (рис. 9). Следует подчеркнуть, что чувствительность предлагаемого ферментно-химического метода анализа значительно выше (1000х) по сравнению с рН-БРЕТ биосенсорами. Линейность

калибровочной кривой является достоверной (р<0,0001) и стандартное отклонение определений в реальных образцах не превышает 7%.

Рис. 9. Сравнение чувствительности химических и ферментативно-химических (ФХ) методов определения формальдегида и метанола. Наклон калибровочных кривых характеризует чувствительность методов

■ - ФХ С70 ни; форналъд«гмд

На рис. 10 представлены линии регрессии корреляции данных, полученных предложенным методом, и двумя референтными методами. Более низкий коэффициент корреляции с хроматографическим методом можно объяснить сложностью процесса анализа метанола и формальдегида методом ГЖХ.

Рис. 10. Корреляция между результатами определения метанола (мг/л) полученными методом газовой хроматографии (А), химическим методом (В) по отношению к результатам ферментно-химического метода

Таким образом, разработан новый ферментно-химический метод для одновременного определения метанола и формальдегида в образцах, содержащих оба этих вещества, с использованием АО и МБТГ. Фермент АО окисляет метанол до формальдегида, а МБТГ играет двойную роль: на первом этапе реакции образуется бесцветный азиновый аддукт с

присутствующим ранее и ФА, образованным в результате ферментной реакции, предотвращая его окисление под влиянием АО; на втором этапе реакции происходит окисление азинового аддукта в окрашенный продукт под влиянием Ре+3 в кислой среде. Возможность одновременного определения метанола и формальдегида предложенным методом доказана как на модельных смесях, так и для проб сточных вод фабрики по производству пластмасс в Пусткове (Польша), а также для технического формалина

Предлагаемый метод, в отличие от химических методов, не требует использования вредных, агрессивных химических веществ (серная, фосфорная или хромотроповая кислоты, перманганат калия), проще в реализации и может быть использован для контроля аналитов в промышленных сточных водах и различных продуктах, содержащих формальдегид.

4. Конструирование элементов биосенсоров, селективно реагирующих на метанол, этанол и формальдегид.

Возможность использования мутантных клеток метилотрофных дрожжей для разработки биосенсоров, селективных для спиртов (метанол, этанол) и формальдегида, была предметом экспериментальных исследований, изложенных в данной главе. План опытов включал:

• селекцию мутантов метилотрофных дрожжей с генетически модифицированным физиологическим ответом на целевые аналиты - метанол, этанол и формальдегид по следующим параметрам: 1) потребление кислорода, 2) выделение перекиси водорода;

• химическую модификацию мутантных клеток в целях повышения селективности аналитического ответа клетки: снижение проницаемости мембран (пермеабилизация) клеток дигитонином или бромидом цетилтриметиламмония;

• конструирование биораспознающих элементов путем иммобилизации генетически или химически модифицированных дрожжевых клеток на поверхности трансдуктора;

• изучение аналитических характеристик лабораторных прототипов биосенсоров для анализа метанола, этанола или формальдегида.

Для анализа спиртов разработаны микробные амперометрические биосенсоры на основе сконструированных мутантов дрожжей с модифицированной физиологической реакцией на аналит. До сих пор предложено много биосенсоров с использованием амперометрических трансдукторов. В большинстве из них используются селективные электроды: кислородный и перекисный. Для повышения селективности сенсоров использованы методы метаболической инженерии. Нами целенаправленно введены мутации, которые тормозили реакции, связанные с использованием кислорода (кислородный биосенсор) или продукцию других электрохимически активных веществ, способных взаимодействовать с электродом (например, перекись водорода с перекисным электродом). С другой стороны, мы использовали химическую модификацию клеток для повышения проницаемости клеточной мембраны для веществ с низкой молекулярной массой.

Мутантный штамм Н. ро/утогрка 7-4А (дсг! ЕЛО) с нарушенной катаболитной репрессией и повышенным конститутивным синтезом АО был выделен после мутагенеза УФ из штамма Н. ро!утогрИа 33 (цсг!). Колонии с повышенной активностью фермента обладали активностью АО в присутствии ингибитора АО - азида натрия. Другой мутант Н. ро1утогрка С-105 (%сг1 смХ) с неактивной каталазой был селекционирован из штамма 33 с нарушенной катаболитной глюкозной репрессий АО. Он неспособен к разложению экзогенной перекиси водорода до кислорода. Изучение дыхательной селективности клеток штамма 7-4А в отношении различных субстратов показало, что зависимое от этанола использование

кислорода клетками мутанта 7-4А при росте на глюкозе было на порядок выше по сравнению с диким типом.

Увеличение дигитонином или бромидом цетилтриметиламмония проницаемости мембраны мутантов незначительно усиливаало их зависимое от алкоголя потребление кислорода. Фермент АО, который использует кислород для непосредственного окисления алкоголя, имеет высокую молекулярную массу (около 600 кДа) и содержит нековалентно связанный ФАД в качестве простетической группы. Эти особенности вызывают неспособность АО диффундировать через мембраны клеток, что позволяет использовать их в качестве естественной формы "инкапсулированной АО".

Отсутствие каталазы у мутанта С-105 вызывало выделение перекиси водорода во время инкубации клеток с метанолом. Увеличение проницаемости мембран, вызванное дигитонином или бромидом цетилтриметиламмония мутантных клеток увеличивает в 4 раза секрецию клетками Н2Ог- Это связано с облегченной диффузией перекиси водорода через клеточные мембраны и, возможно, «вытеканием» из клеток некоторых ферментов. Как показано на рис. 11, мутанты 7-4А, и С-105 при росте на глюкозе имели высокую активность АО - с 4,5 до 6,0 Ед./мг белка в бесклеточных экстрактах.

Рис. 11. Активность АО в бесклеточных экстрактах селекционированных мутантов Н. polymorpha 22 wt (дикий тип), 7-4А и С-105 при росте на среде с глюкозой (Glc) и метанолом (Mth)

Клетки этих мутантов, иммобилизованные в геле альгината кальция и помещенные на поверхности О2- И Н2О2- селективных электродов, были использованы в качестве биоэлементов алкоголь-специфичных сенсоров. Типичные кривые времени отклика для обоих микробных сенсоров показаны на рисунке 12. Сигнал для электрода «клетка/кислород» (1) возрастал быстрее, чем для электрода «клетка/перекись водорода» (2). Оба амперометрических биосенсора показывали высокую чувствительность -нижняя граница чувствительности составляла 0,2 мМ для этанола и 0,03 иМ для метанола. Сконструированные микробные биосенсоры проявляли подобную селективность к спиртам. Наибольший отклик наблюдали в отношении метанола (100%), меньший - для этанола и формальдегида; очень слабый сигнал был зарегистрирован для глюкозы и глицерина, в отличие от других микробных сенсоров (рис. 13).

100

Рис. 12. Кривые ответа микробных сенсоров на этанол. 1 - мутант К ро1утогрИа 7-4А (со сверхэкспрессией АО) — Ог электрод, 0,05 мМ этанол; 2 - мутант Н. ро1утогрИа С-105 (лишенный каталазной активности) — Н2О2 электрод, 2 мМ этанол

- Рис. 13. Селективность амперо-

метрического биосенсора на основе пермеабилизованных мутантных клеток Н. polymorpha, иммобилизованных на 02-электроде. Eth - этанол, Meth - метанол, Form - формальдегид, Glicer - глицерин, Glc - глюкоза

Eth Meth Form Glicer Glc

Очевидно, некоторые физиологические характеристики клеток метилотрофных дрожжей, таких как секреция Н202 или потребление 02, могут быть использованы как специфичный сенсорный ответ на метанол, этанол или формальдегид.

5. Биосенсорное определение метанола в промышленных сточных водах.

В опытах по изучению возможности использования амперометрического биосенсора для определения метанола в окружающей среде использовали ферментный тип биоэлемента -препарат АО Н. polymorpha С-105 очищенный посредством осаждения сульфатом аммония и хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе.

АО использует кислород в процессе окисления метанола согласно реакции:

СН3ОН + 02 -> НСНО + н2о2.

В присутствии метанола в ячейке сенсора, каталитическое действие АО, иммобилизованной в геле альгината кальция между тефлоновой и поликарбонатной мембранами, приводит к локальному снижению концентрации кислорода на чувствительной поверхности датчика, уменьшая ток в электроде Кларка. Сигнал достигал стационарного уровня после достижения в биомембране равновесия процессов диффузии кислорода и метанола. Разработанный биосенсорный метод был использован для анализа промышленных сточных вод крупного химического предприятия «Кендзежин» в городе Кендзежин-Козле (Польша). В пробах сточных вод, взятых на очистных сооружениях, показано наличие метанола (рис. 14). Для сравнения был использовали предложенный нами ранее ферментно-химический метод фотометрического определения метанола.

Представленный биосенсорный метод позволяет определять метанол в присутствии формальдегида, хотя формальдегид может также окисляться в реакции с АО. Это можно объяснить гораздо более низким сродством АО к формальдегиду по сравнению со сродством АО к метанолу. Даже 3-кратный избыток формальдегида по сравнению с метанолом не влияет на точность определения последнего. Как видно из данных, приведенных на рис. 14, результаты анализа метанола в промышленных сточных водах биосенсорным методом были схожи с данными, полученными при помощи ферментно-химического метода с использованием АГМТ. Биосенсорный метод прост в использовании, требует только кислородный электрод и АО. Поскольку он подходит для непрерывного мониторинга содержания метанола в окружающей среде, его использование имеет большое будущее в химической, фармацевтической, промышленности, технологии очистки воды и сточных вод промышленных предприятий.

Первичный Азротэнк Вторичный Очищенные

Рис. 14. Содержание метанола (ммоль/л) в сточных водах очистных сооружений азотного комбината «Кендзежин», полученное биосенсорным и ферментно-химическям методами

6. Разработка амперометрических биосенсоров на основе АО с использованием новых технологий.

В исследованиях по улучшению амперометрических биосенсоров использовали новые технологии:

• иммобилизацию фермента на поверхности электрода путем электроосаждения в

присутствии катодных/анодных полимеров;

• дополнительное введение в структуру биоселективного слоя пероксидазы хрена;

• включение в структуру электродного полимера осмий-содержащего переносчика.

6.1. Иммобилизация АО методом электроосаиедения и изучение возможности использования АО в беспероксидазном биосенсоре. Использовали АО с удельной активностью 23 мкМ'мин" мг"1. Биосенсоры конструировали в трех- электродной конфигурации. В качестве сравнительного электрода был использован Ag/AgCI/ЗM КС1 (серебро-хлорид серебра), а в качестве дополнительного (вспомогательного) электрода был применен платиновый электрод, тогда как рабочий электрод был сформирован на основе графитового стержня. Матрицей для электроосаждения ферментов и химической "прививки" осмий-содержащего медиатора служили анодные и катодные полимеры.

6.2. Конструирование двухфсрментного биосенсора на основе АО и ПО. Изучена возможность введения в состав сенсорного элемента пероксидазы хрена (ПО). ПО в процессе пероксидазного восстановления перекиси водорода может принимать электроны от анода с участием медиатора, содержащего осмий. Образующаяся в результате оксидазной реакции Н2О2 может негативно влиять на стабильность АО, поэтому важно было создать условия для быстрого разложения Н2О2.

