Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Факторы, влияющие на эффективность секреции рекомбинантного активатора плазминогена урокиназного типа клетками дрожжей

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Факторы, влияющие на эффективность секреции рекомбинантного активатора плазминогена урокиназного типа клетками дрожжей"

на правах рукописи

УДК5??.5.0Ч

РОМАНОВА НИНА ВЛАДИМИРОВНА

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ СЕКРЕЦИИ РЕКОМБИНАНТНОГО АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА УРОКИНАЗНОГО ТИПА КЛЕТКАМИ ДРОЖЖЕЙ

03.00.02. - биофизика

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2004

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ на кафедре молекулярной биофизики ФМБФ МФТИ (ГУ).

Научный руководитель: кандидат биологических наук Михаил Олегович Агафонов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Татьяна Сергеевна Калебина кандидат физико-математических наук Роберт Шавлович Бибилашвили

Ведущая организация:

ФГУП ГосНИИ «Генетика» (Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов)

Защита состоится 2004 г. в час. 00 мин. на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер. 9, МФТИ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ. Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук

В.Е. Брагин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение. Актуальность проблемы. Дрожжи являются удобным модельным объектом для изучения секреторного аппарата эукариотической клетки, поскольку позволяют эффективно использовать весь арсенал методов классической и молекулярной генетики. Сходство организации секреторного пути у разных эукариот позволяет использовать дрожжи в качестве организма хозяина для экспрессии секреторных белков других эукариотических организмов. При этом белок должен приобрести правильную конформацию и различные модификации. Для достижения более высоких выходов чужеродных белков исследователи стали использовать в качестве организмов-хозяев не только традиционный объект молекулярно-генетических исследований -Saccharomyces еегеу1$1ае, но и другие виды дрожжей, в том числе метилотрофные дрожжи Иатепы1а ро1уто^а. Однако, многие процессы, происходящие в секреторном пути, не консервативны и существенно дивергировали у разных организмов в ходе эволюции. Очевидно, что с этим связано то, что многие белки высших эукариот неспособны эффективно секретироваться клетками дрожжей. Одним из таких белков является человеческий активатор плазминогена урокиназного типа (иРА). Изучение факторов, влияющих на эффективность секреции рекомбинантных белков клетками дрожжей, может дать ключ к пониманию эволюционных особенностей организации дрожжевого секреторного аппарата, что, в свою очередь, позволит направленно менять свойства реципиентных штаммов и делать их пригодными для получения активных и правильно модифицированных белковых продуктов.

Цели и задачи исследования. Данная работа была направлена на изучение эволюционных особенностей дрожжевого секреторного аппарата, обуславливающих низкую эффективность секреции белков высших эукариот клетками дрожжей. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:

* «ЙЕ»/1

1) Выяснить причины неэффективной секреции иРА клетками дрожжей.

2) Определить, какие домены иРА определяют низкую эффективность секреции.

3) Изучить механизмы, приводящие к увеличению эффективности секреции иРА в клетках мутантов ори24, ret 1-27 wpmtl H. polymorpha.

Научная новизна. Несмотря на то, что ранее предпринимались попытки получить дрожжевые штаммы продуценты секретируемого иРА, высокого уровня секреции этого белка клетками дрожжей достичь не удавалось. В данной работе впервые было показано, что это ограничение уровня секреции связано не с недостаточным уровнем синтеза иРА, а с тем, что лишь небольшая часть синтезирующегося белка преодолевает дрожжевой секреторный аппарат и секретируется. Было показано, что uРА плохо секретируется клетками дрожжей по причине неэффективного сворачивания в эндоплазматическом ретикулуме, что при определенных условиях приводит к образованию высокомолекулярных агрегатов этого белка. Было показано, что соотношение белка в агрегированной и растворимой форме в клеточных лизатах зависит от его способности приобретать правильную конформацию и секретироваться. Это наблюдение было использовано для изучения причин увеличения уровня секреции иРА у ряда мутантных штаммов и было продемонстрировано, что мутации в генах OPU24, RET1 и PMTJ H. polymorpha приводят к улучшению условий для правильного сворачивания иРА в дрожжевом ЭР, за счет чего увеличивается эффективности секреции иРА.

Практическое значение работы. В диссертации были разработаны подходы, позволяющие увеличить продукцию рекомбинантного активатора плазминогена урокиназного типа клетками дрожжей. Эти подходы могут быть также использованы для увеличения продуктивности дрожжевых продуцентов других рекомбинантных белков.

Апробация работы. Основные результаты, изложенные в диссертации, докладывались и обсуждались на III съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) (Москва, 2004), 8-ой Международной Пущинской

школе-конференции молодых ученых (Москва, 2004), III съезде Российского Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), 2-ой Международной конференции сообщества по изучению Hansemtlapolymorpha (Tenerife, 2002).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисных сообщений.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на страницах и включает рисунка, таблиц и список

цитируемой литературы, содержащий ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе применяли стандартные методы генетики дрожжей (Sherman et al., 1986) и молекулярного клонирования (Sambrook et al., 1989); биохимические методы, такие как электрофорез белков и иммуноблоттинг (Laemmli, 1970; Towbin et al., 1979). В работе использовали штаммы дрожжей Н. polymorpha, из коллекции лаборатории молекулярной генетики ИЭК РКНПК МЗ РФ и штамм дрожжей S. cerevisiae YPH499 (МАТа Ieu2 his3 Iys2 ade2 trpl игаЗ) (Yoshida et al., 1995). Активность uPA определяли фибринолитическим методом (Astrup et al., 1952).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Зависимость эффективности секреции uPA от уровня экспрессии в клетках R.polymorpha

Для того чтобы обеспечить экспрессию и секрецию человеческого белка uPA клетками дрожжей Н. polymorpha, использовали экспрессионную кассету МОХ:иРА, которая включала в себя ORF, кодирующую uPA с дрожжевым сигналом секреции, а также промотор гена МОХ и терминатор транскрипции. При помощи подходов, разработанных ранее в лаборатории молекулярной

генетики РКНПК (Agaphonov et 1995; Agaphonov et 1999), был получен набор штаммов, которые отличались друг от друга местом интеграции и копийностью экспрессионной кассеты МОХ.иРА (таблица 1). Способность штаммов продуцировать uРА оценивали по активности uРА в культуральной среде и клеточных лизатах. В дополнение, количество иРА в клеточных лизатах определяли методом иммуноблоттинга.

Анализ штаммов, несущих одну копию экспрессионной кассеты, интегрированную в различные локусы показал, что эффективность экспрессии гибридного гена зависит от его положения в геноме. Способность штаммов продуцировать иРА в случае интеграции экспрессионной кассеты МОХ.иРА в локусы генов МОХ и LEU2 была практически одинакова. У штамма с экспрессионной кассетой, интегрированной в теломерную область, активность иРА в культуральной среде и в клеточных лизатах была заметно ниже по сравнению со штаммами, несущими этот гибридный ген в локусах гена МОХ и LEU2. Также было заметно снижено количество иРА в клеточных лизатах, выявляемое иммунологически. Это говорило об уменьшенном уровне экспрессии иРА при интеграции кассеты в теломерную область по сравнению с уровнем экспрессии иРА в случае интеграции кассеты в локусы генов МОХ или LEU2.

При анализе штаммов с разной копийностью интеграции наблюдалась положительная корреляция количества иРА в клеточных лизатах с количеством копий экспрессионной кассеты. Это свидетельствовало о том, что уровень экспрессии гибридного гена увеличивается с увеличением количества его копий в геноме. Одновременно с этим, увеличение копийности приводило к снижению активности иРА как в культуральной среде, так и в клеточных лизатах. Таким образом, увеличение уровня экспрессии с определенного момента приводило к значительному накоплению неактивного белка внутриклеточно и ингибированию его секреции. Такая тенденция наблюдалась во всех штаммах, независимо от локуса интеграции.

