Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка системы экспрессии генов на основе метилотрофных дрожжей Komagataella kurtzmanii

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка системы экспрессии генов на основе метилотрофных дрожжей Komagataella kurtzmanii"

На правах рукописи

ТЮРИН ОЛЕГ ВЛАДИМИРОВИЧ

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ НА ОСНОВЕ МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ Komagataella киПшапи

03.01.03 - Молекулярная биология

005555681

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2014

2 0 НОЯ 2014

005555681

Работа выполнена в лаборатории эукариотических систем экспрессии Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИГенетика»)

Научный руководитель: Кандидат биологических наук ФГУП «ГосНИИГенетика», г. Москва

Козлов Дмитрий Георгиевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, доцент

Руководитель группы

ИФР им. К.А. Тимирязева РАД г. Москва

Голденкова-Павлова Ирина Васильевна

Кандидат биологических наук

Эльдаров Михаил Анатольевич

руководитель группы

Центр «Биоинженерия» РАН, г. Москва

Ведущая организация: Федеральное государствешюе бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Диссертационного Совета Д.217.(Ш.и1 при фгун «государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов», а также на сайге www.genetika.ai

Защита диссертации состоится

года в на заседании

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В настоящее время микробиологический синтез является основой для получения множества рекомбинантных белков и вакцин, используемых в медицине, ветеринарии и других отраслях промышленности.

Для получения рекомбинантных продуктов используются системы экспрессии, включающие реципиентный штамм, вектор для трансформации, несущий целевой ген, набор методик для работы с данным организмом.

Применяемые в настоящее время системы экспрессии можно подразделить на прокариотические - бактериальные, и эукариотические - на основе клеток дрожжей, мицелиальных грибов, насекомых или млекопитающих. Каждая из них имеет свои технологические достоинства и ограничения, в основе которых лежат различия биологических процессов в организмах. Использование бактериальных систем, например на основе штаммов Escherichia coli, часто сопровождается образованием нерастворимых телец включения и необходимостью рефолдинга целевых белков, что существенно ограничивает их применение.

Основным недостатком систем экспрессии на основе клеток насекомых или млекопитающих, способных производить все необходимые посттрансляционные модификации, считается увеличение стоимости конечных продуктов в связи с необходимостью использования в производственном процессе сложного и дорогостоящего оборудования и питательных сред.

Использование дрожжей в качестве продуцентов целевых рекомбинантных белков является компромиссным, и в ряде случаев оптимальным решением. Дрожжи являются представителями эукариотических организмов и обладают способностью поддерживать большинство постгрансляционных модификаций, а также обладают способностью к эффективной секреции белков в культуральную среду. При этом, культивирование дрожжей не требует дорогостоящего оборудования и сред, а выделение н очистка рекомбинантного белка существенно облегчена тем, что количество эндогенных секретируемых белков дрожжей сравнительно невелико. С начала 1980-х годов, дрожжи Saccharomyces cerevisiae успешно используются для биосинтеза рекомбинантных белков человеческого, животного и растительного происхождения. Однако, одним из существенных недостатков дрожжей S. cerevisiae является гипергликозшшрование секретируемых гетерологичных белков, которое может обусловливать их нежелательную иммуногенностъ и ограничивать использование подобных рекомбинантных белков в фармацевтической промышленности.

С начала 1990-х годов получили развитие альтернативные дрожжевые системы на основе металотрофных дрожжей Pichia pastor is, которые зарекомендовали себя во многих случаях более эффективными и перспективными продуцентами рекомбинантных белков, чем S. cerevisiae. В 2009

году FDA (Food and Drugs Administration, США) присвоила метилотрофным дрожжам Komagataella phaffii (Pichia pastoris) статус GRAS (Generally Regarded as Safe), что сделало их еще более перспективными для применения в фармацевтике. Однако, широкое применение разработанных систем ограничивается необходимостью использования высокотоксичного и огнеопасного метанола для индукции наиболее мощного и часто используемого регулируемого промотора АОХ1. Другим ограничивающим обстоятельством является коммерческий статус систем экспрессии, распространяемых компанией Invitrogen (США). Цели и задачи работы

Целью настоящей работы являлась разработка альтернативной отечественной системы экспрессии, на основе метилотрофных дрожжей штамма ВКПМ Y-727. В процессе решались следующие задачи:

- провести таксономические исследования штамма дрожжей ВКПМ Y-727 и определ1гть его видовую принадлежность;

- исследовать особенности регуляции генов, отвечающих за метаболизм метанола в дрожжах штамма Y-727;

- разработать систему экспрессии на основе оригинальной элементной базы штамма ВКПМ Y-727;

- сконструировать на базе штамма ВКПМ Y-727 продуценты модельных внутриклеточных и секретируемых белков и оценить их экспрессионный потенциал.

- провести поиск альтернативного индуктора промотора алкоголь оксидазы, способного заменить высокотоксичный метанол;

Научная новизна и практическая значимость работы

На основе углубленных таксономических исследований установлен новый вид метилотрофных дрожжей Komagataella kurtzmanii ВКПМ Y-727, представляющих интерес с точки зрения биотехнологии.

Клонированы и секвенированы промоторные области генов АОХ1, GAP дрожжей К.kurtzmanii Y-727 для регуляции гетерологичной экспрессии.

Получен набор мутангных производных базового штамма К. kurtzmanii Y-727, содержащих мутации в генах URA3, HIS4, ARG4 и ADE2.

Получены и охарактеризованы штаммы-продуценты модельных белков: ß-галактозидазы E.coli, инулазы Klyuveromyces marxianus, сывороточного альбумина человека (HSA), сосудисто-эндотелиального фактора роста человека (VEGFnib), поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Доказана высокая эффективность индуцируемого АОХ1 и конститутивного промотора GAP дрожжей K.kurtzmanii Y-727.

Показано, что по эффективности биосинтеза гетерологичных белков продуценты на основе штамма К. kurtzmanii Y-727 не уступают или превосходят продуценты на основе ближайшего аналогаK.phaffiiGS\ 15 (Invitrogen).

Найден новый безопасный индуктор промотора АОХ1 - формиат. Показано, что уровень формиатной индукции промотора сравним с уровнем индукции метанолом.

Проведены исследования механизма индукции промотора АОХ1.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанная система экспрессии на основе метилотрофных дрожжей K.kurtzmanii Y-727 является эффективной и конкурентоспособной по отношению к имеющимся аналогам. Эффективность новой системы экспрессии показана на модельных штаммах-продуцентах как секретируемых так и внутриклеточных белков.

2. Новый найденный индуктор промотора алкоголь оксидазы - формиат обеспечивает сравнимый с метанолом уровень индукции.

3. Делеция гена FLD (формальдегид дегидрогеназы) увеличивает уровень индукции промотора алкоголь оксидазы в метилотрофных дрожжах в ответ на метанол и формиат.

Апробация работы

Диссертационная работа была апробирована на семинаре секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 16 марта 2014 года. Материалы диссертации докладывались на 38-ом конгрессе Федерации европейских биохимических обществ «Механизмы в биологии» (38-th FEBS Congress) 6-11 июня 2013 г. и на 26-ой международной конференции «Генетика дрожжей и молекулярная биология» (26th International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology) 29 августа-3 сентября 2013 г.

Публикации

По основным результатам диссертации опубликовано 7 работ, их них 2 статьи в рецензируемых зарубежных журналах, рекомендованных ВАК, 2 материала на зарубежных конференциях и 3 патента РФ.

Структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 122 страницах и включает: введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, материалы и методы, выводы и список цитируемой литературы (113 источников). Работа включает 19 рисунков и 5 таблиц.

