Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и экспрессия гетерологичных генов в Hansenula Polymorpha

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и экспрессия гетерологичных генов в Hansenula Polymorpha"

МОСКОВСКИЙ ОРДИНА ЛЕНИНА. ОРДЕНА. ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М-ВЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

АПРИКЯН ПАВЕЛ ГУРПЕЕГОВИЯ

УДК 577.21

КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕТЕРОЛОПИНЬЕ ГЕНОВ В нанбениа рос-шовена

оз.оо.оз,- Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических ваук

Москва - 1992г.

Работа выполнена в Центре "Биоинженария" РАН

Научные руководители: член-корр.ВАСХННЛ, профессор

К.Г.Скрябин

кандидат биологических наук М.А.Зльдаров

Официальные оппонента: доктор биологических наук

И.И.Голсторуков

кандидат биологических наук

А.Б.Циомвнко

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики АН СССР.

заседании; Специализированного совета Д 053.05.07 прк Московской Государственном Университете им М.В.Ломоносова но адресу: ГСП 119899, Москва, В-234, Ленинские горы, МГУ, корпус "А", к.535

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке • Биологического факультета МГУ.

Защита состоится

Автореферат

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук

Б.Н.Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Метилотрофные дрогски родов Hansenula и Pichia, наряду с дрсякаш-сахаромицетами, стаж в последнее время одним из наиболее перспективных объектов, биотехнологии и генетической инженерии. Разработка систем молекулярного клонирования и экспрессии генов для этих микроорганизмов ■ПОЗВОЛИЛИ создать штаммы Н. polymorphs; И P. pastor is - продуценты поверхностного антигена вируса гепатита В человека, сывороточного альбумина, глюкоамилазы ИЗ Schvannlomyces occidental is И МНОГИХ других рекомбинантных биологически активных полипептидов (Janowicz Z.A. , 13В&, Callissen G. , 1990, M.A.Hodgklns at al., 1990]. Преимущества метилотрофных дрозае® как продуцентов чужеродных белков определяются рядом обстоятельств, в том числе простотой культивирования рекомбинантннх штаммов на дешевых питательных средах, большим выходом биомассы и высоким уровнем экспрессии гетерслогичных генов, обеспечиваемым сильными регулируешь®. промотсраш генов утилизации метанола •:.'.етанол-оксвдаза, фэряштдегидрогеназа и другие). Сушествешшм ~"ягется таяке тег факт, что меткпотрейзне дрожки способны ^ех-гивно езктотировать гетерологжчнне бедки и правильно стдетшиь зуяетоднн© сигнальные пептиды { Janowtcz Z.a. , leso ¡.

Ornoчекнне особенности мекистрофных зрэдостаБ.чяет

трзхраснуя аозтягость создания, на их основе, новых этшюв-тгссд^щоито'? »«юсе практичесю! звхкпнх белтшв, как гор'оан, '.онруенчэ алгитзиа я т.д., з. шею исследования зз1£0зшсрисстей как биоеннггоа, так а секреций гзтарологичЕых. белков. Цель и зэяачи исследования заалшажсь в создании универсальных кассет экспрессия гетерологнчннх генов з метЕпотрофных дроисхах рода Hansenula polymorphs., Подборе ЕЙбэкТЕЕВСЙ СЖС-ТеШ Eeicrop-xcsOTH, зсслэдоваяии закономерностей биосинтеза и секреции гормона роста человека (СТГ), а гага® закономерности бяоезяхаза основного и среднего поверхностных бэлкез {ОПВ к. СПБ) вируса гепатита 3 человека. Для этого необходимо:

- злгт'&та .тг.гжпг'а-Е^т:1 яжзеету да? зжвз&зеяв тгереж^чгггх гвкез чсгшьсу^ 5' i з* ^щавяругес® области хеш «етаашзаейцагн (ЧОХ) к. poivrerpí)^ ! i:;:c3j;po3AKTi з jiaíocsropEi ниги-Е пукерэт

- клонировать ген гормона роста человека под контроль промоторяой и тершнаторной областей гена МОХ и сигнальной последовательности секреции гена iiFcri, полового феромона дрожжей s.cerevtsiae и на ее основе получить вектор для трансформации дрожжей н.polymorphs;

- клонировать гена СИВ и СЛБ вируса нв/ под контроль промогорной и терминаторнай областей гена МОХ и на их основе получить автономно. реплицируидаеся и интегративные- -вектора для трансформации дромив Н.polymorphs;

- получить стаЯиьнне транаЗорманга, продуцнруидае гормон роста человека и поверхностные антигены вируса hbv;

- изучить с помощью получениях платил закономерности экспрессии гетерологичных генов в метипотрофннх. дрожках рода H.poiynorpha.