2. Свойства секретируемого и внутриклеточного uРА

uPA, обнаруживаемый в культуральной среде, мигрировал при электрофорезе в присутствии SDS в виде диффузного пятна (рисунок 1). После обработки эндогликозидазой Н (EndoH), ферментом, отщепляющим N гликозидные цепи, это диффузное пятно конвертировалось в четкую полосу. Это говорило о том, что ^гликозид в составе молекулы uРА при прохождении аппарата Гольджи модифицируется добавлением «внешних» цепей, которые могут сильно варьировать по размеру.

Таблица 1. Зависимость уровня секреции uРА от количества копий и локуса интеграции экспрессионной кассеты МОХ:иРА.

Количество копий иРА (%) Штамм кассеты в локусе_

mox Ieu2 теломерная область активность в культуральной среде активность в клеточных лизатах количество в клеточных лизатах*

DLU/L 1 100 100 100

DUM/pAM226 1 96 119 f 98

DUM/pAM219/1 1 • 68 59 21

DLÄWpAM219/2 2 50 49 170

DLU/pAM219 1 1 29 71 560

DLU/pAM226 1 1 17 45 620

DL4M/pAM281/1 -8 10 7 1400

DUM/pAM281/2 -8 20 7 1100

* Данные сравнения фибринолитической активности в серии разведений. За 100% принималась активность в препаратах штамма DLU/L, которая, исходя из сравнения с препаратом uРА человека, составляла в расчете на мг клеточного белка примерно 10 ед в случае препарата культуральной среды и 7 ед в случае препарата клеточного лизата

** Вычисление путем сравнения интенсивностей полосы 50кДА на иммуноблоттинге в серии разведений. За 100% принималось количество белка в штамме DLU/L, которое по результатам сравнения со стандартным препаратом рекомбинантного uРА. выделенного из Е. coli, равнялось примерно 1,6 мкг на мг общего клеточного белка

uPA синтезируется в виде предшественника с м.в. 48кДа, который состоит из трех доменов - двух N-концевых, несущественных для энзиматической активности, и С-концевого, каталитического домена. Полоса uPA из культуральной среды, обработанного EndoH, мигрировала при электрофорезе на уровне ЗОкДа. Концентрация белка в культуральной среде, вычисленная по интенсивности этой полосы на иммуноблоте, составляла примерно 0,15 мкг/мл, а активность около 14 ед/мл. Поскольку удельная активность очищенного человеческого uPA составляет около 1,7x105 ед/мг, а дрожжевая N-гликозидная цепь в некоторой степени ингибирует фибринолитическую активность uPA (Wang et al., 2000), можно было утверждать, что белок, соответствующий полосе ЗОкДа, обладает фибринолитической активностью и образуется в результате отщепления N-концевых доменов.

Анализ uPA, обнаруживаемого внутриклеточно у штамма DLU/L, показал, что этот белок образовывал высокомолекулярные агрегаты, поскольку большая его часть оказывалась в осадке после центрифугирования осветленных клеточных лизатов при 10 000 g в течение 10 минут (см. пункт 4). В отличие от секретируемой формы, uPA, обнаруживаемый внутриклеточно, мигрировал при электрофорезе четкой полосой, и его электрофоретическая подвижность лишь ненамного возросла после обработки EndoH (рисунок 1). Это означало, что N-связанные гликозидные цепи молекул uPA, обнаруживаемого внутри клеток, не получают модификаций, характерных для аппарата Гольджи, а значит, агрегаты uPA образуются в ЭР. Однако это не означало, что они постоянно локализованы в этом компартменте. Нельзя исключить, что в агрегированном виде uPA проходит через аппарат Гольджи, а модификации гликозидов не происходит из-за их экранирования в агрегатах. Более того, мы наблюдали наличие продуктов протеолиза uPA в составе агрегатов, что указывало на то, что агрегаты проходят компартменты, содержащие протеазы. ЭР, по-видимому, содержит единственный протеолитический фермент - сигнальную пептидазу, которая вряд ли может принимать участие в протеолизе агрегированной uPA.

Возможно, агрегаты в какой-то момент попадают в вакуоль - органеллу, содержащую целый комплекс протеолитических ферментов.

Рисунок 1. Анализ методом иммуноблоттинга с антителами к иРА культуральной среды и осадочной фракции клеточного лизата штамма DLU/L {1еи2 тох::иРА ТЕи[ЬЕи2и).

1 - культуральная среда

2 - культуральная среда, обработанная EndoH

3 - осадочная фракция клеточного лизата

4 - осадочная фракция клеточного лизата, обработанного EndoH.

3. Эффективность секреции uРА зависит от наличия в составе молекулы ^концевых доменов и участка ^гликозилирования

В секреторном пути иРА модифицируется присоединением гликозидной цепи к аспарагиновому остатку в 302 положении (рисунок 2). Замена этого остатка на другой приводит к нарушению ^гликозилирования. Мы экспрессировали в клетках дрожжей Н. polymorpha под контролем промотора МОХ варианты иРА, отличающиеся наличием участка ^гликозилирования и ^концевых доменов. Вариант uPA-Q отличался от белка дикого типа (иРА) аминокислотной заменой аспарагинового остатка на глутаминовый в 302 положении. Вариант uPA-С и uPA-CQ были лишены ^концевых доменов, при этом вариант uPA-CQ также имел нарушенный участок ^гликозилирования. Экспрессионные кассеты этих белков были интегрированы в одной копии в локус МОХ. Количество uPA, uPA-Q, uPA-C и uPA-CQ в культуральной среде сравнивали по активности и при помощи иммуноблоттинга (таблица 2).

Оказалось, что отсутствие ^концевых доменов (вариант uPA-C) приводит к значительному увеличению секреции по сравнению с белком дикого типа. Отсутствие же ^гликозилирования наоборот уменьшило количество секретируемого белка - приблизительно в 3 раза при анализе активности вариантов в культуральной среде. И эта разница оказалась даже больше (примерно 7 раз) при сравнении вариантов uРА и uPA-Q в культуральных средах методом

анализа активности и иммунологического тестирования в жидкой среде могли определяться тем, что дрожжевая N-гликозидная цепь способна снижать удельную активность uРА в отношении высокомолекулярных субстратов (Wang et al., 2000). Это должно приводить к занижению результатов оценки количества гликозилированного варианта по активности. Поэтому можно заключить, что для сравнения эффективности секреции гликозилированного и негликозилированного варианта метод иммуноблоттинга является более адекватным.

Рисунок 2. Схематическое изображение вариантов иРА. Обозначения: ^ - участок активации иРА, -Ы-гликозид,

Q - аминокислотная замена, которая привела к нарушению N - гликозилирования uРА.

Таблица 2. Сравнение эффективности секреции различных вариантов uРА при экспрессии в клетках дрожжей Н. ро1утогрИа.

Количество иРА в культуральной среде

варианты иРА

определяли при помощи:

Фибринолитический тест на активность (%) Иммуноблоттинг* (%)

иРА 100 100

иРА-С 1850 1500

uPA-Q 30 14

uPA-CQ 770 330

*Оценено сравнением интенсивности полос, соответствующих 30 кДа, на иммуноблоте в серии разведений препаратов культуральной среды. иРА, находящийся в культуральной среде, был обработан EndoH перед нанесением на полиакриламидный гель.

Нарушение ^гликозилирования в варианте без N концевых доменов (uPA-CQ) также приводило к снижению секреции. В то же время уровень секреции uPA-CQ был заметно выше уровня секреции нормального белка uРА. Природа негативного влияния нарушения ^гликозилирования на эффективность секреции uРА, очевидно связана с важностью ^гликозидной цепи в процессе укладки белка и распознавании неправильно свернутых молекул.

Относительно негативного влияния ^концевых доменов на укладку молекулы иРА можно делать разные предположения. Например, оно может быть обусловлено свойствами ^концевых доменов самих по себе. То есть, можно предположить, что С-концевой домен способен относительно легко приобрести правильную конформацию, а ^концевые домены - нет, при этом вся молекула будет детектироваться системой контроля качества сворачивания белков в ЭР (ERQC) как неправильно свернувшаяся. С другой стороны, мультидоменные секреторные белки не характерны для дрожжей и, возможно, низкая эффективность сворачивания молекул иРА в дрожжах связана с тем, что взаимодействие полипептидных цепей соседних доменов мешает их укладке.

