Зависимость термотолерантности дрожжей от типа энергетического метаболизма

Раченко, Елена Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Зависимость термотолерантности дрожжей от типа энергетического метаболизма
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Зависимость термотолерантности дрожжей от типа энергетического метаболизма"

На правах рукописи

Раченко Елена Ивановна

ЗАВИСИМОСТЬ ТЕРМОТОЛЕРАНТНОСТИ ДРОЖЖЕЙ ОТ ТИПА ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА

03.00.12 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2003

Работа выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор В.К. Войииков; кандидат биологических наук, Е.Г.Рихванов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ю.М. Константинов,

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск

кандидат биологических наук В. И. Чемерилова, Иркутский Государственный Университет (ИГУ),-г. Иркутск

Ведущая организация:

Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск

Защита диссертации состоится "5" ноября 2003 г. в 10 ч на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 1243. Факс (3952) 510754; E-mail: matmod@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.

Автореферат разослан 2003 г.

Ученый секретарь

Г.П. Акимова

2.СОЗ- А_

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Митохондрии являются основным источником энергии для эукариотических организмов в обычных условиях и приобретают особое значение для жизнеспособности клетки в стрессовых условиях, в частности при тепловом шоке. К настоящему времени в литературе имеются лишь косвенные данные, позволяющие предполагать связь между функциональной активностью митохондрий и гермотолерантностью клетки. Известно, что во время теплового шока наблюдается снижение уровня АТФ в клетке (Mallouk et al., 1999; Kabakov et al., 2002), а обработка ингибиторами дыхания вызывает индукцию тех же стрессовых генов, что и тепловой шок (Ashbumer, Bonner, 1979). Кроме того, показано, что тепловой шок сопровождается генерацией активных форм кислорода (АФК), основным источником которых являются митохондрии (Sugiyama et al., 2000; Davidson, Schiestl, 2001).

Удобными объектами для изучения механизмов термотолерантности являются дрожжи, сочетающие в себе все преимущества прокариот и признаки эукариот. Все известные виды дрожжей могут использовать глюкозу в качестве источника углерода и энергии. Saccharomyces cerevisiae и родственные им дрожжи утилизируют глюкозу преимущественно за счет ферментации ее до этилового спирта. Другая группа дрожжей, к которой относятся виды Debaryomyces vanrijiae и Rhodotorula rubra получает энергию, утилизируя глюкозу и другие сахара исключительно за счет окислительного фосфорилирования, и строение их митохондрий сходно с таковым у высших растений. Кроме того, у дрожжей S. cerevisiae возможно получение мутантов по генам, кодирующим компоненты дыхательной цепи митохондрий (petite-мутанты).

Учитывая важность функционирования митохондрий в стрессовых условиях и недостаточную изученность этой проблемы, представляет особый интерес, используя дрожжи с разными типами энергетического метаболизма, исследовать роль митохондрий в термотолерантности клетки.

Цель и зздачи исследования. Цель настоящей работы состояла в оценке термотолерантности дрожжей, различающихся по типу энергетического метаболизма и организации дыхательной цепи.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Определить температурные параметры роста разных видов дрожжей и выяснить: существ ует ли зависимость между способностью дрожжевой клетки расти при повышенной температуре и способностью переживать кратковременное воздействие летального теплового шока.

2. Выяснить зависимость индукции синтеза белка теплового шока Hspl04 и термотолерантности дрожжей S. cerevisiae от функционирования митохондрий в клетке.

3. Изучить изменение интенсивности дыхания дрожжевой клетки S. cerevisiae при повышении температуры.

4. Сравнить действие ингибиторов еаестродИфМШЫДОФй цепи (ЭТЦ) митоходрий на интенсивность flbixai ия иБ*№йЖ$$К^ерм(]толерантность

3ОЭ МЦшЩ [

дрожжей S. cerevisiae, Candida albicans, R. rubra, D. vanrijiae, различающихся по типу энергетического метаболизма.

5. Изучить действие азида натрия на индукцию синтеза Hspl04 и на развитие индуцированной термотолерантности дрожжей S. cerevisiae.

Научная новизна. Установлено, что способность дрожжей жить при экстремальных температурах (термоустойчивость) и их способность переносить летальное действие кратковременного теплового шока (термотолерантность) обусловливаются различными процессами.

Получены доказательства того, что функционирование митохондрий может иметь для термотолерантности дрожжевой клетки как положительное, так и отрицательное значение. С одной стороны, митохондрии - это важнейший источник энергии и нарушение их функционирования приводит к снижению термотолерантности дрожжевой клетки, получающей энергию только за счет окислительного фосфорилирования. С другой стороны, митохондрии - источник токсичных для клетки активных форм кислорода (АФК), генерация которых во время теплового шока значительно возрастает.

Выяснено, что механизмы индуцированной и базовой термотолерантности в дрожжевой клетке существенно различаются, и что индукция ответа клетки на тепловой шок зависит от функционирования митохондрий.

Теоретическая и практическая значимость работы. Получены новые результаты о механизмах, регулирующих ответ клеток дрожжей на действие высокой температуры, и о роли митохондрий в этих процессах. Поскольку способность к ферментации глюкозы является систематическим признаком, и показано, что эта способность связана с особенностями строения дыхательного аппарата дрожжевой клетки, данные, полученные в работе, имеют значение для решения ряда вопросов систематики дрожжей. Кроме того, полученные результаты имеют практическое значение и могут служить основой для создания методов консервации различных продуктов, подверженных загрязнению микроорганизмами.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 9 работ. Результаты исследований были доложены и обсуждены на IV съезде физиологов растений (Москва, 1999), Международном симпозиуме «Plant under Enviromental Stress» (Москва, 2001, октябрь, 23-28), Международном конгрессе «Meeting on Signal Transduction» (Брюссель, 2003, июль 3-8), на региональной конференции «Сохранение биологического разнообразия геотермальных рефугиев Байкальской Сибири» (Иркутск, 1999).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 163 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методической и экспериментальной частей, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа включает 30 рисунков. Список литературы состоит из 248 источников, в том числе 229 зарубежных авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовались лабораторные и природные виды дрожжей. S. cerevisiae: штаммы W303-1B, Y-74-D694 и изогенный ему hspl04 мутант. С. albicans: штамм CAI4 и изогенный ему мутант по альтернативной оксидазе W324. D. vanrijiae: штамм ГК46-2 и R. rubra: штамм Дз40-1, выделенные из горячих источников Прибайкалья (Бурятия). Мутанты дыхательной недостаточности (petile-мутанты) получали в результате обработки дрожжевых клеток бромидом этидия (Slonimsky, 1968).

Дрожжи выращивали на средах YEPD (глюкоза), YEPGal (галактоза), YEPE (этиловый спирт) (Рихванов и др., 2001; 2002). Для изучения влияния тиамина на температурные параметры роста дрожжей использовали минимальную среду (Рихванов и др., 2003). Для приготовления твердых сред добавляли в указанные выше среды агар-агар (15 г/л). В ходе экспериментов дрожжи поддерживали на среде YEPD при 30°С.

Рост при различных температурах инкубирования (30, 38 и 41°С в течение 48 часов) и выживаемость после теплового шока определяли, используя дрожжи в логарифмической фазе роста. Выживаемость после теплового шока изучали, экспонируя пробирки с 1 мл дрожжевой суспензии в разных условиях температурной обработки. Для изучения действия ингибиторов на термотолерантность дрожжей в пробирки вносили NaN3 и NaCN в концентрации 0,15 и 1 мМ, соответственно. После теплового шока суспензию клеток охлаждали, соответствующим образом разводили и высевали на твердую среду YEPD. Количество образовавшихся колоний учитывали спустя 24-48 часов инкубации при 30°С. Выживаемость дрожжей определяли как процент образовавшихся колоний после определенного периода теплового воздействия к количеству колоний до теплового шока.

Для определения скорости дыхания дрожжей использовали полярографический метод. Для определения скорости дыхания в присутствии ингибиторов азид натрия добавляли в ячейку в конечной концентрации 0,15 мМ, цианид натрия - 1 мМ, бензгидроксамовую кислоту (БГК) - 2 мМ. Скорости дыхания дрожжей выражали в наномолях поглощенного кислорода в минуту на 107 или 108 клеток (D. vanrijiae), учитывая растворимость кислорода в воде при различных температурах.

Каталазную активность определяли полярографически, измеряя скорость образования 02 при разложении Н202 каталазой (Dat et al., 1998).

Суммарный водорастворимый белок выделяли из дрожжевых клеток, выращенных при 30°С до логарифмической фазы роста, прошедших температурную обработку в присутствии или отсутствии 0,15 мМ азида натрия. Концентрацию белков определяли по методу Lowiy (1957). Электрофорез белков проводили в блоках полиакриламидного геля в модифицированной системе Laemmly (1970). Для выявления полипептидов, иммунохимически родственных Hspl04, использовали соответствующие первичные антитела, предоставленных доктором S. Lindquist (Чикагский университет, США).

Все опыты проводили в трехкратной серии биологических повторностей. Полученные данные обработаны статистически: рассчитывали

средние арифметические значения и ошибки средних.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Температурные параметры роста дрожжей и их толерантность к тепловому шоку

На первоначальном этапе работы было проведено сравнение способности к росту трех видов дрожжей: К rubra, S. cerevisiae и D. vanrijiae при различных температурах инкубации, а также их выживаемости после действия летального теплового шока. Все изученные виды дрожжей имели хороший рост после 48 часов инкубации на среде YEPD при 30°С (рис. 1а). Повышение температуры до 41°С не оказало существенного влияния на рост D. vanrijiae (рис. 1а, ряд 2). Напротив, рост S. cerevisiae значительно снижался при 38°С (рис. 1а, ряд 3) и дальнейшее повышение температуры приводило к полному его прекращению. В отличие от остальных дрожжей рост R. rubra полностью подавлялся уже при 38°С (рис. 1а, ряд 1). Таким образом, из трех исследуемых нами видов дрожжи R. rubra имели самую низкую максимальную температуру роста.

При изучении толерантности исследуемых видов дрожжей к кратковременному летальному действию теплового шока, было обнаружено, что наиболее термотолерантными оказались дрожжи R. rubra (рис. 16, кривая 1). После 60 мин теплового воздействия более 70% клеток сохраняли способность образовывать колонии. В то время как в случае S. cerevisiae и D. vanrijiae только 3,4% и 1,4% клеток, соответственно, оставались жизнеспособными (рис. 16, кривые 3 и 2). Таким образом, дрожжи R. rubra, имеющие самую низкую максимальную температуру роста, оказались в данных условиях гораздо более способными выдерживать летальное действие теплового шока.

100

15 30 45 Время, мин

б)

Рис. 1. Термоустойчивость (а) и термотолерантность (б) дрожжей R. rubra (1), D. vanrijiae (2) и S. cerevisiae (3). Дрожжи либо инкубировали при 30, 38 и 41°С в течение 48 часов (а), либо подвергали действию теплового шока при 45"С (б). Различия достоверны при р>0,95

Сравнение динамики скорости роста изучаемых дрожжей на жидкой среде YEPD при 30°С показало, что с наименьшей скоростью росли дрожжи R. rubra, время генерации в логарифмической фазе составило 2,2 часа (рис. 2, кривая 1). Наибольшей скоростью роста характеризовались D. vanrijiae, время генерации - 1,5 часа (рис. 2, кривая 2). A S. cerevisiae занимали промежуточную позицию, время генерации - 1,86 часа (рис. 2, кривая 3).

Рис. 2. Динамика роста R. rubra (1), D. vanrijiae (2), S. cerevisiae (3) на жидкой среде YEPD при 3(fC. OD - оптическая плотность суспензии при длине волны 600 нм. Различия достоверны при р>0,95

8 10

Время, часы

Причем, после 8 часов культивирования наблюдалось (рис. 2, кривая 3) временное прекращение деления S. cerevisiae (диауксотрофный переход), связанное с исчерпанием глюкозы и адаптацией клеток к накопившемуся в среде инкубации этиловому спирту, что также коррелирует с резким повышением термотолерантности (Thevelein and Winde, 1999).