Научная новизна и практическая значимость. На основе клонированных регулеторных последовательностей гэна МОХ создана универсальная векторная молекула для клонирования и экспрессии гетерсшогшных геноз в метилотрофных дрокхах рода н.polymorphs. Получен рекомбинантный штамм н. polymorphs эффективно секретируицай СТГ шд контролем МОХ промотора и сигнальной последовательности гена uf«i s.cerevisiae. Показано,- что использование препроноследовательносгь гена aF обеспечивает секрецию более 90% экспрессируемого белка. Получены реКОМбИНаНТННе ШТаМШ H.polymorpha Экслрессирущие S И preS2-S антигены вируса гепатита В. Показано, что использование фрагмента митохондриальной ДНК c.utilis способствует процессу интеграции плазмвдной ДНК, но не обеспечивает ее мультимеризацию, как было отмечено в (Икономова Р.Н., 1987). В штамме н.polymorphs Dil показано наличие, по крайней мере пяти хромосом, а также хромосомная локализация генов мох, das и his3.

Результаты работы могут слухнть основой для создания промышленных штаммов эффективно экспрессируюцих и секретирушщх целый ряд важных для медицины белков, а также детального изучения структуры и организации генома метилотрофных дрожжей '.рода

H.polymorpha..

Апробация работы- Материалы диссертации были представлении на Всесоюзных конференциях "Новые напревления биотехнологаи", Пущино, 1990, на IV Школе-семинаре "Перспективные направления молекулярной биологив", Юрмала,- 1990, на Международном симпозиуме

Golden Jubilee Symposium, India, 1991, на НаучНОМ коллоквиуме Инженерного центра "Биоинженерия", Москва, 1991. Структура я объем диссертации. Диссертация состоит из введения и трех глав: обзор литературы, материалы и метода, результаты и

I. Конструирование исходных векторов для клонирования гетерологичных генов под контроль регуляторных элементов Гена МОХ Н.ро1утогрЬа

Для создания системы экспрессии гетерологичных генов в метилотрофннх дрожках н.ро1утюгрЬа ш использовали клонированный в лаборатории низших эукариот (НПО "Биотехнология") ген мох, с 5' и 3' фланкирующими областями, а также ппазмидную ДНК р1.з содержащую маркер ауксотрофности 1еи2 и фрагмент митохондриальной ДНК с. иШ1а. В плазмидной ДНК, несущей ген МОХ делетировали структурную часть гена. В результате получены плазмидная ДНК рдмдш содержащая атс-кодон гена МОХ за которым следует сайт для рестрикционнай зндонуклеазы есонг ( атсссссссааттс ) и плазмидная ДНК рдмддтс с делетированным атс кодоном <атсссааттс). На месте структурной части гена МОХ, в илазмиде рлмдй1 встраивали синтетический полилинкер содержащий три уникальных рестрикцконных сайта и три стои-кодона в трех рамках считывания. Полученная плазмида обозначенная рМ0Х1 представлена на рис. 1.

обсуждение. Она изложена на страницах, содержит рисунков и библиографический список из названий.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

TTGAATTCGGTACCCCGGATCCTAATTAATTAA СТ TAAGCG4TGGGGCCTAGG AT ТААТ ТААТ TCTAG

Рис- ь. Схема рекомби-нантной плазмиды pMOXi несущей промоторную и терминаторную области гена МОХ дрогшей

H.polymorpha.

3'tMOX

EcoRV

H-Sacl

PUC19 delRI

пл. Конструирование вектора для экспрессии / секрета: гормона роста человека i hgh)

Согласно ЛИТературННМ данным (Janowicz Z.A., 19es) prepro последовательность гена MFal S.cerevisiae может служить эффективным лидерннм пептвдом для секреции гетерологичных белков в метилотрофшх дрожжах.

.Используя prepro-сегмент гена MFai, клонированного в нашей лаборатории (И.В.Каршчев, яанд.дисс. М. 1990) и ген hGH , на основе плазмиды paWAATG сконструирована плазмида рМаН, несущая ген hGH с пришитым к нему ргерого- сегментом гена MFai под контролем промотора гена метанолоксидазы. Полученную кассету экспрессии встраивали в илазшщу рьз несущую в качестве области начала репликации фрагмент митохондриальной ДНК с.utilis. Полученная плазмвда обозначена рНРа.ч (рис. 2а). Использование плазмиды pL3 объясняется тем, что согласно [Икономова Р-Н., 1937!, фрагмент митохондриальной ДНК c.uttHs обуславливает как автономную репликация, так и мультимерную интеграцию плазшк несущих этот фрагмент в трансформантах метилотрошкх дроажей.

II.2. Экспрессии/секреции гормона роста человека (СТГ) штаммам: н.polymorphs 1В-НР8 и du трансформированными рекомбшантно?.