4. Низкая эффективность секреции иРА коррелирует с его агрегацией в путях секреции

Степень агрегации четырех вариантов uPA, uPA-Q, uPA-C и uPA-CQ в клетках дрожжей Н. polymorpha оценивали методом иммуноблоттинга по соотношению интенсивности сигнала в растворимой и нерастворимой фракции клеточных лизатов. Растворимую и нерастворимую фракции получали центрифугированием осветленных клеточных лизатов, которые для предотвращения связывания белка с мембранными фракциями получали в присутствии детергента (1% Triton-X100).

Анализ степени внутриклеточной агрегации различных вариантов uРА показал, что соотношение белка в растворимой и нерастворимой фракции клеточных лизатов коррелирует с эффективностью секреции изучаемого

варианта белка. Т. е. чем лучше белок секретируется, тем больше его обнаруживается в растворимой фракции и меньше в агрегатах: при экспрессии варианта uPA-С, который обладает самой высокой эффективностью секреции, доля белка в растворимом состоянии была максимальной; наименьшая доля растворимого белка обнаруживалась в клетках штамма с вариантом uPA-Q -варианта с самым низким уровнем секреции (рисунок 3).

Рисунок 3. Анализ методом иммуноблоттинга с антителами к uРА клеточных лизатов штаммов DLU, DLC, DLQ и DLCQ, экспрессирующих варианты uPA, uPA-C, uPA-Q и uPA-CQ соответственно.

О - нерастворимая фракция, С - растворимая фракция.

Осадочные фракции были разведены в 2- кратном объеме исходного осветленного лизата.

Поскольку in vitro uPA самопроизвольно не агрегирует даже в высокой концентрации, наиболее логичным объяснением природы агрегации является слипание неправильно уложенных молекул. При высоком уровне экспрессии uPA мы наблюдали значительное снижение секреции этого белка и увеличение его количества внутри клеток в неактивном виде. Объяснением этого эффекта может являться то, что при высоком уровне синтеза увеличивается концентрация неуложенных молекул uPA, которые мешают друг другу приобрести правильную конформацию и слипаются в агрегаты. Количество uPA в растворимой фракции должно зависеть от того, как эффективно белок получает правильную укладку, что предотвращает агрегацию, и от скорости выхода белка из ЭР, после чего он получает модификации, меняющие его подвижность и секретируется. Очевидно, что скорость, с которой хорошо секретируемые варианты uPA покидают ЭР, не может быть ниже, чем у плохо

секретируемых, а значит равновесная концентрация растворимого иРА внутри клеток определяется эффективностью укладки его молекулы. То есть белок в растворимой фракции - это, по крайней мере, в существенной степени тот белок, который приобрел правильную конформацию и, в конце концов, секретируется. В то же время, агрегаты формируются из неправильно уложенного белка и их количество будет тем больше, чем ниже эффективность укладки.

5. Влияние температуры инкубации при экспрессии uРА в клетках дрожжей H.polynwrpha

Известным фактом является то, что понижение температуры инкубации при экспрессии в клетках бактерий E.coli гетерологичных белков, которые образуют тела включения, приводит к улучшению их сворачивания и увеличению доли этих белков в растворимой форме. Поэтому мы предположили, что снижение температуры инкубации в процессе индукции экспрессии иРА в клетках Н. polymorpha также может привести к улучшению эффективности сворачивания этого белка.

В предыдущих экспериментах индукцию экспрессии иРА проводили при температуре 37°С, которая является оптимальной для выращивания дрожжей Н. polymorpha (Levine and Cooney, 1973). Чтобы проверить является ли эта температура оптимальной для секреции иРА мы сравнили эффективность секреции этого белка при температурах инкубации 30°С и 37°С и обнаружили существенное увеличение количества секретируемого продукта при понижении температуры (рисунок 4А). Одновременно с увеличением секреции понижение температуры инкубации снижало количество uРА внутри клеток (рисунок 4Б). Это подтверждало наше предположение, что низкая эффективность секреции uРА и внутриклеточное накопление белка в виде высокомолекулярных агрегатов обусловлено его неэффективной укладкой в дрожжевом секреторном пути.

Б 30°С 37°С кДа

^MgMk ™ 57

. ii<n" 41HP

ГГ -38 ~ 33

Рисунок 4. Анализ методом иммуноблоттинга с антителами к uРА

культуральной среды и клеточного лизата штамма

DLQ/L (Ieu2 mox::uPA-Q TEL:[LEU2]) после индукции в нем экспрессии uРА

при 30°С и 37°С.

А. - культуральные среды.

Б. - клеточные лизаты.

6. Роль вакуолярной деградации в секреции иРА

Известно, что некоторые рекомбинантные белки, проходя секреторный путь, могут направляться из поздних компартментов аппарата Гольджи в вакуоль для деградации (Hong et al., 1996; Holkeri and Makarow, 1998). Поэтому мы не могли исключать, что иРА также может направляться в вакуоль на деградацию. Чтобы это проверить мы исследовали влияние мутаций в генах VPS10 и РЕР4 на секрецию иРА. Ген VPS10 кодирует рецептор, транспортирующий белки из аппарата Гольджи в вакуоль, а ген РЕР4 -вакуолярную протеиназу А, активирующую другие вакуолярные протеазы.

6.1. Нарушение гена VPS 10 не увеличивает эффективность секреции иРА

Для того чтобы проверить, сопровождается ли нарушение сортировки в вакуоль в клетках дрожжей увеличением секреции иРА, была получена делеция гена VPS10 в штамме с экспрессионной кассетой uPA-Q. Это нарушение действительно привело к секреции вакуолярного белка CPY в культуральную среду (данные не приведены).

Биологическая функция uРА - это инициация лизиса фибриновых сгустков путем протеолитической активации плазминогена. Поэтому вокруг колоний, секретирующих uРА, при росте на специальной среде, содержащей фибрин, в результате его лизиса образуются зоны просветления. При росте на такой среде мутант образовывал зоны лизиса значительно большего

размера, чем штамм дикого типа (рисунок 5). Однако это было связано не с увеличением секреции uРА, а с протеолитическим процессингом uРА, поскольку при выращивании в жидкой среде мутантный штамм секретировал не больше uРА, чем штамм дикого типа, однако в случае мутанта иРА обнаруживался исключительно в виде протеолитического фрагмента с молекулярной массой 30 кДа (рисунок 6). uРА синтезируется в виде неактивного предшественника, который активируется в результате протеолиза с образованием полипептидной цепи размером 30кДа. Очевидно, что нарушение гена VPS 10 по каким-то причинам привело к тому, что секретированный белок был полностью процессирован в этой области и поэтому был более активным.

6.2. Мутациярер4Л не влияет на эффективность секреции иРА

Ген РЕР4 кодирует предшественник протеазы, обеспечивающей каскадную активацию вакуолярных протеаз, которые участвуют в деградации белков (Jones et al., 1982). Для того чтобы проверить, повлияет ли нарушение вакуолярной деградации на эффективность секреции uРА, была получена делеция этого гена в штамме с экспрессионной кассетой uPA-Q.

При помощи метода иммуноблоттинга было обнаружено, что количество секретируемого uPA-Q, как клетками дикого типа, так и клетками штамма Арер4, практически одинаково (рисунок 7). При этом в результате мутации принципиально не изменился набор протеолитических фрагментов uPA-Q в культуральной среде.

Полученные данные позволили нам утверждать, что нарушение вакуолярной деградации не может являться причиной «сверхсекреции» uPA, a вакуолярные протеазы, активируемые продуктом гена РЕР4, не вносит существенного вклада в протеолиз секретируемого uРА.

Рисунок 5. Влияние делеции гена VPS10 на размер зоны лизиса при росте штамма на среде, содержащей фибрин.

VPS10 - штамм DLQ/L (Ieu2 mox::uPA-Q TEL:[LEU2J) &vps10 - штамм DLQ-Avps10 (Ieu2 mox::uPA-Q vps10::LEU2^

VPS10 AvpslO

кДа Рисунок 6. Анализ методом иммуноблоттинга с антителами — 57 к uPA культуральных сред.

