Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональное изучение 3-концевой области гена тканевого активатора плазминогена человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональное изучение 3-концевой области гена тканевого активатора плазминогена человека"

Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук

на правах рукописи

Сарафанов Андрей Гаруновин

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ З'-КОНЦЕВОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА ТКАНЕВОГО АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА ЧЕЛОВЕКА

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва- 1998 г.

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: д.б.н., проф. Ю.В.Козлов

[ д.б!н., проф. М.Я.Тимофеева |

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: член-корр. РАН, проф. А.П. Рысков д.б.н., проф. П.М. Рубцов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Центр "Биоинженерия" РАН

Ък СУ^ и ^

Защита состоится —• 1998 г. в-^^-часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.79.01

при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984 Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан

_ 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Тканевой активатор плазминогена (тПА) млекопитающих относится к классу сериновых протеиназ. Единственно известным субстратом тПА является профермент плазминоген. тПА расщепляет специфическую пептидную связь плазминогена, превращая его в плазмин, протеазу широкого спектра действия. В кровяном русле плазмин разлагает фибрин, основной компонент тромбов, это ведет к их лизису. Таким образом, тПА является ключевым ферментом фибринолитической системы крови. По многим данным тПА вовлечен и в процессы тканевых перестроек, происходящих при морфогенезе - плазмин, совместно с другими протеазами, участвует в деградации межклеточного матрикса при миграции клеток. Вероятно, тПА аналогичным образом вовлечен и в процессы, происходящие при развитии рака. В связи с важностью биологической роли тПА, к настоящему времени уже достаточно подробно изучены многие процессы, связанные с функциями этого фермента, охарактеризован как он сам, так и его ген.

Однако, З'-концевая область гена тПА человека изучена сравнительно мало. До недавнего времени З'-концевые нетранслируемые области (З'-НТО) эукариотических генов считались не несущими какой-либо генетической информации. В то же время, ввиду того, что для нуклеотидных последовательностей З'-НТО не существует ограничений, связанных с необходимостью кодирования полипептидных участков, они представляют собой удобный "субстрат" для размещения разнообразных сигналов посттранскрипционного контроля экспрессии генов. В последние годы стало ясно, что помимо сигналов процессинга З'-конца пре-мРНК, З'-НТО могут содержать и сигналы, влияющие на стабильность мРНК, на эффективность ее трансляции, на ее внутриклеточную локализацию, а также ряд других сигналов. Настоящая работа посвящена структурно-функциональному изучению З'-концевой области гена тПА человека, в частности, поиску в ней участков, влияющих на регуляцию экспрессии этого гена.

Научная новизна работы. Определена первичная структура З'-концевой области гена тПА человека и участка примыкающей окологенной области; выявлен: ряд ее структурных элементов, гомология с различными генами млекопитающих, полиморфизм. Показано ингибирующее влияние З'-НТО гена на его экспрессию в различных клетках млекопитающих; что предполагает универсальность механизмов этого феномена у млекопитающих. В З'-НТО локализованы участки, непосредственно связанные с указанным эффектом, определен примерный вклад каждого. Оценен сравнительный уровень транскрипции гена тПА в различных органах, отделах органов, тканях и клеточных линиях человека.

Практическая ценность работы. При возрастании средней продолжительности жизни в экономически развитых странах, выявился один из основных факторов смертности населения - заболевания тромботической этиологии (инфаркт миокарда, инсульт и др:). Для борьбы с ними основными и весьма эффективными препаратами является тПА и его различные генно-инженерные варианты; они применяются, как тромболитики. Полученные данные о локализации в З'-НТО гена тПА участков, влияющих на эффективность экспрессии гена, могут быть использованы для генно-инженерного дизайна тПА, а именно для модификации З'-концевой части его гена. Это могло бы повысить выход рекомбинантного тПА при его биотехнологическом получении. Кроме того, изучение механизмов регуляции экспрессии гена тПА имеет, самостоятельное значение для понимания функционирования фибринолитической системы крови.

Апробация работы. Частично, результаты были представлены в виде докладов: на конференции "Геном человека-94" (10 марта 1994 г., Черноголовка), на 2-й международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологи (14 июня 1994 г., Москва), на семинаре лаборатории генной инженерии Кардиологического научного центра РАМН (6 апреля 1995 г., Москва). Полностью, результаты представлены на 3-й международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологи (9-14 июня 1997 г., Москва). Основные положения диссертации обсуждены и представлены к защите на заседании совместного коллоквиума Лаборатории белковых ингибиторов клеточных процессов и Лаборатории гормонов и рецепторов, Института молекулярной биологии имени В.А. Энгольгардта РАН - 03 февраля 1998 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: "Введение", "Литературный обзор", "Экспериментальная часть", "Результаты и обсуждение", "Выводы", "Список литературы". Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 14 рисунков. Библиография включает 214 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ и МЕТОДЫ

Материалы. Все использованные реактивы имели квалификацию "осч" и "чда". Радиоизотопы были производства: [14С]-хлорамфеникол ("Sigma"), [ЮР]- и [ЗЭР]-нуклеозидтрифосфаты ("Радиоизотоп", Ташкент, Узбекистан) и ГНЦ ФЭИ (Обнинск, Россия)). Использованные ферменты были производства "Биопол", "СибЭнзим", "Силекс", "Биомастер", "Promega", "Amersham", "Biolabs" и "Fermentas"; набор Exolll/S," - производства "Fermentas"; наборы для введения [згР]-метки в ДНК "Primo-a-Gene" и для секвенирования ДНК - производства "Promega" и "Amersham". Использованы пазмиды: pUC19, pBluescript II SK+, pCMV-lacZ, pBR-322, pCAT-Control и pCAT- Promoter. кДНК гена тПА и клонотека человека со средним размером вставок 15-1b т.п.н. в фаговом векторе Charon4A была предоставлена М.Б. Уставом ("Эстбиоцентр", Тарту, Эстония). Препараты поли(А*)-РНК, выделенной из различных органов, тканей и клеточных линий человека и иммобилизованной на нейлоновых фильтрах, а также данные по ее гибридизации с В-актиновым зондом, были предоставлены Лабораторией генной инженерии Кардиологического научного центра РАМН. Использованные олигонуклеотиды были синтезированы Б.К. Черновым, (ИМБ РАН). Использовались штаммы Е.соН: при клонировании ДНК - JM109, DH5a и XL1; при выделении фагов - Q358 и LE392. Для экспрессии конструкций в эукариотических клетках использовали мышиные ЗТЗ-подобные фибробласты 10(1) и 10(3), крысиные перевиваемые фибробласты Rat 1, клетки эпителия почки зеленой мартышки CV1, клетки человека: фибробластов 041, остеосаркомы Saos 2, злокачественной меланомы G-361, эпигелиоидной карциномы матки HeLa; они были предоставлены Р.В. Кондратовым (ИМБ РАН, Москва).