Оптимальная структура двухферментного электрода имела конфигурацию ПО/Оз-АР59//АО/СР9 и состояла из двух слоев: первый содержал пероксидазу хрена, введенную в состав полимера Оя-АР59 путем электроосаждения, а второй (внешний) - алкогольоксидазу, иммобилизованную путем катодного электроосаждения в присутствии аминосодержащего полимера (СЯ9). Такая структура биоэлемента обеспечивает быстрый перенос электронов с поверхности электрода на окисленный активный центр ПО при участии осмий-содержащего полимера.

На рис. 15. показана схема конструкции двухферментного биосенсора на основе АО и ПО.

Рис. 15. Схема строения биосенсора на основе АО и ПО

двухферментного

В этой конфигурации окисление этанола, катализируемое АО в наружном слое, связано с окислением пероксидазой комплекса Оз2+ в составе анодного полимера второго слоя и заканчивается восстановлением осмий-содержащего посредника на рабочей поверхности электрода. Чувствительность сконструированного биосенсора была более высокой по сравнению с описанными ранее амперометрическими аналогами на основе АО. Стабильность биосенсоров изучали путем повторного определения сенсорного ответа на 4 мМ этанол при хранении биоэлектрода в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,5 (+4 °С). Стабильность оказалась достаточной, поскольку при 50%-ном уменьшении сигнала за 7 суток сенсорный ответ практически оставался неизменным в течение продолжительного времени (рис. 16).

[ ■ Добавлен 4 мМ у

^100

Рис. 16. Стабильность двухферментного биосенсора структуры ПО/Оз-АР59//АО/СР59

I ! Данный биосенсор применялся в

дальнейшем в опытах по изучению использования природных и мутантных форм АО с уменьшенным

, ,............... , сродством фермента к субстрату в биосенсорных

Время, еут. " 1 ' технологиях.

7. Мутантные формы АО //. ро1утогрка в качестве селективного элемента амперометрического биосенсора.

Выявление и количественное определение спиртов с высокой селективностью и точностью требуется в самых различных областях. Ферментативный и биосенсорный подходы относятся к числу наиболее подходящих аналитических методов в этой области. Алкогольоксидаза дрожжей широко используется для количественного определения первичных спиртов и формальдегида, достигнут значительный прогресс в выборе оптимального транедуктора, иммобилизации и стабилизации фермента. Однако, сродство АО к этанолу достаточно высокое, и прямое измерение целевого аналита на основе АО, например, этанола в реальных образцах вин, пива или бродильных культур, является сложным и экономически невыгодным из-за необходимости многократного трудоемкого разведения образцов. Для преодоления этого недостатка необходимо получение модифицированных форм АО со сниженным сродством к субстрату и широким диапазоном линейного отклика.

Нашей задачей была селекция штаммов метилотрофных дрожжей Я. ро1утогр!га с уменьшенным сродством к этанолу, идентификация изменений в мутантных аллелях

структурных генов АО у полученных штаммов, препаративное выделение мутантных форм белков, а также изучение возможности их использования в биосенсорных технологиях.

7.1. Мутагенез и селекция мутантных штаммов, скрининг мутантов по активности АО. Для выделения мутантов клетки исходного штамма дикого типа Я. polymorpha DL-1-356 культивировали в жидкой среде с глюкозой до середины логарифмической фазы роста, промывали дистиллированной водой, разводили до концентрации 106 клеток/мл и подвергали облучению УФ до 10%-ной выживаемости клеток. Клетки после облучения высевали на агаризованную среду Беркхольдера, содержащую метанол (0,5%) и аллиловый спирт (0,3 мМ). Аллиловый спирт использовали в качестве селективного агента.

В случае окисления аллилового спирта алкогольоксидазой образуется токсичный для дрожжей акролеин. Это вещество вызывает гибель клеток с высокой активностью АО. С другой стороны, активность АО необходима для роста в среде с метанолом в качестве единственного источника углерода. Таким образом, среда, содержащая смесь метанола и аллилового с пира, обеспечивает рост клеток с уменьшенной активностью АО и/или с уменьшенным сродством АО к спиртам. Путем разработанного нами метода селекции были получены три мутантных штамма - СА2, СА4 и СА5 с уменьшенным сродством АО к этанолу. Штамм СА5 обладал низкой активностью АО, поэтому в дальнейших исследованиях использовали штаммы СА2 и СА4.

Сродство АО к этанолу определяли путем кинетических исследований активности фермента в БЭ исходного (Shleev et al., 2006) и полученных мутантных штаммов Я. polymorpha СА2 и СА4 в присутствии различных концентраций этанола (0-100 мМ) используя реакцию окисления ABTS [2,2'-азинобис(3-этилобензотиазолинон-6-сульфонат)] пероксидазой. Было обнаружено, что мутантные штаммы СА2 и СА4 отличаются сродством к субстрату: значение Км по отношению к этанолу для АО исходного и мутантных штаммов составляли, соответственно, 0,41 ; 1,95 и 1,00 мМ (таблица 7). Это показывает, что селекция клеток в соответствии с критерием устойчивости к акролеину позволяет получить мутанты дрожжей Я, polymorpha со пониженным сродством АО к субстрату.

Таблица 7. Значения Км по отношению к этанолу для АО исходного и мутантных штаммов Я. polymorpha

Штамм Я. polymorpha Км, мМ Стандартная ошибка, a Коэффициент линейной регрессии R для графика Лайнуивера-Берка

356 (исходный) 0,411 0,084 0,992

СА2 1,949 0,040 0,958

СА4 1,002 0,130 0,990

7.2. Определение нуклеотиднон последовательности мутантных аллелей структурных генов АО штаммов СА2 i СА4 Н. polymorpha и идентификация мутаций.

Мутантные аллели гена АО амплифицировали в реакции ПЦР с использованием праймеров: 5'-LVl (5-ССС AAG СТТ ATG GCC ATT ССТ GAC GAA ТТС-3'); 3'-LV2 (5'-ССС AAG СТТ ТТА GAA ТСТ GGC AAG ТСС G-3'), а также геномной ДНК, выделенной из Я. polymoipha DL-1-356 и из штаммов СА2 i СА4. Полученные в ПЦР-реакции продукты клонировали в составе гошмиды pUC57 и секвенировали. Последовательность нуклеотидов была транслирована в последовательность аминокислот и проведено сравнение со штаммом

дикого типа. Обнаружено несколько замен аминокислот, которые отдельно или в совокупности, по-видимому, определяют уменьшенное сродство к субстрату - этанолу.

У обоих штамов отмечены изменения I > V в позиции 21 и Т > S в позиции 527. Кроме того, в АО штамма СА2 произошли изменения аминокислот I > V (45), Е > К (131), Р > L (148), К > R (150), N > D (306), F > S (532) i W > R (567). В мутантном белке штамма СА4 изменений аминокислот было меньше: кроме упомянутых это 1 > V (232), Р > S (245), М > V (246) i L > Р (602). Степень уменьшения сродства к субстрату коррелирует с общим количеством аминокислотных замещений, особенное значение могут иметь мутации в участках вблизи положений 20, 50, 150, 360 и 520-600 аминокислотных остатков.

У АО штамма СА2 выявлены 3 участка с незначительным изменением вторичной структуры (такое изменение касается только одного аминокислотного остатка: 148, 153, 366), 4 участка, где структурные изменения касаются 2 остатков (353-354, 531-532, 562-563, 569570) и один участок, где такие изменения охватывают 4 аминокислотных остатка (75-78). Кроме того, можно выделить районы, где участки с измененной вторичной структурой находятся на расстоянии 4-11 аминокислотных остатков (148-153, 353-366, 562-570).

На основании анализа обоих мутантных форм АО можно сделать предположение, что изменения в эффективности связывания субстрата у этих форм не вызваны непосредственной заменой структуры субстрат-связывающего участка, а являются результатом модификации вторичной структуры, вследствие мутаций.

7.3. Выделение и очистка мутантных форм АО. Клетки мутантов Н. polymorpha СА2 i СА4 выращивали на 1%-ном метаноле в качестве единственного источника углерода и энергии до середины логарифмической фазы роста (до концентрации 2,5 - 3,0 мг/мл). Далее использовали методику, аналогичную использованной ранее. Таким способом были получены препараты двух мутантних форм АО (м-АОСА2 и м-ЛОсм) в количествах, близких 100 мг и удельной активностью 16 мкмольмин'мг"1 белка. Средний выход хроматографичсски чистых препаратов АО составлял около 20% от исходной активности клеток. Гомогенность полученных белков подтверждена электрофоретически. Молекулярная масса мутантных белков, согласно данным электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия, близка значениям, характерным для белка дикого типа.

7.4. Конструирование амперометрического биосенсора на основе мутантных форм АО. Иммобилизацию фермента АО дикого типа и его мутантной формы проводили методом электроосаждения на поверхности платинированного графитового электрода (как описано в разделе 4). Оптимальная структура двухферментного электрода имела конфигурацию nO/Os-Ap59//AO/CP9. Характеристику ферментативных свойств мутантной АО (mAO) проводили с использованием для сравнения нормальной АО из штамма дикого типа (пАО). Типичный сенсорный ответ на этанол для биосенсоров на основе mAO и на основе пАО представлены на рис. 17.

На рис. 18 показаны линейные области ответа двухферментного сенсора со структурой nO/Os-AP59//AO/CP59 для этанола и формальдегида. Как видно из представленных данных, для сенсора с мутантной формой АО имеет место расширенние диапазона линейности сигнала для обоих аналитов в связи с изменением величины кажущейся константы Михаэлиса для генетически модифицированной АО.

Время, с

Рис. 17. Хроноамперометрическая характеристика отклика на этанол биосенсора структуры П0/0.$-АР59//А 0/СР9 на основе нормальной и мутантной алкогольоксидазы (пАО и тАО). Стрелками показано поэтапное добавление различных концентраций этанола

Рис. 18. Линейный динамический диапазон ответа на этанол и формальдегид двухферментного биосенсора структуры ПО/Ов-АР59//АО/СР59 на основе природной (пАО) и мутантной (т-АОсм) алкогольоксидазы (3,05 мм графитовый электрод -50 мВ против А^А§С1)

[Анапигі, мМ

Поскольку АО не является высокоселективным ферментом и способна, кроме этанола и метанола, окислять также формальдегид, изучали зависимость амперометрического ответа биосенсоров, сконструированных на основе природной и мутантной форм фермента (пАО і т-АОСА4), от концентрации этанола и формальдегида (рис. 19). Установлено, что природная и мутантная формы АО отличаются величиной Км (в растворе): мутантный фермент ш-АО имеет повышенное значение константы Михаэлиса-Ментен (в 4 раза) и, соответственно, сниженное сродство к аналиту. Эта характеристика мутантного фермента расширяет линейный участок диапазона концентраций биосенсора.

— пАО

Рис. 19. Зависимость амперометрического ответа биосенсоров на основе природной и мутантной АО (пАО и тАО) от концентрации анапитов - формальдегида и этанола

Изучение операционной стабильности и кинетики инактивации сконструированных биосенсоров показало, что сенсоры на основе природной и мутантной форм АО очень похожи (рис. 20). Оба биосенсора сохраняли 50% активности после 5 часов непрерывной работы. Сконструированный амперометрический биосенсор на основе тАО (СА2) характеризуется сниженным сродством к анализируемым субстратам без изменения операционной стабильности работы сенсора.

