Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выделение и характеристика пероксисомдефицитных мутантов метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha
ВАК РФ 03.00.15, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика пероксисомдефицитных мутантов метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha"
На правах рукописи
Г\
КУРБАТОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА
ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕРОКСИСОМДЕФИЦИТНЫХ МУТАНТОВ МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ HANSENULA POLYMORPHA
03 00 15 - Генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА - 2005
Работа выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К. Скрябина РАН, г. Пущино
Научный руководитель.
доктор биологических наук, профессор Ю А Троценко. Официальные оппоненты.
доктор биологических наук, профессор Ю Д Цыганков кандидат биологических наук И.Г. Моргунов
Ведущая организация биологический факультет Московского Государственного Университета им М В Ломоносова
диссертационного совста Д 217 013 01 в ФГУП Гос НИИ Генетика по адресу. 117545 г Москва, 1-й Дорожный проезд, 1
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУП Гос НИИ Г енетика
Защита состоится
в 14 00 часов на заседании
Автореферат разослан
Ученый секретарь Диссертационного совста, кандидат биологических наук
2006 -4
¿U0Q9S
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Пероксисомы - внутриклеточные органеллы, окруженные однослойной белково-липидной мембраной, присущи практически веем эукариснам Эти органеллы, как правило, содержат ферменты ß-окисления жирных кислот, Ацил-КоА оксидазы и каталазу, выполняя жизненно важную функцию - разложение Н2О2 до воды и кислорода. У дрожжей функции пероксисом существенны, в частности, для первичного метаболизма метанола или н-алканов. что делает эти ор1анеллы привлекательными в биотехнологическом аспекте Нарушение биогенеза этих органелл у человека вызывает развитие ряда тяжелых наследственных заболеваний, поэтому пероксисомы стали объектом повышенного внимания исследователей. Иесмогря на внешнюю простор дрожжевых клеток, строение их органелл и закономерности развития близки таковым высших эукариот. Использование дрожжей в качестве модельною объекта для исследования биогенеза пероксисом позвотяет лучше понять патофизиологию пероксисомных заболевании человека и разработать методы их терапии.
Одним из молскулярно-генешческих подходов, разработанных для выделения и характеристики новых факторов, учас1В}ющих в биогенезе пероксисом, является создание представительных коллекций пероксисомных (псроксисомдефицитных) мутантов. Первые коллекции таких рех мутантов были получены с использованием химических мутагенов и негативной селекции на метаноле при оптимальной температуре (37°С, Cregg et al., 1990; Titorenko et al, 1993) Альтернативный метод основан на случайной интеграции в геном специфических линейных плазмид (RALF, RAndom integration of Linear DNA Fragments, van Dijk et al, 2001) Ортологи некоторых генов РЕХ метилотрофных дрожжей Hansenula polymorphe!, впервые найденные у других организмов, были выделены блаюдаря конструированию специфических праймеров и 11ЦР методу Однако, несмотря на выделение и характеристику 13 генов, кодирующих пероксины у данного вида дрожжей (van der Klei & Veenhuis, 2002), мно1ие факторы биогенеза пероксисом остаются неизвесшыми. Поэтому получение />аг-мутантов с использованием новых методов мутагенеза и селекции и их характеристика являкмея важными элементами исследований биогенеза пероксисом, а также необходимыми этапами для клонирования новых генов, участвующих в этом процессе
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было создание коллекции новых пероксисомных мутантов Н polymorpha и поиск новых генов, участвующих в образовании и поддержании функциональной стабильности пероксисом В связи с этим решались следующие основные задачи:
-Получение представительной коллекции мутантов, не растущих на метаноле при повышенной температуре, определение характера и количества мутаций, а также генетический анализ мутантов
-Селекция мутантов с нарушенной морфологией пероксисом методами флуоресцентной микроскопии.
-Изучение свойств отдельных мутантов и клонирование новых генов, участвующих в образовании и поддержании функциональной стабильности пероксисом
• >u,fiUiiA<flt>ir»} ' БИБЛИОТЕКА
«
Научная новизна работы. С использованием химического мутагенеза по модифицированной методике и селекции мутантов при неоптимальной температуре у Я polymorpha впервые получены температурочувствительные (is) мутанты нового класса -не растущие на средах с метанолом только при 45°С Комплементационный тест на аллелизм с применением делеционных мутантов по известным РЕХ-тенгм показал существенные различия спектра полученных мутантов по сравнению с известными пероксисомными мутантами У 52 мутантов с одиночными мутациями показано отсутствие комплементации с одним или несколькими делеционными штаммами Установлено, чш только четверть мутаций локализована в известных РЕХ-генах, тогда как остальные мутанты также имели пероксисомные дефекты. Это свойство предлагается использовать в качестве дополнительного фактора селекции для поиска новых пероксисомиых мутантов Нами были впервые получены "множественные" мутанты, мутанты с гиперпролиферацией пероксисом, а также Is мутант по гену интегрального мембранного белка РехЮр, перспективный для изучения функций и закономерностей регуляции тгого бечка в биогенезе пероксисом Клонированы и секвенированы три новых гена, возможно, участвующих в jtom процессе
Практическое значение работы Полученные Mut' мутанты испотьзукнся для изучения регуляции первичного метаболизма метано ia и клонирования новых pex-i енов участвующих в биогенезе пероксисом метилотрофных дрожжей Модифицированные нами меюд анализа пероксисомных мутантов и комплементационный тест на аллезизм перспективны при изучении белков, формирующих большое количество комплексов, в частности, белков цитоскелета и клеточной стенки
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на международном симпозиуме "ISSY 2001" (Львов, Украина, 2001), 5я и 8й школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXIго века" (ГГущино, 2001, 2004), конференции к 115-летию со дня рождения НИ Вавилова "Актуальные проблемы современной генетики" (Москва 2003), международной конференции посвященной исследованиям микротелец "Peroxisomes Now" (Харен, Голтандия 2003), конференции молодых ученых "GBB meeting of Biocentrum research groups" (Гронингеп, Голландия, 2003)
Публикации. По мат ериалам диссертации опубликовано 8 работ
Структура зиссертации. Диссертация состоит из введения обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Текст диссертации занимает 120 страниц, содержит 29 рисунков, 19 таблиц, и 241 литературный источник
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования и условия культивирования
Генотипы использованных штаммов дрожжей H polymorpha преде гавлены в Табл. 1
Для клонирования использовали штамм Escherichia coh DH5a (iuph44, Л1ас1Л69,(ф80
laclAM15) h<sdR17 recAl endAl, gyrA96, thi-1, relA), выращенный на среде LB (1% гриптона
(Difco), 0.5% (в/о) дрожжевого экстракта (YE, Difco), 1% (в/о) NaCl) Ампициллин вносили в среду до конечной концентрации 100 мкг/мл.
В качестве полной среды для выращивания Н polymorpha использовали среды YPD1 или YPD2. Зеоцин (zeocin, Stratagene, La Jolla, С А) вносили в среды в концентрации 25 мкг/мл Минимальная среда (МС) для выращивания гибридов и тестирования фенотипов мутантов на спиртах содержала (г/л): КН2Р04-1Д MgS04-0.5, NaCl-0.1, СаС12-0 1, (NH4)2S04-3 5, глюкоза-20 и стандартный раствор витаминов (Толсторуков с соавт., 1977). Использовали также приготовленные на основе МС среды, с заменой глюкозы на метанол (ММС), этанол (ЭМС) или глицерин (ГМС) в концентрации 1% (об/об)
Минимальная среда для выращивания трансформантов (YNB) содержала 0 67% Yeast Nitrogen Base (YNB, Difco) и необходимый источник углерода (0.5% (в/о) глюкозы-YND или 0.5% (в/о) метанола-YNM)
Минимальная среда для проведения микроскопии и анализа ферментов (ММ) содержала следующие компоненты (г/л)- (NH4)2S04-2.5, MgS04-0 2, К2НР04-0 7, NaH2P04-3, YE-0.2, стандартные растворы витаминов и микроэлементов (van Dijken et al, 1976), 0 5%-l% (в/о) глюкозу или 0 5% (в/о) метанол в качестве источника углерода.
При необходимости, в минимальные среды вносили аденин, урацил, L-лейцин или L-метионин в концентрации 20 мг/л.
При использовании i идрохлорида метиламина в качестве источника азота, (NH4)2S04 замещали данным соединением в концентрации 0 25% (в/об)
За исключением специально оговоренных случаев, клетки Н polymorpha и Е coh выращивали при 37°С. При определении фенотипов мутантов и микроскопии клетки культивировали при 30 или 44°С.
Таблица 1. Штаммы Н. polymorpha, использованные в работе.
Штамм Геногип Литературный ис гочник
NCYC495 leu 1 1, исходный Gleeson & Sudbery, 1988
NCYC495 игаЗ Gleeson & Sudbery, 1988
NCYC495 ade 11 Gleeson & Sudbery, 1988
NCYC495 leul 1, игаЗ Gleeson & Sudbery, 1988
NCYC495 metö Gleeson & Sudbery, 1988
HF246 NCYC495::(PaoxcGFP SKI,), leul 1 VanDijk et al, 2001
aF7 NCYC495::(PAOxeGFP SKL), adell Данная работа
Apex! NCYC495Apexl HpURA3adellmetö Kiel et al, 1999a
Лрех2 ЖУСЛ95Арех2- HpURA3adel lmetö Не опубл.
ЛрехЗ ШУСА95АрехЗ HpURA3adellmetö Baerends et al., 1996
Лрех4 NCYC495Apex4 HpURA3adellmetö Van der Klei et al, 1998
ApexS NCYC495/ipex5 HpURA3adel lmetö Van der Klei et al, 1995
Лрехб ~NCYC49SApexö HpURA3adellmetö Kiel et al., 1999b
ApexS NCYC495zlp«S HpURA3adellmetö Waterham et al., 1994
ApexlO NCYC495ApexlO HpURA3adeilmetö Tan etal., 1995
Арех12 NCYC495Apexl2 HpURA3adellmetö Не опубл
Apex/3 ~HCYC495Apexl3 HpURA3adellmetö Не опубл.
Лрех14 ШЧСЬ9ЬАрех14 HpVRA3ade 1 lmetö Komori et al, 1997,1999
Apexl9 NCYC495Apexl9 HpURA3adellmetö Otzen et al, 2004.
Получение мутантов. В качестве мутагена использовали нитрозогуанидин (НГ, Sigma, USA). Выживаемость клеток определяли по соотношению количества клеток в 1мкл, подсчитанного в камере Горяева, к количеству колоний, выросших на YPD из того же объема обработанной мутагеном суспензии клеток Обработанные НГ клетки высевали на чашки Петри с YPD из расчета 200-300 колоний на чашку Образовавшиеся колонии перепечатывали параллельно на две чашки со средой YNB-feu, содержащей метанол или глюкозу Чашки с метанолом и глюкозой инкубировали при 45°С и 37°С, соответственно Через 2 суток отбирали полные и мозаичные колонии мул антов, хорошо растущие на среде с глюкозой, но не растущие на среде с метанолом при 45°С Колонии, отобранные с чашек с глюкозой, пересевали штрихами на чашки с YPD, через 1 сутки инкубации при 37°С перепечатывали дважды на среду YNB-Zew с чеганолом и инкубировали один отпечаток при 37°С, другой-при 45°С
Получение гибридов, споруляиия, случайная выборка аскоспор Скрещивание, споруляцию и случайную выборку аскоспор проводили по описанным методам (Толсторуков с соавт, 1977) с модификациями Потребности в факторах роста у сегрегантов определяли на селективных средах MC с разными комбинациями лейцина, аденина и метионина. Выделение и анализ ДНК. Выделение ДНК Н polymorphei проводили по методу, описанному Sherman (Sherman et al, 1986), с модификациями (Miller et al, 1990) Трансформацию Е coli проводили по стандартному методу (Hanahan et al. 1983) с модификациями (Inoe et al, 1990) Электротрапсформацию H polymorpha проводили по методу, описанному Faber et al (1994) Выделение плазмидной ДНК Е colt и электрофоретическое разделение фрагменшв ДНК в aiapojiioM геле проводили в соответствии со стандартными методами (Maniatis et al., 1982, Sambrook et al., 1989). Основные плазмиды, использованные в работе, были любезно предоставлены проф М. Вейнхаузом, лаб "Электронной микроскопии эукарио!", Харен, Нидерланды (Табл.2), или сконструированы в процессе работы
Обработку ДНК ферментами проводили согласно рекомендациям фирм - производителей Выделение фрагментов ДНК из ai арозного геля осуществляли с помощью наСора реактивов QTAEX II (Qiagen, USA) в соответствии с притагаечым протоколом Оеквевирование ДНК проводилось на автоматическом ДНК секвесторе LiCor (LiCor, Lincoln, NB) фирмой BaseClear (Leiden, Нидерланды) Олигонуклеотиды были синтезированы фирмой "Life Technologies" (Breda, Нидерланды), а шкже с н t, ИБФМ РАН Ш.ипшикивым М Г Саузерн -гибридизацию проводили по стантдартным методам (Maniatis, 1982, Sambrook et al, 1989) с использованием набора CCL (Amcrsham. USA) с модификациями, описанными в инсгрукции к набору
Таблица 2. Исходные плазмиды, использованные в работе.