Сокращения, принятые в тексте

YPD - богатая среда состава, масс.% (1-дрожжевой экстракт, 2-пептон, 2-глюкоза, остальное - вода) YP - богатая среда состава, масс.% (1-дрожжевой экстракт, 2-пептон, остальное - вода) YPM- богатая среда состава, масс.% (1-дрожжевой экстракт, 2-neirroH, 1-метанол, остальное - вода) YPgM - богатая среда состава, масс.% (1-дрожжевой экстракт, 2-пептон, 0,1- глицерин, 0,5% метанол, остальное - вода)

YPF - богатая среда состава, масс.% (1-дрожжевой экстракт, 2-пептон, 1,5-формиат калия, остальное -вода)

YNB - минимальная среда состава, масс.% (0.17-yeast nitrogen base, 0,5-сульфат аммония, 0,4- глюкоза)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Выбор штамма

Штамм метилотрофных дрожжей дикого типа У-121 для разработки новой системы экспрессии был получен из коллекции ВКПМ. Согласно описанию, данный штамм был депонирован как штамм Р./?а5?ога, родственный штамму N11111.-11430 или ЫШ1Ь-48124 (05115). Штамм находился в коллекции ВКПМ в открытом доступе с 1998 г. и в этой связи мог быть использован для разработки новой системы экспрессии.

Несмотря на наличие описания, видовая принадлежность штамма не была формально определена. С генетической и биотехнологической точки зрения штамм был не изучен. В частности, не была охарактеризована активность и регуляция гена алкогольоксидазы АОХ, промотор которого предполагалось использовать в качестве ключевого элемента новой системы экспрессии.

С целью первичного исследования регуляции промотора АОХ1 в клетках штамма ВКПМ У-121 был проведен следующий качественный эксперимент. В качестве контрольного штамма сравнения использовали штамм К. р/а//И 05115.

Клетки анализируемых штаммов выращивали до экспоненциальной фазы роста на жидких средах: УРО - с глюкозой; УРМ - с метанолом, УР - без источника углерода.

Таким образом, условия роста на среде УРБ обеспечивали катаболитную репрессию генов АОХ в клетках обоих штаммов; на среде УРМ - индукцию АОХ1,а на среде УР - имитировали условия истощения репрессирующего источника углерода.

Образцы полученных клеточных лизатов анализировали с помощью электрофореза в денатурирующих восстанавливающих условиях в 12% полиакриламидном. Известно, что в условиях индукции синтез алкоголь оксидазы (АОХ), имеющей молекулярную массу 72кДа, может достигать 30% суммарного клеточного белка. Это позволяло, анализируя данные электрофореграммы, оцешгть активность промотора АОХ в соответствующих условиях культивирования клеток по интенсивности сигнала на уровне 72кДа.

Из данных электрофореграммы, представленной на рис.1, видно, что в клетках обоих штаммов не происходит синтеза алкоголь оксидазы в условиях роста на среде с глюкозой (УРО), в результате катаболитной репрессиии. При росте клеток на среде с метанолом (УРМ) присутствует мажорный сигнал, соответствующий массе алкоголь оксидазы. В то же время в условиях роста, имитировавших истощение углеродного субстрата (на среде УР), ясно различимый сигнал АОХ наблюдался только в образце штамма ВКПМ У-727, и отсутствовал у штамма 05115.

Согласно известным данным, в условиях дерепрессии уровень активности АОХ1 в клетках штамма ОЭ115 не превышает 2% от индуцированного уровня, что не позволяло зафиксировать сигнал алкоголь оксидазы в клетках штамма 05115 в виде различимого сигнала в

условиях анализа и коррелировало с полученными данными (рис.1). В то же время согласно полученным данным и в тех же условиях интенсивность сигнала АОХ в образце штамма ВКПМ Y-727 достигала 15-20% относительно метанол-индуцированного уровня (сравнить дорожки №№1 и 5).

Y727 GS115 Y727 GS115 Y727 GS115 1 2 3 4 S 6

70kDa

YP YPD YP+Met

Рисунок 1. Электрофореграмма клеточных лизатов штамма ВКПМ Y-727 и K.pfuff¡i GS115. Стрелками указан сигнал, которому соответствует фермент алкоголь оксидаза. Дорожки с №№ 1-6 соответствуют: (1) Среда YP, штамм ВКПМ Y-727; (2) Среда YP, штамм K.pfaffii GS 115; (3) Среда YPD, штамм ВКПМ Y-727; (4) Среда YPD, штамм K.pfaffii GS И 5; (5) Среда YPM, штамм ВКПМ Y-727; (6) Среда YPM, пггамм K.pfaffii GS 115

Таким образом, экспериментальные данные указали на то, что особенностью штамма ВКПМ Y-727 является способность к автоиндукции промотора АОХ в условиях истощения репрессирующего углеродного субстрата. Данный эффект послужил одним из факторов, усиливших интерес к штамму Y-727, поскольку мог быть использован для решения одной из задач работы - разработки безметанольного способа индукции гетерологичных генов.

2. Таксономическая характеристика штамма ВКПМ Y-727

Принадлежность штамма ВКПМ Y-727 к метилотрофным дрожжам рода Komagataella была подтверждена в результате ростовых тестов на соответствующих субстратах - метаноле, глицерине, олеате, и др. Кроме ростовых тестов, проведено молекулярно-генетическое исследование по следующим маркерам - нуклеотидным последовательностям домена D1/D2 26S субъединицы рибосомапьной РНК; ITS1-5.8S-ITS2 - локуса рибосомальной РНК; фактору элонгации трансляции EF-la; субъединицы RPB1 РНК полимеразы И; митохондриальной малой субъединицы рибосомальной РНК Mito SSU rRNA. Проведенный анализ соответствующих нуклеотидных последовательностей полученных ПЦР-фрагментов ДНК показал, что по уровню гомологии анализируемый штамм ВКПМ Y-727 был наиболее близок штамму К. pfaffii (NRRL Y-7556) (рис.2), который в свою очередь является наиболее близким запатентованному штамму Y-11430 и его производным, в частности широко используемому GS115 (Invitrogen, США).

I _А. .ЧШ|Л".1й<ит

1_ А. м:-1')Т'

1^1 \ К. киг^пмиИ \ КРМ У-727 _К. !*>Ы> УК-4?Р

II ....К.рмк1мншча< У^ТЛО,*1 с май. УК-ЛХ.^ -ПМе аюмЬгашршчн N««1-У-2026т

Рисунок 2. Филогенетическое дерево видов рода Кота°Мае11. Условные обозначения: шкала «0.02» графически отображает 20 различающихся нуклеоткдов в анализируемой последовательсти из 1000 нуклеотидов на горизонтальных ветвях графика. Тем самым, показана степень родства между анализируемыми видами.

Результаты молекулярно-генетического анализа в совокупности с результатами ростовых тестов, подтвердили принадлежность штамма дрожжей ВКПМ У-727 к роду Ката^МаеИа, и в то же время, позволили отнести его к новому виду. По согласованию с выдающимся исследователем в области генетики и молекулярной биологии метилотрофных дрожжей Клетусом Пауль Курцманом, данному виду было присвоено наименование АГоига^а/а<г//а киП:тапИ.

Таким образом, в результате проведенных исследований штамм ВКПМ У-727 был отнесен к новому виду и определен как штамм Komagataella кигктапИ У-727.

3. Морфологические, физиологические и ростовые характеристики

Для оценки ростовых характеристик штамма К. кигИтапИ У-727 в сравнении с наиболее близким ему штаммом К.рИс$А1 05115 (1т'Пю°еп) был проведен опыт по кинетики роста на двух средах, обычно используемых при ферментации: УРС (с глицерином, как источником углерода) и УРМ (с метанолом, как источником углерода).

Рисунок 3. Кинетика роста штаммов К.Ьиг1&папи \-111 н К.рНи^уа 08115. А. На среде с глицерином (YPG) в качестве источника углерода; В. На среде с метанолом (УРМ) в качестве источника углерода

Как показали полученные данные (рис.3), оба штамма продемонстрировали сходную скорость роста на среде с глицерином, обычно используемой для получения высокоплотных культур. В то же время штамм К. киттапИ У727 утилизировал метанол практически в 2 раза медленнее, чем штамм К.рИа£Гй 05115, что коррелировало с относительным уровнем экспрессии алкоголь оксидазы в клетках этих штаммов (рис. 1, дор. 5 и 6).

4. Сравнительное исследование регуляции промоторов АОХ1 в клетках штаммов К. кипгтапи У-121 и ПрИаДи С8115

Для организации экспрессии гетерологичных генов в дрожжах К. киП:тапИ У727 были выбраны строго регулируемый промотор АОХ1 и конститутивный промотор ОАР, зарекомендовавшие себя в качестве наиболее эффективных промоторов в клетках K.phaffli 08115.

Данные секвенирования и выравнивания нуклеотидных последовательностей промоторов АОХ1, клонированных из штаммов К.киг£тапИ У-727 и К.р!ш//11 05115 выявили наличие нуклеотидных замен в промоторе АОХ1 штамма У-727, локализованных в двух из шести областей связывания активатора транскрипции Мхг1р. Присутствие данных мутаций могло обуславливать различие в регуляции промоторов А0Х1 в клетках штаммов У-727 и 08115.

С целью количественного определения сравнительных характеристик активности промоторов АОХ1 были сконструированы репортерные штаммы К. киПгтапИ У727 и К-рИсуЦт ОБ 115, несущие репортерные кассеты А0Х1-1ас2, содержащие ген |}-галактозидазы под контролем промоторов АОХ1. При этом для каждого из штаммов использовали эндогенный промотор.

Клетки репортерных штаммов выращивали до середины логарифмической фазы роста в пробирках со средой трех видов УРО - с репрессирующим АОХ1 источником углерода -глюкозой, УРМ-с индуцирующим АОХ1 источником углерода - метанолом, УР - без источника углерода. Активности промоторов в клетках анализируемых штаммов оценивали по уровню активности р-галактозидазы, содержащейся в соответствующих клеточных лизатах.

Из полученных данных, представленных в табл. 1 и на рис. 4 видно, что промоторы АОХ1 в клетках обоих штаммов обладали одинаковой активностью в присутствии индуктора - метанола, и были полностью репрессированы на среде с глюкозой. Однако, в условиях истощения углеродного субстрата (на среде УР) активность промотора АОХ1 в клетках штамма У-727 более чем в 2 раза превышала активность в клетках штамма бЭ 115.

Таблица 1. Активность (З-галактозидазы продуцируемой клетками штамма К.кигЧтапи У-727 и

Штамм / Среда УР УРМ

К.кигЧтапи У-727 Среднее Ср. кв. откл. 1698,5 2396,0 0,0

120,9 384,7 0,0

АГ.р/я//нС8115 Среднее Ср. кв. отк.1. 804,5 2373,0 0,0

259,3 237,6 0,0

3000,0 2500,0

ш

2000,0

о 1500,0 о

\ 1000,0 с

500,0 0,0

Активность р-галактозидазы, ME

■ Y727 BGS115

УР

Рисунок <4. Уровень активности бета-галактозидазы, продуцируемой клетками штамма K.kurtzmanii ВКПМ Y-727 и штамма K.pfaffii GS115. По вертикальной оси ~ шкала активности в Миллеровых единицах. Голубые столбцы соответствуют активности фермента в лизате клеток штамма K.kurtzmanii Y-727, розовые столбцы соответствуют активности фермента в лизате клеток штамма K.pfaffii GS115. На диаграмме планками отображено стандартное отклонение, рассчитанное по результатам измерения активности у двух клонов.

Таким образом, полученные данные подтвердили, что в клетках K.kurtzmanii Y-727 активность промотора А0Х1 при автоиндукции значительно выше чем в клетках K.pfaffii GS115.

5. Сравнительное исследование регуляции промоторов GAP в клетках штаммов Y-727 и K.phaffti GS115

Данные секвенирования и выравнивания нуклеотидных последовательностей клонированных промоторов GAP из штаммов K.kurtzmanii Y-727 и K.phaffii GS115 выявили наличие десяти замен и делеций в промоторе штамма Y-727. Для изучения влияния данных мутаций на регуляцию и активность промотора GAP штамма Y-727 был проведен опыт по измерению активности репортерного секретируемого белка - инулазы дрожжей дрожжей Klyuveromyces marxianus. Выбор этого репортерного белка определялся наличием у инулазы легко измеряемой инвертазной активности, а также тем, что клетки штамма К. kurtzmanii Y727 и штамма K.pfaffii GS115 не усваивают сахарозу и инулин, т.е. не продуцируют собственную инвертазу, что значительно упрощало интерпретацию результатов измерений.

При этом, было получено 4 варианта продуцентов: 2 из которых - на основе штамма Y-727, в которых ген инулазы находился под контролем эндогенных промоторов АОХ1 и GAP; и 2 - на основе штамма GS115, в которых ген инулазы также находился под контролем эндогенных промоторов АОХ1 и GAP. Для обеспечения секреции инулазы в кулыуральную жидкость лидерный пептид а-фактора (a-MF) клонировали в одну ранку считывания с геном инулазы.

Клетки штаммов-продуцентов, в которых экспрессия инулазы регулировалась промотором GAP инокулировали в среду YPD (с глюкозой). Клетки штаммов-продуцентов, в которых экспрессия инулазы регулировалась промотором АОХ1 инокулировали в среду YPM (с метанолом). Клетки выращивали до середины логарифмической фазы роста, после чего оценивали активность промоторов в клетках анализируемых штаммов по уровню активности инулазы, содержащейся в соответствующих осветленных культуральных жидкостях.

Из полученных данных, представленных в табл. 2 и на рис.5, видно, что в случае экспрессии под контролем промотора АОХ1 активность инулазы в штамме К. kurtzmanii Y727 выше более, чем в 2 раза, по сравнению с контрольным штаммом К. pfaffii GS 115. И наоборот, в случае регуляции гетерологичной экспрессии промотором GAP, активность продуцируемой инулазы больше у штамма К. pfaffii GS 115, по сравнению с K.kurtzmanii Y727.

Таблица 2. Активность инулазы, ед/мл/1 o.e.

Промотор GAP Промотор АОХ1

Y727 Среднее 0,46 0,39

Ст.откл. 0,0 0.1

GS115 Среднее 1,04 0,17

Ст. откл. 0.1 0.0

GSU5 Среднее__ЦМ__(U7_

'__Cm отк !. _ 0.1__00_

. Активность инулазы, ед/wi/lo.e. Активность инулазы. ед/мл/Хо.е.

I i:'

ж ° 0.8 • . t .|

¡Я "V727 0,3 ЙШН «"<"7

0.6 , ^ :|| lili 1М

■ ■ ' ' " СЛПЬ

01 I

д GAP промотор g__AOXlnpOMQiop __

Рисунок 5. А. Активность инулазы, в случае экспрессии гена под контролем промотора АОХ1. В. Активность инулазы, в случае экспрессии гена под контролем промотора GAP. Планками отображено стандартное отклонение по измерениям активности двух клонов.

Таким образом, использование промотора АОХ1 в клетках штамма Y-727 обеспечивало уровень продукции данного репортерного белка более, чем в 2 раза превышающий уровень продукции в клетках GS115. Подобное различие в уровне продукции не проявлялось в отношении внутриклеточно продуцируемой р-гапактозидазы (глава 4, табл. 1), что демонстрирует влияние промотора, регулирующего экспрессию целевого гена, на продукцию, а также возможные различия секреторных аппаратов клеток штаммов.

6. Получение аукеотрофных мутантов

В основе выбранного способа получения ауксотрофных производных штамма K.kurtzmanii Y-727 лежала селекция базового игаЗ мутанта этого штамма, который был отобран на среде, содержавшей фтороротовую кислоту (5'-FOA), обеспечивавшей подавление роста клеток, содержавших ген URA3 дикого типа.

Получение других ауксотрофных мутаций в клетках реципиентного штамма (уже имеющего игаЗ генотип) производилось путем замещения нативного гена трансформирующим клетки фрагментом ДНК, который заключал ген URA3 штамма K.pfaffii GS115 и фланкирующие этот ген дуплицированные последовательности гетерологичной ДНК (в натоящей работе

использовались последовательности структурного гена ТуА ретротранспозона Ту1), с последующим отбором на соответствующей селективной среде без урацила.

Далее, отбор игаЗ мутантов производился таким образом, чтобы в удалении гена был задействован механизм рекомбинации между дуплицированными последовательностями гетерологичной ДНК. Таким образом, в результате рекомбинационного удаления селективного маркера сконструированная ауксотрофная мутация оказывалась маркированной специфическим фрагментом гетерологичной ДНК. Тем самым предусматривалось, что впоследствии данные фрагменты гетерологичной ДНК могут быть использованы в качестве мишеней для направления интеграции целевых экспрессионных кассет (рис.6).

Векторная ДНК

X 1у э X

йй! г» ■ ОКАЗ Ту 3

^ ^___^ Хромосомная ДНК

5* Ту 3"

........'Хромосомная ДНК

Рисунок 6. Схематическое изображение структуры кассет замещения и этапов получения ауксотрофных мутантов. Кассеты замещения содержали: 1) 5' и 3' фланкирующие области, направлявшие интеграцию в локус искомого гена; 2) последовательности Ту, обеспечивавшие рекомбинационное удаление селективного маркера и конструирование нового сайта интеграции; 3) селективный маркерный ген и К АЗ.

Реализация данной схемы позволила многократно использовать ген 1Л1АЗ в качестве селективного маркера для отбора мутантных штаммов. В частности, так были получены | реципиентные штаммы, маркированные множественными ауксотрофными мутациями. В качестве мишеней для получения ауксотрофных мутантов были выбраны следующие гены: иНАЗ, ЯШ, АЯС4 и АОЕ2.

6,1. Получение штамма К.киНгшапИ \-121 игаЗ"™'

Для получения мутантов К.киг1:тапИ У727игаЗши1 была проведена трансформация штамма дикого типа кассетой, которая обеспечивала делецию нативного гена иЯАЗ за счет сайт-специфической рекомбинации. Кассета представляла собой ПЦР-фрагмент локуса ЫЯАЗ геномной ДНК штамма У-727, в составе которого была произведена протяженная делеция в области структурного гена 1Л1АЗ и замена удаленной области гена на гетерологичную последовательность элемента Ту 1 дрожжей 5.се/-еуй/ае (рис.7).

URAi-prom TV Ui=!A3-term

^ pURA3del ^

URA3 URA3 - Chromosome

Рисунок- 7. Схема делении гена URA3 кассетой pURA3del. URA3-prom, URA3-term - плечи, направляющие интеграцию в локус URA3; Ту - фрагмент ретротранспозона Tyl дрожжей S.cerevisiae'7 URA3 - ген оротидин-5-фосфат декарбоксштазы геномной ДНК.

Исходный штамм K.kurtzmanii Y727 трансформировали полученным фрагментом плазмиды pURA3del с целью получения мутантных клонов по гену URA3. Отбор мутантных клонов проводили на селективных чашках YPD, содержащих 5-фтороротидиновую кислоту (5'-FOA), в концентрации 500 мкг/мл агаризованной среды. В результате селекции было отобрано около 200 клонов, обладавших способностью расти в присутствие 5'-FOA.

С целью подтверждения фенотипа ига" отобранные клоны были проверены на способность роста на синтетической агаризованной среде YNB в зависимости от добавления в среду урацила в концентрации 50 мкг/мл среды. Было показано, что среди отобранных клонов только 8 имели фенотип ига".

С помощью ПЦР было исследовано состояние локуса URA3 отобранных восьми клонов Y-727ura3 с фенотипом ига". Было установлено, что ни один из отобранных клонов не являлся истинным трансформантом, т.е. не содержал кассету pURA3del. Таким образом, во всех случаях были отобраны спонтанные мутанты. По всем другим фенотипическим и морфологическим признакам полученные мутанты не отличались от клонов исходного штамма.

У отобранных восьми клонов Y-727ura3 было проведено исследование частоты реверсий. С этой целью полученные мутанты культивировали на среде YPD с добавлением урацила в течение 48 часов. Культуру отмывали от среды и ~108 клеток высевали на чашки с минимальной средой (YNB) без урацила. Ни для одного из анализируемых трансформантов не было зафиксировано появление ревертантов. Соответственно, частота спонтанных реверсий составляла <1/108. Для дальнейшей работы был отобран один клон.

Полученный мутантный штамм Y727 ura3ml" был использован для получения ауксотрофных мутантов путем трансформации кассетами, включающими ген URA3 в качестве селективного маркера.

6.2 Получение штамма K.kurtzmanu Y-727ura3ml"his4A

С целью получения штамма - двойного ауксотрофного мутанта по генам URA3 и HIS , был сконструирован вектор pHIS4del. Фрагмент данного вектора обеспечивал делецию нативного гена

Н154 (кодирующего фермент гистидинолдещдрогеназу, участвующую в синтезе гистидина) при трансформации штамма У727 игаЗ"1"' (рис. 8).

HIS4-5' iy URA3

А яшь........

XpHISWel HIS4 А

HIS4

H(S4 Chromosome

Рисунок 8. Схема делеции гена HIS4 кассетой pHIS4deI. HIS4-5,,HIS4-3' - плечи, направляющие интеграцию в локус HIS4; URA3 -ген URA3 штамма К. Phaffii GSU5; Ту - фрагменты ретротранспозона Ту1 дрожжей S.cerevisiae\ HIS4 - ген гистидинолдегидрогеназы геномной ДНК.

Фрагмент вектора pHIS4del (рис.8) был использован для трансформации клеток штамма Y727 ura3mut. Трансформанты, в геном которых была интегрирована кассета pHIS4del, отбирали по способности к росту на синтетической среде YNB с добавкой гистидина, после чего проверяли у них наличие фенотипа his".

У десяти клонов, продемонстрировавших искомый фенотип, было исследовано состояние локуса HIS4 при помощи ПЦР, с целью проверки корректности интеграции фрагмента вектора pHIS4del и замещения нативного гена HIS4. Проверка подтвердила правильную интеграцию с замещением у всех десяти клонов (данные не приведены). Один из отобранных клонов был назван Y727 his4-Ty и был использован далее для получения штамма Y727 ura3muthis4A.

В состав фрагмента вектора pHIS4del, использованного при получении штамма Y727 his4-Ту входили дуплицированные фрагменты ДНК - Ту, фланкировавшие ген селективного маркера URA3. Организация этих фрагментов ДНК в виде прямых повторов допускала возможность их участия в спонтанной гомологичной рекомбинации, которая должна была сопровождаться выщеплением селективного маркера (рис. 9).

HIS4-5' ту URA3 Ту HIS4-3'

Hl$4det Chromosome

Рисунок 9. Схема выщепления селективного маркера URA3. HIS4-5\HIS4-3' - плечи, направлявшие интеграцию в локус HIS4; URA3 -ген URA3 штамма К Phaffii GS 115; Ту - фрагменты ретротранспозона Tyl дрожжей S.cerevisiae,

С целью поиска клеток, в которых произошла указанная рекомбинация, клетки исходного штамма Y727 his4-Ty несколько раз пассировали в богатой среде YPD, выращивая культуры после каждого пересева в течение 24 часов. После проведения трех пассажей 109 клеток высеяли на чашки с агаризованной средой YPD, содержащей 5'-FOA в концентрации 500 мкг/мл среды, для отбора клонов с искомым фенотипом his ura".

В результате последующего ПЦР анализа было найдено 2 клона, в геноме которых в результате рекомбинации произошла делеция гена иЯАЗ в локусе Н1Б4 (данные не приведены). В результате делеции полученный штамм приобрел генотип игаЗ, и вместе с тем значительная часть структурного гена Н154 оказалась замещена фрагментом гетерологичной ДНК (Ту).

Один из найденных клонов был назван штаммом К. киП:пшпИ У-727 игаЗти1Ыз4Д. Полученный штамм пригоден для трансформации векторами, содержащими в качестве селективных маркеров гены 1Л1АЗ или Н1Б4, с последующим отбором трансформантов на соответствующих селективных средах.

6.3 Получение штаммов К. kurtzmanii Y-727arg4Ahis4A; К. kurtzmanii Y727ade2Ahis4A

Штаммы К. kurtzmanii Y727arg4Ahis4A и Y727ade2Ähis4A, содержащие ауксотрофные мутации в генах ARG4 и ADE2, были сконструированы на базе штамма Y727ura3rnulhis4A с использованием специально сконструированных векторов pARG4del и pADE2del (рис. 10). Эти штаммы пригодны для трансформации векторами, содержащими в качестве селективных маркеров гены ARG4 и ADE2, с последующим отбором трансформантов на соответствующих селективных средах.

ARG4-5' URA3 ARG4-3' ADE2-5' URA3 ADE2-3'

у pARG4del V \/ pADE2del ^

ARG4 ADE2

ARG4 Chromosome ADE2 Chromosome

А. В.

Рисунок 10. А. Схема делении гена ARG4 кассетой pARG4del. ARG4-5', ARG4-3' - плечи, направляюшие интеграцию в локус ARG4; URA3 - ген URA3; ARG4 - ген аргининсукцинатлиазы геномной ДНК. В. Схема делеции гена ADE2 кассетой pADE2del. ADE2-5', ADE2-3' - плечи, направляюшие интеграцию в локус ADE2; URA3 - ген URA3; ADE2 - ген фосфорибозиламиноимидазол карбоксилазы геномной ДНК.

Таким образом, в результате генно-инженерных работ были сконструированы 5 ауксотрофных производных базового штамма K.kurtzmanii Y727 (табл.3). Некоторые из этих штаммов были использованы для конструирования штаммов-продуцентов модельных белков и определения экспрессионных возможностей новой системы экспрессии.

Таблица 3. Генотипы и фенотипы ауксотрофных производных штамма Y727

Штамм Генотип Фенотип

Y727ura3™" игаЗ Ura

Y727ura3""'his4A his4, игаЗ Ura, His'

Y727his4A his-f His"

Y727arg4Ahis4A arg4, his-f Arg", His*

Y727ade2Ahis4A ade2, his4 Ade", His"

7. Разработка оригинальных базовых векторов экспрессии

С учетом генетической близости штаммов К. кигЕтапи и К. р/а//й, для трансформации клеток обоих организмов пригодны одни и те же вектора. Это свойство было использовано ранее при изучении активности промоторов. Тем не менее, для биотехнологического применения новой системы экспрессии требовалось создать новые базовые вектора на собственной элементной базе.

В результате выполненных генно-инженерных работ было получено несколько базовых векторов, основные из которых - содержавшие гены 1ЖАЗ и Н154 в качестве селективных маркеров, представлены на рис. 11 А,В.

Рисунок 11. А. Карта плазмиды Ту-1ЖАЗ-АОХI. Ту — фрагменты структурного гена ретротранспозона Ту из дрожжей - плечи, направляющие интеграцию; АОН1р - промотор алкогольдегидрогеназы 1 из дрожжей

Х УКЛЗбс - ген оротидин декарбоксилазы из дрожжей ¿».сегеу/зш; АОХ1 - промотор алкогольоксидазы 1 из

дрожжей У-171: пшГ - сигнальный пептид а-МР. АОХ1егт - терминатор гена алкогольоксидазы из дрожжей У-121 АрЯ - ген Р-лактамазы. Карта плазмнды рРН93-Н184-АОХ1. 11134 - ген гистидинол дегидрогеназы с собственной регуляторной областью из штамма У-727. АОХ1 - промотор алкогольоксидазы 1 из дрожжей У-727; АОХЦегт -терминатор гена АОХ1 из дрожжей У-727. АрЯ - ген Р-лактамазы.

Оба указанных вектора предполагают возможность замены промоторных элементов и клонирования целевого гена в одно действие. Особенностью вектора Ту-1111АЗ-АОХ1 является упрощенная селекция и повышенный выход многокопийных интегрантов.

8. Оптимизация протокола трансформации

Исходя из известных данных, наиболее эффективным методом трансформации метилотрофных дрожжей является метод электропорации. В ходе проделанной работы для проведения трансформации штамма К. кигктапп успешно использовались протоколы, разработанные для штаммов К. Для получения более высокого выхода трансформантов,

была проведена оптимизация протокола электропорации для штамма У-727.

С этой целью были выбраны ключевые вариабельные параметры: плотность культуры, буфер для инкубации клеток, напряжение импульса электрического разряда (табл.4). В результате сочетания данных параметров было испытано 18 вариантов протоколов.

А.

В.

Таблица 4. Вариабельные параметры электропорации

ог>4М Буферы для инкубации Напряжение импульса

1,0 A: [YPD; 0,2М HEPES; 25mM DTT ; рН 8 0] 1.5 kV

1,5 В: [10шМ bicine-NaOH, 3% (v/v) ethylene glycol, 5% (v/v) DMSO, 1M Sorbitol, lOOmMDTT, pH 8.3] 2.0 kV

2,5 C: [10 mM Tris-HCl, lOOmM LiOAc, 0.6M Sorbitol, 10 шМ DTT, PH7.51

Штамм У-727Ы54Д использовали в качестве модельного штамма для трансформации линеаризованным фрагментом базового вектора рРН93-Н154-АОХ1. Отбор трансформантов проводили на чашках с минимальной агаризованной средой УМВ. Учитывая, что для каждого протокола было использовано одинаковое количестви клеток и равное количество трансформирующей ДНК, по количеству колоний на чашке можно было оценивать эффективность каждого протокола.

В результате проведенного эксперимента было установлено, что самый высокий выход трансформантов - Зх102/(1 мкг ДНК) получили при оптической плотности культуры до ООбоо=1,5, использовании для инкубации буфера С и напряжении импульса 1,5 кВ.

Таким образом, в результате проведенных исследований был получен набор ауксотрофных производных штамма К. киг£тапИ У727, для которых были оптимизированы условия трансформации, а также набор оригинальных базовых векторов, содержавших регуляторные элементы и селективные маркерные гены, комплементировавшие соответствующие ауксотрофные мутации реципиентных штаммов. В совокупности указанные элементы образовали оригинальную систему экспрессии на базе метилотрофных дрожжей А'. киттапИ.

8. Получение и оценка эффективности штамма К.киПгтапи У-7271ш4А/рРН93-АОХ1у-727-Н8А - продуцента человеческого сывороточного альбумина

Для оценки секреторных возможностей штамма новой системы экспрессии были сконструированы 2 штамма-продуцента рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина: на основе штамма К.кигИтапи У-727 и 7/ 08115, в качестве контрольного.

Были созданы 2 идентичные генетические конструкции, на основе базового вектора рРН93-Н154-АОХ1, включающие ген Н8А, находящийся под контролем эндогенного для каждого штамма промотора АОХ1. Для обеспечения секреции альбумина в культуральную среду, ген искусственного лидерного пептида (аминокислотный состав: МНЬЫХЫХЬЬРААЬС) и ген альбумина клонировали в одну рамку считывания.

Для качественной оценки продукции альбумина использовали электрофорез в полиакриамидном геле культуральных жидкостей штаммов продуцентов в денатурирующих

условиях. Для количественной оценки продуцируемого белка использовали метод иммуноферментного анализа (ИФА) на твердой подложке.

Клетки штаммов-продуцентов выращивали в течение 68 часов на богатой среде YPgM, с метанольной индукцией (0,5% v/v), после чего анализировали уровень продукции HSA в культуральной жидкости.

На рис. 12 представлена электрофореграмма образцов культуральных жидкостей двух клонов каждого из продуцентов на основе K.kurtzmanii Y-727his4Ä и K.pfaffii GS 115.

К. -j 2 3 4 Рисунок 12. Электрофореграмма образцов культуральных жидкостей каждого из

продуцентов альбумина на основе K.kurtzmanii Y-727his4Ä и K.pfaffii GS115. ш ™ т. Стрелкой указан сигнал, соответствующий молекулярной массе человеческого

^ . сывороточного альбумина (-67 кДа)

щ (1,2) - K.kurtzmanii Y-727his4A-HSA; (3,4) - K.pfaffii GS115-HSA

Для ИФА использовали стандартный набор Albumin, Human, BioAssay ELISA Kit (производства United States Biological, США).

Выход целевого белка составил 41,12 +/-0,8 мг/л культуральной жидкости или 1,93 +/-0,2 мг/ое для штамма К. kurtzmanii Y-727his4A, и 41,19 +/-1,4 мг/л культуральной жидкости или 1,38 +/-0,1 мг/ое для контрольного штамма K.pfaffii GS 115 (рис. 13, табл. 5).

Продукция HSA, мг/л КЖ

.

Г........- 1

:

ж Y727 SSGS115

мг/л

Продукция HSA, мг/1 o.e.

.........................г...............................................

и ■

| I

I ■ ■................

мг /1 o.e.

■ Y727 SGS115

Рисунок 13. А. Продукция сывороточного альбумина (Н8А), нормированная на объем культуральной жидкости. По вертикальной оси — количество I ¡Я А в мг на 1 л культуральной жидкости. В. Продукция сывороточного альбумина НЭА, нормированная на единицу оптической плотности. По вертикальной оси -количество Н$А в мг на единицу оптической плотности культуры (00=1 при Х=600нм). Планками отображено стандартное отклонение, рассчитанное по результатам измерений продукции у двух клонов.

Таблица 5. Продуктивность штаммов

Штаммы Продуктивность HS А

Y-727his4A Среднее мг/л мг / 1 o.e.

41,105 1,925

Ст.отк7. 0.8 0.2

GSI15 Среднее 41,185 1,375

Ст. отк.1. IJ 0.1

Данные, представленные в таблице 5 и на рис.13 (А,В), свидетельствуют об одинаковой продуктивности обоих штаммов. Однако, учитывая замедленный рост штамма Y-727 в условиях метанольной индукции (рис. 3), его удельные показатели продуктивности оказались выше.

Таким образом использование в качестве модельного белка рекомбинантного сывороточного альбумина позволило показать, что абсолютная и удельная продуктивность продуцентов на основе штамма К. kurtzmanii Y727 не уступает продуктивности штаммов сравнения, сконструированных на основе K.pfaffii GS115.

Для оценки эффективности системы экспрессии в условиях ферментации при повышенной плотности было проведено культивирование сконструированных штаммов в биореакторе. В качестве модельных были выбраны условия культивирования, разработанные ранее во ФГУП «ГосНИИгенетика» для обеспечения биосинтеза спидроина в клетках штамма K.pfaffii GS 115 (В.Г. Богуш и A.B. Глазунов, неопубл. рез). Ферментация обоих штаммов проводилась параллельно с использованием одинаковых параметров. Накопление биомассы на первой стадии проводили на среде с глицерином (54 часа), затем включали подпитку метанолом для индукции промотора АОХ1. Результаты анализа образцов культуральной жидкости обоих штаммов приведены на рис.14.

1234 5678 «¡st« 9 10 11 12 13 " 15 iS

Рисунок 14. Электрофореграмма образцов культуральной жидкости штаммов К. киг11тапи У727 (с двумя копиями гена НвА) и К. р[и}!И (¡4115 (с одной копией гена НN \ ] - продуцентов НвА. Нечетные дор. -образцы штамма ОБ 115, четные - ¥727. Продолжительность культивирования (ч): 54,5 (1 и 2); 71,5 (3 и 4); 78,5 (5 и 6); 95,5 (7 и В); 102,5 (9 и 10); 121,5 (11 и 12) 142,5 (13 и 14) 168,5 (15 и 16). На дорожки наносили 5 мкл (1-8) и 1 мкл (916) культуральной жидкости. Время начала индукции метанолом - 54,5 ч с начала ферментации.

Полученные данные показали, что биосинтез альбумина в клетках штамма К. кигИтапИ У121 начинался раньше, чем в клетках контрольного штамма (сигналы на дорожке №2,4 более интенсивные по сравнению с сигналами на дорожках №1,3), однако достигнутый уровень продукции оказался сопоставим. Согласно данным денситометрического анализа содержание альбумина в образцах культуральной жидкости обоих штаммов достигало 2 - 2,2 г/л. Плотности культур в ходе эксперимента достигали величин 00«н1~300-400.

9. Получение и оценка эффективности продуцента внутриклеточного белка поверхностного антигена вируса гепатита В (НВзА§)

Известно, что штамм К. р/аЛГй 05115 использовался как реципиент для создания продуцента внутриклеточного НВ5А§. Поэтому, аналогично, для оценки штамма К. кигЕтапИ У-727 в качестве продуцента внутриклеточного рекомбинантного белка, было решено создать 2 продуцента поверхностного антигена вируса гепатита - на основе К. кигКтапИ У-727Ыз4Д и, в качестве контроля, на основе штамма К. р/с$и ОБ115.

Для создание продуцентов НВзА§ были сконструированы 2 плазмиды, в которых ген HbsAg находился под контролем эндогенных промоторов А0Х1 из штаммов К. кигйтапИ У-727 и К. р/а$И 05115 соответственно. В результате трансформации и отбора трансформантов получили 2 штамма-продуцента HBsAg на основе К. киПгтапи У-7271ш4Д и К. р/а(р1 ОБ! 15.

Клетки штаммов выращивали на среде YPgM в течение 72 часов с метанольной индукцией, после чего анализировали содержание рекомбинантного HBsAg в клеточных лизатах культур.

Для определения уровня продукции использовали метод иммуноферментного анализа на твердой подложке. Из данных, приведенных на рис.15 видно, что продукция поверхностного антигена вируса гепатита В одинакова у обоих сравниваемых штаммах в пределах погрешности измерения.

120 100

Продукция НВбАё, мкг/100 о.е.

1---------------- т

т

Ш

шт

к У727 65115

мкг /100 о.е.

У-727Ы544

05115

Среднее

Ст.откл.

Среднее

Ст. откл.

Продукция НВэАд

мкг / 100 о.е.

89,15

88,95

Рисунок 15. Продукции НВвАй, нормированная на 100 оптических единиц (О!)..,,.!

Из полученных данных видно, что штамм К. кигктапИ У-727Ыз4Д может обеспечивать сравнимый со штаммом К. р/а/А1 05115 уровень синтеза и внутриклеточного накопления рекомбинантного HBsAg.

10. Получение и оценка эффективности продуцента рекомбинантного эндотелиального фактора роста (УЕОР)

Для того чтобы исследовать возможность использования новой системы экспресиии для получения биологически активных белков сложной природы в качестве модели был выбран эндотелиальный фактор роста человека (УЕОР), представляющий собой дисульфид-связанный гомодимерный белок.

Для создания продуцента VEGF на основе штамма Y-727 был синтезирован искусственный ген VEGFnib, с одной аминокислотной заменой (Asn75->GIn), т.к. в 77-ом положении следует треонин, что явилось бы сигналом нежелательного N-гликозилирования Asn75. Лидерный пептид a-MF был клонирован в одну рамку считывания с геном VEGFmb, что обеспечивало секрецию рекомбинантного ростового фактора в культуральную жидкость. Для регуляции экспрессии целевого гена использовали эндогенный промотор АОХ1.

В результате трансформации штамма Y-727ura3muthis4A получили штамм-продуцент VEGFmb: К. kurtzmanii Y-727/pINT-AOXlY-727-VEGF,,ib

Клетки штаммов-продуцентов выращивали в колбах со средой YPgM с метанольной индукцией, после чего анализировали уровень продукции VEGF в культуральной жидкости.

Для подтверждения экспрессии гена VEGFmb в клетках К.kurtzmanii Y-727 и секреции продукта в культуральную жидкость - образцы культуральной жидкости анализировали с помощью электрофореза, в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях, а также с помощью вестерн блота (рис. 14 А,Б,В,Г). При этом, судя по сигналу на электрофореграмме, секретируемый VEGF mb образовывал гомодимер в невосстанавливающих условиях (рис. 14 Б,Г).

Рисунок 16 А. Электрофореграмма культуральной жидкости К. киПттапИ V 727/р1!ЧТ ЛО\К \ К<,К,];Ь в восстанавливающих условиях. Б. Электрофореграмма культуральной жидкости К. киПгтапИ V 727/р1\Т \Т (,|1; Ь в невосстанавливающих условиях. В. Вестерн блот образцов культуральной

жидкости двух клонов А. кигИтапи У-727/рI\Т ЛОХ 1 у \К(;К]ПЬ в невосстанавливающих условиях. Г. Вестерн блот образцов культуральной жидкости двух клонов К. киНтьапй У"27р1 VI Л()\ 1 у -;-Л К( Л - Ь в восстанавливающих условиях

Данные, представленные на рис. 16 подтверждают димеризацию секретируемого УЕСРщЬ.

На основе опубликованных данных была разработана методика очистки, основанная на двухстадийной хроматографии. Первая стадия представляла собой афинную хроматографию осветленной культуральной жидкости на сорбенте №-ЫТА, и основана на специфическом связывании рекомбинантного УЕСРшЬ с матрицей за счет наличия в самой структуре белка двух следующих друг за другом аминокислотных остатков гистидина, в 11-ом и 12-ом положении. Вторая стадия очистки состояла в обесоливании препарата на сорбенте БерЬаскх 25 (колонка СО-

10), полученного после первой стадии. На электрофореграмме (рис. 17) представлены результаты данной методики очистки.

Рисунок 17. Электрофореграмма образцов VEGFmb после выделения. 1.

Образец VEGFmb после очистки на Ni-NTA агарозе. 2. Образец VEGF|Ub после обессоливания, с буфере PBS.

Для проверки биологической активности выделенного белка, образцы УЕОРщЬ были протестированы в институте Общей Генетики РАН (под руководством С.Л. Киселева) на формирование капилляроподобных структур. Опыт проводился на клеточной линии НиУЕС (человеческие эндотелиальные клетки), на матригеле. В качестве положительного контроля использовался препарат УБвР^а (1ттйт^еп). Было показано, что исследуемый образец поддерживает формирование сосудов с чуть большей эффективностью в сравнении с контрольным образцом.

Таким образом, можно сделать вывод, что в данной модельной системе выделенный УЕОРщЬ обладает биологической активностью. При этом, продукция данного ростового фактора составляет приблизительно 45 мг на 1 литр культуральной жидкости, при культивировании в колбах на богатой среде.

12. Альтернативная индукция формиатом

Как уже было сказано во введении, одним из существенных недостатков экспрессионной системы, основанной на метилотрофных дрожжах, является необходимость использования токсичного и огнеопасного метанола для индукции промотора АОХ1. Данное обстоятельство особенно важно в условиях биотехнологического производства, где при соблюдении норм Российского законодательства, использование метанола практически становится невозможным.

В свете данной проблемы были проведены поиски альтернативного индуктора, способного заменить метанол. Одним из таких индукторов оказалась соль муравьиной кислоты. Было сделано предположение, что являясь последним интермедиатом в метаболическом пути диссимиляции метанола, часть данного субстрата может быть восстановлена до метанола ферментами Р1Х> и АОХ, по аналогии с процессом метаногенеза, и вызвать индукцию промотора АОХ1.

Для проверки гипотезы провели опыт с использованием двух штаммов К. киПгтапи 727/рШТ-АОХ1у-727-Ьасг и К.р/а//и 115/рГЧТ-АОХ 1С8115-1 ас/ с интегрированным репортерным геном 1ас2, находящимся под контролем промотора АОХ1. Клетки штаммов были

выращены до середины логарифмической фазы на средах: YP - без добавления субстрата; YPKOForm - содержащей 1,5% (m/v) формиата калия; YPM - содержащей 1% (v/v) метанол. Была измерена активность ß-галактозидазы в клеточных лизатах культур (рис. 18).

Активность lacZ, ME АОХ1 activity in Miller Units

3500 YP YP+Potass.formate YP+MetOH

3000 2500 2000 1500 ü 1.5% 1%

___________ ■s Р Y727his4û 2785 3481 3395

в Ш SM 2693 3379 3231

BS а S115 Среднее 2739 3430 3313

в .................. р ш Ст.откл. 65,1 72,1 116,0

500 is* I щ 760 2184 3649

* » 16,1» GS115 653 2229 3418

YP YP+Potass.formate YP+MetOH 1% Среднее 706,5 2206,5 3533,5

1.5% Ст. откл. 75,7 31,8 163,3

Рисунок 18. Активность бета-галактозидазы, измеренная лизате клеткок К. киЮтапи У-727/рШТ-АОХ1у.727-Ьасг и K.pfaffu С5115/рШТ-АОХ1ся115-Ьасг. По вертикальной оси - шкала активности в Миллеровых единицах. На диаграмме планками отображено стандартное отклонение по результатам измерения активности у двух клонов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что формиат может является индуктором промотора АОХ1, причем уровень индукции составляет примерно 80-100% от уровня метанольной индукции. Формиат окисляется на последнем этапе диссимиляции метанола, ИАВ-зависимой формиатдегидрогеназой, с образованием углекислого газа и 1 эквивалента ЫАОН. Таким образом, можно предположить, что формиат не является выгодным источником энергиии, при этом, по имеющимся на сегодняшний день данным, формиат вряд ли может быть непосредственным источником углерода, поскольку является конечным метаболитом в цепочке диссимиляции метанола. Однако, проведенный опыт по росту клеток К.киПтгапи Ч-1Т1 а также Кр/аДИ С8115 на минимальной агаризованной среде с формиатом калия, как единственным источником углерода (энергии), показал возможность поддержания медленного роста.

13. Изучение механизма индукции промотора АОХ1

Полученные данные об индукции промотора АОХ1 формиатом дают основания предполагать, что какое-то количество метанола может образовываться в клетке из формиата, который затем индуцирует промотор АОХ1; либо, присутствие какого-то промежуточного метаболита, являющегося непосредственным индуктором промотора АОХ1. Для подтверждения гипотезы о том, что сам метанол является индуктором промотора АОХ1 было предложено делетировать ген ИЬО (формальдегид дегидрогеназы). Таким образом, метаболический путь утилизации метанола должен прерваться, исключая возможность синтеза метанола в клетке из добавленного формиата. Соответственно, при добавлении формиата промотор АОХ1 должен быть в неиндуцированном состоянии, а при добавлении метанола промотор АОХ1 должен быть индуцирован.

Для получения более достоверных данных опыт проводили на клетках двух штаммов K.kurtzmanii У-1X1 а также K.pfaffii GS 115. Чтобы получить мутантные штаммы, были сконструированы 2 плазмиды: pINT-fldA-AOXlY-727-LacZ и pINT-fIdA-AOXlV-727-LacZ, содержащие репортерный ген lacZ, линеаризованные фрагменты которых замещали ген FLD при трансформации штаммов реципиентов K.kurtzmanii Y-727 и K.pfaffii GS115.

В результате трансформации штаммов-реципиентов K.kurtzmanii Y-727his4A и K.pfaffii GS115 линеаризованными фрагментами плазмид получили модифицированные штаммы К. kurtzmanii Y-727/fldA-AOX 1 v_727-LacZ и K.pfaffii GS115/fldA-AOXlCSii5-LacZ, в которых ген FLD делетирован и замещен линеаризованным фрагментом плазмиды pINT-fldA-AOXlY-727/GSH5-lacZ.

В полученных модифицированных штаммах экспрессия гена lacZ регулируется промотором АОХ1. Для проверки активности промотора АОХ1 в данных штаммах с делетированным FLD, клетки штаммов были выращены на средах: YP - без добавления субстрата; YPM - содержащей 1% (v/v) метанол; YPKOForm - содержащей 1,5% (m/v) формиата калия. Ожидалось, что при росте на формиате промотор АОХ1 не будет активирован. Была измерена активность бета-галактозидазы в клеточных лизатах культур (рис.19).

7000 6000 5000 4000 3000 2000 Активность lacZ, ME АОХ1 activity in Miller Units

Y727his4A YP YP+MetOH 1% YP+Potass.formate 1.5%

г в

« 2074 3456 5839

Р __________ Среднее 2060,5 3664,5 5781

Ст.откл. 19,1 294,9

I- Ш - GS11S 600 2344 1956

0 в в 1 642 2170 1808

YPM YPF Среднее 621 2257 1882

Ст. откл. 29,7 123,0 104,7

Рисунок 19. Активность бета-галактозидазы, измеренная лизате клеткок К. kurtzmanii Y-727fldA-AOXlY-727-LacZ и K.pfaffii G S115/fl d А -А О XI Gs,, 1. а с 7. По вертикальной оси - шкала активности в Миллеровых единицах. На диаграмме планками отображено стандартное отклонение по результатам измерения активности у двух клонов.

Выяснилось, что делеция гена FLD в дрожжах вида K.kurtzmanii Y-727 и K.pfaffii (OS 115) оказывает влияние на регуляцию ферментов метаболического пути метанола. Как видно из данных, представленных на рис.18 и 19, существенно возрастает уровень индукции промотора АОХ, как при метанольной, так и при формиатной индукции. При этом, в случае добавления формиата, уровень индукции АОХ промотора возрастает примерно в 2 раза от уровня индукции в штамме с нативным FLD. Данные результаты дают основание полагать, что в клетках метилотрофных дрожжей существует альтернативный, неспецифический путь восстановления формиата до метанола, кроме уже известного. Либо существует промежуточный метаболит, который является непосредственным индуктором промотора АОХ1.

ВЫВОДЫ:

1. Классифицирован и изучен новый вид метилотрофных дрожжей К. кигктапп ВКПМ У-121.

2. Разработана новая система экспрессии на основе нового вида метилотрофных дрожжей К. киПгтапи ВКПМ У-121, включающая ауксотрофные штаммы производные У-121, оригинальные экспрессионные вектора с элементной базой из штамма У-121.

3. Показана эффективность данной системы на модельных штаммах-продуцентах: Р-галактозидазы, инулазы; человеческого сывороточного альбумина, поверхностного антигена вируса гепатита В (НВ5Лс), человеческого сосудисто-эндотелиального фактора роста (УЕОРщЬ).

4. Найден альтернативный метанолу безопасный и дешевый индуктор промотора АОХ1 - соль муравьиной кислоты. Показано, что в клетках дрожжей К.кигСтапИ 4-121 и К.р/а^и 08115 формиат калия обеспечивает практически такой же уровень активации промотора А0Х1, как и метанол.

5. Показано влияние делеции гена Ы,П на регуляцию ферментов метаболического пути метанола.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Патент РФ №2489481 от 10.08.2013. Способ получения белка медицинского назначения E7-HSP70 и штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae для его осуществления. Козлов Д.Г., Чеперегин С.Э., Губайдуллин И.И., Ефремов Б.Д., Тюрин О.В., Залунин И.А.

2. Патент РФ № 2502805 от 27.12.2013. Способ микробиологического синтеза целевого секретируемого белка в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Козлов Д.Г., Молчанова Д.В., Губайдуллин И.И., Чеперегин С.Э., Ефремов Б Д., Тюрин О.В.

3. Tyurin О.V., Gubaydullin I.I., Cheperegin S.E., Efremov B.D., Kozlov D.G. (2013). Amplification of leader proregions as a mean to increase the secretion of antibody fragments in the Pichia pastoris yeast. Applied Biochemistry and Microbiology, 49(7): pp 656-659.

4. Патент РФ №2522479 от 20.05.2014. Применение штамма дрожжей Komagataella pastoris в качестве реципиента для конструирования продуцентов целевого белка. Тюрин О.В., Козлов Д.Г., Чеперегин С.Э., Губайдуллин И.И., Ефремов Б.Д, Клебанов Ф.А.

5. Gennadi I. Naumov, Elena S. Naumova, Oleg V. Tyurin, Dmitry G. Kozlov. (2013) Komagataella kurtzmanii sp. nov., a new sibling species of Komagataella (Pichia) pastoris based on multigene sequence analysis. Antonie van Leeuwenhoek (2013) 104:339-347.

6. Tyurin O, Gubaidullin I, Cheperegin S, Efremov B, Naumov G, Naumova E, Kozlov D (2013). The new expression system based on a novel yeast species of the genus Komagataella // 38-th FEBS Congress, 2013, p.256, Saint-Petersburg

7. Tyurin O, Kozlov D. Novel inductor for the promoters of the methanol utilization pathway // Supplement: Abstract of the 26th International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, 2013, p. S211, Frankfurt

Подписано в печать:

22.10.2014

Заказ № 10320 Тираж - 50 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 \vww.autoreferat. ги