Таким образом, способность клетки противостоять действию летальных температур, вероятно, зависит от скорости роста до теплового воздействия. Дополнительно этот вывод был подтвержден после изучения влияния тиамина на рост и термотолерантность дрожжей D. vanrijiae. Несмотря на то, что тиамин повышал способность D. vanrijiae расти при повышенных температурах, протекторный эффект тиамина на способность дрожжей выдерживать летальный тепловой шок не был обнаружен (Рихванов и др., 2003).

2. Зависимость термо толерантности от функционирования митохондрий в дрожжевой клетке

Изучение механизмов термоюлерантности дрожжей S cerevisiae позволило установить, что одним из ключевых факторов выживания дрожжевой клетки в условиях жесткого теплового шока 50°С является индукция синтеза белка с молекулярной массой 104 кД (Sanchez et al., 1992). Иммунохимический анализ выявил незначительный конститутивный синтез HspI04 в клетках родительского штамма при 30°С. Количество Hspl04, значительно возрастало в клетках родительского штамма, если дрожжи, выращенные при 30°С, инкубировали в течение 30 минут при 37°С (рис. 5).

В следующих экспериментах было проведено сравнение выживаемости родительского штамма и hspl04 мутанта при разных условиях температурной обработки. Как видно из рис. 3, родительский тип (кривая 3)

был гораздо устойчивее Ыр104 мутанта (кривая 4), когда дрожжи, выращенные при 30°С, были сразу подвергнуты действию теплового шока 45°С.

Рис. 3. Индуцированная (1, 2) и базовая (3, 4) термотолерантность 5. сегеу\х\ае (¥-74-0694) (1, 3) и изогенного ему к.чр 104 мутанта (2, 4) на среде с глюкозой при 45°С. Различия достоверны при р>0,95

Предварительная обработка дрожжей в течение 30 мин при 37°С приводила к развитию индуцированной термотолерантности (рис. 3). И в этом случае, после 120 мин действия температуры 45°С количество выживших клеток родительского штамма (кривая 1) было значительно больше, чем клеток hspl04 мутанта (кривая 2).

Полученные результаты подтвердили выводы других исследователей (Sanchez, Lindquist, 1990; Sanchez et al., 1992) о связи индуцированной термотолерантности дрожжевой клетки с индукцией синтеза HspI04 и показали важность этого белка и для базовой термотолерантности. При этом было установлено, что защитная роль Hspl04 проявляется не только при температуре теплового шока 50°С, как это описано раннее (Sanchez, Lindquist, 1990), но и при более умеренном тепловом воздействии -- 45°С.

Рис. 4. Базовая

термотолерантность S.

cerevisiae (4/-74-D694) (1, 3) и изогенного ему hsp 104 мутанта (2, 4) при росте на среде с глюкозой (3, 4) и с галактозой(1, 2) при 4 5° С. Различия достоверны при р>0,95

Время, мин

Далее мы сравнили действие теплового шока на выживаемость родительского штамма 4/-74-D694 и hspl04 мутанта в зависимости от источника углерода в среде культивирования. Использование в качестве источника углерода в среде слабосбраживаемого сахара галактозы позволяло

Время, мин

клеткам обоих штаммов эффективнее переживать тепловой шок 45°С, чем на среде с глюкозой. Несмотря на разницу в выживаемости между родительским типом и кър104 мутантом, термотолерантность обоих штаммов была выше в условиях активного дыхательного метаболизма (рис. 4). Следовательно, термотолерантность дрожжевых клеток, получающих энергию в процессе роста преимущественно за счет дыхания, значительно выше термотолерантности клеток, энергетические потребности которых в основном покрываются за счет ферментации глюкозы.

Проведенный сравнительный иммуноблоттинг с антителами на Няр104 выявил различия в конститутивном синтезе НхрЮ4 у дрожжей, выращенных на разных источниках углерода. Как видно из рис. 5а, при росте на среде с галактозой при 26°С и при 30°С уровень конститутивного синтеза Яхр104 выше, чем на среде с глюкозой при тех же температурных условиях. В то же время повышение температуры до 37°С индуцировало синтез Шр104 в клетках дрожжей, выращенных на среде с глюкозой и галактозой, на одинаковом уровне. Таким образом, более высокий конститутивный синтез 1Ьр104 в клетках дрожжей, растущих на галактозе, может быть одной из причин более высокой термотолерантности клеток дрожжей с дыхательным типом метаболизма по сравнению с клетками с бродильным типом метаболизма.

26°С 30°С 37°С 26"С 30°С 37°С а)

ГЛЮКОЗА ГАЛАКТОЗА

26°С 39°С 26°С 39°С б)

petite-мутант родительский тип

Рис. 5. Индукция синтеза Hspl04 в клетках S. cerevtsiae (x¥-74-D694) при росте на разных источниках углерода (а) и в клетках petite-мутанта (б).

Чтобы подтвердить зависимость синтеза HsplQ4 от функционирования митохондрий в дрожжевой клетке, был проведен иммуноблоттинг с антителами на Hspl04 белка, выделенного из клеток дрожжей S. cerevisae родительского типа и petite-мутанта (рис. 56). Hspl04 конститутивно синтезировался в клетках исследуемых штаммов дрожжей, выращенных при 26°С, на одном уровне. Отсутствие различий в конститутивном уровне мРНК гена HSP104 между родительским штаммом и petite- мутантом было описано и другими исследователями (Traven et al., 2001).

Тепловой шок 39°С индуцировал синтез Нзр104 в клетках обоих штаммов дрожжей. Но у мутанта дыхательной недостаточности эта индукция была менее выражена, чем у родительского штамма (рис. 5), что можно связать с отсутствием в клетках этого штамма функционирующих митохондрий. Таким образом, уровень Нзр104 в клетке меняется в зависимости от активности митохондрий в дрожжевой клетке. Исходя из этого, можно предположить, что митохондрии регулируют реакцию клетки на тепловое воздействие, изменяя экспрессию стрессовых генов.

Чтобы выяснить, как изменяется термотолерангность дрожжей при нарушении митохондриальных функций, было проведено сравнение выживаемости после теплового шока 45°С и 50°С реШе-мутантов, полученных от штамма 4^-74-0694 и ЫрЮ4 мутанта, и выживаемости исходных штаммов в тех же температурных условиях. Проведенные эксперименты показали, что ре1йе-мутанты были более устойчивы к действию теплового шока 45°С (рис. 6а), чем дыхательно-компетентные аналоги.

О 15 30 45 60 мин

а)

Рис. 6. Базовая

термотолерантность S.

cerevisiae xF-74-D694 (РТ) и hspl04 мутанта (hspl04) и полученных от них petite-мутантов (РТ petite и hspl04 petite) при 45°С (а) и при 5(fC (б).

РТ РТ petite kspl04 hspl04 petite

8 мин

б)

При повышении температуры до 50°С (рис. 66) выживаемость реШе-мутанта после 2 мин действия теплового шока достоверно превышала соответствующие значения родительского типа. В течение последующего времени наблюдалось резкое снижение количества выживших клеток реШе-мутанта, и после 8 минут теплового шока выживаемость родительского типа была выше, чем реШе-мутанта. Вероятно причины повреждения клетки при разной степени жесткости температурного воздействия - 45 и 50°С существенно различаются.

При сравнении термотолерантности рей1е-мутантов между собой обнаружено, что выживаемость кар] 04 мутанта с дефектным дыханием после теплового шока 45°С и 50°С была существенно ниже, чем выживаемость реШе-мутанта, полученного от родительского штамма (рис. 6). Это значит, что Няр104 выполняет свои защитные функции и в клетках, дыхание в которых отсутствует.

Полученные результаты позволяют выдвинуть предположение о неоднозначной роли митохондрий в термотолерантности дрожжевой клетки. Известно, что тепловой шок сопровождается окислительным стрессом, который обусловлен усилением генерации активных форм кислорода в клетке. Основным источником АФК являются митохондрии, и с этой точки зрения отсутствие митохондриальной активности при определенных условиях может быть благоприятно для клетки.

3. Изменение интенсивности дыхания дрожжей при повышении температуры. Роль каталазы в термоч олерантности дрожжевой клетки

Наблюдаемые различия в термотолерантности родительского штамма при 45°С и 50°С, можно объяснить разным уровнем дыхательной активности при этих температурах. При температуре 30°С скорость поглощения кислорода клетками штамма £ cerevisae №303-1В в полярографической ячейке практически не менялась в течение 10 мин эксперимента (рис. 7, кривая а). Повышение температуры до 45°С приводило более чем к двукратному усилению поглощения кислорода. С течением времени эксперимента скорость поглощения кислорода несколько снижалась, но и после 10 минут при 45°С достоверно превышала контрольный уровень (рис. 7, кривая б). Повышение температуры до 50°С приводило к аналогичному усилению поглощения кислорода, однако уже после 3 мин интенсивность дыхания не превосходила контрольный уровень, а после 5 мин снижалась значительно (рис. 7, кривая в).

0 ' ' '-•

123456789 10 Время, мин

Можно предположить, что повышение скорости поглощения кислорода при температуре 45°С связано с усилением генерации АФК, что может быть одной из основных причин гибели клетки при этой температуре (рис. 7, кривая б). Поэтому при этих условиях теплового шока ре1йе-мутант, у которого дыхание отсутствует в принципе, оказывается в более выигрышном положении, чем родительский штамм (рис. 6). Однако при 50°С скорость поглощения кислорода штаммом дикого типа быстро падает ниже контрольного уровня и, следовательно, при этой температуре гибель

40 1

Рис. 7. Скорость поглощения кислорода 5. еегеушяе (Ш303-1В) в полярографической ячейке при 30°С (а), 45°С (б), 50"С (в). Различия достоверны при р>0,95

обусловливается уже другими причинами, например непосредственным термическим нарушением лабильных клеточных структур, и petite-мутант в этих условиях оказывается более уязвим, чем дикий тип (рис. 6).

Поскольку тепловой шок сопровождается окислительным стрессом, немаловажную роль в устойчивости клетки к повышенной температуре играют антиокислительные ферменты - супероксиддисмутаза, катал аза и пероксидаза (Davidson et al, 1996). Чтобы объяснить, почему с одной стороны, нарушение дыхания приводит к повышению выживаемости после действия теплового шока, а с другой стороны, активно дышащие дрожжи на среде с несбраживаемым источником углерода гораздо более термотолерантны, чем на среде с глюкозой, был измерен уровень каталазной активности.

Рис. 8. Уровень каталазной активности в клетках дикого типа (\Y303-1B) (а, б) и дыхательного мутанта (в) Б. сегечЫае при росте на среде с глюкозой (а, в) и на среде со спиртом (б).

Каталазная активность у штамма 1¥303-1В, выращенного на среде со спиртом, в несколько раз превышает соответствующий уровень на среде с глюкозой (рис. 8). Поэтому высокую термотолерантность дрожжей, растущих на несбраживаемом источнике углерода, вероятно можно объяснить повышенным уровнем активности антиокислительных ферментов, к которым относится и катал аза. Самый низкий уровень каталазной активности наблюдался у реМе-мутанта (рис. 8). Возможно, цитоплазматическая мутация дыхательной недостаточности создает такие условия в клетке, при которых значительно снижается скорость образования АФК при тепловом шоке, поэтому уровень активности каталазы не имеет значения.

Из приведенных результатов следует, что повышение температуры приводит к резкому возрастанию дыхательной активности, что, вероятно, связано с повышением энергозатрат клетки при стрессе. Возможной причиной снижения термотолерантности 5. cerevisiae при росте на среде с глюкозой можно считать нарушение баланса между способностью генерировать АФК и способностью им противостоять. Напротив, дрожжи, культивируемые на неферментируемом источнике углерода, характеризуются большим уровнем активности антиоксидатных ферментов, что позволяет

дрожжевой клетке быть более подготовленной к окислительному стрессу, сопровождающему тепловой шок. При этих условиях важную роль в защите дрожжевой клетки от окислительного стресса, вероятно, играет и Hspl04, синтез которого повышается в дрожжевой клетке не только в ответ на тепловой шок, но и на действие перекиси водорода (Godon et al., 1998).