. Ш1ЕЗМИД0Й рНРа.ч

Плазмидой рНРсгН Трансф0р;,шрэвали штаммы Н. polymorphs

DL1 (leu I и Н. polymorpha 1В-НР8(leu , ига , ade ). Среди

полученных трансформантов были как крупные, так и мелкие колонии, анализ которых на митотическую стабильность, после 48 часов роста в неселективных условиях показал, что крупные колонии обладав? юог-ной митотичесхой стабильностью, в то время как все мелкие имеют стабильность от 0,5 до 1 %■ Крупные колонии, обладающие близкой к 10QS митотической стабильность», стабилизировались после двух-трег пересевоЕ, тогда как мелкие, как правило, теряли приобретенный ieu+ фенотип.

Secretin cf ñGh' by Rpctyracrpba

/_______________j ?-,;c- a.Oxs.v.a зекторз

____ __ : orceirpeocini / секреток

___ i гсрлснг раста человека

__| Е-Кризая HiKCHJIS-

* ' ra ьсн в культ1-оальноЛ s Vk.4с голе

Псскслъ;;у пгзей задачей Сило получение стгоядькогэ ¡jt&&'¿. трсдуикрукг.?го с:т, r сзтькезпеи f-ш iicrroj&ccBajr» только хеуккие

Храасзгот^акты зктжшзгля ч совде mvis метгкол к опссдедядв налячяе годасягг госта в культуральни средах кггодсн ЖЛУЕОФЗРЖЗТЕОГО 23aJ3!32 U2USA) tCoastra V>. 1931 } 4Sp63 3 суток после жскулявпа. Результата акаякга проведенного среди Солез чем £0 atiero r.na яокагаля, что трансформгити чтйжг

и.роlyaorpha olí пекгзцзав? уровень секрешш на порядок визе тсанссссржнтов атгдаа к.polymorphs 1B-HF8, л составляют or 0,5 до ? мг бедка на .ткгр культуры ; таблица I) - Исходя из зтсгз ■ е дальнсйвем мы использовали траксфоркетн жгсгзаа H.poiyaorphs si:.

Известно, i то концентрация и чсточенк а углэрода з срело роста могут oí'зачзать сусесгзевпоо злиште ira уровень свкропкн балхов КЛеТК.'-ГЛ: дрсзгзй • ! lehikaw» К., 1923!. Б отоЗ сзязх мн

предприняли допнтку оптимизировать условия культивирования полученного ¡паша-продуцента, используя в качестве субстратов роста метанол и глицерин, не подавляющие транскрипцию гена' МОХ [ Подгорский В. С., 1982 ).

Трансформаций выращивали в среде урв/зх глицерин в течение 1 -1,5 суток, после чего в растущие культуры вносили метанол до 1 %. Через каждые 24 часа отбирали пробы. для определения количества секретаруеыого ьсн (как в среде, так и внутри клеток).

• Результаты проведенного анализа представлены в таблице I и на рисунке 2В. ■

Из „ данных, представленных в таблице I и на рисунке 2В следует, что наиболее оптимальными для экспрессии условиями является рост при 37°С в течении 5 суток на среде УРЦ, содержащей зй глицерина и 1% иетанола.

Штампы условия экспрессия количество иен ! клетки : среда !

1В-НР8 УРБ/ 1% ке-танол 0,050-0,1 КГ/Л !

урю/з* глицерин/1 х метанол 0,1-0,2 мг/л !

Б1Л урв/ п метанол 0,050мг/Л 0,5-1МГ/л !

урю/35 глицерин/« мэтаяол 0,5-1мг/л 40-60МГ/л ! !

Таблица I. Экспрессия/секреция СТГ штаммамм н.ро1ушэгрЬа щ.1 и 1в-нр8 трансформированным кассетой экспрессии рНРаН. (В таблице представленны усредненные данные, полученные от нескольких независимых клонов).

и.з. Исследование состояния трансформированной плазмвдкой ДНК в реКОМбИНаНТНСИ ШТаШв Н.ро1утэгрЬа БИ (рНРаН).

На рисунке з(А) представлены результаты гибридизации по Саузерну препаратов суммарной ДНК исходного и рекомбинантного штаммов, с использованием в качестве зонда меченого фрагмента Рз«-Есой1 промоториой области гена МОХ.

-б-

• Из рисунка видно, что ДНК выделенная из трансформированного нлазмидой рНРаН шюна и гияролизованная рестриктазой Есойу (дорожка 6) дает две полоса гибридизации с зондом. Одна из полос соответствует контрольной полосе в исходном, кмрансформированном штамме (дорожка 5), другая находится на уровне плазмвдного фрагмента (дорожка 12). Аналогичную картину наблюдали в случае растепления рестриктазой ЕсоМ (дорожка 1- решшиентный штамм, дорожка 2- рестрщированная ДНК шташа н.ро1утогрЬа ви (рНРаН), дорожка 9~ ресгрицировашая плазмидная ДНК).

