Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование системы гетерологической экспрессии с использованием просмотра гена алкогольоксидазы на базе метилотрофных дрожжей Hansenula Polymorpha

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование системы гетерологической экспрессии с использованием просмотра гена алкогольоксидазы на базе метилотрофных дрожжей Hansenula Polymorpha"

од

j • !,"'' л ¡/нацюнальна акадешя наук укра1ки

i нститу т 'м i кров iaior 11 i Bipycaroriï im. д.к.заеолотного

На правах рунопису

ВИТЕКЦЬКА Сроста IIsTpiEH3

КОНСТРУХЭАННЯ СИСТЕ-И ГЕТЕРОЛЗГ1ЧН01 ЕКСПРЕС!! S ВЖОРИСТАННЯМ ПРОСТОРА ГЕНУ АЛКСГОЛЬОКСЙДАЗК НА БАЗ I МЕТИЛОТРОКИХ ДР1ЗДЯ1В HAKSEKULA fslymorpha

03.00.23 - б!отехколог1я

Автореферат диаертзцИ на эдобуття Еченого ступэня кандидата 61олог1чякх кпук

Ки!а - 199Д

Робота вкконана у в!дд1л1 01ох1ы1чло1 генетики В1дд1-ларкп регудятарних систем кд!тгош 1нституту JioxiMil iM. О.В.Палдад1нз HAH Укрз:ни тз лаборатсрП генно! 1нженэ-pil нигак eyK.npioT. НВО "Б1отехнолог1я", м. Москва.

Кауим i норгптпт

доктор б1олог1чних наук, профосср CKSipHXft A.A., кандидат 6ioaori4Hiix наук Еэбуроа М.Ю.

O^iyiftui оланоптн

доктор 61олог1чних наук, прэфесор глцолкх б.п., кандидат С1олог1чнкх наук СакальськхЯ A.C.

Пров1диа уатаиога

1нститут ыолекулярно! 61ологП та генетики HAH Украйни (м. Ки1в)

Захкст дксертацП в1дбудчться " "M/äc^afibWäi р. о " " год на гао!даши спэц1ал1говано! вчено! ради при 1нститут1 ткро(51олог11 .4-'ЭАрусодогИ 1м. Д.К.Заболотного НДН Укрз1ни эа адресов: Vi. Ka'Ic, вул. ЗаЗолотного, 154

3 дисертацхеп х:о.<на оэкаломитисл у б1бл1отэц1. 1нституту м1кро01олог11 i ,В1рус.ологП 1м. Д.К.Заболотного HAH Укра1ни

Автореферат еоэ! сладки" 43 " iös4 р.

Вчений секретар опец!ал18овано1 вчено! ради

Пур1ш Л.М.

алгллыи характеристика ровоти

4кхуальМсть npo5.iet.nj. Др1ждяг - пронаслоз1 м1кроорга-н1г!.м, як1 акроко викср.:стовуються в бататьох б1огехнолог1ч-них процэсах. Зовсхм недавно вони привернули узагу доол1д;г.!-Шв ян; перспектива! продуцента гет>.~ролог!чнкх 61лгле. Напо-чатку зистеми.експресП г9теролсг!чних ген! в стзорювзли для добре вивчэних пекэрських др!ддж15 ЕзссЬаге.'лусез с?-гэ7!з!аэ. Одна;?, викоркстання с.ахаром!цэт1в як продуцента гэтэроло-г!чнйх б1лк!в поз'лганэ э рядом прэбл-зм СНсэтапсз л1,19Р23.

3 рогз;:тком технолог!5 трзяс$срмзцП чужор!дно1 ДНК рроотзз ЧЯСДО Н0ТРЭД1ТЦ1ЙШ1Х В!!Д1Э, прндатнкх для продукцИ гетерологг-и-гпх б!пс!в. Серед н:::: оссблтзе и1сцз гаймзють мэ-тилотрофн! др1ядя1, що на»» ряд перэваг над еачярсм:1ц*?аз?. Основной характеристик® и9тнлотрсф!з е кгл2м1ст1 уя!кадьних £ормен1чв метзбол1гму метанолу; генл яких м!стять с:;~ьк1 ре-гульовак! проыотори. Так, ген злкогольсксидззи (АСХ) з укосах !ндукцП гебеэпечуе синтез ферменту, ягай склад«; Р0-40л а!д гагалъко? галькост! (5!лку «шкгаи С'/лп Б^кел д1.4 19763. Метилстрофн! др!.гда! досить добр© еквчэя1 э тс;::® гору ф!з!слог!5 та 0!ох!м!1, але з молс-1Г/ллрнс-г>жт>гл;ому аспект! ноя! гнйннл про ц! м1кроорггя1гии эазизэжтасз дзлэко игповаши. Клокозаяо пэзначну к!л1к1сть ггн1я ц>г:< и!кросргз-н!зу!в. Дуя& ¡¿ало н1доьо про рэгуляцИа експрвсП ген!л, цэ иодугть фермент:: метаЗол!гму этанолу, не рогкр::т1 П молекул ;;рн! иехан!гыл. 0станн1ы чзссм ыетилэтрофн! др!лл*1 Нэлз5пи1а роЬтазгрЬз та Р1сЬ!з рг^сг!з 1нтэнс;гсно впкорпс-товукть як о^'ект доел!дхекпя експреоН гэтеролсг!чких гзи1п ССгэгв- еЬ а1., аеа?! ЕгезкПгЬпа вЬ а1.. 1509; с1зго et а1., 1991; Лчпсэисг еЬ а1., 1991; ГеШг.гзг з1., 1991;

Hodgkins et ai., 1993]. Продуктивней; синтезу чуяор!дких С1лк1в у кл1тгаах иэтилотрофнкх др1ждд1в гначно н!ж в

S. cerovisiao CPuckholz & Gleeson, 1СЭ1].

Мэг® вз гавдаяия досз1дяевь. 3 метою отворвння сиотбми експресП гетеролог1чних reiiiB на бза! иэтилотрофних др!жд-«ia Н. polyncrphs у poSoTi стзвилися так! основыi завдання:

1. Селекц1я мутакт!в г поекоджэним геном азкогольокскдааи як рс-цкп!ент1в для клонуебкня гону АОХ i кого промотора;

2. ВИЕчення траисформацП Н. polymorpha рэшИкатлзними та ип'ггратиЕяю.м векторами;

3. Струк1/рно-Фуккц1оназ1!!1Я1 анад!з промотора гену АОХ;

4. Конструкпзння вектор!в для експресП гэтеролог1чних ген!в п!д контролем промотора AQX в кл!тинах Н. polymorpha.

НзуноЕа ногиэлз poSomi. В ро0от1 роароблено метод позитивно! селекци ыутант1в метнлотрофних др1ждж!в з поамодже-HitM скнтевом фермэнт1в мзтабол1г1г/ метанолу, эокрема агко-голюксндаги, Вперпэ отримзко мутант К. polymorpha э дефэкт-ким геном аяиогольоксидааи i вютриотано кого нк рещт1Бкт-н:й: штам при каокуванн! гену ДОХ.

На ocjjoai тону АОХ створено ряд йеетор1в для 1нтеграцП а г%ти Н. polyir.crpha 1 показано, щр найтаз*1в9 така 1нтэг-ра?д1я в1дЗуваетъся в хромосошш: локус АОХ эз рахунок гомолог i4KO'i рэком51кацП.

Показано, що /Лэ1-5з];-£ратмонт плагм1ди YEpl3 э геном LEU2 S. cerevlsiae мостить посл1довносг1> щэ ааОегпечуютъ автоксшу репл1кац1п плззШди в кл1тинах Н. polymorpha; ,

Сконструйовано чозниковт: вектор для експрэсП гену lacZ Escherichia coli п1д контролем промотора AGX Н. polymorphe. &инвл5йс а1ды1ккост1 3 р?г;'ллц11 екСПрЗОИ цьйгп гсну

в др1*джах Н. polynorpha та S. cerevisiao.

Методом делец:плсго гезртування встансвлено область промотора ДОХ, необххдку для ефектизнс'! експресН гчепленого гену та Ti регуляцп, а такт,* впязлено г.осл1дозност1 промотора, я;и, очевидно, впконуютъ ■ роль UAS-íb (upstream sctivating1 sequence).

Отримано мутанти Н. polynorpha г порупзнов глюгаэнсп penpeciea синтезу з-галактогидаги E.coli, ген яга! гкахо-дкться п!д контролем промотора АОХ, у ягак, очевидно, попко-дкено регуляторн! дз.лякки промотора.

Еикористозуючи промоторну та терм1лзтср;г/ посл1дознсот1 гею/ АОХ, скокструйоэало касету г унЗкалъжш салтсм рестрик-цх i Ваг.ЧТ для екслресП гетеролоптагсс ген!в в гсз1тпкзх Н. polymorphe.

Наухзго-г.рактгчяе значеняя робот. Досл1дхзння процесу трзнсфсрмзцП метилотрсфних др1*ди1в репд1катявнкыи та 1н-тегратившаги ввктораш, вквченкя структура промотора гену АОХ та механ1гм1в регуляцп експресП гчеплеютс г mal renia доповнюе наш гнання в облает! молекулярно! генетики i мою посгуяЕзи основою для розробкд незкх rer.uo- i.-ис-.ч-:рткх п!дхо-дхв до вивчвння метилотрофнг: др1*дж1в.

Створення касетк для експрэси гетеролог1чних renis и!д контролен сильного регульоваяого промотора АОХ, якз 1нтэгру= в геном Н. polymorphe, вгдкривае перспектив!! отримакня на Saai цьего виду метилотрофпк др1ядя1з зта.йв-прсдуцс-нт1в прош'.слсго важливих бхлглз.

Лпробзц1я робот яз пубз1кзцН'. Ыатер1алк дис&ртзц15 допов1далися чм Сули представлен! на V М^.нзроднсиу скмпоз1-yui г míкроеного росту на Сх-сполукая (Хзрен, 1Е36), XII

- А -

Шхиародному СимпоэХум! в др!ждж1в (Вежзр, 1987), V Всесоюзному г'1?д1 BTTiC in. Н.1.Вав1лова (Москва, 1937), IV Шж-кароднсму конгрес1 г кл1тинно! СЮлогП (Монреаль, 1088), XVI М1кнародн1й ксн^еренцП г генетики та молекулярно'1 6io-логП др1жди1Е (В1день, 1092), VIII М1якародному cm.mosiyMi г др1«дж1в (Атланта, 1992), М1жнародноыу ceMiHapi в мети-дотрофнзк др!ждж1в (JlbBis, 1902), VI Укрз'1 HCl кому з'1зд1 ге-нетикгв i селека!онер:в (Kii'iB, 1992), I Мшнзроднсму сем!на-pi г ядерного катркксу (Вроцлав, 1994).

• За матераалаш дисертац1йно1 роботи опубл1ковано 3 стат-Ti i 7 те«.'

Сяр^тоу/рл /га об'еы роботи. ДисертаЩя складаетьсл г! ьстуну, огляду л:тературк, матер1зл1в i метода досл!джекь, виклэдекня отрхмалих ревульъат1в та 'ix сбговорекнн, вкснов-KiE 1 списку л1тературк ( даирел). Робота ВЕКлздена на стор1нклх друкова-чого тексту, imcTpoBSHa 13 таблкцями i 13 калюккзы:!.

МДТЕР1ДЛИ i гатоди Е ро5от1 вкк'-ристовували дрджд/.i: Hansenula polymorphe втам DL-l 355 (leu2); итам CBS-i7ö2 (РосИюька колекц!я Mirc-poopraiiisMiB, м. Птсжга) i кого ауксотрэфт-п мутаяти Bv (leu2), D6 (ade2), В13 (игаЗ), ¿8v (игаЗ 1еи2), НРВ1 (ado2 1еи2) (HBO "Б1отехнолог1я", н.Москва); Saccharomyces cerevisiae 1Д6а (игаЗ his3 trp2 1еи2) (Росхйська колегаЦя м1кроорган1гм1в, ы. Бугцшо); Сактерп Escherichia coli C6D0 (F" thi-1 tgr-l loiiBS. lacYl tonA2l supE44 I") i JM103 (D/lac pro/ thi strA supE endA ?bcB hsdR" F' traD36 proAB la?Jq ZDM15) (KBO "EiOTexHOsnriH", м. Москва).

М1крооргая1гма кулътйауваяи в стапдартнкх середозга^х VEPD, YNB, LB [Man i at i s et al., 1В82Э га мэдифкоззному сг-редовгаЦ Беркгаидерз [Sifcimy et ai., i S3?] на чапкзх П®тр1 «и в колбах (проб1рках) кз neínepi (200 об/хв). Середови^а для ПСридизацН та спорулввання описал! [Gleesen Sr.dbary, 1938]j Мутагенез проводили га допомогио УЭ-опроц1ноиня або Н-ыетил-Н'-н1тро-М-я1трогогуан1Д5шу.

Плазы1дну ДНК s бактер1й зндглллп за методам [Jsh-Horor wicz et ál., 1981], ДНК др1кдж1в зздхляли гг1дао мзгсду CShenr-srí et al., 1986]. Пбридязацнэ зз Сзугерисм, а ?зкш sei. кая!пуляцП з ДНК in vitro проводила стандартная! ызто-дами, онисзяими [.Man i at is et al., 1982].

EaKtepl'i тргнсфорыувяли за мгтодккою з CaCla [Manistis et al., 1932]? трансфорй£ц1а гд1йсжзэли л прксут-

JiocTi Í0SÍB LiT Cito et al., 1833J.

Активяост1 $ермэнт1з теетувади in situ в mpaosSisiso-взних дкг1?оа1яаи кйчивах Юййгрный а айвдозйняё, ISSiî аЗо в безкл1гаяя:к екетраетгх Иибпрний а др., îSS?3. Sbsbsvss« акткзясст! наступнлх фермент!вг з-гзгзстозвдзэа яихско ГЕозэ, Betstein, 1S78] 1-к1льк1сйо ttimep, 157S3 ¡ EKiCHD ЕСибиряый в Тетсрзякп, 1233] i к!льк1сно CSibirny ot al., 19S7]; ¡аталзэи [Rogsenka^p st al., 1974]; íopira^a-г!д- i фсрм1атд9г1дрогенгзи CShutta st al., 19763; диг1дрси-сиац?тонк1каэи Cvan Dieken et al., 1978]; фруктсэо-1,6-да-£осфатэ?и [van Dijken & Quyals, 1977]; аасгсУйДвПдрогенааи [Hou et al., 1932]. Пи?С!,(1 активное?! фермэнИв 2ирз*ага в kmojs продукту (субстрат/) ¡ утвореного (гиксрпста-гого) 1 мг б!лку (кл1тин) га 1 хв.

Концентрата б i л; су в 6егкг!т;!няих нктраетзх гааначази

- 6 - • „

еа методом £Цжгу е1 а1., 10513. Концентрац!п кл1тин виека-чали тур01диметр'лта::м методом при 540 км.

Б1ЛКИ безШтинних екстракт1в др!ждж1в рогд1ляли га дс-поыогов електрофорезу в пол!акрилам!дному гел1 (12,5 X) в тр1с-гл1цияоасыу буфер!, рН 8,0 а присутност! 0,1 X додецил-сульфату натр!ю. Для фарбування б!лк!в гель обробляли 0,25%-киа рогчином Ку».'.асс1 5-£5, виготовлэним на сум1е1 нэтанод-оцтова кислота-вода.(5:1:5),

РЕЗУЛЬТАТ.! Д0СЛ1ДХЕНЬ ТА КХ ОЕГОВОРЕШ

1.0тршаиня нутакт!и Н. ро1упогрЬа з пошноджошш геном алкшчиьокшдази та пзжористання IX для клонуванкя геку АОХ.

Ген ДОХ др!кдж!в Н. ро1утогрЬа був е;:5 ранки як джерело надгзичаико сильного промотора,. п!д контролем якого екопре-с!я гену регудоБться пляхом катабол1тно1 рэпрэсП/дерепреси та 1ндукц11 нголгвпкатр еЬ а!., 1ВЭ43. _ 3 метою клонуваннл цього гену шляхом воыплеыентацП в1дпов1дно! мутац!! ми роэ-робкли метод селвкцП рецип!ентного Етаьгу г пошкодженш структурнш генои ДОК. В основ! методу лахить гдатн!сть алкоголь оксвдааи огаслюзати ал!лозий спирт до високо токсичного айроле!ну. Передйачалося, щр кМтшш з високсяо активиста цього фермэнту при 1ккубацН в середовкц! з ал!ловим спиртом гагинуть, а мутантн г поиходжэнон алкогольсксидазою - вкжи-вуть. Оск!льки ыетилотро^к! др1«дж! мЮтять, окр!м алкоголь-оксэдаги, дек!лька 1гоформ алкоголадэг1дрогзнаэи (АСН), кот-р! тем окислить ал!ловий спирт СХе&гару и Кангур', 1983], опечатку отркмали мутанти з пошкодаиноп АБН. Шсля двох ета-п1б сэг&кцП сэред резнетентких до ал1лового спирту клон!в втаму (ЗБб) Оуг.о вибрзно мутант А1-2, пкий слабо р!с в

середовищ! а етанолом, а р1ст на метанол! не був порушений. На третьому етап1 селекцП г цього ста,г/ на середозтЦ, яга mí стило ая!ловий спирт (60мМ),форм1ат (50мМ) i гл!церин (IX), булк EifliSpaHi мутанта, нездатн1 утшИгувата метанол. 3i 100 перев1рених клон!в зид!лено 4 штамп, у яких з npcansaisoBa-них ферментгв мэтабол!зму кэтаколу була з1дсутньса лете ак-TKBHicTb алкогольоксидззи (Табл. 1), Електрс^ореткчно роэд1-лення 'бегшйтинних екстракт!в цих ct-míb заявило в!дсутн1сть б1лково! фракцП, що з!дпоз1даз алкоголзсксидаз!.

Т А Б Л" И Ц Я 1

Akthbhícts geрмопт!з иотабол1зку нотанслу у еиз!дксго штамму А1-2 i aos иутаят1в. Др1ндж1 вироцувзли з середовщ1 з глюкозою (1%) тз 1нкубу-вали в сэредовиЩ з метанолом (IX) протягом 16 гею. ЛОХ -алкоголгоксидаза, CAT - каталаза, FMD - формзльдег1ддег1дро-гезаэз, FTD - форы1атдег1дрогеназз, DAX - диг1дроксиацетон-к1наза( FBF - $руктозо-1,6-дифосфатаза.

Активность, нмоль/'хз/мг б!лку

АОХ CAT" FMD FTD DAK FBF

A1-Z 1230 2460 160 57 64 110

М15 0 1300 130 53 40 72

Ml 8 0 2300 145 47 50 30

М44 0 1020 160 304 18 100

М9б 0 2000 177 35 50 64

* АктивнЮть зиряиади з ыкмолъ/хе/мг 6íffiy.

3 мутанта MIS були 1эольован1 температурочутлив1 ревер-танти (ts), як1 росли на метанол! при 25°, але не при 43°. В щЦтинах ts-peEepTaHTlB, вироцених при перм!сивн!й температур^, активн!сть АОХ була на порядок нижчою, hîk у штаму А1-2, тод! як активност! irarax ферментов метабол1зму метанолу эалишалися без суттевих smîh. Виявилсся, що алкогольогаи-дааа ts-pesepTaHTiB харзктеризувалася пгдвиценою теркола-б1льн1стю в nopiBHHHHi з бхлком штаму А1-2 (Рис. 1). Отрима-Hi результати св1дчили про пошкодження первинно! структура алкогольоксидази ts-peBepTaHTiB. Лог1чно було допустити, що у них, а стже i мутанта М18,пошкоджено структурний ген алкогольоксидази. Можлибо, нонсенс-мутащя в кодухтй частин! гену АОХ мутанта М18 блокувала транскрипщю на ранн!й ста-дП, в результат! чого не синтезувався бглок.

Рис. 1. Вплиз поп&редньо'1 1нкуСац11 на активн!стъ АОХ птаму А1-2 (1,2) i ts-peBepraHTiB (3,4) при 45°С (1,3) i 53°С (2,4)

- е -

Мутант М18 викориотэли як рецжпентний лтам для клону-вання гену АОХ. Попередто э гэномно! 01Сл1отеки H. polymor-pha Суло вид1лено фрагмэнт ДНК, яий г1бридизував з ол1го-нуклеотидом, комплементарна посл!довноот! структурного гену АОХ, яка на той чзс вже Оула в!дома CLedeboer- et al., 1985]. В результат! трансформэцП птаму М18 (leu2 аох) плазм!дса, що MicTiuia фрагмент геному довкшсл 11 т.п.о. i ген Ш!2 S. cerevisiae, отржзлп клони, здатн1 рог.ти в'сэрэдовид! в метанолом, г активною алкогольоксидаэоо. Цэ сотаточно доказало клонуваяня гону АОХ H, polymorpha.

2. Траис*ормац1я H. polynorpha ролл]кг.птажш га iiiror-рптаааиии Еекторгмги.

Panine було показано, що деяк: сахаром!цетн! вектори гдатя! трансформуаати H. polymorpha [Тихомирова и Бельков, 1985; Gleeson et al., 1986; йзигипкатр et al., 1Q86], Ми зя-коризтовували плаам1ди, у яких в рол1 посл1довяостгй, цо эа-бегпэчуить автсномну реплхклцгю (ARS), Еиступала 2 ¡.эт.! ДНК. Виявилося, io ТЫЪКИ TÎ з них, як! окр!« 2 МКМ ДНК М!СТ'.1ЛИ XhoI-SslI-фрагпеят (2,3 т.п.о.) гели,г/ S. cerevisiaa а геном LEU2 Сули здагн! автономно решПкуватися в кптиязх Н. ро-lymcrpha. Частота траноформацП штаму 48v ильцевим вектором YEpl3 становила 10-20 клон!в на 1 мкг ДНК. Стаб!льн!сть таких тралсфсрмант1в дор!вкюва,1а в середньсму 80* nicai виро-цування протягом ' 10 генерац!й в багатому середов!ПЦ VEPD. Трансформация лппйнкм Xhol-Sall- фрагментом (2,3 т.п.о.) цього вектора супроводжувалася гростанняы частота траксфор-маци на порядок. 1-5% трансформачт!в утаорюгзли велик! колони, стаб!льн!сть ягах становилз 100* п1сля вироцуванкя

протягом 10 генеращй в середоыщ! YEPD, а рейха колон!и буди др!0ни.ш г дуже нигькою стабильности (<0,17.). Xhbl-Sall-фрагмент, ваикнутий в пальце, теж трансформував кл!тини H.polymorpha а утворенням нестаб!льних Leu1" колонпт, Ц! дан1 св1дчили про те, що, очевидно, при трансформацп л!н!йним фрагментом плазм!.ди УЕр13 в ряд! в1шадк!в (стабШн! клони) в1дбуваеться !нтеграц1я него в геном Н. polymorpha га рачу-нок негонолог!чно1 рекомбшацП, ■ Негсмолог!чну рек.омб!нац!ю екгогенно! ДНК в др1жджах Н. polymorpha яюстер1гали також . [Rotenkamp et al., 1QS6; Tikhomirova et al., 1086; Faber et al., 19923.. Поява неотаб!льних Leu* колон!й у випадку трансформацп китьцевим фрагментом YEpl3 св1дчила про його авто-яомну репл!кац:ю. Це дозволило нам припустити, шр в межах Xhol-Sall фрагменту геному S. cereviaiae г геном LEU2 энахо-дяться nocaíflobkooti, здатн1 Функц1онувати в рол! ARS-íb в KaiTKHi Н. polymorpha.

Ефективна експресхя гетеролог!чного гену вимагае стабильно: рэпл!кацП чужер!дно1 ДНК в кл!тин1. Найб!льш над1и-ним способом стабШгацП s !нтеград1п i"i в геном. Для !н-теграцП ДНК у.вигначене м!сце геному використовуить методи рсгс;еплення та эаы1п;эння гену, в- ochobí яких лежить гоыоло-г!чна рекомб!нац!я. Констругаочи 1нтегра7ивн! вектори, ми ви-користали HindiI;-5ас/-фрагмент клонованого гену АОХ Н. ро-lyr.orpha (Рис. 2).

Еектор pMOXl було отриыано в результат! включения в ВзП сайт кодуючо"! посл1довност1 гену АОХ гену LEU2 S. се-revisiae. Вектор рМОХЗ отримали заменою Ессйу-фрагменту гену АОХ на ген LEU2 S. cerevisiae. Штам НРВ1 трансформуаали лШйякми фрагментами ДНК ! в!дбирали Leu1- клоки. П!слл

л

"li-

st Sp H P I P I P E J-1 I I I. I_!_

TATA TAA

RV В В В RV S

тах 1 , 1

-1600 0 +2250

I- ) ■ . ............... uPHK AOX

В

pMOXl

RV RV S

P pAOX _J________I T

рМОХЗ H pAOX

t\\\\\\\\\№}2\\\\\\\\\\,'///l;RP2/77

pmn

RV RV S H ___pAOX I__!_ '

1—СШБХШЕШг—i лох 0^//Ti&2///

Peg.2. A. Oieircsa карта фрагменту ДНК з геном AOX, кгонова-кого Ledsboer ot al. (1235).

Б. 1птеграгивя1 вектори, скснструйован! нз ochobI гону АОХ.

H-HindIII; P-PstI; St-StuI; Sp-SphI; Е-Ее"¿73; RV-EcoRVj B-Bsrllli S-Saol.

трансформац!i спостерхгали появу стаб1дьких (1-5%) i неста-б1дьних (<0,17.) клонхв. Стаб1льн1 трансформанти мали Аох'фе-нотип, що св1дшшо про 1нтегращю сахаромЩетного гену LEU2 в хромоссмнкй локус АОХ Н. polymorphs. У випадку вектора рМОХЗ bcí аох трансформанти були дэфектними по утил1зацП триптофану (Тгр~), що шдтвердило передбачення Reíd [19833 про рогтщення на 3'-к1нщ гену АОХ вгдкрито! рамки ечиту-вання, гомолог1чно1 гену TRP2 S. cereyisiae, Поява трансфор-mshtíb г фенотипом Аох'Тгр" була незалеречним докаэом гомо-лог1чно1 eaMiHii AQX-TRP2 хромосомного локусу Н. polymorpha на (aox-trp2)::IEU2 фрагмент вектора. Трансформант sde2(aox-trp2):! LEU2 скрестили , г í шташм игаЗ hls3::LEU2 1 отримали сегрегант НРВ11 (ade2 hísS: :LEU2(ao:<-trp2): :LEU2), який послужив рецинхентом при трансформацП вектором pHPi.il. Цеи вектор mícthb три гчеплей гени Н. polymorpha HIS3-A0X-TRP2, Ер знаходилися в меиах HindIII-SacI-фрагменту (Fue, 2). Ген HIS3 {Семенова и др., 1991] був вбудований в StuI сайт промотора гену АОХ. Особлив1сть дано! конструкцП полягала в тому, що в!дновлення активност1 гену TRP2 у трансформант!в ' могло в1дбутися лише у випадку зам!ни (sox-trp2):¡LEU2 хромосомного локуса на A0X-TRP2 посл!дов-híctb векторз. Реэультати трансформацП' приведен!, в табл. 2. Д1йсно, клони, в1д1бран1 га оэнакои Тгрт, м1стили активну АОХ. До „того ж, переважна С1льш1сть а них набули фенотипу Н1зт. Це вказувало на 1нтеграц1ю гену HIS3 у склад1 вектора pHPMl в геном.Г1Сридиаац1я за Сауэерном хромосмно! ДНК тагам трансформант1в покааала, що у них в1дбулася эам!на шляхом г.эдв1йного кросинговеру aox-trp2 локусу рецшйБнтного штаму ка посл1дэвн1сть вектора рКШ1. У трансформзк?1в э фенотипом

ТАЕЛИЦЯ 2 Транс$ормащя Я. polyrcorpha НРВ11 вектором pHPiil.

Селек- ТИВНИН маркер Число проанадг-гозаних клонiв Фенотип трансформант!з

His1" Тгрт Аохт ■ His" Тгр1" Аохт His1" Тгр" Аохг НЧз1" Тгр" Аох"

Тгр His 22 103 21 38. 1 0 0 63 0 2

His~TrpTAox't' рекомб1нащя в1дбулася Mi» генами АОХ i TFP2, не зачепивпн гену HIS3, ягам, очевидно, згодсм ел1:Лнузався. Серед трахсформан^в, 31Д1браних за оэнаксю His1", картина рексмб!наятних фенотип1в була б1дъш р1знсман1тною, зло у пе-реважаичо! б1льност1 випадкхв (95%) 1нтеграц1я в!дбувал,зся в локус аох. Ц1 дан1 сз^чили про еисоку частоту гомолоПчно'! рекоыб1нацП у Н. polymorpha.

Метод зам1п;ення гену ми використали для введения дело-ц!й та iHcepuiii в промотор АОХ геному Н. polyrrarpha.

3. Винчения excnpociii готоролог1чного гону п!д контролем промотора АОХ на модел! AOX-lacZ у др^лдакгззс.

Човниковий вектор pMG, цо вкличзз ген 3-галактоэндаэи (lacZ) Е. coll п!д контролем промотора гену АОХ Н. ро!увог-pha, огримали в результат! включения з подШнкер плагы1ди YEp356R [Meyer? etal.,1986] Hindi 11-ЕсоМ-$>рагы1тт/ 5'-некодушог облаетi гену АОХ (1,6 т.п.о.) i Xhol-Sail менту э геном LEU2 гено>,г/ S, cerevisiae (Рте. 3). Частота

- и -

трансформацИ илзгм1дсш pi.iG др1ждж1в Н, polymorpha i S, cerevisiae стансв;:лз 50-100 Leu1" колонif: на 1 мхг ДНК, До того к, вс! трзксформанти ыЮтндз: 3-GAL. Стаб1льн1сть траксформант;в ni-сля впроцузаккя протягом 10 гэ-нераЩй з нэселектквик' уксьах в середньому дорШггвала ео У. для Н. polymorpha i 70 % для S. cerevisiae.

Т -А Б Л И Д Я 3 AHKfflKicx» и-галаггагаидазл в дрхждтаг Я. polymorpha i S. cerovisiae на piaimx джоролах вуглоцн. Др1ждк1 вкроксували в свредовищ! s гаикозсю, а потхм 1н-кубували в середовщ! вказаного складу прстягсм 16 год.

Джерело вугдеца AktkbhIctl в-галактозидаэи, ныоль/'хв/мг б!лку

Н. polymorpha S. cerevisiae

Глюкоза 2 X 0 310

Без Буглецю 2500 ■ юео

Глицерин 2 7. 650 3030

Метанол 1 V /т 13000 1050

Етааол 1 % 0 3100

ЕсойУ

Рис.3. Схеыа вектора р.МЗ а геном lacZ Е, coli п!д контролем промотора АОХ.

- 15 -

В кл1тинах метзиотрофяих др!иля1в експресоя гену lacZ п!д контролем гтромоторз ДОХ регуливзлася таким же чином, як i екгпрес!я власного гену АОХ,тсбто шляхом глзокозно! репре-сП/дерепресп та метанольно! !ндукцП (Табл. 3). Але на В1дм1ну в1д Н. polymorphe, у S. cerevisiae. метанол не !нду-куваз синтезу 3-GAL. а гл1церпн та етанол не внступали в рс-л! penpecopiB. В топ же час penpecia синтезу D-GAL в присут-hootí глюкози в обох вэд1в са!дчкла про под1бн1сть Mexaais-míb глх;коэно1 penpeci'i у др!ждя1в. Orpiajasi дан! п!дтвердили попередн1 поз1домлення [Gleesen & Sudben/, 19S3; Сибирный и др., 1985] про те, цо етанольна- та глюгагна penpeci'i синтезу фермент i в метабол 1гиу метанолу в1дбуваються р1энпми гдяхами.

4. Структурно-$у?1Кщональ11Ий аиал1з промотора го;гу ЛОХ.

3 метою встановлення посл!довностей, оуттгвих для ефек-thbhoí eKcnpeci'i гену та 'ií регуляцП, проведено делэц!йне картування промотора АОХ. Делец!j д1лянок промотора в сгаад! плазмгди pMG та !нтегративних вектср1в отрклузата еляхом ви-р1гання певних рестрикцпших фрагмент!в або обребкою нуклеа зою Еа1,31. Вплив делец!й на експрес!ю гену зпзчата на модел! AOX-lacZ (див. роэд!л 3) або зам!ною iKxaKTHoro промотора АОХ геному Н. polyirrarpha на делец1йн! пох!дн! методом эам!-щення гену (див. ро?д!л 2). 3 таблиц! 4 видно, цо делеЩя другого Pst I-фрагменту промотора, розм!п;еного м!ж -1000 i -655 п.о., гнияг/взаа активн!сть 3-GAL на метанол! в 1,5 рази, тод! як вир1гання двох Pst 1т фрагмента mím -1000 i -403 п.о. привело до эменаення актизност! в 3 рази, te; допустили, .що з межах цих фрагмент!в эначодяться посл1довност!, ¡до активують експрес!» (UAS). Делец!I в промотор! спразз в!д

Т А Е Л И Ц Я 4

Еплив дзлодгй е npoKQxopi АОХ на encnpeciio roi;y IsdZ E.coli Др1жд»1 вирощували в оерэдовищ а глюкозою (2 Т.),а пот!м iK-куйувгли 15 год без вуглецо (-С) а5о з'метанолом (1 7.).

Схема промотора ЛОХ i ¿ого Акт ¡IBHiCTb ß- .пм

Вектор кмоль/хв /мг б!лку

делецишж ПОУЛДШЭС

ГЛЕКОЭЗ -с Ы-гТсиаОЛ

Р р р г

рМЗ I t 1 1 0 25D0 13000

Р р р Е

pMGAl ! 1 « . 0 3000 9500

Р -665 Р Е

pMGi2 1 | , 0 700 3500

-1000 -403 Е

рШДЗ 1 0 IOC

-350 Е

pi,tai4 , 0 92

-310 Е

рМЗД5 1 0 53

. -2S0 Е

pIvfiA)? | 0 30

-270 Е

p.\Sa7 0 20

-260 Е

47К -93 0 - 10

-403 п.о., отриман! за доломогоя кукяеаги Bal31, супроводжу-валпся pisraiM пад1нням ачтизност1 P-GAL. Цэ св1дчило про суттвву роль uis'i д1лянки промотора в експресп зчепленсго гену.

Наш! данх узгоджуються э результатами, отриманпмн Lede-Ьоег et al.tlS853, hki вказують на розм1щення tovkii iHiijia-Ui'i транскрппцП на 105-115 п. о, вл!зо в!д кодону АТВ, а на роль ТАТА-боксу пропонують ТАААТТ-посл1дсвн1сть в позицП -171 заесть ТАТАААТА-пасл1довност1,розм1щено1 в позицН -56.

Введения делец!й та 1нсёрц1й в промотор АОХ на хромосо-Mi дозволило виклшити вплив фактору KonifeocTi на р1вень експресП гону (Табл. 5). Тая, було естэнозлрко, що делец1я окремнх Pst¡-фрагментов промотора (вектори 1 р.\*Л2) чи поикодаення ix структур» шляхом 1ксерцП гену HIS3 (a StuT сайг - вектор pHPMl i в SphI сайт - вектор pHPi.12), незнатно знижув aKTHBHicTb АОХ, Але одяочасне видалення обоз: PstI-4parMeHTiB приводить до пад1ння активност1 АОХ мапже з 20 paaiB. Отримаш дан1 подтвердили наие прзпущення про ic-нування в промотор! АОХ иАЗ-посл1довностей. Мл передбачаемо, що UAS1 розм1щвний м1я -665 i -403 п.о., a UAS2 знаходиться в межах -1000 1 -848 п. о. Под1бне твердження про з.снузання в межах Pst¡-фрагментов промотора АОХ двох UAS-iB вкслоаилн Godecke & Hollenbers C1B90D.

Делевдкним картуваяняы нам не вдалося встановити посл1-довностей промотора АОХ, як! би прийыали участ-ь в глюкозн1й чи етзнольн1й penpeci'i. 3 Ц1бю метою ми селекщонувалл мутанта э пошкоджэнозо глюкозною penpecisio синтезу D-G'X, ген пко1 значодизся тд контролем проютора АОХ на плази!д1 р!.!3. На середозкц!, яке мостило лачтогу (10*) - дг.эрело зуглецо,

Т А Б Л И Ц Я 5

Вплкв incapuíñ i дэлзщй е промотор! АОХ на експрзспю гену аляогода окслдази Др1яд»1 внрошували Е середовипц ai cyuinm глщерпку (2 Т.) 1 метанолу (1 £). P-Pstlj Sp-SphI; St-Stulj E-Eco473.

1 форм!ат - 1ндуктор синтезу 3-ЕА!_, з1д1брал:и мутанта, ре-зистентн1 до 2-дезоксиглюкоги (175 мг/д), У б!льсост! з них Суло пошкоджеко глюкогну репресш синтезу як З-ВАЬ,' так 1 АСХ. МутацП такого типу мали рецесивний характер 1, очевидно, в1дбулкея в транс-дпзчих генах, якд прпймають участь в глюхоэг-ий репресп синтезу фермэнт!в мета5ол!зму метанолу. Липе у 2-х птам!в (15-2 1 15-9) нз глюкоз! спсстзр^аласа чаяткова дерепрес!я синтезу 3-&М-, але не ЛОХ (Табл.6). Еулэ встанозлено, ар щ мутацП домхнактн! ! гначодпться з цисТ Л Б Л И Ц Я У Лктивгпсть З-галаятозядази' 1 аяноголасксидатш у е-впдного штаму 1ГР0 1 мутант1а з позкод^сноя глхксзко!з репрс-с1еч: Др1ждж1 вирощузачи *в середовзгд! э глюкозою (1"), а потом ^кубуьали 16 год в середов!Пя1 без джерэла вуглецю (-С) чк а мэтанолоц (1%). Активность зирзнали в нмоль/хв/мг б1лку.

Глюкоза -с У.!этанол

В-БЛЬ АОХ З-ЕАЬ АСХ С-С1А1. АОХ

НРБ 1,3 0 241 65 4780 1070

15-2 7,7 0 1820 58 15400 950

15-9 . 14,0 0 3170 64 "21300 5.'¿г»

8,0 0 871 175 °780 800

5Ь 4,4 0 1350 66 14060 430

71 • 15,0 0 284 116 2б"0 240

161 2,1 0' 254 81 4.450 «00

пололелн! по з1дковеннг до гену 1асг. Кргм муганПв, резистентных до 2- д есо-сиглкксг, мл в!д1брали птаглп, здатн! роста б середогщ! г лактозе» без 1ндуктора (¡.-мутанта), у яки р!векъ актззност! а-ЗЛЬ на глюкоз! в!д 3 до 15 раз перевигу-газ р!зенъ видного птгму.!.!;: передбачагмо, цо у вид!ленкх нзын мутантов псгкодя.ено д!лянки лрскотора АОХ, я:;х прлпма-ать упасть в глнкозн;;: рэпресгь Остаточнш доказом цього Суде с!кзгнувз:-:ня та:-з2: промотор!в.

Б, Ко!!стру:с.-ш:нл касота для експрзс!'! гетеролоНщпи ген аз пгд как трахеи промотора АОХ я кл!тш;аг II. ро1утглгрЬа.

Як приклад гетерогоПчЕо! експресИ продемокстровано гену поверхневсго антигену в 1 руса гепатиту В (НВзЛ£) в ¡-а! тинах Н. ро1уг.огрЬа. .Для цього створено вектор, цр м!сткз ген п1д контролем промотора АОХ (Рис.4).' Ген

НВ/зуу? су5 талу Суло юлоноезно в лаборзторП Г!бадул1на Р. А. Гг"т:г.'угу з1руоодаг11 Н1. Д. 1. 1вановського РАМН. Ира1-фраг-нен? з1русно'1 ДНК (1034 п.о.>, цс в1дпов1даЕ кодуш!й посл!-довксет! антигену без про-частин, включали в НатЯГ сайт В5кгсрз р£1, ягай н:сг.з промотор довхикою 540 п. с. 1 З'-мотргнслксчу облает* гею/ АОХ (ген ТКР2) Н. ро1угсогрЬэ (вектор рНВЕЗ). Дат! ВатЯ/-^/-фрагмент цього вектора заы1-ккли ка 11 ратмент гену АОХ г терм1натором тракс-

;:р:и:ц11 (вгктор рКЕ£4). Шелл цього в ЕсоИ' сайт гену ТР.Р2 гнел:: еглэкткзний каркэр - ген Шй Б. сегеу1з!ае. Отркмаги ас'.чгср рНН25. йло^г^агметхсм цього вектора траясфзрмувага сяган К. ро1у1г.огрпа £у 1 в!дбирали Ьг-и* клони, як! тестуазли на пр;кутн1сть НВэАг пг/кологИгно. При пер1одпчкоку культн-зугзнк! на суши: глщгркку (2?.) 1 иэтаколу (0,5*) . 61Л1-

ВотН! ' 21 "

Рис. 4. Конструквання зекторн з геном КБзАг п!д контролем промотора АОХ.

яхсть клок1в продукувала 50-100 мкг антигену на 1 г клгтгтл-ного б!лку, 1 т1льки 1-2 X клок!а синтезуаало 10-20 «г прог дукту на 1 г б!лку. Г1Сридигац:еп за Саузернсм ДКК, 'вид1ле-цо! э найбШш активних трзнсформантгз, булс показано, пр у них ген НВэАг ¿нтегрував в геном в числ! 2-3-:; кол1-"1. Для пор1Бняння, ,1апс«1сг е1 а1. [19913 э кл!тинах Н. ро1уг.о:-рЬа отримзли 1,5-2,0 иг, а Сгвег зЬ а1. [19573 в Р. разссп:? отрицали 23 мг КЕбА? на 1 г С1лку при ШтеграцП В1рускз1 ДКК

в гексм рэцЕЛ1£нтного стачу» год! як клхтики S. cerevisiae спнтегували блкгько 10 .чг' HHsAj, ген якого знаходпзся в чпс-л1 51льео Е0 коп!й на плагыШ [Vslenzuela et al., 1982; Hitzeman et al., 1923]. Вкрхгавта £а7Я/-фрагмэнт плазм1ди pHSSS s геном KBsAg;, отримази касету, ВД кастилз промоторну та терм!наторку посл1добност1 гену АОХ, селектизкий маркер LEU?, i '/Hlкальки:"; сайт рестрикцп BanHI, За допомогоа uis'i касоти 1!о;к!а отримати eKcnpeciu будь-якого гетерологгчного теку в кйтинзх Н. polymorpha. Егаш мэтшготрофних др1лдж1в, цэ скнтегуютъ чужзр1дн1 б!лки, можуть предстазляти интерес для промислового виробництва.

Бйаювки

1. 3 викорпстанням лрсмоторко! та терм1наторно"1 посл1довнсс-тей гену алкогольокскдази (АОХ) дрхядж1в н. polymorpha сконотруйовако касету для експресП гетеролог!чних ген!в у ;и!тикзх цнх др!кдж1з.

2. Отримано експрес!п ген!в ß-галактозидаги (1ас7.) Е. coli i поверхзеЕого антигену Bipyoa гепатиту В (HBsAg), щр гна-ходяться п!д конторолем промотора АОХ, в кл1тикзх К. polymorpha,

3. Делзцй'хнкч: картуаанпяы промотора гену АОХ встанозлено, щр посл!довтсть промотора uix -403 i -38 п.о. необх!дна для ефективно! експресП в умовах дерепрес!1/!ндукцп, а такал достатки для глвкозно! та етанольно! penpecil в кл!-Tiniax К. polyr.orpha. ОС ласт! промотора и1к -1000 i -848 п.о. 1 -493 i -403 п.о., очевидно, ыЮтять посл!довнсст1, щр ахт:зуатъ експресйз (UAS).

Выявлено sisniKHOCTi в регуляцп експрес!! гену IzcZ nifl

- 23 -

контролем промотора ДОХ у метилотрофних i пекарськлх др!жджах,

5. Показано, що Xhol-Sall- фрагмент з геном LEU2 геному S. cerevisiae, здатний забезпечити автономзу репл!кзц1п плазм!д в .чл!ткнач Н. polyncrpha.

6. Розроблено метод позитивно! селекц!! мутачт!в Н. polynor-pha, неуткл!зуючих метанол, за допомогон пкого 1зольсвана мутант з попкодженим геном алкогольоксидаги.

7. Отримано мутанти Н. polymorpha, у яких поредбачагться позкоджекня д!лянок промотора АОХ, цо пркймають участь а глккозн!й penpecii.

СПИСОК POEIT, 0ПУЕЛ1К03АЮЯ ПО TEMI jSKJEPTAÜ.li

1. A.A.Sibirny, V, i.Titorenko, M.V.Gonchar, V.M.Ublyvovk, G.P.Ksheainskaya, O.P. Vytvytskaya. Genetic control of methanol utilisation in yeasts//J.3asic Microbiol. - 1983.-V.5.- p.293-319.

2. Сибирный A.A., Витзицкая О.П., Кулачковсгай А,Р., jfCäí-возк В.U. Селекция и свойства мутартоз штнлотрофнк. дрожжей Hansenula polymorphe с позреждеьной алксгольокси-' дазсй//!,!икробпология. - 1S89. - т. 58, вып. 5.- с.751-759.

3. Грачева В.Д., Мнханловер В.М., Щедрин А.Б,Зг.твицкэд О.П., Семенова В.Д. Предпосылки к создания системы экспрессии генов в метилэтрофнмх '■ дрожжах Hansenula polymorpha. Клонирование гена _ метаксяоксидззы//ССорнйк научных трудов ВНЮЕЗЭНТИ.- М., 1950. - т. 1. - с. 5-12.

•i. Витвицкая О.П.. Злочезский М.Л., Бебуроз M.S3. Структурно- функциональный зкглнз промотора гу.тз АОХ иетилзтрофкнх дрохжей Hansenula ро1упогрЬз//Пода:га до друку.

- Ei -

Витвкцкая 0, IL Конструирование скатаии готорологзмной анспросоиа с кспад&зстз;в;г-ы прэноторл гэаа алкогольоиспдаги на базе иатклзгрс*акп дрояскзЯ Ilansenula polyroorpha. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.23, - биотехнология. Институт микробиологии и вирусологии ил.Д.К.Заболотного HAH Украины, Киев, 1ВЭ4 год.

Исследована возможность применения метилотрофных дрся-жэи Н. polytrorpha в качество продуцентов гетерологкчных бел-К02. Используя прокоторнув и торыйпаторнув последовательности гена алкогольокскдааы (АОХ) Н. polymorpha, сконструирован вектор, содэржащай уникальный сайт рестрикция, для экспресии гетерологичньд генов в клетках метилотрсфньф дрожжей. Исследована трансформация Н, polymorpha репликатизными и создан-гсаги из базе гена АОХ интегратизныма векторами. Проведен структурно-функциональный анализ промотора гена АОХ и установлены области, активирукц::о экспрессию.Получека экспресса генов JscZ Escherichia coli и K3sA? в метилотрофных дрсниах.

Ключевые слова; др!;*дж1, промотор, гетзролоМчна експрес!я.

Vytvytsk3 O.P. Creation af tho hatorolnsous ozpressiro sysfcon using the alcohol oiridaso promoter on tho baso of tho mathylotrophic yoasfc Kansonula polyrcirpba.

Thesis to obtain the candidate of biological sciences in the speciality 03.00.23. - biotechnology, Zabolctny Institute of microbiology and virology, Ukrainian National Academy of Sciences, Kyiv, 1SS4.

The possibility of the use of the rethylctrophic yeast H. polymorphs as the producer cf heterologous proteins has boon investigated. Uring promoting and terminating sequences cf the alcohol oxidase ¡jane (A0X),the vector with the unique restriction site for the heterologous gene expression in the methylotrophic yeast cells has been constructed. The transformation of the H.polyrr.crpha by replicative and integrative vectors hss been researched. The«structural and functionc1 analysis of the AOX gene promoter has been done and the upstream activating sequences have been established. The expression of the lacZ Escherichia coli and tr.e HEsAj eer.es in the methylotrophic yeast has been recieved.