Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль кальция в митохондриальной регуляции экспрессии генов HSP104 Saccharomyces cerevisiae и HSP101 Arabidopsis thaliana

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Роль кальция в митохондриальной регуляции экспрессии генов HSP104 Saccharomyces cerevisiae и HSP101 Arabidopsis thaliana"

На правах рукописи

Пятрикас Дарья Валерьевна

РОЛЬ КАЛЬЦИЯ В МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Н5РЮ4 Б А ССНАЯОМУСЕБ СЕЯЕУШАЕ И НБР101А11АВШ0Р818

ТНАиАШ

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 ФЕВ 2013

Иркутск - 2013

005050037

005050037

Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном учреждении науки Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук, г. Иркутск

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Боровский Геннадий Борисович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Глянько Анатолий Константинович

доктор биологических наук, профессор

Тимофеев Максим Анатольевич

Ведущая организация:

Федеральное Государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН

Защита диссертации состоится «19» марта 2013 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Федеральном Государственном бюджетном учреждении науки Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317. Факс (3952) 510754; e-mail: matmod@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального Государственного бюджетного учреждения науки Сибирского института физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН.

Автореферат разослан «18» февраля 2013 г. Ученый секретарь

диссертационного совета Д 003.047.01, кандидат биологических наук

Г.П. Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на то, что достаточно хорошо известно, как осуществляется регуляция экспрессии генов БТШ на транскрипционном уровне, механизм, вызывающий активацию транскрипционных факторов, остается во многом неизвестным. В последнее время все больше появляется данных о вероятном участии в активации транскрипции таких вторичных мессенджеров, как кальций и активные формы кислорода (АФК) (Saidi et al., 2011; Reddy et al., 2011), которые обладают способностью активировать экспрессию стрессовых генов, в том числе и генов БТШ (Trofimova et al., 1999; Moraitis, Curran, 2004; Volkov et al., 2006; Колупаев, Карпец, 2009; Saidi et al., 2009; Федосеева и др., 2010; Креславский и др., 2012).

Известно, что митохондрии могут как активировать (Krause, Durner, 2004; Kuzmin et al., 2004), так и подавлять (Lee et al., 2002) экспрессию стрессовых генов в процессе ретроградной регуляции. Предварительное мягкое тепловое воздействие, активирующее экспрессию БТШ, вызывает гиперполяризацию внутренней митохондриальной мембраны в клетках S. cerevisiae (Rikhvanov et al., 2005), в культуре клеток A. thaliana (Rikhvanov et al., 2007) и в культуре клеток млекопитающих (Balogh et al., 2005). Агенты, способные при данных экспериментальных условиях снижать потенциал на внутренней митохондриальной мембране (мтД\|/), подавляли также активацию экспрессии БТШ. На этом основании было сделано предположение, что повышение мтДу является одним из необходимых условий для активации экспрессии БТШ при тепловом стрессе (Rikhvanov et al., 2005, 2007). Причины повышения мтДу в клетках дрожжей и растений остаются неизвестными.

Для клеток животных показано, что повышение концентрации ионов кальция в цитоплазме ([Са2+]цит) сопровождается транспортом этого иона в митохондрии. Кальций в митохондриях активирует ферменты цикла Кребса, что, в свою очередь, сопровождается повышением мтДу (Robb-Gaspers et al., 1998). Очевидно, что аналогичная ситуация происходит в клетках животных и при тепловом стрессе (Balogh et al., 2005). Хотя существуют данные, что растительные митохондрии также участвуют в гомеостазе внутриклеточного кальция (Subbaiah et al., 1998; Logan, Knight, 2003), однако неизвестен механизм взаимодействия цитозольного кальция с митохондриями, а именно, может ли повышение уровня [Са2+]цит приводить к повышению потенциала на внутренней митохондриальной мембране и, следовательно, активировать экспрессию БТШ.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование роли кальция в митохондриальной регуляции экспрессии генов HSP104 S. cerevisiae и HSP101 A. thaliana при тепловом стрессе, действии регулятора кальциевого гомеостаза амиодарона (АМД) и протонофора карбонилцианидал(-хлорфенилгидразона (СССР).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить влияние амиодарона на жизнеспособность клеток S. cerevisiae и культуры клеток Л. thaliana,

2. Сравнить влияние амиодарона и СССР на экспрессию генов HSP104 и HSP101 и термотолерантность клеток при обычной температуре инкубации и тепловом стрессе.

3. Изучить роль транскрипционных факторов Msn2p/Msn4p в индукции синтеза Hspl04p в клетках S. cerevisiae при обработке амиодароном.

4. Изучить возможность модулирования амиодароном термотолерантности клеток 5. сегеушое в зависимости от наличия гена Н8Р104.

5. Исследовать влияние теплового стресса, амиодарона и СССР на уровень цитозольного кальция и потенциал внутренней митохондриальной мембраны в культуре клеток А. ЛаИапа.

Положение, выноснмое на защиту:

Митохондриальная регуляции экспрессии Н8Р101 и №Р104 в клетках А. ЛаИапа и & сегеушое происходит через взаимообусловленное изменение мембранного потенциала митохондрий и содержания ионов кальция в цитозоле.

Научная новизна работы.

Амиодарон - активатор кальциевых каналов на плазматической мембране клеток животных и дрожжей вызывает повышение мтДу в клетках дрожжей. В работе впервые показано, что этот агент оказывает аналогичное действие на клетки растений. Амиодарон вызывает повышение уровня кальция в цитозоле и гиперполяризацию митохондриальной мембраны в культуре клеток А. ¡ИаИапа. Впервые установлено, что амиодарон и СССР при обычной температуре инкубации индуцируют синтез Шр101р в клетках А. ¡ИаПапа и №р104р в клетках сегехч$1ае. Способность амиодарона индуцировать синтез №р104р в клетках & еелеушае зависит от наличия транскрипционных факторов М8п2р/М8п4р. Показано, что обработка амиодароном защищает клетки 5. еет-еушае от гибели при жестком тепловом шоке и этот эффект зависит от присутствия НврКМр.

Впервые продемонстрировано, что при обработке культуры клеток & сегеч'тае и А. IИаНапа протонофором СССР, деполяризующем митохондриальную мембрану, происходит увеличение уровня цитозольного кальция, индукция синтеза ШрКМр и НэрКИр, а также повышение термотолерантносги. Совместное действие СССР и теплового стресса оказывало аддитивный эффект на содержание кальция в цитозоле, что сопровождалось ингибированием экспрессии ШрКПрЛ. (ИаНапа.

Таким образом, полученные результаты указывают на важную роль ионов кальция в митохондриальной регуляции экспрессии ряда стрессовых белков и развитии термотолерантности клеток растений и дрожжей.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание физиологических механизмов активации экспрессии стрессовых генов с участием митохондрий растений и дрожжей. Показана связь между изменением уровня цитозольного кальция и потенциалом на внутренней митохондриальной мембране, которая играет важную роль в экспрессии стрессовых генов. В работе впервые получены данные о возможности роста термотолерантности дрожжей при действии агентов, модулирующих содержание цитоплазматического кальция.

Поскольку, амиодарон относительно безвреден для растительной клетки и в то же время обладает значительным фунгицидным эффектом, то амиодарон или агенты со сходным механизмом действия потенциально могут быть использованы для обеззараживания сельскохозяйственных растений.

Материалы диссертации могут быть включены в курсы лекций по генетике, экологии, физиологии и биохимии растений, использоваться в профильных научно-исследовательских институтах РАН, РАМН и РАСХН.

Публикации н апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Результаты исследования по теме диссертации были представлены в устных докладах на научной сессии СИФИБР СО РАН (Иркутск, 2012), на международной конференции «Plant genetics, genomics and biotechnology» (Irkutsk, 2012) и на VI международной научно-практической конференции «Научная дискуссия: вопросы физики, химии, биологии» (Москва, 2013).

Структура н обьем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (274 источников, в том числе 23 российских и 251 иностранных). Работа изложена на 161 странице, содержит 26 рисунков и 1 таблицу.

Личное участие автора в получении научных результатов. Автор лично принимал участие в планировании и проведении экспериментов, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов, а также в написании статей, опубликованных по результатам работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали следующие штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae: Ч'-74-D694 (МЛ Та adel-14(UGA) trpl-289(UAG) his3A-200 игаЗ-52 1еи2-3 112 [psf]), являющийся родительским типом для изогенного ему мутанта hspl04A, предоставлены проф. S. Lindquist (Институт биомедицинских исследований, Уайтхед, США), а также W303-1A (Mata ade2-l игаЗ-1 his3-l 1 15 1еи2-3 112 trpl-1 canl-100 SUC2), являющийся родительским типом для изогенного мутанта msn2Amsn4A, получены от к.б.н. Д.А. Кнорре (НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского при МГУ им. М.В. Ломоносова).

В работе также использовали культуру клеток Arabidopsis thaliana (L.) Heynh (раса Columbia), полученную из 14-ти дневных проростков, выращиваемую в темноте при 26 °С в среде (MS), содержащей соли по Murashige, Skoog (1962), 3 % сахарозы, 0,5 мг/мл тиамина, 0,5 мг/мл пиридоксина и 0,1 мг/мл 2,4-Д. Для экспериментов использовали 8-ми дневную культуру, что соответствовало второй половине логарифмической фазы роста, которая характеризуется наибольшей физиологической активностью клеток и наименьшим конститутивным уровнем синтеза БТШ.

Обработка клеток. Обработку клеток S. cerevisiae и клеток суспензионной культуры A. thaliana производили путем добавления концентрированных растворов действующих веществ в кулыуральную среду.

Оценка жизнеспособности. Количество жизнеспособных клеток дрожжей оценивали по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) капельным методом. Количество жизнеспособных клеток суспензионной культуры арабидопсиса оценивали по их способности восстанавливать 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (ТТХ) (Еникеев и др., 1995).