! Рис- 20. Сравнение операционной

стабильности биосенсоров на основе природной (пАО) и мутантной (тАО) форм алкогольоксидазы

Таким образом, предложена новая »'*'(' »« .-» ' >« методика выделения мутантных форм АО и

емя, мин

их использование в качестве биоэлементов для биосенсорных технологий. На основании селекции с использованием аллилового спирта получены мутантные штаммы СА2 и СА4 метилотрофных дрожжей Н. ро1утогр!га со сниженным сродством алкогольоксидазы к этанолу. Проведено секвенирование мутантных аллелей структурных генов АО из мутантных штаммов СА2 и СА4 Н. ро1утогрка, идентифицированы точечные мутации в гене ЛОХ, которые приводят к заменам аминокислот и к уменьшению сродства фермента к субстрату.

Изучены некоторые структурно-функциональные свойства мутантных форм АО. Разработаны технологии иммобилизации ферментов на поверхности рабочего электрода при помощи электроосаждения, что использовано в конструировании биосенсоров на основе нативной и мутантной форм АО. Показано, что биосенсор на основе мутантной формы АО обладает расширенным диапазоном линейного ответа на аналиты по сравнению с сенсором на основе АО дикого типа.

Стабильность действия сенсора с тАО-иммобилизованным электродом не изменялась и оставалась подобной стабильности электрода с ферментом дикого типа. Описанная методика открывает возможность конструирования биосенсоров для точного, быстрого и дешевого анализа этанола в реальных образцах.

Для дальнейшего совершенствования применения тАО в качестве элемента биосенсора, могут быть использованы различные подходы: 1) прямое конструирование мутантных форм АО на основе результатов, полученных при помощи сайт-специфического мутагенеза; 2) эволюционная инженерия мутантных форм АО посредством непрерывного культивирования соответствующих штаммов в среде с увеличенными концентрациями аллилового спирта; 3) определение кристаллической структуры АО из Н. ро1утогр)га, выяснение особенностей фермент-субстратного взаимодействия и последующей прямой модификацией характеристик фермента.

8. Биоаналитическое использование формальдегиддегидрогеназы.

Формальдегиддсгидрогеназа, ключевой фермент метаболизма формальдегида у микроорганизмов, также может быть использован в биоаналитических исследованиях, но использованию ФАДГ в аналитической практике препятствует недостаточная активность коммерческих ферментных препаратов из Pseudomonas pulida и Candida boidinii, а также высокая стоимость ферментов, выделенных из штаммов дикого типа.

В этой главе представлены результаты исследований, полученные при оптимизации условий культивирования сконструированного посредством генной инженерии штамма термотолерантных метилотрофных дрожжей Я. polymorpha со сверхпродукцией ФАДГ, методики выделения термостабильного фермента из рекомбинантных клеток, характеристике очищенной ФАДГ, разработке основанного на ФАДГ метода определения ФА и использование этого метода для анализа промышленных стоков.

8.1. Оптимизация условий культивирования. Выделение и характеристика фермента. Стабильный рекомбинантный штамм II. polymorpha со сверхпродукцией ФдДГ получен в соответствии с описанной методикой (Demkiv et al., 2005). Для конструирования рекомбинантного штамма - сверхпродуцента ФАДГ, ген FLDI из Я. polymorpha с собственным промотором был вновь клонирован в LEXJ2-содержащей интегративной плазмиде pYTl, лишенной ARS, для использования в мульти-копийной интеграции гена в хромосоме реципиентного штамма NCYC 495 (leul-1). После трансформации клеток линейной и циклической формами плазмиды были отобраны 50 клонов среди Leu+-трансформантов с повышенной устойчивостью к ФА и определена активность ФАДГ штаммов. В качестве сверхпродуцента ФАДГ был выбран стабильный рекомбинантный штамм Tf 11-6 с наибольшей активностью фермента в бесклеточных экстрактах. Штамм Tf 11-6 обладал активностью ФАДГ в бесклеточных экстрактах (БЭ) до 4.0 мкмоль мин ' мг"' белка. Для оптимизации условий культивирования с целью получения максимального количество фермента, изучали влияние состава среды на уровень ФАДГ у штамма Tf 11-6 (рис. 21). Как показано на рис. 21 А, активность ФАДГ в БЭ зависит от источника углерода. Культивирование на среде с 1% метанола приводило к максимальному уровню синтеза фермента у реципиентного штамма Я. polymorpha leu 1-1 и штамма Tf 11-6 со сверхпродукцией ФАДГ. Добавление ФА к среде с метанолом стимулировало синтез ФАДГ.

Из рис 21В видно, что удельная активность ФАДГ в бесклеточном экстракте штамма Tf 11-6 при выращивании на среде с метанолом с добавлением 10 мМ ФА составляла 7,0 Ед./мл, что было в два раза выше по сравнению с культурами, выросшими на среде без добавления ФА.

Для выделения ФАДГ клетки штамма-сверхпродуцента выращивали в среде с 1% метанола с добавлением 5 мМ ФА. Характеристика процедуры очистки с двухступенчатой ионообменной хроматографией и осаждением сульфатом аммония приведена в таблице 8. Молекулярная масса субъединицы ФАДГ, определенная при помощи электрофореза с SDS, составляла около 40 кДа, и имела такое же значение, как для фермента С. boidinii - 41 кДа.

Изучены некоторые физико-химические параметры выделенной ФАДГ. Оптимум pH находился в пределах 7,5 - 8,5; наивысшую стабильность ФАДГ наблюдали при pH 7,0 - 8,5. Оптимальная температура для активности фермента - 50 °С. При 65 °С фермент сохранял 60% своей активности (время определения около 5 мин), что соответствовало уровню активности ФАДГ при 30 °С.

Активность фермента при 37 "С была в 1,6 раза выше по сравнению со стандартными условиями определения активности ФАДГ (25 °С). Изучение термостабильности фермента

показало, что активность полностью сохранялась после 10 мин инкубации при 40 °С, частично (до 70%) при 55 °С, и в 25% - при 60°С. Полная инактивация имела место после инкубации при 70 "С в течение 5 мин. Такая высокая термотолерантность потенциально дает возможность использования ФАДГ в биоаналитических целях, в частности, для определения ФА в пищевых продуктах, промышленных сточных водах и лекарственых препаратах, а также для биотрансформации ФА до муравьиной кислоты.

ЕЮН МеОН

СІ І Н^оіужогрка /вы-/ Г~'1 ТГ 1І-6

5 мЧ [ФА|

Рис. 21. Активность ФАДГ в экстрактах клеток реципиентного и рекомбинантного штаммов, выращенных на различных средах.

A. Активность ФАДГ в 8%-ном полиакриламидном геле после электрофореза БЭ. Источник углерода в среде: 1% этанол (ЕЮН), 1% метанол (МеОН) или 1% глюкоза (С1с). Каждая проба БЭ содержала 0,1 мг белка: 1 - ТА 1-6 (0,12 Ед. для ЕЮН, 0,35 Ед. для МеОН, и 0,05 Ед. для Оіс); 2 - 1еи 1-1 (0.01 Ед. для ЕЮН и «с, 0,15 Ед. для МеОН); К - 0,01 мг очищенного преперата ФАДГ (0,17 Ед.).

B. Активность ФАДГ в экстрактах клеток, выращенных на среде с 1% метанола и различными концентрациями ФА, мМ

Таблица 8. Характеристика очистки ФАДГ рекомбинантного штамма Тґ 11-6

Стадия Общая активность, Ед. Специфическая активность, Ед. ■ мг" Выход % Фактор очистки (кратность)

Бесклеточный экстракт 191 4,5 100 1

Хроматография 1*, неадсорбированный белок 184 8,8 96,0 2,0

Хроматография 2*, элюат 39 12,1 21,0 2,7

80% (МН4)2504 30 17,0 15,7 3,8

* 1 и 2 - Хроматография на ОЕАЕ-ГоуореагІ-650 М при различных рН (8.0 и 8.8)

8.2. Использование ФАДГ для ферментативного определения ФА. На основе проведенных исследований предложен метод ферментативного определения ФА с использованием ФАДГ. Разработанный метод основан на фотометрическом определении

окрашенного продукта, формазана, который образуется из нитротетразолиевого голубого в реакции окисления ФА, катализируемого ФАДГ (рис. 22).

Рис. 22. Схема реакции разработанного ферментного метода определения ФА с использованием ФАДГ

Исследования проводили в условиях неполного превращения аналита (около 10%) и ограниченной концентрации фермента (23 мЕд./мл). Такие условия позволяют снизить стоимость анализа. В условиях полного окисления ФА (фермент в избытке) порог чувствительности метода оценивается на 2,5 мкМ (в окончательной реакционной смеси) или 20 мкМ - в исследуемых пробах.

Надежность разработанного метода проверена на пробах промышленных сточных вод, содержащих ФА. Сравнение содержания ФА, полученного методом ФАДГ и двумя традиционными химическими методами (с использованием хромотроповой кислоты и МБТГ) показало хорошую корреляцию результатов, полученных различными методами (таблица 9).

Таблица 9. Сравнение результатов определения содержания ФА в пробах сточных вод различными методами

Пробы Концентрация ФА (мг/мл)

Химические методы Ферментативный метод с ФАДГ

Хромотроповая кислота МБТГ

ОК1 9,30±0,61 9,56±0,51 7,89±0,59

ОК2 8,70±0,50 8,06±0,32 6,66±0,26

ОКЗ 7,20±0,33 7,84±0,36 6,88±0,41

ЭК4 7,10±0,36 6,30±0,46 7,58±0,32

ЭК5 1,65±0,35 1,20±0,15 2,32±0,08

ОК6 4,64±0,24 4,99±0,06 5,73±0,32

ЭК7 1,62±0,17 1,96±0,20 2,47±0,15

\VW-A 112±4,5 (метод стандартных добавок) 84,4±6,5 (традиционное определение) - 116±5,1 (метод стандартных добавок) 111 ±6,1 (традиционное определение)

Для оценки возможного интерферирующего влияния реальных компонентов проб на определение ФА ФАДГ-методом и методом с хромотроповой кислотой, использовали метод стандартных добавок для пробы \VW-A. Следует подчеркнуть, что использованные химические методы не свободны от потенциальных ошибок, вызванных, преимущественно, интерференцией загрязнений, содержащихся в пробах сточных вод, например, фенола, который присутствует в стоках наряду с ФА. В наших опытах было показано, что химический метод является более чувствительным на интерферирующее воздействие компонентов промышленных сточных вод по сравнению с ферментативным методом:

значения наклона калибровочных кривых, полученных для водных растворов ФА, и для проб сточных вод (WW-A) отличаются на 24% (соответственно, 2,986 и 2,255). Подобные значения получены для ферментного метода - соответственно, 0,761 и 0,729, причем разница составляла только 4,2%, что находится в границах ошибки.

8.3. Использование ферментных и клеточных биосенсоров для анализа ФА в вакцинах. Существующие методы ферментного анализа ФА зачастую являются трудоемкими недостаточно селективным и точными, кроме того, до сих пор таких методов нет на мировом рынке. Для решения этой проблемы, мы разработали новые биосенсорные подходы по анализу ФА в вакцинах с использованием НАД+ - и глутатион- зависимой ФАДГ из рекомбинантных клеток дрожжей со сврхпродукцией этого фермента. В качестве биораспознающих элементов использовали рекомбинантный дрожжевой клон Tf 11 -6, производный от реципиентных термотолерантных метилотрофных дрожжей Н. polymorpha NCYC 495, и очищенную НАД+- и глутатион- зависимую ФАДГ, выделенную из сверхпродуцирующих ФАДГ рекомбинантных клеток. Оба сконструированных биосенсора бьши использованы для анализа содержания ФА в реальных вакцинах. Была показана хорошая корреляция результатов аналитических определений между разработанными методами и традиционными химическими методами.

