Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурные особенности организации и регуляция активности транскрипционного активатора HSF (Heat-Shock Transcription Factor) из дрожжей K. Lactis H S. cerevisiae

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурные особенности организации и регуляция активности транскрипционного активатора HSF (Heat-Shock Transcription Factor) из дрожжей K. Lactis H S. cerevisiae"

ИНСТИТУТ Ш1Т0Л0ГИИ РОССИИСКОП АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

{

БАРЛЕВ Николай Анатольевич

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ТРАНСКРИПЦИОННОГО АКТИВАТОРА HSF CHEAT-SHOCK TRANSCRIPTION FACTOR) ИЗ ДРОЖЖЕЙ К. LûCTIS И S. CEREl'ISIdE.

03.00.25 - клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

Работа выполнена в лаборатории структурной организации генома Отдела клеточных культур Института цитологии Российской Академии наук и отделе молекулярной биологии Орхус-ского университета. Дания.

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор С. Н. Борхсениус.

Официальные оппоненты: лектор биологических наук Т. Р. Сойдда. кандидат биологических наук Ю. Н Павлов.

Ведущее учережденме - Ленинградский Институт Ядерной Физики.

.. 1994 г в У'ЗчаСОЬ

Зашита состоится и " "чч'/пч* 1Э94 г. в-Очасов

на заседании Специализированного совета Д. 002.73.01 при

Институте цитологии РАН по адресу: 194064. Санкт-Петербург. Тихорецкий пр. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан ^^{¿¿ур^ 1994 года.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук Л. Н. Писарева

йктуальность темы. Б ответ на гипертермию и некоторые другие Формы Физиологического стресса. в клетках начинает транскрибироваться определенный набор i енов. кодирующих так называете "белки теплового шока" CDTUP. 'Руш.цпи этик белког. до конца еще не изучены, однако показано, что они участвуют в процессах ренатурации и/или солюбилизации денатурированных белков (Linclquist. 1966; Еяспг. .S Pel nam. 1987.1, защищая теп самым клетку от неблагоприятных последствий стресса СJakobsen & Pelham. 1988).

Возможность индукции транскрипции генов БТШ у эукаг-иот определяется наличием специфически:-: последовательностей ЛНК HSE Cheat-shock elements.) в пропоторной области генов, nsp Cheat-shock prole in1. HSE представляет собой инвертирован ные повторы длиной 5 пар оснований nGAfln и найдены как у низших С S. cere visiAe~> так и у высших С P!'osvptiila~> эукариот CBienE .Я Pelham. 1982; fimin c-t al. , 1988). НЕЕ служат специфическими сайтами связывания дла ядерного белка HSF Cheat-shock transcriptional factor) с молекулярным весом 120-140 кДа CSorger 5 F'elham, 1987). который в сбою очередь, взаимодействуя с транскрипционным аппаратом, меняет уровень транскрипции генов hsp.

На сегодняшний день, гены H3F выделены из S. cereviviae CSorger & Pelham, 1988), К. lactis CJakobsen -Я Pelham. 1991), Drosophircios et al. , 1990), человека С Rabinclran et al.. 1991), мыши CSarge et al. , 1991), томатов fScharf et al., 1990). У дрожжей HSF представлен одной копией гена на геном, тогда как у человека, мышей и растений томата существует несколько копий С Lis & U'u, 1993). Этот Факт может обуславливать наблюдаемые функциональные различия между молекулами HSF из разных организмов. Несмотря на высокую степень гетерогенности на аминокислотном уровне. найдено несколько функциональных доменов: ДНК-связывающий домен, триме-ризационный и активирующие, котрые отличаются высокой консервативностью аминокислотного состава и позволяют отнести HSF к классу белков-активаторов транскрипции. HSF синтезируется в клетке постоянно, так как показано, что индукция транскрипции генов hsp не блокируется ингибиторами белкового синтеза CSimarino 5 Wu, 1987), но специфически активируется лишь в результате определенных форм стресса. Более того, известно, что существуют как минимум два механизма регуляции активности H3F. У позвоночных и дрозофиллн молекулн HSF в нормальных условиях существуют в виде мономеров не способных связываться с ДНК. однако под воздействием тепло-

вого стресса они образуют триперы. связываются с ДНК и активируют транскрипцию генов hsp (Kingston et al.. 198?; Sorger et al.. 1987). У дрожжей, напротив. HSF постоянно существует в виде тримера. связанного с ДНК. но приобретает способность существенно активировать транскрипцию лишь в мо-пент теплового шока, претерпевая, по-видимому. некие конфор-мационные изменения CJakobsen S Pelham. 1988). В связи с этии. особый интерес представляет собой исследование структурной организации белковой молекулы HSF дрожжей и выяснение роли отдельных ее элементов в процессе регуляции активации транскрипции.

Цели и задачи исследования. Целью предлагаемой работы являлось изучение различных структурных элементов молекулы HSF и выяснение их роли в процессах активации и инактивации транскрипции генов hsp. В соответствии с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Создать серию делеций генов HSF из дрожжей А'. lactis и S. cerei'Jsiae, кодирующих С-кониевые фрагменты белковой молекулы HSF. с последующим определением их способности активировать транскрипцию с тестерной плазмиды. несущей ген в-галактозидазы. для того, чтобы локализовать месторасположение непосредственно С-концевого транскрипционного активатора в молекуле HSF.