Выделение общего белка, электрофорез белков и Вестерн-блотгинг. Для

разрушения клеток биологический материал растирали с кварцевым песком в жидком азоте. Белковые фракции получали методом дифференциального центрифугирования из гомогенатов тканей. Электрофорез белков в ПААГе с ДДС-Na проводили по методу Лэммли (Laemrali, 1970), используя прибор для электрофореза Mini-PROTEAN Ш ("BIO-RAD", США). Перенос белков на нигроцеллюлозную мембрану ("Amersham", США)

и последующую обработку антителами проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.

ОТ-ПЦР-анализ. Тотальную РНК выделяли с помощью набора SV Total RNA Isolation System ("Promega", США). Для синтеза первой цепи кДНК использовали 1 мкг тотальной РНК, праймер oligo(dT)18 (20 рМ) и набор REVERTA ("АмплиСенс", Россия). Полуколичественный ОТ-ПЦР-анализ был выполнен при использовании кДНК в качестве матрицы (50 нг) и геноспецифичных праймеров (10 рМ каждого). Равные объемы ПЦР-продуктов разделяли в 1,5 % агарозном геле.

Микроскопия. Анализ клеток проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа AxioObserver Z1 ("Zeiss", Германия) с цифровой монохромной камерой AxioCam MRm3 и пакетом программного обеспечения для захвата и анализа изображений "AxioVision Rel.4.6". Визуализацию величины потенциала на внутренней митохондриальной мембране клеток A. thaliana проводили с использованием 5 мкМ потенциал-зависимого катионного красителя 5,5',6,6'-тетрахлор-1,1\2,2'-тетраэтилбензимидазоло-карбоцианина (JC-1) ("Fluka", Германия), для дрожжей использовали 5 мкМ потенциал-зависимого катионного красителя метилового эфира тетраметилродамина (TMRM) ("Invitrogen", США). Для количественной оценки интенсивность флуоресценции митохондрий обсчитывали статистически. Для определения уровня кальция в цитоплазме клеток A. thaliana использовали 15 мкМ флуоресцентного красителя Fluo-4/AM ("Invitrogen", США).

Статистическая обработка данных. Эксперименты повторяли не менее 3 раз. Полученные данные обработаны статистически: рассчитаны средние арифметические значения и их стандартные отклонения (Лакин, 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние АМД на жизнеспособность S. cerevisiae и культуры клеток

A. thaliana

Для изучения токсичного влияния АМД на дрожжи и культуру клеток A. thaliana использовали концентрации в диапазоне 0-100 мкМ. В соответствии с литературными данными (Pozniakovsky et al., 2005) обработку АМД клеток дрожжей проводили в течение 60 мин при 30 °С. Культуру клеток Л. thaliana обрабатывали АМД в течение 120 мин при 26 °С, поскольку одной из задач данного эксперимента являлось определение зависимости между индукцией синтеза БТШ и гибелью культуры клеток A. thaliana. Ранее было показано, что максимальная индукция синтеза БТШ в клетках A. thaliana наблюдалась после 120 мин теплового воздействия (Rikhvanov et al., 2007). Жизнеспособность S. cerevisiae определяли по способности клеток образовывать колонии (КОЕ), а для измерения жизнеспособности в культуре клеток A. thaliana использовали метод восстановления ТТХ. Обработка АМД сопровождалась гибелью клеток штамма W303-1A S. cerevisiae, которая возрастала с повышением концентрации агента. В концентрации 100 мкМ число жизнеспособных клеток снижалось на 90 % (рис. 1 а). Токсичный эффект АМД на культуру клеток A. thaliana был гораздо менее выражен. При обработке 100 мкМ АМД наблюдалось снижение количества жизнеспособных клеток A. thaliana на 40 % (рис. 1 б). Очевидно, что клетки растений гораздо более устойчивы к воздействию АМД, чем дрожжи.

120

н

0

г? юо ы

9 «80

1 §

0 =

1 *40 а

1 20 j

СО

о

(а)

н

н

ÉLÉL

о

са

120 100

о «О

ч

| 60 в

о

* 40 20 0

(б)

10 20 50 100

АМД, мкм

0 5 10 20 50 100 АМД, мкМ

Рис. 1. Влияние АМД на выживаемость клеток дрожжей 5. сегстг'-нае и культуры клеток А. ЛаЧапа.

а - Клетки штамма \V303-1A выращивали на среде с глюкозой и инкубировали при 30 °С 60 мин в присутствии АМД (0-100 мкМ). Затем клетки отмывали от агента и высевали на твердую питательную среду УЕРО. Количество образовавшихся колоний учитывали, спустя 48 часов инкубации при 30 °С. «=3; М±8.Е.

6 - Культуру клеток А. /ИаИапа выращивали на М8-среде, инкубировали при 26 или 37 °С 120 мин в присутствии АМД (0-100 мкМ). Затем клетки отмывали от агента, ресуспендировали в свежей среде и инкубировали при 26 °С в течение 120 мин. Количество живых клеток определяли, спустя 4В ч инкубации при 26 °С после обработки АМД по восстановлению ТТХ. и=3; М±8.Е.

Влияние АМД на содержание ЕТШ в клетках дрожжей S. cerevisiae

Поскольку АМД активирует экспрессию ряда стрессовых генов у дрожжей (Zhang, Rao, 2007), то для того чтобы установить связь между гибелью клеток и содержанием БТШ, дрожжи обрабатывали АМД, как это описано выше, и определяли содержание Hspl04p и HspóOp.

Обработка АМД клеток дрожжей штамма W303-1A приводила к увеличению содержания Hspl04p, которое возрастало с повышением концентрации агента (рис. 2). Содержание HspóOp при обработке АМД не изменялось, что позволяет использовать этот критерий в качестве показателя равномерной нагрузки белка на трек. Отчетливое повышение количества Hspl04p наблюдалось при концентрациях АМД 20, 50 и 100 мкМ. В то же время после теплового стресса при 39 °С количество Hspl04p было гораздо больше, чем при обработке АМД в любой из использованных концентраций (рис. 2).

АМД, мкМ

<->•

о 5 10 20 50 100 К39

..................... .....................„:::............Ilsp6(l[)

Рис. 2. Влияние АМД на содержание Hspl04p и HspóOp в клетках дрожжей штамма W303-1А.

Клетки дрожжей штамма W303-1A выращивали на среде с глюкозой, инкубировали 60 мин при 30 °С в присутствии 0-100 мкМ АМД. Для сравнения справа приведено содержание Hspl04p и HspóOp после инкубации при 39 °С в течение 60 мин (К39). Представлены данные типичного эксперимента (п=3).

Аналогичное повышение содержания Hspl04p при обработке АМД также наблюдалось при использовании штамма 4/-74-D694 (рис. 7 а). Следовательно, несмотря на то, что АМД оказывал ярко выраженное летальное действие на клетки дрожжей (рис. 1 а), он в тех же условиях повышал содержание Hspl04p (рис. 2).

Роль транскрипционных факторов Msn2p/Msn4p в повышении количества Hspl04p, индуцированного обработкой АМД

Известно, что экспрессия HSP104 при тепловом стрессе регулируется двумя независимыми друг от друга системами, которые включают в себя Hsf и транскрипционные факторы Msn2p/Msn4p (Рихванов, Войников, 2005; Yamamoto et al., 2008). Чтобы узнать через какую из этих систем АМД индуцирует синтез Hspl04p, использовали клетки дрожжей родительского типа штамма W303-1A и изогенного ему мутанта, у которого отсутствуют гены MSN2 и MSN4 (msn2Amsn4A). Количество Hspl04p резко возрастало при 39 °С как в клетках дрожжей родительского типа, так и в клетках двойного мутанта msn2Amsn4A (рис. 3), что свидетельствует о том, что в отсутствии транскрипционных факторов Msn2p/Msn4p повышение количества Hspl04p при тепловом стрессе определяется функционированием Hsf (Boy-Marcotte et al., 1999; Grably et al., 2002). Обработка АМД при обычной температуре инкубации увеличивала содержание Hspl04p в клетках родительского типа. Способность АМД индуцировать синтез Hspl04p снижалась в клетках мутанта msn2Amsn4A (рис. 3). Этот результат указывает на то, что АМД активирует экспрессию HSP104 в результате активации транскрипционных факторов Msn2p/Msn4p. АМД оказывал различный эффект на синтез Hspl04p при тепловом стрессе. Присутствие АМД при мягком тепловом стрессе не влияло на тепловую индукцию синтеза Hspl04p в клетках родительского типа, но подавляло повышение содержания этого белка в клетках двойного мутанта (рис. 3).

W303-1A msn2Amsn4A

КЗО АМДЗО К39 АМД39 К30 АМДЗО К39 АМД39

* " " ";1М: 1111 и ...........HspKMp

«www» я.......II»" ' 1......" «ЯШШ* ........ .11 » тяшW» Hsp60p

Рис. 3. Влияние мягкого теплового стресса и АМД на содержание Hspl04p и Hsp60p в клетках дрожжей штамма W303-1A родительского типа и изогенного ему мутанта по гену MSN2/MSN4 (msn2Amsn4A).

Клетки дрожжей штамма W303-1A выращивали на среде с глюкозой, инкубировали 30 мин при 30 °С в присутствии 0-100 мкМ АМД. Для сравнения справа приведено содержание Hspl04p и Hsp60p при 39 °С в течение 30 мин (К39). Представлены данные типичного эксперимента (п=3).

Влияние АМД на содержание и активацию экспрессии БТШ в культуре клеток A. thaliana

Поскольку обработка АМД в течение 120 мин вызывала гибель культуры клеток A. thaliana (рис. 1 б), для выявления зависимости между снижением жизнеспособности клеток и синтезом БТШ использовали ту же продолжительность обработки. Результаты, полученные с помощью вестерн-блоттинга, показали, что при обычной температуре инкубации содержание HsplOlp было незначительным, но резко возрастало при

8

обработке мягким тепловым стрессом (37 °С, 120 мин). Значительных изменений количества ШрбОр и Нвр70р не наблюдалось. Обработка АМД в течение 120 мин при 26 °С приводила к повышению содержания Нзр101р. Чем выше была концентрация агента, тем выше было количество белка (рис. 4 а). В то же время содержание НврШр при 37 °С было значительно выше, чем при обработке АМД. Таким образом, обработка АМД, как и в случае дрожжей, повышает содержание Нзр101р в клетках А. ЛаНапа.