к-

ЙКЙГ

I л

иг*

А

"\3\if-

1413121110 9 8 7 6 5 4 3 2 1

Рис. Зо^иегп-габридизащм тотальной £НК выделенной ИЗ Трансформированных КЛОНОВ Н.ро1утогрЬа, продуцирующих гормон роста челзвека (ьсн > и поверхностный антиген вируса гепатита В

(НВг-ЯАк)

Получении в разультаты, а также одинаковая интенсивность сигналов гибрадЕЗ?ЦЕН полученных как в доракэ 2, так и в дороже

6. позволяли предположить, что трансформированная плазмидная ДНК рНРаН находится в автономно реплицирующемся состоянии и при этом в одной копии. Тем hs менее, многочисленные попытки ретрансформировать в E.coii плазмиду рНРаЯ не увенчались успехом. Для получения более, четкого результата мы провели повторную гибридизацию.

На рисунке 3(В) представлен радиоавтограф результата позторной гибридизации фильтра Ц) с ник-транслированной пробой плазкиды puci9. Из рисунка видно, что при сравнении дорожек 2 (ДНК трансформанта), 9 (плазмидная ДНК), 6 (ДНК.трансформанта) и 12 (плазмидная ДНК), мы имеем совершенно различные картины гибридизации. Кроме того, дорожки 2 и 6 дают по две полосы гибридизации в отличии от дорожек 6 и 12. Учитывая это мы мокем говорить о наличии двух копий кассеты экспрессии, находящихся в интегрированном состоянии.

XI.3. Анализ hGK секретируемого/экспрессируемого штаммом-продуцентом DLl H.polymorpha (рНРаН).

Препараты культуральной среды и экстракты клеток штамма

Н.polymorphe. DLl/рНРаН И ШТаММа S.cerevlsiae 2QB12, несущего

аналогичную конструкцию под контролем промотора gapdh s.cerevlsiae, анализировали методом иммуноблотинга (рис 4).

Секретируемый штаммом H.poiymorpha иммунореактивный полипептид (дорожа 7) соответствовал по подвижности зрелому гипофизарному hGH (дорожка 1) и отличался от hGH, секретируемого s.cerevlsiae (дорожка 3). Наблюдаемые различия в молекулярных массах секретируемых рекомбинантных ьсн свидетельствуют, на наш взгляд, о правильном процессинге предшественника препро-а-фактор/hGH в клетках H.poiymorpha, в то время как в используемом штамме s.cerevlsiae, дефектном по вакуолярным протеазам, отсутствует одна из необходимых для этого активностей дгаюятндила'.вшзтеятггдазная, осуществляющая процесснгг спейсерной последовательности (Giu-Aia}2 после расщепления предшественника эндопептидазой КЕХ2 по сайту Lys-Arg. Внутри клеток Н.polymorphe И S.cerevlsiae обнаруживались МНОКесТВеННЫЧ формы ишунореактивяых полипептидов, (дорожки 2 и- 6)

-а- ■

представлявших собой, скорее всего, иктермедиаты процессшга предшественника препро-сг-фактор/hGH.

Рис. Иммуноблотинг препаратов культуральной среды и экстрактов КЛеТОК Н,ро1утогрЬа И З.сегеу1э1ае, штаммов-продуцентов ьсн. 1, 2-стандарт (гипсфизадаый ьсн), 3-лизат клеток З.сегеу1з1ае ГфОДУ-цируюцих ьсн, 4- препарат культу-ральной среды ШТаММа З.сегеу1з1ае продуцирующего ьсн, 5-лизат клеток ИСХОДНОГО ШТаКМа Н.ро1утаогрЬа 1Б1.1 I,

6-препарат культуральной среды исходного штамма шл , 7-лизат клеток н.ро1утогрЬа пял), штамма- продуцента ьсн, 8-препарат культуральной среды штамма- продуцента Ьсн

iiJirci j

iii.i. Конструирование кассеты экспрессии генов основного и среднего поверхностных белков вируса гепатита В

Для конструирования кассеты экспрессии использовали плазмиду pMOXl И плазмнду preS2,M15Sl (Арья Б. канд. дне., М.,1991). Фрагмент EcoRl-EamHi плазмиды preS2,Hi5si, содержащий средний поверхностный белок вируса гепатита В, клонировали в плазмвду pMOxi. Полученная плазвда обозначена рМНЕз (рис. 5).

Для дальнейшей работы из плазмиды pMHBs была удалена press область. Полученная при этом плазмида, несущая лишь основной поверхностный белок (S-область), была обозначена как pMHBss.

Нуклеотидная последовательность прилегающая к гену ОПБ, содержит ggg участок на расстоянии трех нуклеотидов от ATG-кодона. Известно, что подобные структуры могут снижать эффективность трансляции гетерологичной мРНК, мы удалили этот "нежелательный" участок с помощью экзояуклеазы si. в результате делеций были отобраны три плазмиды (pMHBsS, pMHBsii, рмнвз12) с теоретически оптимальной последовательностью области, прилегающей к АТС кодону (рис. 6).