Методы. Использованные в работе методы описаны в соответствующих разделах руководства Sambrook и соавт. (1989), а также в протоколах производителей соответствующих ферментов и наборов. Эти методы включали в себя: выращивание бактериальных и фаговых штаммов; скрининг клонотеки и выделение индивидуальных фаговых клонов; выделение плазмидной и фаговой ДНК; специфическое расщепление ДНК с помощью рестрикционных эндонуклеаз; рсстрикционное картирование выделенных геномных фрагментов ДНК; электрофорез ДНК в агарозных и полиакриламидных гелях; блоттинг ДНК на мембраны; выделение индивидуальных фрагментов ДНК; субклонирование ДНК; анализ ДНК .методом ПЦР; введение радиоактивной метки в ДНК; гибридизации с

ДНК и РНК - in situ, по Southern и по Nothern; получение делеций фрагментов ДНК с помощью экзонуклеаз Exolll и S,; определение нуклеотидных последовательностей ДНК по Sanger; транзиентную экспрессию конструкций с репортерным геном в эукариотических клетках; определение в клеточных лизатах активности генов |5-галактозидазы и хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT); авторадиографии. В работе были использованы методы компьютерного анализа: при денситометрии радиоавтографов и при анализе нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК (программы DNASUN и FOLDRNA).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. ВЫДЕЛЕНИЕ ГЕНА тПА, СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНОМНОЙ ОБЛАСТИ, ВКЛЮЧАЮЩЕЙ З'-КОНЦЕВОЙ УЧАСТОК ГЕНА, АНАЛИЗ ПОЛУЧЕНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Выделение фрагментов гена тПА в составе рекомбинантных фагов из клонотеки человека. В качестве зонда для скрининга клонотеки была использована кДНК гена тПА (-2,4 т.п.н.). При первичном скрининге исслодовали ~2 млн. рекомбинантных фагов, было получено 30 позитивных по гибридизации фаговых клонов. ДНК, выделенную их них, исследовали методом рестриктазного картирования и блот-гибридизации с зондами, полученными из исходной кДНК - с "5'-зондом" и с "З'-зондом" (имевшим гомологию с 1-2 и 12-14 экзонами гена), как показано на рис.1. Гибридизующиеся с тем, или иным зондом фрагменты соотносили с рестриктазной картой гена тПА (Degen и соавт., 1986) и определяли соответствие исходного клонированного фрагмента ДНК той или иной области гена; результаты картирования были подтверждены субклонированием и частичным секвенированием некоторых рестриктных фрагментов. Таким образом, было отобрано три клона, содержащие различные участки гена тПА и перекрывающие всю его область. Результаты картирования клонов представлены на рис.2. Для исследования указанной геномной области, был выбран клон (N1), содержащий З'-конец гена и участок прилегающей окологенной области.

Секвенирование геномной области, включающей З'-конец гена тПА и участок прилегающей окологенной области. Эта область схематически изображена в нижней части рис.2. Её нуклеотидная последовательность была получена секвенированием двух перекрывающихся фрагментов, соответствующих З'-концевой области вставки из клона N1: Xmal/EcoRI- и Bglll-фрагментов. Xmal/EcoRI-фрагмент (-0,95 т.п.н) содержал часть кодирующей области гена тПА, З'-НТО гена и короткий участок прилегающей окологенной области. Bglll-фрагмент длиной -3,8 т.п.н., содержал дистальную часть З'-НТО гена и отрезок прилегающей окологенной области (а также участок вектора). По обозначенным на рисунке рестриктазным сайтам было выполнено картирование этой области, перекрывающие ее фрагменты ДНК были субклонированы и секвенированы. При помощи компьютерной обработки их нуклеотидные последовательности были объединиены в единую последовательность (Genbank NCBI АС.Х77531), представленную на рис.3.

Анализ полученной нуклеотидной последовательности. Компьютерный анализ показал, что эта последовательность состоит из 817 п.н. З'-конца гена тПА и 1735 п.н. прилегающей окологенной области ДНК. З'-конец гена тПА здесь соответствует дистальной части 14-го экзона, он выделен в отдельный верхний абзац: нуклеотиды с 1-го по 58-й кодируют С-конец белка тПА, с 59-го по 61-й соответствуют стоп-кодону, с 62-го по 817-й представляют собой З'-НТО гена (Pennica и соавт., 1983). Degen и соавт. (1986). секвенировали эту область генома

1. а. t г з « 5 6 г б. г г з * 5 в г в. гt3+ SSt

а. г -я* -£.6 - f.f *

+,* - 2.J-г,о- * 4 ** * * У : i. \ 1 t ч

» t I i й

II. а. б. в

i т j 4 s в т г г>У / в-7' ''.*/>'♦ s ¿г*

2.0-

Рис. 1. Блот-гибридизация рестриктазных фрагментов ДНК, выделенной из первых семи тПА-позитивных фаговых клонов. ДНК

клонов гидролизовали рестриктазами EcoRI (I.) или Bglll (II.). а. -гибридизация с кДНК тПА; б. - регибридизация тех же фильтров с "5-зондом"; в. - регибридизация фильтров с "З'-зондом". Отмечены длины маркеров - рестриктазных фрагментов ДНК X/Hind III (в т.п.н.).

Вс1П:В В В В В В В В . .В()П

0 I |5 | 1.0 | | 151 20 | у ••[■■■ С"«)

1 г • "' 'I п'Т'т

ЕсоИ: Е ЕЕ ЕЕ ...Ест И

N13,30 ' ' ' ' '

К 2,5 1 ' . ' ',',,'

Хт»1

N1.22 -1 | 1ц I , , ^ |,-.

""" ЕИц!

Хт«1 В ¿111 Иге] ЕсоШ БрЫ Сч«1 ЕсоШ РуиЛ

I ,< И I I I и|Ц„

Рис.2. Схема расположения клонированных фрагментов гена тПА относительно известной карты гена и секвенирования З'-конца гена тПА с прилегающим окологенным участком. В верхней части рисунка двойной линией обозначен ген тПА, одинарной - прилегающий к его 3'-концу участок генома с известной нуклеотидной последовательностью. Заштрихованные области гена соответствуют экзонам. В средней части рисунка показано соответствие клонированных фрагментов гена его карте, их нумерация соответствует нумерации рекомбинантных фаговых клонов. В нижней части рисунка изображена секвенированная область З'-конца гена тПА и прилегающего окологенного участка. Стрелками указаны направления и протяженность секвенирования соответствующих субклонов, полученных по обозначенным рестриктазным сайтам (пунктиром обозначен примыкающий участок вектора).