4. Действие ингибиторов электрон-транспортной цепи митохондрий на дыхательную активность дрожжей

Данные, касающиеся роли митохондрий в термотолерантности дрожжей S. cerevisiae, описанные в настоящей работе и полученные другими исследователями, достаточно противоречивы. С одной стороны, активно дышащие дрожжевые клетки S. cerevisiae более устойчивы к действию высокой температуры, чем клетки с преобладанием бродильного метаболизма. С другой стороны, отсутствие функциональных митохондрий в клетках petite-мутанта и анаэробно выращенных дрожжей (Davidson et al., 1996) благоприятно сказывается на их термотолерантности. Вероятнее всего, что причиной этих противоречий является наличие альтернативного пути получения энергии у S. cerevisiae - процесса брожения.

Для подтверждения этого предположения была изучена реакция на тепловой шок дрожжей с разными типами энергетического метаболизма в присутствии ингибиторов дыхания азида натрия и цианида натрия. Кроме S. cerevisiae, для дальнейших исследований были выбраны еще три вида дрожжей: R. rubra, D. vanrijiae, С. albicans. Критериями этого отбора послужили имеющиеся систематические данные о способности этих видов дрожжей сбраживать глюкозу. Известно, что D. vanrijiae и все представители рода Rodothorula не сбраживают глюкозу ни при каких условиях. Дрожжи вида С. albicans эффективно ферментируют глюкозу при снижении концентрации кислорода, поэтому названы кислород-чувствительными или Крэбтри-негативными. Дрожжи вида S. cerevisiae глюкозу сбраживают и в анаэробных, и в аэробных условиях культивирования (Kurtzman, Fell, 1998).

Рис. 9. Действие азида натрия, цианида натрия и бензгидроксамовой кислоты (БГК) на дыхательную активность О. \amrijiae (а) и 5. cerevisiae (б) Различия достоверны прир>0,95.

При изучении действия ингибиторов на дыхательную активность

+БГК

(б)

дрожжей было выяснено, что исследованные виды, помимо различий в способах получения энергии, имеют особенности в строении ЭТЦ митохондрий. Для дрожжей D. vanrijiae (рис. 9а), а также для R. rubra и С. albicans (Рихванов и др., 2002; 2003) показано наличие дыхания, нечувствительного к действию азида и цианида, но подавляемого бензгидроксамовой кислотой, что свидетельствует о функционировании в клетках дрожжей этих видов альтернативной оксидазы. Одной из предполагаемых функций альтернативной оксищазы является снижение степени восстановления компонентов дыхательной цепи, что не дает накапливаться электронам в ЭТЦ и тем самым предотвращает образование АФК (Меденцев и др., 1999). У дрожжей S. cerevisiae цианидрезистентный путь отсутствует (рис. 96; Joseph-Horn, 2001), что, вероятно, связано с наличием у них другого пути снижения уровня восстановления переносчиков ЭТЦ - брожения. Наши результаты подтверждают данные Veiga с соавт. (2001), о том, что у ферментирующих видов дрожжей отсутствует альтернативная оксидаза. Это представляет интерес не только для целей нашей работы, но и с точки зрения систематики дрожжей.

5. Действие ингибиторов дыхания на териотолерантность дрожжей

Чтобы оценить роль дыхания в развитии термотолерантности дрожжевой клетки, в следующих экспериментах была исследована выживаемость при непосредственном действии теплового шока в присутствии ингибиторов дыхания: азида натрия и цианида натрия. Полученные результаты позволяют утверждать, что действие ингибиторов на термотолерантность дрожжей зависит от способа получения клеткой энергии. Обработка ингибиторами цитохром оксидазного (рис. 10) и сукцинат дегидрогеназного комплексов (Рихванов и др., 2003) клеток дрожжей R. rubra и D. vanrijiae, получающих энергию только в процессе дыхания, приводила к усилению повреждающего действия теплового шока.

100 (а) £ ю

S 1 \

I 0,1 t * --JJ

л а 0,01

15 30 45 60 0 5 10 15

Время, мин Время, мин

Рис. 10. Базовая термотолерантность D. vanrijiae (а) при 45°С и R. rubra (б) при 50°С в присутствии азида натрия (2), цианида натрия (3) и без ингибиторов(1). Различия достоверны при р>0,95

Похожая картина наблюдалась, когда дрожжи S. cerevisiae и С. albicans (рис. 116, 126) выращивали на среде с галактозой и подвергали тепловому

Чк

шоку в присутствии азида натрия и цианида натрия. Напротив, если в клетках дрожжей S. cerevisiae и С. albicans (рис. 11а, 12а) преобладали процессы брожения при росте на среде с глюкозой, присутствие в среде инкубирования ингибиторов дыхания или никак не влияло на термотолерантность этих видов дрожжей, или в отдельных случаях повышало ее.

Время, мин Время, мин

Рис. 11. Базовая термотолерантность штамма дрожжей 8. сегеу 'тае Ч/74-0694 (1 и 2) и Ияр 104 мутанта (3 и 4) на среде с глюкозой (а) и галактозой (б) в присутствии азида натрия (2 и 4) и без ингибитора (1 и 3) при 45°С. Различия достоверны при р>0,95

Время, мин

Рис. 12 Базовая термотолерантность дрожжей С. albicans штамма СА14 (1 и 2) и мутанта по альтернативной оксидазе WH324 (3 и 4) на среде с глюкозой (а) и галактозой (б) в присутствии азида натрия (2 и 4) и без ингибитора (1 и 3) при 45°С. Различия достоверны при р>0,95

Обобщая результаты действия ингибиторов дыхания на термотолерантность дрожжей, можно заключить, что существует прямая зависимость между устойчивостью дрожжей к тепловому шоку и функционированием митохондрий при условии, если энергетические потребности клетки удовлетворяются в основном за счет окислительного

фосфорилирования. Подавление окислительного фосфорилирования такими ингибиторами, как азид и цианид, у дрожжей S. cerevisiae при росте на неферментируемых источниках углерода приводило к снижению содержания АТФ в клетке.

Наоборот, оба ингибитора не оказывали никакого влияния на концентрацию АТФ на среде с глюкозой (Machida, Tanaka, 1999). Восстановление повреждений, полученных при тепловом шоке, с помощью системы шаперонов является энергозатратным процессом (Parsell et al., 1993) и недостаточное содержание АТФ в клетке может усугубить повреждающее действие теплового шока (Nguyen et al., 1994). Следовательно, одной из возможных причин гибели дрожжей, неспособных ферментировать глюкозу, или дрожжей, растущих на слабо ферментируемых источниках углерода, является истощение АТФ при блокировании электрон-транспортной цепи митохондрий ингибиторами.

Известно, что образование АФК в клетке происходит главным образом в митохондриях. Эксперименты с использованием изолированных митохондрий показали, что азид и цианид, переводя компоненты электрон-транспортной цепи в более восстановленное состояние, способствуют увеличению образования АФК в митохондриях (Turrens, 1997). Усиление генерации токсичных для клетки АФК при тепловом шоке отмечено многими исследователями (Davidson et al., 1996; 2001; Sugiyama et al., 2000). Поэтому повышение концентрации АФК при действии ингибиторов может быть дополнительной причиной снижения термотолерантности дрожжей. В то же время, уровень генерации АФК в присутствии митохондриальных ингибиторов в дрожжевой клетке зависит от окислительного или бродильного метаболизма источника углерода (Cabiscol et al., 2000).

Индукция petite-мутантов у S. cerevisiae указывает на окислительное повреждение митохондриальной ДНК (Sugiyama et al., 2000). Поэтому, чтобы оценить степень действия ингибиторов на генерацию АФК при тепловом шоке в условиях дыхательного и бродильного метаболизма, сравнили индукцию petite-мутантов при 45°С в клетках S. cerevisiae при росте на среде с галактозой и на среде с глюкозой в присутствии 1 мМ цианида натрия (рис. 13). В результате экспериментов не было выявлено каких-либо различий в спонтанном уровне petite-мутации на изучаемых средах (рис. 13, 1 и 4). Число образовавшихся мутантов дыхательной недостаточности при тепловом шоке 45°С при росте дрожжей на глюкозе и галактозе также заметно не различалось (рис. 13, 2 и 5). Но внесение ингибитора значительно повышало индукцию petite-мутантов при тепловом шоке в клетках S. cerevisiae, растущих на галактозе (рис. 13, 6), но не на глюкозе (рис. 13, 3). Исходя из этого, можно заключить, что еще одной причиной снижения термотолерантности активно дышащей дрожжевой клетки в условиях блокирования электрон-транспортной цепи митохондрий ингибиторами является повышение уровня АФК.

Таким образом, индуцируемое митохондриальными ингибиторами снижение уровня АТФ и увеличение концентрации АФК повышает чувствительность к тепловому шоку, когда клетка получает энергию,

главным образом, за счет окислительного фосфорилирования. В клетках ферментирующих видов дрожжей активация процессов сбраживания глюкозы при тепловом шоке, на фоне ингибирования дыхания, может привести к снижению генерации АФК и компенсировать падение уровня АТФ за счет активации гликолиза, что объясняет протекторный эффект ингибитора на термотолерантность этих видов дрожжей. При этом вероятно, процессы брожения более эффективны для снижения токсического действия АФК, чем аналогичное действие альтернативной оксидазы, и поэтому являются предпочтительными для дрожжевой клетки, способной к ферментации глюкозы.

Рис. 13. Действие цианида натрия на индукцию реШе-мутантов Б. сегеу1з1ае при тепловом шоке (45°С). Различия достоверны при р>0,95

1 и 4 - спонтанный уровень реШе-мутантов при 30" С

2 и 5 - уровень реШе-мутантов при 45°С

3 и 6 - уровень реШе-мутантов при 45°С в присутствии 1 мМ цианида натрия

50 45 40 35 -30 25 20 -15 10 5 0

- 3

-рЗ"*» 4

г ,-

Глюкоза

Галактоза

6. Действие азида натрия на индуцированную термотолерантность дрожжей 5. сегегтае

Для изучения действия азида натрия на развитие индуцированной термотолерантности клетки инкубировали в присутствии ЫаЫ3 в течение 30 мин при 37°С, затем отмывали от ингибитора и подвергали действию теплового шока 45°С. В этих условиях процент выживших колоний как родительского штамма (рис. 14, линия 2), так и мутанта (рис. 14, линия 4) после действия ингибитора был существенно ниже, чем в контрольных вариантах (рис. 14, линии 1 и 3). Таким образом, азид натрия повышал базовую термотолерантность изучаемых штаммов дрожжей, но в то же время он ингибировал развитие индуцированной термотолерантности после предварительного мягкого теплового воздействия.

Достаточно близкие значения выживаемости у ¡юр 104 мутанта в контроле и у родительского штамма в присутствии ингибитора (рис. 14, линии 2 и 3) позволили предположить, что действие ингибитора может быть связано либо с блокированием синтеза Шр104 при тепловой обработке, либо с ингибированием его активности. Результаты электрофореза в ПААГ и иммуноблоттинга с антителами на Шр104 (рис. 15), показали, что при 30°С в клетках родительского штамма конститутивный уровень Няр104 достаточно высокий. Азид натрия не оказывал существенного влияния на синтез Нзр104

при 30°С. При повышении температуры до 37°С количество Н$р№4 в клетке значительно возрастало. Внесение азида натрия (0,15 мМ) в среду инкубирования приводило к частичному подавлению индукции синтеза Нзр104 при 37°С как на среде с глюкозой, так и на среде с галактозой (рис. 15).

Рис. 14. Индуцированная термотолерантность & сегечшае штамма 1Р- 74-В694 (1 и 2) и к$р104 мутанта (3 и 4)в присутствии азида натрия (2 и 4) и без него {1 и 3) при 45°С. Различия достоверны при р>0,95

Таким образом, снижение термотолерантности дрожжей в присутствии азида после предварительной тепловой обработки при 37°С можно объяснить частичной репрессией синтеза Hspl04. Но вряд ли это единственная причина, поскольку подавляющий эффект азида наблюдался и у мутанта (рис. 14). Развитие индуцированной термотолерантности дрожжей связано не только с синтезом Hspl04, но и с индукцией других белков теплового шока (Glover, Lindquist, 1998), а также каталазы (Wieser et al., 1991), ферментов биосинтеза глутатиона (Sugiyama et al., 2000). Известно, что индукция тепловым шоком экспрессии генов GSH1 and GSH2 S. cerevisiae, кодирующих ферменты биосинтеза глутатиона, не наблюдается, если клетки обработать другим митохондриальным ингибитором KCN (Sugiyama et al., 2000). Вероятно, азид натрия затрагивает эти или какие-то другие механизмы формирования защитной реакции.