Как было отмечено в и.1, плазмиду pL3 можно использовать как шатл-вектор для трансформации H.poiyaorpha. Учитывая это,

зчмск

cSad

-1_hsa-saç_i-

!

»

AA*CtAAATCC&*AT7CGôaviC ATS GAS JVC

ЛМС G»G Л/С ЕНРМйЛ ЛЛЛСААЛ ATOVC AT3 G** Л/С РНЯН6»11

I

ЛЛЛ*СААС ATQ A/Ü СНР№«12

\Sl-deJ / ЕсоИ /

XIW

PUC19 delRI

puc1s delfi!

Рис• 5- Схема конструирования плазмидной ДНК рМНБз, несущей ргеБг-э область (СПБ) вируса нву под контролем промотора гена МОХ Н.ро1утогрЬа

Рисунок Делеционше варианты ибэ-б антигена (СПБ) вируса нбу полученные в результате удаления йсй- участка, прилегающего к атс кодону б- антигена

.аналогично конструированию плазмиды рНРаН (рис. 2А), были получены плазмиды phphbss, рНРНВзИ и phphes12: в плазшшу pl3 встраивали Sall-EcoRV фрагменты содержащие ОПЗ из полученных делеционных вариантов. Полученными iua3tamaMK трансфоршзровалк Штаммы 1В-НР8 И DLl H.polymorpha.

ill.2. экспрессия hesag в трансформантах штампов 1в-нр8 и dli.

Среди трансфорлантов IB-hps и dli плазшздаш рНРНЗз5, pHPHBsi i и pHPHBsi2 отбирали крупные колошш, анализ митотической стабильности которых дал результаты аналогичные полученным в случае с гормоном роста. При этом величина митотической стабильности отдельных крупных колоний повышалась от 70-90 s до

-1С-

1005 после двух- трех пересевов.

В полученных трансформангах, имеющих 100S митотическую стабильность, после выращивания в различных условиях к разрушения, определяли уровень экспрессии ОПБ вируса гепатита В методом elisa. Результаты определения показали довольно низкое содержание экспрессируемого антигена, порядка 100-200мкг/л, независимо от условий культивирования. При зтом трансформанты штамма 1В-НР8 содержали лишь следовые количества ОПБ. Возмошой причиной низкого уровня экспрессии ОПБ моает являться неудачная структура 3' концевой области экспрессируемого гена.

К этому времени, в наией лаборатории (Арья Б. канд. дне., М.,1991) была получена шгазмвда 23/АВ-18 несущая ген ОПБ с оптимизированной структурой 3' концевой области. Используя эту плазмвду мы произвели замену 3' концевой области гена ОПБ во всех трех имеющихся конструкциях. Полученными в результате такой замены плазмвдаш,. обозначенными рНРНВзЗ,з', рНРНВаП.з*, pHPHBs 12,3' , трансформировали: ШТаММ DL1 H.polynorpha. Данные по определению уровня экспрессии ОПБ вируса гепатита В в различных трансформантах, при различных условиях культивировался, представлены в таблице II.

Штата». условия экспрессия плазивды количество ОПБ в клетках ! 3 ОПБ о? 1 тотального ¡раств.Оелпа

DL1 YPD/3% глицерин/1 % метанол pHPHBsS,3 * pHPHBsl1,3* 1000-2500мкг/л 700-1500мкг/л » ! 0,1% -! 0,2% ! 0,075

_ pHPHBsl2,3' 1000-1500МКГ/Л I 0,05У-

_ pMH14 1200?Ш7\л ! 0.15Г»

- pMHlfi 1200мкг/л i 0 ,15S !

Таблица II. Экспрессия основного поверхностного белка вируса гепатита В (НВэ-зав) штамма*® н.ро!ушогрЬа 1В-н£в и вп трансфорягоовавными плазмвдаш ?нрнвз5( п12) и рНРНВз5,з■(II,3';12,з■ ) и среднего поверхностного белка штаммом н.ро1улюгрЬа шл трансформированным плазмидами рМН14 и рмшв. (Приведенные в таблице значения являются усредненными данными иолучеными от пяти и более независимых клонов каждого типа).

Из данных таблицы II видно, что замена в 3' концевой области привела к увеличению уровня экспресслруемого белка на порядок. Однако, делеции в проыоторной области, прилегающей к атс кодону существенно не повлияли на уровень экспрессии ОПБ.

ш.з. Конструирование интегративного вектора экспрессии среднего поверхностного антигена вируса гепатита В и отбор стабильных трансфор,!антов Н.ро1утогрЬа ВЫ.

Известно, что интегративные вектора в дрожжах-сахаромзщегах имеют низкую частоту трансформации и низкую когшйность (порядка 1-2 копий), в то время как в метшютрофных дрожжах иапои1ог 2.к., 1990 ] они способны мультимеризоваться и иметь довольно высокую копийносгь, порядка восьми -и более копий на клетку.