ggqtgtgtac ассаадд^а ссаас^ассЪ адасЬдда^ cgtgacaaca tgcgaccgtg 60

ассаддааса cccgactcct саааадсааа tgagatcccg cctcttcttc ttcagaagac 120

асЬдсааадд cgcagtggtt ctctacagac ttctccagac ссассасасс дсадаадсдд 180

дасдадассс Ъасаддадад ggaagagtgc attttcccag atacttccca ttttggaagt 240

tttcaggact tggtctgatt tcaggatact ctgtcagatg ggaagacatg aatgcacact 300

адсс^сЪсса ggaatgcctc ctccctgggc agaaagtggc catgccaccc Ъд^^садд 360

taaagcccaa cctcctgacc tgtcaccgtg адсадсС^д дааасаддас cacaaaaatg 420

aaagcatgtc йсааЪадЪаа аада£аасаа даЬсйЪйсад дааадасдда ttgcattaga 4 80

ааtagacagt atatttatag tcacaagagc ссадсадддс сЪсааадЪЪд gggcaggctg 540

gctggcccgt catgttcctc аааадсассс ^дасд^аа gtctccttcc cctttcccca 600

с^сссСддс^ ctcagaaggt attccttttg tgtacagtgt gtaaagtgta аа^с^Ь^ 660

ctttataaac tttagagtag catgagagaa ttgtatcatt tgaacaacta ggcttcagca 720

tatttatagc aatccatgtt agtttttact ttctgttgcc acaaccctgt tttatactgt 78 0 ас^ааСааа ttcagatata tttttcacag tttttcc

ааа atcaaagtgg aatggttttg 840 ^¿ЬаааЪдс tgtatcccac tctttattca tgttcacatt ttaaaatcat ttggaattct ' 900

дс^сас^сд cttaacatat асасаасасс tgtaacatac aaggcaatgg gctaggtgct 960

ссадассддд ааааддаддд acaggaatgc ttggtctgat gggctaatat ggcatttaga 1020

gaagtaccaa ggtacagtgg agccggtcac аааадддсад acttgtagta gaattcagtt 1080

дсаададдда ttggggaatc ^ааддаааа aatagaatct taaggaaaaa ataactgggt 1140

дадасдЪдда ctgtggacag дЬдЪддаааа ggcactctcc atggaggtat gaatatgtag 1200

адддссаада gaggggagta садддадааа Ьдад^дадс ttgtctgaag tgaacttcag 1260

даададдаас аЪаддсСдда atttagatta tgggggctct даасассааа ctgagtttgg 1320

ас^аа^да cttctgtagg саасдаддад ccatggagat tctgctcagg gaagtgagga 1380

cctgggcatg ccttaggaaa а^аассадд gggtggctgg саадсаадса дасадсадда 1440

даддаасдс^ gtggggatag ддаддаадаа cctcgcatga ccttgctaac acagcaacat 1500

cccaaccgtt ggttcggcct agaagctggt а1:^дддсса tctgtctccc attgtcttaa 1560

ttttctgctc а^адааа^ gaacccctaa accagtccac acaagtacgt tatctaagta 1620

аЬд^дса*:Ь ctgcttctct 1адасЪас^ tttttttttt ЪЪЪЪЪдадас agagtctcgc 168 0

tcttttgccc аддсЪдаадЪ дсадЪдсдсд ctatctgcaa gctctgcctc ctgggttcac 1740

дсса^с^с tgcctcagtc ЪсссдадЪад ctgggactat аддЪдсссдс ассаЪдсссд 1800

gctaattttt саЪаЪЪЪдЪа дйададасдд дд^сассдЪ gttagccagg atggtctcga 1860

ЪсЪссЪдасс tcgtgatccg ссЪдссЪсдд ссЪсссаадд tgctgggatt acaggcgtga 1920

дсса&Ьдсас осадсссЪсЪ ЪадасЪасЪЪ totactcgcg адаЪдсаасс ссЪаЪЪссЪд 1980

дсЪдсЬд!оЪ ддсадс^^ д^сЪса^д acatcctagt ^саада^а aatcggatgc 2040

tgcaatgctg ctgttgggga tatgctgaca cagctcctca дададдадаа aggtggtcgt 2100

ctctctggtg gagttgtcag aactgctcag 1:^ададд^ cttggaacaa aagtcgttta 2160

aactcacaaa адааададаЪ tctttaactc ccaagagctt gactggggtg адддаддсад 2220

cgggggacat ccctgaagtg ttgaagtacc taggccagta aataaatgca ддЪсасадад 2280

acttaagtca cagatttctt дас^садас tgctcacttg catgttctac agtttttaga 2340

cagatgtgtg tctcagccat ttaagaaaaa cattgtttga ддссаддаас ggtggctcat 2400

gcctataatc ccagcacttt aggaggctga cgtgggtgga tcacttgagg ctaggagttt 2460

дадассадсс tggccaacgt ддсаааассс catctctact aaaatacaaa agttagctgg 2520

gtctggtggt gatgcaccnt gtggctccag па 2552

Рис.З. Нуклеотидная последовательность секвенированной области 3'-конца гена тПА и прилегающего окологенного участка. Верхним абзацем выделен участок, соответствующий З'-концу гена: подчеркнут его фрагмент, кодирующий С-конец белка, нижележащая последовательность этого абзаца соответствует З'-НТО гена. Два участка, соответствующие каноническому "сигналу полиаденилирования" (ААТААА) выделены курсивом и подчеркнуты. А1и-подобный элемент в окологенной области обозначен жирным шрифтом.

по 1175 п.н. Таким образом, нуклеотидная последовательность участка с 1176 по 2552 п.н. - представляет собой новые данные о первичной структуре окопогенной области, прилегающей к З'-концу гена тПА.

При сравнении участка 1-1175 п.н. с последовательностями, полученными другими авторами при секвенировании клонотек и кДНК гена тПА (человека), был обнаружен ряд различий - в основном, это однонуклеотидные замены, делеции или вставки. Вероятно, эти различия отражают полиморфизм указанного участка генома - в окологенной области он выражен существенно сильней, чем в области гена.

При сравнении полученной последовательности с банком последовательностей ДНК (GenBank) оказалось, что область с 1641 по 1990 п.н. соответствует Alu-подобному элементу (выделено жирным шрифтом). При сравнении его (в обеих ориентациях) с каждым из 27 Alu-повторов, находящихся в интронах гена тПА (Degen и соавт., 1986) было обнаружено, что степень гомологии составляет не более 70%. Напротив, указанный Alu-повтор обнаружил существенно большую гомологию (до 90%) с Alu-повторами из З'-НТО мРНК ряда генов человека. Причем для одного из них, гена антионкогена р53, недавно показано, что Alu-повтор в составе З'-НТО его мРНК - ингибирует трансляцию этого транскрипта (Fu и Benchimol, 1997). Кроме того следует отметить, что на 36 п.н. "ниже" обсуждаемого Alu-повтора обнаружена последовательность, соответствующая сигналу полиаденилирования (ААТААА), а в позициях "2043" и "2297' обнаружены участки, гомологичные каноническим последовательностям CACTG и YGTGTTYY, часто встречающимся вблизи областей полиаденилирования генов и, как полагают, необходимым для формирования З'-концов функционально зрелых мРНК (Berget и соавт., 1984; McLauchlan и соавт., 1985).

Эти данные позволили предположить, что участок окологенной области, имеющий в своем составе перечисленные выше последовательности, может быть связан с геном тПА функционально. Он мог бы соответствовать еще одному экзону гена, и это означало бы наличие у npe-мРНК гена тПА альтернативного 3'-концевого сплайсинга. Подобным образом организованы многие эукариотические гены и это, как правило, связано с их дифференциальной экспрессией в различных тканях (Edwalds-Gilbert, 1997).

2. АНАЛИЗ мРНК ГЕНА тПА В ОБРАЗЦАХ поли(А')-РНК, ВЫДЕЛЕННОЙ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЕЙ ЧЕЛОВЕКА

Данный эксперимент был выполнен для проверки предположения об альтернативном З'-концевом сплайсировании пре-мРНК гена тПА при тканеспецифической экспрессии гена и для оценки сравнительного уровня транскрипции гена в разных отделах организма. Для этого, в различных тканях человека оценивалась возможная З'-концевая гетерогенность мРНК гена - по гибридизации с зондами: 1) с кДНК гена тПА; с геномными фрагментами - 2) ВдШ/ЕсоВ1-фрагментом, соответствующим З'-концу гена и 3) Ога1-фрагментом, содержащим участок прилегающей к З'-концу гена тПА окологенной области, включающей обсуждаемый выше А1и-повтор; 4) с 31-членным олигонуклеотидом, прилегающим с 5'-конца к данному А1и-повтору (комплементарному участку указанной на рис.3 окопогенной последовательности с 1577 н. по 1607 н.); 5) с 27-членным олигонуклеотидом, комплементарным участку мРНК р-актина человека -для нормирования содержания в образцах мРНК гена тПА, по мРНК гена р-актина.

В эксперименте были использованы препараты поли(А*)-РНК, выделенной из 57 органов, отделов органов и тканей, и 12 клеточных линий человека, и иммобилизованной блоттингом на нейлоновых фильтрах. Фильтры

2 Й. 5

8 8 „ | 1

I 2 § ь * | г I §

§ I 5 ? И I

52Ё г й | 2 ■

£ I § I | I г I I I I ? 1 I г Е I

¿¡гьавсЯЬз'БкБхга.Ь.Е длины РНК мвв-ииогЗкХсйисияй (тыс.нукл.)

Г1Л

9 О

--4.1

3.1

--2.0

1 й

тВМЛ

Рис.4. Радиоавтограф гибридизации препаратов иммобилизованной на фильтре мРНК, выделенной из различных органов человека, с меченой кДНК тПА. В нижней части рисунка показан фрагмент радиоавтографа, после регибридизации фильтра с олигонуклеотидом, комплементарным мРНК р-актина.

Таблица. Относительное содержание мРНК гена тПА в тканях и органах человека

Орган (отдел органа, ткань, клеточная линия)

Относительное значение количества мРНК гена тПА (в %)•

почка (геп).................................................................

желудок (gaster)..........................................................

гипофиз (hypophysis)...................................................

аппендикс (appendix)...................................................

субталамические ядра (nuclei subthalamic!)....................

сетчатка (retina)..........................................................

сердце (cor)................................................................

яичник (ovarium).........................................................

молочная железа (mamma)..........................................

трахея (tracheae)........................................................

спинной мозг (medulla spinalis).................. ...................

мозговое вещество надпочечников (medulla suprarenalis)

мочевой пузырь (vesica urinaria)...................................

легкое (pulmo)............................................................

большой сальник (epiploen)..........................................

надпочечник (glandula suprarenalis)...............................

семенник (testis).........................................................

корковое вещество надпочечников (cortex suprarenalis)..

плацента (placenta)......................................................

головной мозг (cerebrum).............................................

щитовидная железа (glandula thyreoidea).......................

гипоталамус (hypothalamus).........................................

хвостатое ядро (nucleus caudatus).................................

матка (мышца) (uterus)................................................

лобная доля (lobus frontalis)..........................................

аорта I (нормальная) (aorta).........................................

слюнная железа (glandula salivatoria).............................

путамен (скорлупа) (putamen, neostriatum).....................

матка (uterus).............................................................

мозжечок (cerebellum).................................................

широчайшая мышца спины (musculus latissimus dorsi)......

толстая кишка (colon)..................................................

миндалина (головного мозга) (amygdala).......................

черная субстанция (substantia nigra)..............................

продолговатый мозг (medulla oblongata).........................

аорта II (атеросклеротическая) (aorta)...........................

костный мозг (medulla ossea).......................................

затылочный полюс (polus occipitalis)..............................

тонкий кишечник (intestinum tenue)................................

лимфатические узлы (nodí lymphatíci).............................

лейкоциты (leukocytes).................................................

100,0 ..53,7 „52,5 ..50,7 ..47,2 ..45,8 ..44,3 ..43,3 ..41,2 ..39,1 ..36,6 ..33,6 ..33,1 „32,8 ..32,8 ..31,8 ..29,9 ..29,4 ..28,4 ..26,0 ..26,0 ..24,8 ..24,6 ..24,2 ..23,9 ..23,3 ..23,0 ..23,0 ..22,5 ..22,5 ..21,6 ..21,6 ..21,5 ..21,3 ..19,0 ..18,2 ..16,9 ..16,0 ..16,0 ..15,7 ..14,9

Орган (отдел органа, ткань, клеточная линия)

толстая кишка (мышца) (colon)..........................

придаточное ядро (nucleus accumbens).............

гиппокамп (hyppocampus)................................

кора головного мозга (cortex cerebri).................

поджелудочная железа (pancreas)....................

подкожная жировая клетчатка (tolla subcutanea)

височная доля (lobus temporalis).......................

предстательная железа (prostata).................

печень (hepar)................................................

кожа (дерма и эпидермис) (cutis)......................

щитовидная железа (thymus)............................

селезенка (lien)..............................................

Органы плода

почка (ren fetale)............................

легкое (pulmo fetale).......................

сердце (cor fetale)..........................

головной мозг (cerebrum fetale).......

Клеточные линии

0-361 (меланома)....................................................

РА-1 (тератокарцинома яичников).............................

5\Л/-480 (аденокарцинома толстого кишечника)...........

Ы1Н:0\/САВ-3 (аденокарцинома яичников)..................

БаисЯ (лимфома Беркитта)........................................

А-549 (рак легких)....................................................

Не1.а (эпителоидный рак шейки матки)......................

М01.Т-4 (клетки периферической крови при

остром лимфобластном лейкозе)...............................

2й-75-1 (рак молочной железы).................................

К-562 (миелогенные клетки при хроническом лейкозе). НЬ60 (клетки периферической крови

при промиелоцитарном лейкозе)...............................

Т-470 (рак протоков молочной железы)......................

* Примечание: за 100 % принято содержание мРНК тПА в почке

последовательно гибридизовали со всеми указанными зондами и авторадиографировали.

Ни в одном из исследованных образцов гетерогенности З'-концевой области мРНК гена тПА обнаружено не было. В большинстве случаев, при гибридизации выявлялся единственный транскрипт длиной ~2,5 т.н., гибридизующийся как с полноразмерной кДНК гена тПА, так и с зондом "2", содержащим последний экзон гена. Один из таких радиавтографов представлен на рис.4. Два других зонда, комплементарные участкам прилегающим к З'-концу гена (зонды "3" и "4") -сигналов гибридизации в этой области не давали. Можно отметить, что зонд "3", содержащий в своем составе обсуждаемый выше А1и-повтор, во всех образцах давал заметный фон по всей длине трека, а в некоторых образцах - ряд отдельных слабых сигналов, например, транскрипты длиной -1,5 т.н., -3 т.н., несколько транскриптов в интервале 5-8 т.н. Это указывает, вероятно, на сравнительно широкую распространенность А1и-подобных мотивов в транскриптах многих генов и существование мРНК, имеющих гомологию с этим А1и-повтором. Несмотря на то, что в данном опыте не удалось выявить продукты возможного З'-концевого альтернативного сплайсинга пре-мРНК гена тПА, полностью исключать такую возможность было бы неверно. мРНК, как продукт такого сплайсинга могла бы присутствовать в отдельных тканях (на различных этапах онтогенеза), как минорный компонент, количество которого ниже предела чувствительности использованного метода.

Тем не менее, результаты гибридизации фильтров с кДНК гена тПА дают возможность оценить в исследованных образцах сравнительный уровень транскрипции гена тПА по относительному содержанию его мРНК. После денситометрии радиоавтографов, отнорительное содержание мРНК гена тПА в каждом образце расчитывали путем нормирования по относительному содержанию в нем мРНК р-актина. Полученные результаты представлены в виде таблицы. Можно отметить, что содержание мРНК в исследованных препаратах варьировало в диапазоне 0-100 относительных единиц. Для оценки того, насколько точно полученные данные могут характеризовать сравнительный уровень экспрессии гена тПА в исследованых тканях, необходимо учитывать индивидуальные генетические различия между донорами исследованного материала, их поп, возраст и функциональное состояние (гормональный статус). Эти факторы в данном случае, носят неопределенный характер. Известной проблемой при исследовании тканой человека является и оперативность отбора материала, что имеет важное значение ввиду относительно низкой стабильности мРНК.

В то же время, сопоставление полученных данных с данными других авторов, указывает в пользу того, что они, в основном, отражают истинное содержание мРНК тПА в ислледованных образцах. Относительное содержание мРНК тПА в них, в основном, коррелирует с относительным содержанием мРНК тПА в соответствующих образцах мыши (Ис^ев и соавт., 1988). В свою очередь, в большинстве таких же образцов (мыши), относительное содержание мРНК тПА, в основном, находится в соответствии с относительным уровнем активности тПА (ОапдМ и соавт., 1985). Подобная корреляция наблюдается между относительным содержанием мРНК тПА в исследованных нами образцах и относительным количеством тПА-антигена в аналогичных органах и тканях человека (Уатайа и соавт., 1989). Таким образом, полученные нами данные об относительном содержании в исследованных образцах мРНК гена тПА, могут, в определенной степени, характеризовать сравнительный уровень транскрипции гена в этих отделах организма человека.

EaoW EooRI

..loci .Kpnl .

^ (A)

.»UCI^

HCAT^>V

AccI EcoRV ,.,KpnI..

ay« poy

ИН SV4'i pos

H SV4Q P°4 ^ Jf'L'.'j.;: Дpox **—' РРЧ

Д(5'-Э')

X^AT^—g^^U'LLiVtma I—jSV40 1><'»1

|V|

И . Sod.. Mini. Kpnl.

Sac I Smal ) EcoRV *ccl

//

ExoIlL/SI-делеции

в.

M

рис.5. Схема получения основных экспрессионных конструкций, а. -

исходный вектор pCAT-Control (С), б. - клонирование в него адаптера I. в.-е. - этапы субклонирования в эту плазмиду из исходного фагового клона N 1 фрагмента, содержащего З'-НТО гена тПА (закрашенный полутоном участок), е. - основная "З'-НТО гена тПА/ген CAT' конструкция (В), стрелками отмечены ее участки, комплементарные олигонуклеотидам, использованным для ПЦР-аналиэа и секвенирования ключевых областей этой конструкции и ее производных (В), ж. и з. -получение двух серий производных конструкций с Exolll/S,-делеционными вариантами З'-НТО. и. - исключение из плазмиды В клонированного фрагмента и замещение его адаптером II - получение вектора, содержащего область поликлонирования, расположенную "ниже" кодирующей области гена CAT (V). к. - клонирование в него Mlul-фрагмента ДНК фага X (L). п. - конструкция с "З'-НТО гена тПА в обратной ориентации" (*В). м. - делегирование в конструкции "З'-НТО гена тПА/ген CAT' области "nonn(A)-SV40" (и области энхансера, конструкция В ).

3. ЭКСПРЕССИЯ КОНСТРУКЦИЙ, СОДЕРЖАЩИХ УЧАСТКИ З'-КОНЦЕВОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА тПА И РЕПОРТЕРНЫЙ ГЕН.

Для картирования в З'-НТО гена тПА возможных участков, содержащих сигналы посттранскрипционного контроля экспрессии гена, этот участок гена тПА был исследован в системе транзиентной экспрессии репортерного гена.

Схема создания основных конструкций показана на рис.5. Вектор для необходимого клонирования был предварительно получен на основе плазмиды ■ pCAT-Control, содержащей, в качестве репортерного гена, ген CAT (а.). В 3'-концевую область гена CAT были введены необходимые рестриктазные сайты (б.). В эту область была клонирована З'-НТО гена тПА (в.-е.). Из этой плазмиды (е.), была получена серия производных плазмид, содержащих систематические делеционные варианты З'-НТО (ж., з.). Были получены контроли - две плазмиды, у которых в ту же область вектора клонированы: фрагмент ДНК фага X такой же длины, как З'-НТО и плазмида с обратной ориентацией З'-НТО гена тПА (к., п.). Были также получены две конструкции содержащие делеции проксимальной и дистальной половин З'-НТО (рис.6, а.), и три конструкции, содержащие дистальную половину З'-НТО с участками прилегающей окологенной области различной длины (рис.9, а.-е.). Все полученные конструкции были проверены секвенированием их областей, включающих сайты клонирования, либо области делеций. Определение активности CAT выполняли с помощью нормирования по активности р-галактозидазы, при котрансфекции в клетки соответствующей плазмиды.

1. Предварительные эксперименты по экспрессии конструкций с простыми делеционными вариантами З'-НТО гена тПА (рис.6). При экспрессии конструкций, содержащих полноразмерную З'-НТО гена тПА, и делеции ее дистальной и проксимальной половин (а.), во всех исследованых клеточных линиях получены сходные результаты: З'-НТО гена тПА ингибирует экспрессию гена CAT в 5-10 раз, по сравнению с экспрессией контрольных конструкций. Это, в основном, связано с влиянием дистальной половины З'-НТО (б., в.).

Подобное ингибирование экспрессии репортерного гена наблюдалось во всех исследованных клеточных линиях - как различных видов млекопитающих, так и их различных тканей. Поэтому, весьма вероятно, что механизмы ингибирования экспрессии гена тПА З'-нетранслируемой областью его мРНК в различных тканях млекопитающих достаточно консервативны, по крайней мере, для грызунов и приматов.

2. Экспрессия основных делеционных конструкций. Две панели делеционных конструкций с более мелким "шагом" делеций с обеих сторон З'-НТО (рис.5, ж., з.) были экспрессированы в трех независимых экспериментах с каждой из двух выбраных клеточных линий. Трансфекция этих панелей в клетки CV1 показала наличие в З'-НТО трех участков, влиявших на экспрессию репортерного гена (рис.7). На карте З'-НТО в центральной части рис.8, эти участки обозначены как "А" (83-170 п.н.), "Б" (371-538 п.н.) и "В" (602-817 п.н.). Их отдельный вклад в экспрессию гена CAT можно оценить следующим образом: участок "А", внося наиболее слабый вклад, увеличивает экспрессию в 1,5-2 раза, участки "Б" и "В" -уменьшают ее, каждый в 2,5-3 раза. Причем, длины областей, непосредственно ответственных за ингибирование экспрессии репортерного гена составляют, как минимум: -35 п.н. (участок "Б", 420-435 п.н.) и -90 п.н. (участок "В", 676-765 п.н.) -повреждение каждой из них депециями с любой из сторон, ведет к снятию указанного эффекта (рис.7).

Экспрессия тех же конструкций в клеточной линии 10(1) (мышь), не выявила воздействия области "А" на экспрессию репортерного гена. Вероятно, этот факт отражает видоспецифичность влияния этого участка на экспрессию гена тПА. Однако, поскольку область "А" имеет определенную гомологию с проксимальным

а«

fiamHI

. Sad . Amai ЬсШ EcoRV Kpnl

(B)

(HA)

poly A f*'

(BB)

6.

© © © V © «

* *

© © о о © © о

*

С L *B В BA BB B1

Oth.

С L 'В В BA BB В'

рис.6. Получение (а.) и экспрессия конструкций с простыми Двлециями З'-НТО гена тПА (ВА и ВВ): б. - радиоавтограф ТСХ-продуктов САТ-реакции клеток CV1, трансфецированых этими конструкциями (В, С, L, *В и В' - контроли, см. рис.5.), в. - результат его компьютерного сканирования (за относительную единицу принят уровень экспрессии гена CAT в конструкции В).

L 'В В 1 2 3 4 5 6 7 В 9 10 И 12 13 14 V

_А(5'«-3')_

ОоОООвООооООР*с'"

L '3 В 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 V

П. Отн.

<"Л

' 5 4 3 2 1

IT

ЙЙ

Йи"

¡'V

ЦТ

т

L 'В В 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 18 17 IB V

Д(5'-3')

ее

•ее•ООФОФО

••9999ff9ff99999999999

L 'В В 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 V

б

б

рис.7. Экспрессия конструкций с геном CAT и систематическими делециями З'-НТО гена тПА: I - с делециями З'-НТО с З'-конца, "Д(5'<-3')"-ряд"; II - с делециями З'-НТО с 5'-конца, ("Д(5'->3')"-ряд), (L, V, В' и В - контроли, см. рис.5), а. - результаты компьютерного сканирования радиоавтографов ТСХ-продуктов САТ-реакции клеток CV1, трансфецированых этими конструкциями (результаты трех независимых опытов, соответствующие значения активности CAT выражены в относительных единицах его активности в конструкции с полноразмерной З'-НТО тПА (В)), б. - радиоавтографы одного из таких экспериментов, с каждым из двух делеционных рядов.

1 - 14

рис.8. Картирование полученных Ехо111/8,-делеций З'-НТО гена тПА в составе акспрессионных конструкций и определение в З'-НТО границ участков, содержащих сигналы, влияющие на экспрессию репортерного гена. В верхней части рисунка схематически изображен ряд систематических делеций З'-НТО с З'-конца - "Д(5'<-3')", в нижней -подобный ряд с делециями З'-НТО с 5'-конца - "А(5'—>3')". На фотографиях представлены результаты элетрофореза соответствующих делеционных ПЦР-фрагментов З'-НТО. В средней части рисунка двойной линией изображена карта геномной области, включающей в себя З'-конец гена тПА, клонированой в состав конструкции с репортерным геном. Густой штриховкой отмечен конец кодирующей области гена тПА, светлой штриховкой - З'-НТО гена, неокрашенная область соответствует участку прилегающей окологенной области. Прямоугольниками со штриховкой на -карте З'-НТО отмечены области наиболее выраженной гомологии с З'-НТО тПА мыши и крысы (горизонтальная штриховка) и с З'-НТО уПА человека (вертикальная штриховка). Большими прямоугольниками обозначены три области - "А" (87-170 п.н.), "Б" (371-540 п.н.) и "В" (598-817 п.н.), в пределах которых локализованы сигналы, влияющие на экспрессию репортерного гена. Стрелками внугри этих областей указаны сайты, начиная с которых возникает эффект изменения экспрессии гена CAT при "вступлении" в данную область соответствующего делеционного ряда (рис 7).

Ж.

Р ВВ' В'в В'вэ

Р ВВ' В'Э в вв

Рис.9. Клонирование и экспрессия конструкций, содержащих делеционные варианты прилегающей к З'-концу гена тПА окологенной области (и не содержащих областей "поли(А)-" и энхансера Б\/40"). а. - исходный для данного эксперимента вектор - конструкция В' (рис.5, м.). б.-г. этапы субклонирования в нее фрагмента, содержащего -1,73 т.п.н. прилегающей окологенной области, д., е. - получение его делеций, содержащих -500 и -80 п.н. участков окологенной области з. -результаты компьютерного сканирования радиоавтографов ТСХ-продуктов САТ-реакции клеток С\1~\, трансфецированных этими и контрольной конструкциями (Р - плазмида рСАТ-Ргото1ег, содержащая область "поли(А)-Б\/40"); представлены результаты шести независимых опытов (значения активности САТ выражены в единицах его активности в конструкции ВВ'. ж. - радиоавтограф одного из таких опытов.

А. ГОРА О») gCCttCCTCTtccTCTTCcaCAaA^lаdtaCgcCTg-AAAOGC-CdAQcg-TTCTc ..

ММТРА (39) _ дССГ1ССТСТгссТСТТСЬаСЛОААОа1дС^сСТа-АААОСС-СаАОса-ТТСТй ..

ВТРА (96) 1ССсдССТСТ---ТСТТС^САОААОаса---СТдсАААООСдС-АОсдсТТСГс ...

Б. ГОРА (340) дА^д—ТОТСТСА*сАО--СдАаАТ-АСААс^аАТ----СТТТСАООА;! ...

ММТРА (339) _ дА1:Са-~Т0ТСТСААсАвсаааАаАТ-АСААсГ1ОАТ----СТТТСАСОА^ - ...

ВТРА (422) _ аАдСа—ТСТСТСААсАОСаааАдАТаАСЛА---вАТ----СТТТСАООАаЗ ...

ВЗШСРМ (738) - сАдСас-ТОТСТСАдч^сас!?:^—АСАЬа—аАТдъссСТТТС^ООсс ...

ГОРА (389) „ сТОСАсТдадаАдА-АОА-АГОТдТгТТТАТАасТаСАСАэ .

ММТРА (389) „ ^ОСАсТдддОАдА-АДА--АсОТдТГТТТАТАО::ТаСАСА; ...

ВТРА (471) 1ТОСА-Т-1аСЗАаА1АОАсА-ОТаТаТТТЛТАО-Т-САСАа

В. ВТРА (625) сСТТ-ХТОТОТ-----СааТОТОТаААаТОТа ...

вдижрм (5зе> аСГГдТХатоТдддсгвгОаОТО'Т-ААЗЮТд _

ГОРА (564) _ 1дТ-СТТТТТСТТТАТАЛАСТ-Т*ТссАОА-ТдОс-ТОдаАДААсТОТАТдАТТТСААС -.

ММТРА (559) _ tgT-CTTTTTCTTTATAAACTcTaT--AаA-TgOt-TOgаAflAAcTOTATgATTTtAAt ...

ВТРА (651) ааТсСТТТТТСТТТАТАААСТ-Т-Т--АДАОТАДсаТОаОАОААсТОТАТсАТТТдААс ...

ваша (1958) _ ТАТАААСТ-Т-Т--АОАОТАО „

ГОРА («36) tAatATATTTATAtttg-AATCtA-tTTAOtTTTTAC-Tg-TOTTаCtAЗAACt ..

ММТРА (630) _ tAQtATATTTATAttt t-AATCtAt tTTA¡ЗaTTTTAC-Tt-TЗTTaCt:AtAACt

ВТРА (716) - сАОсАТАТТТАТА---дсААТСсАГдТТАОИТТТАСгТГсТОТТцСсАсААСс _

ГОРА (685) _ СТОТаТТАТдСТаТАСЕдаааТААТАААТТсСА-АддТАТТТТТСАСА-сгТТТ (А)

ММТРА (680) - 1ТОТаТТАГаСТатАСС Г а а аТААТАААТТ-САдАддТАТТТТТСАСА- с-ТТТ .. (А)

ВТРА (787) - сТ(тгГАТаСГОТА^----TAATAAATT-CAgAtaTATTTTTCACAgttTTT=c ... (А)

рис.10. Гипотетическая вторичная структура транскрипта З'-НТО гена тПА и гомологии первичной структуры этой области с З'-НТО других генов. Изображена рассчитаная вторичная структура этого фрагмента мРНК (ДЭ = -198,8 ккал/моль); ее участки, содержащие сигналы экспрессии гена обозначены как "А", "Б" и "В". Стрелками указаны позиции, начиная с которых возникает изменение экспрессии репортерного гена при "вступлении" в эту область соответствующего делеционного ряда (рис.7). Участки высокой гомологии с З'-НТО генов тПА мыши (ММТРА) и крысы (РМРА) выделены жирной линией, с З'-НТО уПА человека (НЭиКРМ) - двойной линией, с З'-НТО гена егд2 человека (НЭЕРЮ) - двойной линией с заштрихованной внутри областью. Участки этих генов с наиболее выраженными гомологиями с участками областей "А", "Б" и "В" приведены в нижней части рисунка. В обеих частях рисунка отмечен участок "ТАТТТАТ", охарактеризованный для ряда генов, как детерминанта нестабильности их мРНК.

участком З'-НТО гена тПА мыши (см. ниже), полностью исключить ее влияния на экспрессию этого гена в каких-либо других тканях мыши нельзя - и в этом случае область "А" могла бы содержать тканеспецифические сигналы экспрессии гена.

3. Экспрессия конструкций не содержащих области "nonn(A)-SV40" и содержащих делеционные фрагменты окологенной области, прилегающей к З'-концу гена тПА. Для оценки наличия в окологенной области каких-либо сигналов, влияющих на транскрипцию гена, была изучена экспрессия панели конструкций не содержащих области полиаденилирования SV40, а содержащих помимо дистальной половины З'-НТО гена тПА, участки различной длины прилегающей окологенной области (-80, -500 и -1730 п. н., рис.Э, г.-е.). Все они не имели энхансера транскрипции SV40. В качестве контроля использовался вектор рСАТ-Promoter (Р), напротив, содержащий область полиаденилирования SV40 (но не имеющий области энхансера транскрипции). При экспрессии этой панели в клетках CV1 и 10(1) (в шести и трех независимых экспериментах) все конструкции относительно контороля показали одинаковый уровень экспрессии в них гена CAT (ж., з.).

Из равенства уровней экспрессии этих конструкций, следует, что все сигналы гена тПА, влияющие на экспрессию репортерного гена, расположены в пределах 80-ти п.н. окологенной области гена тПА. Экспрессия этих конструкций была изучена для оценки наличия в окологенной области таких сигналов экспрессии гена тПА, как, например, сигналов "пауз транскрипции", которые для генов млекопитающих, транскрибируемых РНК-полимеразой II могут находится в окологенной области на расстоянии в десятки, сотни и даже тысячи п.н. "ниже" 3'-концоз генов (Proudfoot 1989, Richardson 1993) То, что на указанном участке окологенной области (80-1730 п.н.) таких сигналов не обнаружено, конечно, совсем кэ означает, что их там нет вообще - возможно, использованная система репортерного гена имеет свои ограничения для изучения подобных сигналов. Нельзя исключить и возможность того, что эти сигналы могут лежать вообще за пределами (т.е. еще "ниже") исследованного участка.

Анализ нуклеотидной последовательности З'-НТО гена тПА. Компьютерный анализ показал определенную гомологию участков 190-240 п.н., 310-360 п.н. и 510817 п.н. З'-НТО с некоторыми участками различных генов приматов, последний из этих участков почти совпадает с участком "В". Сравнение же З'-НТО гена тПА человека с З'-НТО генов тПА крысы, мыши и гена другого активатора плазминогена человека - урокиназного типа (уПА), выявило наличие некоторых участков с выраженной гомологией. При этом, гомология З'-НТО гена тПА человека с З'-НТО генов тПА грызунов была значительно большей, чем гомология З'-НТО человеческих тПА и уПА. Участки этих гомологии расположены внутри областей "А", "Б" и "В", и схематически показаны на рис.8, а на рис.10 -представлены последовательности, соответствующие наиболее сильным таким гомологиям. 17-ти нукпеотидный участок полной гомологии из области "В" обнаружен с участком З'-НТО онкогеноподобного гена егд2. Следует отметить наличие в участках "Б" и "В" одного из указанных выше повторов - "ATATTTATAG", элемент которого "ТАТТТАТ" охарактеризован, как сигнал нестабильности мРНК многих генов млекопитающих (Zubiaga и соавт., 1995). Это соответствует данным Ouang и соавт. (1995) о негативном влиянии дистального участка З'-НТО гена тПА на стабильность его мРНК. Поэтому, можно предположить, что ингибирование экспрессии гена CAT участком "В", вероятно связано с дестабилизацией им химерного транскрипта.

На рис.10 схематически изображена рассчитанная на компьютере возможная вторичная структура участка мРНК, соответствующего З'-НТО гена тПА. Она имеет отдельные, более компактные структуры, которые примерно совпадают с областями "А", "Б" и "В". При этом, участки наибольшей гомологии этой

А.

с-—

Б

Bpjl SacI BtlXl__ Noll

... aagagaaagg tagaagaccc CAAGCGAGCT CCACCGCGGT GGCGGCCGCf

IXU1) Sp.l В*шН1 Smal Mlul EcoKV IHmdIIll CI.I

CIAGAACTAG 7GGA7CCCCC GGGACGCGTG ATATCAAGCT TATCGATACC [Salt] DnQ

lAccll Xbol Apal Kpnl Bell

GTCGACCTCG AGGGGGGGCC CGGTACCGTG ATCAGCaact Iglltatlgc ...

область промотора SV40......................412-614 п.о.

В. кодирующая область гана CAT............... 646- 1306 п.о.

область еюнала полиаденилирования SV40 ... 1811- 1940 п.о.

область энхаисара транскрипции SV40.......1947-2184 п.о.

кодирующая область р-лактамаэы......... 3394 - 4254 п.о.

Рис.11. Экспрессионный вектор с репортерным геном - рСАТ-3' (А). Вектор получен на основе плазмиды рСАТ-Сопио! замещением ее области 1691-2106 п.н. на область поликлонирования. Показана нуклеотидная последовательность участка поликлонирования, в ней отмечены уникальные сайты рестрикционных эндонуклеаз (Б) (сайты рестриктаз, присутствующих в других местах вектора заключены в скобки). Этот участок вектора составлен из элементов полилинкера плазмиды рВЮеаспр! II БК+ и двух олигонуклеотидных адаптеров. Указаны основные области конструкции, существенные для ее транскрипции в зукариотических клетках (В).

зледовательности с последовательностями З'-НТО генов тПА грызунов и уПА повека входят в состав образований типа "шпилька" или "стебель-петля", пяющихся элементами этих структур. Оба указанных выше повтора, содержащих гнал нестабильности мРНК (ТАТТТАТ) обнаруживаются в составе ухцепочечных участков рассчитанной вторичной структуры транскрипта З'-НТО.

Новый экспрессионный вектор - рСАТ-3'. Созданная при получении новных конструкций плазмида V (рис.5, и.) может быть полезна, как вектор, зволяющий встраивать различные фрагменты чужеродной ДНК в З'-концевую пасть репортерного гена и изучать содержащиеся в них сигналы экспрессии. На с.11 представлена схема этой конструкции. Находящийся "ниже" гена CAT асток поликлонирования имеет 14 уникальных сайтов общеупотребительных ¡стриктаз; это дает возможность легко клонировать в него различные фрагменты Ж. Клонированный фрагмент оказывается в составе транскрипта репортерного на, что позволяет изучать содержащиеся в нем сигналы посттранскрипционного (нтроля экспрессии гена, реализующиеся на уровне мРНК. Организация ютриктных сайтов в указаной области вектора (концевые сайты Sacl и Kpnl) дает >зможность получать в клонированном фрагменте систематические делеции с юих его концов с помощью экзонуклеаз Exolll и S„ подобно тому, как это было (опано в настоящей работе. Данный вектор (его можно назвать, как рСАТ-3') эзволяет, например, изучать сигналы экспрессии различных генов, «¡положенные в их З'-НТО.

Можно добавить, что коммерчески доступных эукариотических экспрессионных зкторов, имеющих сайты поликлонирования в З'-концевой области репортерного !на к настоящему времени нет - все такие векторы имеют подобные сайты лишь эпастях, расположенных "выше" 5'-конца репортерного гена. Это связано с тем, го до недавнего времени, обычно изучались регуляторные области, лежащие в гномах в 5'-областях генов и "выше" (промоторы и энхансеры транскрипции).

Данная работа финансировалась фантом Российского фонда фундаментальных сследований 94-04-12646 ("Исследование окологенных пространств гена <аневого активатора плазминогена человека").

ВЫВОДЫ

Изучена структурная организация геномной области человека, содержащая З'-концевую часть гена тПА и прилегающий окологенный участок.

Изучена функциональная организация З'-концевой части гена тПА. Показано, что в различных клетках млекопитающих З'-НТО гена тПА существенно ингибирует экспрессию репортерного гена. В З'-НТО локализованы участки, связанные с указанным эффектом, оценен примерный вклад каждого из них.

> Определен сравнительный уровень транскрипции гена тПА в различных органах, отделах органов, тканях и клеточных линиях человека.

» Получен вектор, позволяющий изучать сигналы экспрессии генов, расположенные в их З'-концевых областях.

Список опубликованных по теме диссертации работ.

1. Сарафанов А.Г., Тимофеева М.Я., Алешков С.Б., Куприянова Н.С., Банников В.М., Захарьев В.М., Баев A.A. "Выделение и характеристика фрагментов ДНК области гена тканевого активатора плазминогена и прилегающих к нему участков генома человека". // Молекулярная биология. 1994. Т. 28. С. 790-795.

2. Сарафанов А Г., Тимофеева М.Я., Банников В.М., Захарьев В.М., Мамаева O.K., Тихомирова Т.П., Баев A.A. "Определение и анализ первичной структуры геномной последовательности, прилегающей к 3'-концу гена тканевого активатора плазминогена человека". // Молекулярная биология. 1995. Т. 29. С. 287-293.

3. Сарафанов А.Г., Тимофеева М.Я. "Н. sapiens ТРА gene." // GenBank NCBI. 1996. АС.Х77531.

4. Сарафанов А.Г., Тимофеева М.Я. "мРНК тканевого активатора плазминогена в различных тканях и органах человека". // Молекулярная биология. 1996. Т. 30. С. 1326-1333.

5. Сарафанов А.Г., Кондратов Р.В., Захарьев В.М., Прасолов B.C., Козлов Ю.В. "Ген тканевого активатора плазминогена человека: регуляция экспрессии сигналами, расположенными в З'-нетранслируемой области". // Молекулярная биология. 1998.

Подписано в печать 12.02.98 г. Формат 60x90/16. Бумага офсетная №1. Тираж 100 экз._Зак. № 16.

ГОПП ЦНИИТЭИ легпрома; г. Москва, ул. Вавилова 69/75.