Плазмида Характеристика
pBlucscript II SK+ pYT3 pHS6-A pBS-URA3orl pZ4-eGFP Вектор для клонирования в Е coli, amp' Е coli /Н polymorpha вектор, ampr, S cerevisiae LEU2 gene, HARS1 E coli / H polymorpha вектор, полученный из pBluescript II SK', amp', S cerevisiae LEU2 gene, HARS1 E coli /H polymorpha вектор, потученный из pBluescript II SK+, amp', S cerevisiae URA3 gene, HARS1 E coli /H polymorpha вектор, zeor S cerevisiae LEU2
Микроскопия. Морфологию дрожжевых ктсток изучали с помощью микроскопа Zeiss Axioskop (Carl Zeiss, Gottingen. Germany), оборудованною CCD камерой фирмы Princeton Instruments (Rlb/CCD-1300 Y. Princeton, The Netherlands) Локализацию содержащих eGFP гибридных белков определяли по описанному меюду (Baerends et al, 2000) Биохимические методы. Для индупии пероксисомных ферментов клетки, выращенные на минеральной среде с 0.5% глюкозы до истощения субстрата (в течение ночи), переносили на среду, содержащую 0 5 % метанола в качестве источника углерода. Для индукции ферментов метаболизма метиламина выращенные клетки переносили на минеральную среду с 0 5% глюкозы, в которой fNH4bS04 заменяли на 0 25% (в/об) метиламин Бесклеточныи экстракт для измерения акшиности ферментов по 1учали по описанному меюду (Waterham et at, 1994) Активность алкогольоксидазы, кататазы, диоксиацетонсиша!ы, аминоксидазы и NADH дегидрогеназы определяли по описанным методам (Verduyn et al, 1984, Luck, 1963, Bystrykh et al, 1990, Zwart et al, 1980 и Scholes & Smith, 1968, соответственно) Концентрацию белка измерячи по методу Лоури (Т owry et al. 1951)
Для аналида последовательное г си ДНК использовали программу "Clone Manager 5" Программа "BLAST" быта испотьзована для поиска данных в базах данных NCBI Для выравнивания последовате 1ьностей ДНК испотьзовали программы "ClustalX" и ' Genedoc"
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Получение и первичная характеристика мутантов. В качестве исходного ипамма в данной работе использовали Hansenula polymorpha HF246 leul-I Поскольку биогенез пероксисом у метилотрофньгх дрожжей индуцируется метанолом, отсутствие роста на этом спирте использовали как фактор селекции. Под действием нитрозогуанидина (НГ), по модифицированному нами методу при средней выживаемости 22% было получено 260 мутантов, не способных расти на метаноле при повышенной температуре (45°С) (Mut, methanol utilization) Селекция мутантов на средах, содержащих лейцин, исключала отбор мутантов с дополнительными ауксотрофными мутациями Частот Mut' мутантов среди клеток, выживших после обработки мутшеном, составляла приблизительно 10%, что па порядок выше величин, полученных отбором мутантов при оптимальной температуре 37°С (Cregg et al, 1990).
После нескольких пересевов со срсды, содержащей меганол, на YPD и обратно, свой первоначальный Mut' фенотип сохранили 227 мутантов, которые использовали в дальнейшей работе.
Общая характеристика мутантов. 227 стабильных мутантов протестировали на среде с метанолом при трех температурах и разделили на две большие группы: 1) Mut'-nts (не растущие на метаноле при 30-45°С, 133 мутанта) и 2) Mut' -ts (ne растущие на меганоле только при 45°С, 94 мутанта)
Доминантность или рецессивность мутации Mut определяли в скрещиваниях со штаммом дикого типа H polymorpha NCYC 495 ade 11 11 мутантов не образовывали гибридов с этим штаммом. Тестирование потученньгх гибридов на среде с метанолом при трех температурах выявило группу доминантных мутантов, 21 из них являются cs-доминантными (гибриды не растут на метаноле только при 30°С), а 27 мутантов являются is-доминантными (гибриды не растут на метаноле только при 45°С). Двенадцать мутантов были es- и ts- доминантными одновременно. Только один мутант проявлял доминантность при всех трех температурах (30,
37 и 45°С) Частота доминантных мутантов и сочетание ростовых дефектов у выделенных мутантов соответствовали таковым в предыдущих работах
Идентификация мутантов при помощи делеционных рех-тестерок. В качестве тестеров использовали деледионные мутанты Apex 1-Лрех б, Apex 8, Apex 10 Apex 12-Apex 14 Apex 19 (все двойные ауксотрофы adel 1 met6) При проведении теста по два клона от каждого мутанта скрещивали со всеми тестерами и определяли способность полученных гибридов расти на среде с метанолом при 45°С
По результатам комплементационного анализа 52 мутанта разделили на две группы Первую группу составили мутанты, не комплементирующие один из рех тестеров (30 мутантов, Табл. 3) Вторую группу составили так называемые "множественные" мутанты (22 мутанта. Табл. 4), гибриды которых от скрещивания с несколькими разными рех тестерами не росли на метаноле Бодьшая часть этих мутантов (за исключением одного "множественного" мутанта, являющегося ts- доминантным) несли рецессивные мутации У 52 мутантов обеих групп ("одиночных" и "множественных") определяли способность к росту на этаноле (Eth) и глицерине (Ger) при температурах 30, 37 и 45°С Проведенные исследования позволили выявить 7 различных групп среди МиС - nt% мутантов и 4 таких группы среди Mut' - ts мутантов В итоге среди 52 испытывавшихся MyiamoB выявлено 23 Muf-nts мутантов и 10 Mut мутантов без дополнительных фенотипических характеристик Изучение "множественных" мутантов. Эта группа состоит из 22 мутантов, большинство которых (за исключением двух) входит в группу Mut' - nts мутантов Анализ случайной выборки аскоспор гибридов (Табл. 4), полученных от скрещиваний му гаи той со штаммом дикого типа adell, показал, что у 19 мутантов неспособность расти на среде с метанолом определяется в каждом случае единственной мутацией, которая, следовательно, имитирует множественность мутаций.
Таблица 3. Мутанты, не комплементирующие один из reciepoB
Тестерные Номера мутантов и их фенотип на среде с метанолом
дслеционные ts nts
мутанты
Apexl 237
Арех4 226* 227*
dpex 5 250,253,232, 191,126* 63
ApexS 197, 42, 231
ApexI3 245*
Арех14 78*
Арех19 204,215,217 165, 234,30
Apexl0 257, 258, 100, 102 36,140, 56, 106, 109, 185
'Нестабильные мутанты
Для установтения локализации единичных мутаций у мутантов этой труппы использовали подход, примененный ранее с аналогичной целью в случае доминантных мутантов (Titorenko et al, 1993) У пяти "множественных" мутантов анализировали рост на среде с метанолом у сегрегантов из потомства диплоидных птбридов полученных в результате скрещивания мутантов с делеционными тестерами (Apex) Каждому мутанту соответствовал индивидуальный набор Дрех-тестеров, гибриды с которыми не росли на метаноле. Отсутствие Mut* сегрегантов позволяет локализовать мутацию в конкретном гене
Проведенный анализ позволил локализовать рех мутации у четырех из 5 проанализированных "множественных" мутантов, два из которых (108 и 98) несут единичную МиГ мутацию (Табл. 4). В случае мутанта N213, имеющийся набор тестеров (àpexl-6,8,10,12-14,19) оказался недостаточным для идентификации мутировавшего гена, так как в гаплоидном потомстве всех гибридов имелись сегрсганты, растущие на метаноле При проведении в качестве контроля скрещивания делеционных тестеров между собой формировались фенотипичсски нормальные гибриды, растущие на метаноле
Два других "множественных" мутанта (154 и 174) несут независимые Muí' мутапии в двух разных генах Ceipei анты первого поколения от скрещивания мутантов NN\ 74 и 154 со штаммом дикого типа различались по фенотипу на метаноле (ts и nls), что позволило разделить Muí мутации на одиночные У каждого мутанта удалось локализовать только одну из возможных мутаций (рех4 у 154 и рех12 у 174) Вторая чутаиия может находиться как в РЕХ-тепе (делеционный мутант по которому отсутствует в нашей коллекции тестеров), так и в гене, кодирующем один из ферментов первичного метаболизма метанола (алкогольоксидазу, каталазу и др ), мутанты по которым также не способны расти на метаноле.
Для проверки устойчивости фенотипа "множественности" у мутантов, несущих единичные мутации, были почучены сегреганты от скрещивания со штаммом дикого типа (ade 11) Случайно выбранные Mut"ade II сегреганты (по одному oj каждого мутанта) скрещивали с leul-1 сегрегантами oi Apex (исходно adellmeíG). Фенотип сегреганшв с вариациями совпадал с исходным фенотипом (Табл. 4)
Анализ скрещивания двух сегрегантов рех 12-174 nts и 4-х рех4-154 ts с набором тестеров, характерных для исходных штаммов, показал, что фенотип множественности, наблюдаемый у исходных мутантов, был утрачен у сегрегантов, и вероятно, связан со второй мутацией Mut ( 174 ts и 154 nts).
Ранее было показано, что у H polymorpha пероксисомные белки могут формировать комплексы, а точковые мутанты по соответствующим РЕХ-генам демонстрировали отсугс!вие комплементации при пониженной температуре (Tan et al, 1993, Titorenko et al ,1995) Использование рекомбинационного анализа показало, чю, по крайней мере у трех "множественных" мутантов (гибриды которых с соответствующими тестерами не росли на метаноле при всех проверенных температурах), Mut мутация локализовалась в конкретном РЕХ - гене. Мы полагаем, что отсутствие комплементации с другими Дрех-тестерами является результатом взаимодействия продукта данного РЕХ-гена (в котором локализована мутация) с продуктами других генов, участвующих в формировании соо1ветствующих белковых комплексов По нашему мнению, использование делеционных тестеров позволяет выявлять мутанты по неизвестным компонентам таких комплексов. Отсутствие роста гибридов на среде с метанолом возможно на фоне нарушения стабильности комплексов при неоптимальных температурах за счет уменьшения количества белка (ген которого делегирован) у гетерозиготных гибридов Мы также полагаем, что выделенные впервые "множественные" мутанты несут мутации по белкам - компонентам комплексов известных Рех-белков с еще не описанными пероксинами, белками клеточной стенки и цитоскелета, взаимодействие с которыми ранее показано для других видов дрожжей (например, белки S cerevisiae Рех22р и Рехбр взаимодействуют с белками хитинсинтазами Chs 1р и Chs7p
(Tong et al, 2004), Рех14р - с Chs5p (Tong et al., 2004), а Pex7p с Myo2p (Hoepfner et al, 2001)).
Функциональный тест на аллелизм, проведенный в группе из 19 множественных мутантов (в качестве 1естсров испотьзовали 7 чушншв представителей разных фенотипических групп), выявит 5 групп комплементации Самая многочисленная третья группа вктючает 12 мутантов с фенотипами рехЮ-13 и рех10-14 (Табл. 4) Гибриды от скрещивании мутантов этой группы не растут на метаноле при одной из неоп гимальных температур (30 и 45°С) РехМр и Рех13р относятся к белкам формирующим большое котичес!во комптексов У двух хорошо изученных видов дрожжей (S cerevisiae и Р pastoris) было показано что Рсх13р и Рех14р взаимодействуют с Рсх17р (ранее неизвестным у II p/ilymorphaj, формируя субкомп 1екс, связанный с мембранным белком РехЮр который по постсдним данным играет одну из ключевых ролей в формировании целого ряда мембранных комплексов (Eckert & Johnson, 2003)
Изучение "одиночных" муташов. При изучении этой группы мутантов показано, что у большинства из них Mut' фенотип связан с единственной мутацией (Табл. 5)
При анализе фенотипов сегрегантов от гибридов мутантов с соответствующим рех тестером было показано, что только у 7 мутантов (25% от общего количества мутантов этой группы) мутация действительно локализована в РЕХ гене (Табл. 5) В остальных случаях в гаплоидном потомстве тибридов обнаружены сирегангы, растущие на метаноле что свидетельствовало о локализации мутации вне исстедованных генов PLX (псевдо "рех" мутанты)
Мутанты наиболее многочисленных групп комплементации (рех!9, pexlO и рех5) скрещивали между собой В результате получены данные, подтверждающие, что одна группа может включать мутанты по разным генам причем это не зависит от исходного фенотипа мутантов (ts/nts)
Изучение "одиночных" мутантов подтвердило установтениые ранее закономерности Тестирование роста гибридов мутантов этой группы с тетенионными тестерами выявило отсутствие комплементации мутантов 63, 250 197, 42. 231, 257 и 258 с соответствующими тестерами (Арех5, Лрех8 и ЛрехЮ) при всех ¡емпературах, независимо oí фенотипа (t4/nt4) Установлено, что при локализации мутации в конкретном РЕХ гене, гибриды, полученные от скрещивания таких мутантов с соответствующим рех тестером не растут на метаноте как при оптимальной ¡емпературе (37"С), так и при температурах отличных от оптимальной (30 и 45°С) Псевдо рех-мутанты образовывали с тестерами типтоитные гибриды, не рас1\щие на метаноле точько при температурах, отткчных от оптимальных (30 и 45°С), при згоч пероксисомы большинства из них имели дефекты (Табл. 5)
Цитологическая характеристика полученных мутантов. Штамм Н polymorpha HF246, использованный для получения коллекции мутантов, содержит интегрированную в геном илазмиду с eGFP, С-концевая часть которого представляет собой пероксисомный сигнальный трипепгид SKL (Van Dyk et а! 2001). eGFP SKL встроен под промотор ЛОХ и, в условиях роста на метаноле, по PTS1 транспортному нуги направ^ется в пероксисомы, что позволяет оценить форму, размеры и количество этих оргачелл Все 218 мутантов ("ро^е тех, у которых локализация мутации была надежно установлена) после выращивания по описанной схеме были проанализированы методами флуоресцентной микроскопии Предст авляющие особый интерес мутанты анализировали дважды (Табл. 6)
Таблица 4. Свойства 22 множественных мутантов НапэепиШ ро1утогрИа НЛ?246 1еи1-1.