Амперометрические биосенсоры на основе ФАДГ и рекомбинантных клеток с архитектурой 2CPOs-HAjT-0AMr-GSH-Ha<puoH (ферментативный биосенсор) и 2CPOs-HAjf- Tfl l-ö-GSH-Нафион (клеточный биосенсор) использовали для определения содержания ФА в реальных образцах вакцин. Результаты таких анализов представлены на рисунке 23 (клеточный биосенсор) и в таблице 10.

Перенос электронов между иммобилизованным ферментом и платинированным графитовым электродом осуществлялся при помощи положительно заряженного катодного электроосаждающего слоя, модифицированного Оз-бис-М,1Ч-(2,2'-бипиридил)-дихлоридом ([Os(bpy)2Cl2]). Вместо полимерного Os-содержащего медиатора, использованного в ферментном сенсоре, клеточный (микробный) сенсор на основе рекомбинантных клеток содержал свободно диффундирующий медиатор PMS.

Сконструированный безреагенгтный амперометрический биосенсор на основе ФАДГ с архитектурой 2СРОз-НАД -ФАДГ-СЗН-Нафион использовали для определения содержания ФА в различных вакцинах: ADT-M (против дифтерии и столбняка), антигеморрагической вакцине кроликов, противополиомиелитной вакцине Imovax Polio с использованием метода стандартных добавок.

75 1) Кроличья вакцина 70- п, 10' с,41-9 тМ

1 2 Добавленный ФА, мМ

Рис. 23. Калибровочные кривые, полученные методом стандартных добавок для клеточного биосенсора на основе рекомбинантных клеток с архитектурой 2СРОя-НА/С-Т/11-6-СВН-Нафион, использованного для определения ФА в кроличьей антигеморрагической вакцине при различных разведениях (1 - 10-кратное разведение; 2 - 20-кратное разведение). (А, 8 - параметры линейной регрессии, п - разведение, С0 - расчетное содержание ФА в вакцине).

Интерферирующее влияние компонентов реальных образцов вакцин на определение ФА наблюдали для всех вакцин, но в разной степени. Для всех проанализированных вакцин наблюдали хорошую корреляцию между результатами определения ФА биосенсорным методом на основе фермента ФАДГ и химическими методами (с применением метода стандартных добавок).

Таблица 10. Содержание формальдегида в реальных образцах вакцин, полученное различными методами: химическими (МБТГ, Пурпальд, хромотроповая кислота) и с использованием биосенсоров (сенсоры на основе ФАДГ и на основе рекомбинантных клеток)

Проба/Метод Концентрация ФА (мМ)

Химические методы Ферментный ФАДГ-биосенсор Клеточный биосенсор

МБТГ Пурпальд Хромотроповая кислота

Антигеморрагическая вакцина кроликов 37,88±3,10 43,07±2,41 29,45±4,83 41,29±0,50 42,06±0,10

Вакцина Imovax Polio _ _ 0,89±0.01 0.96+0,04

Вакцина ADT-M против дифтерии и столбняка 1,02±0,07 1,24±0,08 1,19±0,22 1,26±0,09

Полученные данные свидетельствуют о реальной возможности биоаналитического использования ФАДГ из стабильного рекомбинантного штамма Н. ро1утогрка со сверхпродукцией фермента для определения токсичного ФА в пищевых продуктах, промышленных сточных водах и вакцинах.

9. Конструирование штаммов дрожей с увеличенной продукцией этанола.

В настоящее время этанол получают из сахара или крахмала с помощью дрожжей 5. сегеуише. Между тем, имеющиеся количества исходного сырья не обеспечивают растущих потребностей в биоэтаноле, поскольку используется в пищу человека и для корма животным. Наиболее оптимальным и перспективным является получение топливного биоэтанола из возобновляемого и дешевого сырья, особенно из гидролизатов лигноцеллюлозных отходов сельского хозяйства и деревообрабатывающей промышленности.

9.1. Конструирование рекомбинанатного штамма дрожжей Р'иЫа анрЫъ с улучшенной алкогольной ферментацией ксилозы. Среди основных Сахаров лигноцеллюлозных гидролизатов, кроме гексоз, значительный процент (35-45%) составляют пентозы (ксилоза, арабиноза), которые сахаромицеты не способны метаболизировать. Ферментировать пентозы способна ограниченная группа микрорганизмов, среди которых наибольший интерес вызывают дрожжи Р. №/н'1и. Наши усилия были направлены на улучшение природных штаммов этого вида дрожжей с помощью современных методов метаболической инженерии. В данном разделе работы представлены результаты конструирования рекомбинантного штамма Р. ¡Ирик с усиленной экспрессией модифицированной формы ксилозорсдуктазы (первого фермента катаболизма ксилозы),

который характеризовался повышенной производительностью алкогольной ферментации ксилозы в составе лабораторных и полупромышленных питательных сред.

Брожение ксилозы у дрожжей начинается с восстановления до ксилита с помощью НАДФН(Н+)-зависимой ксилозоредуктазы (КР). Ксилит далее с помощью НАД-зависимой ксилитолдегидрогеназы (КДГ) окисляется до ксилулозы. В результате этих окислительно-восстановительных реакций при ограниченной аэрации в процессе ферментации происходит накопление 1ГАДФ* и НАДН(Н+), что приводит к накоплению побочных продуктов и снижению количества синтезируемого этанола. КР дрожжей P. stipitis использует как кофактор не только НАДФН(Н+), но и НЛДН(Н') (Verduyn et al„ 1985). Однако сродство КР P. stipitis к НАДН(Н+) является низкой. Установлено, что уровень экспрессии гена XYLI, кодирующего КР при алкогольной ферментации ксилозы дрожжами P. stipitis, существенно повышается (Jeffries, Vleet, 2009). Учитывая дисбаланс нуклеотидных кофакторов, было предложено снизить сродство КР к НАДФЩЬГ) и усилить экспрессию такой модифицированной формы КР в геноме дрожжей P. stipitis.

Используя сайт-специфический мутагенез, было осуществлено изменение кофакторного сродства КР P. stipitis, что привело к снижению сродства КР к НАДФН(Н+). Соответствующие фрагменты, а также сильный конститутивный промотор гена GAPDH Р. stipitis (кодирует глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу), были объединены при помощи праймеров IS62/IS313. Полученный фрагмент, содержащий ВРТ модифицированного гена XYLI P. stipitis под контролем сильного конститутивного промотора GAPDH был обработан рестриктазой ВатШ и клонирован в SamHI-линеаризованный и дефосфорилированный вектор pl9L2 (Voronovsky et al., 2002). Сконструированная плазмида получила название p!9L2+ prGAPDH+XYLImodPs (рис. 24).

HSpP si в

У ¥

prom. -_, t _i

tacZ LEV2SC \YLlmoA_Ps fcGAPDHP, ,acZ Ыа QRI

pl9L2+prGAPDH+XYLlmodPs - 7,0 т.п.н

Рис. 24. Линейная схема плазмиды pI9L2+prGAPDH+XYLlmodPs; фрагмент, содержащий модифицированный ген XYLI P. stipitis, обозначен черной полосой; фрагмент, содержащий промотор GAPDH P. stipitis, обозначен белой полосой; фрагмент, содержащий ген LEU2 S. cerevisiae, обозначен серой полосой; тонкой черной линией обозначена бактерийная часть вектора. Сайты рестрикции обозначены: Н, Hindm-, Sp, Sphl; К, KpnV RI EcoR[; SI, Sail, B, BamHl; Sm, SmaV, Sc, Sacl. ' '

•Sard-линеаризованный вектор 19L2+prGAPDH+XYLlmodPs трансформировали в штамм PLU20 (1еи2, игаЗ) P. stipitis. Селекцию Leu+ - трансформантов проводили на минимальной среде YNB с урацилом. Стабильность Ьеи+-интегрантов проверяли путем поочередного культивирования на неселективной и селективной средах. Наличие в геноме сконструированных штаммов рекомбинантной конструкции prGAPDH-XYL 1 P. stipitis проверяли с помощью ПЦР, используя соответствующую пару праймеров IS62/IS313.

Была определена эффективность алкогольной ферментации ксилозы отобранным стабильным трансформантом XYLlm9. Продуктивность алкогольной ферментации ксилозы сконструированным штаммом составляла 0,34 г/л/ч, превышая продуктивность исходного

штамма в 1,3 раза (таблица 11). Максимальная концентрация синтезированного этанола составляла 33 г/л на четвертые сутки ферментации.

Проводилось определение эффективности алкогольной ферментации гидролизатов пшеничных отрубей. Производительность синтеза этанола рекомбинантным штаммом ХУ1Лт9 составляла 0,15 г/л/ч, что превышает производительность синтеза этанола исходного штамма на 15% (см. таблицу 11). Максимальная концентрация синтезированного этанола составляла 10,8 г/л на вторые сутки ферментации. Общее содержание гексоз и пентоз в гидролизатах пшеничных отрубей в наших экспериментах составляло около 35 г/л. Гидролизаты пшеничных отрубей содержали около 60% глюкозы, 37% ксилозы и 3% арабинозы. Известно, что наилучшими организмами, ферментирующими глюкозу, являются сахаромицеты. Однако, сахаромицеты неспособны ферментировать ксилозу, поэтому было предложено провести коферментацию, используя бинарную культуру: рекомбинантный штамм Р. яИрШя Х\'1Лт9 и штамм дикого типа X сегегч^чае ВУ4742 в соотношении 1:1. Производительность алкогольной коферментации гидролизатов пшеничных отрубей была выше чем производительность ферментации с использованием отдельных штаммов Р. ¡ирШя и £ ссгеуйше и составила 0,25 г/л/ч против 0,16 г/л/ч и 0,11 г/л/ч, соответственно (см. таблицу 11). Итак, производительность алкогольной коферментации была выше в 1,6 раза по сравнению с производительностью ферментации рекомбинантного штамма ХУ1Лт9, а максимальная концентрация синтезированного этанола составляла 18 г/л.

Таблица 11. Продуктивность синтеза этанола штаммами Р. зНрШз и 5. сеге\ч$'ше на различных средах

Штамм Продуктивность синтеза этанола (г/л/час)

¥N6 + 9% ксилоза Гидролизаты пшеничных отрубей Гидролизаты опилок + сусло 3,5 °Б

Р. 5¡¡¡п^ РШ20 (дики тип) 0,26±0,03 0,13±0,02 0,08±0,01

Р. хЧрШ5 ХУЫт9 (рекомбинантый штамм) 0,34±0,04 0,15±0,02 0,15±0,02

5. сегеугБ 'ше ВУ4742 (дикий тип) - 0,11 ±0,02 -

Р. .чНрШ.? ХУ1Лт9 + 5. ссгеу151ае ВУ4742 - 0,25±0,03 -

Также проводилась алкогольная ферментация полупромышленной среды на основе гидролизатов опилок. Продуктивность синтеза этанола рекомбинантным штаммом ХУЫт9 составляла 0,15 г/л/ч, что превышает продуктивность синтеза этанола исходного штамма в 1,9 раза (см. таблицу 11). Максимальная концентрация синтезированного этанола составляла 10,5 г/л на третьи сутки ферментации.

Результаты представленных исследований были реализованы при разработке лабораторного и полупромышленного регламента получения этанола из гидролизатов растительной биомассы, что позволяет масштабировать процесс и начать производство этанола из вышеупомянутого сырья.

Сконструированный рекомбинантный штамм Р. $НрШ$ обладал повышенной в 1,3 раза продуктивностью алкогольной ферментации ксилозы. Введение в геном дрожжей Р. ¡ИрШз

гена ХУ11то<1, кодирующего модифицированную форму КР с пониженным сродством к НАДФН(ЬГ) под контролем сильного конститутивного промотора гена САРШ1, обеспечило накопление повышенных количеств этанола при ферментации ксилозы. Параметры алкогольной ферментации гидролизатов лигноцеллюлозы (отруби и опилки) сконструированным штаммом также были увеличены. При ферментации гидролизатов пшеничных отрубей сконструированный штамм характеризовался повышенной продуктивностью этанола в 1,5 раза по сравнению со штаммом дикого типа дрожжей 5. сеге\<'тае. Установлено, что синтез этанола дополнительно может быть повышен в 1,6 раза путем одновременного использования смеси двух штаммов дрожжей - рекомбинантного штамма ХУ1Лт9 Р. ¡ЧрШз и штамма дикого типа сегемЫае. Сконструированный штамм ХУЫш9 Р. зИрШз также характеризовался повышенной производительностью алкогольной ферментации полупромышленной среды на основе кислотных гидролизатов опилок. Это дает возможность получения этанола из гидролизатов растительной биомассы в более широком масштабе и в перспективе начать промышленное производство этанола из вышеупомянутого сырья.

9.2. Улучшение параметров алкогольной ферментации глюкозы рекомбинантными штаммами дрожжей Н. ро!утогрка и & сегегтае с увеличенным уровнем внутриклеточного глутатиона. Глугатион (СБИ) является распространенным небелковым тиолом, присутствующим в большинстве живых клеток, от микроорганизмов до человека. Он играет ключевую роль в стрессовой реакции, вызваной голоданием, тяжелыми металлами и ксенобиотиками. Известно, что этанол, продуцируемый в процессе спиртового брожения, индуцирует метаболический стресс, который, в свою очередь, может ухудшить продуктивность этанола. Однако, роль ОБН в качестве основного фактора защиты от стресса в продукции этанола и толерантности к этанолу, до сих пор не изучали. Поиск надежных штаммов дрожжей, устойчивых к метаболическому стрессу и накапливающих повышенные количества этанола является важной биотехнологической задачей. Поэтому мы исследовали возможные взаимосвязи между внутриклеточным пулом ввН, продукцией этанола и устойчивостью к этанолу у пекарских дрожжей 5. сегеушае и метилотрофных дрожжей Я. ро1утогр1га.

Для изучения корреляции между уровнем СБН и спиртовым брожением, мы проверили штаммы Я. ро1утогрИа с мультикопийной экспрессией генов, участвующих в биосинтезе ОЭН: ОКН2 (гомолог гена С51И 5. сегеутае) и МЕТ4 (гена участвующего в регуляции метаболизма серы), а также у мутантов, дефектных по генам, участвующим в синтезе и деградации ОЯ1Г (А Л ££'//). У £ сегычз'те мы изучали спиртовое брожение штамма дикого типа и рекомбинантных штаммов с мультикопийной экспрессией гена С5Я/.

9.2.1. Ферментация глюкозы и ксилозы Н. ро1утогр!ш в качалочных колбах и в ферментере. Было установлено, что штаммы с мультикопийной интеграцией генов С5Я2 и МЕТ4 накапливают этанол в более высоких концентрациях по сравнению со штаммами дикого типа. Штамм дикого типа максимально накапливал около 1,5% этанола, штамм с гиперэкспрессией гена МЕТ4 накапливал 3% этанола, тогда как концентрация этанола у штамма со свсрхэкспрессией гена С$!12 достигла 4,5 %. Накопление повышенного уровня этанола сопровождалось повышением потребления глюкозы у соответствующих штаммов (таблица 12). Аналогичную картину наблюдали и во время ферментации этими штаммами в биореакторе в накопительной культуре при культивировании в среде с 4% глюкозы в условиях ограниченной аэрации при 37°С (рис. 25,26).

Штаммы с гиперэкспрессией генов 05Я2 и МЕТ4 и повышенным внутриклеточным уровнем ОЭН накапливали этанол очень быстро и продуцировали максимальное количество этанола после 30 часов инкубации, что в 3 раза выше по сравнению со штамами дикого типа. После 30 ч инкубации уровень этанола уменьшался очень быстро, что может быть связано с полной утилизацией глюкозы клетками дрожжей. После 30 часов инкубации концентрация глюкозы в среде падала до нуля.

Рис. 25. Накопление биомассы клетками Я. ро1утогрка ОН дикого типа (\¥Т) и рекомбинантными штаммами с увеличенным уровнем глутатиона (тсЯр05Я2 и тсНрМЕТ4)

Время инкубации, 'I

Рис. 26. Накопление этанола клетками Я. ро1утогр/ш ОН дикого типа (\УТ) и рекомбинантными штаммами с увеличенным уровнем глутатиона (тсНрСБН2 и тсНрМЕТ4)

Время ИНК'Убяцнн, ч.

Мы также наблюдали увеличение накопления этанола несколькими другими мутантами, а именно, штаммом \ips34 с дефектом в аутофагии и штаммом \ps34 со сверхэкспрессией гена С5Я2 (таблица 12). Штаммы с нарушенным синтезом глутатиона и с

нарушенной деградацией вБН (А^щ!) не отличались по накоплению этанола от родительского штамма дикого типа (табл. 12). Мутация в гене не приводила к

изменению содержания клеточного глутатиона и нарушение биосинтеза СБН у мутанта А\gsh2 уравновешивалось поступлением вБН из питательной среды в концентрации 0,1 мМ. В отличие от ферментации глюкозы, мы не обнаружили существенных различий между штаммом дикого типа и испытанными рекомбинантными штаммами и мутантами по накоплению этанола при ферментации ксилозы (табл. 12). Однако количества накапливаемого этанола были двольно низкими по сравнению с опытами, где в качестве источника углерода использовали глюкозу.

9.2.2. Ферментация глюкозы штаммами Я. сеге\ч*'ше в качалочных колбах и в биореакторах. Мы проанализировали ферментацию глюкозы штаммом сегеушяе дикого типа и рекомбинантным штаммом с мультикопийной интеграцией гена С-УЯУ, который содержит увеличенный внутриклеточный пул вЭН. Обнаружено, что, в отличие от штаммов Я ро1утогр1га с повышенным пулом С8Н, аналогичный штамм дрожжей £ сеге\^1ае не отличался от его родительского штамма дикого типа по накоплению этанола как при

брожении в условиях встряхивания в колбах в полуаэробных условиях, так и в строго анаэробных условиях в биореакторе. Таким образом, влияние пула ОЭН на выход этанола и продуктивность этого процесса у 5. сегеуише и Я ро/утогрИа различны.

9.2.3. Влияние сверхпродукции (ХН на резистентность дрожжей 5. сегеуШе и Н. ро1утогрИа к этанолу. Мы также изучали резистентность указанных штаммов к экзогенному этанолу (рис. 27, 28). Установлено, что штаммы Я. ро1утогрИа и 5. сегтШе с более высоким пулом глутатиона всегда были более восприимчивы к экзогенному этанолу по сравнению со штаммами дикого типа. Среди штаммов Я. ро1утогр1га наиболее чувствительным к этанолу был штамм vps34/pddl, который не мог расти на 5% этаноле.

Таблица 12. Алкогольная ферментация клетками Н. ро1утогрИа штаммов дикого типа, рекомбинантных и мутантных штаммов в зависимости от источника углерода в среде на 3 день культивирования при 100 об./мин (исходная биомасса СЮ ~ 10) и 37 °С.

Штамм

DL-I 356 (wild type)

mcHpMET4 mcHpGSH2 NCYC495 adell (wild type)

Agsh2 adell1 CBS4732 ura3 (wild type)

Aggtl ura3 NCYC495 Ieul-1 (wild type)2 vps34 leul-1 vps34 mcHpGSIC1

Источник углерода в спиртовом брожении

Глюкоза, 12%

Биомасса, OD«,o

14 13 13 12 13

Этанол,

13 30 45 15 18 18 15 17 29 33

Остаточная глюкоза,

g/1

45 30 20

39 28 30 38 45

40 35

Ксилоза, 12%

Биомасса, OD600

14 16 14 NT NT 10 7 12

Этанол, g/1

1.05 0.75 0.95 0.27 0.27 NT NT 0.22 0.29 0.18

Инкубацию мутантных клеток проводили в индикаторной среде с добавлением 0,1 мМ GSH; Представлены данные на 2 день культивирования

Штаммы Я. polymorpha тсМЕГ4 и mcGSH2 более чувствительны к экзогенному этанолу как на чашках с глюкозой (данные не показаны) так и с ксилозой, тогда как штаммы дикого типа толерантны к значительно более высоким концентрациям этанола (рис. 27). Анализ жизнеспособности дрожжевых клеток, окрашенных двумя флуоресцентными красителями: пропидиум иодидом (PI) и флуоресцин диацетатом (FDA) также подтвердил, что штаммы Я polymorpha и £ cerevisiae со сверхэкспрессией генов биосинтеза глутатиона оказались менее толерантными к этанолу (рис. 28, 29).

Рис. 27. Резистентность клеток Я polymorpha штаммов дикого типа (DL-1 356 и NCYC495 leu 1-1), рекомбинантных (mcHpGSH2 и тсНрМЕТ4) и мутантных штаммов (vps34 leul-I) к экзогенному этанолу на среде YPX при 37 °С в течение 3 дней

mcHpMETi mcHpGSH2 »NCYC495 leul-1 vp<¡34 Uul-1

I>L1 356

VPX

УРХ+5%Этанол УРХ+8%Этанол

15 lb-

Рис. 28. Анализ жизнеспособности дрожжевых клеток, инкубированных при различных концентрациях этанола. Выживаемость клеток Н. ро1утогрИа штамма дикого типа (\УТ) и рекомбинантных штаммов (тсНрМЕТ4 и тсНрС5Н2) определяли после 1 ч воздействия этанола

Этанол, %

Рис. 29. Анализ жизнеспособности дрожжевых клеток, инкубированных при различных концентрациях этанола. Выживаемость клеток сегеушяе штамма дикого типа (\УТ) и рекомбинантных штаммов (тс.УсОЗЯ/ и тс,!>с05Я/Л4аг//) определяли после 1 ч воздействия этанола

Сверхпродукция GSH, как было установлено, вызывала сильное стимулирующее влияние на алкогольную ферментацию глюкозы у Я. polymorpha, хотя не влияла на продукцию этанола из ксилозы. Однако, увеличение пула GSH у S. cerevisiae никаким образом не влияло на спиртовое брожение глюкозы как в полуанаэробных, так и в строго анаэробных условиях. Причины стимуляции продукции этанола из глюкозы у Я polymorpha и отсутствие такого эффекта у S. cerevisiae неизвестны. S. cerevisiae и Я. polymorpha - это различные виды по многим критериям. Особенности конкретного участия GSH в регуляции алкогольной ферментации у S. cerevisiae в сравнении с Н. polymorpha пока неизвестны, хотя мы предполагаем, что наблюдаемые различия зависят от упомянутых выше типов питания исследованных видов.