Для того чтобы установить как АМД влияет на транскрипцию генов БТШ, изучали экспрессию генов Н8Р101 (а!1ё74310) и ШРбО (а13ё23990, а!2ё33210), используя метод полуколичественного ОТ-ПЦР анализа. В качестве контроля использовали ген 255 гЯЫА, экспрессия которого значительно не меняется в культуре клеток А. вшНапа во время стрессовых воздействий. Транскрипционные профили генов Н5Р101 и НБРбО в клетках, инкубированных при 26 °С в отсутствии или в присутствии АМД (рис. 4 5), в основном были схожи с данными, полученными с помощью вестерн-блоттинга (рис. 4 а). Обработка АМД концентрационно-зависимым образом повышала содержание транскриптов Н8Р101 и не оказывала влияния на содержание транскриптов НБРбО.

АМД, мкМ

(а)

*Hsp70p Hsp60p

АМД, мкМ

(6)

О 5 10 50 100 37 °С

0 5 10 20 50 100 37°С

»«—шин iispioip

HSP101

IISP60

25S rRNA

Рис. 4. Влияние АМД на содержание (а) и активацшо экспрессии БТШ (б) в культуре клеток A. thaliana.

Клетки A. thaliana инкубировали 120 мин при 26 "С в присутствии 0-100 мкМ АМД. Для сравнения справа приведено содержание белков или транскриптов после обработки при 37 °С, 120 мин. Представлены данные типичного эксперимента (п=3).

Влияние АМД на развитие термотолерантности в клетках дрожжей S. cerevisiae

Обработка АМД индуцирует синтез Hspl04p (рис. 2). В связи с этим изучали влияние этого агента на способность клеток дрожжей выдерживать повреждающее действие жесткого теплового шока в зависимости от присутствия Hspl04p. Для решения этой задачи использовали штамм 4J-74-D694 S. cerevisiae и изогенный ему мутант по

гену HSP104 (hspl04A).

Клетки дрожжей, выращенные при обычной температуре инкубации (30 °С) и подвергнутые жесткому тепловому шоку при 50 °С (10 мин), погибали (рис. 5 а). Однако, если дрожжи предварительно обработать мягким тепловым воздействием (39 °С, 30 мин), то в клетках развивалась индуцированная термотолерантность, их выживаемость повышалась в несколько раз (рис. 5 a). Sanchez и Lindquist (1990) показали, что в развитии индуцированной термотолерантности дрожжей ключевую роль

играет белок Hspl04p.

В соответствии с этими данными, у клеток дрожжей родительского типа после обработки мягким тепловым воздействием (39 °С, 30 мин) наблюдалось резкое

9

повышение содержания НэрКМр (рис. 5 б) и развивалась устойчивость к тепловому шоку (50 °С, 10 мин) (рис. 5 а). В то же время у изогенного данному штамму мутанта по гену Н8Р104 (/цр104А), у которого увеличения содержания ШрШр после обработки при 39 °С не происходило (рис. 5 б), развитие индуцированной термотолерантности резко снижалось (рис. 5 а).

100

90 -н 80 -° 70 ы" 60 8 § 50 £ о. 40

I | 30 1 20 1 Ю о

л «

(а)

□ 30 с

□ 39 С

¥-74-0694 Ь8рЮ4Д

*Р-74-В694 А эрША (б)

30 °С 39 °С 30 °С 39 °С

№р104р » НврбОр

Рис. 5. Влияние мягкого теплового стресса (39 °С) на развитие термотолерантносги (а) и содержание НэрКМр и НэрбОр (б) в клетках дрожжей штамма родительского типа Ч/-74-Об94 и изогенного ему мутанта по гену Н8Р104 [1ир104Ь). Выживаемость после действия теплового шока (50 °С), определяемая по _ подсчету КОЕ (а). п=3; М±8.Е. Содержание НэрКМр и НврбОр (б). Представлены данные типичного эксперимента (п=3).

Для того чтобы изучить влияние АМД на термотолерантность, подобрали такие условия, в которых АМД не оказывал бы самостоятельного токсичного действия на клетки дрожжей. Обработка дрожжей 20 мкМ АМД (30 мин) не оказывала значительного негативного влияния (рис. 6 а). Для определения влияния АМД на термотолерантность клетки дрожжей штамма Ч,-74-0694 и мутанта И$р104А инкубировали в присутствии 20 мкМ АМД (30 °С, 30 мин) и подвергали действию жесткого теплового шока при 50 "С (10 мин). Предварительная обработка АМД приводила к значительному повышению термотолерантности штамма родительского типа (рис. 6 б). Однако у клеток мутанта Изр104А эта способность была снижена (рис. 6 б).

140 120

§ 100

И 3

¿180 и Ь

II60

о *

2 40

оз

20 0

г-Н

(а)

□к

□АМД

<Р-74-0694 (рт)

К АМД

(6)

А ьрША К АМД

4-74-1)694 (рт) И*р104Л

0 О с> 0 О

V 2 О «г, 6 О о о

|4 О е.

1« ♦/V

8

Рис. 6. Влияние АМД на содержание НврШр и термотолерантность клеток дрожжей 5 сеге\тае.

Клетки дрожжей штамма ¥-74-0694 (родительский тип) и мутанта И*р104А инкубировали ПРИ °С 30 мин в присутствии 20 мкМ АМД. Определение жизнеспособности после обработки АМД (а) или после действия теплового шока (б). Выживаемость клеток определяли через 48 часов по подсчету КОЕ (а), п=3, М±8.Е. и с помощью репликатора (б) Представлены данные типичного эксперимента (п=3).

Таким образом, обработка АМД, так же как и мягкий тепловой стресс, защищает клетки дрожжей от гибели при жестком тепловом шоке и этот эффект зависит от присутствия гена HSP104.

Сравнение влияния АМД и СССР на индукцию синтеза БТШ и развитие термотолерантности клеток дрожжей S. cerevisiae

Известно, что АМД вызывает повышение уровня Са2+ в цитозоле ([Са2+]ц„) S. cerevisiae (Courchesne, Ozturk, 2003; Gupta et al., 2003). Поскольку обработка экзогенным кальцием индуцировала синтез Hspl04p и развитие термотолерантности (Федосеева и др., 2010), можно предположить, что именно повышение уровня [Са2+]цит обуславливает способность АМД увеличивать количество БТШ, что, в свою очередь, приводит к развитию термотолерантности клеток дрожжей. Протонофор СССР также вызывает повышение концентрации Са2+ в клетках S. cerevisiae (Eilam et al., 1990), поэтому на следующем этапе сравнивали влияние АМД и СССР на развитие термотолерантности дрожжевых клеток.

Клетки дрожжей штамма 4/-74-D694 инкубировали в присутствии АМД (20 мкМ) или СССР (20 мкМ), а также обоих этих агентов одновременно при 30 или 39 °С (30 мин). Обработка как СССР, так и АМД на среде с глюкозой при 30 °С вызывала значительное повышение количества Hspl04p. Совместное присутствие СССР и АМД не приводило к такому эффекту. Несмотря на то, что СССР увеличивал содержание Hspl04p при обычной температуре инкубации, добавление СССР во время теплового стресса 39 °С ингибировало повышение содержания этого белка (рис. 7 а). Повышение содержания Hspl04p при обработке АМД и СССР сопровождалось повышением термотолерантности клеток дрожжей к действию теплового шока. Обработка СССР и АМД по отдельности значительно повышала выживаемость клеток дрожжей, а совместная обработка этими агентами подавляла термотолерантность ниже контрольного уровня (рис. 7 б). Следовательно, СССР, как и АМД, обладает способностью увеличивать содержание Hspl04p и повышать термотолераптность.

30°С 39°С (а)

К АМД С АМД+С к С <-> <->

ЯШГП1ШШИ». ашп. ..« ......... Hsp6(lp

Рис. 7. Влияние АМД и СССР на термотолерантность и содержание Hspl04p в клетках дрожжей S. cerevisiae. а - Количество Hspl04p и Hsp60p. Представлены данные типичного эксперимента (п=3). 6 - Выживаемость после действия теплового шока (50 °С), определяемая по количеству КОЕ. п=3, M±S.E.

Клетки дрожжей штамма 4/-74-D694 инкубировали в течение 30 мин при 30 или 39 °С в присутствии 20 мкМ АМД, 20 мкМ СССР (С) или 20 мкМ АМД и 20 мкМ СССР (АМД + С) или в отсутствии этих агентов (К).

мин при 50°С

Сравнение влияния АМД и СССР на активацию экспрессии генов БТШ в культуре клеток А. ИхаИапа

Клетки культуры А. ¡ИаИапа инкубировали при 26 или 37 °С (120 мин) в присутствии или отсутствии СССР (4 мкМ) или АМД (50 мкМ) и выделяли тотальную РНК. В качестве контроля использовали гены домашнего хозяйства АСТ2 и 255' гША. Как и ожидалось, экспрессия Н8Р101 повышалась при обработке культуры клеток мягким тепловым стрессом (37 °С) (рис. 8). Активации экспрессии НБРбО не наблюдалось. Обработка 50 мкМ АМД активировала экспрессию #5/70/ при обычной температуре инкубации (26 °С, 120 мин). Если агент добавляли при 37 °С (120 мин), то он не оказывал значительного влияния на экспрессию Н5Р101. Обработка СССР (4 мкМ) также активировала экспрессию Н5Р101 при 26 °С. Однако в отличие от АМД обработка СССР при тепловом стрессе 37 °С ингибировала тепловую активацию экспрессии Н8Р101 (рис. 8). Полученные результаты указывают на то, что АМД и СССР активируют экспрессию БТШ в результате функционирования различных механизмов.

Рис. 8. Влияние АМД и СССР на активацию экспрессии БТШ в культуре клеток А. IИаИапа. Клетки А. ЛаНапа инкубировали в течение 120 мин при 26 "С или 37 °С в присутствии 50 мкМ АМД (АМД), 4 мкМ СССР (С) или в отсутствии этих агентов (К). Представлены данные типичного эксперимента (п=3).

Сравнение влияния АМД и СССР на развитие термотолерантности в культуре клеток A. thaliana

Как было установлено ранее, активацию экспрессии HSP101 в клетках A. thaliana вызывали как АМД, так и СССР (рис. 8). В связи с этим следовало выяснить, влияет ли обработка этими агентами на устойчивость клеток растений к тепловому шоку. Клетки суспензионной культуры A. thaliana обрабатывали АМД (50 мкМ) или СССР (4 мкМ) при 26 °С в течение 120 мин. Затем клетки несколько раз промывали MC-средой для удаления исследуемых веществ, ресуспендировали в свежей среде и инкубировали при 26 °С в течение 120 мин. После этого клетки подвергали действию повреждающего теплового шока (50 °С, 10 мин). Выживаемость клеток суспензионной культуры определяли после 48 ч инкубации при 26 °С по восстановлению ТТХ. Известно, что повышение экспрессии HSP101 при тепловом стрессе (рис. 8) играет ключевую роль в развитии термотолерантности растений (Queitsch et al., 2000; Hong, Vierling, 2000; Rikhvanov et al., 2007). Действительно, жизнеспособность клеток растений (К26), непосредственно подвергнутых тепловому шоку при 50 °С (10 мин), значительно снижалась. Однако предварительная обработка мягким тепловым воздействием при 37 °С (К37), приводила к активации экспрессии HSP101 (рис. 8) и развитию индуцированной термотолерантности (Rikhvanov et al., 2007; Richter et al., 2010) (рис. 9). Инкубация клеток в присутствии АМД как при 26 °С, так и при 37 °С не сопровождалась какими-либо изменениями в устойчивости клеток к тепловому шоку.

26 °С 37 °С

К АМД С К АМД С

Присутствие СССР при 26 °С несколько увеличивало устойчивость клеток А. ЛаИапа, однако при 37 °С СССР ингибировал развитие индуцированной термотолерантности. Способность СССР влиять на экспрессию генов БТШ в клетках растений при обычной температуре инкубации и при тепловом стрессе согласуется с результатами, полученными на клетках дрожжей (рис. 7). Несмотря на то, что при обработке АМД наблюдалась активация экспрессии Н8Р101 (рис. 8) в клетках А. ЛаИапа, развития термотолерантности при этом не происходило (рис. 9).

Рис. 9. Влияние АМД и СССР на термотолерантность клеток А. IЬаНапа. К - контроль; С - СССР; Ам - АМД. Стрелками внизу обозначены образцы, инкубированные при 26 или 37 °С в присутствии СССР или АМД или в отсутствии этих агентов (К), а затем подвергнутые тепловому шоку при 50 "С. Первые два столбца соответствуют контрольным образцам, которые не инкубировали при 50 "С. Выживаемость клеток определяли спустя 48 ч инкубации при 26 °С по восстановлению ТТХ. я=5; М±8.Е.

Изучение влияния АМД на потенциал внутренней митохондриальной мембраны в клетках S. cerevisiae и А. thaliana

На культурах клеток млекопитающих (Balogh et al., 2005), растений (Rikhvanov et al., 2007) и дрожжей (Rikhvanov et al., 2005) показано, что мягкий тепловой стресс повышает потенциал внутренней митохондриальной мембраны (мтДу). Pozniakovsky с соавторами (2005), используя потенциал-зависимый зонд Mitotracker orange показали, что обработка АМД вызывает повышение мтДу в клетках дрожжей S. cerevisiae. Аналогичные результаты были получены с помощью флуоресцентного зонда JC-1 (Knorre et al., 2008).

TMRM является потенциал-зависимым красителем, который накапливается в митохондриях пропорционально значению мтДу и флуоресцирует в красном свете (Scaduto, Grotyohann, 1999). В соответствии с ранее полученными результатами

Рис. 10. Влияние различных концентраций АМД на флуоресценцию TMRM в клетках дрожжей S. cerevisiae штамма W303-1 А.

Обсчет интенсивности флуоресценции TMRM после инкубации дрожжей в течение 10 мин при 30 или 39 °С на среде YEPD в присутствии 5-100 мкМ АМД. п=3; M±S.E.

120

100

80

х £40

20

Öl

К26К37 К Ам С <->

. 26 С

К Ам С <->

37 С,

50 С

1000

800

II

600

400

200

D0

i

КЗО 5 10 20 50 100 К39 АМД, мкМ

(ЮкИуапоу й а1., 2005) при обычной температуре инкубации (30 °С) флуоресценция ТМЯМ была незначительной и возрастала при мягком тепловом стрессе (39 °С) (рис.

10). Подтверждая данные, полученные Ро2шакоузку с соавторами (2005), обработка АМД (10 мин) при 30 °С приводила к повышению флуоресценции TMR.N1 в клетках штамма \V303-1 А, которая возрастала с повышением концентрации агента (рис. 10).

Дрожжи являются факультативными анаэробами и при росте на глюкозе -75 % энергетических потребностей удовлетворяют за счет брожения (Мепсо й а1., 2007). Соответственно, в этих условиях снижается интенсивность дыхания (КлкИуапоу е! а1., 2005), хотя и не подавляется при этом полностью. Поэтому флуоресценция ТМЯМ у дрожжей на среде с глюкозой (КЗО) была гораздо ниже, чем на среде с этанолом (рис.

11). Повышение флуоресценции ТМ1Ш в клетках дрожжей, использующих этанол в качестве источника энергии, свидетельствует о том, что изменение флуоресценции этого

Рис. 11. Влияние АМД на флуоресценцию ТМЯМ в клетках 1рожжей штамма \V303-1A в ¡ависимости от источника получаемой энергии.

Статистический обсчет интенсивности флуоресценции ТМЯМ после инкубации теток дрожжей в присутствии 20 мкМ \МД или в отсутствии этого агента при 50 (КЗО) или 39 °С (К39) на среде УЕРИ глюкоза) или УЕРЕ (этанол). п=3\ УЬБ.Е.

зонда корректно отражает изменение мтАу.

АМД и тепловой стресс вызывали повышение флуоресценции TMRM независимо от типа энергетического метаболизма. АМД в концентрации 20 мкМ вызывал примерно такое же увеличение, что и мягкий тепловой стресс при 39 °С (рис. 12 а и б).

Протонофор СССР эффективно подавлял повышение флуоресценции TMRM, индуцированное обработкой АМД (Ам+С), независимо от типа энергетического метаболизма (рис. 12 а и б). В то же время ингибитор III комплекса дыхательной цепи антимицин А незначительно ингибировал повышение флуоресценции TMRM на среде с глюкозой (рис. 12 а), но так же эффективно, как и СССР, ингибировал этот процесс на среде с этанолом (рис. 12 б).

В условиях бродильного метаболизма поддержание мтА\|/ у дрожжей может обеспечиваться за счет электрогенного транспорта АТФ4~ в обмен на АДФ3- через внутреннюю митохондриальную мембрану посредством транслокатора адениновых нуклеотидов (Traba et al., 2009; Физикова, 2011). Соответственно, антимицин А в этих условиях не будет влиять на мтДу. Таким образом, можно предполагать, что механизмы повышения мтД\|/ при обработке АМД различаются в зависимости от типа энергетического метаболизма. Аналогичный результат был получен ранее при изучении влияния теплового стресса на изменение мтА\|/ (Rikhvanov et al., 2005).

14

Ь к ° 3

г? а. 250 .. н

50 -

I

Глюкоза

(а)

КЗО АЗО С30 Ам Ам+ААм+С К39

300 250 200 150 100 50 0

Этанол

(б)

lft.PI II,

КЗО АЗО СЗО Ам Ам+ААм+С К39

Рис. 12. Влияние АМД, антимицина А и СССР на флуоресценцию ТМИМ в клетках дрожжей штамма \УЗОЗ-1А в зависимости от источника получаемой энергии. Обсчет интенсивности флуоресценции ТМЯМ после инкубации клеток дрожжей штамма \V303-1A в течение 10 мин при 30 или 39 °С в присутствии 20 мкМ АМД (Ам), 10 мкМ антимицина А (АЗО), 20 мкМ СССР (СЗО), 20 мкМ АМД и 10 мкМ антимицина А (Ам + А) или 20 мкМ АМД и 20 мкМ СССР (Ам + С) или в отсутствии этих агентов (КЗО, К39). п=3\ М±8.Е.

Обработка АМД клеток дрожжей повышала мтДу (рис. 10). Поэтому на следующем этапе изучали эффект АМД на мтДу культуры клеток А. ЛаИапа. Для этого использовали флуоресцентный краситель .1С-1, который при низких значениях митохондриального потенциала флуоресцирует в зеленом свете (зеленый канал), а при высоких значениях образует агрегаты, флуоресцирующие в красном свете (красный канал) (БаЫоН й а!., 1997). Обсчет интенсивности флуоресценции проводили в красном канале.

К26

АМД5

АМД10

АМД20

АМД50 АМД100 АМД100+СССР К37

Рис. 13. Влияние различных концентраций АМД и СССР на флуоресценцию .1С-1 (красный канал) в культуре клеток А. IНаИапа.

Клетки А. 1НаИапа инкубировали в течение 10 мин при 26 °С или 37 °С в присутствии АМД (0-100) или в его отсутствии (К). Бар равен 20 мкМ. Представлены данные типичного эксперимента (п=3).

В соответствии с ранее полученными результатами (ШкЬуапоу е1 а1., 2007), флуоресценция красителя в красном канале была незначительной при 26 °С и возрастала при мягком тепловом стрессе (37 °С) (рис. 13). Обработка АМД (10 мин) при 26 °С также сопровождалась повышением флуоресценции 1С-1, которая возрастала с увеличением концентрации агента (рис. 13). Изменение спектра флуоресценции .1С-1 с зелёного на красный указывает на повышение мтДу. Для того чтобы это доказать, использовали митохондриальный ингибитор антимицин А и протонофор СССР. Добавление как СССР, так и антимицина А значительно подавляло повышение флуоресценции .1С-1 в красном канале при обработке АМД (рис. 14). Действие этих агентов на флуоресценцию 1С-1 доказывает, что АМД вызывает гиперполяризацию внутренней митохондриапьной мембраны в культуре клеток А. вшИапа.

Рис. 14. Влияние АМД, антимицина А и СССР на флуоресценцию .Ю-] (красный канал) в культуре клеток А. ОшИапа.

Клетки А. ЛаИапа инкубировали при 26 °С в течение 10 мин в присутствии 20 мкМ АМД (Ам), 2 мкМ антимицина А (А), 4 мкМ СССР (С), 20 мкМ АМД и 2 мкМ антимицина А (Ам+А), 20 мкМ АМД и 4 мкМ СССР (Ам+С) или в отсутствии этих агентов (К26). и=3; М±8.Е.

1200

)S 2

= 1000

я

а

Л э 800 H 3

я „ 600 5 ч = 3

я s "00

TDdd.UOOU

Влияние АМД и СССР на уровень цитозольного Са2+ в клетках A. thaliana

Обработка АМД клеток дрожжей приводит к повышению уровня цитозольного Са2+ (Courchesne, Ozturk, 2003; Gupta et al., 2003; Muend, Rao, 2008; Yadav et al., 2007, Peña et al., 2009; Pozniakovsky et al., 2005). Поскольку неизвестно, как АМД влияет на содержание внутриклеточного кальция у растений, на следующем этапе изучали влияние этого агента на изменение уровня [Са2+]цит в клетках A. thaliana, используя флуоресцентный краситель Fluo-4AM. Fluo-4AM превращается в клетке во Fluo-4 в результате отщепления ацетоксиметилового эфира (AM - acetoxymethyl ester). Флуоресценция Fluo-4 при связывании с ионами Са2+ возрастает (Paredes et al., 2008). Для измерения уровня [Са2+]цит культуру клеток A. thaliana инкубировали при 26 °С в присутствии 15 мкМ Fluo-4AM (120 мин). Затем клетки обрабатывали 100 мкМ иономицина, 50-100 мкМ АМД при 26 °С (10 мин) и регистрировали изменение флуоресценции. В качестве дополнительного контроля использовали тепловой стресс 37 °С.

Иономицин - кальциевый ионофор, который приводит к искусственному повышению [Са2+]цит в растениях (Saidi et al., 2009). Как и ожидалось, обработка иономицином вызывала повышение флуоресценции Fluo-4 (рис. 15). Интенсивность флуоресценции при обработке иономицином была в 1,5 раза выше, чем в контроле. Этот

результат указывает, что изменение флуоресценции Fluo-4 отражает изменения в уровне цитозольного кальция клеток A. lhaliana.

В соответствии с литературными данными (Бияшева и др., 1993; Gong et al, 1998; Saidi et al., 2011), мягкий тепловой стресс 37 °C сопровождался повышением уровня цитозольного Са2+ в клетках A. lhaliana (рис. 15). Обработка клеток арабидопсиса 50 мкМ АМД приводила к повышению [Са2+]ц|1Тв 1,8 раза по отношению к контролю, в то время как обработка 100 мкМ АМД приводила к повышению Са2+ в цитозоле в 2,8 раза. Таким образом, АМД обладает способностью повышать уровень цитозольного кальция не только в клетках дрожжей (Gupta et al., 2003; Pozniakovsky et al., 2005; Muend, Rao, 2008; Pena et al., 2009), но и в клетках A. thaliana.

и.

К S Я Я

О

Я

I

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

Рис. 15. Влияние АМД на уровень цитозольного Са2+ в клетках А. IИаНапа. Культуру клеток А. IкаНапа инкубировали при 26 или 37 °С в присутствии 100 мкМ иономицина (И), 50 мкМ АМД (Ам50) или 100 мкМ АМД (АмЮО) или в отсутствии этих агентов. п=3\ М±8.Е.

К26

Ам50 АмЮО К37

Представленные выше результаты указывают на положительную зависимость между [Са2+]цит (рис. 15) и мтДч* (рис. 13) при обработке АМД культуры клеток А. ¡ИаИапа. С другой стороны известно, что протонофор СССР, деполяризующий митохондриапьную мембрану, также вызывает повышение [Са2+]цит в культуре клеток кукурузы (8иЬЬа1аЬ е1 а1., 1998). Поэтому в следующем эксперименте сравнили эффект АМД и СССР на уровень [Са2+]тт в культуре клеток А. ЛаНапа. Как и ожидалось, АМД

200

150

гг 100

АМД СССР К АМД СССР -> <->

Рис. 16. Влияние АМД и СССР на уровень цитозольного Са2+ в клетках А. /каИапа. Культуру клеток А. !ИаИала инкубировали при 26 или 37 °С в присутствии 50 мкМ АМД (АМД) или 4 мкМ СССР (СССР) или в отсутствии этих агентов (К). »=3; М±8.Е.

26 С

37 С

и СССР при обычной температуре инкубации (26 °С), а также тепловой стресс (37 °С) вызывали повышение [Са2+]ц„т (рис. 16). В то же время комбинированное действие теплового стресса и СССР имело аддитивный эффект. Уровень [Са2+]цит, наблюдаемый при действии теплового стресса в присутствии СССР, превышал эффект каждого из этих факторов в отдельности. Напротив, обработка АМД при 37 °С вызывала примерно такое же повышение [Са2+]цит, что тепловой стресс в отсутствии этого агента (рис. 16).

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты, полученные в настоящей работе, подтвердили литературные данные (Courchesne, 2002; Zhang, Rao, 2007; Serrano-Martín et al., 2009) о токсичности амиодарона (АМД) по отношению к клеткам дрожжей S. cerevisiae (рис. 1 а). Механизм летального действия АМД на клетки S, cerevisiae, вероятно, заключается в его способности вызывать кратковременное повышение кальция в цитозоле (Gupta et al., 2003), снижать внутриклеточный рН (Maresova et al., 2009; Peña et al., 2009), усиливать генерацию АФК (Pozniakovsky et al., 2005). Так же как и в случае клеток дрожжей, АМД вызывал в культуре клеток A. thaliana повышение потенциала на внутренней митохондриальной мембране (мтДу) (рис. 13), что является одной из причин усиления генерации АФК (Korshunov et al., 1997; Pozniakovsky et al., 2005), а также повышение уровня кальция в цитозоле (рис. 15 и 16). В то же время результаты показали, что клетки A. thaliana оказались гораздо более устойчивы к летальному действию АМД (рис. 1 б). Обработка АМД в течение 60 мин в концентрации 100 мкМ снижала жизнеспособность клеток S. cerevisiae на 90 % (рис. 1 а). Однако АМД в той же концентрации за 120 мин обработки снижал жизнеспособность клеток A. thaliana на 40 % (рис. 1 б). Таким образом, АМД относительно безвреден для растительной клетки и, в то же время, обладает значительным фунгицидным эффектом. Поскольку поражение растений патогенными грибами приводит к значительным потерям сельского хозяйства, то АМД или агенты со сходным механизмом действия потенциально могут быть использованы для обеззараживания сельскохозяйственных растений от вредителей.

Обработка АМД активировала экспрессию Hspl04p в клетках S. cerevisiae (рис. 2) и HsplOlp в клетках A. thaliana (рис. 4), несмотря на то, что при этих же условиях наблюдалось снижение жизнеспособности как дрожжей (рис. 1 а), так и растений (рис. 1 6). Такой эффект АМД отличается от описанного ранее действия теплового шока на экспрессию БТШ в клетках A. thaliana (Rikhvanov et al., 2007) и S. cerevisiae (Rikhvanov et al., 2005). Активация экспрессии БТШ наблюдалась только при тепловом воздействии, которое не оказывало негативного эффекта на жизнеспособность (Rikhvanov et al., 2005, 2007). Вероятно, что АМД нарушает механизм, регулирующий зависимость между экспрессией БТШ и активацией гибели в клетках растений и дрожжей. Тем не менее, обработка клеток дрожжей АМД в тех концентрациях, которые не оказывали негативного влияния на жизнеспособность, способствовала повышению их термотолерантности к повреждающему тепловому шоку (рис. 6 б), этот эффект зависел от присутствия Hspl04p (рис. 5 б).

Кальций играет разнообразную роль в жизнедеятельности клетки. В одних условиях он вызывает гибель клетки, в других, активирует экспрессию стрессовых генов, защищающих ее от гибели. Тепловой стресс вызывает кратковременное

18

повышение [Са2^]^ в клетках A. thaliana (рис. 15 и 16), что является одной из причин активации экспрессии БТШ у растений (Saidi et al., 2011). Зависимость между [Са2+]цит и экспрессией БТШ подтверждается в данной работе. АМД и СССР вызывают повышение [Са2+]ц„ в клетках S. cerevisiae (Gupta et al., 2003; Eilam et al., 1990) и в данной работе показано, что эти агенты индуцируют синтез Hspl04p у дрожжей (рис. 7 а). Аналогичным образом АМД и СССР при обычной температуре инкубации вызывали повышение [Са2+]циг в культуре клеток A. thaliana (рис. 16) и одновременно активировали экспрессию HSP101 (рис. 8). Однако АМД и СССР оказывали различный эффект на экспрессию БТШ при повышении температуры. Присутствие СССР во время теплового стресса ингибировало повышение содержания Hspl04p (рис. 7) и активацию экспрессии HSP101 (рис. 8), а АМД такого эффекта не оказывал. Сравнение эффекта СССР на экспрессию HSP101 и изменение [Са2+]ц„ при 37 °С показывает, что комбинированное действие СССР и теплового стресса приводило к аддитивному эффекту. При совместном действии двух факторов наблюдался наиболее высокий уровень [Са2+]щ„, который превышал эффект воздействия теплового стресса и СССР на этот показатель по отдельности (рис. 16). Чрезмерное повышение [Са2+]ШГ1 сопровождалось ингибированием экспрессии HSP101 (рис. 8). Для активации экспрессии БТШ при тепловом стрессе необходима конкретная пространственная и временная динамика изменения уровня Са2+ в цитозоле - сигнатура Са2+ (Медведев, 2005). Нарушение этой динамики может приводить не к активации, а к подавлению экспрессии БТШ у растений (Saidi et al., 2011). Вероятно, именно по этой причине СССР, повышая концентрацию Са2+ в цитозоле до критического уровня, ингибировал активацию экспрессии HSP104 и HSP10I при действии теплового стресса.

Регуляция экспрессии HSP104 и других генов БТШ в клетках S. cerevisiae осуществляется с помощью двух независимых систем - фактора теплового шока (Hsf, heat shock factor) и транскрипционных факторов Msn2p/Msn4p (Treger et al, 1998; Amoros, Estruch, 2001; Grably et al., 2002). В работе впервые показано, что способность АМД индуцировать синтез Hspl04p в клетках дрожжей зависит от присутствия факторов Msn2p/Msn4p (рис. 3). Есть основания полагать, что активация транскрипционных факторов Msn2p/Msn4p в клетках S. cerevisiae может зависеть от присутствия ионов Са2+ (Федосеева и др., 2010; Ohdate et al., 2010; Takatsume et al., 2010). Поскольку АМД повышает уровень [Са2+]щгг в клетках S. cerevisiae (Gupta et al., 2003), очевидно, что АМД индуцирует синтез Hspl04p в результате активации транскрипционных факторов Msn2p/Msn4p.

В клетках S. cerevisiae источником повышения [Са2+]цит при обработке АМД является поступление кальция внутрь клетки из внеклеточного пространства (Gupta et al., 2003). Показано, что АМД изменяет свойства плазматической мембраны, что и приводит к повышению [Са2+]1(ит (Gupta et al., 2003). В результате действия аналогичного механизма наблюдается повышение [Са2+]цит у растений при повышении температуры (Saidi et al., 2011). Напротив, повышение [Са2+]цит при обработке СССР, по-видимому, происходит в результате функционирования другого механизма. Показано, что СССР вызывал деполяризацию митохондриальной мембраны в культуре клеток кукурузы и выход Са2+, депонированного в митохондриях, в цитозоль (Subbaiah et al., 1998). Таким образом, повышение [Са2+],,ит до критического уровня в результате совместного

19

действия теплового стресса и СССР (рис. 16) является, по-видимому, следствием суммы двух одновременных процессов: поступления кальция в цитозоль через плазматическую мембрану и выхода кальция из митохондрий.

Полученные ранее результаты указывают на то, что экспрессия БТШ при тепловом стрессе зависит от изменения потенциала на внутренней митохондриальной мембране. Тепловой стресс вызывал повышение мтД\|/ в клетках дрожжей (ШкЬуапоу е1 а1., 2005), растений (ИкЬуапоу с! а1., 2005) и млекопитающих (Ва1о^ с! а1., 2005), и это событие, очевидно, является необходимым условием для активации экспрессии БТШ (ШкЬуапоу й а1., 2005, 2007). Зависимость между значением мтДу и экспрессией генов БТШ подтверждена в данной работе. Гиперполяризация митохондриальной мембраны (рис. 10 и 13) и активация экспрессии БТШ (рис. 2 и 4) наблюдались при тепловом стрессе и обработке АМД клеток 5. сегеч'шае и А. ¡ИаИапа. Однако зависимость между повышением мтДу и экспрессией БТШ не является абсолютной. Обработка АМД вызывала гораздо более значительное повышение мтДу, чем тепловой стресс (рис. 10, 13), однако экспрессия БТШ была выше при тепловом стрессе, чем при обработке АМД (рис. 2,4).

Вероятно, гиперполяризация внутренней митохондриальной мембраны при повышении температуры и обработке АМД является следствием повышения уровня Са2+ в цигозоле (рис. 17 а). Ва1о^ с соавторами (2005) показали, что в клетках млекопитающих при тепловом стрессе повышается [Са2+]Ц1ГГ, что сопровождается повышением мтДу. Аналогичным образом обработка АМД клеток 5. сеге^'Ыае приводила к увеличению содержания Са2+ в цитозоле и повышению мтДу, что дало основание предполагать связь между этими двумя явлениями (Рогшакоуэку е1 а1., 2005). Очевидно, что подобная зависимость выполняется и для растений. Тепловой стресс и обработка АМД вызывали гиперполяризацию митохондриальной мембраны (рис. 13) и повышение [Са^щт (рис. 15) в клетках А. IИаИапа.

Анализ результатов, а также литературных данных позволяет предположить следующую гипотетическую последовательность процесса митохондриальной ретроградной регуляции, активируемой в культуре клеток А. ЛаНапа при повышении температуры и обработке АМД. Тепловой стресс, а также обработка АМД вызывают изменение структуры плазматической мембраны. В результате активируются кальциевые каналы, и наблюдается повышение [Са24]^ (рис. 17 о). С одной стороны, повышение [Са2^]^ является причиной снижения жизнеспособности дрожжей и культуры клеток А. /ИаИапа (рис. 1), но с другой стороны, повышение [Са2+]ц,„ может активировать экспрессию ШР104 (рис. 7) и ШР101 (рис. 8). Поскольку длительное повышение уровня кальция в цитозоле имеет неблагоприятные последствия, то кальций транспортируется из цитозоля в митохондрии. Повышение концентрации Са2+ в митохондриях растительной клетки приводит к повышению мтДу. Повышение мтДу усиливает генерацию АФК (КогеЬипоу й а1., 1997; РогшакоУБку е1 а!., 2005).

Повышение генерации АФК до определенного уровня также может вносить вклад в активацию экспрессии БТШ (Уо1коу й а1., 2006; ЗшШ е1 а1., 2011). Чрезмерное повышение уровня АФК вызывает гибель клетки (рис. 1). Митохондрии, таким образом, изменяя потенциал на внутренней митохондриальной мембране, модулируют уровень

внутриклеточного Са2+ и АФК и, тем самым, осуществляют ретроградную регуляцию экспрессии тР104 и ШР101.

Иная последовательность событий наблюдается в случае обработки СССР дрожжей и культуры клеток А. ЛаНапа при обычной температуре инкубации (рис. 17 б). Протонофор СССР вызывает деполяризацию митохондриальной мембраны, что приводит к выходу Са2+, депонированного в митохондриях, в цитозоль (БиЫ^аЪ е1 а1., 1998). Повышение [Са2+]цит (рис. 16) активирует экспрессию Н8Р104 5. сегеуигае (рис. 7) Н5Р101 А. ¡ИаНапа (рис. 8). Однако деполяризация внутренней митохондриальной

Тепловой стресс или амиодарон

(б)

Тепловой стресс СССР

Рис. 17. Гипотетический механизм митохондриальной ретроградной регуляции экспрессии Н5Р104 5. сегеутае и И8Р101 А. ?ИаНапа при действии теплового стресса или амиодарона (а), СССР (б), а также комбинированного действия СССР и теплового стресса (в).

мембраны во время теплового стресса, во-первых, ингибирует удаление Ca из цитозоля в митохондрии, а, во-вторых, вызывает выход депонированного Са2+ из митохондрий в цитозоль (рис. 17 в). В результате [Са2+]цит повышается до критического уровня (рис. 16), при котором экспрессии HSP104 (рис. 7) и HSP101 (рис. 8) не происходит.

Полученные результаты свидетельствуют, что нарушение митохондриальных функций не только может активировать экспрессию генов БТШ растений, как это было показано другими исследователями (Krause, Durner, 2004; Kuzmin et al., 2004), но и подавлять активацию экспрессии БТШ при действии теплового стресса. Таким образом, очевидно, что митохондрии регулируют экспрессию ядерных генов растений как позитивным, так и негативным образом.

ВЫВОДЫ

1. Амиодарон в микромолярных концентрациях значительно снижает жизнеспособность дрожжей S. cerevisiae, но менее токсичен для культуры клеток А. thaliana.

2. Амиодарон и СССР при обычной температуре инкубации индуцируют синтез HsplOlp в клетках А. thaliana и Hspl04p в клетках S. cerevisiae.

3. Способность амиодарона индуцировать синтез Hspl04p в клетках S. cerevisiae зависит от наличия транскрипционных факторов Msn2p/Msn4p.

4. Амиодарон повышает термотолерантность клеток S. cerevisiae. Повышение термотолерантности зависит от присутствия гена HSP104.

5. Повышение содержания ионов кальция в цитозоле культуры клеток А. thaliana при обработке амиодароном и действии теплового стресса сопровождается гиперполяризацией внутренней митохондриальной мембраны.

6. Деполяризация внутренней митохондриальной мембраны при обработке СССР приводит к повышению содержания ионов кальция в цитозоле культуры клеток А. thaliana. Присутствие СССР при действии теплового стресса еще больше повышает уровень ионов кальция, что сопровождается ингибированием экспрессии HSP101.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

И.В. Федосеева, Д.В. Пятрнкас. H.H. Варакина, Т.М. Русалева, A.B. Степанов, Е.Г. Рихванов, Г.Б. Боровский, В.К. Войников. Влияние амиодарона на термотолерантность и синтез Hspl04p у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Биохимия. - 2012. -Т.77, №1. - С.99-109.

Д.В. Пятпчкас, И.В. Федосеева, Е.Г. Рихванов, Г.Б. Боровский. Эффект амиодарона на содержание HsplOlp и жизнеспособность культуры клеток Arabidopsis thaliana. VI международная научно-практическая конференция «Научная дискуссия: вопросы физики, химии, биологии», Москва, 2013, С.21.

Д.В. Пятрнкас. Е.Г. Рихванов, И.В. Федосеева, H.H. Варакина, Т.М. Русалева, Е.Л. Таусон, A.B. Степанов, Г.Б. Боровский, В.К. Войников. Митохондриальная ретроградная регуляция экспрессии HSP10I Arabidopsis thaliana при тепловом стрессе и действии амиодарона // Физиология растений.

Д.В. Пятрикас. И.В. Федосеева, Е.Г. Рихванов, Г.Б. Боровский. Влияние амиодарона и теплового стресса на содержание Hspl04p и HsplOlp и жизнеспособность клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae и культуры клеток Arabidopsis thaliana // Вестник ИрГТУ. - 2013. - С.

D.V. Pvatrikas. I.V. Fedoseeva, N.N. Varakina, T.M. Rusaleva, A.V. Stepanov, E.G. Rikhvanov, G.B. Borovskii, V.K. Voinikov. Amiodarone induces the synthesis of Hsps in Saccharomyces cerevisiae and Arabidopsis thaliana cells. The 2nd International conference «Plant genetics, genomics and biotechnology», Irkutsk, 2011, P.54.

Подписано к печати 14.02.2013 г. Формат 60*84/16. Объем 1,4 п л. Тираж 100 экз. Заказ № 582. Издательство Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН. 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 1.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пятрикас, Дарья Валерьевна, Иркутск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ СИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

Пятрикас Дарья Валерьевна

Роль кальция в митохондриальной регуляции экспрессии генов Н8Р104 ЗассИаготусеБ сегвУ151ае и Н5Р101 ЛгаЫйорБЬя МаИапа

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Диссертация на соискание ученой степени ^^ кандидата биологических наук

О

см

^ Научный руководитель:

Ю II доктор биологических наук,

профессор

V ю

О О Боровский Геннадий Борисович

СМ «

Иркутск-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..........................................................................6

1. ВВЕДЕНИЕ...........................................................................................8

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................14

2.1. Белки теплового шока.................................................................14

2.1.1. Классификация БТШ..............................................................15

2.1.2. Регуляция синтеза БТШ.........................................................20

2.2. Предполагаемые регуляторы активации экспрессии генов БТШ ........................................................................................................25

2.2.1. Гипотеза обратной связи........................................................25

2.2.2. Генерация активных форм кислорода..................................29

2.2.3. Повышение уровня кальция в цитозоле...............................31

2.3. Митохондриальная ретроградная регуляция............................34

2.3.1. Митохондриальная регуляция экспрессии БТШ при

тепловом стрессе...........................................................................................42

2.4. Амиодарон....................................................................................45

2.4.1. Эффект амиодарона на дрожжи сегеушяе.......................46

2.4.2. Фунгицидный эффект амиодарона.......................................46

2.5. Выводы из обзора литературы и формулирование цели исследования и задач........................................................................................53

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................58

3.1. Объекты и условия культивирования........................................58

3.2. Температурные обработки, обработка АМД, ингибиторами и разобщителями ЭТЦ.........................................................................................59

3.3. Определение жизнеспособности................................................60

3.3.1. Определение жизнеспособности по восстановлению ТТХ ..........:...............................................................................60

3.3.2. Определение жизнеспособности по подсчету колониеобразующих единиц.............................. ...........................................61

3.3.3. Определение жизнеспособности с помощью репликатора..................................................................................................61

3.4. Выделение суммарного белка.....................................................61

3.5. Электрофорез в ПААГе с ДДСЖа.............................................62

3.6. Окрашивание и обесцвечивание гелей......................................62

3.7. Вестерн-блоттинг.........................................................................62

3.7.1. Использованные антитела......................................................63

3.8. ОТ-ПЦР-анализ............................................................................64

3.8.1. Выделение РНК.......................................................................64

3.8.2. Синтез кДНК...........................................................................64

3.9. Флуоресцентная микроскопия....................................................64

3.9.1. Качественная визуализация величины потенциала на внутренней митохондриальной мембране..................................................66

3.9.2. Определение жизнеспособности по окраске флуоресцентными красителями ФДА и ПЙ...............................................67

3.10. Метод детекции изменения уровня Са в цитоплазме клеток А. ЖаНапа с помощью флуоресцентного красителя Р1ио-4/АМ..................67

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..................................................69

4.1. Изучение жизнеспособности клеток при действии АМД и высоких температур..........................................................................................69

4.1.1. Влияние АМД на жизнеспособность сегеушае...............69

4.1.2. Влияние теплового воздействия различной интенсивности на выживаемость клеток дрожжей & сегеушяе.........................................71

4.1.3. Влияние АМД на выживаемость культуры клеток А. МаИапа ...................................................................................................74

4.2. Изучение влияния АМД на содержание БТШ..........................76

4.2.1. Влияние АМД на содержание БТШ в клетках дрожжей 5". cerevisiae ...................................................................................................76

4.2.2. Влияние АМД на содержание и активацию экспрессии

БТШ в культуре клеток А МаИапа..............................................................79

3

4.2.3. Сравнение влияния АМД и СССР на активацию экспрессии генов БТШ в культуре клеток A. thaliana...................................................81

4.3. Влияние АМД на термотолерантность......................................83

4.3.1. Влияние АМД на развитие термотолерантности в клетках дрожжей S. cerevisiae....................................................................................83

4.3.2. Изучение влияния СССР на индукцию синтеза БТШ и развитие термотолерантности клеток дрожжей S. cerevisiae...................88

4.3.3. Сравнение влияния АМД и СССР на развитие термотолерантности в культуре клеток A. thaliana...................................92

4.4. Изучение влияния АМД на потенциал внутренней митохондриальной мембраны..........................................................................94

4.4.1. Изучение влияния АМД на потенциал внутренней митохондриальной мембраны в клетках S. cerevisiae...............................94

4.4.2. Изучение влияния АМД на потенциал внутренней митохондриальной мембраны в клетках A. thaliana..................................98

4.5. АМД как агент, индуцирующий повышение содержания ионов кальция в цитозоле..........................................................................................101

4.5.1. Влияние АМД и СССР на уровень цитозольного Са2+ в клетках A thaliana.......................................................................................101

4.6. Изучение влияния АМД на клетки S. cerevisiae с отсутствием транскрипционных факторов Msn2p/Msn4p................................................105

4.6.1. Роль транскрипционных факторов Msn2p/Msn4p в повышении количества Hspl04p, индуцированного обработкой АМД .....................................................................................105

4.6.2. Влияние АМД на потенциал внутренней митохондриальной мембраны в клетках дрожжей родительского типа и изогенного ему мутанта msn2Amsn4A...................................................................................107

5. ОБСУЖДЕНИЕ................................................................................108

5.1. Механизм токсичного действия АМД на клетки дрожжей

S. cerevisiae и растений A thaliana................................................................108

4

5.2. АМД как индуктор синтеза Hspl01p/Hspl04p в растительных и

дрожжевых клетках.........................................................................................110

5.3. АМД повышает термотолерантность клеток дрожжей в зависимости от присутствия Hspl04p...........................................................113

5.4. Механизм гиперполяризации внутренней мембраны митохондрий. Связь с активацией экспрессии генов БТШ........................114

5.5. Зависимость между уровнем кальция в цитозоле и гиперполяризацией внутренней митохондриальной мембраны................119

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................123

7. ВЫВОДЫ..........................................................................................130

8. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.............................131

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АА - антимицин А

АМД - амиодарон - 2-бутил-3-(3,5-дийод-4-диэтиламиноэтоксибензоил)-бензофуран

АОХ - альтернативная оксидаза АФК - активные формы кислорода БТШ - белки теплового шока

ДИК - дифференциально-интерференционный контраст

ДНФ - 2,4-динитрофенол

КОЕ - колониеобразующая единица

НАДФН - никотинамиддинуклеотидфосфат восстановленный

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

ПИ - пропидий иодид

ИКС - программируемая клеточная смерть

ТСБ - трис-солевой буфер

ТТХ - 2,3,5 - трифенилтетразолийхлорид

ЭГТА - (Этилендиокси) диэтилендинитротетрауксусная кислота

ФДА - флуоресцеин диацетат

ФМСФ - фенилметилсульфонилфлюорид

ЦГ - циклогексимид

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

[Са ]цит - цитоплазматический кальций

[Са ]мит - митохондриальный кальций

ААА+ - АТФазы, связанные с различными активностями клеток (ATPases associated with various cellular activities) CaM - кальмодулин

СССР - карбонилцианид ^и-хлорфенилгидразон (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone)

CTD - карбокси-концевой домен (carboxy-terminal domain) cyt с - цитохром с

DBD - ДНК-связывающий домен (DNA binding domain) DREB - dehydration-responsive element-binding

ESR - стрессовый ответ на абиотическое воздействие (environmental stress response)

FCCP - карбонилцианид-л-трифторметоксифенилгидразон (cyanide p-trifluoromethoxyphenyl hydrazone)

Fluo-4AM - 2-{[2-(2-{5-[бис(карбоксиметил)амино]-2-

метилфенокси}этокси)-4-(2,7-дифлюоро-6-гидрокси-3-оксо-3//-ксантен-9-

ил)фенил](карбоксиметил)амино} уксусная кислота (2-{[2-(2-{5-

[bis(carboxymethyl)amino]-2-methylphenoxy}ethoxy)-4-(2,7-difluoro-6-hydroxy-

3-oxo-3//-xanthen-9yl)phenyl]( carboxymethyl)amino} acetic acid)

HSE - элемент теплового шока (heat shock element)

Hsf - фактор теплового шока (heat-shock transcription factor)

Hsp - белок теплового шока (heat shock protein)

IP3 - инозитол 1,4,5, трифосфат (inositol 1,4,5-trisphosphate)

JC-1 - 5,5',6,6'-тетрахлоро-1,Г,2,2'-тетраэтилбензимидазол-карбоцианин

йодид (5,5',6,6'-tetrachloro-l,r,3,3'-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanine

iodide)

Msn2p/Msn4p - факторы транскрипции

мтА\|/ - потенциал на внутренней митохондриальной мембране

NBD - нуклеотид-связывающий домен (nucleotide binding domain )

NES - домен ядерного экспорта (nuclear export signal)

NLS - сигнал ядерной локализации (nuclear localization signal)

NTD - N-концевой домен (N-terminal domain)

STRE - элемент стрессового ответа (stress response element)

TMRM - метиловый эфир тетраметилродамина (tetramethylrhodamine

methylester)

YEPD - yeast extract, peptone, dextrose (питательная среда) YEPE - yeast extract, peptone, ethanol (питательная среда)

1. ВВЕДЕНИЕ

Митохондрии обладают собственной генетической системой. Однако, несмотря на это, большая часть белков, необходимых для их функционирования, кодируются ядерным геномом (Millar et al., 2005; Unseld et al., 1997). Согласованность в работе ядерного и митохондриального геномов в клетке осуществляется с помощью антероградного пути регуляции, в результате работы которого ядерная ДНК контролирует биогенез и функционирование митохондрий (Liu, Butow, 2006; Rhoads, Subbaiah, 2007; Юрина, Одинцова, 2008, 2010). Абиотические и биотические воздействия, а также мутации в митохондриальной ДНК могут изменять функционирование митохондрий. В ответ митохондрии активируют экспрессию ядерных генов. Этот процесс получил название митохондриальная ретроградная регуляция (Liu, Butow, 2006; Rhoads, Subbaiah, 2007; Юрина, Одинцова, 2008, 2010). Таким образом, митохондрии, влияя на экспрессию ядерных генов с помощью митохондриальной ретроградной регуляции, модулируют функционирование многих метаболических процессов. Так, например, установлено участие этих органелл в азотном метаболизме (Liu, Butow, 2006), старении (Liu, Butow, 2006; Cui et al., 2012), диауксотрофном переходе (Kitagaki et al., 2009) и др.

Нарушение функционирования митохондрий, с одной стороны, может активировать экспрессию стрессовых генов и приводить к развитию устойчивости клеток растений (Maxwell et al., 2002; Karpova et al., 2002; Dutilleul et al., 2003; Vidal et al., 2007), дрожжей (Traven et al., 2001; Moye-Rowley, 2005; Chan, Roth, 2008; Tani et al., 2008) и животных (Martinus et al., 1996; Biswas et al., 2005) к абиотическому и биотическому стрессам. С другой стороны, митохондриальная дисфункция может сопровождаться подавлением активации экспрессии ядерных генов в ответ на стрессовое воздействие (Lee et al., 2002).

Абиотический стресс вызывает кратковременное повышение уровня

кальция в цитозоле ([Са2+]цит) и усиление продукции АФК (Saidi et al., 2011).

8

Изменение в уровне этих сигнальных молекул имеет значение для активации экспрессии стрессовых генов, в том числе генов белков теплового шока или БТШ, которые защищают клетки растений и дрожжей от последующего повреждающего теплового воздействия (теплового шока) (Richter et al., 2010; Saidi et al., 2011). Очевидно, что митохондрии играют существенную роль в этих процессах. Показано, что при охлаждении и при действии осмотического стресса наблюдается повышение цитозольного кальция в клетках A. thaliana, которое сопровождается транспортом этого иона в митохондрии (Logan, Knight, 2003). Самые различные абиотические воздействия, включая повышение температуры, стимулируют митохондриальную продукцию АФК (Schwarzländer et al., 2009). Эти результаты дают основание предполагать, что митохондриальная ретроградная регуляция активируется при повышении температуры. Это предположение подтверждается рядом результатов, указывающих на связь между экспрессией БТШ у растений и функционированием митохондрий. Так, нарушение митохондриальных функций клеток А. thaliana в результате обработки бактериальным элиситором харпином приводило к активации экспрессии БТШ (Krause, Durner, 2004). Аналогичный эффект наблюдался в результате мутаций в митохондриальных генах Zea mays, кодирующих компоненты дыхательной цепи (Kuzmin et al., 2004).

Ранее было показано, что предварительное мягкое тепловое

воздействие (тепловой стресс), активирующее экспрессию БТШ, вызывает

гиперполяризацию внутренней митохондриальной мембраны в клетках S.

cerevisiae (Rikhvanov et al., 2005) и в культуре клеток А. thaliana (Rikhvanov et

al., 2007). Аналогичное явление было описано для культуры клеток

млекопитающих (Balogh et al., 2005). Агенты, способные при данных

экспериментальных условиях подавлять потенциал на внутренней мембране

митохондрий (мтА\|/), подавляли также активацию экспрессии БТШ

(Rikhvanov et al., 2005, 2007). Полученные результаты указывают, что

повышение мтА\|/ является необходимым условием для активации экспрессии

9

генов БТШ при тепловом стрессе (Balogh et al., 2005; Rikhvanov et al., 2005, 2007). Усиление продукции АФК является одним из условий для активации экспрессии генов БТШ при тепловом воздействии (Saidi et al., 2011), а продукция АФК, в свою очередь, может зависеть от значения мтА\|/ (Korshunov et al., 1997). На настоящий момент причины митохондриальной гиперполяризации при повышении температуры у растений и дрожжей неизвестны. Однако показано, что в клетках растений (Logan, Knight, 2003) и животных (Robb-Gaspers et al., 1998) повышение [Са2+]цит приводит к параллельному повышению уровня кальция в митохондриях. Предполагается, что в клетках животных повышение уровня митохондриального кальция может стимулировать активность дегидрогеназ цикла Кребса. Дегидрогеназы, в свою очередь, активируют транспорт электронов по дыхательной цепи, что, соответственно, повышает мтЛ\|/ (Robb-Gaspers et al., 1998). Очевидно, то же самое правило справедливо для клеток животных и при тепловом воздействии. Показана зависимость между повышением [Са ]цих, гиперполяризацией митохондриальной мембраны и индукцией синтеза Hsp70 при повышении температуры (Balogh et al., 2005). На основании этих результатов было сделано предположение, что повышение мтД\|/, наблюдаемое в клетках S. cerevisiae (Rikhvanov et al., 2005)

и A. thaliana (Rikhvanov et al., 2007) при действии теплового стресса, является

2+

следствием повышения [Са ]цит. Связь между уровнем цитозольного кальция и потенциалом на внутренней митохондриальной мембране была подтверждена для клеток дрожжей при изучении реакции на обработку амиодароном. Амиодарон вызывает в клетках S. cerevisiae повышение [Са2+]цит (Gupta et al., 2003) и гиперполяризацию внутренней митохондриальной мембраны (Pozniakovsky et al., 2005). Хотя митохондрии растительной клетки активно участвуют в гомеостазе внутриклеточного кальция (Subbaiah et al., 1998; Logan, Knight, 2003), остается неизвестным,

как изменение уровня кальция в цитозоле влияет на изменение потенциала на внутренней митохондриальной мембране у растений.

Чтобы ответить на этот вопрос, а также подтвердить зависимость между повышением мтД\|/ и активацией экспрессией генов БТШ, в настоящей работе изучили эффект амиодарона на изменение уровня кальция в цитозоле, потенциал на внутренней мембране митохондрий и активацию экспрессии БТШ в клетках S. cerevisiae и в культуре клеток A. thaliana.

Поскольку нарушение функционирования дыхательной цепи, как правило, деполяризует митохондриальную мембрану и приводит в ряде случаев к активации экспрессии генов БТШ (Kuzmin et al., 2004; Krause, Durner, 2004), в качестве дополнительного контроля использовали протонофор СССР, который эффективно снижает мтАу у дрожжей и растений.

Данная работа выполнялась в период с 2009 г. по 2012 г. в лаборатории физиологической генетики СИФИБР СО РАН.

Положение, выносимое на защиту:

Митохондриальная регуляции экспрессии HSP101 и HSP104 в клетках А. thaliana и S. cerevisiae происходит через взаимообусловленное изменение мембранного потенциала митохондрий и содержания ионов кальция в цитозоле.

Актуальность проблемы. Несмотря на то, что достаточно хорошо известно, как осуществляется регуляция экспрессии генов БТШ на транскрипционном уровне, механизм, вызывающий активацию транскрипционных факторов, остается во многом неизвестным. В последнее время все больше появляется данных о вероятном участии в активации транскрипции таких вторичных мессенджеров, как кальций и активные формы кислорода (АФК) (Reddy et al., 2011; Saidi et al., 2011), которые обладают способностью активировать экспрессию стрессовых генов, в том числе и генов БТШ (Trofimova et al., 1999; Moraitis, Curran, 2004; Volkov et

al., 2006; Колупаев, Карпец, 2009; Saidi et al., 2009; Федосеева и др., 2010; Креславский и др., 2012).

Известно, что митохондрии могут как активировать (Krause, Durner, 2004; Kuzmin et al., 2004), так и подавлять (Lee et al., 2002) экспрессию стрессовых генов в процессе ретроградной регуляции. Предварительное мягкое тепловое воздействие, активирующее экспрессию БТШ, вызывает гиперполяризацию внутренней митохондриальной мембраны в клетках S. cerevisiae (Rikhvanov et al., 2005), в культуре клеток A. thaliana (Rikhvanov et al., 2007) и в культуре клеток млекопитающих (Balogh et al., 2005). Агенты, способные при данных экспериментальных условиях снижать потенциал на внутренней митохондриальной мембране (мтДу), подавляли также активацию экспрессии БТШ. На этом