Номера мутантов Случайная выборка аскоспор, Ш*/Ме( Лрос,гибрваыс которыми не растут иа метаноле* .фех, гибриды cerpenairroBc которыми не расгутна метаноле Локализация мутации Рост на спиртах Груши комплементации
220 74/150 Г\2,3И,4С\5В ,6.8,10, 12я, 13.14,19 10, 13 н о М-йэ III
245 128/89 Ю'МЗ'5 10,13 н.о М-гйэ
246** 138/50 1-4к, 6С\8С5,12СМЗ, 14",19 10,13 н.о М-гЛз
259 119/98 1сь,3-6С!, 8м,10,12м,13, 14,19 10,14 н о М-йв
202 104/64 10,13,14 10,14 н о М-гйв
200 110/70 10,13,14ts,19 10,14 н.о М-тэ
206 340/390 13,14ts 10,14 но М-!^
213** 154/90 10,13,14 10,14* рех X М-пК
248** 175/186 4й, 13,14 10,14's Н О М-1в
118 131/172 1,3CS,4CS,5, 8,10,13 8,1015 н.о М-Шв
229 189/197 1",4и,13га 1,4,10 н.о Мчв II
98 170/152 2,10 2,10 рех 2 М-пй I
224 138/98 10,13 2СЬ,10,13 н.о М-п1ь, Г-П15 111
108 170/210 1.4,5,6,10,13, 14 1-6, 10 рех 1 М-п1ь V
167 112/114 4,13,14 10,19 н 0 М-Г^, IV
225 169/174 1,4,13 12,14,19 Н 0 M-nts, Э-й, ГЧв н.о
26 160/174 1-6CS, 8CS,10,12C,,13, 14 Г\4,6, Hei гс рех19 Н О М-пЬ> н о
223 179/51 2,6,12,13 2,6,12,13 Н 0 М-г^э н.о
142** 184/69 12'%13,14ls 13,14 Н о М-п(ч г III
143 158/302 Ю'МЗ'М9Й с н.п.*** н.о М-тв, Э-п^, Г-тэ
174 44/156 2,3CS,4CS,5B,6, 8й,12,13 с н.п. рех 12 М-т^э -
154 88/156 4,10,19b с н.п рех 4 М-П15 -
* В случае некочплементации тестера мутанюм при всех трех температурах, название тестера выделено жирным шрифтом, отсутствие индекса у названия тестера указывает на некомплементацию при двух температурах (30 и 45°С)
** Мутанты с дефектными пероксисомачи (описано далее)
*** Сегреганты не получали
Таблица 5. Генетическая характеристика "одиночных" мутантов.
Номера мутантов Случайная выборка аекпепор с расщеплением но фенотипу на метаноле при 45°С, Mut'/Muf Результат первичной идентификация с Apex Фенотип гибридов на среде с метанолом** Локализация мутации в РЕХ гене
237* 190/99 РЕХ1 ts -
226 172/140 РЕХ4 ts -
227 145/155 РЕХ4 ts -
63* 80/87 РЕХ5 Mut PEXS
250* 129/87 РЕХ5 Mut РЕХ5
126* 70/52 РЕХ5 ts -
253 166/135 РЕХ5 ts -
232* 153/137 РЕХ5 ts -
191* 149/129 РЕХ5 ts -
197* 140/106 РЕХ8 Mut' PEXS
42* 171/159 PLX8 Mut РЕХ8
231* 94/105 РЕХ8 Mut РЕХ8
245 140/156 РЕХ13 ts -
78 151/141 РЕХ14 ts -
30* 126/156 РЕХ19 ts -
165 162/108 РЕХ19 ts
204* 139/179 РЕХ 19 ts -
215 154/101 PEXI9 ts -
217 123/113 РЕХ19 ts -
234* 116/74 РЕХ19 ts -
36* 119/101 РЕХ 10 ts -
56* 56/198 РЕХ10 ts -
100* 159/194 РЕХ10 ts -
102* 162/143 РЕХ10 ts -
106* 219/193 РЕХ10 ts -
109* 102/130 РЕХ10 ts -
140* 98/97 РЕХ 10 ts -
185* 138/108 РЕХ10 ts -
257* 156/128 РЕХ 10 Mut' РЕХ10
258* 79/87 РЕХ 10 Mut РЕХ10
♦мутанты с дефектными нероксисомами (описаны далее)
** - не растут на среде с метанолом при 45°С, Ми{ - при всех температурах (30-45°С)
Количество групп комплементации пероксисомных мутантов Носкотьку известно, чю у Я polymorpha дефекты в одном и том же РЕХ !ене могут вызывать различные нарушения биогенеза пероксисом (Titorenko et al, 1995), для определения котичсства групп сцепления все мутанты с обнаруженными дефектами пероксисом скрещивали между собой Для этою у 43 мутантов этой группы (Табл. 6) были получены Mut'adel 1 - сирианты oi скрещивания со штаммом H polymorpha NCYC495 adel 1 не имеющим пероксисомных дефектов В случае мутантов, несущих как минимум две Mut' мутации (68, 173, 201, 1, 20, 205. 62, 79. 135, и 69, Табл. 6), в качестве штамма дикого типа использовали H polymorpha aF7
Таблица 6. Пероксисомные мут ан i ы И. polymorpha HF246, полученные в данной работе.
Номера мутантов Пероксисомный дефект
68 nts Цепочки клеток с нитоплазматическим еСРР
11 nts 1 пероксисома
140 nts 1 пероксисома
248 nts 1 пероксисома
142 nts 1 пероксисома
136 nts 1 пероксисома
44 nts Гиперпролиферация пероксисом
139 nts Гиперпролиферация пероксисом
173 nts Гиперпролиферапия пероксисом
201 nts Гиперпролиферация пероксисом
214 nts Гиперпролиферация пероксисом
1 nts Нарушение локализации евРР
20 nts Нарушение локализации евРР
43 nts Нарушение локализации еОРР
56 nts Нарушение локализации еОРР
81 nts Нарушение локализации еОРР
106 nts Нарушение токализации ейГР
109 nts Нарушение токализации евРР
185 nts Нарушение локализации ебРР
205 nts Нарушение локализации еСРР
221 nts Нарушение локализации еОИР
237 nts Нарушение локализации еОРР
30 nts Нарушение локализации еОРР
213 nts Нарушение локализации евРР
62 nts Нарушение локализации еСГР
53 nts Мелкие пероксисомы
79 nts Мелкие пероксисомы
246 nts Мелкие пероксисомы
129 nts Меткие пероксисомы
135 ts Цепочки клеток с цитоплазматическим еСРР
191 ts Гиперпролиферация пероксисом
65 ts Нарушение локализации евГР
69 ts Нарушение локализации еСГР
102 ft 1 иперпротиферация пероксисом
126 ft Нарушение токализации еОЬР
163 ft Нарушение локализации евРР
232 ts Нарушение локализации еОГР
238 ft Нарушение локализации евРР
257 ft Нарушение локализации еОРР
258 ft Нарушение локализации евРР
36 ft Вакуолярныи евРР
100ft Вакуолярный еОРР
41 ts Вакуолярныи ейРР
Жирным шрифтом выде1ены мутанты, несущие как минимум две Mut мутации
Полученные гибриды были гомозиготны по eGFP, что позволило проанализировать все Mut сегреганты, полученные от таких гибридов, методом флуоресцентной микроскопии После проведенного анализа выбирали ауксотрофные сегреганты (по 7-15 от каждого мутанта) с дефектами пероксисом, как у исходного мутанта Такие сегреганты затем повторно скрещивали с подходящим штаммом дикого типа (Я polymorpha NCYC495leu 1-1 или H polymorpha NCYC495 metö) Для скрещивания с исходными мутантами отбирали сегреганты второго поколения с единственной Mut' мутацией и подходящей ауксотрофностью Тестирование полученных в результате таких скрещиваний гибридов на среде с метанолом при трех температурах (30, 37 и 45°С) выявило четыре малочисленные группы комплементации
Поскольку наибольший интерес представляли tt-муганты нового, не описанного ранее класса, для дальнейшего изучения были выбраны три мутанта с разными дефектами пероксисом, несущие единичную рецессивную Mut' мутацию
Свойства мутанта N47. Обнаружено, что мутант N47 не растет на метаноле только при 45°С, в условиях индукции пероксисом метанолом при 45°С в клетках детектируется 1-2 пероксисомы, а большая часть eGFP обнаруживается в вакуолях (Рис. 1)
Мутант N47 растет на глюкозе, этаноле и глицерине при 30-45°С, однако при повышенной температуре формируются более мелкие колонии по сравнению с колониями штамма дикого типа H polymorpha HF246 Подобный эффект наблюдался на средах со всеми протестированными источниками углерода, в том числе и на полной среде (YPD) (Рис. 2) Комплементация ростовых дефектов мутанта N47 геномной библиотекой и клонирование гена РЕХ А. Поскольку мутант N47 не рос на метаноле при 4<i"C, оказалось возможным использовать этот признак для клонирования гена, вызывающего дефекты развития пероксисом у мутанта и локализацию eGFP в вакуолях Для этого мутант трансформировали библиотекой генов на основе pYT3 (HARS ampr LEU2) 1 рансформанты рассевали на 20 чашек с YND После появления прототрофньгх трансформантов, их колонии посредством отпечатков переносили на чашки с метанолом Шесть хорошо растущих на метаноле колоний отобрали и использовали для выделения общей ДНК Для накопления плазмиды полученными образцами ДНК трансформировали штамм Е coli В результате были выделены плазмиды, несущие 4 типа вставок, при этом при повторной трансформации мутанта N47 одна из плазмид (pYT-47-б содержащая вставку размером около 7 5 т п н ) комплементировала проявления мутации (рост на метаноле) Рос г на метаноле восстанавливался также при культивировании трансформанта в жидкой среде с метанолом (ОПббо N47-pYT = 0 35, ОПдео N47-pYT-47-6 = 1 65), при этом формировались клетки нормального размера с пероксисомами без дефектов
Рис. 1. Пероксисомные дефекты у мутанта N47.
37"С
45"С
РЕХЛ
реха
РЕХЛ
реха
А
Б
Рис. 2. Рост мутанта N47 на плотных средах при 37 и 45°С
А - полная среда УРО, Б - минимальная среда с 0 5% метанола (УТч'М)
Определение нуклеотидной последовательности комплементирующего фрагмента и характеристика соответствующего белкового продукта. Субклонирование вставки ДНК плазмиды, изолированной из библиотеки генов (рУТ-47-6), привело к минимизации содержащего комплементирующий ген фрагмента ДНК до 2 6 т п н Была определена нуклеотидная последовательность вставки При этом оказалось, что данный фрагмент ДНК содержит одну открытую рамку считывания Открытая рачка считывания гена РРХ А кодирует белок (РехАр), состоящий из 519 аминокислот рассчитанный мотекулярный вес которого равен 59 кДа В результате поиска в компьютерных базах данных было обнаружено что белок РехАр наибопее близок белку У§г046\Ур ,9 сегеутае В литературе имеются нсмногочистенные данные о возможном участии У^046\Ур в транспорте белков митохондриального матрикса Инактивация гена У01104б]¥ X сегеушае при делегировании легальна для клеток (НагЬип е1 а1, 2003)
Определение внутриклеточной локализации белка РехАр Н. ро1утогрка. Для этого была сконструирована плазмида рУТ-47еСРР, кодирующая Л-концевую часть белка РехАр и) 200 аминокислот с удаленным терминальным тринуклеотидом Г-конец предполагаемого химерного бетка представлял собой еОРР мутантную форму флуоресцирующего белка ОКР Фрагмент ДНК, кодирующий РехАр, был получен методом ПЦР с использованием сконструированных нами праймеров Фрагмент был клонирован в плазмиду ^4-еО¥Р, несущую ген еСРР Плазмида была переведена в линейную форму гидролизом ферментом Вч1В1 (ЯЛг!) (сайт для которого единственный на плазмиде и расположен внутри Ы-концевой части белка РехАр), и, посредством электротрансформации интегрирована в геном Н роЫтогрка ЫСУС495 1еи1-1
Правильность интеграции "чазчиды была подтверждена ПЦР анализом с использованием праймеров и Саузерн-гибридизацией Флуоресценцию наблюдали в к тетках трансфорчантов, выращенных по обычной схеме Фтуореснирующий белок обнаруживался в
везикулах, отличных от пероксисом по форме, размеру и количеству в клетке (Рис. 3) и, возможно, являющихся митохондриями
Рис. 3. Флуоресценция химерного белка PexAp-eGFPp.
Дальнейшее исследование полученного штамма с использованием центрифугирования лизированных клеток в градиенте сахарозы и последующей детекцией eGFP при помощи специфических антител показало, что РехАр Н polymorpha действительно локализован в митохондриях По последним данным, Yrg046Wp 5 cerevisiae также локализован в митохондриях (Hazbun et al, 2003)
Конструирование нулевой аллели гена РЕХ А. Для создания нулевой аллели гена РЕХ А сконструировали плазмиду pHS-47del, в которой ген РЕХ А был замещен геном URA3 S cerevisiae Фрагментом плазмиды (3 т п н), полученным гидролизом pHS-47del ферментами Asp718I и Sphl, трансформировали штамм Я polymorpha NCYC 495 leul 1, игаЗ Однако среди leu ига* трансформантов не удалось найти ни одного с нарушением гена РЕХ А Мы предполагаем, нто этот ген является жизненно важным также для Я polymorpha и его делегирование летально для клеток
Активности ферментов первичного метаболизма метанола у мутанта N47. Поскольку у метилотрофных дрожжей метанол является одним из субстратов, индуцирующих рост и деление пероксисом, а мутант N47 не рос на среде, содержащей этот спирт (Рис. 4), определяли активность пероксисомных ферментов первичного метаболизма метанола после переноса выращенных на глюкозе клеток в среду с метанолом При длительном культивировании (24 час) при повышенной температуре (45"С) этот мутант не только не рос на метаноле, но и лизировался
Активности ферментов были изучены в динамике (Рис. 5) Для получения биомассы, мутант выращивали на среде с глюкозой, а затем, для индукции пероксисомных ферментов переносили на среду, содержащую 0 5% метанола
26 2
= 1S
I ,
üí О
1Q 15 2D вреия, час
WT N47
Рис. 4. Рост штамма дикого типа
(Н. ро1утвгрка НР246) и мутанта N47 на
среде с 0.5% метанола при 45°С.