- 38

- зз

УР810 - штамм ОКЖ (1еи2 тох'.иРА-О ТЕЦ1.Еи2]) АурзЮ - штамм ОЮ-ДурэЮ (/еи2 тох::иРА-0 урв10.±Еи2)

Рисунок 7. Анализ методом иммуноблоттинга с антителами к uPA культуральных сред

РЕР4 ^рер4кДа

_ 38 РЕР4 -штамм DLQ/L (Ieu2 mox\vPA-Q TEL:[LEU2J) _ зз Apep4 - штамм DLQ-Apep4 (Ieu2 mox::uPA-Q pep4::LEU2).

7. Мутации, увеличивающие секрецию uРА

В лаборатории молекулярной генетики ранее была получена коллекция мутантов Н polymorpha, с увеличенной способностью к секреции uРА. В ряде случаев были идентифицированы гены, в которых произошли мутации. В данной работе мы анализировали проявления мутаций гей-27, ори24, pmtl и ртг1-Л Н. polymorpha с точки зрения их влияния на секрецию иРА. Мутация ртй снижает степень О-гликозилирования секретируемых белков, поскольку нарушает один из белков семейства протеин-О-маннозилтрансфераз, осуществляющих перенос первого маннозного остатка О-гликозидных цепей на сериновые и треониновые аминокислотные остатки белков, синтезирующихся в ЭР. Ген ОРи24 кодирует пирофосфорилазу ГДФ-маннозы - фермент, обеспечивающий синтез соединения, которое используется в качестве донора остатков маннозы для синтеза гликозидных цепей белков. С этим связано то, что мутация ори24 приводит к нарушению гликозилирования белков. Ген РМЯ1 кодирует мембранную Сг2* АТФазу, которая обеспечивает транспорт Са2<

против градиента концентрации из цитозоля в средние цистерны аппарата Гольджи. Инактивация этого гена приводит к сильному снижению концентрации ионов кальция в компартментах секреторного пути. Мутация

retl-27нарушает С-концевой домен a-субъединицы белкового комплекса COPI, который обеспечивает везикулярный транспорт между компартментами секреторного пути. COPI-зависимый транспорт, в частности, обеспечивает возвращение в ЭР резидентных и неправильно уложенных белков из промежуточного компартмента.

7.1. Агрегация иРА в мутантах ори24, pmtl и retl-27, «сверхсекретирующих» иРА

Чтобы проверить влияют ли «сверхсекреторные» мутации на эффективность сворачивания иРА, мы интегрировали экспрессионную кассету МОХ.иРА в геном мутантных штаммов и штаммов, несущих аллели изучаемых генов дикого типа. В полученных транс формантах индуцировали экспрессию этого белка и исследовали степень его агрегации.

Оказалось, что в клетках исследуемых мутантов количество агрегированного иРА было ниже, а количество растворимого выше, чем в клетках штамма дикого типа (рисунок 8). Это свидетельствовало о том, что в результате этих мутаций эффективность секреции иРА увеличивается за счет улучшения условий для укладки молекулы этого белка в эндоплазматическом ретикулуме. Однако для разных мутаций можно предполагать разные механизмы их влияния на секрецию иРА.

Мутация ори24, помимо нарушения гликозилирования, приводит к дефекту элиминации неправильно свернутых белков в ЭР (Agaphonov et al., 2000). Поскольку гликозилирование существенно для эффективной укладки белковых молекул, можно ожидать, что в результате этой мутации больше белков, синтезируемых клеткой, будут неспособны принять правильную конформацию, а дефект их элиминации приведет к накоплению большого количества неправильно свернутого белка в ЭР. Это должно активировать механизм ответа клетки на накопление в ЭР неправильно свернутых белков (unfolded protein response, UPR). Активация этого сигнального пути приводит, например, к увеличению синтеза шаперонов ЭР, что может способствовать

правильной укладке таких белков как uРА, таким образом, увеличивая эффективность секреции.

Мутация ори24 влияет на все типы гликозилирования секретируемых белков и изучение этого мутанта не позволяло связать улучшение эффективности секреции uРА с дефектом какого-то конкретного типа гликозилирования. В отличие от мутации ори24, мутация в гене РМТ1 приводит к нарушению исключительно О-гликозилирования белков и этого уже достаточно для увеличения эффективности секреции иРА.

С точки зрения анализа возможных причин «сверхсекреторного» фенотипа мутанта РМТ1 важно знать, не модифицируется ли иРА в секреторном пути дрожжей присоединением О-гликозидных цепей при участии белка Pmtlp. В наших экспериментах uPA-Q секретированный дрожжами мигрировал при SDS-электрофорезе четкой полосой, подвижность которой соответствовала подвижности белка выделенного из Е. coli и заведомо несодержащего модификаций. Более того, мы не выявили разницы в электрофоретической подвижности uPA-Q, секретируемого мутантом pmtl и клетками дикого типа (данные не приведены). Несмотря на это, мы не можем исключить, что, например, один или два остатка серина или треонина в молекуле иРА модифицируются присоединением О-гликозидной цепи при помощи Pmtlp, не приводя к заметному изменению эпектрофоретической подвижности.

Известно, что О-гликозилирование неправильно свернутых белков может препятствовать их выходу из ЭР в цитозоль для утилизации посредством деградации (Harty et al., 2001). Если бы это было верно для uРА, который может содержать О-гликозидную цепь, накопление uРА в ЭР клеток дикого типа должно быть намного большим чем в клетках мутанта, обладающего нарушением О-гликозилирования белков. Так как накопление uРА в клетках дикого типа может мешать укладке синтезирующегося иРА в ЭР, то будет, в итоге, «отравлять» секрецию. Поэтому можно было предположить, что мутация pmtl увеличивает эффективность секреции uРА благодаря снижению

накопления в ЭР неправильно свернутого uРА. Однако, при низком уровне экспрессии uРА, когда не происходит его внутриклеточного накопления, мутация pmtl также приводила к увеличенной секреции uРА (данные не приведены). Следовательно, «сверхсекреция» uРА мутантом pmtl, скорее всего, не может определяться усилением элиминации неправильно свернутого белка.

Можно предложить еще две гипотезы, объясняющие феномен «сверхсекреции» uРА мутантом pmtl. Первая также основывается на предположении, что uРА О-гликозилируется. И если эта модификация может каким-то образом мешать сворачиванию uРА в ЭР, то отсутствие 0-гликозилирования uРА будет увеличивать секрецию этого белка. Однако нам не известны данные, указывающие на то, что О-гликозиды могут мешать укладке белков. Напротив, известно, что в некоторых случаях это необходимо для стабильности некоторых секреторных белков в дрожжах S. cerevisiae (Sanders et al., 1999; Strahl-Bolsinger et al., 1999), а инактивация гена РМТ1 в дрожжах Н. polymorpha приводила к снижению количества О-гликозилированных белков, к примеру - хитиназы (Соколов С.С., не опубликовано). О-гликозилирование может быть необходимо для стабильности не только хитиназы, но и возможно, других О-гликозилированных белков Н. polymorpha. Роль О-гликозилирования в укладке белков и их стабильности в дрожжах подтверждается также тем, что О-гликозидные цепи присоединяются, по-видимому, к еще несвернутым молекулам белков (Strahl-Bolsinger et al., 1999; Harty et al., 2001). Поэтому вторая гипотеза совпадает с предположением, сделанным для мутации ори24. То есть дефект О-гликозилирования приводит к появлению неправильно свернутых белков, что активирует UPR, увеличивая синтез белков, способствующих сворачиванию белков в ЭР, и, таким образом, увеличивается эффективность секреции иРА.

Мутация retl-27 приводила к неспособности клеток расти при недостатке ионов кальция в среде и снижению количества Pmrlp в клетке- белка, обеспечивающего транспорт кальция в цистерны аппарата Гольджи. Было также обнаружено, что мутация retl-27 приводит к секреции аберрантных форм

иРА с аномальной электрофоретической подвижностью, обладающих при этом фибринолитической активностью. Оценки количества этих аберрантных форм позволяли предполагать, что они вносят существенный вклад в «сверхсекреторный» фенотип мутанта (данные М. Б. Чеченовой). Секрецию аберрантных форм иРА мутантом Ш1-27 можно объяснить нарушенным СОР1-зависимым транспортом, который, в частности, обеспечивает возвращение в ЭР неправильно свернутых белков, которые по каким-либо причинам смогли попасть из ЭР в следующий компартмент секреторного пути.

При увеличении экспрессии гена PMR1 в клетках мутанта Ш1-27 степень агрегации усилилась даже по сравнению со штаммом дикого типа (рисунок 8), хотя сверхсекреторный фенотип был подавлен не полностью (данные не приведены). По-видимому, «сверхсекреторный» фенотип этого мутанта имел двоякое происхождение. С одной стороны нарушение баланса ионов кальция каким-то образом привело к улучшению условий для укладки молекул иРА в дрожжевом ЭР, а с другой - секреция «недоуложенных» молекул также вносила свой вклад в «сверхсекреторный» фенотип мутанта. Увеличение экспрессии гена PMR1 в клетках мутанта приводило к ухудшению эффективности укладки иРА и, возможно, даже снижению количества «недоуложенных» молекул этого белка, способных в мутантных клетках покинуть ЭР и секретироваться.

В связи с этим интересно было понять, как влияет нарушение гена PMR1 И. polymorpha на процесс секреции иРА. Действительно, штамм с мутацией в этом гене образовывал существенно большие зоны лизиса на твердой среде, содержащей фибрин, чем штамм дикого типа, что свидетельствовало об увеличении эффективности секреции (рисунок 9). Однако, количество секретированного иРА при росте мутанта в жидкой среде в расчете на клеточный белок было сопоставимо со штаммом дикого типа (данные не приведены). Мы сталкивались с похожим несоответствием при изучении штамма с нарушенным рецептором транспортировки белков в вакуоль. В том случае несоответствие объяснялось массовой протеолитической активацией иРА в процессе секреции, в результате чего мутант секретировал не больше

белка, чем штамм дикого типа, но этот белок был полностью активирован. Несмотря на то, что мутация в гене PMR1 приводит к нарушению сортировки белков в вакуоль (Плотникова ТА, не опубликовано), это объяснение в данном случае не годится, поскольку мы не обнаружили увеличения количества активированной формы uРА у мутанта по сравнению со штаммом дикого типа (рисунок 10). Скорее всего, мутация действительно увеличивает эффективность секреции uРА, а несоответствие между результатами, полученными при выращивании на чашке и в жидкой среде, связано с тем, что штамм очень плохо рос в жидкой среде и, возможно, экспрессия иРА была очень низкой. На это указывал и результат анализа внутриклеточной аккумуляции иРА - у мутанта белок фактически не накапливался (рисунок 11). Этот факт вместе с невысоким уровнем секреции свидетельствовал о том, что у мутанта улучшение эффективности секреции компенсируется снижением уровня экспрессии гена иРА в жидкой среде.

Рисунок 8. Анализ методом иммуноблотгинга с антителами к иРА клеточных лизатов

А. осадочная (О) и растворимая (С) фракции клеточных лизатов. OPU24 - штамм 3aMA60/L24/A {Ieu2 ори24 [LEU2, OPU24]), ори24 - штамм 3aMA60/L/A {Ieu2 opu24 [LEU2]), осадочная фракция разведена в 10 раз относительно исходного осветленного лизата

Б. осадочная (О) и растворимая (С) фракции клеточных лизатов РМТ1 - штамм DL/AM226 [Ieu2 [LEU2, и PA}), pmtl - штамм DLM-20/AM226 (leu2:[LEU2, uPA]pmt1-1) осадочная фракция разведена в 25 раз

В. осадочная (О) и растворимая (С) фракции клеточных лизатов RET1 - штамм 2d-C (Ieu2 тох::иРА ret1-27 [LEU2 RET1]), ret1-27 - штамм 2d-L (Ieu2 mox::uPA ret1-27 [LEU2J), ret1-27+*PMR1 -штамм 2d-P10 (Ieu2 mox: uPA ret1-27 10X[LEU2 PMR1J)

осадочная фракция разведена s 5 раз 19

Рисунок 9. Влияние делеции I эна РМЯ1 на размер зоны лизиса при росте штамм > на среде, содержащей фибрин.

РМР1 - штамм ОЮА. (1еи2тс х::иРА-0 ТЕЦ1.Еи2]) Дртг1 ■ штамм ртг440 (1еи2 сг ж:иРА-0 ртг1:±Е1)2)

Рисунок 10. Анализ методом t ммуноблоттинга с антителами к иРА культуральн лх сред.

pmrl - штамм pmr44Q (Ieu2 mos uPA-Q pmrl LEU2) PMR1- штамм DLQ/L (Ieu2 тохмРА-Q TEL:[LEU2J)

Рисунок 11. Анализ методом иммуноблоттинга с антителами к иРА клеточных лизатов.

ртП - штамм ртг1-44/М (1еи2 тох::иРА ртП:±Еи2 [МОХ]) РМЙ1- штамм ртг1-44/М_РМШ (1еи2 тоху.иРА ртП: 1Е1!2 [МОХ; РМЯ1])

Количество препарата клеточного лизата штамма ртг1-44/М, наносимое на дорожку, было в 2 раза больше, чем штамма ртг1-44/М_РМР1.

выводы

1. Человеческий активатор плазминогена урокиназного типа (иРА) плохо секретируется клетками дрожжей по причине неэффективного сворачивания в эндоплазматическом ретикулуме.

2. Дефект укладки иРА в дрожжевом эндоплазматическом ретикулуме в существенной степени определяется ^концевыми доменами этого белка.

3. При высоком уровне синтеза иРА происходит его внутриклеточное накопление в виде высокомолекулярных агрегатов. Агрегаты формируются в эндоплазматическом ретикулуме. Количество белка в агрегированной форме зависит от эффективности его укладки в эндоплазматическом ретикулуме.

4. Мутации ори24, кй-27 и pmtl, увеличивающие эффективность секреции иРА, снижают степень агрегации этого белка в эндоплазматическом ретикулуме, что свидетельствует об улучшении условий для правильного сворачивания этого белка.

5. Улучшение укладки иРА у мутанта кй-27 связано с нарушением баланса кальция в секреторном пути.

6. Нарушение транспортировки белков из поздних компартментов аппарата Гольджи в вакуоль не увеличивает эффективность секреции иРА, но увеличивает протеолитический процессии г этого белка.

7. Протеолитический процессинг иРА в существенной степени не зависит от вакуолярных протеаз, активируемых продуктом гена РЕР4, протеиназой А.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Chechenova M.B., Romanova N.V., Deev A.V, Packeiser A.N., Smirnov V.N., Agaphonov M.O. and Ter-Avanesyan M.D. C-terminal truncation of a-COP affects functioning oj secretory organelles and calcium homeostasis in Hansenulapolymorpha. Eukaryotic Cell 2004; V.3, p.52-60.

2. Agaphonov M.O., Romanova N.V., Trushkina P.M., Smirnov V.N. and Ter-Avanesyan M.D. Aggregation and retention ofhuman urokinase type plasminogen activator in the yeast endoplasmic reticulum. BMC Mol Biol. 2002; V.3, p. 15.

3. Ill съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». 6-12 июня 2004, Москва. Чеченова М.Б., Романова Н.В., Агафонов М.О. Механизмы, обуславливающие «сверхсекреторный» фенотип у мутантов дрожжей. Сборник тезисов, т.1., стр. 346.

4. 8-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука XXI века». 17-21 мая 2004, Пущино. Романова Н.В. Влияние нарушении транспорта белков в вакуоль на секрецию урокиназы человека клетками дрожжей Hansenula polymorpha. Сборник тезисов, стр. 29.

5. 2nd Hansenula polymorpha worldwide network conference. 26-29 September, 2002, University La Laguna Tenerife, Canary Islands. Agaphonov M.O., Romanova N.V., Chechenova M.B. and Ter-Avanesyan M.D. Heterologous protein secretion in Hansenula polymorpha as a model /or study of eukaryotic secretory pathway. Program and Abstracts, p. 17.

6. Ill съезд Российского Биохимического общества. 26 июня - 1 июля 2002, Санкт-Петербург, Россия. Чеченова М.Б. Романова Н.В. Агафонов М.О. Урокиназа человека как модель для изучения механизмов секреции у дрожжей. Тезисы научных докладов, стр. 124.

7. 21s1 International specialized symposium on yeasts: "Biochemistry, genetics, biotechnology and ecology of non-conventional yeasts". 21-25 August, 2001, Lviv, Ukraine. Agaphonov M.O.. Romanova N.V., Chechenova M.B. and Ter-Avanesyan M.D. Secretion ofthe human urokinase by yeasts Saccharomyces cerevisiae and Hansenula polymorpha. Book of Abstracts, p. 109.

РОМАНОВА НИНА ВЛАДИМИРОВНА

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ СЕКРЕЦИИ РЕКОМБИНАНТНОГО АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА УРОКИНАЗНОГО ТИПА КЛЕТКАМИ ДРОЖЖЕЙ

03.00.02.-биофизика

Редактор H.A. Волкова Коррогюр О.П. Котооо

J lo;uiHUino » печать 1Ь 112004. Формат 60 х 84 Бумаги офсстиая. Печать офеетш. Усл. псч. л. 3 .* Уч-Н1д.л. 19Д Тираж 70 • экз. 3;1к;п № ф-21У,

Гоеуда|Нгг»ешк>с обрпюиагели юс учреждение имсшсго I i|xxj)ccci toi liuii.i юго oöpajouamw Московский фишхо-тсхничсский иистигуг

(1'0C>7U1|K'1 ИСШ1ЫЙ \ IIIШСрСИТСТ)

Огдел ¿штома ni ш|юш11шых издательских систем

"ФИ'ЛР.Х-ПОЛИП'ЛФ"

Ы1700, Москоискам обл., I. Долгопрудный, НпетшугскиП пер , У

я 2 3 О о S

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Романова, Нина Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: СЕКРЕТОРНЫЙ ПУТЬ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ

ДРОЖЖЕЙ И МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

Введение.

1. Общая организация секреторного пути.

1.1. Транслокация белка из цитозоля в эндоплазматический ретикулум (ЭР).

1.2. Внутриклеточная система транспорта секреторных белков.

1.2.1. Комплексы окаймления СОРИ и СОР1 участвуют в транспорте белков между

ЭР и аппаратом Гольджи.^

1.2.2. Клатриновое окаймление участвует в транспорте белков из поздних компартментов аппарата Гольджи в лизосомы (вакуоль), от плазматической мембраны в аппарат Гольджи или лизосому (вакуоль).

1.2.3. Секретируемые белки покидают эукариотическую клетку преимущественно конститутивным образом.^

1.2.4. Слияние транспортных везикул с мембранами происходит при участии цитозольных и мембранных белков.^

1.3. Сортировка секреторных белков в секреторных путях.

1.3.1. Сортировка растворимых белков.

1.3.2. Сортировка мембранных белков, проходящих начальные этапы секреторного

ПУТИ.

1.3.2.1. Сигналы локализации белков в мембранах аппарата Гольджи.

1.3.3. Сигналы сортировки трансмембранных белков в лизосомы.

1.4. Модификации секреторных белков.

1.4.1. Гликозилировапие.

1.4.1.1. Ы-гликозилирование.

1.4.1.2. О-гликозилирование.

1.4.2. Протеолитический процессинг.

2. Контроль качества укладки белков в ЭР (ЕК(^С).

2.1. Сборка и укладка белков происходит в ЭР.

2.1.1. В дрожжах S. cerevisiae идентифицированы сборочные факторы.

2.2. Контроль качества укладки белков в ЭР.

2.2.1. Роль моноглюкозилированных N-гликозидов в системе контроля качества (ERQC).

2.2.2. Роль кальнексина и кальретикулина в системе контроле качества (ERQC).

2.3. Модель контроля качества укладки белков в ЭР млекопитающих.

2.4. Контроль качества укладки белков отличается у дрожжей Sch. pombe, S.cerevisiae и млекопитающих.^ ¡

2.5. Маннозидаза I участвует в формировании сигнала для системы деградации неправильно свернутых белков.^

2.6. Альтернативные модели системы контроля качества в клетках млекопитающих.

2.7. ERp57 в комплексе с кальнексином/кальретикулином способствует правильной укладке белков.^

2.8. Модель контроля качества укладки белков в дрожжах S. cerevisiae - контроль качества без участия кальнексина, кальретикулина и глюкозилтрансферазы (GT).

2.9. Гомологи компонентов системы укладки белков в дрожжах Н. polymorpha.

3. Ответ клетки на накопление неправильно свернутых белков (IJPR).

3.1. НАС1-активация механизма UPR.

4. Деградация белков в секреторном пути.

4.1. Деградация белков, ассоциированная с эндоплазматическим ретикулумом (ERAD).

4.1.1. Компоненты система убиквитинилирования в клетках дрожжей.

4.1.2. Компоненты системы ERAD в клетках дрожжей.

4.2. Деградация белков в вакуоли.

4.2.1. Вакуоль.

4.2.2. Некоторые белки, проходящие путь секреции, направляются в вакуоль на деградацию.

4.2.3. Рецептор вакуолярного сортинга VpslOp способен направлять в вакуоль неправильно свернувшиеся белки.,,,

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Штаммы микроорганизмов.

1.1. Условия культивирования.

1.2. Штаммы бактерий Е. соП.

1.2.1. Среды для выращивания Е. соП.

1.3. Штаммы дрожжей.

1.3.1. Среды для выращивания дрожжей.

2. Генетические методы.

2.1. Трансформация дрожжей Н. ро1утогрка и сегеУ1^1'ае.

2.2. Выделение и анализ ДНК клеток Н. ро1утогрка.

2.3. Гибридизационный анализ дрожжевой ДНК.

3. Клонирование.

3.1. Выделение плазмидной ДНК из Е. соП.

3.2. Трансформация Е. соН.

4. Методы работы с белками.

4.1. Тестирование ферментативной активности иРА.

4.2. Индукция экспрессии иРА в штаммах Н. ро1утогрка и сеге\1$1ае.

4.3. Измерение суммарного клеточного белка (биуретовый метод).

4.4. Электрофорез и иммуноблоттинг.

4.5. Анализ иРА из культуралыюй среды.

4.6. Приготовление и фракционирование дрожжевых лизатов.

4.7. Определение количества иРА в препаратах культуральной среды или дрожжевых лизатах с использованием иммуноблоттинга.

5. Получение антисыворотки против карбоксипептидазы У (СРУ).

6. Плазмиды.

6.1. Место стыковки сигнальной последовательности с различными вариантами иРА.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Зависимость эффективности секреции иРА от уровня экспрессии в клетках Н. ро1утогрЬа.^

1.1. Зависимость продукции иРА от количества копий и места интеграции экспрессиоппой кассеты.^

1.2. Экспрессия иРА в клетках Н. ро1утогрЬа под контролем промотора гена РВИ.

2. Свойства секретируемого и внутриклеточного иРА.

3. Эффективность секреции иРА зависит от наличия в составе молекулы Ы-концевых доменов и участка М-гликозилирования.^

4. Низкая эффективность секреции иРА коррелирует с его агрегацией в путях секреции.^

5. Экспрессия вариантов иРА с сигналом задержки в ЭР.

6. Влияние температуры инкубации при экспрессии иРА в клетках дрожжей Н. ро1утогрЬа.g^

7. Экспрессия иРА в дрожжах Я. сеге\1$1ае.

8. Мутации, приводящие к улучшению секреции иРА.

8.1. Эффективность сортировки в вакуоль карбоксипептидазы У в клетках мутантов, « сверхсекретирующих иРА.

8.2. Нарушение рецептора УрэЮр не увеличивает эффективность секреции иРА.

8.3. Мутациярер4Л не влияет на эффективность секреции иРА.

8.4. Агрегация иРА в мутантах, «сверхсекретирующих» иРА.

8.4.1. Агрегация иРА и иРА-КХ)ЕЬ в клетках мутантартй.

8.4.2. Влияние мутаций ори24 и гег1-27 на агрегацию иРА.

8.4.2.1. Влияние мутации на агрегацию иРА-КЭЕЬ.

8.4.2.2. Влияние мутации ори24 на агрегацию иРА-КЭЕЬ.

8.5. Экспрессия иРА под контролем промотора гена РИП в клетках «сверхсекреторных» мутантов.д^

8.6. Свойства секретируемого и внутриклеточного иРА при экспрессии в клетках мутанта ртг! Н. ро1утогрЬа.^

9. Влияние «сверхсекреторных» мутаций на чувствительность к дитиотрейтолу.

9.1. Влияние мутации retl-27 H. polymorpha на чувствительность клеток к дитиотрейтолу.pg

9.2. Влияние мутаций pmrl и pmtl H. polymorpha на чувствительность клеток к дитиотрейтолу.дд

ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Высокого уровня секреции иРА нельзя добиться путем увеличения уровня экспрессии.jqq

2. При высоком уровне экспрессии иРА накапливается внутриклеточно в виде агрегатов, формирующихся в ЭР.j qj

3. Агрегация uPA не ипгибирует секрецию иРА.

4. Домены молекулы иРА влияют на эффективность секреции этого белка клетками дрожжей.jq

5. Накопление белка в ЭР мешает укладке новых молекул.

6. Неправильно свернутый иРА может элиминироваться путем деградации.

7. Вклад различных процессов, происходящих в ЭР, в эффективность секреции иРА.

7.1. Схема секреции иРА в дрожжах при «низком» уровне экспрессии этого белка.

7.2. Схема секреции иРА в дрожжах при «высоком» уровне экспрессии этого белка.

8. Гликозилирование влияет па эффективность укладки иРА.

9. Возможные причины «сверхсекреции» иРА.

9.1. «Сверхсекреторные» мутации pmtl и ори24 H. polymorpha.

9.2. «Сверхсекреция» у мутантов с нарушенным балансом ионов кальция в секреторном пути.^

10. Чувствительность «сверхсекреторных» мутантов к реагентам, провоцирующим образование несвернутых белков в ЭР.^ ^

11. Секреция иРА клетками дрожжей S. cerevisiae.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Факторы, влияющие на эффективность секреции рекомбинантного активатора плазминогена урокиназного типа клетками дрожжей"

Прогресс в исследованиях молекулярных механизмов функционирования эукариотической клетки в последние десятилетия был в существенной степени обеспечен использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве модельного организма. Это обусловлено легкостью проведения генетических и геипо-инженерных манипуляций с этим организмом. Многие клеточные процессы являются консервативными, что делает знания, полученные в исследованиях дрожжевой клетки, приложимыми к описанию аналогичных процессов в клетках высших эукариот.

Схожесть процессов синтеза и созревания белков делает дрожжи хорошим организмом-хозяином для экспрессии гетерологичных эукариотических генов. Путем экспрессии в дрожжах можно получать различные белки, используемые в промышленности, медицине и научных исследованиях. Стоит отметить, что многие процессы, происходящие в клетках различных эукариот, существенно дивергировали в ходе эволюции. Изучение процесса секреции белков высших эукариот в клетках дрожжей позволяет выявить особенности организации секреторного пути дрожжевой клетки. Однако результаты, полученные на одном модельном объекте, например на S. cerevisiae, часто оказываются не приложимыми к описанию процессов происходящих в клетках других организмов. Поэтому использование альтернативных модельных объектов позволяет понять, какие процессы в клетке эволюционно консервативны, а какие отражают особенности данного организма. Более того, та или иная особенность нового модельного объекта может быть использована как эффективный инструмент исследования, который в большей степени подходит для решения конкретной экспериментальной задачи.

В данной работе мы изучали особенности прохождения по дрожжевому пути секреции человеческого белка - активатора плазминогена урокиназного типа (иРА). Оказалось, что метилотрофпые дрожжи Hansenula polymorpha имеют ряд преимуществ перед более традиционным модельным объектом - S. cerevisiae для решения поставленных экспериментальных задач. Именно использование Н. polymorpha позволило подробно изучить многие закономерности, связанные с секрецией иРА клетками дрожжей.

Метилотрофные дрожжи Н. polymorpha уже более 15 лет используются в качестве организма-хозяина для экспрессии рекомбинантпых белков. Этот организм также давно привлекает исследователей, изучающих метаболизм метанола и функционирование пероксисом, а в последнее время все шире используется и в работах по изучению других процессов, например, гликозилирования белков, ассимиляции нитрата и нитрита, регуляции генной экспрессии и др. Недавно при финансировании фирмой Rhein Biotech была определена последовательность нуклеотидов более 90% генома Н. ро1утогрка, что в существенной степени облегчает проведение молекулярно-генетических исследований на этом объекте.

В лаборатории молекулярной генетики ИЭК РКНПК МЗ РФ на протяжении ряда лет проводятся исследования по изучению факторов, влияющих на секрецию различных чужеродных белков клетками дрожжей & сегех'тае и Н. ро1утогрка. Одни из этих белков, иРА, неспособен эффективно секретироваться, что позволило получить мутации, увеличивающие эффективность секреции этого белка. Был клонирован ряд генов, в которых произошли эти мутации. Однако, оставалось невыясненным, какие именно механизмы препятствуют секреции иРА. Данная работа посвящена изучению факторов, определяющих низкую эффективность секреции иРА клетками дрожжей и механизмов, приводящих к ее увеличению в результате геномных мутаций.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СЕКРЕТОРНЫЙ ПУТЬ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ И

Введение

Человеческая клетка, в среднем, содержит 10 ООО различных белков, клетка дрожжей около 5000. Дчя нормального функционирования клетки каждый из этих белков должен оказаться в нужном компартменте или мембране ком парт мент л Направление новоси итерированных полипептпдных цепей к «месту назначения», так называемая сортировка белков («prolein sorting») - необходимый процесс для компартментацим и функционирования эукариотической клетки. При этом некоторые белки, кодируемые ДНК. находящейся в митохондриях и хлоропластах. синтезируются на рибосомах в этих органеллах и остаются там же. Однако большинство митохондриатьных белков и белков хлоропласт, а также все белки других органелл. кодируются ядерной ДНК. Они синтезируются на рибосомах в цитозоле и распределяются по орган ел лам при помощи систем узнавания с Игнатов сортировки.

Для прохождения секреторного пуш также используются сигналы сортировки новое и итерированная полипептидная цепь направляется в полость эндоплазматического ретикулума (ЭР), датее попадает в аппарат Гольджи, направляется к плазматической мембране и секретпруется (рисунок i).

МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Рисунок 1. Секреторный путь в эукариотических клетках.

1) Все ядерные мРНК транслируются на цитозольных рибосомах.

2} Рибосомы, синтезирующие секреторные белки направляются к шероховатому ЭР, благодаря наличию сигнальной последовательности.

3) После трансляции в полость ЭР секреторные белки попадают в аппарат Гольджи при помощи везикулярного транспорта

4а, 4Ь, 4с) Секреторные белки направляются далее: либо секретируются, либо попадают в лизосомы (вакуоль), либо остаются в плазматической мембране

Стоит отметить, что белками секреторного пути являются не только те, которые в конечном итоге секретируются, но и ферменты и белки, которые постоянно присутствуют в полости ЭР, аппарате Гольджи, лизосомах, а также белки, «интегрированные» в мембраны этих органелл или плазматическую мембрану.

Данный обзор будет посвящен описанию организации секреторного пути и механизмов, при помощи которых секреторные белки клеток дрожжей и млекопитающих сортируются по клеточным компартментам. Особое внимание будет уделено «созреванию» (модифицированию) белка и прохождению им системы «контроля качества».

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Романова, Нина Владимировна

117 ВЫВОДЫ

1. Человеческий активатор плазминогена урокиназного типа (иРА) плохо секретируется клетками дрожжей по причине неэффективного сворачивания в эндоплазматическом ретикулуме.

2. Дефект укладки иРА в дрожжевом эндоплазматическом ретикулуме в существенной степени определяется М-концевыми доменами этого белка.

3. При высоком уровне синтеза иРА происходит его внутриклеточное накопление в виде высокомолекулярных агрегатов. Агрегаты формируются в эндоплазматическом ретикулуме. Количество белка в агрегированной форме зависит от эффективности его укладки в эндоплазматическом ретикулуме.

4. Мутации ори24, ге11-27 и рти, увеличивающие эффективность секреции иРА, снижают степень агрегации этого белка в эндоплазматическом ретикулуме, что свидетельствует об улучшении условий для правильного сворачивания этого белка.

5. Улучшение укладки иРА у мутанта ге//-27 связано с нарушением баланса кальция в секреторном пути.

6. Нарушение транспортировки белков из поздних компартментов аппарата Гольджи в вакуоль не увеличивает эффективность секреции иРА, но увеличивает протеолитический процессинг этого белка.

7. Протеолитический процессинг иРА в существенной степени не зависит от вакуолярных протеаз, активируемых продуктом гена РЕР4, протеиназой А.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработка методов генной инженерии позволила получать многие белки путем их экспрессии в клетках бактерий. Казалось, что проблема получения белков высших эукариот для фармакологического использования решена. Однако, многие важные белки не приобретают правильную конформацию и посттрансляционные модификации, необходимые для их активности, в результате прохождения через компартменты эукариотического пути секреции. Для решения этой проблемы было предложено использовать одноклеточный эукариотический организм - дрожжи. Однако, многие процессы в секреторном пути проходят по-разному у разных эукариот и многие животные белки не способны преодолеть секреторный путь дрожжей или их модификация ферментными системами чужеродного организма также не обеспечивает им необходимых свойств. В этом случае теоретически можно пойти по пути генетической модификации оргапизма-хозяипа, которые изменили бы устройство его секторного пути, сделав его более подходящим для экспрессии белков высших эукариот. Эта задача требует понимания того, почему белки высших эукариот часто не секретируются клетками дрожжей. В нашей работе мы предприняли попытку разобраться в причинах плохой секреции человеческого uPA и изучить, какие изменения в секреторном пути дрожжевой клетки могут улучшать секрецию этого белка.

В анализе зависимости уровня секреции от уровня экспрессии uPA в дрожжах Я. polymorpha было обнаружено, что одна копия экспрессионной кассеты, содержащей промотор МОХ, обеспечивает максимальный уровень секреции. Увеличение уровня экспрессии при введении в геном большего числа копий экспрессионной кассеты или его снижение при использовании более «слабого» промотора приводило к снижению скорости секреции. Однако даже при «оптимальном» уровне экспрессии количество секретированного белка оставалось ничтожным.

Оказалось, что при высоких уровнях экспрессии uPA накапливается впутриклеточно в виде высокомолекулярных агрегатов. Увеличение уровня экспрессии сопровождалось увеличением внутриклеточного агрегированного белка и снижением секреции. Полученные в данной работе результаты исключают предположение о том, что агрегация является причиной низкого уровня секреции uPA клетками дрожжей, а является следствием неспособности этого белка эффективно приобретать правильную конформацию в дрожжевом ЭР. Что и является причиной низкого уровня секреции uPA клетками дрожжей.

Мы обнаружили, что низкая эффективность секреции uPA определяется его доменной организацией. А именно: без N-концевых доменов белок секретировался намного эффективнее, чем полпоразмерпый вариант, и практически не обнаруживался в клетках в виде высокомолекулярных агрегатов. Очевидно, что И-копцевые домены определяют неспособность иРА эффективно приобретать правильную укладку в ЭР клеток дрожжей.

В данной работе мы продемонстрировали, что неспособность иРА эффективно приобретать правильную конформацию в дрожжевом ЭР является основной причиной низкого уровня секреции этого белка клетками дрожжей. В существенной степени к такому заключению удалось прийти благодаря использованию разработанного нами подхода по оценке эффективности укладки белка в ЭР по степени его агрегации. Этот метод оказался применим только для анализа штаммов с высоким уровнем экспрессии иРА. Такой уровень экспрессии можно было достичь у трансформантов Н. ро1утогрка, несущих только одну копию экспрессиоппой кассеты стабильно интегрированную в геном, а в аналогичных трансформантах & сегеу'шае необходимого уровня экспрессии достичь не удавалось.

Анализ степени агрегации иРА у мутантов Н. ро1утогрка с увеличенной эффективность секреции этого белка показал, что в этих штаммах улучшены условия для правильной укладки молекулы иРА в ЭР. Мутации ори24 и рт11 нарушали гликозилирование белков в секреторном пути, при этом мы предполагаем, что их влияние на секрецию иРА обусловлено не нарушением гликозилирования самого иРА, а связано с ответом клетки на общий дефект гликозилирования белков. Анализ взаимодействия мутации геИ-27 со сверхэкспрессией гена РМЯ1 позволил получить данные, указывающие на важную роль баланса ионов кальция в секреторном пути и в эффективности укладки молекулы иРА.

Мы также рассматривали возможность влияния вакуолярной деградации на эффективность секреции иРА, однако обнаружили, что ни нарушение транспортировки молекул из поздних компартментов аппарата Гольджи в вакуоль при помощи рецептора вакуолярной сортировки УрэЮр, ни отсутствие протеиназы А, активирующей протеолитический комплекс вакуоли, не изменило уровень секреции иРА клетками дрожжей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Романова, Нина Владимировна, Москва

1. Захаров,И.А., Кожин,С.А., Кожина,Т.Н., Федорова,И.В. (1984). Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л:Наука.

2. Agaphonov,M.O., Beburov,M.Y., Ter-Avanesyan,M.D., and Smirnov,V.N. (1995). A disruption-replacement approach for the targeted integration of foreign genes in Hansenula polymorpha. Yeast 11, 1241-1247.

3. Agaphonov,M.O., Trushkina,P.M., Sohn,J.H., Choi,E.S., Rhee,S.K., and Ter-Avanesyan,M.D. (1999). Vectors for rapid selection of integrants with different plasmid copy numbers in the yeast Hansenula polymorpha DL1. Yeast 15, 541-551.

4. Amara,A„ Littman,D.R. (2003). After Hrs with HIV J Cell Biol. 162(3), 371-5.

5. Andersson,H., Kappeler,F., and Hauri,H.P. (1999). Protein targeting to endoplasmic reticulum by dilysine signals involves direct retention in addition to retrieval. J. Biol. Chem .274, 15080-15084.

6. Aridor,M. and Traub,L.M. (2002). Cargo selection in vesicular transport: the making and breaking of a coat. Traffic. 3, 537-546.

7. Astrup T. and Mullerts S. (1952). Fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity. Arch. Biochem. Biophys 40, 346-351.

8. Baksh,S., Burns,K., Andrin,C., and Michalak,M. (1995). Interaction of calreticulin with protein disulfide isomerase. J. Biol. Chem. 270, 31338-31344.

9. Balch,W.E., McCaffery,J.M., Plutner,H., and Farquhar,M.G. (1994). Vesicular stomatitis virus glycoprotein is sorted and concentrated during export from the endoplasmic reticulum. Cell 76, 841-852.

10. Baldari,C., Murray,J.A., Ghiara,P., Cesareni,G., and Galeotti,C.L. (1987). A novel leader peptide which allows efficient secretion of a fragment of human interleukin 1 beta in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 6,229-234.

11. Ballou,C.E. (1990). Isolation, characterization, and properties of Saccharomyces cerevisiae mnn mutants with nonconditional protein glycosylation defects. Methods Enzymol. 185:440-70., 440-470.

12. Balow,J.P., Weissman,J.D„ and Kearse,K.P. (1995). Unique expression of major histocompatibility complex class I proteins in the absence of glucose trimming and calnexin association. J. Biol. Chem. 270, 29025-29029.

13. Bankaitis,V.A., Johnson,L.M., and Emr,S.D. (1986). Isolation of yeast mutants defective in protein targeting to the vacuole. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 83, 9075-9079.

14. Bannykh,S.I., Rowe,T., and Balch,W.E. (1996). The organization of endoplasmic reticulum export complexes. J. Cell Biol. 135, 19-35.