Рис. 15. Индукция синтеза Hspl04 в клетках дрожжей S.

1 2 3 4 cerevisiae штамма T-74-D694, ' " • 1 -г выращенных на среде YEPD (1,2,3,4) и

YEPGal (5,6,7,8) и инкубированных в

,__ „.,.,,......... течение 30 минут в присутствии 0,15

мМ азида натрия (2,4,6,8) и без него

(1.3.5.7) при 3(fC (1,2,5,6) и 37°С

(3.4.7.8).

Анализ полученных результатов показал, что азид натрия по-разному действовал на базовую и индуцированную термотолерантность дрожжей & cerevisiae. Если ингибитор вносили непосредственно перед тепловым шоком, выживаемость дрожжей после действия высокой температуры значительно

Время, мин

повышалась. И этот эффект не связан с индукцией синтеза Нзр104, поскольку азид натрия таким же образом действовал и на Ыр104 мутант (рис. 11). Добавление азида натрия в среду инкубации во время мягкой тепловой предобработки снижало развитие индуцированной термотолерантности 5. сегеушае (рис. 14). Одной из причин этого снижения может быть частичное подавление индукции синтеза Шр104 (рис. 15). Исходя из этого, можно утверждать, что механизмы базовой и индуцированной термотолерантности в дрожжевой клетке существенно различаются.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведешшх экспериментов был сделан вывод, что способность дрожжевой клетки расти при высокой температуре (термоустойчивость) и ее способность переживать кратковременное воздействие летального теплового шока (термотолерантность) определяются хотя и сходными, но различными механизмами. Поэтому под термином термотолерантность следует понимать - способность организма переживать действие летального теплового шока, под термином термоустойчивость -способность к росту при температурах выше оптимальной. При этом термотолерантность дрожжей не зависит от их максимально возможной температуры роста, но, возможно, существует обратная зависимость термотолерантности от скорости роста дрожжей до теплового воздействия.

Одним из основных факторов, обеспечивающих базовую и индуцированную термотолерантность дрожжевой клетки, является белок теплового шока с мол. массой 104 кДа (Шр104). Активно дышащие дрожжевые клетки, в отличие от клеток с преобладанием процессов брожения, характеризуются более высокой термотолерантностью и более высоким уровнем конститутивного синтеза Няр 104. На основании этого можно утверждать, что митохондрии регулируют толерантность дрожжевой клетки к тепловому шоку. В пользу этого утверждения говорит тот факт, что индукция синтеза Нзр104 при тепловом шоке снижается в клетках реМе-мутанта и при обработке клеток ингибитором дыхания азида натрия. Рейе-мутанты были менее чувствительны к действию теплового шока (45°С), чем дыхательно-компетентные дрожжевые клетки, но термотолерантность рейе-мутантов, полученных от Ыр104 мутанта, была значительно ниже, чем у реШе-мутантов, полученных от родительского штамма. Это свидетельствует о том, что свои защитные функции Нзр104 выполняет и в клетках с нарушенной дыхательной активностью.

Различия в выживаемости родительского штамма 5. сегечтае и реШе-мутанта после теплового шока дают основания говорить о неоднозначной роли митохондрий в термотолерантности дрожжевой клетки. Одной из причин этих различий является повышение уровня АФК при тепловом шоке, основным источником которых в дрожжевой клетке являются митохондрии. Можно предполать, что усиление дыхательной активности при повышении температуры приводит к увеличению концентрации АФК в клетке. При этом активно дышащие клетки, имеющие высокий

конститутивный уровень синтеза не только белков теплового шока, но и антиоксидатных ферментов, гораздо лучше противостоят разрушительному действию окислительного стресса, сопровождающего тепловой шок. Но генерация АФК при разных температурах теплового шока, вероятно, различается. Об этом можно судить по результатам экспериментов, показавшим, что при 45°С уровень поглощения кислорода значительно превышает аналогичные значения при 30°С, а при 50°С - дыхательная активность очень быстро снижается. Вероятно, различия в скорости поглощения кислорода определяют концентрацию АФК в клетке: достаточно высокую при 45°С и минимальную при 50°С. По этой причине мутант дыхательной недостаточности был устойчивее родительского штамма при 45°С, поскольку при сравнительно низкой активности антиоксидатных ферментов, у реше-мутанта отсутствовал источник АФК. Напротив, при 50°С причины гибели вызваны, вероятно, денатурирующим действием высокой температуры и в этих условиях рс1ке-мутант был более уязвим, чем родительский штамм.

Немаловажным фактором нормального функционирования клетки в стрессовых условиях является уровень АТФ, поскольку восстановление поврежденных тепловым шоком клеточных структур - энергозатратный процесс. Дыхание является не единственным источником энергии для дрожжей 5. сел-етшаг. Дрожжи этого вида могут получать энергию в процессе гликолиза при сбраживании глюкозы до этилового спирта. Это, по нашему мнению, основная причина возникших в настоящей работе противоречий о роли митохондрий при тепловом шоке. С одной стороны - активно дышащие клетки более устойчивы к действию высокой температуры, чем клетки, сбраживающие глюкозу. С другой стороны - клетки, в которых по причине мутации отсутствует дыхание, лучше переживают тепловой шок, чем дыхательно-компегентные клетки. Чтобы разрешить эти противоречия, было проведено сравнение действия ингибиторов дыхания на термотолерантность дрожжей с разными типами энергетического метаболизма. Анализируя в целом результаты этих экспериментов, можно утверждать, что когда клетка использует преимущественно дыхательный путь получения энергии, внесение ингибиторов дыхания значительно усугубляет повреждающее действие теплового шока. В работе рассматриваются две основных причины подавляющего действия этих ингибиторов на термотолерантность дрожжей с дыхательным типом метаболизма. Первая - это перевосстановление компонентов дыхательной цепи, и, как следствие, повышение уровня АФК в клетке. И вторая — потеря единственного источника энергии, которая является основным фактором для восстановления структур клетки, поврежденных в результате действия температуры и оксидантов. В клетках с бродильным типом метаболизма переход дыхательной цепи в более восстановленное состояние активизирует процессы брожения и тем самым позволяет дрожжевой клетке, ферментирующей глюкозу, избежать увеличения производства вредных радикалов.

Другим механизмом, препятствующим накоплению электронов в дыхательной цепи митохондрий, является функционирование альтернативной

оксидазы, которая индуцируется в ответ на действие митохондриальных ингибиторов. Активизация альтернативного пути переноса электронов позволяет растительной клетке снижать производство АФК (Maxwell et al., 1999; Moller, 2001). Это при определенных условиях может быть справедливо и для дрожжевой клетки. Но, как показано на примере С. albicans, гликолитический путь в этом случае оказывается более эффективным.

Сравнение действия азида натрия на развитие базовой и индуцированной термотолерантности дрожжей S. cerevisiae позволяет утверждать, что эти процессы регулируются разными механизмами. Как было показано, наличие Hspl04 необходимо для лучшего переживания дрожжевой клеткой теплового шока как после предварительной тепловой обработки, так и без нее. Но действие азида натрия на выживаемость дрожжей при разных температурных условиях существенно различалось: базовая термотолерантность повышалась, индуцированная - снижалась. Причем одной из причин такого снижения можно считать частичное подавление индукции синтеза Hspl04.

ВЫВОДЫ

1. Способность дрожжей переносить летальное действие кратковременного теплового шока (термотолерантность) не зависит от их максимальной температуры роста (термоустойчивости) и, вероятно, определяется скоростью роста дрожжей до теплового воздействия.

2. Термотолерантность дрожжевой клетки зависит от типа ее энергетического метаболизма. Дрожжи, растущие в условиях активного дыхательного метаболизма, более устойчивы к действию высокой температуры, чем дрожжи, ферментирующие глюкозу, что объясняется высоким конститутивным синтезом белков теплового шока, в частности Hspl04, и антиоксидантных ферментов.

3. Повышение температуры приводит к возрастанию дыхательной активности, что, вероятно, связано с увеличением энергозатрат клетки. Поскольку при тепловом шоке увеличивается количество petite-мутантов, можно предполагать, что повышение потребления кислорода связано с усилением генерации АФК. Различия в термотолерантности petite-мутанта при тепловом шоке разной степени жесткости свидетельствуют о том, что митохондрии могут иметь для термотолерантности дрожжевой клетки и негативное и позитивное значение.

4. Действие ингибиторов дыхания на термотолерантность дрожжевой клетки от способа получения клеткой энергии. Если дрожжевая клетка получает энергию в основном за счет окислительного фосфорилирования, блокирование дыхательной цепи ингибиторами приводит к снижению термотолерантности. Когда дрожжевая клетка использует в основном гликолитический путь получения энергии, ингибирование процессов дыхания способствует лучшему переживанию клеткой условий теплового шока.

5. Наличие в дрожжевой клетке ярко выраженного цианидрезистентного дыхания свидетельствует о неспособности этого вида дрожжей сбраживать глюкозу.

6. Азид натрия различным образом действует на развитие базовой и индуцированной термотолерантности дрожжевой клетки, что свидетельствует о том, что механизмы индуцированной и базовой термотолерантности в дрожжевой клетке существенно различаются.

7. Индукция синтеза Hspl04 при тепловом шоке зависит от функционирования митохондрий. В клетках дрожжей, несущих petite-мутацию или в условиях блокирования дыхательной цепи ингибиторами наблюдалось частичное подавление синтеза Hspl04.

Список рабог, опубликованных по теме диссертации

1. Созинов Д.Ю., Рихванов Е.Г., Варакина Н.Н., Раченко Е.И., Войников В.К. Влияние температуры послешоковой инкубации на выживаемость дрожжей Debaryomyces vanriji II Физиология растений.- 1999.Т. 46(2).- С. 276-281.

2. Рихванов Е.Г., Варакина Н.Н., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Киселева В.А., Войников В.К. Изменение дыхания при действии теплового шока на дрожжи Saccharomyces cerevisiae II Микробиология.- 2001,- Т. 70 (4).- С. 531-535

3. Рихванов Е.Г., Варакина I1.H., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Киселева В.А., Войников В.К. Действие азида натрия на термотолерантность дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Debaryomyces vanriji II Микробиология.-

2001.- Т.70 (3).- С. 300-304.

4. Рихванов Е.Г., Варакина Н.Н., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Войников В.К. Изучение действия азида натрия на термоустойчивость дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans И Микробиология,-

2002.- Т. 71 (6).- С. 768-772.

5. Rikhvanov E.G., Varakina N.N., Rusaleva T.M., Rachenko E.I., Voinikov V.K. Sodium azide reduces the thermotolerance of respiratively grown yeasts // Curr. Microbiol.- 2002,- V. 45(6).- P. 394-399

6. Рихванов Е.Г., Варакина H.H., Русалева T.M., Раченко Е.И., Войников В.К.. Действие ингибиторов цитохромоксидазного комплекса на термоустойчивость дрожжей // Микробиология.- 2003.- Т. 72 (2).- С. 174-179.

7. Rikhvanov E.G., Rachenko E.I., Varakina N.N., Rusaleva T.M., Borovskii G.B., Voinikov V.K. Heat-shock-induced synthesis of Hspl04 Saccharomyces cerevisiae is regulated by mitochondrial activity // European Journal of Biochemistry.- 2003,- V. 270 (si).- P. 138.

8. Рихванов Е.Г., Варакина H.H., Русалева T.M., Раченко Е.И., Войников В.К. Отсутствие прямой зависимости между способностью дрожжей расти при повышении температуре и их выживаемостью после летального теплового шока // Микробиология.- 2003.- Т. 72 (4).- С. 423-427.

9. Рихванов Е.Г., Варакина Н.Н., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Войников В.К.. Действие малоната натрия на термотолерантность дрожжей // Микробиология.- Т. 72 (5).

» 1 4 6 8 1

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Раченко, Елена Ивановна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. РОСТ И ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ МЕТАБОЛИЗМ ДРОЖЖЕЙ

2.1.1. Физиология метаболизма и роста дрожжей

2.1.2. Регуляция энергетического метаболизма дрожжей

2.1.3. Особенности строения дыхательного аппарата дрожжевой клетки

2.2. РЕАКЦИЯ ДРОЖЖЕЙ НА ТЕПЛОВОЙ ШОК И СВЯЗАННЫЕ С НЕЙ МИТОХОНДРИАЛЬНЫЕ ФУНКЦИИ

2.2.1. Митохондрии - основной источник АФК в дрожжевой клетке

2.2.2. Изменения в углеводном метаболизме

2.2.3. Синтез и функции белков теплового шока

2.2.4. Нзр104 - ключевой белок толерантности дрожжей сегеушае к стрессу

2.3. РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ СТРЕССОВЫХ ГЕНОВ Б.СЕЯЕУШАЕ

2.3.1. Элемент теплового шока (#££) и фактор теплового шока (Я^)

2.3.2. Стрессовая реакция и цАМФ-зависимая протеинкиназа А

2.4. ВЫВОДЫ ИЗ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ, ЦЕЛЬ И

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ШТАММЫ ДРОЖЖЕЙ И ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

3.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РОСТОВЫХ ПАРАМЕТРОВ И ТЕМПЕРАТУРНАЯ ОБРАБОТКА

3.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЫХАТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ В

ЗАВИСИМОСТИ ОТ ТЕМПЕРАТУРЫ ИНКУБИРОВАНИЯ И

ДЕЙСТВИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ИНГИБИТОРОВ

3.4. ДЕЙСТВИЕ ИНГИБИТОРОВ ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНОЙ ЦЕПИ МИТОХОНДРИЙ НА ТЕРМОТОЛЕРАНТНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ

3.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАТАЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ

3.6. ВЫДЕЛЕНИЕ ДРОЖЖЕВОГО БЕЛКА

3.7. ОДНОМЕРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

3.8. ОКРАСКА И ОБЕСЦВЕЧИВАНИЕ ГЕЛЕЙ

3.9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКОВ

3.10. ИММУНОБЛОТТИНГ

3.11. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АНТИТЕЛ

3.12. ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТОВ ДЫХАТЕЛЬНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

3.13. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ 68 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. ТЕМПЕРАТУРНЫЕ ПАРАМЕТРЫ РОСТА ДРОЖЖЕЙ

4.1.1. Температурные параметры роста дрожжей и их толерантность к тепловому шоку

4.1.2. Влияние тиамина на термоустойчивость и термотолерантность дрожжей/), vanrijiae

4.2. ЗАВИСИМОСТЬ ТЕРМОТОЛЕРАНТНОСТИ ОТ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ МИТОХОНДРИЙ В ДРОЖЖЕВОЙ КЛЕТКЕ

4.2.1. Роль Нзр104 в развитии термотолерантности дрожжей

51. cerevlsiae

4.2.2. Термотолерантность дрожжей сегеушяе в зависимости от источника углерода в среде культивирования

4.2.3. Индукция синтеза Н5р104 в зависимости от функционирования митохондрий в клетках сегеушае

4.2.4. Сравнение термотолерантности & сбгеу/5ае родительского типа и мутанта дыхательной недостаточности

4.3. ИЗМЕНЕНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ДЫХАНИЯ ДРОЖЖЕЙ ПРИ ПОВЫШЕНИИ ТЕМПЕРАТУРЫ. РОЛЬ КАТАЛАЗЫ В ТЕРМОТОЛЕРАНТНОСТИ ДРОЖЖЕВОЙ КЛЕТКИ

4.4. ДЕЙСТВИЕ ИНГИБИТОРОВ ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНОЙ ЦЕПИ МИТОХОНДРИЙ НА ДЫХАТЕЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ

4.4.1. Действие азида натрия и цианида натрия на дыхательную активность D. vanrijiae и R. rubra

4.4.2. Действие азида натрия и цианида натрия на дыхательную активность S.cerevisiae и С.albicans

4.5. ДЕЙСТВИЕ ИНГИБИТОРОВ ДЫХАНИЯ НА ТЕРМОТОЛЕРАНТНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ

4.5.1. Действие ингибиторов дыхания на базовую термотолерантность дрожжей D. vanrijiae

4.5.2. Действие ингибиторов дыхания на базовую термотолерантность дрожжей R. rubra

4.5.3. Действие ингибиторов дыхания на базовую термотолерантность дрожжей S. cerevisiae

4.5.4. Действие ингибиторов дыхания на базовую термотолерантность дрожжей С. albicans

4.5.5. Механизм действия ингибиторов дыхания на термотолерантность дрожжей

4.5.6. Действие азида натрия на индуцированную термотолерантность S. cerevisiae

Введение Диссертация по биологии, на тему "Зависимость термотолерантности дрожжей от типа энергетического метаболизма"

Дрожжи являются одними из первых микроорганизмов, которые начал использовать человек. В Ветхом Завете (Исход, Главы 12 и 13) упоминается о закваске, вероятно, смеси различных видов дрожжей и бактерий, которую и поныне используют для выпечки хлеба в удаленных местностях. По этим же историческим причинам вид дрожжей Saccharomyces cerevisiae занял доминирующее положение на научной сцене и для многих людей стал синонимом дрожжей вообще.

Дрожжи очень широко распространены в природе и окружающей человека среде, и S. cerevisiae является одним из 800 описанных видов дрожжей (Kurtzman, Fell, 1998). Сам термин «дрожжи» таксономического значения не имеет. Под «дрожжами» в настоящее время понимают все грибные организмы, находящиеся в одноклеточной форме в ростовой фазе и размножающиеся преимущественно почкованием. Одноклеточные грибы, которые принято называть неноменклатурным термином «дрожжи», в зависимости от наличия и типа полового процесса распределяются по трем классам высших (септированных) грибных организмов: Ascomycetes, Basidiomycetes и Fungi Imperfecti, или Deuteromycetes (Рейвн и др., 1990).

В качестве объекта исследований для специалистов в области биохимии, генетики и молекулярной биологии дрожжи обладают рядом преимуществ и уникальных свойств. Дрожжи - одноклеточные микроорганизмы, растущие на простых по составу средах; к ним применимы почти все методы микробиологических исследований. Вместе с тем дрожжи - простейшие эукариотические организмы, обладающие митохондриями -наиболее совершенной системой превращения энергии окисления субстратов в АТФ и другие формы энергии, используемые клеткой. В этом отношении дрожжи с их полноценным дыхательным аппаратом близки клеткам высших организмов и значительно отличаются от прокариотов. Некоторые виды дрожжей (например, S. cerevisiae) способны расти как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Лабильность дрожжевой клетки, ее зависимость от внешних условий среды и многообразие путей адаптации являются характерными чертами, свойственными микроорганизмам. Так, если половина жизни митохондрий растений составляет 5-10 дней, то половина жизни самой дрожжевой клетки - 1-3 часа. Всего лишь 6-8 часов необходимо для развития полноценных митохондрий с нормальными кристами при переходе дрожжей & сегеушае от анаэробных условий к аэробным. Однако появление ферментов дыхательной цепи, отсутствующих у анаэробно выращенных дрожжей, может быть ясно обнаружено уже через 10-30 мин аэробной адаптации. Поскольку клетки сегеугБае могут существовать, получая энергию не только за счет дыхания, но и за счет брожения, то можно получать штаммы с разнообразными митохондриальными (цитоплазматическими) мутациями, причем даже такими, которые полностью блокируют способность клетки к дыханию, что открыло путь для изучения генетики митохондрий (Звягильская, Котельникова, 1991).

Дыхательная цепь дрожжевых митохондрий построена по тому же типу, как у высших организмов и, в частности, содержит классический набор цитохромов. Тем не менее, она обладает и особенностями, отличающими ее от дыхательной цепи растений и млекопитающих. По строению дыхательной цепи разных видов дрожжей можно проследить эволюционное усложнение организации окислительного фосфорилирования: от двух точек сопряжения энергии у факультативных анаэробов (& сегеу1$1'ае) до более совершенного дыхательного аппарата у дрожжей с выраженным аэробным типом обмена (Звягильская, Котельникова, 1991).

Митохондрия - ключевая органелла, определяющая жизнь и смерть клетки. Являясь основным источником энергии для аэробно живущих организмов в нормальных условиях, митохондрии приобретают особое значение для жизнеспособности клетки в стрессовых условиях, в частности при тепловом шоке. В пользу этого утверждения говорит тот факт, что предотвращение денатурации и аггрегации важнейших белковых структур клетки, а также восстановление поврежденных действием высокой температуры молекул белков осуществляется АТФ-зависимыми шаперонами (Trott, Morano, 2003).

Тепловой шок часто сопровождается повышением концентрации активных форм кислорода (АФК), источником которых являются митохондрии. По этой причине усиление дыхательной активности митохондрий при тепловом шоке может иметь отрицательный результат для клетки. Но при этом в клетке существует многоуровневая защитная система, которая индуцируется при стрессовом воздействии и предотвращает накопление АФК, и подвергает деградации уже появившиеся (Skulachev, 2001).

К настоящему времени в литературе имеются лишь косвенные данные, позволяющие предполагать связь функциональной активности митохондрий и термотолерантности клетки. Показано, что во время теплового шока снижается уровень АТФ в клетке (Findly et al., 1983; Currie et al., 1999; Mallouk et al., 1999; Kabakov et al., 2002), и что митохондриальные ингибиторы вызывают индукцию тех же генов, что и тепловой шок (Ashburner, Bonner, 1979). Но до сих пор нет работ, обобщающих результаты исследований о роли митохондрий при тепловом шоке.

Большинство исследований, касающихся роли митохондрий в термотолерантности дрожжевой клетки, проведены на лабораторных штаммах S. cerevisiae. Результаты этих работ противоречивы и не дают полного представления о связи между термотолерантностью дрожжевой клетки и функциональной активностью митохондрий (Mitchel and Morrison, 1983; Weitzel et al., 1987; Patriarca and Maresca, 1990; Sánchez et al., 1992). Одной из возможных причин этих противоречий может быть наличие у S. cerevisiae альтернативного пути получения энергии - брожения. По этой причине в данной работе мы изучили роль дыхания при тепловом шоке, используя, кроме S. cerevisiae, и другие виды дрожжей, различающиеся по типу энергетического метаболизма.

При изучении процессов термотолерантности дрожжей S. cerevisiae основным предметом наших исследований был белок теплового шока с мол. массой 104 кД (Hspl04). Известно, что этот белок является ключевым компонентом защитной системы дрожжевой клетки S. cerevisiae от повреждающего действия высокой температуры и других стрессовых воздействий. К настоящему времени хорошо изучены структура, функции и локализация этого белка (Schirmer et al., 2001). Кроме дрожжей, гомологи Hspl04 с аналогичными функциями обнаружены в клетках растений, бактерий и у простейших (Lee et al., 1994; Schirmer et al., 1994, 1996; Singla et al., 1997; Wells et al., 1998; Keeler et al., 2000; Campbell et al., 2001; Eriksson et al., 2001; Nieto-Sotelo et al., 1999, 2002). Последние исследования дают основания предполагать, что Hspl04 участвует в регуляции дыхания в клетках S. cerevisiae (Lee et al., 1998; Lee et al., 2001). Чтобы доказать или опровергнуть эти предположения, в нашей работе мы попытались установить зависимость между синтезом Hspl04 и связанной с ним термотолерантности дрожжевой клетки и функционированием митохондрий.

Автор выражает большую признательность и благодарность своим научным руководителям д.б.н., профессору Войникову Виктору Кирилловичу и к.б.н. Рихванову Евгению Геннадьевичу за постоянное внимание к данной работе, а также к.б.н. Варакиной H.H., Русалевой Т.М., д.б.н. Боровскому Г.Б. за помощь в проведении ряда экспериментов, д.б.н. Побежимовой Т.П. и д.б.н. Колесниченко A.B. за конструктивные замечания при написании диссертации. Кроме того, автор благодарит весь коллектив лаборатории физиологической генетики за дружеское участие и поддержку.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Раченко, Елена Ивановна

6. выводы

2. Термотолерантность дрожжевой клетки зависит от типа ее энергетического метаболизма. Дрожжи, растущие в условиях активного дыхательного метаболизма, более устойчивы к действию высокой температуры, чем дрожжи, ферментирующие глюкозу, что объясняется высоким конститутивным синтезом белков теплового шока, в частности Н8р104, и антиоксидантных ферментов.