Полученные резучьтаты указывали на то, что в первые часы после внесения метанола уровни трех пероксисомных ферментов (АОХ CAT и DHAS) были выше таковых у штамма дикого типа но быстро снижались до нуля после 10 час культивирования клеток с метанолом при 45°С Мы предполагаем, что вакуолярная локализация eGFP на самом деле вторична и обусловлена быстрой деградацией пероксисом а не нарушением транспорта пероксисомных белков
a as 0 3 О 35 02 015 1 1
С OS л
u 0 1 s 5 1С I 24
■ WT 0 0 01 0 02 D 2B 03ia | 03
•f N47 a 72 0 15 0 01 С I 0
время медмдим, чк
время иодм*1и, час
Bi
0 I 1 5 3 6 10 24
■ WT □ 2 S7 10 45 22 32 3D 20
%N47 1 09 \ 12 Б9 23 1S39 0 0
Рис. 5. Индукция метанолом (0.5%) пероксисомных ферментов у штамма дикого типа и мутанта N47 при 45°С.
А - алкогольоксидаза, Б - каталаза, В - диоксиацетонсинтаза
Механизм участия РехАр в поддержании гомеостаза пероксисом пока неизвестени, несомненно, заслуживает дальнейшего изучения в плане поиска сигнала (сигнального белка) начала деградации пероксисомы У И ро1утогрЬа показано участие мембранных пероксисомных белков РехЗр и РехИр в инициации пексофагии РехАр может также участвовать в зависящей от температуры регуляции функционирования гипотетического репрессорного белка, природа которого неизвестна
Так как бетковый продукт клонированного гена РЕХ А предположительно локализуется в митохондриях, определяли активность первого фермента цепи переноса электронов, токализованного в мембранах митохондрий - NADH дегидрогеназы Однако существенные различия активности этого фермента у штамма дикого типа и мутанта N47 не были выявлены
Свойства мутанта N102. Этот мутант был выделен как не растущий на метаноле только при 45°С (Рис. 7А, 8) Анализ фенотипических харак1ерис!ик мутанта на других спиртах не выявил допопнительных ростовых проявлений мутации — мутант 4102 рос на этаноте и глицерине со скоростью, близкой таковой исходного штамма Я ро1утогр1ш 11Е246
Акатаз мутанта N102 с использованием люминесцентного микроскопа выявил гиперпролиферацию пероксисом и наличие евРР в мелких пероксисомах (Рис. 6)
Рис. 6. Гиперпролиферация пероксисом у мутанта N102.
3 ГС 45°С
/>£ЛГ£ рех в РЕХВ рехв
Рис. 7. Рост мутанта N102 на плотной среде с 0.5% метанола в качестве источника углерода (Л) и среде с 0.5% глюкозы и 0.25% метиламина в качестве источника азота (Б) при 37 и 45°С.
Способность Н ро1утогрка использовать метиламин в качестве источника азота при росте на средах, содержащих глюкозу, также связана с пероксисомами Поэтому мы исследовали способность штамма N102 расти на среде с глюкозой (0 5%) и добавлением 0 25% метиламина в качестве единственного источника азота Выяснилось, что этот мутант слабо рос на метиламине при 45°С как на плотных, так и на жидких средах (Рис. 7, 8) Анализ 40 случайно выбранных сегрегантов, полученных от гибрида - продукта скрещивания мутанта N102 и штамма дикого типа, выявил сцепление двух описанных признаков, а именно слабый рост на метаноле и метиламине при 45°С
Рис. 8. Рост штамма дикого типа (Н. ро1утогрИа НР246) и мутанта N102 на среде с 0.5% метанола (А) и среде с 0.5% глюкозы и 0.25% метиламина в качестве источника азота (Б) при 45°С.
Активности пероксисомных ферментов метаболизма метанола и метиламина у мутанта N102. Были определены активности пероксисомных ферментов метаболизма метанола (АОХ, CAT и DHAS), а также метиламина (аминоксидаза и CAT) (Рис. 9) Оказалось, что удельная активность обеих оксидаз не только не понижалась, по сравнению с их активностью у исходного штамма, но даже повышалась, тогда как уровень каталазы уменьшался
60 30 - -
Рис. 9. Активности пероксисомных ферментов у мутанта N102 и И. ро1утогрИа НР246 (АУТ). А Пероксисомные ферменты метаболизма метанола (алкогольоксидаза, каталаза и диоксиацетонсинтаза) в условиях индукции этим спиртом при 45°С в течение 6 часов Б. Активности пероксисомных ферментов метаболизма метиламина при переносе клеток на среду, содержащую 0 25% метиламина и 0 5% глюкозы и их инкубировании при 45"С в течение 10 часов
Клонирование гена, комплементирующего ростовой дефект у мутанта N102. Поскольку мутант N102 был выделен как не растущий на метаноле при 45"С, комплементация этого фенотипического признака была выбрана как селективный фактор для клонирования соответствующего гена Трансформация мутанта бибчиотекой генов Я ро1утогрка с последующей селекцией трансформантов на метаноле при 45°С позволила изолировать 30 клонов, хорошо растущих на метаноле В результате были выделены плазмиды 7 разных типов, в том числе и исходный вектор не содержащий вставки, что свидетельствовало о высокой частоте реверсий у этого мутанта При повторной трансформации мутанта выделенными плазмидами оказалось что только три из них частично комплементируют отсутствие роста на среде с метанолом причем с разной эффективностью Плазмиду рУТ-102-2 (ОДббо >П02-рУТ 102-2-1 1) выбрати для дальнейшей работы Ее размер (3 45 т п н) минимизировать не удалось При анализе нуклеотидной последовательности оказалось, что этот участок ДНК принадлежит двум открытым рамкам считывания, кодирующим белки, имеющие сходство с двумя белками 5 сегеуиюе УАЬ002\Ур (Урявр, 134 кДа, вакуолярный сортирующий белок) и гипотетическим белком УР1?090\¥р с неизвестными функциями Однако нуклеотидные лос 1едоватетьности, кодирующие эти белки, оказались неполными ПОЗЗ С-концевых аа из 1223 аа для Урь8р и 166 аа для УРЯ090\Ур), что, возможно объясняет неполную комплементацию ростового дефекта
АйХ ИЕя/мт CAT Вд/мг Г.ВЬЯ ,ИвД/мГ
Синхронное изменение активностей обеих проверенных пероксисомных оксидаз может свидетельствовать об участии клонированного нами гена (гомологичного УРЯ8 гену 5 сегепхше) в регуляции количества пероксисом независимо от субстрата, вызывающего их индукцию Как предполагалось ранее, нарушение транспорта матриксных белков может приводить к увеличению числа компетентных к такому транспорту мелких пероксисом Увеличение числа пероксисом дает клетке возможность повысить эффективность транспорта пероксисомных белков и, как следствие, частично компенсировать нарушение их функций (Еуеге й а!, 1994) Однако участие фосфотрансферазы Урэ8р (у 5 сегеущгае этот белок вовлечен в транспорт и сортировку вакуолярной гидролазы СРУ) в транспорте белков мембраны и пероксисомного матрикса ранее не показано, э мутанты с таким фено I ипом при 45°С получены впервые
Свойства мутанта N163. Мутант N163 не растет на среде с метанолом при 45°С (Рис. 10) и, как показал анализ, проведенный при помощи флуоресцентной микроскопии, не имеет структур, напоминающих пероксисомы, при этом еОРР локализован в цитозоле (Рис. 11)
—лгг ' - N133
Рис. 10 Рост И. ро1утогрка НР246 (\\'Т) и мутанта N163 на среде с 0.5% метанолом при 45°С.
Рис. 11. Дефекты пероксисом у мутанта N163. Флуоресцирующий белок локализован в цитозоле.
Анализ активностей пероксисомных ферментов метаболизма метанола (АОХ, КАТ и ОНАБ) при переносе мутантных клеток в среду, содержащую метанол, после культивирования при 45°С в течение 6 час показал, что уровень всех трех ферментов на порядок ниже, чем у штамма дикого типа (Рис. 12)
Рис. 12. Активности пероксисомных ферментов метаболизма метанола у мутанга N163 в условиях индукции 0.5% метанолом при 45"С в течение 6 часов.
Клонирование гена, комплемеитируюшего ростовой дефект у мутанта N163.
Поскольку мутант N163 был выделен как не растущий на метаноле при 4^0, для клонирования мугантного гена использовали тот же подход, что и при клонировании других генов, кодирующих пероксисомные белки у 11 polymorpha В результате трансформации мутанта библиотекой генов Н polymorpha и селекции траисформантов на среде YNB с метанолом при 45°С нами отобраны 8 клонов хорошо растущих на метаноле и не являющихся ревертантами Плазмиды, выделенные из 8 трансформантов имели вставки 4 типов, однако только одна из них (pYT-163-1) была способна комплементировать исходный дефект у мутанта Данная плазмида содержала вставку ДНК размером 6400 пн В результате проведенного субклонирования были получены две плазмиды - pYT3-163A и pHS 163В Последняя содержала фрагмент исходной плазмиды pYT-163 1 размером 3109 пн и комплементировала ростовой дефект у мутанта N163 (ОП66и N163 pHS 163В—1 67, ОН«« N163-pYT3=0 38) Компьютерный анализ последовательности ДНК вставки pHS-163B показат наличие только одной полной открытой рамки считывания, кодирующей белок РехСр размером 36 кДа, который имеет высокую степень юмотогии с белком Sit4p S cerevisiae Ген Ser/Thr фосфатазы SIT4 хорошо известен у разных видов эукариот и принимает участие в контроле разнообразных процессов - от формирования клеточной стенки и рибосом у S cerevisiae до образования гифов и контроля вирулентности у Candida alh'cars (Lee et al, 2004) У S ссемь'ае кро«е мпду шрования TOR (Target Of Raparmcm) сигнального пути, SIT4 также участвует в регуляции перехода клетки из поздней Gl-фазы в S-фазу посредством транскрипционного контроля Gl-циклиновых генов (Luke et а1, 1996) У S cerevisiae также продемонстрирована роль SIT4 в подавлении протеинкиназного регуляторного каскада (Kamada et al, 1995), что влияет на связанные с его функционированием биологические функции - организацию цитоскелета и экспрессию рибосомных генов (De La Torre-Ruiz et al, 2002) У эукариот обратимое фосфорилирование белков является ключевым регулятором многих клеточных процессов Особою внимания заслуживает тот факт, что у Н polymorpha и Р pastern фосфорилирование некоторых белков необходимо для их правильного функционирования Возможно, именно фосфоритированле / дефосфорилирование позволяет Рех14р служить своеобразным регутятором переключающим программу развития пероксисом на их деградацию (Komon & Kiel 1999)
Таким образом, исследование полученных в данной работе мутантов и клонирование трех новых генов, участвующих в биогенезе и юмеостазе пероксисом, может пролить свет на структурно-функциональные особенности этих органелл у метилотрофных дрожжей.
ВЫВОДЫ
1 Создана представительная коллекция из 227 не растущих на среде с метанолом мутантов метилотрофных дрожжей НагиетЛа ро1утогрИа Впервые получены 94 темнературочувствительных («) мутанта, не растущих па метаноле только при 45°С Определены количество и характер проявления мутаций.
2 Тест на аллелизм с использованием 12 делеционных мутантов по известным у Н. ро1утогрИа РЕХ-геиш выявил отсутствие комплементации при повышенной температуре При этом только 25% исследованных мутантов несут мутации, аллельные известным РЕХ-генам, а спектр полученных пероксисомных мутантов отличался от описанных ранее Показана возможность использования отсутствия комплементации в качестве дополнительного фактора селекции мутантов по пероксинам и связанных с ними белкам
3. Анализ полученных мутантов методами флуоресцентной микроскопии выявил 43 мутанта с нарушенной структурой пероксисом, в юм числе 7 новых мутантов с гиперпролиферацией пероксисом.
4. У /5-мутанта N47 при повышенной температуре выявлена быстрая деградация пероксисом Проявления мутации кочплементировались геном РЕХА, кодирующим митохондриальный белок, юмологичньгй белку Ygr046Wp ЗассИаготусе1 сегеу1ь1ае
6 Энзимологический анализ ^-мутанта N102 с гиперпролиферацией пероксисом показал повышенный уровень алкогочьоксидазы и аминоксидазы, но пониженный уровень других пероксисомных ферментов - каталазы и диоксиацетонсинтазы Проявления мутации комплементировались геном РЕХВ, кодирующим белок, гомологичный вакуолярному сортирующему белку Урч8р ¿> сеге\тае
7. У мутанта N163, мутация, вызывающая отсутствие роста на метаноле при 45°С и снижение активностей грех пероксисомных ферментов (алкогольоксидазы, каталазы и диоксиацетонсинтазы) комплементирустся геном, кодирующим гомолог 8ег/ТЪг фосфатазы 6' сегешше
Список работ по теме диссерт аиии:
1. Ashin VV, Kourbatova ЕМ and Trotsenko У A Recent findings in alcohol oxidase of methylotrophic yeasts' A minor protein // Proceedings of the 21st International Specialized Symposium on Yeasts (ISSY2001), I viv, Ukraine, 2001
2. Курбатова EM, Auiun В В, Троценко Ю А Каталаза метилотрофных дрожжей Picha pastoris: выделение и некоторые свойства "Биотогия - наука 21го века" 5-я путинская конференция молодых ученых, Пущино, 2001
3 Курбатова Е М, Серкова И Н Генетические подходы к изучению взаимодействия пероксисомных белков у Hansenulapolymorpha HF246 "Актуальные проблемы современной генетики", конференция к 115-летию со дня рождения Н И Вавилова, Москва, 2003 4. Kurhatova Е, de Vnes В, Pajak В, Meyer М, Veenhuh М & van der Klei I J Isolation of peroxisome deficient mutants of Hansenula polymorpha HF246 "Peroxisomes Now" International meeting of the microbody research groups Ilaren, The Nederlands, 2003 5 Kurhatova E de Vnes В Pajak В Meyer M Veenhuis M & van der Klei I J Isolation of peroxisome deficient mutants of Uansenula polymorpha HF246 GBB meeting of Biocentrum research groups Groningen, The Nederlands, 2003
6. Курбатова EM Поиск новых генов, участвующих в биогенезе пероксисом метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha HF246 "Биология - наука 21го века" 8-я международная Пущинская школа-конференция мо юдых ученых Пущино, 2004
7. ЕМ Курбатова, ТА Дутова, НИ Серкова, ЯМ Рабинович, ЮА Троценко Выделение и первичная характеристика мутнтов по биогенезу пероксисом у метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha Генетика, Т 40, №5, 2004, стр 472-477.
8 ЕМ Курбатова, ТА Дутова, ЮА Троценко Структурно-функциональные и генетические аспекты биогенеза пероксисом Генетика. Т 41 №2,2005, в печати
РНБ Русский фонд
2006-4 2689
И--84Й
Принято к исполнению 28/12/2004 Заказ №533
Исполнено 29/12/2004 Тираж 100 экз
ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095) 318-40-68 www autoreferat ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Курбатова, Елена Михайловна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Метаболические пути метилотрофных дрожжей, связанные с образованием пероксисом.
1.1. Метаболизм метанола.
1.2. Метаболизм метиламина у Hansenula polymorpha.
Глава 2. Пероксисомы, их строение и функции.
2.1. История открытия и основные функции пероксисом.
2.2. Выделение пероксисомных мутантов и клонирование РЕХ- генов.
2.3. Транспорт пероксисомных белков.
2.4. PTS1 транспорт матриксных белков.
2.5. PTS2 транспорт белков матрикса.
2.6. Транспорт мембранных белков.
2.7. Формирование пероксисом.
2.8. Деление пероксисом.
2.9. Гомеостаз пероксисом у Н. polymorpha.
2.10. Деградация пероксисом у метилотрофных дрожжей.
2.11. Общие этапы биогенеза пероксисом и макропексофагии у Н. polymorpha.
2.12. Участие пероксисом в программах дифференцировки клеток.
2.13. Болезни человека, связанные с нарушением биогенеза пероксисом. 41 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
Глава 3. Материалы и методы.
3.1. Штаммы микроорганизмов, использованные в данной работе.
3.2. Состав сред.
3.3. Условия культивирования.
3.4. Молекулярно - генетические методы.
3.4.1. Методы генетики Н. polymorpha.
3.4.2. Общие методы.
3.5. Плазмиды, использованные в работе.
3.6. Клонирование генов.
3.7. Световая и флуоресцентная микроскопия.
3.8. Биохимические методы.
3.8.1. Индукция пероксисомных ферментов.
3.8.2. Получение бесклеточного экстракта.
3.8.3. Определение активности ферментов.
3.8.4. Определение концентрации белка.
3.9. Методы компьютерного анализа.
Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.
4.1. Получение и первичная характеристика мутантов.
4.2. Общая характеристика мутантов.
4.2.1. Определение фенотипа мутантов в условиях индукции биогенеза пероксисом на среде с метанолом.
4.2.2. Определение рецессивности/доминантности мутаций.
4.2.3. Идентификация мутантов при помощи делеционных рех-тестеров.
4.2.4. Изучение "множественных" мутантов.
4.2.5. Изучение "одиночных" мутантов.
4.3. Цитологическая характеристика полученных мутантов методами флуоресцентной микроскопии.
4.4. Определение количества групп комплементации среди мутантов с дефектами пероксисом.
4.5. Свойства мутанта N47.
4.5.1. Фенотипические характеристики мутанта N47.
4.5.2. Комплементация ростовых дефектов мутанта N47 геномной библиотекой и клонирование гена РЕХА.
4.5.3. Определение нуклеотидной последовательности комплементирующего фрагмента и характеристика соответствующего белкового продукта.
4.5.4. Определение внутриклеточной локализации белка РехАр Н. polymorpha.
4.5.5. Конструирование нулевой аллели гена РЕХ А.
4.5.6. Определение активности ферментов метаболизма метанола у мутанта N47,
4.6. Свойства мутанта N102.
4.6.1. Фенотипические характеристики мутанта N102.
4.6.2. Определение активностей пероксисомных ферментов метаболизма метанола и метиламина у мутанта N102.
4.6.3. Клонирование гена, комплементирующего ростовой дефект у мутанта N102.
4.7. Свойства мутанта N163.
4.7.1. Фенотипические характеристики мутанта N163 и активности ферментов первичного метаболизма метанола.
4.7.2. Клонирование гена, комплементирующего ростовой дефект у мутанта N163.
Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
5.1. Получение мутантов и их первичная характеристика.
5.2. Комплементационный тест на аллелизм и селекция мутантов методами флуоресцентной микроскопии.
5.3. Изучение ts мутантов и клонирование новых генов. 94 ВЫВОДЫ. 99 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ABTS - 2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzthioazoline-6-sulfonic acid)
АОХ (AOD) - алкогольоксидаза
CAT (СТА) - каталаза
DHAS - диоксиацетонсинтаза
DTT - 1,4-дитиотрейтол (1,4-ditio-DL-threitol)
FAD - флавинадениндинуклеотид
GFP - зеленый флуоресцирующий белок (Green Fluorescent Protein) HARS - автономно реплицирующаяся последовательность Н. polymorpha ME - экстракт солода (Malt Extract) mPTS - мембранная направляющая пероксисомная последовательность (membrane
Peroxisomal Targeting Signal)
NADH - никотинамиддинуклеотидфосфат
NS - нарождающаяся пероксисома (Nascent Peroxisome)
PMP - пероксисомный мембранный белок (Peroxisomal Membrane Protein)
PTS - направляющая пероксисомная последовательность (Peroxisomal Targeting
Signal)
SDS - додецил сульфат натрия TPR - тетратрикопептидные повторы
Vps - вакуолярный сортирующий белок (Vacuole Protein Sorting)
YE - дрожжевой экстракт (Yeast Extract)
ZS - синдром Целвегера (Zellweger Syndrome)
АТФ - аденозин-5'-трифосфат
ДХИФ - дихлорфенолиндофенол
ЖК — жирные кислоты
НБП - нарушения биогенеза пероксисом (Peroxisome Biogenesis Disorders) НГ - нитрозогуанидин (N-ethyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin) ОРС - открытая рамка считывания П - пероксисома
СЖК - среднецепочечные жирные кислоты т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид ЭДТА - этилендиаминтетраацетат ЭР - эндоплазматический ретикулум.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение и характеристика пероксисомдефицитных мутантов метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha"
Актуальность работы. Пероксисомы - внутриклеточные органеллы, окруженные однослойной белково-липидной мембраной, присущи практически всем эукариотам. Эти органеллы, как правило, содержат ферменты р-окисления жирных кислот, Ацил-КоА оксидазы и каталазу, выполняя жизненно важную функцию - разложение Н2О2 до воды и кислорода. У дрожжей функции пероксисом существенны, в частности, для первичного метаболизма метанола или н-алканов, что делает эти органеллы привлекательными в биотехнологическом аспекте. Нарушение биогенеза этих органелл у человека вызывает развитие ряда тяжелых наследственных заболеваний, поэтому пероксисомы стали объектом повышенного внимания. Несмотря на внешнюю простоту дрожжевых клеток, строение их органелл и закономерности развития близки таковым высших эукариот. Использование дрожжей в качестве модельного объекта для исследования биогенеза пероксисом позволяет лучше понять патофизиологию пероксисомных заболеваний человека и разработать методы их терапии.
Состояние вопроса. Биогенез пероксисом - активно исследуемый процесс. К настоящему времени, благодаря ряду работ, выполненных на мутантах дрожжей, дефектных по этому процессу (рех), выделено более 30 функционально различающихся белков - пероксинов, формирующих пероксисомную мембрану или участвующих в посттрансляционном транспорте белков матрикса этих органелл.
Одним из молекулярно-генетических подходов, разработанных для выделения и характеристики новых факторов, участвующих в биогенезе пероксисом, является создание представительных коллекций пероксисомных мутантов. Первые коллекции таких рех мутантов были получены с использованием химических мутагенов и проведением негативной селекции на метаноле при оптимальной температуре (37°С, Cregg et al., 1990; Titorenko et al., 1993). Альтернативный метод основан на использовании случайной интеграции в геном специфических линейных плазмид (RALF, RAndom integration of Linear DNA Fragments, van Dijk et al., 2001). Ортологи некоторых генов РЕХ Н. polymorpha, впервые найденные у других организмов, были выделены благодаря конструированию специфических праймеров и ПЦР. Однако, несмотря на выделение и характеристику 13 генов, кодирующих пероксины у данного вида дрожжей (van de Klei & Veenhuis, 2002), многие факторы биогенеза остаются неизвестными. Поэтому получение и характеристика мутантов, полученных с использованием новых методов проведения мутагенеза и методов селекции, отличных от использованных ранее, является важным элементом исследований биогенеза пероксисом, а также необходимым этапом для клонирования новых генов, участвующих в этом процессе.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было создание коллекции новых пероксисомных мутантов Н. polymorpha и поиск новых генов, участвующих в образовании и поддержании функциональной стабильности пероксисом. В связи с этим решались следующие основные задачи:
- Получение представительной коллекции мутантов, не растущих на метаноле при повышенной температуре, определение характера и количества мутаций, а также генетический анализ мутантов.
- Селекция мутантов с нарушенной морфологией пероксисом методами флуоресцентной микроскопии.
-Изучение свойств отдельных мутантов и клонирование новых генов, участвующих в образовании и поддержании функциональной стабильности пероксисом.
Научная новизна работы. С использованием химического мутагенеза по модифицированной методике и селекции мутантов при неоптимальной температуре у Н. polymorpha впервые получены температурочувствительные (ts) мутанты нового класса - не растущие на средах с метанолом только при 45°С. Комплементационный тест на аллелизм с применением делеционных мутантов по известным ЛЕХ-генам показал существенные различия спектра полученных мутантов по сравнению с известными пероксисомными мутантами. У 52 мутантов с одиночными мутациями показано отсутствие комплементации с одним или несколькими делеционными штаммами. Установлено, что только четверть мутаций локализована в известных РЕХ-генах, тогда как остальные мутанты также имели пероксисомные дефекты. Это свойство предлагается использовать в качестве дополнительного фактора селекции для поиска новых пероксисомных мутантов. Нами были впервые получены "множественные" мутанты, мутанты с гиперпролиферацией пероксисом, а также ts мутант по гену интегрального мембранного белка РехЮр, перспективный для изучения функций и закономерностей регуляции этого белка в биогенезе пероксисом. Клонированы и секвенированы три новых гена, возможно, участвующих в этом процессе.
Практическое значение работы. Полученные Muf мутанты используются для изучения регуляции первичного метаболизма метанола и клонирования новых РЕХ-генов, участвующих в биогенезе пероксисом метилотрофных дрожжей. Модифицированные нами метод анализа пероксисомных мутантов и комплементационный тест на аллелизм перспективны при изучении белков, формирующих большое количество комплексов, в частности, белков цитоскелета и клеточной стенки.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на международном симпозиуме "ISSY 2001" (Львов, Украина, 2001), 5й и 8й школах-конференциях молодых ученых " Биология- наука XXIго века" (Пущино, 2001, 2004), конференции к 115-летию со дня рождения Н. И. Вавилова "Актуальные проблемы современной генетики" (Москва, 2003), международной конференции, посвященной исследованиям микротелец "Peroxisomes Now" (Харен, Голландия, 2003), конференции молодых ученых "GBB meeting of Biocentrum research groups" (Гронинген, Голландия, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ. Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Текст диссертации занимает 120 страниц, содержит 29 рисунков, 19 таблиц, и 241 литературных источника.
Заключение Диссертация по теме "Генетика", Курбатова, Елена Михайловна
выводы
1. Создана представительная коллекция из 227 не растущих на среде с метанолом мутантов метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha. Впервые получены 94 температурочувствительных (As) мутанта, не растущих на метаноле только при 45°С. Определены количество и характер проявления мутаций.
2. Тест на аллелизм с использованием 12 делеционных мутантов по известным у Н. polymorpha Р£Х-генам выявил отсутствие комплементации при повышенной температуре. При этом только 25% исследованных мутантов несут мутации, аллельные известным ЛЕА^генам, а спектр полученных пероксисомных мутантов отличался от описанных ранее. Показана возможность использования отсутствия комплементации в качестве дополнительного фактора селекции мутантов по пероксинам и связанных с ними белкам.
3. Анализ полученных мутантов методами флуоресцентной микроскопии выявил 43 мутанта с нарушенной структурой пероксисом, в том числе 7 новых мутантов с гиперпролиферацией пероксисом.
4. У fa-мутанта N47 при повышенной температуре выявлена быстрая деградация пероксисом. Проявления мутации комплементировались геном РЕХА, кодирующим митохондриальный белок, гомологичный белку Ygr046Wp Saccharomyces cerevisiae.
5. Энзимологический анализ fa-мутанта N102 с гиперпролиферацией пероксисом показал повышенный уровень алкогольоксидазы и аминоксидазы, но пониженный уровень других пероксисомных ферментов - каталазы и диоксиацетонсинтазы. Проявления мутации комплементировались геном РЕХВ, кодирующим белок, гомологичный вакуолярному сортирующему белку Vps8p S. cerevisiae.
6. У мутанта N163 мутация, вызывающая отсутствие роста на метаноле при 45°С и снижение активностей трех пероксисомных ферментов (алкогольоксидазы, каталазы и диоксиацетонсинтазы), комплементируется геном, кодирующим гомолог Ser/Thr фосфатазы S. cerevisiae.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Курбатова, Елена Михайловна, Пущино
1. Быстрых Л.В., Быковская С.Д., Троценко Ю.А. (1986) Регенерация ксилулозо-5-фосфата в диоксиацетоновом цикле ассимиляции метанола у дрожжей. Биохимия. 51 (2): 302-305.
2. Пуста К.А., Троценко Ю.А. (1996) Структурно-функциональная организация и биогенез пероксисом метилотрофных дрожжей. Биохимия. 62 (2): 236-252.
3. Подгорский B.C. (1982) Физиология и метаболизм метанолусваивающих дрожжей. Киев, Наукова думка, с. 1-85.
4. Сысоев О.В., Грузман М.Б., Иванов Е.В., Троценко Ю.А. (1991). Каталаза метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha: очистка и свойства. Биохимия. 56 (10): 1858-1863.
5. Толсторуков И.И., Дутова Т.А., Беневоленский С.В., Соом Я.О. (1977). Гибридизация и генетический анализ метанолокисляющих дрожжей Pichia pinus МН4. Генетика. 13 (2): 322-329.
6. Троценко Ю.А. (1983) Метилотрофные эукариоты. Успехи микробиологии, 18: 18-38.
7. Abe I. & Fujiki Y. (1998). cDNA cloning and characterization of a constitutively expressed isoform of the human peroxin Pexllp. Biochem.Biophys. Res. Commun. 252: 529-533.
8. Abeliovich H. & Klionsky D.J. (2001) Autophagy in yeast: mechanistic insights and physiological function. Microbiol. Mol. Biol. Rev. (65): 463-479.
9. Adoutte A., Balavoilne G., Lartillot N., Lespinet O. et al. (2000). The new animal phylogeny: reliability and implications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 4453-4456.
10. Albertini M., Rehling P., Erdmann R., et al. (1997). Pexl4p, a peroxisomal membrane protein binding both receptors of the two PTS-dependent import pathways. Cell. 89: 83-92.
11. Allais J., Louktibi A., Barratti J. (1983). Oxidation of methanol by the yeast Pichia pastoris, purification and properties of the formate dehydrogenase. Agric. Biol. Chem. 47:1509-1516.
12. Aminova L.R., Kyslikova E., Volfova O. & Trotsenko Y.A. (1991) Characterization of catalase-negative mutants of methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. Folia Microbiol. 36,158-163.
13. Arndt K.T., Styles C.A. & Fink G.R. (1989). A suppressor of a HIS4 transcriptional defect encodes a protein with homology to the catalytic subunit of protein phosphatases. Cell. 56: 527-537.
14. Bellu A.R., Salomons F.A., Kiel J.A.K.W., Veenhuis M. & van der Klei I.J. (2002) Removal of РехЗр is an important stage in selective peroxisome degradation in Hansenula polymorpha. J. Biol. Chem. 277:42875-42880.
15. Bellu AR., Komori M., van der Klei,I.J., et al. (2001). Peroxisome biogenesis and selective degradation converge at Pexl4p. J. Biol. Chem. 276: 44570-44574.
16. Berteaux-Lecellier V. et al. (1995). A mammalian homolog of the PAF1 gene (Zellweger syndrome) discovered as a gene involved in caryogamy in the fungus Podospora anserina. Cell. 81: 1043-1051.
17. Birdsey M., Lewin J., Cunningham A. et al. (2004). Differential enzyme targeting as an evolutionary adaptation to herbivory in Carnivora. MBE. 21 (4):632-646
18. Breitling R., Sharif O., Hartman M.L., Krisans S. (2002). Loss of compartmentalisation cases misregulation of lysine biosynthesis in peroxisome-deficient yeast cells. Eucaryotic Cells. 1(6): 978-986.
19. Brocard С., Kragler F., Simon M.M., et al. (1994). The tetratricopeptide repeat-domain of the PAS 10 protein of Saccharomyces cerevisiae is essential for binding the peroxisomal targeting signal-SKL. Biochem. Biophys. Res. Commun. 204: 1016-1022.
20. Bystrykh L.V. Sokolov A., Trotsenko Y. (1981) Purification and properties of dihydroxyacetone synthase from the methylotrophic yeast Candida boidinii. FEBS Lett 132:324-328.
21. Bystrykh L.V., de Koning W. and Harder, W. (1990) Dihydroxyacetone synthase from Candida boidinii KD1. In: Methods in Enzymology. 188: 435-445.
22. Chandoga J, Petrovic R. (2001). Peroxisomal hereditary metabolic disorders. Cas Lek Cesk. 140 (21): 651-657.
23. Chang C.C., Warren D.S., Sacksteder K.A. and Gould S.J. (1999). PEX12 interacts with PEX5 and PEX10 and acts downstream of receptor docking in peroxisomal matrix protein import. J. Cell Biol. 147: 761-774.
24. Chudzik D.M., Michels P.A, de Walque S., and Hoi W.G. (2000). Structures of type 2 peroxisomal targeting signals in two trypanosomatid aldolases. J. Mol. Biol. 300: 697-707.
25. Couderc R., Baratti J. (1980) Oxidation of methanol by the yeast Pichia pastoris. Purification and properties of alcogol oxidase. Agric. Biol. Chem. 44:2279-2289.
26. Cregg G. M., van der Klei I.J., Suiter G.J. et al. (1990). Peroxisome-deficient mutants of Hansenula Polymorpha. Yeast 6: 87-97.
27. Cregg J.M. (1993) Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris. Bio/Technology. 11: 905-910.
28. Cregg J.M., Madden K.R., Barringer K.J., Thill G.P., Stillman C.A. (1989) Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia pastoris. Mol Cell Biol 9: 1316-1323
29. Crespo J. & Hall M. (2002). Elucidating TOR signaling and rapamycin action: lessons from Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66(4): 579 591.
30. Depreter M., Espeel M., & Roels F. (2003). Human peroxisomal disorders H Micr. Res. Technol. 61:203-223.
31. Didion Т., Roggenkamp R. (1992). Targeting signal of the peroxisomal catalase in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. FEBS Lett 303: 113-116.
32. Distel В., Erdmann R., Gould S.J. et al. (1996). Unified nomenclature for peroxisome biogenesis factors. J. Cell Biol. 135: 1-3.
33. Dodt G., Braverman N., Wong A. et al. (1995). Mutations in the PTS1 receptor gene, PXR1, define complementation group 2 of the peroxisome biogenesis disorders. Nat. Genet. 9: 115-125.
34. Dodt G., Gould S.J. (1996). Multiple PEXgenes are required for proper subcellular distribution and stability of Pex5p, the PTS1 receptor: evidence that PTS1 protein import is mediated by a cycling receptor. J. Cell Biol. 135:1763-1774.
35. Doseff A. I. & Arndt K.T. (1995). LAS1 is an essential nuclear protein involved in cell morphogenesis and cell surgace growth. Genetics. 141: 857-871.
36. Douma A.C., Veenhuis M., de Koning W., Evers M.E., Harder W. (1985). Dihydroxyacetone synthase is localized in the peroxisomal matrix of methanol-grown Hansenula polymorpha. Arch. Microbiol. 143: 237-243.
37. Dyer J.M., McNew J.A. and Goodman J.M. (1996). The sorting sequence of the peroxisomal integral membrane protein PMP47 is contained within a short hydrophilic loop. J. Cell Biol. 133: 269-280.
38. Eckert J. H. & Erdmann R. (2003). Peroxisome biogenesis. Rev Physiol Biochem Pharmacol. 147:75-121
39. Eckert J. & Jonsson (2003) A Split-ubiquitin based analysis of peroxin interaction. In: Peroxisomes now. Peroxisomal Meeting. Haren, May, 1-2. L8.
40. Eitzen G., Szilard R., Rachubinski R. (1997). Enlarged peroxisomes are present in oleic acid-grown Yarrowia lipolytica overexpressing the PEX16 gene encoding an intraperoxisomal peripheral membrane peroxin. J. Cell Biol. 137:1265-1278.
41. Elgersma Y., Elgersma-Hooisma M., Wenzel T.J. et al. (1998). A mobile PTS2 receptor for peroxisomal protein import in Pichiapastoris. J. Cell Biol. 140: 807-820.
42. Elgersma Y., Kwast L., Klein A., et al (1996). The SH3 domain of the Saccharomyces cerevisiae peroxisomal membrane protein Pexl3p functions as a docking site for Pex5p, a mobile receptor for the import PTS1-containing proteins. J. Cell Biol. 135:97-109.
43. Elgersma Y., Tabak H. (1996). Proteins involved in peroxisome biogenesis and functioning. Bioch. Bioph. Acta. 1286:269-283.
44. Erdmann R. & Blobel G. (1995). Giant peroxisomes in oleic acid induced Saccharomyces cerevisiae lacking the peroxisomal membrane protein Pmp27p. J. Cell Biol. 128: 509-523.
45. Erdmann R., Veenhuis M. and Kunau W.-H. (1997). Peroxisomes: organelles at the crossroads. Trends Cell Biol. 7: 400-407.
46. Erdmann R., Wiebel F., Flessau A. et al. (1991). PAS1, a yeast gene required for peroxisome biogenesis, encodes a member of a novel family of putative ATPases. Cell. 64: 499-510.
47. Evers M.E., TitorenkoV.I., van der Klei I.J., Harder W. & Veenhuis M. (1994) Assembly of alcohol oxidase in peroxisomes of the yeast Hansetxula polymorpha requires the cofactor flavin adenine dinucleotide. Mol. Biol. Cell. 5: 829-837.
48. Faber K.N., Haan G.J., Baerends R.J., et al. (2002). Normal. peroxisome development from vesicles induced by truncated Hansenula polymorpha РехЗр. J Biol Chem. 277:11026-11033.
49. Faber K.N., Haima, P., Harder, W., Veenhuis, M. (1994). Highly efficient electrotransformation of the yeast Hansenula polymorpha. Current Genetics. 25: 305-310
50. Faber K.N., Keizer-Gunnink I., Pluim D., Harder W., Veenhuis M. (1995) The N-terminus of amine oxidase of Hansenula polymorpha contains a peroxisomal targetingsignal. FEBS Lett 357: 115-120.
51. Footitt S., Slocombe S., Lamer V., et al. (2002). Control of germination and lipid mobilization by COMATOSE, the Arabidopsis homologue of human ALDP. EMBO J. 21:2912-2922.
52. Fransen M., Chantal B.,Grys K., et al. (2002) Analysis of mammalian peroxin interaction using a non-transcription-based bacterial two-hybrid assay. Mol.Cell. Proteomics. 1:243-252.
53. Fransen M., Brees C., Baumgart E., et al. (1995). Identification and characterization of the putative human peroxisomal C-terminal targeting signal import receptor. J. Biol. Chem. 270: 7731-7736.
54. Fransen M., Terlecky S.R. and Subramani S. (1998). Identification of a human PTS1 receptor docking protein directly required for peroxisomal protein import. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 8087-8092.
55. Gellissen G (2000) Heterologous protein production in methylotrophic yeasts. Appl Microbiol Biotechnol 54: 741-750
56. Gleeson M.A.G. & Sudbery P.E. (1988) Genetic analysis in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. Yeast. 4: 293-303.
57. Goodman J.M., Scott C.W., Donahue P.N., Atherton J.P. (1984) Alcohol oxidase assembles post-translationally into the peroxisome of Candida boidinii. J Biol Chem 259: 8485-8493
58. Gould S. & Valle D. Peroxisome biogenesis disorders: genetics and cell biology. Trends Genet. 16: 340-345.
59. Gould S. J., Keller G., Hosken N., et al. (1989). A conserved tripeptide sorts proteins to peroxisomes. J. Cell Biol. 108: 1657-664.
60. Gould S., Kalish J., Morrell J., et al. (1996). Pexl3p is an SH3 protein of the peroxisome membrane and a docking factor for the predominantly cytoplasmic PTS1 receptor. J. Cell Biol. 135: 85-95.
61. Gould S., Valle D., & Raymond J. (2001). The peroxisome biogenesis disorders In: The metabolic and molecular bases of inherited disease. (C.R. Scriver, A.L. Beaudet, W.S. Sly, and D. Valle, editors). McGraw-Hill, New York. 3181-3217.
62. Gould S.J., Keller G.A., Schneider M., Howell S.H., Garrard L.J., Goodman J.M., Distel В., Tabak H., Subramani S. (1990) Peroxisomal protein import is conserved between yeast, plants, insects and mammals. EMBO J. 9: 85-90.
63. Gray J., Petsko G., Johnston G., Ringe D., Singer R. & Werner-Washburne M. (2004)."Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68(2): 187 206.
64. Hanahan, D. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmid DNA. J. Mol. Biol. 166: 557-580.
65. Hansen H., Didion Т., Thiemann A., Veenhuis M., Roggenkamp R. (1992) Targeting sequences of the two major peroxisomal proteins in methylotrophic yeast Hansenulapolymorpha. Mol.Gen Genet 235: 269-278.
66. Harder W., Trotsenko Y., Bystrykh L & Egli T. (1987) Metabolic regulation in methylotrophic yeasts. In: Microbial Growth on CI Compounds (ed by H.W. Verseveld & J.A. Duine.). MartinusNijhoff Publishers: 137-149.
67. Harris T. & Lawrence J. (2003).TOR Signaling. Science's STKE, 212: rel5 -15.
68. Hazbun T.R., et al. (2003) Assigning function to yeast proteins by integration of technologies. Mol. Cell 12(6):1353-1365.
69. Hazra P.P., Suriapranata I., Snyder W.B. and Subramani S. (2002) Peroxisome remnants in pex3delta cells and the requirement of РехЗр for interactions between the peroxisomal docking and translocation subcomplexes. Traffic 3: 560-574.
70. Heinemann P. & Just W. (1992). Peroxisomal protein import. FEBS Lett. 300: 179-182.
71. Hettema E. & Tabak H. (2000). Transport of fatty acids and metabolites across the peroxisomal membrane. Bioch.Biophys. Acta. 1486: 18-27.
72. Hoepfner D., van den Berg M., Philippsen P. et al. (2001). A role for Vpslp, actin, and the Myo2p motor in peroxisome abundance and inheritance in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 155: 979-990.
73. Horiguchi H., Yurimoto H., Kato N. & Sakai Y. (2001). Antioxidant system within yeast peroxisome. Biochemical and physiological characterization of CbPmp20 in the methylotrophic yeast Candida boidinii. J. Biol. Chem. 276: 14279-14288.
74. Huber C., Saffrich R., Anton M., et al. (1997). A heterotrimeric G protein-pho-pholipase A2 signaling cascade is involved in the regulation of peroxisomal motility in CHO cells. J. Cell Sci. 110: 2955-2968.
75. Huhse В., Rehling P., Albertini M., et al. (1998). Pexl7p of Saccharomyces cerevisiae is a novel peroxin and component of the peroxisomal protein translocation machinery. J. Cell Biol. 140: 49-60.
76. Jedd G. & Chua N-H. (2000). A new self-assembled peroxisomal vesicle required for efficient resealing of the plasma membrane. Nat. Cell Biol. 2: 226-231.
77. Just W. and Diestelkotter P. (1996). Protein insertion into the peroxisomal membrane. Ann. N.Y. Acad. Sci.804: 60-75.
78. Kammerer S., Holzinger A., Welsch U. & Roscher A. (1998). Cloning and characterization of the gene encoding the human peroxisomal assembly protein РехЗр. FEBS Lett. 429: 53-60.
79. Kato N., Omori Y., Tani Y., Ogata K. (1976) Alcohol oxidase of Kloeckera sp. and Hansenula polymorpha. Catalytic properties and subunit structures. Eur J Biochem 64: 341-350
80. Kato N., Sakazawa C., Nishizawa Т., Tani Y., Yamada H. (1980) Purification and characterization of S-formylglutathione hydrolase from a methylotrophic yeast, Kloeckera sp. No.2201. Biochim Biophys Acta 611: 323-332.
81. Kato N., Yoshikawa H., Tanaka K., Shimano M., Sakazawa C. (1988) Dihydroxyacetone kinase from a methylotrophic yeast, Hansenula polymorpha CBS 4732: purification, characterization and physiological role. Arch. Microbiol. 150: 155-159.
82. Kiel J.A.K.W., Hilbrands R.E., van der Klei I.J., et al. (1999). Hansenula polymorpha Pexlp and Рехбр are peroxisome-associated AAA proteins that functionally and physically interact. Yeast 15: 1059-1078.
83. Kim, J. and Klionsky, D.J. (2000) Autophagy, cytoplasm-to-vacuole targeting pathway, and pexophagy in yeast and mammalian cells. Annu. Rev. Biochem. 69: 303-342.
84. Kimura A., Takano Y., Furusawa I. and T. Okuno. (2001). Peroxisomal metabolic function is required for appressorium-mediated plant infection by Colletotrichum lagenarium. Plant Cell. 13: 1945-1957.
85. Klionsky D. (2003). Autophagy. Landes Bioscience, Georgetown, USA.
86. Klionsky D., Cregg J., Dunn W., Scott D. et al. (2003). A Unified Nomenclature for autophagy-related genes has added confusion to the Yeast Autophagy-Related Genes. Developmental Cell. 5: 539-545.
87. Koch A., Thiemann M., Grabenbauer M., et al. (2003). The dynamin-like protein DLP1 is involved in peroxisomal fission. J. Biol. Chem. 278(10): 8597-8605.
88. Roller A, Snyder W., Faber K.N., et al. (1999). Pex22p of Pichia pastoris, essential for peroxisomal matrix protein import, anchors the ubiquitin-conjugating enzyme, Pex4p, on the peroxisomal membrane. J. Cell Biol. 146: 99-112.
89. Komori M., Kiel J.A.K.W., Veenhuis M. (1999). The peroxisomal membrane protein Pexl4p of Hansenula polymorpha is phosphorylated in vivo. FEBS Lett. 457: 397399.
90. Komori M., Rasmussen S.W., Kiel J.A.K.W., et al. (1997). The Hansenula polymorpha PEX14 gene encodes a novel peroxisomal membrane protein essential for peroxisome biogenesis. EMBO J. 16: 44-53.
91. Maniatis, Т., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982). Molecular cloning; A laboratorymanual.
92. Marshall P. A., Dyer J. M., Quick M. E. and Goodman J. M. (1996). Redox-sensitive homodimerization of Pexllp: a proposed mechanism to regulate peroxisomal division. J. Cell Biol. 135: 123-137.
93. Marshall P., Krimkevich Y., Lark R., et al. (1995). Pmp27 promotes peroxisomal proliferation. J Cell Biol. 129: 345-355.
94. Marzioch M., Erdmann R., Veenhuis M., and Kunau W.H. (1994). PAS7 encodes a novel yeast member of the WD-40 protein family essential for import of 3-oxoacyl-CoA thiolase, a PTS2-containing protein, into peroxisomes. EMBO J. 13: 4908-4918.
95. Masuda C.A., Ramirez J., Pena A. & Montero-Lomeli M. (2000). Regulation of monovalent ion homeostasis and pH by the Ser-Thr protein phosphatase SIT4 in Saccharomyces cerevisiae. J.Biol. Chem. 275: 30957-30961. 56: 527-537.
96. Matsumoto N., Tamura S., Fujuki Y. (2003). The pathogenic peroxin Pex26p recruits the Pexlp-Pex6p AAA ATPase complexes to peroxisomes. Nature Cell Biol. 5: 454-460.
97. McGuinness M. C., Lu J.-F., Zhang H.-P., Dong G.-X., Heinzer A. K., Watkins P. A., Powers J., & Smith K. D. (2003) Role of ALDP (ABCD1) and mitochondria in X-Linked Adrenoleukodystrophy. Mol. Cell. Biol. 23(2): 744-753.
98. McNew J. A. and Goodman J. M. (1996). The targeting and assembly of peroxisomal proteins: some old rules do not apply. Trends Biochem. Sci. 21: 54-58.
99. Miller, S.A., Dykes, D.D. and Polesky, H.F. (1990) A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucl. Acid Res. 16 (3): 1215.
100. Moyersoen J., Choe J., Fan E., Hoi W.G.J., Michels P. (2004) Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target. FEMS Microb. Rev. 28(5): 603-643.
101. Motley A.M., Hettema E.H., Ketting R., et al. (2000). Caenorhabditis elegans has a single pathway to target matrix proteins to peroxisomes. EMBO Rep. 1: 40-46.
102. Mozaffar S., Ueda M., Kitatsuji K., Shimizu M., Tanaka A. (1986). Properties of catalase purified from a methanol-grown yeast, Kloeckera sp. 2201. Eur. J. Biochem. 155:527-531.
103. Mukaiyama H., Oku M., Baba M., Samizo Т., Hammond A.T., Glick B.S., Kato N. and Sakai Y. (2002) Paz2 and 13 other PAZ gene products regulate vacuolar engulfment of peroxisomes during micropexophagy. Genes & Cells 7: 75-90.
104. Nakagawa Т., Mukaiyama H., Yurimoto H., Sakai Y., Kato N. (1999) Alcohol oxidase hybrid oligomers formed in vivo and in vitro. Yeast 15: 1223-1230.
105. Neben I., Sahm H., Kura M.-R. (1980) Studies on an enzyme, S-formylglutathione hydrolase, of the dissimilatory pathway of methanol in Candida boidinii. Biochem. Biophys. Acta 614: 81-91.
106. Nishikawa M., Hagishita Т., Yurimoto H., Kato N., Sakai Y., Hatanaka T. (2000) Primary structure and expression of peroxisomal acetylspermidine oxidase in the methylotrophic yeast Candida boidinii. FEBS Lett 476: 150-154.
107. Nunnari J., and Walter P. (1996). Regulation of organelle biogenesis. Cell. 84:389.394.
108. Ogata K., Nishikawa H., Ohsugi M. (1969) A yeast capable of utilizing methanol. Agric Biol Chem 33: 1519-1520.
109. Okumoto K., Abe I. and Fujiki Y. (2000). Molecular anatomy of the peroxin Pexl2p. J. Biol. Chem. 275: 25700-25710.
110. Otzen M., Perband U., Wang D., Baerends R., Kunau W., Veenhuis M., & Van der Klei I. J. (2004) Hansenula polymorpha Pexl9p is essential for the formation of functional peroxisomal membranes. J. Biol. Chem. 279 (18): 19181-19190.
111. Petriv O.I., Pilgrim D.B, Rachubinski R.A. & Titorenko V.I. (2002). RNA interference of peroxisome-related genes in C. elegans: a new model for human peroxisomal disorders. Physiol. Genomics. 10: 79-91.
112. Pitts K.R., Yoon Y., Krueger E.W. and McNiven M.A. (1999). The dynamin-like protein DLP1 is essential for normal distribution and morphology of the endoplasmic reticulum and mitochondria in mammalian cells. Mol. Biol. Cell. 10: 4403-4417.
113. Purdue P.E. and Lazarow P.B. (2001). Peroxisome biogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17: 701-752.
114. Raymond C.K., Bukowski Т., Holderman S.D., Ching A.F.T., Vanaja E., Stamm M.R. (1998). Development of the methylotrophic yeast Pichia methanolica for the expression of the 65-kilodalton isoform of human glutamate decarboxylase. Yeast 14: 1123
115. Rehling P., Skaletz-Rorowski A., Girzalsky W., et al. (2000). Pex8p, an intraperoxisomal peroxin of Saccharomyces cerevisiae required for protein transport into peroxisomes binds the PTS1 receptor Pex5p. J. Biol.Chem. 275: 3593-3602.
116. Sahm H., Wagner F. (1973). Microbial assimilation of methanol. The ethanol and methanol-oxiding enzymes of the yeast Candida boidinii. Eur. J. Biochem. 36:250-256.
117. Sakai Y, Tani Y (1992) Cloning and sequencing of the alcohol oxidase-encoding gene (AODi) from the formaldehyde-producing asporogenous methylotrophic yeast, Candida boidinii 82. Gene 114: 67-73
118. Sakai Y, Tani Y, Kato N (1999) Biotechnological application of cellular functions of the methylotrophic yeast. J. Mol. Catal. B: Enzymatic 6: 161-173
119. Sakai Y., Koller A., Rangell L.K., Keller G.A. and Subramani S.(1998) Peroxisome degradation by microautophagy in Pichia pastoris: identification of specific steps and morphological intermediates. J. Cell Biol. 141,625-636.
120. Sakai Y., Nakagawa Т., Shimase M., Kato N. (1998) Regulation and physiological role of the DAS1 gene, encoding dihydroxyacetone synthase, in the methylotrophic yeast Candida boidinii. J. Bacteriol. 180: 5885-5890
121. Sakai Y., Saiganji A., Yurimoto H., Takabe K., Saiki H., Kato N. (1996) The absence of Pmp47, a putative yeast peroxisomal transporter, causes a defect in transport and folding of a specific matrix enzyme. J. Cell Biol. 134: 37-51
122. Salomons F.A., Kiel J.A.K.W., Faber K.N., et al. (2000) Overproduction of Pex5p stimulates import of alcohol oxidase and dihydroxyacetone synthase in a Hansenula polymorpha PEX14 null mutant. J. Biol. Chem. 275: 12603-12611.
123. Salomons F.A., van der Klei I. J., Kram, et al. (1997) Brefeldin A interferes with peroxisomal protein sorting in the yeast Hansenula polymorpha. FEBS Lett. 411: 133-139.
124. Sambrook J.E., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, NY.
125. Sarmiento C., Ross J.H.E., Herman E., and Murphy D.J. (1997). Expression and subcellular targeting of a soybean oleosin in transgenic rapeseed. Implications for the mechanism of oil-body formation in seeds. Plant J. 11: 783-796.
126. Schrader M., Burkhardt J.K., Baumgart E., et al. (1996). Interaction of microtubules with peroxisomes. Tubular and spherical peroxisomes in HepG2 cells and their alterations induced by microtubule-active drugs. Eur. J. Cell Biol. 69: 24-35.
127. Schrader M., Reuber B.E., Morrell J.C., et al. (1998). Expression of PEX11 mediates peroxisome proliferation in the absence of extracellular stimuli. J. Biol. Chem. 273: 29607-29614.
128. Schutte H., Flossdorf J., Sahm H., Kula M.-R. (1976). Purification and properties of formaldehyde dehydrogenase and formate dehydrogenase from Candida boidinii. Eur. J. Biochem. 62:151-160.
129. Sepulveda-Saavedra, J., van der Klei I.J., Keizer I., Lopez A.P., Harder W. and Veenhuis, M. (1992). Studies on the effects of toxin T-514 on the integrity of peroxisomes in methylotrophic yeasts. FEMS Microbiol. Lett. 91: 207-212.
130. Shen S., Suiter G., Jeffries T.W., Gregg J.M. (1998). A strong nitrogen source-regulated promoter for controlled expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris. Gene. 216: 93-102.
131. Sherman F., Fink GR, Hicks JB (1981). Methods in yeast genetics. Course instruction. Cold Spring Harbor Press, NY.
132. Shimizu N., Itoh,R., Hirono Y., et al. (1999). The peroxin Pexl4p: cDNA cloning by functional complementation on a Chinese hamster ovary cell mutant, characterization, and functional analysis. J. Biol. Chem. 274: 12593-12604.
133. Shimozawa N., Tsukamoto Т., Nagase T. et al. (2004). Identification of a new complementation group of the peroxisome biogenesis disorders and PEX14 as the mutated gene. Hum Mutat. 23(6): 552-558.
134. Small G.M., Szabo L.J., and Lazarow P.B. (1988). Acyl-CoA oxidase contains two targeting sequences each of which can mediate protein import into peroxisomes. EMBO J. 7: 1167-1173.
135. Smith J.J. and Rachubinski R.A. (2001). A role for the peroxin Pex8p in Pex20p-dependent thiolase import into peroxisomes of the yeast Yarrowia lipolytica. J. Biol. Chem. 276: 1618-1625.
136. Smith J.J., Marelli M., Christmas R.H. et al. (2002). Transcriptome profiling to identify genes involved in peroxisome assembly and function. J. Cell Biol. 158: 259-271.
137. Snyder W., Faber K., Wenzel Т., et al. (1999a). Pexl9p interacts with РехЗр and PexlOp and is essential for peroxisome biogenesis in Pichia pastoris. Mol. Biol. Cell. 10: 1745-1761.
138. Soukupova M., Sprenger C., Gorgas K. et al. (1999). Identification and characterization of the human peroxin PEX3. Eur. J. Cell Biol. 78: 357-374
139. South S. & Gould S. (1999). Peroxisome synthesis in the absence of preexisting peroxisomes. J. Cell Biol. 144: 255-266.
140. South S., Sacksteder K., Li X. et al. (2000). Inhibitors of COPI and COPII do not block РЕХЗ-mediated peroxisome synthesis. J. Cell Biol. 149: 1345-1360.
141. Stasyk O.V., van der Klei I.J., Bellu A.R., Shen S., Kiel J.A.K.W., Cregg J.M. & Veenhuis M. (1999) A Pichia pastoris VPS 15 homologue is required in selective peroxisome autophagy. Curr. Genet. 36: 262-269.
142. Stewart M., Esposito R., Gowani J. & Goodman J. (2001). Alcohol oxidase and dihydroxyacetone synthase, the abundant peroxisomal proteins of methylotrophic yeasts, assemble in different cellular compartments. J. Cell Sci. 114: 2863-2868.
143. Subramani S. (1993). Protein import into peroxisomes and biogenesis of the organelle. Annu. Rev. Cell Biol. 9: 445-478.
144. Subramani S., Koller A., & Snyder W.B. (2000). Import of peroxisomal matrix and membrane proteins. Annu. Rev. Biochem. 69: 399-418.
145. Suiter G., Looyenga 1., Veenhuis M., Harder W. (1990). Occurrence of peroxisomal membrane proteins in methylotrophic yeasts grown under different conditions. Yeast.6: 35-43.
146. Swinkels B.W., Gould S.J., Bodnar A.G., et al. (1991). A novel, cleavable peroxisomal targeting signal at the amino-terminus of the rat 3-ketoacyl-CoA thiolase. EMBO J. 10: 3255-3262.
147. Szilard R.K. & Rachubinski R.A. (2000). Tetratricopeptide repeat domain of Yarrowia lipolytica Pex5p is essential for recognition of the type 1 peroxisomal targeting signal but does not confer full biological activity on Pex5p. Biochem. J. 346: 177-184.
148. Szilard R.K., Titorenko V.I., Veenhuis M. & Rachubinski R.A. (1995). Pay32p of the yeast Yarrowia lipolytica is an intraperoxisomal component of the matrix protein translocation machinery. J. Cell Biol. 131: 1453-1469.
149. Tabak H., Murk J., Braakman I. & Geuze H.J. (2003). Peroxisomes start their life in the endoplasmic reticulum. Traffic. 4: 512-518.
150. Tam Y.Y.C., Torres-Guzman J.C., Vizeacoumar F.J., et al. (2003). Pexll-related proteins in peroxisome dynamics: A role for the novel peroxin Pex27p in controlling peroxisome size and number in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. Cell. 14: 4089-4102.
151. Tamura S., Shimozawa N., Suzuki Y. et al. (1998). A cytoplasmic AAA family peroxin, Pexlp, interacts with Рехбр. Biochem. Biophys. Res. Commun. 245: 883-886.
152. Tan X., Titorenko V.I., van der Klei I.J., Suiter G.J. et al. (1995) Characterization of peroxisome-deficient mutants of Hansenula polymorpha. Curr. Genet. 28: 248-257.
153. Tan X., Waterham H. R., Veenhuis M. & Cregg J. M. (1995). The Hansenula polymorpha PER8 gene encodes a novel peroxisomal integral membrane protein involved in proliferation. J. Cell Biol. 128: 307-319.
154. Terlecky S.R., Nuttley W.M., McCollum D., et al. (1995). The Pichia pastoris peroxisomal protein PAS8p is the receptor for the C-terminal tripeptide peroxisomal targeting signal. EMBO J. 14:3627-3634.
155. Thines E., Weber R.W.S., and Talbot N.J. (2000). MAP kinase and protein kinase A-dependent mobilization of triacylglycerols and glycogen during appressorium turgor generation by Magnaporthe gwea.Plant Cell. 12: 1703-1718.
156. Titorenko V. & Rachubinski R. (2004). The peroxisome: orchestrating important developmental decisions from inside the cell. J. Cell Biol. 164: 641-645.
157. Titorenko V. I. & Rachubinski R. A. (2000). Peroxisomal membrane fusion requires two AAA family ATPases, Pexlp and Рехбр. J. Cell Biol. 150: 881-886.
158. Titorenko V. I. and Rachubinski R. A. (2001). Dynamics of peroxisome assembly and function. Trends Cell Biol. 11: 22-29.
159. Titorenko V. I., Chan H. & Rachubinski R. A (2000). Fusion of small peroxisomal vesicles in vitro reconstructs an early step in the in vivo multistep peroxisome assembly pathway of Yarrowia lipolytica. J. Cell Biol. 148: 29-43.
160. Titorenko V. I., Eitzen G. A. & Rachubinski R. A. (1996). Mutations in the PAY5 gene of the yeast Yarrowia lipolytica cause the accumulation of multiple subpopulations of peroxisomes. J. Biol. Chem. 271: 20307-20314.
161. Titorenko V. I., Smith J. J., Szilard R. K. & Rachubinski R. A. (1998). Pex20p of the yeast Yarrowia lipolytica is required for the oligomerization of thiolase in the cytosol and for its targeting to the peroxisome. J. Cell Biol. 142: 403-420.
162. Titorenko V.I., & Rachubinski R.A. (1998). Mutants of the yeast Yarrowia lipolytica defective in protein exit from the endoplasmic reticulum are also defective in peroxisome biogenesis. Mol. Cell. Biol. 18: 2789-2803.
163. Titorenko V.I., & Rachubinski R.A. (2001).The life cycle of the peroxisome. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 357-368.
164. Titorenko V.I., Keizer I., Harder W. & Veenhuis M. (1995). Isolation and characterization of mutants impaired in the selective degradation of peroxisomes in the yeast Hansenulapolymorpha. J. Bacterid. 177: 357-363.
165. Titorenko V.I., Ogrydziak D.M. & Rachubinski R.A. (1997). Four distinct secretory pathways serve protein secretion, cell surface growth, and peroxisome biogenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. Mol. Cell. Biol. 17: 5210-5226.
166. Titorenko V.I., Waterham, H.R., Cregg, J.M., Harder, W. & Veenhuis, M. (1993) Peroxisome biogenesis in the yeast Hansenula polymorpha is controlled by a complex set of interacting gene products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7470-7474.
167. Tong A.H., Lesege G., Bader G. et al. (2004). Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 6, 304(5659): 774-775.
168. Tsukamoto Т., Miura S., & Fujiki Y. (1991). Restoration by a 35K membrane protein of peroxisome assembly in a peroxisome-deficient mammalian cell mutant. Nature. 350: 77-81.
169. Van der Klei, Veenhuis M. (2002). Peroxisomes: flexible and dynamic organelles. Curr. Opin. in Cell Biol. 14: 500-505.
170. Veenhuis M., Komori M., Salomons F., Hilbrands R.E., Hut H., Baerends R.J.S., Kiel J.A.K.W. & van der Klei I.J. (1996) Peroxisomal remnants in peroxisome-deficient mutants of the yeast Hansenula polymorpha. FEBS Lett. 383: 114-118.
171. Veenhuis M., Suiter G., van der Klei I. & Harder W. (1989). Evidence for functional heterogeneity among microbodies in yeasts. Arch. Microbiol. 151: 105-110.
172. Veenhuis M., van Dijken J.P., Pilon S.A. & Harder W. (1978). Development of crystalline peroxisomes in methanol-grown cells of the yeast Hansenula polymorpha and its relation to environmental conditions. Arch. Microbiol. 117: 153-163.
173. Veenhuis M., Zwart K.B. & Harder W. (1981) Biogenesis and turnover of peroxisomes involved in the concurrent oxidation of methanol and methylamine in Hansenula polymorpha. Arch. Microbiol. 129: 35-41.
174. Verduyn С., Giuseppin M.L.F., Scheffers W.A., van Dijken J.P. (1989) Hydrogen peroxide metabolism in yeasts. Appl. Environ. Microbiol. 54: 2086-2090.
175. Verduyn C., van Dijken J.P. & Scheffers W.A. (1984) Colorimetric alcohol assays with alcohol oxidase. J. Microbiol. Methods 2,15-25.
176. Walter C., Gootjes J., Mooijer P.A. et al. (2001). Disorders of peroxisome biogenesis due to mutations in PEX1: phenotypes and PEX1 protein levels. Amer. J. Hum. Genet. 69: 35^*8.
177. Walton P.A., Hill P.E., and Subramani S. (1995) Import of stably folded proteins into peroxisomes. Mol. Biol. Cell. 6: 675-683.
178. Wang C.- W. & Klionsky D. J. (2003). The molecular mechanism of autophagy. Mol. Med. 9(3): 65-77.
179. Warren G.& Wickner W. (1996). Organelle Inheritance. Cell. 84: 395^*00.
180. Wendland M. & Subramani S. (1993) Presence of cytoplasmic factors functional in peroxisomal protein import implicates organelle-associated defects in several human peroxisomal disorders. J. Clin. Invest. 92: 2462-2468.
181. Wiemer E.A.C., Luers G.H., Faber K.N., et al. (1996) Isolation and characterization of Pas2p, a peroxisomal membrane protein essential for peroxisome biogenesis in the methylotrophic yeast Pichiapastoris. J. Biol. Chem. 271: 18973-18980.
182. Wiemer E.A.C., Wenzel Т., Deerinck T.J., et al. (1997) Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. J. Cell Biol. 136: 71-80.
183. Wilcke M., Hultenby K. & Alexson S. E. H. (1995) Novel peroxisomal populations in subcellular fractions from rat liver. Implications for peroxisome structure and biogenesis. J. Biol. Chem. 270: 6949-6958.
184. Will G.K., Soukupova M., Hong X., et al. (1999) Identification and characterization of the human orthologue of yeast Pexl4p. Mol. Cell Biol. 19: 2265-2277.
185. Yaffe M.P. (1999) Dynamic mitochondria. Nat. Cell Biol. 1: 149-150.
186. Yahraus Т., Braverman N., Dodt G. et al. (1996) The peroxisome biogenesis disorder group 4 gene, PXAAA1, encodes a cytoplasmic ATPase required for stability of the PTS1 receptor. EMBOJ. 15: 2914-2923.
187. Yoon Y., Pitts K.R., Dahan S. and McNiven M.A. (1998) A novel dynamin-like protein associates with cytoplasmic vesicles and tubules of the endoplasmic reticulum in mammalian cells. J. Cell Biol. 140: 779-793.
188. Yurimoto H., Lee., Yano Т., Sakai Y. & Kato N. (2003) Physiological role of S-formylglutathione hydrolase in CI metabolism of the methylotrophic yeast Candida boidinii. Microbiology. 149: 1971-1979.
189. Yurimoto H., Sakai Y. & Kato N. (2002). Methanol metabolism. In: Hansenula polymorpha: Biology and Applications (Ed. by G. Gellissen). Weinheim: Wiley-VCH. pp. 61-75.
190. Zhang J.W. & Lazarow P.B. (1995) PEB1 (PAS7) in Saccharomyces cerevisiae encodes a hydrophilic, intra-peroxisomal protein that is a member of the WD repeat family and is essential for the import of thiolase into peroxisomes. J. Cell Biol. 129: 65-80.
191. Zwart K., Veenhuis M., van Dijken P., Harder W. (1980) Development of amine oxidase containing peroxisomes in yeasts during growth of glucose in the presence of methylamine as the nitrogen source. Arch. Microbiol. 126: 117-126.1. Благодарности.
192. Автор искренне признателен своему научному руководителю д.б.н., проф. Троценко Юрию Александровичу за научное руководство и всестороннюю помощь при выполнении и написании работы.
193. Автор глубоко благодарен с.н.с. ФГУП ГосНИИ Генетики и Селекции промышленных микроорганизмов Дутовой Татьяне Анатольевне за неоценимую помощь в освоении методов классической генетики дрожжей и участии в обсуждении полученных данных.
194. Автор благодарит всех членов своей семьи за помощь и всестороннюю поддержку.
-
Курбатова, Елена Михайловна
-
кандидата биологических наук
-
Пущино, 2005
-
ВАК 03.00.15
- Разработка новых методов анализа спиртов и альдегидов и конструирование продуцентов этанола с использованием нетрадиционных дрожжей Hansenula polymorpha и Pichia stipitis
- Роль маннозилтрансферазы Рmt1p в формировании молекулярного ансамбля клеточной стенки дрожжей Hansenula polymorpha
- Структурно-функциональные особенности алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Pichia metahanolica
- Особенности метаболизма метилотрофов
- Факторы, влияющие на эффективность секреции рекомбинантного активатора плазминогена урокиназного типа клетками дрожжей