С целью получения множественной интеграции и увеличения за счет этого выхода экспрессируемого продукта мы сконструировали вдазмиды, обозначенные рМНВгН и рМНЕз18 и отличаициеся друга от друга ориентацией маркерного гена, в качестве которого был использован ген 1еи2 S.csrevlsizs (риС. 7).

ЕссйУ ЕсоИ

о К }

!еи2

ГсоИ ЕсоКУ 0 0

РМН14

РМН13

ХЬз) „ ,, . ВаягН

Рис. 7. Схема конструирования вектора интеграции кассеты экспрессии поверхностного антигена вируса гепатита В

Трансформация рецишентного штамма ш, полученный! плазмидами, в отличие от р1.3 и ее производных привела к появлению большого числа мелких (порядка 50-100 колоний) и нескольких крупных (2-4 колонии на чашку) колоний. Определение стабильности выросших трансформантов показало, что все крупные колонии обладают ЮС» митотической стабильность по лейциновому маркеру, в то время как у мелких она составляет от 0,5 до 2 %.

Для определения уровня экспрессии ргеэг-Б антигена отбирали только крупные колонии со 100%-ной стабильностью. Условия культивирования и результаты анализа уровня экспрессии антигена представлены в таблице II.

П1.4. Исследование состояния трансформированных плазмид в реком-бИНаНТНЫХ ШТаММаХ Н. ро 1угаогрЬа ИИ (рНРН&з5 ,3' и рНРНВз18)

Поскольку результаты гибридизационного анализа состояния плазмидной ДНК в рекомбинангяом штамме н.ро1ушогрЬа ошрнрнвзб.з') Ее отличаются от результатов гибридизационного анализа ДНК, выделенного из итакма н.ро1уиогрЬа Ш(рНРаН), мы не будем повторять их (рис. 3). Стоит лишь отметить, что большая интенсивность сигнала гибридизации соответствующая хромосомному фрагменту (дорожки 3 и 7) объясняется тем, что использованная тотальная ДНК была выделенна из штамма показывающего митотическув стабильность порядка 70ж.

Результаты гибридизационного анализа рекомбинантного клона н.ро1утогрЬа ш.1, трансфэршрованного интегративным Еекторо?^ рМИВяН, показывают совершенно иную картину (рис. 3).

Так, при сравнении дорокек 4(тотальная ДНЕ, рестрицированная ЕсоНУ) и 11(плазмидная ДНК, рестрицированная ЕсоР.у) на рисунке 6А видно, что одна из полос гибридизации в дорокке 4 совпадает по подвижности с полосой гибридизации в дорожке 11. Другая полоса в дорояке 4 совпадает по подвижности с полосой гибридизации полученной в дорожке 5 (тотальная ДНК, выделенная из исходного штамма и рестрицированная рестркктазой ЕсойУ). При этом нижняя полоса в дорожке 4, соответствующая хромосомному фрагменту дает менее сильный сигнал гибридизации по сравнению с вершей полосой. Сканирование сигналов гибридизации

этих полос на лазерном денситометре показало, что интенсивность сигнала гибридизации соответствующей плазмидному фрагменту в три раза превышает интенсивность сигнала соответствующего хромосомному фрагменту. Этот факт говорит о том, что кассета экспрессии в полученном трансформанте находится в количестве трех копий на геном.

Следует отметить, что уровень экспрессии СПБ, обусловленный наличием трах копий интегрированной • кассеты экспрессии СПБ практически не отличается от уровня экспрессии обусловленного наличием двух копий кассеты экспрессии ОПБ.

II 1.5. Анализ данных полученных в результате исследования экспрессии поверхностных антигенов вируса гепатита В

Сумшхруя данные таблица и п результаты гаОридизационного евалкза ми пркздщн к зцводу, что отобранные нами трансформанты показывают относительно нязнай уровень экспрессии основного к среднего позс-рхгостЕШХ белков вируса гепатита 3, при атом, незазяшдо от тзша зегяора ч тесла кошм, уровень гкспрзссчрусизто гетерологжчного бзлка примерно одинаков.

К ссхагаиаз, ш вз удалось выявить,, среди более чем ста традсфорквнтов какого ттек., кдсш воказшквдЕе уровень £кспгесс1,.и близко; к даони;.; полученным другим-! ЖСЛеДСШТЖмА. и&по\ЛсЬ аг. а1.., 1508, аЬ а!., 1990,

Сгеег Л1 сЬ г.1, 1987 г ЗМ-Нз 1гщ,д БЬеп, 1939!.

Сразкигая пгак результата с ранее оаублажовавннш могно прздашояихь, что вероятно?; щотишК низкого уровня экспрессии возможно является то обстоятельство, ЧТО В отличии от АИБ— последовательности н.ро1ушогрЬа (НАРЗ), использованной отмеченными авторами в конструкциях, обеспечивающих высокий . уровень экспрессии и капийность .от еосьми до ста на геном, мн использовали в качестве области начала репликации участок китохщцриальноЁ .ДНК с.йШг. .

Нал вно'ор был обусловлен тем, чте согласно С Тихомирова Л.П., 1935, Икозоксаа Р.Н., 19371 фрагмент »¿атсхондриальной: ДНК с .ис!На, в соетсвэ шгагкады рьз, обослзчЕваэ? как авгшошда рзгшгкацме, так к «уяьтЕшризяо квтеграш» вд&агаш рьз. Однако;

ни в одном из полученных нами клонов не удалось показать ни автономной репликации, ни мультимерной интеграции, что. вероятно, привело сы к увеличению выхода поверхностных антигенов, в силу увеличения дозы гена.

Следует отметить наш результаты, касающиеся наличия в составе плазмидной ДНК фрагмента митохондриальной ДНК c.utiiis. Результаты трансформации штамма dli н.polymorphs плазмвдами серии рНРНВз, как содержащими, так и не содержащими митохондриальную ДНК c.utuis, говорят о том, что наличие такого фрагмента способствует интеграции плазмидной ДНК (данные не приведены).

Можно предположить, что наличие фрагмента митоховдриальной ДНК C.utiiis влияет на место интеграции плазмидной ДНК, которое, вероятнее всего, отличается от места интеграции конструкций несущих HARS- последовательность. В результате этого, возможно имеют место нарушения каких-то клеточных функций, влияющих на эффективность экспрессии поверхностных антигенов вируса гепатита В. Кроме того результаты таблицы II говорят о том, что разница в одну- две копии существенно не отражается ка уровне экспрессии. Из этого можно предположить, что существенным является место интеграции рекомбинантного вектора.

IV. разделение нативных хромосом штамма dli н.polymorphs и рекомбинантных штаммов dlitрНРаН), dli (рНРНВз), dli(pUHBsie) в пульсирующем электрическом поле.

Первое сообщение касающееся разделения больших молекул ДНК В Пульсирующем ЭЛеКТрИЧеСКОМ ШЛО ПОЯВИЛОСЬ В 1984 ГОДУ (Carl G.F., Olson M.V., 1984 ).

С тех пор опубликовано множество работ по разделению целых хромосом различных организмов, в том числе и дрожжей. Однако до сих пор в литературе нам не встречались данные, относительно разделения нативных хромосом метанолутилкзирующих дрокжей рода н.polymorphs в пульсирующем электрическом поле и доказательств локализации на хромосомах хотя бы некоторых генов (локализованных генетическими методами).

Для решения ЭТОГО вопроса МЫ использовали штамм Hansenula

polymorphs DLi, имеющийся з наавм распоряжении, а танке рекомбкнантные штаммы i pHP«H), bli ( dHFHBs ) и dlj (pMHBsiei.

Препараты для электрофореза готозили согласно Cari с.F.et £.1, äi?ss; i; помещали ь лунки is агарозного геля приготовленного на Сj05 ;,í 2Е7А. Гэль помешали в прибор, содержащий 0,5 кратный TBE буфер.

Первоначально, для злзктрссгорзза использовались условия, ysz^xise слтлл'злъные *.лл разделения патиьных хромосом 5.c.arovis¿ae T.¿. ЗШШйяЯв 175 ЕоЛЬТ II ЗрвМЯ ЛуЛЬОа 150 секунд. Грл этом после 36 '-*аоов эдехттгофогеза видно лишь четыре оазлалънла полосаг ооотьетствьаао чаторе мстиеныв прсьосомы 'рлсреок 12). Те-л нз ч'.элез, лрл зглмателшом тзассмотрэнки лол-чезыл sacos, з:р~~:о раглхчзе л ло; гатенсштоста, что говорит : .-isne.rzc;.'. рао-олеклл лрзлссол. ¿ лззультате а арълровазпк

l_V;lLlls • • рагаалслздл

лллазллл ."OMOCCV лрогаел п.зс

í лсос::;кл í i: ¿ л

''лЬтО";"? í ' Г ЛуЛЛ-

лллщл^ с"-алтлллзском лоло ¿¡г: :o'iJibT, аралокл л!лъса - '.с О jíEicyaai лллтель-

лалалаэлл^ л г-лэлсл'л пульса л талле времена электрос.ороза. лц •дызли. нз наа лзлллд. о'олео олка/глинно условия для разделения ла'ллллех ллслоосл лта:;;ла Г-Л H.poi^cri-ha. ;лагфГй:онк& SO Вольт, ъоелл яульоа сСС секунд, ллоил протекькйх электрофореза не менее v£ -глсо;:-;- Гсоульга? алелтрспсраоа при таких условиях ирсдотазлэк на рло;лл;е 14В на котором четко различаются пять лоолооол.

Поскольку з напои расяэршкзэз; ay,злись гены ШХ, das, а секке ген hi-чЗ (лкбэзно лредостсаисшшй на;д Бобурозни Н.Э., ШО "Блотолнологлл), ш поставили лэред собой задачу влясшть л&кглягашо ггхов :го зрокосоием.

1;сол9 пэролоса лралооо;.; на ¡оал^рзлу яхъояй ярозодоя гпбршзгка) с лж-траксллковаЕпллл участка;® гекоз мох. das и

ЫзЗ. Результаты гибридизации представлены на рисунке 14В и 14С.

Результат гибридизации меченных участков геноЕ мох и ЫнЗ представлен на рисунке 14 А, из которого следует, что отмеченные гены расположены во второй по величине хромосоме н.ро1утогрЬа (поскольку гибридизация танов мох и Ь1гЗ дает одинаковую картину, мы приводим лишь одну из них). Кроме этого, результат гибридизации в дорожках 3, 4 и 5 говорит о том, что экспрэссионные кассеты интегрировании в ту же хромосому (как было показано ранее трансформированные штаммы несут кассету зхспрэссии в интегрированном состоянии).

3 2 1 5 4 3 2 1 4 3 2 " 1

Ä

h

Ja

■ cs^i

m

■¿-У-*

..V -Л

Рисунок 14. ¿U Результат гибридизации с меченными гена?,к >\'Сл и МзЗ. в^ Результат разделения хромосом в агатозном геле. CL. Результат гибридизации с меченным участком гена das. Результаты раздел еня.<: нативных хромосом в пульсирующем электшческоь поле штамма DL1 H.polyraorpna (ДОрОЖКИ 1, 2) К ракомбинантных штаммов H.polymorpha DL! (рКРсгН, pHPHBs5, pMHIS) (дорожки 3, 4, 5 -соответственно), а также их гибридизационный анализ.

На рисунке 14С представлен реузультат гибридизации ник-транслированного гена das, из которого следует, что участок

ДНК кодирующий ген das расположен в самой легкой хромосоме H.polymorpha. ~

таким образом, результаты проведенного гибршшзационного анализа дают нам четкое представление о хромосомной локализации генов МОХ, DAS И hls3 метилотрофных дрожжей H.polymorpha DLI.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. На основе клонированных регуляторных последовательностей гена МОХ H.polymorpha созданы векторные молекулы для экспрессии гетерологичных генов в метилотрофных дрожжах.

2. Получен рекомсинантный штамм H.polymorpha DLl(pHPctH) эффективно секретирующий СТГ человека под контролем промоторного участка гена МОХ и сигнальной последовательности гена UFal S.cerevlsiae.

3. Получены рекомбшантные штаммы H.polymorpha DLI ( pHPHBsö ,3' , pHPHBsi1,3', pHPHBsi 2,з' и püHBsI4,iö) экспрессируицие основной и средний поверхностные белки вируса гепатита В.

4. Показано, что фрагмент митохондриальной ДНК c.utiiis не обеспечивает автономную репликацию рекомбинантных плазмидных ДНК в трансформированных дрожжах (как это утверждалось ранее), однако способствует стабильности трансформированного маркера.

5. Показано наличие, по крайней мере, пяти хромосом у дрожжей рода Hansenula роlymorpha, а таюке хромосомная локализация генов МОХ, DAS И his3 H.polymorpha.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. М.Ю.Бебуров,' М.Ы.Злочевский, П.Г.Априкян, В.М.Михайловер, И.В.Карпычев, В.Л.Семенова, В.Л.Грачева, Л.П.Тихомирова, М.А.Эльдаров, К.Г.Скрябин "Экспрессия гетерологичных генов в метоногрофных дрожках Hansenula polymorpha", ВсесОПЗНЭЯ конференция "Новые направления биотехнологии", 1990г., г.Пущино

2. П.Г.Априкян, В.М.Михайловер, И.В.Карпычев, М.Ы.Злочевский:, М.А.Эльдаров, М.Ю.Бебуров "Экспрессия гетерологичных генов в метилотрофных дрокхах Hansenula polymorpha", IY ШкОЛа-СвМИНар "Перспективные направления молекулярной биологии", 1990г., г.Юрмала (Латв.ССР)

3. П.Г.Априкян, И.В.Карпычев, В.М.Михайловер,. В.Д.Грачева, А.М.Щздрин,-М.Ю.Бебуров, М.А.Эльдаров и К.Г.Скрябин- "Экспрессия/ секреция гормона роста человека в метилотрофных дрожжах Hansenula. polymorpha", ДАН СССР 1991, Т.321, 2, стр.390-394

4. P.C.Aprikian, I.V.Karpychev, M.A.Eldarov, M.M.Zlochevskiy, M.Yu.Beburov and K.G.Skryabln, Heterologous gene expression in methylotrophic yeast H.polymorpha, Golden Jubilee Symposium, 1991, India.