Резонно предположить, что в присутствии этанола, GSH в высоких концентрациях неправильно выполняет свои функции, например, для поддержания надлежащего соотношения между -SH и S-S связей в белках, или наоборот, способствует пагубному воздействию этанола на клетки. Так как этанол может действовать на многие цели (Ma, Liu, 2010; Teixeira et al., 2009), определение основных целей этанола при увеличенном внутриклеточном пуле GSH должно быть целью специального исследования. Одно из возможных объяснений возрастания восприимчивости к этанолу при увеличенном содержании GSH заключается в том, что этанол и GSH ингибируют гликолитические ферменты, поэтому повышенные концентрации GSH могут привести к более мощному ингибированию этанолом гликолиза и роста дрожжей.

выводы

1. Препарат алкогольоксидазы (АО), полученный из бесклеточного экстракта мутантов нетрадиционных метилотрофных дрожжей НапэепЫа ро1утогр1ш с нарушенной катаболитной репрессией, лишенных каталазной активности и способных к сверхсинтезу АО в среде с глюкозой без метанола, впервые использован для анализа этанола и метанола в биогенных пробах (вино, пиво, соки, безалкогольные напитки), метанола и формальдегида в модельных растворах и промышленных сточных водах, а также формальдегида в рыбных продуктах.

2. Разработан новый ферментно-химический метод определения метанола и формальдегида в смесях этих веществ, основанный на использовании химического анализа формальдегида с гидразоном З-метил-2-бензотиазолина без АО и последующей реакции с участием АО, что позволяет определять общее содержание метанола и формальдегида в пробе. Предлагаемый метод, в отличие от химических методов, не требует использования вредных, агрессивных химических веществ, прост в реализации и может быть использован для контроля промышленных сточных вод и различных продуктов, содержащих формальдегид.

3. Сконструирован новый прототип двухферментного амперометрического биосенсора, содержащего АО и пероксидазу хрена, методом раздельного электроосаждения двух ферментов в различный слоях с использованием катионных и анионных полимеров, что дает возможность получения быстрого ответа на аналит при высокой чувствительности и стабильности биосенсора. Показана возможность использования такого биосенсора для анализа метанола, этанола и формальдегида.

4. Разработан метод селекции мутантов дрожжей Н. ро1утогрИа с пониженным сродством по отношению к субстратам (формальдегид, метанол). Выделены препараты мутантных ферментов, проведена их иммобилизация на поверхности амперометрических биосенсоров и показана возможность использования для анализа этанола в расширенном диапазоне концентраций. Идентифицированы мутации в гене ЛОХ1, которые приводят к уменьшению сродства фермента к субстратам.

5. Получены препараты высокоочищенной ФАДГ из клеток рекомбинантного штамма Я. ро1утогрИа со сверхпродукцией термостабильной формальдегиддегидрогеназы и показана возможность их использования в для определения содержания формальдегида в сточных водах и пищевых продуктах. Сконструированы лабораторные прототипы энзиматических и клеточных биосенсоров для анализа формальдегида и показана возможность их использования при определении содержания формальдегида в промышленных сточных водах и в сыворотках.

6. Сконструирован рекомбинантный штамм дрожжей ХУПт9 Р. хИрИя с повышенной продуктивностью алкогольной ферментации ксилозы. Параметры алкогольной ферментации гидролизатов лигноцеллюлозы сконструированным штаммом при алкогольной ферментации полупромышленной среды на основе кислотных гидролизатов опилок также были улучшены. Штамм характеризовался повышенной продуктивностью по этанолу при ферментации гидролизатов пшеничных отрубей в 1,5 раза по сравнению

со штаммом дикого типа дрожжей 5. сегытае. Продукцию этанола можно повысить в 1,6 раза путем одновременного использования совместной культуры рскомбинантного штамма Р. зИрШз и штамма дикого типа 5. секп'шае.

7. Сконструированы рекомбинантные штаммы Н. ро1утогрИа с повышенным пулом внутриклеточного ОБН в результате гиперэкспрессии первого гена биосинтеза вЗН гамма-глутамилцистеинсинтетазы, либо центрального регуляторного гена метаболизма серы МЕТ4. Рекомбинанты накапливали почти в два раза больше этанола при сбраживании глюкозы по сравнению со штаммом дикого типа. Трансформанты 5.

и Я. ро1утогрка с повышенным пулом С8Н оказались более чувствительными к экзогенному этанолу, чем соответствующие штаммы дикого типа.

Публикации по диссертации

А. Статьи в российских журналах, рекомендуемых ВАК, и в приравниваемых к ним периодических изданиях, входящих хотя бы в одну из библиографических баз цитирования, в том числе с международным импакт-фактором (IF)

1. Maidan М.М., Sybirny W.A., Gonchar M.V., Kotylak Z„ Sybirny A.A. Wykorzystanie biosensora elektrochemicznego do oznaczania metanolu w sciekach przemyslowych. Ochrona Srodowiska, 2000, N4(79), 27-28. [IF = 0,6]

2. Gonchar M., Maidan M., Korpan Y., Sibirny V., Kotylak Z., Sibimy A. Metabolically engineered methylotrophic yeast cells and enzymes as sensor biorecognition elements. FEMS Yeast Research, 2002, 2, 307-314. [IF-- 1,172]

3. Gonchar M.V., Grabek D„ Oklejewich В., Pavlishko H.M., Shamlian O.V., Sybirny V.A., Kotylak Z., Rudke K., Csoregi E., Sibirny A.A.. A New enzymo-chemical method for simultaneous assay of methanol and formaldehyde. Ukr. Biochem. J. 2005, 77, 146-154.

4. Сибирный B.A., Гончар M.B., Рябова O.B., Майдан М.М. Современные методы анаилиза формальдегида, метанола и этанола с использованием микробных и ферментных систем. Микробиол. ж. (Киев), 2005, 67, 85-110.

5. Sybirny A., Sybirny W., Puchalski Cz. Biopaliwowy etanol z lignocelulozy (biomasy roslinnej): osi^gnifcia, problemy, perspektywy. Post?py Nauk Rolniczych, 2007, N 4, 15-23.

6. Sybirny W., Puchalski Cz., Sybirny A. Metaboliczna inzynieria drobnoustrojow dla konstruowania wydajnych producentow bioetanolu z lignocellulozy. Biotechnologia, 2007, N 4, 38-54.

7. Demkiv O.M., Paryzhak S.Y., Gayda G.Z., Sibirny V.A., Gonchar M.V. Formaldehyde dehydrogenase from recombinant yeast Hansenula polymorpha: isolation and bioanalitica! application. FEMS Yeast Res., 2007, 7, 1153-1159. [IF= 2,812]

8. Dmytruk K.V., Smutok O.V., Ryabova O.B., Gayda G.Z., Sibirny V.A., Schuchman W. Gonchar M.V., Sybirny A.A. Isolation and characterization of mutated alcohol oxidases from the yeast Hansenula polymorpha with decreased affinity toward substrates and their use as selective elements of an amperometric biosensor. BMC Biotechnology, 2007, 7, 33-39. [IF= 2,723]

9. Sibirny V.A., Gonchar M.V., Grabek-Lejko D., Csoregi E., Pavlishko H.M., Sibimy A.A. Photometric assay of methanol and formaldehyde in industrial waste-waters using alcohol oxidase and 3-methyl-2-benzothiazoline hydrazone. Int. J. Environ. Anal. Chem., 2008, 88, 289-301. [1F= 1,114]

10. Sibirny V., Demkiv 0., Klepach H„ Honchar Т., Gonchar M. Alcohol oxidase- and formaldehyde dehydrogenase-based enzymatic methods for formaldehyde assay in fish foods

products. Food Chemistry, 2011, 127, 774-779. [IF= 3,458]

11. Kamiñska-Kiszka E., Wit L„ Sibirna L„ Sibirny V., Gonchar M. Oznaczanie zawartosci etanolu metodi} enzymatycznq w winach i napojach owocowych oraz sokach. Zywnosc Nauka Technologia. Jakosc, 2011, 4,45-57. [IF= 0.157]

12. Sibirny V., Demkiv O., Paryzhak S., KJcpach H„ Korpan Y., Smutok O., Nisnevich M„ Gayda G., Puchalski C., Gonchar M. Formaldehyde-oxidizing enzymes and genetically modified yeast Hansenula polymorpha cells in monitoring and removal of formaldehyde. In: Waste Water -Evaluation and Management, Fernando Sebastián García Einschlae (Ed.) InTech 2011 n 115154. ISBN: 978-953-307-23Э-3. '

13. Grabek-Lejko D„ Kurylenko O.O., Sibirny V.A., Ubiyvovk V.M., Penninckx M„ Sibirny A.A Alcoholic fermentation by the wild-type and the recombinant strains of Hansenula polymorpha and Saccharomyces cerevisiae with elevated level of intracellular glutathione. J. Industrial Microbiol, and Biotechnol., 2011,38, 11, 1853-1859 f/F= 2,416]

14. Smutok O., Gayda G„ Dmytruk K„ Klepach H„ Nisnevitch M„ Sibirny A., Puchalski Cz„ Broda D., Schuhmann W., Gonchar M., Sibirny V. Amperotometric biosensors for lactate] alcohols and glycerol assays in clinical diagnostics. In: Biosensors for Health, Environment and Biosecunty, Book 1, InTech, 2011, p.401-446. ISBN 978-953-307-328-6.

15. Сибирный В.А., Гончар M.B. Ферментативное определение содержания этанола в плодово-ягодных винах и соках. Вестник УГСХА, 2011, N2(14), 57-62.

16. Сибирный В.А., Гончар М.В. Определение формальдегида в рыбе с использованием алкогольоксидазы и формальдегиддегидрогеназы. Вестник УГСХА, 2012, N 1(17) 67-73

17. Grabek-Lejko D„ Sibirny V., Sibimy A. Regulacja ekspresji genów u 'drozdzy metylotroficznych. Postçpy Biochemii, 2013, 59 (1), 95-106.

Б. Монографии

18. Sybirny W. Nowe enzymatyczne i biosensorowe metody analizy formaldehydu, metanolu oraz etanolu w srodowisku i artykulach spozywczych. Wydawnictwo Uniwersytetu Rzeszowskiego Rzeszöw, 2008, 101 s.

19. Сибирный В. Анализ спиртов и альдегидов, конструирование продуцентов этанола. Разработка новых методов с использованием неконвенционных дрожжей Hannsenula polymorpha и Pichia stipitis. ISBN 978-3-8473-9155-5. Palmarium Academic Publishing Saarbrucken, Germany, 2012, 256 с.

В. Статьи в других журналах и сборниках

20. Bien J., Sybirny W., Sybirny A. Maidan N, Gonchar M. Nowa enzymatyczno-chemiczna metoda oznaczania formaldehydu i metanolu w sciekach przemyslowych. Inzynieria i Ochrona Srodowiska, 1999, 2, N3-4, 323-331.

21. Бень Я., Гончар M„ Майдан Т., Сибирный В., Сибирный А. Новые методы анализа метанола и формальдегида в сточных водах. В: Труды Международного экологического конгресса «Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности». Санкт-Петербург 2000, 182-186. Р yV '

22. Gonchar M.V., Ryabova О.В., Dmytruk K.V., Zakalska O.M., Smutok O.V., Pavlishko H.M., Gayda G.Z., Sibirny V.A., Sybirny A.A. Isolation and characterization of the mutant forms of Hansenula polymorpha alcohol oxidase as a selective element of the amperometric biosensor. In: Investigations on sensor systems and Technologies. Ed. By A.V. Elskaya and V.D. Pokhodenko. Kiev, National Acad. Sei. of Ukraine, 2006, 134-140.

23. Paryzhak S., Demkiv. O., Gajda G., Sibirny V., Schuhmann W., Gonchar M. Enzyme- and cells-based biosensors for assay of formaldehyde in vaccines. In: 2nd Polish-Ukrainian Weigl Conference "Microbiology of the XXI century" Warsaw Agricultural University - SGGW 2426 September, 2007, p. 170-173.

24. Дмитрук К.В., Куриленко О.О., Ищук О.П., Убийвовк В.М., Снбирный В.А., Федорович Д.В., Сибириый А.А. Конструирование рекомбинантного штамма дрожжей Pichia stipitis с улучшенными параметрами алкогольной ферментации ксилозы. Наука та інновації (Київ), 2010, т. б, №6, 45-50.

25. Sibirny V., Kaminska-Kiszka Е., Sibima L., Gonchar M. Zastosowanie zestawu enzymatycznego „Alkotest" do oznaczania etanolu w winach owocowych, napojach і sokach. In: Proceeding Book of X International Scientific Conference "Risk factors of food chain", September 13-14, 2010, Nitra, Slovak Republic, p. 282-288.

26. Sibirny W., Smutok O., Klepach H., Gayda G., Dmytruk K., Broda D., Gonchar M. Alcohol-selective amperomctric biosensors based on natural and mutated alcohol oxidases. In: Nowoczesne metody analizy surowcow roslinnych. G. Bartosz, Cz. Puchalski (red.), Wydawnictwo Uniwersytetu Rzeszowskiego, Rzeszow, 2011, 241-253.

27. Demkiv O., Chen D., Lupak M., Grabek-Lejko D„ Gayda G„ Gonchar M., Sibirny W. Konstruowanie laboratoryjnych modeli bioreaktorow do detoksykacji formaldehydu ze srodowiska. W: Nowoczesne metody analizy surowcow roslinnych. G. Bartosz, Cz. Puchalski (red.),Wydawnictwo Uniwersytetu Rzeszowskiego, Rzeszow, 2011, 255-264.

28. Grabek-Lejko D., Sybirny W., Sibirny A. Drozdze niekonwencjonalne jako potcncjalni producenci etanolu paliwowego z lignocelulozowych odpadow rolniczych. W: Nowoczesne metody analizy surowcow roslinnych. G. Bartosz, Cz. Puchalski (red.),Wydawnictwo Uniwersytetu Rzeszowskiego, Rzeszow, 2011, 369-378.

29. Сибириый B.A., Гончар M.B. Биотехнологические параметры определения формальдегида с использованием алкогольоксидазы и формальдегиддегидрогеназы. В: Настоящее и будущее биотехнологии в решении проблем экологии, медицины, сельского, лесного хозяйства и промышленности. Сборник научных трудов научно-практического семинара с международным участием. Ульяновск, УлГУ, 2011, 141-146.

Г. Тезисы научных конференций

30. Sibirny v., Maidan М„ Pavlishko Н., Stasyk О., Smutok О., Stel'mashchuk S„ Gonchar M., Sibirny A. Bioanaliyical application of enzymes from methylotrophic yeasts. In: Proc. 21!t Intern. Spec. Symp. On Yeasts (ISSY 2001)"Biochem., Genetics, Biotechnol. and Ecol. Of Non-conventional Yeasts (NSY)", 2001, Lviv, Ukraine, 84.

31. Ryabova O.B., Maidan M.M., Gonchar M.V., Zaczek A., Grabek D., Oklejewicz В., Grzadka M., Sibirny V.A., Kotylak Z., Sibirny A.A. Glukose and xylose fermentation to acetaldehyde and etanol by the yeasts Hansenula polymorpha and Pichia stipitis. In: Proc. 22nd Intern. Spec. Symp. On Yeasts (ISSY 2002) „Yeast Fermentations and other Yeast Bioprocesses", 2002, Pillanesburg National Park, South Africa, 64.

32. Ryabova O.B., Chmil O.M., Grabek D., Sibirny V.A., Kotylak Z., Sibirny A.A. Xylose and cellulose fermentation to ethanol by the thermotolerant methylotrophic yeast Hansenula polymorpha and Pichia stipitis. In: Proc.22"d Intern. Spec. Symp. On Yeasts (ISSY 2002) „Yeast Fermentations and other Yeast Bioprocesses", 2002, Pillanesburg National Park, South Africa, 86.

33. Sibirny A., Kotylak Z., Sibirny W., Grabek D., Oklejewicz В., Grzadka M., Ryabova O. Biotechnologia produkcji etanolu paliwowego z ligninocellulozy przez drozdze. Materialy II Krajowego Kongresu Biotechnologii. Lodz, 2003, 89.

34. Grabek D., Oklejewicz В., Kotylak Z., Sibirny A., Sibirny V., Gonchar M. Biosensory na zasadzie genetycznie zmodyfikowanych komorek drozdzy metylotroficznych oraz enzymow і perspektywy ich wykorzystania. Materialy II Krajowego Kongresu Biotechnologii. Lodz, 2003, 92.

35. Gonchar M., Pavlishko H., Oklejewicz В., Grabek D., Kotylak Z., Sibirny A., Sibirny V. Nowa enzymatyczna metoda rownoczesnego oznaczania zawartosci formaldehydu і metanolu w sciekach przemyslowych. Materialy II Krajowego Kongresu Biotechnologii. Lodz, 2003, 86.

36. Kotylak Z., Sibirny A., Sibirny V., Zaczek A., Kus-Liskiewicz M. Genetyczna analiza termotolerancyjnych szczepow drozdzy Saccharomyces cerevisiae. Materialy II Krajowego Kongresu Biotechnologii. Lodz, 2003, 227.

37. Gonchar M., Korpan Y., Grabek D., Kotylak Z„ Sibirny V., Elska A., Sibirny A. Yeast cellsand alcohol oxidase-based biosensors for assay of formaldehyde. In: 6-th International Conference on Role of Formaldehyde in Biological Systems. Pecs, Hungary, 2003, 54.

38. Gonchar M„ Gayda G., Pavlishko H., Smutok O., Sibirny V., Kotylak Z„ Sibirny A. Metabolically engineered yeast cells and enzymes as the biorecognition elements of biosensors. First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology. Lviv, UCCB, 2004, 85.

39. Sibirny A., Gonchar M., Ryabova O., Dmytruk K., Zakalska O., Smutok O., Pavlishko H., Gayda G., Sibirny V., Schuchman W. Genetically engineered oxidases: structural and functional characterization and analytical exploration. Abstracts of Ukrainian-German Symposium on Nanobiotechnology "Current State and Prospects for Future Cooperation" Kyiv December 14-16, 2006, p. 133.

40. Sibirny V.A., Grabek-Lejko D., Gonchar M.V., Sibirny A.A Enzymo-chemical method for simultaneous assay of methanol and formaldehyde in industrial waste-waters using alcohol oxidaseand 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone. Abstracts of 12-th International Congress on Yeasts, Kyiv, August 11-15, 2008, p.332.

41. Sybirny v., Dmitruk K_, Zakalska O., Klepach H„ Smutok O., Gonchar M„ Sybirny A.. Alcohol oxidases from the yeast Hansenula polymorpha with decreased affinity toward substrates as the bioelements of amperometric biosensors. Abstracts of 3rd Ukrainian-Polish Weigl Conference "Microbiology on Service for Human", Odessa, September 14-17 2009 p 108-109.

42. Sibirny V., Kaminska-Kiszka E., Sibirna L„ Gonchar M. Application of the enzymatic kit „Alkotest" for etanol assai In fruit wines, soft drinks and juices. Abstracts of X International Scientific Conference "Risk factors of food chain", Nitra, Slovak Republic, September, 13-14 2010, p. 37.

43. Grabek-Lejko D., Kurylenko O., Ubiyvovk V.M., Sibirny V., Penninckx M., Sibirny A. Interactions between glutathione metabolism and glucose fermentation in Hansenula polymorpha and Saccharomyces cerevisiae yeasts. Abstracts of 28th International Specialized Symposium on Yeasts, Bangkok, Thailand, September 15-16, 2010, p. 78.

44. Sibirny V., Honchar T., Gonchar M. New enzymatic method for formaldehyde assay in fish food products using enzymes at Hansenula polymorpha. Abstracts of XI International Scientific Conference "Risk factors of food chain", Iwonicz, Poland, September, 5-6, 2011, p. 77.

45. Demkiv O., Gayda G., Korpan Y„ Sigawi S., Nisnevich M., Sibirny V., Gonchar M. Recombinant yeast Hansenula polymorpha cells for formaldehyde monitoring and bioconversion in bioreactor. Abstracts of International Symposium on Cell Biology jointly with 3rd Ukrainian Congress for Cell Biology, Yalta, May 16-20, 2012, p. 68.

Подписано в печать 16.09.2013 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 75 экз. Заказ № 1331 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Сибирный, Владимир Андреевич, Москва

05201351791

на правах рукописи

СИБИРНЫЙ Владимир Андреевич

Разработка новых методов анализа спиртов и альдегидов и конструирование продуцентов этанола с использованием нетрадиционных дрожжей Натепи1а ро1утогрка и РкМа зНрШя

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 - микробиология

диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений........................................................................................8

1. ВЕДЕНИЕ.........................................................................................................10

2. ОБЗОР ИТЕРАТУРЫ......................................................................................22

2.1. Этанол, метанол и формальдегид.................................................................22

2.2. Микробная деградация формальдегида и метанола

в сточных водах............................................................................................29

2.3. Химические и физико-химические методы определения этанола, метанола и формальдегида...........................................................................32

2.4. Хемосенсорные методы анализа этанола, метанола и формальдегида ...37

2.5. Методы анализа этанола, метанола и формальдегида

с использованием ферментов.....................................................................39

2.5.1. Характеристика метилотрофных дрожжей и метилотрофного метаболизма................................................................................................43

2.5.2. Свойства алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей.......................46

2.5.3. Выделение и очистка алкогольоксидазы (АО) из метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha...............................................................52

2.5.4. Биосенсорные методы анализа этанола, метанола и формальдегида ...58

2.6. Конструирование штаммов дрожжей с увеличенной продукцией этанола...........................................................................................................68

2.6.1. Конструирование продуцентов этанола на основе дрожжей Saccharomyces cerevisiae............................................................................68

2.6.2. Конструирование продуцентов этанола на основе бактерий

Zymomonas mobili и Escherichia coli.................................................................74

2.6.3. Биотехнологическое совершенствование нетрадиционных

дрожжей Pichia stipitis.............................................................................76

2.6.4. Конструирование продуцентов этанола на основе метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha...............................................................79

2.6.5. Промышленная продукция этанола из лигноцеллюлозы.......................82

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.........................................84

3.1. Объекты исследований................................................................................84

3.2. Условия культивирования............................................................................85

3.3. Определение биомассы клеток...................................................................85

3.4. Пермеабилизация клеток.............................................................................86

3.5. Получение бесклеточного экстракта (БЭ)..................................................86

3.6. Определение содержания белка..................................................................86

3.7. Определение активности ферментов..........................................................87

3.7.1. Определение активности оксидаз............................................................87

3.7.2. Определение активности алкогольдегидрогеназы (АДГ)......................87

3.7.3. Определение активности формальдегиддегидрогеназы (ФАДГ)........87

3.7.4. Определение активности пероксидазы (ПО)..........................................87

3.7.5. Единицы определения активности ферментов, формула расчетов......88

3.8. Электрофорез АО Н. ро1утогрИа.................................................................90

3.9. Определение константы Михаэлиса (Км) алкогольоксидазы

Н. ро1утогрка для метанола, этанола и формальдегида при помощи кислородного электрода Кларка..................................................................90

3.10. Определение формальдегида и метанола в промышленных стоках с использованием АО и 4-амино-5-гидразино-3-меркапто-1,2,4-триазола (АГМТ)................................................................................91

3.10.1. Определение содержаня формальдегида...............................................91

3.10.2. Определение содержания метанола.......................................................92

3.11. Одновременное определение содержания метанола и формальдегида с использованием АО и гидразона З-метил-2-бензотиазолинона (МБТГ)........................................................................................................93

3.12. Анализ содержания этанола.......................................................................95

3.12.1. Анализ содержания этанола с использованием

алкогольдегидрогеназы (АдГ)................................................................95

3.12.2. Анализ содержания этанола с алкогольоксидазой и пероксидазой

(метод АОП)..............................................................................................95

3.12.3. Анализ содержания этанола оксидазно-химическим методом

с использованием АО и МБТГ................................................................95

3.12.4. Определение содержания этанола в соках и плодово-ягодных

винах..........................................................................................................96

3.13. Биосенсорные методы анализа этанола....................................................98

3.13.1. Разработка амперометрического биосенсора на основе алкогольоксидазы.....................................................................................98

3.13.2. Формирование чувствительной мембраны............................................98

3.13.3. Формирование амперометрического АОП- биоосенсора.....................99

3.13.4. Формирование двухслойного двухферментного элемента биосенсора................................................................................................99

3.14. Ферментативное определение формальдегида......................................100

3.14.1. Определение формальдегида методом АОП.......................................100

3.14.2. Определение содержания формальдегида в рыбе................................100

3.15. Использование электрохимического биосенсора для определения метанола в промышленных сточных водах............................................106

3.16. Выделение из мутантов дрожжей Hansenulapolymorpha АО с пониженным сродством к субстратам....................................................107

3.16.1. Штаммы и среды....................................................................................107

3.16.2. Определение аминокислотных последовательностей........................108

3.16.3. Молекулярно-биологические методы..................................................108

3.16.4. Определение операционной стабильности биосенсоров...................108

3.17. Выделение и биотехнологическое использование формальдегиддегидрогеназы (ФАДГ)....................................................108

3.17.1. Источник ФАДГ, условия культивирования и получения бесклеточного экстракта (БЭ)...............................................................108

3.17.2. Выделение и очистка ФАДГ.................................................................109

3.17.3. Электрофорез.........................................................................................110

3.17.4. Ферментативное определение формальдегида...................................110

3.18. Конструирование рекомбинантного штамма дрожжей Pichia

stipitis с улучшеной алкогольной ферментацией ксилозы...................110

3.18.1. Штаммы и среды....................................................................................110

3.18.2. Молекулярно-генетические методы.....................................................111

3.19. Изучение алкогольной ферментации у диких и рекомбинантных штаммов Hansenula polymorpha и Saccharomyces cerevisiae.....................................................................................................113

3.19.1. Использованные штаммы.....................................................................113

3.19.2. Условия культивирования......................................................................113

3.19.3. Конструирование плазмиды, содержащей ген GSH1 S. cerevisiae.....115

3.19.4. Аналитические методы..........................................................................116

3.19.5. Резистентность к экзогенному этанолу................................................117

3.20. Статистический анализ полученных результатов..................................117

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.........................................................119

4.1. Разработка ферментативных фотометрических методов анализа этанола, метанола и формальдегида..........................................................119

4.1.1. Анализ этанола в плодово-ягодных винах, напитках и соках.............121

4.1.3. Разработка оксидазно-химического метода определения этанола......133

4.1.4. Разработка ферментативных фотометрических методов анализа формальдегида..........................................................................................134

4.1.5. Энзиматическое определение формальдегида (ФА) в рыбных продуктах с использованием АО и ФАДГ.............................................137

4.1.6. Использование энзимо-химического метода для определения содержания формальдегида и метанола в промышленных сточных водах.........................................................................................................153

4.2. Конструирование элементов биосенсоров, селективно реагирующих

на метанол, этанол и формальдегид..........................................................164

4.3. Биосенсорное определение метанола в промышленных сточных

водах............................................................................................................171

4.4. Разработка амперометрических биосенсоров на основе АО

с использованием новых технологий........................................................175

4.4.1. Иммобилизация АО методом электроосаждения и изучение возможности использования АО в безоксидазном биосенсоре...........175

4.4.2. Конструирование двухферментного биосенсора с использованием

АО и ПО....................................................................................................176

4.5. Мутантные формы АО H. polymorpha в качестве селективного элемента амперометрического биосенсора............................................181

4.5.1. Мутагенез и селекция мутантных штаммов, скрининг мутантов по активности АО..........................................................................................182

4.5.2. Определение кинетических параметров мутантной АО......................183

4.5.3. Определение нуклеотидной последовательности мутантных аллелей структурных генов АО штаммов СА2 и СА4 Н. polymorpha и идентификация мутаций.........................................................................184

4.5.4. Выделение и очистка мутантных форм АО...........................................186

4.5.5. Конструирование амперометрического биосенсора на основе мутантных форм АО...............................................................................188

4.6. Биоаналитическое использование формальдегиддегидрогеназы (ФАДГ)........................................................................................................193

4.6.1. Оптимизация условий культивирования. Выделение

и характеристика фермента...................................................................193

4.6.2. Использование ФАДГ для ферментного определения ФА..................200

4.6.3. Использование ферментных и клеточных биосенсоров

для анализа ФА в вакцинах....................................................................204

4.7. Конструирование штаммов дрожжей с увеличенной продукцией этанола..........................................................................................................215

4.7.1. Конструирование рекомбинантного штамма дрожжей Pichia stipitis

с улучшенной алкогольной ферментацией ксилозы.............................215

4.7.2. Улучшение параметров алкогольной ферментации глюкозы рекомбинантными штаммами Hansenula polymorpha и Saccharomyces cerevisiae с повышенным уровнем внутриклеточного глутатиона ...............................................................................................221

5. ВЫВОДЫ........................................................................................................235

6. ЛИТЕРАТУРА................................................................................................238

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГМТ - 4-амино-5-гидразин-3-меркапто-1,2,4-триазол (Purpald) АДГ - алкогольдегидрогеназа АДДГ - альдегиддегидрогеназа АО - алкогольоксидаза

АОП-метод - метод алкогольоксидазно-пероксидазный БЭ - бесклеточный экстракт

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГЖХ - газо-жидкостная хроматография ДТТ - дитиотрейтол

ДЭАЭ-целлюлоза - диэтиламиноэтилцеллюлоза МБТГ - гидразон З-метил-2-бензотиазолинона

НАД+, НАД(Н+) - никотинамидадениндинуклеотид окисленный,

восстановленный ОХ-метод - оксидазно-химический метод ПААГ - полиакриламидный гель ПО - пероксидаза ТВ - Трис буфер ТХУ - трихлоруксусная кислота ФА - формальдегид ФАД - флавинадениндинуклеотид ФАДГ - формальдегиддегидрогеназа ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота AAP - 4-аминоантипирин

ABTS - 2,2'-азинобис(3-этилобензотриазолин-6-сульфоновая кислота) АТР - аденозин-3-фосфат

DTNB - 5,5-дитиобис-(2-нитробензойная кислота) EtOH - этанол

НВТ - 2-гидразинбензотиазол МеОН - метанол

MOPS - 3-СК-морфолино)-пропансульфоновая кислота

NBD - N-нитробензолдиазоний

NTB - нитротетразолиевый голубой

PMS - феназин метосульфат

PMSF - фенилметилсульфонилфторид

SDS - додецилсульфат натрия

ТМВ - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин

1. ВВЕДЕНИЕ

Мониторинг среды, включающий контроль воздуха, сточных вод, пищевых продуктов, почвы и питьевой воды, приобретает все большее значение в программах улучшения условий жизни и питания человека. Среди множества методов все большее внимание уделяется новейшим биоаналитическим методам [34, 35, 253]. В них используются высокоспецифичные ферменты, а также биосенсоры на основе ферментов, микробных клеток, либо иных биоэлементов. Для внедрения биосенсорных методов анализа в широкую практику необходимы исследования по конструированию биоэлементов с оптимальными параметрами, включая создание ферментных и микробных сенсорных элементов с необходимыми биоаналитическими характеристиками.

Современный этап развития цивилизации в значительной степени зависит от успешной разработки новых технологий для производства биотоплива, особенно топливного этанола из непищевых источников. В настоящее время этанол производится в больших количествах (79 млрд л в 2009 г.), причем около 75 % этого вещества используется в качестве топлива для двигателей внутреннего сгорания и лишь 15 % - для приготовления крепких спиртных напитков. Бензин в настоящее время зачастую

используется в смесях с этанолом, который будут получать из биомассы растений, причем в странах Евросоюза с 2010 г. введено требование, согласно которому бензин должен содержать не менее 5,5 % этанола [220]. Известно также положительное влияние биотехнологического производства этанола на глобальный парниковый эффект. Сжигание этанола, полученного из биомассы, не приводит к дополнительной эмиссии С02 в атмосферу [198]. В настоящее время топливный этанол получают из пищевого и кормового сырья (крахмал, сахароза). Поэтому конструирование штаммов, способных к эффективной конверсии в этанол гидролизатов растительной биомассы, состоящих, в основном, из глюкозы и ксилозы, имеет первостепенное значение для увеличения производства этого биотоплива. Важной задачей является также усовершенствование методов анализа этанола.

Метанол играет важную роль в качестве исходного сырья для химического синтеза. Значительная его часть используется в процессе получения формальдегида, а также для производства синтетических смол и лавсана, биотоплива, а также в качестве добавки к бензину. Случайное потребление метанола приводит к слепоте, необратимым неврологическим нарушениям и даже к смерти [1, 2]. В связи с высокой токсичностью метанола [3-5] важное значение имеет определение его содержания в алкогольных напитках, биологических жидкостях, при контроле промышленных отходов.

Одна из крупнейших по масштабу химическая технология заключается в производстве различных пластмасс с применением формальдегида. Поэтому определение формальдегида и сопутствующего ему метанола очень важно для мониторинга окружающей среды, контроле многих промышленных товаров и медицинских препаратов, пищевых продуктов. Особенно высокий уровень формальдегида, как натурального метаболита, в ряде рыбных продуктов семейства тресковых [295], содержание которого в процессе хранения в замороженном состоянии его содержание может достигать от 210 до 780 мг на

1 кг сырой биомассы, что представляет собой серьезную токсикологическую проблему [251].

Для эффективного производства биоэтанола необходим поиск и генно-инженерное улучшение дрожжей, способных сбраживать до этилового спирта гидролизаты лигноцеллюлозы. Важнейшее значение имеет исследование метилотрофных дрожжей Н. polymorpha, которые могут сбраживать как глюкозу, так и ксилозу, а также P. stipitis, дикие штаммы которых по характеристикам ферментации ксилозы не уступают лучшим рекомбинантным штаммам Saccharomyces cerevisiae. Такие дрожжи представляют интерес для разработки процесса одновременного энзиматического гидролиза лигноцеллюлозы с последующей ферментацией образуемых Сахаров до этанола. Штаммы с улучшенными параметрами ферментации лигноцеллюлозного сырья могут сделать этот процесс более рентабельным [13].

Информация о работе

Сибирный, Владимир Андреевич
доктора биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка новых методов анализа спиртов и альдегидов и конструирование продуцентов этанола с использованием нетрадиционных дрожжей Hansenula polymorpha и Pichia stipitis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы