Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные особенности алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Pichia metahanolica

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ашин, Виктор Васильевич

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Функциональная роль и процессинг алкогольоксидазы.

1.1.1. Участие алкогольоксидазы в первичном метаболизме дрожжей.

1.1.2. Регуляция и структура А ОХ генов.

1.1.3. Транспорт алкогольоксидазы в пероксисомы.

1.1.4. Сборка алкогольоксидазы.

1.1.5. Регуляция биосинтеза Ф АД - кофактора алкогольоксидазы.

1.2. Свойства алкогольоксидазы.

1.2.1. Биохимическая характеристика.

1.2.2. Олигомерные формы алкогольоксидазы.

1.2.3. Механизм катализа.

1.2.4. Взаимодействие с азидом натрия.

1.2.5. Взаимодействие с перекисью водорода и формальдегидом.

1.2.6. Полухинон ФАД в активном центре алкогольоксидазы.

1.3. Модифицированный ФАД - уникальный кофактор алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей.

1.3.1. Модификация ФАД.

1.3.2. Структура мФАД.

1.3.3. Зависимость Кт и Утах алкогольоксидазы от содержания модифицированного ФАД.

1.4. Алкогольоксидаза в биотехнологии.

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Штаммы дрожжей и условия культивирования.

2.2. Индукция изоформ алкогольоксидазы.

2.3. Индукция метанолом дрожжей, дефектных по алкогольоксидазе.

2.4. Очистка изоформ алкогольоксидазы и минорного белка с активностью алкогольоксидазы.

2.4.1. Хроматографические методы.

2.4.2. Препаративный электрофорез и проявление алкогольоксидазы по активности.

2.4.3. Электроэлюция из ПААГ алкогольоксидазы и минорного белка с активностью алкогольоксидазы.

2.5. Изучение свойств изоформ алкогольоксидазы и минорного белка с активностью алкогольоксидазы.

2.5.1. Определение молекулярной массы.

2.5.2. Определение кинетических параметров.

2.5.3. Определение рН оптимумов активности и стабильности.

2.5.4. Хроматофокусирование.

2.6. Анализ субъединиц изоформ алкогольоксидазы и минорного белка с активностью алкогольоксидазы.

2.6.1. Аминокислотный анализ.

2.6.2. ВЭЖХ субъединиц алкогольоксидазы и минорного белка с активностью алкогольоксидазы и их триптических гидролизатов.

2.7. Изучение модификации ФАД.

2.7.1. Анализ содержания модифицированного ФАД в изоформах алкогольоксидазы и минорного белка с активностью алкогольоксидазы.

2.7.2. Эксперименты с алкогольоксидазой в буферных растворах.

2.7.3. Эксперименты с ФАД в буферных растворах.

2.7.4. Эксперимент с 2 14С-рибофлавином.

2.8. Исследование структуры модифицированного ФАД.

2.8.1. Препаративное выделение модифицированных ФАД и флавина.

2.8.2. Получение масс-спектров модифицированного флавина и рибофлавина.

2.8.3. Ограниченная деградация флавинов.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

ЗЛ.Очистка и характеристика изоформ алкогольоксидазы.

3.1.1. Выделение индивидуальных изоформ алкогольоксидазы.

3.1.2. Молекулярные, кинетические свойства изоформ и локализация.

3.1.3. Субъединичный состав изоформ.алкогольоксидазы.

3.1.4. Экспрессия изоформ алкогольоксидазы и содержание в них модифицированного ФАД.

3.2. Проверка предположения о возможности модификации ФАД.

3.2.1. Модификация ФАД в алкогольоксидазе и в клетках дрожжей.

3.2.2. Модификация ФАД in vivo с 214С-рибофлавином.

3.3. Анализ структуры модифицированного ФАД.

3.3.1. Масс-спектрометрический анализ модифицированного флавина.

3.3.2. Анализ конфигурации С-атомов углеводного участка модифицированного флавина.

3.4. Очистка и характеристика минорного белка с активностью алкогольоксидазы.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональные особенности алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Pichia metahanolica"

Актуальность проблемы. Дрожжи, использующие метанол как источник углерода и энергии, представляют интерес в качестве модельных организмов для изучения транспорта и импорта белков в пероксисомы эукариот, и в связи с перспективами их применения в биотехнологии. При этом особое внимание уделяется алкогольоксидазе (АО), первому и ключевому ферменту метилотрофного метаболизма дрожжей. АО обладает широкой субстратной специфичностью, содержит два изомера ФАД и образует в матриксе пероксисом псевдокристаллическую структуру (кристаллоид), отчетливо видимую под электронным микроскопом. Природа широкой субстратной специфичности, роль изомеров ФАД и функциональная значимость кристаллоидной формы АО не вполне ясны. Поэтому актуально изучение структурно-функциональных особенностей этого фермента у различных метилотрофных дрожжей.

Состояние вопроса. К началу данной работы, М. Б. Грузманом (Gruzman et al., 1991) в нашей лаборатории впервые были найдены изоформы АО у дрожжей Pichia methanolica МН4 (в соответствии с более ранней классификацией Pichia pinus МН4), однако оставались неясными механизм их образования и принципы регуляции активности. Вместе с тем, задолго до обнаружения изоформ АО у Р. methanolica МН4, было известно, что у других метилотрофных дрожжей этот фермент выявляется нативным электрофорезом в виде двух активных белков (Lee and Komagata, 1983). Попытки выделить данные белки по отдельности из препарата АО Hansenula polymorpha DL1 оказались неудачными (Bystrykh et. al, 1989), что было объяснено диссоциацией октамерной формы АО (758 кДа) до активного тетрамера (440 кДа) во время электрофореза при щелочных значениях pH электрофоретического буфера. Октамерная форма АО являлась минорной по отношению к тетрамерной форме. Однако мы обратили внимание на то, что у дрожжей Р. methanolica МН4 наряду с изоформами АО присутствует также минорная полоса АО, идентичная таковой у Н. polymorpha DL1. Таким образом, возник вопрос: как связаны структура и функция изоформ АО и минорной АО у дрожжей Р. methanolica МН4. В ходе исследований наше внимание привлекли другие нерешенные вопросы: структура и происхождение модифицированного ФАД (мФАД) - уникального кофактора АО метилотрофных дрожжей (Sherry and Abeles, 1985).

Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным представлялось логичным выяснить взаимосвязь структуры и функции АО у Р. methanolica МН4 для понимания принципов регуляции этого фермента. В соответствии с этой целью в работе решались следующие основные задачи:

1. Выделить АО активные белки из P. methanolica МН4 и сравнить их с таковыми из дрожжей Н. polymorpha DL1.

2. Выяснить молекулярные механизмы образования изоформ АО P. methanolica МН4, закономерности их экспрессии и функциональную значимость.

3. Определить происхождение и молекулярную структуру мФАД.

Научная новизна. Установлено, что изоформы АО P. methanolica МН4 состоят из двух типов субъединиц, различающихся по первичной последовательности аминокислот (Ашин и Троценко, 1998), что недавно подтвердили японские исследователи на генетическом уровне (Nakagawa et al., 1999). Показана зависимость экспрессии изоформ АО и соотношения в них мФАД/ФАД от условий культивирования дрожжей (Ашин и Троценко, 1998). При росте дрожжей в присутствии экзогенного 214С-рибофлавина, включение метки клетками обнаружено преимущественно в ФАД, но не в мФАД. Постулирован путь биосинтеза мФАД, в котором рибофлавин не является предшественником данного кофактора. Разработан химический метод ограниченной деградации флавинов, и установлено, что мФАД имеет структуру ксило-ФАД, но не арабино-ФАД, как сообщалось ранее (Kellogg et al., 1992). Из дрожжей Р. methanolica МН4 и Н. polymorpha DL1 впервые выделен и охарактеризован минорный белок с АО активностью (Alcohol Oxidase Protein или х-АОР), считавшийся октамерной формой АО (Bystrykh et al, 1989). Подобно АО, х-АОР локализуется в пероксисомах, но отличается от АО регуляцией экспрессии, молекулярными свойствами, аминокислотной последовательностью и отсутствием флавинов.

Практическое значение работы. Разработанный нами метод ограниченной деградации флавинов характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью и простотой исполнения. Наш вариант препаративного электрофореза в ПААГ позволяет быстро и с высокой эффективностью разделять белки с очень близкими соотношениями молекулярных масс и поверхностных зарядов. С помощью этого метода удалось выделить и охарактеризовать полный спектр индивидуальных изоформ АО. Согласно нашим данным, для коммерческого применения АО из Р. methanolica МН4 наиболее удобны препараты фермента, выделенные из биомассы дрожжей в поздней логарифмической фазе роста на метаноле, или при скоростях протока культуральной среды 0.01-0.05 ч"1. В этих условиях у дрожжей доминирует экспрессия изоформы 1 с большим сродством к метанолу (Km 0.5 мМ) по сравнению с изоформой 9 (Km 5.7 мМ). 7

При производстве алкобиосенсоров необходимо учитывать, что АО из P. methanolica МН4 и других дрожжей содержит минорный х-АОР, который, как оказалось, совместно с АО, но не в отдельности, способен окислять глюкозу наряду со спиртами. Изучая индукцию данных ферментов, мы выявили, что глюкоза является репрессором АО и х-АОР, тогда как глицерин препятствует экспрессии х-АОР, но не АО. Отсюда следует, что в качестве источника АО без х-АОР можно использовать выращенные на глюкозе клетки дрожжей, после их индукции глицерином.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ашин, Виктор Васильевич

ВЫВОДЫ

1. Показано, что метанол индуцирует экспрессию 9 изоформ АО у метилотрофных дрожжей РгсМа теМапоПса МН4, тогда как формальдегид является индуктором изоформ 1 - 4, а формиат индуцирует только изоформу 1. При росте дрожжей на метаноле, в начале экспоненциальной фазы и при скорости протока культуральной среды 0.16 ч"1, наиболее выражена изоформа 9. Напротив, в конце экспоненциальной фазы роста дрожжей и при скорости протока культуральной среды 0.05 ч"1 доминирует изоформа 1.

2. Изоформы АО впервые выделены и охарактеризованы в индивидуальном состоянии с использованием модифицированного метода препаративного электрофореза. Данные изоформы различаются по изоэлектрическим точкам (р1 5.2 - 4.18), но имеют одинаковую кажущуюся молекулярную массу 450 кДа и м. м. субъединиц 75 кДа.

3. Методом ВЭЖХ интактных изоформ АО и их триптических гидролизатов показано, что изоформы 1 и 9 являются гомоолигомерами, состоящими из а- или Р-субъединиц соответственно, тогда как промежуточные изоформы (2 - 8) -гетероолигомеры состоят из обоих типов субъединиц, ассоциированных в различных соотношениях.

4. Установлено, что изоформы АО содержат ФАД и его модифицированный аналог, мФАД, причем соотношение данных кофакторов зависит от фазы роста дрожжей и скорости протока культуральной среды. Включение 214С-рибофлавина в ФАД, но не в мФАД, свидетельствует об образовании мФАД биосинтетическим путем, а не посредством спонтанной изомеризации ФАД. Модифицированным методом деградации флавинов, ВЭЖХ и масс-спектрометрически мФАД идентифицирован как ксило-ФАД.

5. Обнаружен новый пероксисомный белок (х-АОР), имеющий высокую степень гомологии с АО по первичной аминокислотной последовательности и проявляющий активность АО. Однако, х-АОР отличается от АО по молекулярной массе (680 кДа), Мг субъединиц (78 кДа), не содержит флавинов, репрессируется глицерином и окисляет глюкозу совместно с АО.

6. Найденные структурно-функциональные особенности АО, проявляющиеся, в частности, в расширении субстратной специфичности в присутствии х-АОР, нашли применение в исследованиях селективности алкобиосенсоров.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенный нами структурно-функциональный анализ АО дрожжей Р. теМапоИса МН4 выявил ряд взаимосвязанных механизмов регуляции активности данного фермента: 1) кинетические параметры изоформ зависят от соотношения в них ФАД/мФАД; 2) соотношение ФАД/мФАД и экспрессия изоформ АО зависят от фазы роста дрожжей или скорости протока культуральной среды; 3) суммарная активность АО зависит от экспрессии различных изоформ, отличающихся по кинетическим параметрам. У Я ро1утогрка БЫ и других дрожжей изоформы АО отсутствуют, и кинетические параметры фермента зависят только от соотношения в нем ФАД/мФАД. Физиологическая значимость мФАД у дрожжей подтверждается также тем, что этот кофактор образуется в результате биосинтеза, а не за счет спонтанной модификации ФАД. В соответствии с нашими данными, в состав мФАД входит ксилоза, в отличие от ФАД, содержащего рибозу. Поэтому путь биосинтеза мФАД может существенно отличаться от биосинтетического пути ФАД. В связи с этим необходима полная расшифровка пути биосинтеза мФАД.

В отличие от кинетических параметров, субстратная специфичность АО, как свидетельствуют наши данные, зависит от взаимодействия АО с другими белками. Мы обнаружили новый пероксисомный белок (х-АОР), который, как и АО, окисляет метанол, но в тандеме с АО окисляет глюкозу, тогда как в гомогенном виде эти ферменты не активны с глюкозой.

Согласно ВЭЖХ триптических гидролизатов, субъединицы АО и х-АОР (75 и 78 кДа соответственно) практически идентичны, за исключением четырех пептидов. Вместе с тем, х-АОР существенно отличается от АО значением Мг нативных молекул (680 и 450 кДа соответственно) и отсутствием флавинов. В связи с этим, представляется весьма интересным исследовать механизмы оксидазной функции х-АОР при отсутствии в нем флавинов в качестве кофакторов и сопряженного окисления глюкозы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ашин, Виктор Васильевич, Пущино

1. Грузман М. Б., Титоренко В. И., Ашин В. В., Луета К. А., Троценко Ю. А. (1996). Множественные молекулярные формы алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Pichia methanolica. Биохимия. 61, вып. 12, 2131 2139.

2. Ашин В. В., Троценко Ю. А. (1998). Образование и распределение модифицированного FAD между изоформами алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей Pichia methanolica. Биохимия. 63, вып. 12,1654 1661.

3. Троценко Ю. А. (1983). Метилотрофные эукариоты. Успехи микробиологии. 18, 18-38.

4. Яновская JI. А., Юфит С. С., Кучеров В. Ф. (1975). Химия ацеталей. Москва, "Наука", с. 12-14.

5. Albertini, М., Rehling, P., Erdmann, R., Girzalsky, W., Kiel, J. A., Veenhuis, M. and Kunau, W. H. (1997). Pexl4p, a peroxisomal membrane protein binding both receptors of the two PTS-dependent import pathways. Cell. 89, 83-92.

6. Antony, A. C., Utley, C. S., Marcell, P. D. and Kolhouse, J. F. (1982). Isolation, characterization, and comparison of the solubilized particulate and soluble folate binding proteins from human milk. J Biol Chem. 257, 10081-10089.

7. Ashin V. V., Trotsenko Y. A. (2001). Alcohol oxidase of the methylotrophic yeasts: new findings. J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 10, N°1 3, 295 - 303.

8. Bacher, A., Eggers, U. and Lingens, F. (1973). Genetic control of riboflavin synthetasein Bacillus subtilis. Arch Microbiol. 89, 73-77.

9. Bacher, A. and Mailander, B. (1973). Biosynthesis of riboflavin. The structure of the purine precursor. J Biol Chem. 248, 6227-6231.

10. Bellion, E. and Goodman, J. M. (1987). Proton ionophores prevent assembly of a peroxisomal protein. Cell. 48,165-173.

11. Boteva, R., Visser, A. J. W. G., Filippi, B., Vriend, G., Veenhuis, M. and Van der Klei I. (1999). Conformational transitions accompanying oligomerization of yeast alcohol oxidase, a peroxisomal flavoenzyme. Biochemistry. 38, 5034-5044.

12. Brooke, A. G., Dijkhuizen, L. and Harder, W. (1986). Regulation of flavin biosynthesis in the methylotrophic yeast Hansenulapolymorpha. Arch Microbiol. 145, 62-70.

13. Bruice, T. C. and Yano, Y. (1975). Radical mechanisms for l,5-dihydro-5-methylflavine reduction of carbonyl compounds. J Amer Chem Soc. 97, 5263-5271.

14. Bystrykh, L. V., Dijkhuizen, L. and Harder, W. (1991). Modification of flavin adenine dinucleotide in alcohol oxidase of the yeast Hansenula polymorpha. J Gen Microbiol. 137, 2381-2386.

15. Bystrykh, L. V., Dvorakova, J. and Volfova, 0. (1989). Alcohol oxidase of methylotrophic thermo- and acidotolerant yeast Hansenula sp. Folia Microbiol. 34, 233237.

16. Bystrykh, L. V., Romanov, V. P., Steczko, J. and Trotsenko, Y. A. (1989). Catalytic variability of alcohol oxidase from the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. Biotech Appl Biochem. 11, 184-192.

17. Choong, Y. S. and Massey, V. (1980). Stabilization of lactate oxidase flavin anion radical by complex formation. J Biol Chem. 255, 8672-8677.

18. Cregg, J. M„ Madden, K. R„ Barringer, K. J., Thill, G. P. and Stillman, C. A. (1989). Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia pastoris. Mol Cell Biol. 9, 1316-1323.

19. Cregg, J. M„ Van der Klei, I. J., Suiter, G. J., Veenhuis, M. and Harder, W. (1990). Peroxisome-deficient mutants of Hansenula polymorpha. Yeast. 6, 87-97.

20. Cregg, J. M., Vedvick, T. S. and Raschke, W. C. (1993). Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris. Biotechnology (NY). 11, 905-910.

21. Clark D. S., Geresh S. and Cosimo D. R. (1994). Enantioselective oxidation of 2-methyl-l-butanol by alcohol oxidase from methylotrophic yeasts. Bioorg Medicinal Chem Lett. 4, 1745- 1748.

22. Couderc, C. L., Barrati, J. (1980). Oxidation of methanol by the yeast, Pichia pastoris. Purification and properties of the alcohol oxidase. Agric Biol Chem. 44, 2279 2289.

23. Clark, D. S., Geresh, S. and Cosimo, R. D. (1994). Enantioselective oxidation of 2-methyl-l-butano) by alcohol oxidase from methylotrophic yeasts. Bioorgan Medicin ChemLett. 4, 1745-1748.

24. Dodt, G. and Gould, S. J. (1996). Multiple PEXgenes are required for proper subcellular distribution and stability of Pex5p, the PTS1 receptor: evidence that PTS1 protein import is mediated by a cycling receptor. J Cell Biol. 135, 1763-1774.

25. Douma, A. C., Veenhuis, M., Suiter, G. J. and Harder, W. (1987). A proton-translocating adenosine triphosphatase is associated with the peroxisomal membrane of yeasts. Arch Microbiol. 147, 42-47.

26. Douma, A. C., Veenhuis, M., Suiter, G. J., Waterham, H. R., Verheyden, K., Mannaerts, G. P. and Harder, W. (1990). Permeability properties of peroxisomal membranes from yeasts. Arch Microbiol. 153, 490-495.

27. Douma, A. C., Veenhuis, M., Waterham, H. R. and Harder, W. (1990). Immunocytochemical demonstration of the peroxisomal ATPase of yeasts. Yeast. 6, 4551.

28. Egli Th., van Dijken J. P., Veenhuis M., Harder W., Fiechter A. (1980). Methanol metabolism in yeasts: regulation of the syntesis of catabollic enzymes. Arch Microbiol. 124, 115-121.

29. Eggeling L., Sahm H. (1978). Derepression and partial insesitivity to carbon catabolite repression of the methanol dissimilating enzymes in Hansenula polymorpha. Eur J Appl Microbiol Biotechnol. 5, 197-202.

30. Eggeling L., Sahm H. (1980). Regulation of alcohol oxidase synthesis in Hansenula polymorpha: oversynthesis during growth on mixed substrrates and induction by methanol. Arch Microbiol. 127, 119 -124.

31. Eggeling L., Sahm H., Wanger F. (1977). Induction of FMN adeniltranferase in the methanol utilizing yeast Candida boidinii. FEMS Microbial Lett. 1, 205 210.

32. Ehrenberg, A., Muller, F. and Hemmerich, P. (1967). Basicity, visible spectra, and electron spin resonance of flavosemiquinone anions. Eur J Biochem 2, 286-293.

33. Elgersma, Y. and Tabak, H. F. (1996). Proteins involved in peroxisome biogenesis and functioning. Biochim Biophys Acta. 1286, 269-283.

34. Ellis, S. B., Brust, P. F., Koutz, P. J., Waters, A. F., Harpold, M. M. and Gingeras, T. R. (1985). Isolation of alcohol oxidase and two other methanol regulatable genes from the yeast Pichia pastor is. Mol Cell Biol. 5, 1111-1121.

35. Erdmann, R. and Blobel, G. (1996). Identification of Pexl3p a peroxisomal membrane receptor for the PTS1 recognition factor. J Cell Biol. 135,111-121.

36. Evers, M. E., Hohfeld, J., Kunau, W. H., Harder, W. and Veenhuis, M. (1991). Physiological studies on the utilization of oleic acid by Saccharomyces cerevisiae in relation to microbody development. FEMS Microbiol Lett. 69, 73-78.

37. Evers, M. E., Langer, T., Harder, W., Hartl, F. U. and Veenhuis, M. (1992). Formation and quantification of protein complexes between peroxisomal alcohol oxidase and GroEL. FEBS Lett. 15, 51-54.

38. Evers, M. E., Titorenko, V., Harder, W., ven der Klei, I. and Veenhuis, M. (1996). Flavin adenine dinucleotide binding is the crucial step in alcohol oxidase assembly in the yeast Hansenula polymorpha. Yeast. 12, 917-923.

39. Evers, M. E., Titorenko, V. I., van der Klei, I. J., Harder, W. and Veenhuis, M. (1994). Assembly of alcohol oxidase in peroxisomes of the yeast Hansenula polymorpha requires the cofactor flavin adenine dinucleotide. Mol Biol Cell. 5, 829-837.

40. Fujiki, Y., Rachubinski, R. A., Zentella-Dehesa, A. and Lazarow, P. B. (1986). Induction, identification, and cell-free translation of mRNAs coding for peroxisomal proteins in Candida tropicalis. J Biol Chem. 261, 15787-15793.

41. Gellissen, G., Melber, K., Janowicz, Z. A., Dahlems, U. M., Weydemann, U., Piontek, M., Strasser, A. W. and Hollenberg, C. P. (1992). Heterologous protein production in yeast. Antonie Van Leeuwenhoek. 62, 79-93.

42. Gellissen, G., Weydemann, U., Strasser, A. W., Piontek, M., Janowicz, Z. A. and Hollenberg, C. P. (1992). Progress in developing methylotrophic yeasts as expression systems. Trends Biotechnol. 10, 413-417.

43. Gleeson, M. A., Haas, L. O. and Cregg, J. M. (1990). Isolation of Candida tropicalis auxotrophic mutants. Appl Environ Microbiol. 56,2562-2564.

44. Godecke, S., Eckart. M., Janowicz, Z. A. and Hollenberg, C. P. (1994). Identification of sequences responsible for transcriptional regulation of the strongly expressed methanol oxidase-encoding gene in Hansenula polymorpha. Gene. 139, 35-42.

45. Goodman, J. M., Scott, C. W., Donahue, P. N. and Atherton, J. P. (1984). Alcohol oxidase assembles post-translationally into the peroxisome of Candida boidinii. J Biol Chem. 259, 8485-8493.

46. Gruzman, M.B., Sysoev, O.V., Titorenko, V.I., Maslakiewicz, P., Trotsenko, Y.A., and Sibirny, A.A. (1991) in Abstr. 15th Int. Spec. Symp.on Yeasts, Riga, p.52.

47. Gruzman, M.B., Titorenko, V.I., Maslakiewicz, P., Ivanov E.V., Ashin, V.V., and Trotsenko,Y.A. (1992) in Abstr. 7th Int. Symp.on Microbial Growth on Cl-Compounds, Warwick, B78.

48. Trotsenko, Y.A., Gruzman, M.B., and Ashin, V.V. (1994) in Abstr. 3rd German -Russian Workshop Biotechnology, Berlin, p.56.

49. Gould, S. J., Kalish, J. E., Morrell, J. C., Bjorkman, J., Urquhart, A. J. and Crane, D. I. (1996). Pexl3p is an SH3 protein of the peroxisome membrane and a docking factor for the predominantly cytoplasmic PTsl receptor. J Cell Biol. 135, 85-95.

50. Gould, S. J., Keller, G. A., Hosken, N„ Wilkinson, J. and Subramani, S. (1989). A conserved tripeptide sorts proteins to peroxisomes. J Cell Biol. 108, 1657-1664.

51. Gunkel K., Veenhuis M. and Van der Klei I. (2002). Import and assembly of peroxisomal alcohol oxidase in the yeast Hansenula polymorpha. Third Yarrowia lipolytica Int. Meeting: Cell Biology and Biotechnology of a Nonconventional Yeast (Dresden).

52. Gurd, R. S., Mahler, H. R. and Moore, W. J. (1972). Differences in protein patterns on polyacrylamide-gel electrophoresis of neuromal membranes from mice different strains. JNeurochem. 19, 553-556.

53. Giuseppin M. L. F., van Eijk H. M. J., Bos A., Verduyn C., van Dijken J. P. (1988). Utilization of methanol by a catalase-negative mutant of Hansenula polymorpha. Eur J Appl Microbiol Biotechnol. 3, 120 -126.

54. Hansen, H., Didion, T., Thiemann, A., Veenhuis, M. and Roggenkamp, R. (1992). Targeting sequences of the two major peroxisomal proteins in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. Mol Gen Genet. 235, 269-278.

55. Hansen, H. and Roggenkamp, R. (1989). Functional complementation of catalase-defective peroxisomes in a methylotrophic yeast by import of the catalase A from Saccharomyces cerevisiae. Eur J Biochem. 184, 173-179.

56. Harder W., Trotsenko Y. A., Bystrykh L. V., Egli T. (1987). Methabolic regulation in methylotrophic yeasts, in Proc. 5th Int. Symp. Microbial growth on Q compounds. Eds. Verseveld van H. W., Duine J. A. Martinus Nijhof Publishers Dordrecht. 139 149.

57. Hopkins T. R., Muller F. Biochemistry of alcohol oxidase. (1987) in Proc. 5th Int. Symp. Microbial growth on Ci compounds. Eds. Verseveld van H. W., Duine J. A. Martinus Nijhof Publishers Dordrecht. 150- 157.

58. Kato N., Omori Y., Tani Y., Ogata K. (1976). Alcohol oxidase of Kloeckera sp. and Hansenula polymorpha. Eur J Biochem. 64, 341 350.

59. Keizer, I., Roggenkamp, R., Harder, W. and Veenhuis, M. (1992). Location of catalase in crystalline peroxisomes of methanol-grown Hansenula polymorpha. FEMS Microbiol Lett. 72, 7-11.

60. Korpan, Y. I., Dzyadevich, S. V., Zharova, V. P. and El'skaya, A. V. (1994). Conductometric biosensor for ethanol detection based on whole yeast cells. Ukr Biokhim Zh. 66, 78-82.

61. Koutz, P., Davis, G. R., Stillman, C., Barringer, K., Cregg, J. and Thill, G. (1989). Structural comparison of the Pichia pastoris alcohol oxidase genes. Yeast. 5,167- 111.

62. Lowry, O. H., Rosenbrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. (1951). Protein measurements with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193, 265 271.

63. Lee, J-D., Komagata, K. (1983). Further taxonomic study of methanol assimilating yeasts with spesial references to electroforetic comparison of enzymes. J Gen Appl Microbiol. 29,395-416.

64. Macro-Varga, G., Johansson, K., Gorton, L. (1994). Enzyme-based biosensor as a selective detection unit in column liquid chromatography. J Chromatogr. A. 660, 153 -167.

65. Massey, V. and Palmer, G. (1966). On the existence of spectrally distinct classes of flavoprotein semiquinones. A new method for the quantitative production of flavoprotein semiquinones. Biochemistry. 5, 3181-9.

66. McCammon, M. T., McNew, J. A., Willy, P. J. and Goodman, J. M. (1994). An internal region of the peroxisomal membrane protein PMP47 is essential for sorting to peroxisomes. J Cell Biol. 124, 915-925.

67. McNew, J. A. and Goodman, J. M. (1994). An oligomeric protein is imported into peroxisomes in vivo. J Cell Biol. 127, 1245-1257.

68. Mincey, T., Tayrien, G., Mildvan, A. S. and Abeles, R. H. (1980). Presence of a flavin semiquinone in methanol oxidase. Proc Natl Acad Sci USA. 77, 7099-7101.

69. Muller F., Hopkins T. R., Lee J., Bastiaens P. L. (1992). H. in Chemistry and Biochemistry of Flavoenzymes. 3, (Muller F, ed.), CRC Press, London, 95 119.

70. Murdanoto, A. P., Sakai, Y., Sembiring, L., Tani, Y. and Kato, N. (1997). Ester synthesis by NAD(+)-dependent dehydrogenation of hemiacetal: production of methyl formate by cells of methylotrophic yeasts. Biosci Biotechnol Biochem. 61,1391-1393.

71. Nakagawa, T., Mukaiyama, H., Yurimoto, H., Sakai, Y. and Kato, N. (1999). Alcohol oxidase hybrid oligomers formed in vivo and in vitro. Yeast. 15, 1223-1230.

72. Nakagawa, T., Uchimura, T. and Komagata, K. (1996). Isozymes of methanol oxidase in a methanol-utilizing yeast, Pichia methanolica IAM 12901. J Ferment Biotechnol. 81, 498-503.

73. Nash, T. (1953). The colorimetric estimation of formaldehyde by means of the Hantzsch reaction. Biochem J. 55,416-421.

74. Nelsen, P., Neuberger, G., Floss, H. G., Bacher, A. (1984). Biosynthesis of riboflavin: Enzymatic formation of the xylene moiety from carbon 14C-labelled ribulose-5'phosphate. Biochem Biophys Res Commun. 118, 814 820.

75. Neuberger, G., Bacher, A. (1985). Biosynthesis of riboflavin. An aliphatic intermediate in the formation of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine from pentosephosphate. Biochem Biophys Res Commun. 127, 175- 181.

76. Oltmanns, O. (1971). Riboflavins mutants of Saccharomyces cerevisiae. The problem of the r/65-gene. Mol Gen Genet. 105, 306-313.

77. Ohi, H., Miura, M., Hiramatsu, R. and Ohmura, T. (1994). The positive and negative cis-acting elements for methanol regulation in the Pichiapastoris AOX2 gene. Mol Gen Genet. 243, 489-499.

78. Patel, R. N., Hou, C. T., Laskin, A. I. and Derelanko, P. (1981). Microbial oxidation of methanol: properties of crystallized alcohol oxidase from a yeast, Pichia sp. Arch Biochem Biophys. 210, 481-488.

79. Phillips petroleum Co. (1980). A method for producing alcohol oxidase, alcohol oxidase enzyme preparation and a method for determining the concentration of a compound in an alcohol containing sample. Patent EP 0019937.

80. Phillips petroleum Co. (1982). Biochemical conversions by yeast fermentation at high cell densities. Patent US 4414329.

81. Reshetilov, A. N., Trotsenko, Y. A., Morozova, N. 0., Iliasov, P. V., Ashin, V. V. (2001). Characteristics of Gluconobacter oxydans B-1280 and Pichia methanolica MH4 cell based biosensors for detection of ethanol. Proc Biochem. 36, 1015 1020.

82. Ritz, H., Schramek, N., Bacher, A., Herz, S., Eisenreich, W., Richter, G., Bacher, A. (2001). Biosynthesis of riboflavin: studies on the mechanism of GTP cyclohydrolase II. J Biol Chem. 276, 22273 -22277.

83. Roggenlcamp, R. (1988). Constitutive appearance of peroxisomes in a regulatory mutant of the methyl otrophic yeast Hansenula polymorpha. Mol Gen Genet. 213, 535-540.

84. Roa, M., Blobel, G. (1983). Biosynthesis of peroxisomal enzymes in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. Proc Natl Acad Sci USA. 80, 6872 6876.

85. Roggenkamp, R., Didion, T. and Kowallik, K. V. (1989). Formation of irregular giant peroxisomes by overproduction of the crystalloid core protein methanol oxidase in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. Mol Cell Biol. 9, 988-994.

86. Roggenkamp, R., Janowicz, Z., Stanikowski, B. and Hollenberg, C. P. (1984). Biosynthesis and regulation of the peroxisomal methanol oxidase from the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. Mol Gen Genet. 194,489-493.

87. Sahm, H. and Wagner, F. (1973). Microbial assimilation of methanol. The ethanol- and methanol-oxidizing enzymes of the yeast Candida boidinii. Eur J Biochem. 36, 250-256.

88. Sakai, Y., Akiyama, M., Kondoh, H., Shibano, Y. and Kato, N. (1996). High-level secretion of fungal glucoamylase using the Candida boidinii gene expression system. Biochim Biophys Acta. 1308, 81-87.

89. Sakai, Y., Murdanoto, A. P., Sembiring, L., Tani, Y., Kato, N. (1995). A novel formaldehyde oxidation pathway in methylotrophic yeasts: methylformate as a possible intermediate. FEMS Microbial Lett. 127, 229 234.

90. Sakai, Y„ Rogi, T., Yonehara, T., Kato, N. and Tani, Y. (1994). High-level ATP production by a genetically-engineered Candida yeast. Biotechnology (N Y). 12, 291293.

91. Sakai, Y., Saiganji, A., Yurimoto, H., Takabe, K., Saiki, H. and Kato, N. (1996). The absence of Pmp47, a putative yeast peroxisomal transporter, causes a defect in transport and folding of a specific matrix enzyme. J Cell Biol. 134, 37-51.

92. Sakai, Y., Saiganji, A., Yurimoto, H„ Takabe, K., Saiki, H. and Kato, N. (1996). The absence of Pmp47, a putative yeast peroxisomal transporter, causes a defect in transport and folding of a specific matrix enzyme. J Cell Biol. 134, 37-51.

93. Sakai, Y., Yoshida, H., Yurimoto, H., Yoshida, N., Fukuya, H., Takabe, K. and Kato, N. (1999). Production of fungal fructosyl amino acid oxidase useful for diabetic diagnosis in the peroxisome of Candida boidinii. FEBS Lett. 459,233-237.

94. Sakai Y., Tani Y., Kato N. (1999). Biotechnological application of cellular functions of the methylotrophic yeast. J Mol Catalysis B Enzymatic. 6,161 173.

95. Schramek, R. H., Bracher, N., Herz, A., Eisenreich, S., Richter, W., Bacher, G., (2001). Biosynthesis of riboflavin: studies on the mechanism of GTP cyclohydrolase II. J Biol Chem. 276, 22273-22277.

96. Shen, S., Suiter, G., Jeffries, T. W. and Cregg, J. M. (1998). A strong nitrogen source-regulated promoter for controlled expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris. Gene. 216, 93-102.

97. Sherry, B. and Abeles, R. H. (1985). Mechanism of action of methanol oxidase, reconstitution of methanol oxidase with 5-deazaflavin, and inactivation of methanol oxidase by cyclopropanol. Biochemistry. 24, 2594-2605.

98. Silverman, R. B. and Hoffman, S. J. (1981). N-(l-Methyl)cyclopropylbenzylamine: a novel inactivator of mitochondrial monoamine oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 101, 1396-1401.

99. Subramani, S. (1993). Protein import into peroxisomes and biogenesis of the organelle. Annu Rev Cell Biol. 9, 445-478.

100. Swinkels, B. W., Gould, S. J. and Subramani, S. (1992). Targeting efficiencies of various permutations of the consensus C- terminal tripeptide peroxisomal targeting signal. FEBS Lett. 305, 133-136.

101. Tani, Y., Miya, T., Nishikawa, H., Ogata, K. (1972). The microbial methabolism of methanol, part I. formation and crystallization of methanol-oxidizing enzyme yeast, Kloeckera sp. 2201. Agr Biol Chem. 36, 68 75.

102. Terlecky, S. R., Nuttley, W. M., McCollum, D., Sock, E. and Subramani, S. (1995). The Pichia pastoris peroxisomal protein PAS8p is the receptor for the C- terminal tripeptide peroxisomal targeting signal. Embo J. 14, 3627-3634.

103. Thauer, R. K., Jungermann, K. and Decker, K. (1977). Energy conservation in chemotrophic anaerobic bacteria. Bacteriol Rev. 41, 80-100.

104. Titorenko, V. I., Waterham, H. R„ Cregg, J. M., Harder, W. and Veenhuis, M. (1993). Peroxisome biogenesis in the yeast Hansenula polymorpha is controlled by a complex set of interacting gene products. Proc Natl Acad Sci USA. 90, 7470-7474.

105. Nakagava, T., Sakai, Y., Mukaiyama, H., Mizumura, T., Miyaji, T., Yurimoto, H., Kato, N., Tomizuka, N. (2001). Analysis ofalcohol oxidase isozymes in gene-disrupted strains of methylotrophic yeast Pichia methanolica. 19, 225-227.

106. Nakagava, T., Mizumura, T., Mukaiyama, H., Miyaji, T., Yurimoto, H., Kato, N., Sakai, Y., Tomizuka, N. (2002). Physiological role of the second alcohol oxidase gene MOD2 in the methylotrophicgrowth of Pichia melhanoI/ca Yeast. 19,1067-1073.

107. Trotsenko, Y. A., Bystrykh, L. V., Ubiyvovk, V. M. (1984). Regulatory aspects of methanol metabolism in yeasts, in Microbial growth on Ci compounds. Proc. 4th Int. Symp., Washington, 118 -122.

108. Veenhuis, M., Douma, A., Harder, W. and Osumi, M. (1983). Degradation and turnover of peroxisomes in the yeast Hansenula polymorpha induced by selective inactivation of peroxisomal enzymes. Arch Microbiol. 134,193-203.

109. Veenhuis, M., van Dijken, J. P. and Harder, W. (1976). Cytochemical studies on the localization of methanol oxidase and other oxidases in peroxisomes of methanol-grown Hansenula polymorpha. Arch Microbiol. 111, 123-135.

110. Veenhuis, M., Van Dijken, J. P. and Harder, W. (1983). The significance of peroxisomes in the metabolism of one-carbon compounds in yeasts. Adv Microb Physiol. 24, 1-82.

111. Waterham, H. R. and Cregg, J. M. (1997). Peroxisome biogenesis. Bioessays. 19, 57-66.

112. Waterham, H. R., Russell, K. A., Vries, Y. and Cregg, J. M. (1997). Peroxisomal targeting, import, and assembly of alcohol oxidase in Pichia pastoris. J Cell Biol. 139, 1419-1431.

113. Wegner, G. H. and Harder, W. (1987). Methylotrophic yeasts-1986. Antonie Van Leeuwenhoek. 53, 29-36.

114. Wilson, A. C., Pardee, A. B. (1962). Regulation of flavin synthesis by Escherichia coli. J Gen Microbiol. 28, 283 303.83

115. Yamada, H., Sgin, K-C., Kato, N., Shimizu, S., Tani, Y. (1979). Purification and characterization of alcohol oxidase from Candida 25 A. Agric Biol Chem. 43, 877 -878.1. БЛАГОДАРНОСТИ