2. Исследовать интрамолекулярные взаимодействия между отдельными доменами HSF с помощью ди-гибридного метода (Fields. 1988) и их роль в регуляции активности HSF.

3. Изучить влияние фосфорилирования на изменение конфор-мации молекулы HSF. а также Физиологическую роль этого процесса в момент перехода HSF в активное состояние путем анализа различных мутантов методом гель-ретардации и измерения их транскрипционной активности.

Научная новизна и научно-практическая ценность работы. Работа содержит новые данные, касающиеся структурных особенностей транскрипционного активатора белковой природы HSF и механизма его регуляции в процессе теплового шока.

Впервые нами было точно определено расположение аминокислотной последовательностей в белках HSF К. lactis (K1HSF) и S.cerevisiae (ScHSF). обладающих высоким ¿гз/ге-активирую-ишп потенциалом (способность к активации транскрипции даже в контексте чужеродного ДНК-связывающего домена).

Тримеризационный домен HSF состоит из двух пространственных спиральных структур. носящих название лейциновые затворы ( leucine zippers). Причем лейциновый зат-

вор А (расположен ближе к N-концу) необходим для олигомери-зации, о то время как более дистально расположенный затвор В маскирует оба (слабый N-концевой и потный располагающийся в С-хонце молекулы) транскрипционных активатора, которыми обладает HSF.

Показано, что существует два типа активности HSF (идуни-бельный и конститутивный), которые определяются взаимодействием между разными функциональными доменами молекулы HSF: состояние N-концевого активатора определяет индуцибельную активацию транскрипции при кратковременном тепловом шоке, конститутивная же осуществляется за счет С-концевого активатора и необходима для выживания при длительном тепловом стрессе.

Выяснена роль ФосФорилирования цепи аминокислотных остатков серина."прилегающих к СЕ2 (conservative element), который располагается между С- и N-кониами. Мощное ФосФорили-рование. сопутствующее активации HSF, давало основания предполагать, что ФосФорилирование может инициировать активацию HSF. либо поддерживать его в активном состоянии (Sorger. 1991). Нам же удалось впервые показать. что фосфорилирова-ние. напротив, связано с инактивацией молекулы HSF. возггох-но. за счет привлечения шаперонных hsp. которые, как показано. участвуют в негативной регуляции активности HSF (Mosser et al. . 1993).

Полученные данные углубляют наше понимание механизмов регуляции активации HSF и позволяют предложить модель функционирования HSF при тепловом шоке.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Международном симпозиуме "Organization and Regulation of Genes" (Aarhus. Дания. 1992). на семинарах в Институте цитологии РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи___

Объем работы. Диссертация изложена на стр. машино-

печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения. выводов и списка литературы, содержащих 22.Q названий. Работа иллюстрирована £3 рисунками и J таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы. В данной работе использовался гаплоидный дрожжевой штамм, полученный диссекцией тетрад из диплоидного ЫЗОЗ. несущий хромосомную мутацию HSF:: TRP. разрушающую ген

HSF. и утилизирующий HSF. экспрессируепый с плазмиды VCp50 с URA3 селективнып паркером. В экспериментах по гель-ретардации использовались гаплоидные штаппы BJ 5462 (игаЗ-52. Irpl. Ieu2dl. his3d200. pep4::HIS3). а также сконструированный из BJ 160 штамп с генотипом: leu2. рер4-3: : НI S3< dHSF::TRP1. HSF-URA3/CEN.

Плазмиды. Гены K1HSF и ScHSF были клонированы под промотор HSF S. c&revisjae (782 п. н. ) ' в дрожжевую плазмиду HIS/CEN pRS313 С Sikorsky & Hieter. 1989). Делеционные Фрагменты генов K1HSF и ScHSF. кодирующие различные С-кониевые части белка, были получены в результате обработки экзонук-леазой III и нуклеазой из соевых бобов в сочетании с гидролизом специфическими рестриктазами плазмид pBlueScript (-). содержащих гены K1HSF и ScHSF. встроенные в разных направлениях в полилинкерную область впереди стоп-кодонов по трем рамкам считывания. Эти фрагменты были затем клонированы по Sall-Notl сайтам в CEN/URA плазмиду pVCdl9N (получена из YCP88-lexA-gcn4-dl9 (Hope et а!.. 1988) путем вставки Notl-линкера в уникальный EcoRI сайт), кодирующую ДНК-связы-ваюший район бактериального репрессора lex A (Ginger & Ptashne. 1985). Экспрессируемые химерные белки, таким образом. состояли из N-кониевого фрагмента (а.к. 1-87) lex А и различных С-концевых фрагментов молекулы HSF.

Гибридные белки. несущие различные части лейциновых затворов, экспрессировались с соответствующих П11Р-синтезиро-ванных фрагментов генов HSF. Причем прайнеры для ПЦР были синтезированы таким образом. что передний содержал Sal I сайт, а задний праймер - Notl сайт, что позволило клонировать по этим сайтам полученные nUP-продукты. сохраняя рамку считывания, как в pyCdl9N. так и в плазмиду рВУ102. содержащую С-конец молекулы HSF под сильным конститутивным триозо-фосфатизоперазным СТФИ) промотором. Плазмида pBY102 была получена из CEN6-ARSH4/HIS3 плазмиды pRS313 путем клонирования Pstl-EcoRI ТФИ-фрагмента по EcoRV-EcoRI сайтам и вставки синтетического Mlu-линкера. содержащего старт-колон ATG и Sali сайт, по сайтам EcoRI-Notl.

Трансформация дрожжевыми плазмидами. Трансформацию проводили путем получения сферопластов кальциевым методом как описано (Jakobsen & Pelham. 1991).

Измерение в-галактозидазной активности. Для измерения уровня транскрипционной активности конструкций было необходимо избавиться от плазмидного HSF CYcp50/URA). Это достигалось путем культивирования штамма на твердой среде в присут-

ствии 1мг/мл 5-флюорортовой кислоты (S-iOK). добавление которой ведет к мошной контрселекиии против урацилсинтезирую-ших генов из-за образования токсичных продуктов. Выжившие в результате обработки клетки и соответственно содержащие только путантный HSF трансформировали индикаторной плазпи-дой. несушей HSE последовательность Ссайт связывания HSF) впереди CYC1/TATA области 1ас2 гена. кодирующего фермент в-галактозидазу. который, при взаимодействии с субстратом о-нитроФенил-в-О-галактопиранозидом СОНФГ). превращает его в окрашенное производное.Тестируемые мутанты культивировали на селективной жидкой среде при различных температурах. затем подвергали тепловому шоку (ТШ) при определенных температурах от 37 до 41 градуса Цельсия. После ТШ культуры инкубировали еще некоторое время при нормальной температуре Фермента в-галактозидазы. Клеточные экстракты готовили как описано у Согера (Sorger & Pelham. 1988). В-галактозидазная активность вычислялась по Формуле:

А 1000x(0D420( t)-0D420(o))/0D600C t)-0D600(o)

где А - активность выраженная в условных единицах

OD - оптическая плотность при разных длинах волн

в начальный (о) и конечный (О моменты времени.

Белок-белковые взаимодействия. В основу этих экспериментов был положен подход. предложенный Стэном Филдзом (Fields & Song. 1989). Химерные белки, состоящие из ДНК-свя-зываюшего района бактериального репрессора 1ехА и различных комбинаций лейииновых затворов А и А+В Ca.к. 304-356 и 304-389 соответственно) козкспрессировали вместе со "свободным" С-концом HSF И. lactis. находящимся под сильным ТФИ промотором. с CEN/URA и CEN/LEU плазмид. Для того, чтобы эндогенный HSF не интерферировал с тестируемыми мутантами, в эк-сериментах использовался штамм с хромосомной мутацией HSF и живущий на плазпиде CEN/HIS с геном HSF без тримеризационно-го домена (а. к. 311-318).

Метод гель-ретардации. Белковые экстракты и радиоактивно-меченные олигонуклеотидные пробы готовили как описано у Согера (Sorger et al.. 1987). используя дефицитный по про-теазе штамм BJ 160. Обычно реакцию связывания тестируемых мутантных белков с олигонуклеотидной пробой, несущей 3 HSE сайта проводили в объеме 50 мкл при комнатной температуре в течение 30 минут. В экспериментах по деФосФорилированию HSF. белковые экстракты обрабатывали 20 ед. тимусной фосфатазы (Boeringer) в течение 20 минут перед добавлением меченной пробы. Электрофорез вели при комнатной температуре в О.25Х

ТБЕ при постоянном токе 20 мА. Для разделения с<6г-а.5ук<шл:-:с.ч комплексов использовали ЗХ полнакриламидный гель с пониженный содержанием бис-акрилапида (40:0.5).

Сайт-направленный мутагене?. С а й т- н а п р а в л е н н i j й мутагенез проводили по стандартной методике ССэмбрук и др.). гиб-ридизуя одноцепочечную матричную ДНК. с олигонуклеотиднып прайнероп с последующей трансформацией в штамп £.' coli TGI.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Точная локализация С-концевого активатора KSF щ. К. JactJs и S. cerevJsuat.

Кал было показано ранее CJakobsen X Pelham. 1091) K1HSF и ScHSF имеют 9 района гомологии, соответствующие функциональным доменамг СЕ1 (conservative element в N-конце). ДНК-связываюший домен, участок, отвечающий за тринеризаиир. и гептапептид. располагающийся б дистальной части Н-конца, СЕ2 Срис. 1). С-концы K1HSF и ScHSF не обладают видимой гомологией, но оба несут высокий транскрипционный потенциал, который обычно подавлен в естественной контексте молекулы HSF. но проявляется с полной силой при подсоединении С-конца HSF к гетерологичному ДНК-связив&ющему домену. например бактериального репрессора lexA (Jakobsen & Pelham. 1991; Sorg&r. 1990). Более того, было установлено. что С-кониы K.1HSF и ScHSF взаимозаменяемы без потери активности или регуляции. Ны решили котировать месторасположение С-концевых транскрипционных активаторов в молекулах K1HSF и ScHSF для того, чтобы изучить особенности ик строения и регуляции.

К. lactß

СЕ1 DMA • triner СЕ2 binding А В

т

r/M а

62-72 195-298 320-372 <451 -466

fc.77

euisiae С

S. cerevisi&e

C-t&rrwnsJ J «ctw-àtofi

57-69 167-284 344-413

536-551

J

Рис. 1 Строение белков KLHSF и ScHSF. Гомологичные долены бн--делены различной штриховкой С CEI. ДНК- с в я г ые ающи й и. трпперп-зашюнный домены, СЕ2 и С-кониы, в которых располагается активаторы.

В данной работе иы получили набор делеционных фрагментов ДНК по обоим концам генов K1H3F и ScHSF. комбинируя нес-пеииФический гидролиз ДНК экзонуклеазой III и нуклеазой из соевых бобов с рестрикилонным гидролизом по соответствугншш эндонуклеазным сайтам. Полученные фрагменты клонировали в экспрессируюшую плазмиду. кодирующую N-конец lexA Ca. к. 1-87), что соответствует его ДНК-связыватему домену. Транскрипционный потенциал экспрессированных С-концевых полипептидов белков K1H5F и ScHSF определяли по уровне» в-га-лактозидазной активности с помощью репортивной плазнидн LEX-laeZ с си. Материалы и методы}, (рис.2).

К.2асЫз

WO LEX 1-87MGRRAIA

klCI LEX 1-87I1GRRA1A klC2 LEX 1-S7MGRRA1A

Äs

USGHG

REU

Aclivily

n?oo 8)00

I2vv

k!C3 LEX 1-87I1GRRAIA н та ¡та г.'in^-чяу.уз"13 c.qj

WC4 LEX1-87MGRRAIA

kIC5LEX 1-87MGRRA1A E

&

Е32Я

USGSHG

klC б LEX 1-S7HGRRA1A r

5A'

kINI LEX 1-87I1GRRGLST k!N2 LEX 4-87MGRR klN3 LEX 1-87MGRRPUDE Ш1 LEX 1-87I1GRRGLST k!N5 LEX 1-87I-1GRRGLST MNS LEX1-37MGRR

1OVO0

I0i-v<

LV.

¿77

^йяяэнг?'

r?

KLHSF

Хи-lv :-:A си-i: раин и к

Рис 2 Делеиионный анализ С-кониевого активатора мерные конструкции состоят из ДНК-связыватегс« района (LEX 1-87) и Фрагментов С-конца K1HSF. представленных, б де черных прямоугольников. Цифрами указаны позиции точек фрагментов согласно аминокислотной последовательности K1HSF. Однозначным буквенным кодом обозначены аминокислоты, образовавшиеся при клонировании С-концевых фрагментеб f. плймиду pdl8N. В-галактозидазная активность определялась помощь^ репортивной плазмиды. содержащей lexA-связнг.а«юи сайт, ■

Делеции в С-концевом направлении вплоть до а. к. 625 K1HSFCK1C2). не имели значительного эффекта на транскрипционную активность. Однако делеция уже следующей аминокислоты 622 ведет к уменьшению активности в 10 раз С конструкция К1С5). Следующее резкое падение активности до базалыюго уровня отмечается при делетировании аминокислот начиная с позиции 610 до а. к. 525, конечной точки делеций с С-конца СК1С5. К1С6).

Делеции С-концевого участа молекулы K1HSF с N-конца до позиции а. к. 592 не ведут к значительному снижению активности.'. но укорочение на 3 и 6 последующих аминокислоты (конструкции K1N5, K1N4J оказывает ощутимый эффект на уровень транскрипции, снижая его в 3 и 50 раз соответственно. Последующие делеционные мутанты с последовательностями, начинаю-щимимся с позиции 602 и далее практически неактивны. На основе проведенного делеционного анализа мы сделали заключение "о том. что аминокислотный участок 592-623 является критическим для сохранения С-концом K1H3F высокого транскрипционного потенциала.

Чтобы выяснить является ли локализованная нами аминокислотная последовательность собственно активатором, способный независимо от окружения активировать транскрипцию Стран-с-активатор). мы сравнили транскрипционную ^тиин^ст:. пон-струкции с внутренней делецией фрагмента а. к. 560-653 С рис. 5, конструкция1) с активностью самого этого фрагмента а.к. 559-654 (конструкция 2).

• K-Lactis HSF Activitv

457 559 654 677

1. LEX 1-87 mgrrala----Ж///ШШ/Ж-----grv ------ Ш 30

S59 592 623 654

2. LEX 1-87 mgrrglstgpgai---------------- р^гаЙКШ --cew 3500

3. LEX 1-87 mgrriesp-------------------------- ЦЦО- dpmdi 45

14

118

4. LEX 1-87 mgrivpg

132155

-in

7600

14 _155

5. LEX1-87 mgrrvpg -----------------I l"lin 35

Phç. 5 Аминокислоты 592-623 обладают высоким транскрипционный потенциалом (выделены другим цветом?. Остальные обозначения как в Рис. 2.

Как и предполагалось, конструкция 1 была неактивна. а конструкция 2 имела высокий транскрипционный потенциал. Тем не менее, более короткий пептид а. к. 592-623 не мог активиро-„ вать транскрипцию с ЬЕХ-1ас2 репортивной плазпиды (конструкция 3). что могло объясняться несколькими причинами:

а). активатор не ограничивается районом 592-623 и требует-дополнительных элементов, расположенных в С-конце:

б), на его нормальное функционирование могут влиять прилегающие последовательности (например, соединяющая активатор с~ 1ехА последовательность отличается по аминокислотному составу от таковой в конструкциях К^2 и К1С2 (см. рис. 2). Введение активирующего допена в гетерологичный М-концевой участок ШНБЕ. который сам. как было показано ранее, не обладает транскрипционной активностью (Ваг1еу & ОакоЬгеп нео-публик. ). превращает весь фрагмент в чрезвычайно мощный активирующий домен (конструкции 5 и 4 соответственно). Таким образом, можно сказать, что аминокислотная последовательность 592-623 представляет собой активирующий домен белка КШБЕ.

Эо^ег (1990) показал, что в С-конце БсНЗЕ - Са»к... 584-833) выделяется отдельный участок (а.к. 584-783). обладающий высокой транскрипционной активностью, будучи присоединенным к 1ехА ДНК-связывающему домену. Тем не менее; эта активность в 6 раз ниже, чем у полноразмерного С-конца. В наших экспериментах (рис.4) делетирование аминокислотных остатков до позиции а.к. 7 83 лишь незначительно снижало активность. Однако удаление двух последующих аминокислот вело к 6-кратному падению активности (БсС2). Следующее существенное падение активности замечено при достижении позиции 691 (ЗсС4). Химеры с делеииями после а. к. 650 были практически неактивны (ЭсСб). И-концевые делеции сохраняют полную актив-, ность вплоть до аминокислоты 595. Дальнейшее делетирование до позиции а.к. 662 ведет к 60-кратному падению активности, и конструкции, начинающиеся после а. к. 688. лишь в 1.5-2 ра-. за более активны по сравнению с Фоном. Полученные данные говорят о том. что. по-видимому, у 51. сегеулялае полный тран-скрипционно-активный активатор состоит из двух участков: Первый располагается между а. к. 595 и 713 и способен самостоятельно в значительной мере активировать транскрипцию. но соединенный со вторым участком. расположенным более дис-тально (примерно около а.к. 650 и до 783) по отношению к первому, приобретает активирующие свойства сравнимые с полноразмерным С-концевым фрагментом ЗсНЗЕ.

S.cerevlslaa

scCO LEX 1-87-MGRUDARGP scC1 LEX 1-8 7-MGRUD ARGP

scC2 LEX1-87-MGRUDARGP в!

scC3 LEX1-87-MGRUDARGP scC4 LEX 1-87-MGRUDARGP ' scC5 LEX 1-87-MGRUDARGP scC6 LEX1-87-MGRUDARGP

scN1 LEX 1-87-MGRG scN2 LEX 1-87-MGRUDARA

scN3 LEX1-87-MGRG scW LEX1-87-MGRUDARD scN5 LEX 1-87-MGR UARA scN6 LEX 1-87-MGRG scN7 LEX 1-87-MGRG

82

M

USE

агаммшяя whu J&T*

Жа

a

ж

25í2S33¡2£SÍ&

ActivUy 11300 9400 1540 1630

365 154 34

15000 12100

с, с о

lata www» ít

60

Рис. 4 Делеционный анализ С-концевого активатора ScHSF. Активность определялась как описано в рис. 2. Условия яеле-ционных экспериментов С-концевых активаторов KIHûF и ocHoF были идентичны. .

2. Активирующие доиены K1HSF и ScHSF перекрываются с а-спиральными структурами "лейциновыми затворами".

Несмотря на кажущуюся гетерогенность карбоксильных, концов K1H5F и ScHSF. аминокислотные последовательности 581-608 К1Н5Р и 626-655 ScHSF обладают ограниченной гомологией С рис. 5). Гептадные повторы гидрофобных аминокислот, замеченные у обоих активаторов, потенциально могут образовывать а-спира-ли типа "лейшшовых затворов" - структуры, активно участвующие в образовании белок-белковых взаимодействий, в частности в процессах ¿лигомеризации активаторов CLandschultc с-1. al. . 1988). Подобные С-концевые структуры обнаружены в H3F из мыши, дрозофиллы. цыпленка и человека С Clos et al. . 1990; Sarge et al. , 1991? NaKai & Horimoto. 1893). Более того, мутация. разрушающая целостность С-концевого лейциновс-го затвора HSP дрозоуиллы приводила к конститутивной тринеризации и активному" ДНК-связыванию белковых молекул HSF. Была пред-•ложена модель, где роль С-концевого затвора заключается б ингибировании тринеризации HSF в нормальных условиях путем

образования термочувствительных контактов с другим» лейцино-выми затвор&пи, расположенными в Н-концевой области молекулы (ЯаМпагап е! а1., 1993).

580

610

К.ЛасЫз 5.сегеу1з1ав

590 у ео°

I -v -v I

ИЕбРЩЙРЫШтЙвдЕЙЙАКБШ ЫХ1ЕЫМН?Н13 в Щурмкзгык

Г I ~ "" I I

А 630 640 650 660

(595)

А

КРЕЬЙМ -г ^ -г ^ -г

ТБЗТмТ -668-763- РОХКГБАТЕЫТКУЗОЫЬРЭРЫ

' 1 ' А

670 770 780 Л - __• _ *__

.Рис. 5 Сравнение по аминокислотному сост5Бу активирующих. С-кониёвых доменов К1НЗ? и ЗсНЗ?. Гидрофобные аминокислоты, участвующие в образовании двух гептадных повторов, обозначены пустыни и затемненными треугольниками. Идентичные аминокислоты в последовательностях К1НЗР и ЗсНЗГ выделены жирным— шрифтом, а гомологичные заключены в заштрихованные прямоу- , гольники. Длинные стрелки указывают на границы фрагментов, обладающих полный транскрипционным потенциалом, а короткие -на позиции, начиная с которых, активность теряется.

Чтобы проверить действительно ли эти последовательности Са. к. 581-608 и 628-655 у К1НЗ? и ЭсНЗГ соответственной-могут образовывать, предсказанные на основе компьютерного анализа, структуры, мы сравнили транскрипционные активности мутантного К1Н5Е. в котором предполагаемый С-кс<нцевой лейци-новый затвор был заменен на гетерологичный из ЗсНЗК. и нормального К1Н5Р (рис. 6, конструкции 2 и ыО. Оказалось, что произведенная замена никак не влияет ми на уровень активности, ни на модус регуляции НЗГ. Возникает вопрос можно ли заменить С-конец НЗГ на любой гетерологичный. активатор? Созданная нами конструкция НРйаХ (рис. 6). г-которой С-конец К1Н5Г запенен на активаторну» область мощного .транскрипционного активатора СйЬ4, показывает, что происходит неспецифическая репрессия активности №-концом НЗ?. и

гт

а

и.

со >

а: §

■ч:

о о сэ о

+ + +

о о см

о см

о о

+

+

К 5

ом

о со

и

со

■ч-

• • ь

«1 И

г* ь.

ш VI

(о й ю

3 и. и.

V) V)

I X

8 §

« И

Г- г.

е Е

О а о о

сп о о о

о "ч- со со

1— о> со •ч'

+ +

+ + +

+ + +

о см

ю «о

■ч-

о) см со v

см

ок <р

а а

<0

о а

Рис. 6 Влияние мутаций б С-конце К1НЗГ на уровень в-галакто-зидазной активности до Ссоп) и после С1т5) теплового шока. (+) и С-О обозначают способность мутантов • расти при длительном повышении температуры. Транскрипционная активность С-концевых фрагментов определялась как б естественном контексте ПЭГ. так и б химерных конструкциях с ДНК-связывашип участком бактериального репрессора 1ехА Сем. Рис.2,4).

нормальная регуляция активации в ответ на повышение температуры отсутствует. По-видимому. в С-кониах K1HSF и ScHSF существуют некие структуры, которые, взаимодействуя с элементами N-конца, осуществляют четкую регуляцию активации HSF. Попытки вызвать дерегуляцию K1HSF. воздействуя на гидрофобные аминокислотные остатки, образующие С-концевой лейцино-вый затвор, не привели к успеху, так как слабые мутации не имели ощутимого эффекта (конетр. 5. 6). а сильные - разрушали сам активатор (констр. 4; рис.6), делая клетки температу-рочувствительными к длительной инкубации при высоких температурах. Тем не менее нам удалось выявить короткую последовательность (а. к. 609-612). которая образует "'виток" а-спи-рали. и состоит из повторяющихся аминокислотных остатков пролина и глицина (PGPG). Делеция этого участка, хотя и несколько снижает, способность активировать транскрипцию с LEX-lacZ индикаторной плазмиды. однако практически полностью "подавляет" индуцибельный ответ на тепловой шок (констр. 7; рис.6). При этом сам С-концевой активатор остается неразрушенным. так как клетки способны расти при 35"С. Это является еще одним свидетельством в пользу теории, по которой, чувствительность к повышеннной температуре роста не зависит от индуцибельного ответа на тепловой шок. осуществляемый в основном за счет активации N-кониевогй слабого, пока еще не идентифицированного активатора. Таким образом. в ответ на повышение температуры, регуляция HSF может контролироваться двумя различными механизмами в зависимости от того кратковременным или продолжительным будет тепловой шок. и только правильная регуляция последнего механизма необходима для роста при повышенной температуре.

3.Короткий лейциновый затвор В тримеризационного домена HSF необходим для репрессии активности в нормальных условиях.

Предыдущие исследования показали. что деления двух N-концевых доменов: тримеризационного и СЕ2 ведут к полной дерегуляции HSF (Jakobsen & Pelham. 1991). Мы решили выяснить какое участие принимают эти структуры в механизмах регуляции ответа на кратковременный (КТШ) и продолжительный (ПТШ) тепловой шок. Было обнаружено, что тримеризационный домен K1HSF состоит из двух лейциновых затворов: большого (А) и.малого (В), разделяемых гистидином. Делеция лейциново-го затвора А резко влияет на силу связывания HSF с ДНК. но не имеет эффекта на регуляцию активности (Рис.7).

[>на Ьик&к)

иипел2а1юл а в

зсшное с

>94 - »9 356-]?$ 451-466 311-355

580-623 677

Ас1т1у

с нэ 20 200

DN

м

. КЕМ I 1мцимяп-у/Л | I ',20 180

НРйВ I - ИШ.даг,'ЦМ ЬччччМ 8 I 210 200

Ч)70"~Р

НРв^р | втамм.чн ШШ В I-'--1 I 180 170

и70>- Р

НРВ^рйС I ' Н 55 60

Рис. 7 Лейциновый затвор Б контролирует транскрипционную активность при норкальной температуре. ДНК- связывающая способность определялась методом гель-ретардации.

Отсутствие же затвора Б, которое также снижает способность НЭГ связываться с ДНК. ведет к дерегуляции НЭГ. Для того, чтобы проверить; не является ли эта дерегуляция следствием изменения ДНК-связывашей способности, пы ввели точечную мутацию. заменяющую остаток лейцина в позиции а. к. 570 (конец дейцинового затвора Б) на пролин, который, как известно, разрушает лейциновие спир&ли. Эффект этой точечной мутации на регуляцию оказался таким же, как и удаление целиком лей-цинового затвора В. однако ДНК-связывающая способность в этой.-случае оставалась нормальной. Методом гель-ретардации было также показано, что мутация в конце затвора В не влияет на способность НЭГ к олигомеризации. Более того, НЗГ, лишенный. С-конца и несущий эту мутацию, становился конститутивно активным. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что лей-шшовый затвор Б играет специфическую роль б репрессии транскрипционной ^активности обоих Ы- и С-активаторов.

Логично было предположить, что лейииновый затвор В осуществляет контроль над С-концевым активатором, через взаимодействие с лейциновып затвором С, которое разрушается при

теплоЕом шоке. Однако нам не удалось убедительно показать наличие таких контактов Срис. 8).

lex а

esssa-sss

lex а

Езагаи-ша

lex а

act.

с 677

Activity 10

ta

а в

Рис. 0 Способность лейциновых затворов ft. В и С в различных комбинациях взаимодействовать между собой Сем. раздел "МЕТОДЫ).

В экпериментах по белок—белковым взаимодействиям Сем. Методы), мы исследовали возможность образования контактов между лейциновыни затворами А, А+В и свободным С-актисатоРом. Интересен тот Факт, что хотя конструкция lex-fi не способна образовывать контакты с А-СТА CC-terminal activator) или с А+В-СТА Срис. 8. эксп. 2,3). тем не менее конструкция 1ех-А*В приобретает эту способность Срис. 8, эксп. 5,6). Этот результат говорит о том, что возможно процесс олигомеризации затвора А стабилизируется дополнительными контактами, возникающими между затвором В и СТА. что косвенно указывает на возможность существования таких взаимодействий в интактноп HSF. Тем не менее нельзя не учитывать возможности существования В - В взаимодействий, хотя нами было показано. что 1ех-А+Б не образует контактов с Б-СТА CBarlev & . Jakobsen неопублик. ).

4. Гептапептид СЕ2 участвует в репрессии СКА и возвращении его в неактивное состояние после теплового шока. •

Кроме тримеризационного района, важную роль в регуляции активности H3F играет гептапептид СЕ2. расположенный в W-конце. Чтобы исследовать функции, выполняемые этим доменом, в процессе регуляции активности, мы ввели несколько то-

fi-galactosidase activity

p-galactosidase activity

Рис. 9 Точечные мутации в СЕ2 влияют на транскрипционную активность при длительном СЬ>, но не при кратковременном тепловом шоке Са). Наверху каждого графика однобуквеннып кодом показана аминокислотная последовательность. СЕ2. Аминокислотные зелены подчеркнуты. Кратковременный тепловой шок обычно проводили при 40"С в течение 40 минут.

чечных мутаций в этот район. Замена отатка аспарагина Asp-456 или аргинина Arg-457 на аланин С Ala) не имела значительного эффекта на регуляцию активности H3F. Замена же лейцинов С Leu 453, 454) в аланин приводила к дерегуляции HSF при температуре 30"С. Однако наиболее интересными оказались замены Arg-451 и Lys-455 на Ala. которые вели к частичной дерегуляции HSF. Полученные мутанты были подвергнуты кратковременному или продолжительному повышению температуры. Мутации Arg 451 или Lys 455 не ведут к дерегуляции HSF и профили активности при кратковременном тепловом шоке примерно повторяют таковые для дикого типа (рис. 9а). Нутация Leu 453 имеет более ощутимый эффект, т. к. уровень базальной активности выше, чем у дикого типа (рис. 9а). Тем не менее этот мутант сохраняет способность активировать транскрипцию при КТШ, однако длительная инкубация при повышенной температуре ведет к полной дерегуляции С рис. 9t>). Таким образом, СЕ2 контролирует скорее ответ на долговременное повышение температуры. нежели на кратковременный тепловой шок. Другой вывод. который был сделан нами на основе анализа точечных мутаций СЕ2. состоит е том. что СЕ2. вероятно, участвует в регуляции активности, не зависящей от ТШ, или. что более вероятно. в инактивации HSF.

5. 'Госфорилирование серинов. прилегающих r. СЕ2. ускоряет переход HSF б неактивное состояние. Для того. чтобы выяснить роль примыкающих к СЕ2 сериновых аминокислот, которые, как было показано ранее, фосфорилируются б процессе ТШ (Sorger. 1991), ни совместили мутацию Arg 451 с мутацией серинов С рис. 10). Замена серинов на Ala (рис. 9с) вызывала сильную дерегуляци», если клетки культивировались долгое время при высокой температуре, но не отменяла активацию в ответ на Till. Их нутации в остатки аспарагиновой кислоты нейтрализовали эффект Arg 451 мутации, восстанавливая нормальную (рис. 10d. 10а, 10Ь) регуляцию. Эти результаты говорят о том, что внесение отрицательного заряда остатками фосфорной кислоты при ФосФорилировании серинов. прилежащих к се2, может ускорять переход H3F из активного в пассивное состояние, -^сфорилирование. по всей видимости, не связано с активацией ответа на ТШ.

ЗФФект фосфорилирования KSF при ТШ также наблюдается в экспериментах по гель-ретардации. H3F, выделенный из клеток, после ТШ движется в нативном геле медленнее по сравнению с контрольным HSF из клеток. инкубированных при нормальной

a b

Growth temperatura before heat shock Growth temperature before host sh

С

ALLLKHRAM-A A A A A AH ffl,, . s,

. fa-nwth-LamDcrature before heat shock

Рис. 10 Фосфорилирование cepHHOBtax аминокислот, прилегающих к СЕ2. при тепловой шоке контролирует уровень деактивации HSГ у Ca) H5F дикого типа. СЬ) с мутацией Arg 451 в fila Ce) с мутацией Arg 451 в Ala и Ser 458+460-465 в Ala. Cd) HSF с мутацией Arg 451 в Ala и Ser 458+460-465 в Asp.

температуре. Обработка клеточноых экстрактов после ТШ ФосФатазой элиминирует это различие. Это изменение подвижности также между контролем и ТШ НЭГ исчезает при мутации прилегающих к СЕ2 серинов в аспарагиновые или аланиновые остатки аминокислот, хотя НБР с мутациями Э в 0 движется гораздо медленнее, чем при Э в А НЭК. Однако обе конструкции (мутации Э в Р и Б в А) теряют способность реагировать изменением подвижности на обработку ФосФатазой. Термоиндуцированное фосфорилирование серинов прилегающих к СЕ2 способствует возвращению НБЕ в неактивное состояние. Для выяснения роли СЕ2 в конформационных изменениях, которые претерпевает молекула НЭГ при ТШ. мы провели эксперимент по гель-ретардации НЗР с делеиией СЕ2. Контрольный и ТШ образцы НБЕ с1е1СЕ2 обладали одинаковой подвижностью. Однако после обработки ФосФатазой появлялось четкое различие в подвижности НБЕ <1е1СЕ2 до и после ТШ по сравнению с необработанными ФосФатазой образцами. Мы оь-ьясняем это тем. что. по-видимому, в НЭР с1е1СЕ2 се-рины подвержены конститутивному фосфорилировэнию. которое вряд ли является результатом термоактиваиии киназы при ТШ. Напротив, СЕ2 в нормальных условиях участвует в образовании-конформаии. защищающей серины от ФосФорилирования. которое, в свою очередь, необходимо для возвращения С-концевого активатора в неактивное состояние.

Каким образом СЕ2 обеспечивает деактивацию НБР после ТШ с помощью ФосФорилирования прилегающих к этому домену серинов? В предлагаемой модели С рис. 11), активатор "замаскирован" Ы-концевыии структурами, которые взаимодействуют с СЕ2. В результате ТШ происходят конформационные изменения в Ы-коние НЭЕ, которые разрушают связь с СЕ2 и приводят к освобождению активатора. В результате этих событий серины. прилегающие к СЕ2. становятся доступными для фосфорилирова-.-ния, что, в свою очередь. ведет к восстановлению связей И-кониа с СЕ2 и возвращению НБГ в исходное состояние.

Каким образом фосфорилирование влияет на "реФолдинг-НЭЕ? Вполне вероятно, что возникающая в процессе фосффорили-рования конформация гидрофобного "кора" СЕ2 становится мишенью действия БТШ. Действуя как шаперон. БТШ через белок-белковое взаимодействии способствует возвращению Н5Р в исходную конформацию. Показано, что гены Нзр 70 сегеу¿ае и человека участвует в механизме саморегуляции по принципу обратной связи. Темой будущих исследований является анализ механизмов возможного взаимодействия СЕ2 с БТШ.

- о?

Рис.11 Нодель активации и деактивации НЗР. " а.1 Линейная структура функциональных доменов НЗР; СЬ) КонФоРмация НЗК при нормальной температуре (двойная линия обозначает ДНК г НЗЕ сайтами); (с) Изменение конформации НЗР при тепловом стрессе (кружочки с Р04 обозначают фосфатные остатки при фосфорилировании серинов, стрелки показывают мишени фосфори-лирования. а также механизм перехода НЗР в неактивное состояние).

выводы

1. В С-концах белков HSF из дрожжей К. lactis и .5. cerev is iae локализованы аминокислотные последовательности обладающие высоким потенциалом активации транскрипции, которая репрессировуется при нормальных условиях, но проявляется при тепловом шоке.

2. Показано, что в зависимости от продолжительности теплового шока. регуляция активности HSF может осуществляться по двум механизмам: при кратковременном теплоЕоп шоке активация транскрипции осуществляется в основном за счет N-концевого "слабого" активатора, при более длительном тепловом стрессе реализуется другой механизм. затрагивающий С-хонцевой активатор.

3. Транскрипционый потенциал обоих активаторов репрессируется в нормальных условиях небольшим дистальным участком тримеризационного домена. образующим альфа-спиральную структуру, известную как "лейциновый затвор".

4. Короткий гептапептид СЕ2 (см. рис 1). располагающийся между N- и С-концами молекулы HSF. участвует в репрессии С-хонцевого активатора при нормальных условиях, а также способствует возвращению С-кониевого активатора в репрессированное состояние после теплового шока за счет фосфорилирова-ния прилегающих к СЕ2 сериновых остатков.

5. Фосфорилирование сериновых аминокислотных остатков прилегающих к СЕ2 не связано с активацией HSF при ТШ. как считалось ранее, но. наоборот. служит (возможно. за счет привлечения Hsp 70) для возвращения HSF в неактивное состояние.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Chen V.. Barlev N. А. . Uestergaard О. and Jakobsen В.К. "Identification of the C-terminal activator domain in yeast heat shock factor: independent control of transient and sustained transcriptional activity" - EMBO Journal. 1993. v.12. n.13. pp 5007-50018.

2. Barlev N. A. & Jakobsen В. K. "Phosphorllation of a short conserved element in yeast HSF mediates conversion of HSF to the inactive state after heat shock activation" -ilol. and Cell. Biology. 1994 (in press).