3. Повышение температуры приводит к возрастанию дыхательной активности, что, вероятно, связано с увеличением энергозатрат клетки. Поскольку при тепловом шоке увеличивается количество ре1;ке-мутантов, можно предполагать, что повышение дыхательной активности приводит к усилению генерации АФК. Различия в термотолерантности ре1:ке-мутанта при тепловом шоке разной степени жесткости свидетельствуют о том, что митохондрии могут иметь для термотолерантности дрожжевой клетки и негативное и позитивное значение.

7. Индукция синтеза Шр104 при тепловом шоке зависит от функционирования митохондрий. В клетках дрожжей, несущих ре1;ке-мутацию или в условиях блокирования дыхательной цепи ингибиторами наблюдалось частичное подавление синтеза Нзр104.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вопросам температурной адаптации клетки посвящено достаточно большое количество работ. Сопоставление данных, полученных на разных объектах (животных, растениях, микроорганизмах), дает оснований утверждать, что существуют общие механизмы, регулирующие ответ клетки на действие высокой температуры. Вероятно, эти механизмы обусловлены не столько систематической принадлежностью того или иного вида, а скорее условиями, оптимальными для его роста и размножения. В связи с этим, приобретение дополнительных знаний позволяет лучше понимать не только механизмы защитной реакции конкретного вида, но интерпретировать эти знания на другие организмы.

Н.Ф. Реймерс термин «устойчивость» (особи) трактует, как «ее способность переносить внешние воздействия, т.е. выносливость к ним.», а термин «толерантность - способность организмов выносить отклонения экологических факторов от оптимальных для себя.» (Популярный биологический словарь, 1990). Соответственно в научной литературе понятия термоустойчивость и термотолерантность используются как синонимы. Их применяют как для оценки способности к росту при повышении температуры, так и выживаемости при летальном тепловом шоке. Сравнивая способность разных видов дрожжей расти при максимальной температуре (термоустойчивость) и их способность переживать кратковременное летальное действие теплового шока (термотолерантность), мы пришли к выводу, что эти два явления определяются хотя и сходными, но различными механизмами. Поэтому под термином термотолерантность мы понимаем -способность организма выдерживать летальное воздействие теплового шока, а под термином термоустойчивость - способность к росту при температурах выше оптимальной. При этом термотолерантность дрожжей не зависит от их максимально возможной температуры роста, но существует обратная зависимость термотолерантности от скорости роста дрожжей до теплового воздействия.

Тепловой шок вызывает в клетке глобальные перестройки метаболизма: белкового, углеводного, липидного. Прежде всего, развитие термотолерантности любой эу- или прокариотической клетки связывают с синтезом специфического набора белков, которые получили название белки теплового шока. К настоящему времени существует достаточно подробная классификация этих белков, гомологичные белки с похожими функциями обнаружены у представителей разных царств живой природы. В этом отношении дрожжи не являются исключением. Среди прочих, особое место в развитии термотолерантности дрожжевой клетки (S. cerevisiae) занимает белок с мол. массой 104 кД. Как следует из результатов нашей работы, наличие этого белка в дрожжевой клетке необходимо не только для развития индуцированной термотолерантности, связь Hspl04 с которой отмечалась ранее (Sanchez, Lindquist, 1990, Sanchez et al., 1992). При действии летального теплового шока без предварительной мягкой тепловой обработки клетки, способные экспрессировать ген HSP104, также более устойчивы к действию высокой температуры, чем клетки hspl04 мутанта.

В зависимости от того, как дрожжевая клетка S. cerevisiae получает энергию в процессе метаболизма, различается степень ее термотолерантности. В условиях аэробного брожения термотолерантность дрожжевой клетки значительно ниже, чем в условиях дыхательного метаболизма. При этом активно дышащие клетки S. cerevisiae имели сравнительно высокий конститутивный уровень синтеза Hspl04, чего не наблюдалось в клетках с преобладанием бродильного метаболизма (Sanchez et al., 1992, гл. 4.2.3.). В клетках дрожжей S. cerevisiae, митохондрии которых неактивны по причине petite-мутации или действия ингибиторов электрон-транспортной цепи, при неизменном конститутивном уровне синтеза, индукция синтеза Hspl04 при повышении температуры снижалась (гл. 4.2.3, 4.5.6). Эти факты говорят в пользу утверждения о том, что индукция синтеза Hspl04 зависит от функциональной активности митохондрий. Чем опосредована эта зависимость, пока остается неясным. Дрожжи, выращиваемые на галактозе, были более устойчивы к действию высокой температуры, чем дрожжи, растущие на глюкозе, но делеция гена Н8Р104 существенно снижала термотолерантность дрожжей и в том и в другом случае. Мутанты дыхательной недостаточности, несмотря на низкий индуцированный уровень Нзр104, были менее чувствительны к действию теплового шока (45°С), чем дыхательно-компетентные дрожжевые клетки. Но термотолерантность реи1е-мутантов, имеющих мутацию по гену Н8Р104, была значительно ниже, чем у ре1ке-мутантов, не имеющих такой мутации. Это свидетельствует о том, что свои защитные функции Нзр104 выполняет и в клетках с нарушенной дыхательной активностью. Этот тезис дополнительно был подтвержден тем фактом, что при действии азида натрия, митохондриального ингибитора, дрожжевые клетки с функциональным геном Н8Р104, переживали тепловой шок с большей эффективностью, чем клетки к$р!04 мутанта.

Безусловно, Нзр104 не единственный фактор, определяющий термотолерантность дрожжевой клетки. Тем более, что выполнение этим белком своих функций происходит только в комплексе с Нзр40 и Ну/? 70 и отмечена его связь с другими шаперонами. Не последнюю роль в защите клетки от действия высокой температуры занимают антиоксидантные ферменты, поскольку известно, что тепловой шок часто сопровождается окислительным стрессом. Основным источником активных форм кислорода в дрожжевой клетке являются митохондрии, и, естественно, усиление дыхательной активности при повышении температуры приводит к увеличению концентрации АФК в клетке. При этом активно дышащие клетки, имеющие высокий конститутивный уровень синтеза не только белков теплового шока, но и антиоксидатных ферментов, гораздо лучше противостоят разрушительному действию окислительного стресса, сопровождающего тепловой шок. Но генерация АФК при разных температурах теплового шока различается. Об этом можно судить по результатам экспериментов, показавшим, что при 45°С уровень поглощения кислорода в два раза превышает аналогичные значения при 30°С на протяжении всего времени эксперимента, а при 50°С - дыхательная активность усиливается кратковременно и после 10 минут измерений падает ниже контрольного уровня. Вероятно, различия в скорости поглощения кислорода определяют концентрацию АФК в клетке: достаточно высокую при 45°С и минимальную при 50°С. По этой причине мутант дыхательной недостаточности был устойчивее родительского штамма при 45°С, поскольку при сравнительно низкой активности антиоксидатных ферментов, у ре^е-мутанта отсутствовал источник АФК. Напротив, при 50°С причины гибели вызваны, вероятно, денатурирующим действием высокой температуры и в этих условиях реШе-мутант был более уязвим, чем родительский штамм. Причины, по которым отсутствие функциональных митохондрий снижает термотолерантность дрожжевой клетки при 50°С, еще предстоит выяснить. Тем более что блокирование дыхания митохондриальными ингибиторами почти также действовало на термотолерантность дрожжей, растущих на среде с глюкозой, при тех же температурах теплового шока.

Совсем другой эффект ингибиторов мы наблюдали, когда исследовали их действие на термотолерантность дрожжей, получающих энергию только за счет окислительного фосфорилирования и ферментирующих видов дрожжей, растущих на среде с галактозой, которая обеспечивает высокий уровень дыхательного метаболизма в клетке. При этом наблюдалось резкое снижение выживаемости дрожжевых клеток, в которых дыхание было заблокировано азидом или цианидом. В нашей работе мы рассматриваем две основных, на наш взгляд, причины подавляющего действия ингибиторов на термотолерантность дрожжей с дыхательным типом метаболизма. Первая -это перевосстановление дыхательной цепи, и, как следствие, повышение уровня АФК в клетке. И вторая - потеря единственного источника энергии, которая является основным фактором для восстановления структур клетки, поврежденных в результате действия температуры и оксидантов.

Наличие в дрожжевой клетке альтернативных путей переноса электронов и получения энергии может привести к снижению производства вредных для клетки радикалов и компенсировать недостаток АТФ, образовавшийся в результате блокирования дыхания. При этом способность дрожжевой клетки к ферментации глюкозы оказывается предпочтительнее, чем активизирование функций альтернативной оксидазы, как было показано нами на примере дрожжей С. albicans.

Но если азид натрия повышал базовую термотолерантность дрожжей S. cerevisiae при росте на глюкозе, то индуцированная термотолерантность в присутствии этого ингибитора значительно снижалась. Причем одной из причин такого снижения мы считаем показанное нами частичное подавление индукции синтеза Hspl04. Поскольку развитие индуцированнной термотолерантности обусловлено также синтезом других белков теплового шока, антиоксидантных ферментов и т.д., подавляющий эффект ингибитора может определяться его действием и на другие компоненты защитной системы клетки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Раченко, Елена Ивановна, Иркутск

1. Жданова-Пушкина С.М. Основы роста культур микроорганизмов // Л.: Изд-во Ленингр. ун-та.- 1983.- 188 с.

2. Меденцев А.Г., Акименко В.К. Развитие и активация цианидрезистентного дыхания у дрожжей Yarrowia lipolitica II Биохимия.-1999.-T. 64(8).-С. 1123-1131.

3. Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. Регуляция и физиологическая роль цианидрезистентной оксидазы у грибов и растений // Биохимия.- 1999.- Т.64(11).- С.1457-1472.

4. Плохинский H.A. Биометрия,- Новосибирск: Изд-во СО АН СССР.- 1961.-С. 9.

5. Рейвн П., Эверт Р., Айкхорн С. Современная ботаникаю- М: Мир.- 1990.

6. Рихванов Е.Г., Варакина Н.Н., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Войников В.К. Действие ингибиторов цитохромоксидазного комплекса на термоустойчивость дрожжей // Микробиология.- 2003.- Т. 72(2).- С. 174179.

7. Рихванов Е.Г., Варакина Н.Н., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Войников В.К. Действие малоната натрия на термоустойчивость дрожжей // Микробиология.- 2003.- Т. 72(6).- в печати.

8. Рихванов Е.Г., Варакина Н.Н., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Киселева В.А., Войников В.К. Действие азида натрия на термотолерантность дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Debaryomyces vanriji 11 Микробиология,- 2001.- Т. 70(3).- С. 295-299.

9. Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом.- М: Наука 1973 - 221 с.

10. Созинов Д.Ю., Рихванов Е.Г., Варакина Н.Н., Раченко Е.И., Войников

11. B.К. Влияние температуры послешоковой инкубации на выживаемость дрожжей Debaryomyces vanriji 11 Физиология растений- 1999.- Т.46(2).1. C.276-281.

12. Abbas-Terki Т., Donze О., Briand P.A., Picard D. Hspl04 interacts with Hsp90 cochaperones in respiring yeast // Mol Cell Biol.- 2001.- V. 21(22).- P. 75697575.

13. Ames B.N., Shigenaga M.K., Gold L. S. DNA lesions, inducible DNA repair, and cell division: three key factors in mutagenesis and carcinogenesis // Environ Health Perspect.- 1993.- V. 101.- P.35-44.

14. Ashburner M., Bonner J.J. The induction of gene activity in Drosophilla by heat shock // Cell.- 1979,- V. 17(2).- P. 241-254.

15. Benaroudj N., Lee D.H., Goldberg A.L. Trehalose accumulation during cellular stress protects cells and cellular proteins from damage by oxygen radicals // J Biol Chem.- 2001.-V. 276(26).-P. 24261-242617.

16. Boveris A., Costa L.E., Poderoso J.J., Carreras M.C., Cadenas E. Regulation of mitochondrial respiration by oxygen and nitric oxide // Ann N Y Acad Sci — 2000,- V. 899.-P. 121-135.

17. Boy-Marcotte E, Lagniel G, Perrot M, Bussereau F, Boudsocq A, Jacquet M, Labarre J. The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsflp régulons // Mol Microbiol.-1999,- V. 33(2).-P. 274-283.

18. Boy-Marcotte E., Tadi D., Perrot M., Boucherie H., Jacquet M. High cAMP levels antagonize the reprogramming of gene expression that occurs at the diauxic shift in Saccharomyces cerevisiae // Microbiology 1996.- V. 142(3).-P. 459-467.

19. Breunig K.D., Bolotin-Fukuhara M., Bianchi M.M., et al. Regulation of primary carbon metabolism in Kluyveromyces lactis II Enzyme Microb Technol-2000.- V. 26(9-10).-P. 771-780.

20. Brown-Peterson N.J., Salin M.L. Purification and characterization of a mesohalic catalase from the halophilic bacterium Halobacterium halobium U J. Bacteriol.- 1995.-V. 177(2).-P. 378-384.

21. Burke J.J., O'Mahony P.J., Oliver M.J. Isolation of Arabidopsis mutants lacking components of acquired thermotolerance // Plant Physiol 2000.- V. 123(2)-P. 575-588.

22. Cabiscol E., Belli G., Tamarit J., Echave P., Herrero E., Ros J. Mitochondrial Hsp60, resistance to oxidative stress, and the labile iron pool are closely connected in Saccharomyces cerevisiae IIJ Biol Chem 2002.- V. 277(46).- P. 44531-44538

23. Cabiscol E., Piulats E., Echave P., Herrero E., Ros J. Oxidative stress promotes specific protein damage in Saccharomyces cerevisiae II J Biol Chem 2000.-V. 275(35).- P. 27393-27398.

24. Cameron S., Levin L., Zoller M., Wigler M. cAMP-independent control of sporulation, glycogen metabolism, and heat shock resistance in S. cerevisiae // Cell.- 1988.- V. 53(4).-P. 555-566.

25. Chen S., Smith D.F. Hop as an adaptor in the heat shock protein 70 (HsplO) and Hsp90 chaperone machinery 11 J Biol Chem.- 1998.- V. 273(52).- P. 35194-35200.

26. Craig E.A., Gross C.A. Is Hsp70 the cellular thermometer? // Trends Biochem. Sci.- 1991.-V. 16.-P. 135-140.

27. Craig E.A., Jacobsen K. Mutations of the heat inducible 70 kilodalton genes of yeast confer temperature sensitive growth // Cell 1984,- V. 38(3).- P. 841849.

28. Currie S., Tufts B.L., Moyes C.D. Influence of bioenergetic stress on heat shock protein gene expression in nucleated red blood cells of fish // Am J Physiol.- 1999.- V. 276(2).-P. 990-996.

29. Dat J.F., Lopez-Delgado H., Foyer C.H., Scott I.M. Parallel changes in H202 and catalase during thermotolerance induced by salicylic acid or heat acclimation in mustard seedlings // Plant Physiol 1998.- V. 116(4).- P. 13511357.

30. Davidson J.F., Schiestl R.H. Cytotoxic and genotoxic consequences of heat stress are dependent on the presence of oxygen in Saccharomyces cerevisiae IIJ Bacteriol 2001.- V. 183(15).-P. 4580-4587.

31. Davidson J.F., Schiestl R.H. Mitochondrial respiratory electron carriers are involved in oxidative stress during heat stress in Saccharomyces cerevisiae // Mol Cell Biol.- 2001.- V. 21(24).- P. 8483-8489.

32. Davidson J.F., Whyte B., Bissinger P.H., Schiestl R.H. Oxidative stress is involved in heat-induced cell death in Saccharomyces cerevisiae // Proc Natl Acad Sci USA.- 1996,- V. 93(10).- P. 5116-5121.

33. De Deken R.H. The Crabtree effect: a regulatory system in yeast // J. Gen. Microbiol.- 1966.- V. 44(2).- P. 149-156.

34. De Virgilio C., Hottiger T., Dominguez J., Boiler T., Wiemken A The role of trehalose synthesis for the acquisition of thermotolerance in yeast. I. Genetic evidence that trehalose is a thermoprotectant // Eur J Biochem- 1994,- V. 219(1-2).-P. 179-186.

35. Dreher D., Junod A. F. Role of oxygen free radicals in cancer development // Eur. J. Cancer.- 1996.- V. 32A.- P. 30-38.

36. Dubaquie Y., Looser R., Funfschilling U., Jeno P., Rospert S. Identification of in vivo substrates of the yeast mitochondrial chaperonins reveals overlapping but non-identical requirement for Hsp60 and HsplO // EMBO J 1998.- V. 17(20).-P. 5868-5876.

37. Duchniewicz M., Germaniuk A., Westermann В., Neupert W., Schwarz E., Marszalek J. Dual role of the mitochondrial chaperone Mdjlp in inheritance of mitochondrial DNA in yeast // Mol Cell Biol.- 1999.- V. 19(12).- P. 82018210.

38. Duina A.A., Kalton H.M., Gaber R.F. Requirement for Hsp90 and a Cyp-40-type cyclophilin in negative regulation of the heat shock response // J Biol Chem.- 1998.-V. 273.-P. 18974-18978.

39. Elliott В., Futcher B. Stress resistance of yeast cells is largely independent of cell cycle phase // Yeast.- 1993.- V. 9(1).- P. 33-42.

40. Estruch F. Stress-controlled transcription factors, stress-induced genes and stress tolerance in budding yeast // FEMS Microbiol Rev 2000.- V. 24(4).- P. 469-486.

41. Feder M.E., Hofmann G.E. Heat-shock proteins, molecular chaperones, and the stress response: evolutionary and ecological physiology // Annu Rev Physiol —1999.-V. 61.-P. 243-282.

42. Felts S.J., Owen B.A., Nguyen P., Trepel J., Donner D.B., Toft D.O. The• Hsp90-related protein TRAP1 is a mitochondrial protein with distinct functional properties // J Biol Chem.- 2000,- V. 275(5).- P. 3305-3312.

43. Ferreira P.C., Ness F., Edwards S.R., Cox B.S., Tuite M.F. The elimination ofthe yeast PSI+. prion by guanidine hydrochloride is the result of Hspl04inactivation // Mol Microbiol.- 2001.- V. 40(6).- P. 1357-1369.

44. Fiechter A; Fuhrmann GF; Kappeli O. Regulation of glucose metabolism ingrowing yeast cells // Adv Microb Physiol 1981.- V.22.- P.123-183.

45. Findly R.C., Gillies R.J., Shulman R.G. In vivo phosphorus-31 nuclearmagnetic resonance reveals lowered ATP during heat shock of Tetrahymena II• Science.- 1983.- V. 219(4589).- P. 1223-1225.

46. Flores C-L., Rodriguez C., Petit T., Gancedo C. Carbohydrate and energy-yielding metabolism in non-conventional yeasts // FEMS Microbiology Rev.2000,-V.24.-P. 507-529.

47. Gasch A. P. The environmental stress response: a common yeast response to diverse environmental stresses // // Springer-Verlag Berlin Heidelberg: Topics in Current Genetics, V.l: Yeast Stress Responses / S.Hohmann/P.W.H.Mager (Eds.).-2003 .-P. 11-70.

48. Gassler C.S., Wiederkehr T., Brehmer D., Bukau B., Mayer M.P. Bag-1M accelerates nucleotide release for human Hsc70 and Hsp70 and can act concentration-dependent as positive and negative cofactor // J Biol Chem-2001.- V. 276(35).- P. 32538-32544.

49. Gonzalez-Flecha B., Demple B. Metabolic sources of hydrogen peroxide in aerobically growing Escherichia coli II J Biol Chem.- 1995.- V. 270(23).- P. 13681-13687.

50. Grant C.M., Maclver F.H., Dawes I.W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae // FEBS Lett.- 1997.- V. 410(2-3).-P. 219-222.

51. Graumlich T.R., Stevenson K.E. Respiration and viability of thermally injured Saccharomyces cerevisiae // Appl Environ Microbiol 1979.- V. 38(3).- P. 461-465.

52. Gross C., Watson K. De novo protein synthesis is essential for thermotolerance acquisition in a Saccharomyces cerevisiae trehalose synthase mutant // Biochem Mol Biol Int.- 1998.- V. 45(4).- P. 663-671.

53. Hartl F.U., Hayer-Hartl M. Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein // Science.- 2002.- V. 295(5561) P. 1852-1858.

54. Hasan R., Leroy C., Isnard A.D., Labarre J., Boy-Marcotte E., Toledano M.B. The control of the yeast H2O2 response by the Msn2/4 transcription factors // Mol Microbiol.- 2002.- V. 45(1).-P. 233-241.

55. Hernandez M.P., Sullivan W.P., Toft D.O. The assembly and intermolecular properties of the Hsp70-Hop-Hsp90 molecular chaperone complex // J Biol Chem.- 2002.- V. 277(41).-P. 38294-38304.

56. Hong S.W., Vierling E.M. Mutants of Arabidopsis thaliana defective in the acquisition of tolerance to high temperature stress // Proc Natl Acad Sci USA-2000,- V. 97(8).-P. 4392-4397.

57. Hoogerheide J.C. Studies on the energy metabolism during anaerobic fermentation of glucose by baker's yeast // Radiat Environ Biophys.- 1975.-V. 11(4).- P. 295-307.

58. Joseph-Horne T., Hollomon D.W., Wood P.M. Fungal respiration: a fusion of standard and alternative components // Biochim. Biophys. Acta.- 2001.- V. 1504.-P. 179-195.

59. Jung G., Masison D.C. Guanidine hydrochloride inhibits Hspl04 activity in vivo: a possible explanation for its effect in curing yeast prions // Curr Microbiol.- 2001,- V. 43(1).-P. 7-10.

60. Kawai R., Fujita K., Iwahashi H., Komatsu Y. Direct evidence for the intracellular localization of Hspl04 in Saccharomyces cerevisiae by immunoelectron microscopy // Cell Stress Chaperones 1999.- V. 4(1).- P. 4653.

61. Machida K., Tanaka T. Farnesol-induced generation of reactive oxygen species dependent on mitochondrial transmembrane potential hyperpolarization mediated by F(0)F(l)-ATPase in yeast // FEBS Lett.- 1999.- V. 462(1-2).- P. 108-112.

62. Mager W.H., De Kruijff A.J. Stress-induced transcriptional activation // Microbiol. Rev.- 1995.- V. 59.-P. 506-531.

63. Mai B., Breeden L. Xbpl, a stress-induced transcriptional repressor of the Saccharomyces cerevisiae Swi4/Mbpl family // Mol Cell Biol.- 1997,- V. 17(11).-P. 6491-6501.

64. Mallouk Y., Vayssier-Taussat M., Bonventre J.V., Polla B.S. Heat shock protein 70 and ATP as partners in cell homeostasis // Int J Mol Med 1999.- V. 4(5).-P. 463-474.

65. Matsunaka S., Morita S., Conti S.F. Respiratory system of Rhodotorula glutinis. I. Inhibitor tolerance and cytochrome components // Plant Physiol.-1966,- V. 41(8).- P. 1364-1369.

66. Maxwell D.P., Wang Y., Mcintosh L. The alternative oxidase lowers mitochondrial reactive oxygen production in plant cells // Proc Natl Acad Sci USA.- 1999.- V. 96(14).- P. 8271-8276.

67. Milani G., Jarmuszkiewicz W., Sluse-Goffart C.M., Schreiber A.Z., Vercesi A.E., Sluse F.E. Respiratory chain network in mitochondria of Candida parapsilosis: ADP/O appraisal of the multiple electron pathways // FEBS Lett — 2001,-V. 508(2).-P. 231-235.

68. Misra H.P., Fridovich I. Inhibition of superoxide dismutases by azide // Arch Biochem Biophys.- 1978.-V. 189(2).-P. 317-322.

69. Morano K.A., Santoro N., Koch K.A., Thiele D.J. A trans-activation domain inyeast heat shock transcription factor is essential for cell cycle progressionduring stress // Mol Cell Biol.- 1999.- V. 19(1).- P. 402-411.

70. Nathan D.F., Vos M.H., Lindquist S. In vivo functions of the Saccharomycescerevisiae Hsp90 chaperone // Proc Natl Acad Sci USA 1997,- V. 94(24).- P.12949-12956.

71. Neves M.J., Francois J. On the mechanism by which a heat shock induces trehalose accumulation in Saccharomyces cerevisiae II Biochem J — 1992.- V. 288(3).-P. 859-858.

72. Newnam G.P., Wegrzyn R.D., Lindquist S.L., Chernoff Y.O. Antagonistic interactions between yeast chaperones Hspl04 and Hsp70 in prion curing // Mol Cell Biol.- 1999,-V. 19(2).-P. 1325-1333.

73. Nieto-Sotelo J., Martinez L.M., Ponce G., Cassab G.I., Alagon A., Meeley R.B., Ribaut J.M., Yang R. Maize HSP101 plays important roles in both induced and basal thermotolerance and primary root growth // Plant Cell-2002.-V. 14(7).-P. 1621-1633.

74. Nikawa J., Cameron S., Toda T., Ferguson K.M., Wigler M. Rigorous feedback control of cAMP levels in Saccharomyces cerevisiae II Genes Dev.- 1987.- V. 1(9).-P. 931-937.

75. Nollen E.A., Brunsting J.F., Roelofsen H., Weber L.A., Kampinga H.H. In vivo chaperone activity of heat shock protein 70 and thermotolerance // Mol Cell Biol.- 1999.-V. 19(3).-P. 2069-2079.

76. Nollen E.A., Morimoto R.I. Chaperoning signaling pathways: molecular chaperones as stress-sensing 'heat shock' proteins // J Cell Sci.- 2002.- V. 115(14).-P. 2809-2816.

77. Ohmori S., Nawata Y., Kiyono K., Murata H., Tsuboi S., Ikeda M., Akagi R.,

78. Morohashi K.I., Ono B. Saccharomyces cerevisiae cultured under aerobic andanaerobic conditions: air-level oxygen stress and protection against stress //

79. Biochim Biophys Acta.- 1999.- V. 1472(3).-P. 587-594.

80. Oszan S., Johnston M. Function and regulation of yeast hexose transporters //

81. Mic. and Mol. Biol. Rev.- 1999.- V.63(3).- P. 554-569.

82. Parrou J.L., Enjalbert B., Plourde L., Bauche A., Gonzalez B., Francois J.

83. Dynamic responses of reserve carbohydrate metabolism under carbon andnitrogen limitations in Saccharomyces cerevisiae II Yeast 1999.- V. 15 - P.191.203.

84. Parsell D.A., Kowal A.S., Lindquist S. Saccharomyces cerevisiae Hspl04 protein. Purification and characterization of ATP-induced structural changes // J Biol Chem.- 1994.-V. 269(6).-P. 4480-4487.

85. Parsell D.A., Lindquist S. The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins // Annu Rev Genet.- 1993.- V. 27.-P. 437-496.

86. Parsell D.A., Sanchez Y., Stitzel J.D., Lindquist S. Hspl04 is a highly conserved protein with two essential nucleotide-binding sites // Nature 1991 .V. 353(6341).-P. 270-273.

87. Patriarca E.J., Maresca B. Acquired thermotolerance following heat shock protein synthesis prevents impairment of mitochondrial ATPase activity atelevated temperatures in Saccharomyces cerevisiae II Exp Cell Res 1990.- V. 190(1).-P. 57-64.

88. Pearl L.H., Prodromou C. Structure and in vivo function of Hsp90 11 Curr Opin Struct Biol.- 2000.- V. 10(1).- P. 46-51.

89. Piper P.W. Molecular events associated with acquisition of heat tolerance by the yeast Saccharomyces cerevisiae // FEMS Microbiol Rev.- 1993.- V. 11(4).-P. 339-355.

90. Piper P.W. The heat shock and ethanol stress responses of yeast exhibit extensive similarity and functional overlap // FEMS Microbiol Lett 1995.- V. 134(2-3).-P. 121-127.

91. Piper P.W. Yeast superoxide dismutase mutants reveal a pro-oxidant action of weak organic acid food preservatives // Free Radic Biol Med.- 1999.- V. 27(11-12).-P. 1219-1227.

92. Queitsch C., Hong S.W., Vierling E., Lindquist S. Heat shock protein 101 plays a crucial role in thermotolerance in Arabidopsis U Plant Cell 2000.- V. 12(4).-P. 479-492.

93. Queitsch C., Sangster T.A., Lindquist S. Hsp90 as a capacitor of phenotypic variation // Nature.- 2002.- V. 417(6889).- P. 618-624.

94. Reading D.S., Hallberg R.L., Myers A.M. Characterization of the yeast HSP60 gene coding for a mitochondrial assembly factor 11 Nature- 1989,- V. 337(6208).-P. 655-659.

95. Reinders A., Burckert N., Boiler T., Wiemken A., De Virgilio C. Saccharomyces cerevisiae cAMP-dependent protein kinase controls entry into stationary phase through the Riml5p protein kinase // Genes Dev.- 1998.- V. 12(18).-P. 2943-2955.

96. Rikhvanov E.G., Varakina N.N., Sozinov D.Y., Voinikov V.K. Association of bacteria and yeasts in hot springs // Appl Environ Microbiol.- 1999.- V. 65(9).-P. 4292-4293.

97. Rosser M.F., Nicchitta C.V. Ligand interactions in the adenosine nucleotide-binding domain of the Hsp90 chaperone, GRP94. I. Evidence for allosteric regulation of ligand binding // J Biol Chem.- 2000.- V. 275(30).- P. 2279822805.

98. Russell M., Bradshaw-Rouse J., Markwardt D., Heideman W. Changes in gene expression in the Ras/adenylate cyclase system of Saccharomyces cerevisiae: correlation with cAMP levels and growth arrest // Mol Biol Cell 1993.- V. 4(7).- P. 757-765.

99. Rutherford S.L., Lindquist S. Hsp90 as a capacitor for morphological evolution 11 Nature.- 1998.-V. 396(6709).-P. 336-342.

100. Sanchez Y., Lindquist S.L. HSP104 required for induced thermotolerance // Science.- 1990.-V. 248(4959).-P. 1112-1115.

101. Sanchez Y., Parsell D.A., Taulien J., Vogel J.L., Craig E.A., Lindquist S. Genetic evidence for a functional relationship between Hspl04 and Hsp70 // J Bacterid.- 1993,-V. 175(20).-P. 6484-6491.

102. Sass P., Field J., Nikawa J., Toda T., Wigler M. Cloning and characterization of the high-affinity cAMP phosphodiesterase of Saccharomyces cerevisiae 11 Proc Natl Acad Sei USA.- 1986,- V. 83(24).- P. 9303-9307.

103. Schirmer E.C., Glover J.R., Singer M.A., Lindquist S. HSPlOO/Clp proteins: a common mechanism explains diverse functions 11 Trends Biochem Sei 1996.-V. 21(8).-P. 289-296.

104. Schirmer E.C., Lindquist S., Vierling E. An Arabidopsis heat shock protein complements a thermotolerance defect in yeast // Plant Cell.- 1994.- V. 6(12).-P. 1899-1909.

105. Schirmer E.C., Queitsch C., Kowal A.S., Parsell D.A., Lindquist S. The ATPase activity of Hspl04, effects of environmental conditions and mutations //J Biol Chem.- 1998.- V. 273(25).- P. 15546-15552.

106. Schmitt M., Neupert W., Langer T. The molecular chaperone Hsp78 confers compartment-specific thermotolerance to mitochondria // J Cell Biol 1996.-V. 134(6)- P. 1375-1386.

107. Siligardi G., Panaretou B., Meyer P., Singh S., Woolfson D.N., Piper P.W., Pearl L.H., Prodromou C. Regulation of Hsp90 ATPase activity by the co-chaperone Cdc37p/p50cdc37 // J Biol Chem.- 2002.- V. 277(23).- P. 2015120159.

108. Singer M.A., Lindquist S. Multiple effects of trehalose on protein folding invitro and in vivo // Mol Cell.- 1998.- V. 1(5).- P. 639-648.

109. Singla S.L., Pareek A., Grover A. Yeast HSP104 homologue rice HSP110 isdevelopmentally- and stress-regulated // Plant Science- 1997.- V. 125 P.211.219.

110. Smith A., Ward M.P., Garrett S. Yeast PKA represses Msn2p/Msn4p-depQndent gene expression to regulate growth, stress response and glycogen accumulation // EMBO J 1998.- V. 17(13).-P. 3556-3564.

111. Sorger P.K. Heat shock factor and heat shock response // Cell.- 1991.- V. 65.-P. 363-366.

112. Sorger P.K., Pelham H.R.B. Yeast heat shock factor is an essential DNA-binding protein that exhibits temperature-dependent phosphorylation // Cell.-1988.- V. 54.-P. 855-864.

113. Storz G., Imlay J.A. Oxidative stress // Curr Opin Microbiol 1999.- V. 2(2).-P. 188-194.

114. Sugiyama K., Izawa S., Inoue Y. The Yaplp-dependent induction of glutathione synthesis in heat shock response of Saccharomyces cerevisiae II J Biol Chem-2000.- V. 275(20).- P. 15535-15540.

115. Sugiyama K., Kawamura A., Izawa S., Inoue Y. Role of glutathione in heat* shock-induced cell death of Saccharomyces cerevisiae 11 Biochem J.- 2000.- Y. 352(1).- P. 71-78.

116. Tamura K., Miyashita M., Iwanashi H. Stress tolerance of pressure-shocked • Saccharomyces cerevisiae II Biotech Letters.- 1998.- V. 20(12).- P. 1167-1169.

117. Thevelein J.M., de Winde J.H. Novel sensing mechanisms and targets for the cAMP-protein kinase A pathway in the yeast Saccharomyces cerevisiae 11 Mol Microbiol.- 1999.- V 33(5).-P. 904-918.

118. Thevelein J.M., Hohmann S. Trehalose synthase: guard to the gate of glycolysisin yeast? // Trends Biochem Sci 1995,- V. 20 - P. 3-10.

119. Toda T., Cameron S., Sass P., Zoller M., Scott J.D., McMullen B., Hurwitz M.,m

120. Trott A., Morano K. A. The yeast response to heat shock // Springer-Verlag• Berlin Heidelberg: Topics in Current Genetics, V.l: Yeast Stress Responses / S.Hohmann / P.W.H.Mager (Eds.).- 2003.- P. 71-119.

121. Turrens J.F. Superoxide production by the mitochondrial respiratory chain // Biosci. Rep.- 1997.- V. 17.-P. 3-8.

122. Turrens J.F., Boveris A. Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria // Biochem J 1980.- V. 191(2).-P. 421-427.

123. Tzagoloff A., Myers A.M. Genetics of mitochondrial biogenesis // Ann. Rev.

124. Biochem.- 1986.-V. 55.-P. 249-285.

125. Veiga A., Arrabaca J.D., Loureiro-Dias M.C. Cyanide-resistant respiration is frequent, but confined to yeasts incapable of aerobic fermentation // FEMS Microbiol Lett.-2000.-V. 190(1).-P. 93-97.

126. Weber J., Senior A.E. Effects of the inhibitors azide, dicyclohexylcarbodiimide, and aurovertin on nucleotide binding to the three F1-ATPase catalytic sites measured using specific tryptophan probes // J Biol Chem.- 1998.- V. 273(50).-P. 33210-33215.

127. Wells D.R., Tanguay R.L., Le H., Gallie D.R. HSP101 functions as a specific translational regulatory protein whose activity is regulated by nutrient status // Genes Dev.- 1998.-V. 12(20).-P. 3236-3251.

128. Wilson D.F., Chance B. Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation // Biochim Biophys Acta.-1967.-V. 131(3).-P. 421-430.

Информация о работе

Раченко, Елена Ивановна
кандидата биологических наук
Иркутск, 2003
ВАК 03.00.12

Диссертация

Зависимость термотолерантности дрожжей от типа энергетического метаболизма - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы