Митохондрия как критическое звено в ответе растительной и дрожжевой клетки на тепловое воздействие

Рихванов, Евгений Геннадьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Митохондрия как критическое звено в ответе растительной и дрожжевой клетки на тепловое воздействие
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Митохондрия как критическое звено в ответе растительной и дрожжевой клетки на тепловое воздействие"

РИХВАНОВ Евгений Геннадьевич

МИТОХОНДРИЯ КАК КРИТИЧЕСКОЕ ЗВЕНО В ОТВЕТЕ РАСТИТЕЛЬНОЙ И ДРОЖЖЕВОЙ КЛЕТКИ НА ТЕПЛОВОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Иркутск-2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук, г. Иркутск

Научный консультант:

доктор биологических наук,

профессор Войников Виктор Кириллович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Константинов Юрий Михайлович

доктор биологических наук,

профессор Щербаков Дмитрий Юрьевич

доктор биологических наук Тимофеева Ольга Арнольдовна Ведущая организация:

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского

Защита диссертации состоится « 11 » сентября 2012 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317. Факс (3952) 510754; e-mail: matm od@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Сибирского института физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН.

Автореферат разослан « 10 » июня 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 003.047.01, кандидат биологических наук

QjftHJMpf^ Г Л . Акимова

; ^--i ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Митохондрии являются энергетическими станциями, которые обеспечивают клетку энергией. Кроме производства АТФ, эти ор-ганеллы могут регулировать экспрессию ядерных генов в ходе процесса, известного как ретроградная регуляция (Rhoads et al., 2006). Предполагается, что важную роль в этом процессе играет способность митохондрий генерировать активные формы кислорода (АФК) и модулировать содержание ионов Са2+ в цитозоле (Юри-на, Одинцова, 2010).

Твердо установлено, что митохондрии принимают активное участие в инициации программированной гибели клеток (ПГК) (Wang, Youle, 2009). Гибель клеток в процессе ПГК также зависит от усиления митохондриальной продукции АФК (Perrone et al., 2008) и нарушения гомеостаза внутриклеточного кальция (Szabadkai, Duchen, 2008). Известно, что тепловой шок инициирует ПГК в клетках животных и растений (Gabai, Sherman, 2002; Reape, McCabe, 2010). Развитие ПГК наблюдается в клетках дрожжей после действия самых различных воздействий (Skulachev, 2002; Гордеева и др., 2004), но неизвестно, происходит ли подобное событие в дрожжевой клетке после теплового шока.

Усиление генерации АФК при повышении температуры вносит существенный вклад в активацию гибели растительной (Suzuki, Mittler, 2006) и дрожжевой клетки (Davidson et al., 1996). При этом механизм, в результате которого усиливается генерация АФК, остается неизвестным. Повышение концентрации Са2+ в цитозоле стимулирует генерацию АФК (Гордеева и др., 2003). Поэтому можно предполагать, что митохондрии дрожжей и растений, генерируя АФК, участвуя в регуляции уровня Са2+, играют важную роль в активации гибели клетки при тепловом шоке, а сам процесс происходит программируемым образом.

Чтобы защитить себя от повреждающего воздействия теплового шока, клетка синтезирует белки теплового шока (БТШ) (Richter et al., 2010). Считается, что БТШ, действуя в качестве молекулярных шаперонов, восстанавливают поврежденные при нагревании белки или, если это невозможно, способствуют их деградации в результате протеолиза (Kubota et al., 2009). В то же время известно, что БТШ, модулируя конформационное состояние определенных белков, могут подавлять либо, наоборот, активировать развитие ПГК в клетках животных (Arya et al., 2007). Выполняют ли подобную функцию БТШ растений и дрожжей, во многом остается неизвестным.

Другой важный вопрос, на который до сих пор нет четкого ответа, как активируется экспрессия БТШ? Классическая модель регуляции экспрессии генов БТШ, основанная на появлении в клетке денатурированных белков (Voellmy, Boellmann, 2007), не объясняет, почему агенты, которые не вызывают появления денатурированных белков, тем не менее, активируют экспрессию генов БТШ (Finka et al., 2011). С другой стороны, есть основания полагать, что усиление генерации АФК и повышение уровня кальция в цитозоле может как непосредственно, так и косвенным образом оказывать значительное влияние на экспрессию генов БТШ у растений (Saidi et al., 2011).

Таким образом, анализ литературных данных показывает, что усиление продукции АФК и повышение уровня кальция в цитозоле, с одной стороны, регулируют запуск механизма гибели, а с другой стороны, активируют экспрессию стрессовых генов, которые защищают клетку от гибели (Креславский и др., 2012). По-

скольку митохондрии являются одним из источников АФК (ВЫЛ¡па, Ра§егз1ес11:, 2010) и активно влияют на концентрацию кальция в клетке (Медведев, 2005), можно предполагать, что эти органеллы, модулируя содержание этих вторичных мес-сенджеров, определяют жизнь и смерть дрожжевой и растительной клетки после теплового воздействия.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение роли митохондрий растительной и дрожжевой клетки в запуске программы гибели и активации экспрессии генов белков теплового шока в ответ на тепловое воздействие.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить зависимость между способностью дрожжей расти при температурах выше оптимальной и способностью выдерживать кратковременное повреждающее действие теплового шока

2. Сравнить базовую термотолерантносгь дрожжей, различающихся по типу энергетического метаболизма.

3. Изучить эффект нарушения функционирования дыхательной цепи на изменение базовой термотолерантности и генерацию активных форм кислорода (АФК) при тепловом шоке в клетках дрожжей.

4. Установить зависимость между продукцией АФК в клетках БассИаготусе5 сегеу1яше и АгаЫс1ор!1$ ¡ИаПапа при тепловом шоке и гиперполяризацией внутренней митохондриальной мембраны.

5. Выявить признаки развития программированной гибели клеток (ПГК) после действия теплового шока различной интенсивности в клетках сегеушае и А. IИаПапа.

6. Определить эффект повышения уровня белков теплового шока (БТШ) на развитие признаков ПГК в клетках £ сегеушае и А. /ИаПапа после действия теплового шока.

7. Изучить зависимость между действием митохондриальных ингибиторов и разобщителей на развитие индуцированной термотолерантности, экспрессию генов белков теплового шока и изменение потенциала на внутренней митохондриальной мембране в клетках 5. сегечЫае и А. IИаПапа.

8. Изучить механизм повышения уровня кальция в цитозоле 5. сегеу'яше при тепловом стрессе и установить связь между этим явлением и функционированием митохондрий.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Дрожжи реализуют различные стратегии адаптации, чтобы существовать в условиях длительного повышения температуры и выдерживать повреждающее воздействие кратковременного теплового шока.

2. Механизмы гибели клеток дрожжей и растений при тепловом шоке существенно различаются в зависимости от интенсивности теплового воздействия. Гиперполяризация внутренней митохондриальной мембраны при умеренном тепловом шоке сопровождается повышением митохондриальной продукции активных форм кислорода, что является одной из причин гибели.

3. При умеренном тепловом шоке гибель клеток дрожжей и растений имеет признаки программированной гибели, которая подавляется в результате повышения количества БТШ.

4. Митохондрии растительной и дрожжевой клетки играют активную роль в развитии индуцированной термотолерантности к повреждающему тепловому шо-

ку. Гиперполяризация внутренней митохондриальной мембраны при мягком тепловом стрессе является необходимым условием для экспрессии генов БТШ.

Научная новизна работы. В результате сравнения способности различных видов дрожжей, а также мутантов се№1$1ае переносить повреждающее действие теплового шока и расти при температуре выше оптимальной продемонстрировано, что между этими двумя явлениями отсутствует зависимость. Клетки дрожжей, неспособные поддерживать рост при повышенной температуре, могут лучше сохранять жизнеспособность после кратковременного жесткого теплового шока.

Впервые проведено сравнение термотолерантности видов дрожжей, различающихся по типу энергетического метаболизма. Показано, что способность дрожжей переживать повреждающее действие теплового шока зависит от того, какой энергетический метаболизм, бродильный или окислительный, используют дрожжи. Активация окислительного энергетического метаболизма в клетках & cerevisiae сопровождается увеличением конститутивного синтеза НэрКМр и повышением термотолерантности.

Впервые показано, что повышение температуры вызывает гиперполяризацию внутренней митохондриальной мембраны в клетках 5. сегвушае и А. IИаНапа, что сопровождается усилением продукции АФК и снижением жизнеспособности. В клетках сегеушде гиперполяризация и значительное усиление продукции АФК наблюдаются при умеренном (45°С), но не при жестком тепловом шоке (50°С).

Анализ изучения параметров снижения жизнеспособности при умеренном тепловом шоке позволил впервые показать, что гибель дрожжей 51. сегеушае и А. IИаНапа имеет признаки программированной гибели клеток (ПГК): гиперполяризация внутренней митохондриальной мембраны, повышение продукции АФК, развитие процесса во времени и выход цитохрома с и ШрбОр из митохондрий. Гибель клеток се№1$1ае при умеренном тепловом шоке подавляется в результате мутации реШе и обработки циклогексимидом.

Изучение распределения цитоплазматического белка Нэр 101 р А. ¡каИапа между митохондриальной и цитоплазматической фракциями белков впервые позволило показать, что Нэр 101 р при тепловом стрессе локализуется преимущественно в митохондриальной фракции белков. Гомологичный ему белок Нэр104р сегеуЫае также обнаруживается в митохондриальной фракции клеток дрожжей.

Впервые показано, что повышение количества БТШ в результате предварительного теплового стресса ингибирует все наблюдаемые признаки развития ПГК в клетках растений и дрожжей, включая выход митохондриальных белков из митохондрий, повышение продукции АФК, а также снижает длительность гиперполяризации внутренней митохондриальной мембраны.

Установлено, что гиперполяризация внутренней митохондриальной мембраны является необходимым условием для активации экспрессии БТШ при тепловом стрессе. Агенты, которые при данных экспериментальных условиях подавляют гиперполяризацию, одновременно подавляют тепловую активацию экспрессии генов БТШ.

Изучен механизм повышения уровня кальция в цитозоле £ сегеушае при тепловом стрессе. Повышение концентрации Са2+ при повышении температуры происходит за счет функционирования низкоаффинной и высокоаффинной (М1<11р и СсЫр) систем транспорта Са2+ через плазматическую мембрану.

Впервые показано, что отсутствие белков М5сЗ 1р и СсЫр, регулирующих транспорт кальция через плазматическую мембрану, приводит к снижению потен-

циала на внутренней митохондриальной мембране и к подавлению дыхательной активности в клетках S. cerevisiae.

Научно-практическая значимость. Результаты, полученные в данной работе, позволили впервые доказать, что митохондрии растительной и дрожжевой клетки, модулируя продукцию активных форм кислорода (АФК) и участвуя в гомеостазе внутриклеточного кальция, определяют судьбу растительной и дрожжевой клетки при тепловом воздействии. В ответ на повышение температуры в клетке повышается потенциал на внутренней митохондриальной мембране, что в зависимости от интенсивности воздействия, либо запускает механизм гибели, либо активирует экспрессию белков теплового шока (БТШ), защищающих клетку от гибели. Способность митохондриальных ингибиторов и разобщителей, модулируя потенциал на внутренней митохондриальной мембране, ингибировать активацию экспрессии генов БТШ растений и дрожжей при тепловом стрессе, указывает, что обнаружен новый, ранее неизвестный, механизм, с помощью которого митохондрии регулируют экспрессию генов БТШ в ответ на стрессовое воздействие.

Изучение роли митохондрий в продукции АФК имеет огромное значение в связи с участием АФК в развитии многих заболеваний человека, таких как инсульт, инфаркт, нейродегенеративные заболевания. Понимание механизма образования АФК митохондриями может помочь в разработке новых терапевтических подходов и лекарственных средств для борьбы с этими заболеваниями. Описанный в работе феномен синергического действия теплового шока и митохондриальных ингибиторов на снижение жизнеспособности дрожжей может быть использован для разработки новых способов борьбы с патогенными микроорганизмами и лечения раковых опухолей, устойчивых к химиотерапии. В условиях глобального потепления и загрязнения окружающей среды антропогенными соединениями, влияющими на активность митохондрий, результаты диссертации могут быть использованы для оценки экологических и экономических рисков. Материалы диссертации могут быть включены в курсы лекций по генетике, экологии и физиологии растений, использоваться в профильных научно-исследовательских институтах РАН, РАМН и РАСХН.

Апробация работы. Результаты исследования по теме диссертации были представлены на международной конференции «Environmental stress, genetic adaptation and evolution" (Франция, 1998), Международном конгрессе FEBS «Special Meeting 2003 on Signal Transduction» (Бельгия, 2003), XXXII Международном конгрессе FEBS «Molecular machine» (Австрия, 2007), Съезде общества физиологов растений России (1999, 2003, 2011), Съезде Русского ботанического общества (Санкт-Петербург, 1998), Международной конференции "Российская биоэнергетика: от молекул к клетке" (Москва, 2005), Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, 2010), IX Международной конференции «Биология клеток in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008), Международной конференции «Проблемы современного картофелеводства» (Минск, 2008), Всероссийской научной конференции «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006), Всероссийской научной конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004), Всероссийской научной конференции «Структура и экспрессия митохондриального генома растений» (Иркутск, 2006), Всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2007), Всероссийской конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным фактором внешней среды» (Иркутск, 2009), Научной конференции

«Сохранение биологического разнообразия геотермальных рефугиев Байкальской Сибири» (Иркутск, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликована одна монография и 26 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, заключения, выводов, приложения, а также списка литературы (785 источников, в том числе 27 российских и 748 иностранных). Работа изложена на 371 странице, содержит 71 рисунок и 1 таблицу.

Личное участие автора в получении научных результатов. Автор являлся руководителем проектов РФФИ № 02-04-48275-а и РФФИ № 07-04-01177-а, а также исполнителем проектов РФФИ № 07-04-01055-а и № 10-04-00921-а, при поддержке которых выполнялась данная работа. Автор лично принимал участие в планировании и проведении экспериментов, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов, а также в написании статей, опубликованных по результатам работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали дрожжи Rhodotorula rubra и Debaryomyces vanrijiae, выделенные из горячих источников республики Бурятия, а также лабораторные штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans. Для проведения экспериментов дрожжи выращивали при 30°С на термостатируемой качалке на среде YEPD (с глюкозой), либо на среде YEPGal (с галактозой), либо на среде УЕРЕ (с этанолом) до достижения логарифмической или стационарной фазы роста. Для изучения люминесценции экворина использовали минимальную среду SC (Sherman, 1991).

В работе также использовали гетеротрофные культуры клеток растений: а) культуру клеток A. thaliana (L.) Heynh (раса Columbia), полученную д.б.н. К.З. Гамбургом; б) культуру клеток сахарного тростника Saccharum officinarum (сорт POJ2878), полученную в ИФР РАН, предоставленную к.б.н. В.Н. Шмаковым. Растительные культуры выращивали в темноте на термостатируемой качалке при 26°С на среде МС (Murashige, Scoog, 1962). Для экспериментов использовали культуру клеток, находящуюся в логарифмической фазе роста.

Определение жизнеспособности дрожжей проводили либо по количеству образовавшихся колониеобразующих единиц (КОЕ), либо с помощью окраски про-пидий иодидом (ПИ, 10 мкг/мл), который окрашивает мертвые клетки, и флуорес-цеин диацетатом (ФДА, 50 мкМ), который окрашивает живые клетки. Жизнеспособность растительных культур определяли по восстановлению 2,3,5 - трифенил-тетразолиум хлорида (ТТХ) (Еникеев и др., 1995). Адекватность определения жизнеспособности по восстановлению ТТХ подтверждали измерением жизнеспособности по отрастанию каллуса (Rikhvanov et al., 2007). Определение дыхательной активности дрожжей и растительных культур проводили полярографически, используя платиновый электрод закрытого типа (электрод Кларка) (Rikhvanov et al., 2005; 2007).

Для изучения эффекта агентов на базовую термотолерантность клетки обрабатывали указанными в тексте концен трациями и сразу же их подвергали тепловому воздействию. После окончания действия теплового шока клетки отмывали от ингибиторов и определяли жизнеспособность (Rikhvanov et al., 2002). Для изучения

действия ингибиторов на развитие индуцированной термотолерантности и экспрессию БТШ клетки дрожжей и растений обрабатывали исследуемыми агентами при обычной температуре инкубации или при тепловом стрессе. Затем клетки отмывали и, либо анализировали изменения в экспрессии БТШ, либо подвергали действию теплового шока и анализировали жизнеспособность (Rikhvanov et al., 2005; 2007).

Для выделения общей белковой фракции клетки ресуспендировали в буфере для выделения белка, замораживали жидким азотом и растирали с кварцевым песком. Для получения митохондриальной и цитоплазматической фракций растительные клетки и протопласты дрожжей разрушали в гомогенизаторе Даунса. Белковую фракцию отделяли от клеточных компонентов центрифугированием, белок осаждали холодным ацетоном и растворяли в буфере для образца. После разделения белков путем SDS-электрофореза проводили вестерн-блоттинг с соответствующими антителами (Rikhvanov et al., 2005; 2007).

Для ОТ-ПЦР-анализа тотальную РНК выделяли с помощью набора SV Total RNA Isolation System («Promega», USA). Для синтеза первой цепи кДНК использовали 1 мкг тотальной РНК, праймер oligo(dT)18, набор РЕВЕРТА («АмплиСенс», Москва). Полуколичественный ОТ-ПЦР-анализ проводили, используя кДНК в качестве матрицы и специфичные праймеры. Равные объемы ПЦР-продуктов разделяли в 1,5% агарозном геле.

Микроскопический анализ клеток проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа AxioObserver Z1 (Германия) с цифровой монохромной камерой AxioCam MRm3 и пакетом программного обеспечения для захвата и анализа изображений «AxioVision Rel.4.6». Определение потенциала на внутренней митохондриальной мембране клеток A. thaliana проводили с использованием 5-10 мкМ потенциал-зависимого катионного красителя JC-1. Для дрожжей использовали 1-5 мкМ потенциал-зависимого катионного красителя метилового эфира тетраметилродамина (TMRM). Для определения АФК использовали 1-50 мкМ дихлорфлуоресцеин диацетата (H2DCF DA).

Для изучения уровня внутриклеточного кальция использовали штаммы 5. cerevisiae, трансформированные плазмидой с геном апоэкворина. Для восстановления функционального экворина добавляли 1 мкМ целентеразина и инкубировали при 30°С в течение 60 мин в темноте. Люминесценцию после теплового стресса измеряли с временным интервалом в одну секунду с помощью люминометра LumiCounter 2500 (Microtech-Nichion Со., Funabashi, Japan). Условия теплового стресса в ячейке люминометра создавали, как описано (Torrecilla et al., 2000).

Эксперименты повторяли не менее 3 раз. Полученные экспериментальные данные обработаны статистически С использованием программы Microsoft Excel: рассчитаны средние арифметические величины и их ошибки. Представлены только результаты, попавшие в доверительный интервал 95% по критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Скорость роста и базовая термотолерантность дрожжей

Для изучения зависимости между способностью к росту при повышении температуры и способностью выдерживать кратковременный повреждающий тепловой шок использовали три вида дрожжей: R. rubra, S. cerevisiae и D. vanrijiae. Вид D. vanrijiae имел самую высокую максимальную температуру роста. Самую

низкую максимальную температуру роста имел стью подавлялся при 38°С (рис. 1а).

Определение способности дрожжей, выращенных при 30°С, выдерживать кратковременный тепловой шок (45°С, 60 мин) показало, что лучше всего сохраняли жизнеспособность клетки R. rubra, а хуже всего - D. vanrijiae (рис. 16). Таким образом, вид R. rubra имеет самую низкую максимальную температуру роста (рис. 1а), но лучше других видов сохраняет жизнеспособность после теплового шока 45°С (рис. 16). Наоборот, вид D. vanrijiae имеет самую высокую максимальную температуру роста (рис. 1а), но погибает быстрее, чем остальные виды дрожжей после обработки 45°С (рис. 16). Следовательно, способность дрожжей к росту при повышении температуры и способность выдерживать кратковременный повреждающий тепловой шок определяются различными механизмами. Предлагается под термином «термотолерантность» понимать способность организма выдерживать повреждающий тепловой шок, а под термином «теплолюбивость» — способность к росту при температурах выше оптимальной.

Измерение скорости роста при обычной температуре инкубации показало, что вид R. rubra имел самую низкую скорость роста при 30°С (рис. 1 в) и, в то же время, самую высокую базовую термотолерантность (рис. 16). Вид D. vanrijiae отличался самой высокой скоростью роста при 30°С (рис. 1в) и одновременно, самой низкой термотолерантностыо (рис. 16). Следовательно, в соответствии с работой (Lu et al., 2009), наблюдается обратная зависимость между скоростью роста дрожжей при обычной температуре инкубации и термотолерантностью изучаемых видов дрожжей. Чем медленнее скорость роста, тем выше термотолерантность.

Митохондрии и термотолерантность дрожжей

Для изучения термотолерантности дрожжей в зависимости от типа энергетического метаболизма использовали дрожжи D. vanrijiae и S. cerevisiae. Вид D. vanrijiae является облигатным аэробом, а вид S. cerevisiae -факультативным анаэробом. Клетки дрожжей выращивали на среде с глюкозой и галактозой

вид R. rubra. Рост R. rubra полно-

41 "С

0 15 30 45 60

Время при 45'С, мни

2 4 6 8

Врсмп при 3D С, ч

Рис. 1. Теплолюбивость (а), термотолерантность (б) и рост при 30°С (в) дрожжей R. rubra (Rr), D. vanrijiae (Dv) и S. cerevisiae (Sc). Дрожжи выращивали на среде с глюкозой при 30°С, затем либо (а) высевали на твердую среду и инкубировали 48 часов при 30, 38 и 41°С, либо (б) определяли жизнеспособность после теплового шока 45°С, либо (в) анализировали скорость роста при 30°С, п=3.

и обрабатывали при 45°С (60 мин). Клетки D. vcmrijicte утилизируют как глюкозу, так и галактозу за счет окислительного фосфорилирования. Не было обнаружено различий в термотолерантности этого вида при росте на галактозе или глюкозе (рис. 2а). Клетки 5. cerevisiae на среде с глюкозой получают энергию преимущественно за счет сбраживания, а на среде с галактозой за счет окислительного фосфорилирования. Оказалось, что на среде с галактозой клетки этого вида лучше переживали тепловой шок, чем на среде с глюкозой (рис. 26). Следовательно, дрожжи, использующие окислительный метаболизм. отличаются повышенной термотолерантностью.

Поскольку термотолерантность 5. cerevisiae зависит от синтеза Hspl04p (Richter et al., 2010), было измерено содержание Hspl04p в клетках S. cerevisiae, выращенных на разных источниках углерода. Как видно на рис. 3, на среде с галактозой при 26°С и при 30°С уровень конститутивного синтеза Hspl04p в клетках 5. cerevisiae был выше, чем на среде с глюкозой. Повышение температуры до 37°С индуцировало синтез Hspl04p примерно в одинаковой степени во всех вариантах эксперимента Следовательно, повышенная термотолерантность клеток 5. cerevisiae, использующих окислительный метаболизм (рис. 2а), сопровождается повышением конститутивного синтеза Hspl04p (рис. 3). Очевидно, высокий уровень конститутивного синтеза Hspl04p является одним из факторов повышения базовой термотолерантности дрожжей, использующих окислительный энергетический метаболизм.

Чтобы вычленить роль митохондрий в термотолерантности дрожжей, клетки выращивали на среде с глюкозой или галактозой, обрабатывали ингибитором IV комплекса дыхательной цепи азидом натрия и подвергали тепловому

Время при 45ПС\ мин

Рис. 2. Зависимость базовой термотолерантности от типа энергетического метаболизма дрожжей.

Дрожжи О. vanrijiae (а) и 5і. сегеушае, штамм \V303-IB (б) выращивали на среде с глюкозой (глю) или галактозой (гала) и инкубировали при 45°С, п=4-6, гп+5.Е.

глюкоза галактоза

26 30 37 26 30 37 °С

.....—ч.V™**"—" 1 1 Няр104р

Рис. 3. Синтез НБрІСМр в зависимости от типа энергетического метаболизма се^ізіае. Клетки штамма \V303-1B выращивали на среде с глюкозой или галактозой при 26 или 30°С и определяли синтез Нзр] 04р после теплового стресса 37°С (30 мин), п=3, типичный эксперимент.

воздействию при 45°С. Исследуемые виды дрожжей различным образом реагировали на добавление азида. Азид резко снижал термотолерантность клеток облигат-ного аэроба Д уапгуше как на среде с глюкозой, так и на среде с галактозой (рис. 4). В то же время, эффект азида на термотолераитность факультативного анаэроба 5'. сегеч'15\ае значительно различался в зависимости от того, на какой среде выращивали клетки. На среде с глюкозой азид существенно защищал клетки 5. сегеу 'тае от гибели, а на среде с галактозой защитного эффекта не наблюдалось. В этих условиях азид даже несколько снижал термотолерантность 5. сегеу/',у;с7г (рис. 4). Сходные результаты были получены при использовании других митохонд-риальных ингибиторов - цианида и мапоната (представлено в диссертации). Таким образом, эффект азида натрия, а также других митохондриальных ингибиторов на термотолерантность дрожжей зависит от типа энергетического метаболизма. В условиях бродильного метаболизма азид повышает термотолерантность дрожжей, а в условиях окислительного метаболизма, наоборот, снижает.

£>. \>апгЦ1ае 5. сегеуЫае

Время при 45"С, мин Время при 45"С, мин

Рис. 4. Действие азида натрия на термотолерантность дрожжей на среде с глюкозой и галактозой.

Дрожжи О. vanhjiae и 5. сегеУ131ае, штамм Ч/-74-0694, выращивали на среде с глюкозой и галактозой, инкубировали при 30°С или при 45°С в отсутствии (К) или присутствии 0,15 мМ ЫаЫ3 (А). Жизнеспособность определяли по образованию КОЕ, п=4-8, т+Б.Е.

Противоположный эффект азида на термотолерантность дрожжей в зависимости от типа энергетического метаболизма позволил предположить, что митохондрии могут являться одной из причин гибели дрожжей. Чтобы проверить это предположение, провели сравнение термотолерантности клеток родительского типа S. cerevisiae и мутанта petite. Мутанты petite не могут дышать в результате утраты митохондриальной ДНК (Tzagoloff, Myers, 1986). Мутант petite гораздо лучше переживал обработку 45°С, чем родительский тип. Однако при температуре 50°С такой разницы не наблюдалось. Напротив, после теплового шока 50°С клетки мутанта petite были менее термотолерантными, чем клетки родительского типа (рис. 5).

Рис. 5. Влияние мутации дыхательной недостаточности (мутации petite) на термотолерантность S. cerevisiae.

Клетки штамма родительского типа, штамм W303-IB (РТ) и мутанта дыхательной недостаточности (А/) выращивали на среде с глюкозой и инкубировали при 45°С и 50°С. Жизнеспособность определяли по образованию КОЕ, n=4, m+S.E.

При повышении температуры у растений и дрожжей наблюдается усиление генерации АФК (Davidson et al., 1996; Saidi et al., 2011). Для измерения продукции АФК клетки родительского типа S. cerevisiae и petite мутанта подвергали действию теплового шока при 45°С. Продукцию АФК измеряли по интенсивности флуоресценции DCF. Тепловой шок при 45°С приводил к резкому усилению генерации АФК в клетках родительского типа. Усиление генерации АФК наблюдалось также и у petite мутанта, но в значительно меньшей степени (рис. 6). Следовательно, мутация petite подавляет генерацию АФК при тепловом шоке, что сопровождается повышением термотолерантности (рис. 5).

Далее изучили, как обработка азидом и протонофором ДНФ повлияет на генерацию АФК при тепловом шоке при 45°С. Усиление генерации АФК происходило независимо от типа энергетического метаболизма 5. cerevisiae. Повышение флуоресценции DCF наблюдалось в клетках дрожжей, выращенных на глюкозе и этаноле (рис. 7). Обработка азидом и ДНФ подавляла генерацию АФК у дрожжей, выращенных на среде с глюкозой. Наоборот, азид и ДНФ стимулировали продукцию АФК при тепловом шоке в клетках, выращенных на несбраживаемом источнике углерода - этаноле (рис. 7). Таким образом, механизм образования АФК у дрожжей различается в зависимости от типа энергетического метаболизма. По-

0,1

0,001

О 15 30 45 60 Время при 45°С, мин

О 3 6 9 12 Время при 50°С, мин

скольку нарушение функционирования митохондрий в результате мутации petite или обработки азидом и ДНФ подавляет или стимулирует генерацию АФК при тепловом шоке, очевидно, что одним из источников АФК являются митохондрии. Подавление азидом генерации АФК на среде с глюкозой сопровождалось повышением термотолерантности и, наоборот, стимуляция азидом генерации АФК в условиях окислительного энергетического метаболизма приводила к снижению термотолерантности (рис. 4). Следовательно, митохондриальная продукция АФК вносит существенный вклад в гибель клетки при тепловом шоке 45°С.

- + -РТ30 —0—РТ45 —к— M30 -ÎT-M45

глюкоза ФК DCF

этанол ФК DCF

О 15 30 45 60

Время при 45°С, мин

Рис. 6. Генерация АФК при тепловом шоке в клетках родительского типа S. cerevisiae и мутанта petite. Клетки родительского типа, РТ (W303-1В) и мутанта petite (M) выращивали на среде с глюкозой, инкубировали при 30 или 45°С в присутствии 40 мкМ bbDCF DA. Представлены данные типичного эксперимента, п=3.

К45

А45

Д45

Рис. 7. Эффект азида и ДНФ на генерацию АФК в клетках 5. се№151ае при тепловом шоке.

Клетки 5. сегеуи/'ае (штамм Т-74-0694) выращивали на среде с глюкозой или этанолом, обрабатывали 0,15 мМ ЫаЫ3 (А) или 1 мМ ДНФ (Д) и инкубировали при 45°С (30 мин) в присутствии 50 мкМ НзОСР ЭА, п=3. ФК - фазовый контраст. Масштабная линейка - 10 мкм.

Гиперполяризация внутренней митохондрнальной мембраны, связь с продукцией АФК

Согласно гипотезе В.П. Скулачева (8ки1асЬеу, 1998), генерация АФК митохондриями происходит при повышении потенциала на внутренней митохондриаль-ной мембране (мтД\|/). Чтобы изучить изменение мтД\|/ в клетках дрожжей, использовали флуоресцентный краситель ТМЯМ. Этот краситель накапливается в митохондриях в зависимости от мтДу (БсасШК), Ого1уо1шпп, 1999). Повышение температуры до 39°С приводило к увеличению флуоресценции ТМЯМ в клетках 5. сегеч'тае, растущих на глюкозе. Еще более значительное увеличение наблюдалось при 45°С (рис. 8). В клетках 5. сегеушае, растущих на этаноле, значительная флуоресценция ТМЯМ наблюдалась и в контроле (30°С), а повышение температуры до 39°С приводило к еще большему увеличению. Следовательно, повышение флуоресценции ТМЯМ при повышении температуры происходит независимо от типа энергетического метаболизма.

i. нокогл

Рис. 8. Умеренный тепловой шок вызывает гиперполяризацию внутренней митохондри-апьной мембраны в клетках 5. cerevisiae.

Клетки штамма T-74-D694 выращивали на среде с глюкозой или с этанолом и обрабатывали в присутствии 1 мкМ TMRM при 30, 39 и 45°С (10 мин). ДИК - дифференциально-интерференционный контраст, УК - улучшенный контраст. Масштабная линейка - 10 мкм.

Чтобы подтвердить, что наблюдаемое нами повышение флуоресценции TMRM при тепловом шоке отражает реальное изменение мтД\|/, использовали FCCP (карбонилцианид-л-трифторметоксифенилгидразон), агент, который снижает митохондриальный потенциал. Добавление FCCP при 45°С приводило к полному гашению флуоресценции, однако при 50°С подавляющий эффект FCCP отсутствовал (рис. 9). Полученные данные указывают, что при 50°С TMRM накапливается в дрожжах в результате неспецифичного поступления в клетки, а при 45°С его флуоресценция зависит от повышения мтД*|/.

(а)

4000

3000

2000

1000

(б) 1500

■9 & i> Л

30 39 45 50 60 Температура °С

Рис. 9. Сравнение интенсивности гиперполяризации внутренней митохондриапьной мембраны и генерации АФК в клетках S. cerevisiae при тепловом шоке.

Клетки S. cerevisiae (штамм 4/-74-D694) выращивали на среде с глюкозой и инкубировали при указанных температурах в течение 10 (TMRM) и 30 мин (H,DCF DA) в присутствии 1 мкМ TMRM или 50 мкМ H,DCF DA. (а) Обсчет интенсивности флуоресценции TMRM в отсутствии или присутствии 20 мкМ FCCP, n=4, m+S.E. (б) Обсчет интенсивности флуоресценции H,DCF DA, п=3, m+S.E.

Сравнение продукции АФК и значения мтДу (рис. 9) показало, что наиболее высокий уровень продукции АФК наблюдался в клетках дрожжей при температуре 45°С. Одновременно при этой температуре наблюдалось наиболее высокое значение мтД\|/. При температуре 50°С уровень продукции АФК был незначителен. В этих условиях повышения мтДу не происходит, поскольку FCCP не подавляет флуоресценцию TMRM (рис. 9).

В обычных условиях митохондрии являются основным источником АФК в гетеротрофной культуре растений (Blokhina, Fagersledt, 2010). Чтобы изучить изменение митохондриального потенциала в клетках арабидопсиса, использовали другой потенциал-зависимый зонд JC-1. В митохондриях с высоким значением потенциала JC-1 образует агрегаты, флуоресцирующие в красном свете (Dressler et al., 2006). Сравнение уровня образования АФК в клетках А. thaliana и мтД*|/ при тепловом шоке показало, что наблюдается линейная зависимость между этими показателями. Повышение мтД\|/ сопровождается усилением продукции АФК (рис. 10). Зависимость между образованием АФК и повышением мтДу при тепловом шоке в клетках дрожжей и растений указывает на причинно-следственную связь между этими явлениями.

гнперполярнзацця

50"С

Продукция АФК

, -, -. • - ' -чЧ . , 's ' ■ V-

"-Л

WjJ) Ж D 55

ДИК

JC-1 кк

дик

DCF

Рис. 10. Гиперполяризация внутренней митохондриальной мембраны и продукция АФК в клетках A. tlialicina при тепловом шоке.

Клетки A. thaliana инкубировали при 26, 37, 39, 43, 46 или 50°С в присутствии 10 мкМ JC-1 или 1 мкМ H2DCF DA (10 мин). ДИК - дифференциально-интерференционный контраст, КК - красный канал. Масштабная линейка - 20 мкм. Представлен результат типичного эксперимента, п=3.

Механизмы гибели клетки при тепловом шоке

Способность мутации petite защищать клетки от гибели (рис. 5) и усиление генерации АФК (рис. 9) указывает, что гибель клеток S. cerevisiae при 45°С имеет признаки программированной гибели клеток (ПГК). Развитие ПГК требует активного белкового синтеза, а ингибитор белкового синтеза циклогексимид (ЦГ) подав-

ляет развитие ПГК в клетках млекопитающих и дрожжей (5ки1асИеу, 2002). Чтобы изучить эффект ЦГ на жизнеспособность, клетки 5. сегеуи/ое обрабатывали этим агентом в течение 30 мин при 30°С и определяли жизнеспособность после теплового шока 45°С. Обработка ЦГ значительно повышала термотолерантность клеток дрожжей к тепловому воздействию 45°С (рис. 11а), но этого не наблюдалось при 50°С (рис. 116).

Время при 45ПС, мин Время при 50°С, мни

Рис. 11. Эффект циклогексимида на термотолерантность S. cerevisiae. Клетки штамма W303-1B выращивали на среде с глюкозой, обрабатывали при 30°С (30 мин) в присутствии 20 мкг/мл циклогексимида (ЦГ) или без него (К) и подвергали тепловому воздействию при 45°С или 50°С, n=4-6, m+S.E.

Таким образом, способность ЦГ повышать термотолерантность указывает, что гибель клеток дрожжей зависит от синтеза белков de novo, а развитие гибели при умеренном тепловом шоке происходит программируемым образом. Различный эффект ЦГ на термотолерантность клеток S. cerevisiae при 45 и 50°С свидетельствует, что механизмы гибели клетки существенно различаются в зависимости от интенсивности теплового воздействия. Этот вывод подтверждает результаты, демонстрирующие различный эффект мутации petite на термотолерантность 5. cerevisiae при жестком и умеренном тепловом шоке (рис. 5).

Развитие ПГК в клетках растений после теплового шока не приводит к мгновенной гибели. Большая часть клеток остается живой сразу же после теплового воздействия. Гибель наступает во время инкубации при обычной температуре (Locato et al., 2009). Чтобы изучить динамику гибели S. cerevisiae, клетки обрабатывали при 45°С (30 мин) и спустя 0-96 ч инкубации при 30°С проводили подсчет живых и мертвых клеток путем окрашивания ФДА и ПИ. Сразу же после окончания теплового шока 45°С все 100% клеток окрашивались как живые (рис. 12). Появление мертвых клеток наблюдалось спустя 8 ч инкубации при 30°С, а через 24 ч погибало 90% клеток. Через 96 ч клетки, пережившие шок, приступали к делению. Количество живых клеток после теплового шока 50°С существенно не изменялось на протяжении 48 ч инкубации при 30°С, но спустя 72 ч их число резко снижалось (рис. 12).

100

¿60 с

+ 40

20 0

0 4 8 12 16 20 24 72

Время при 30"С, ч

Рис. 12. Динамика снижения жизнеспособности клеток 5. сегеу1.ч!ае после теплового шока.

Клетки штамма 4^74-0694 выращивали на среде с глюкозой, обрабатывали при 45 и 50°С (30 мин). Жизнеспособность определяли окрашиванием 50 мкМ ФДА и 5 мкг/мл ПИ, спустя 0-96 ч инкубации при 30°С, п=3, гп+Б.Е.

Чтобы изучить динамику гибели клеток А. IИаИапа, культуру обрабатывали при 50°С (10 мин) и измеряли жизнеспособность по восстановлению ТТХ во время восстановительного периода при 26°С. Сразу же после теплового шока жизнеспособность клеток уменьшалась на 30%. Инкубация при 26°С приводила к дальнейшему снижению жизнеспособности клеток арабидопсиса (рис. 13а). Временная динамика снижения жизнеспособности в точности соответствовала степени деградации ядерной ДНК. Деградация ДНК в контрольных клетках и в клетках, отобранных сразу же после теплового шока 50°С. не наблюдалась, но через 24 ч инкубации при 26°С ДНК подвергалась значительному разрушению (рис. 136). Таким образом, гибель клеток дрожжей и арабидопсиса после теплового шока развивается во времени, что свидетельствует об активном характере процесса.

(а)

г-

8 -

гіп

26"С

50°С 24 36 48

0 6 24 36 48 54 ч Время при 26"С после 50"С

26°С

50°С 24 36

0 6 24 36 48 54 ч Время при 26°С после 50°С

Рис. 13. Динамика снижения жизнеспособности культуры клеток А. Оіаііапа после теплового шока 50°С. Клетки А. Міста обрабатывали при 50°С (10 мин) и инкубировали 0-54 ч при 26°С. (а) Динамика восстановления ТТХ; п=3, т+5.Е. (б) динамика деградации ДНК, п=3.

Цитохром с, освобождаемый из митохондрий, действует как важный посредник в инициации ПГК (Wang. Youle, 2009). Для изучения изменения локализации цитохрома с при тепловом шоке, клетки S. cerevisiae обрабатывали при 45°С (30 мин) и выделяли митохондриапьную и цитоплазматическую фракции белков. В обычных условиях инкубации (30°С) цитохром с регистрировался исключительно в митохондриапьной фракции дрожжей и отсутствовал в цитоплазматической (рис. 14а). Тепловой шок 45°С приводил к исчезновению цитохрома с в митохондриапьной фракции и его появлению в цитоплазматической.

(я) МИТ цит

30°С 45"С 30°С 45°С

Рис. 14. Тепловой шок вызывает выход цитохрома с из митохондрий, (а) Клетки штамма 4'-74-D694 выращивали на среде с глюкозой, обрабатывали при 30 и 45°С (30 мин), п=3. (б) Клетки A. thaliana обрабатывали при 26°С и 50°С (10 мин) и дополнительно инкубировали 120 мин при 26°С, п=3. Митохондриальная (мит) и цитоплаз-матическая (цит) фракции белков.

Чтобы выяснить, индуцирует ли тепловой шок выход цитохрома с из митохондрий растений, клетки A. thaliana обрабатывали при 50°С (10 мин) и выделяли митохондриальную и цитоплазматическую фракции белков. В контроле (26°С) цитохром с и изоцитратдегидрогеназа (Idh2p) присутствовали исключительно в митохондриапьной фракции (рис. 146). После теплового шока наблюдалось понижение количества цитохрома с в митохондриапьной фракции и, одновременно, его появление в цитоплазматической. В то же время Idh2p, локализованная в митохондри-апьном матриксе. не обнаруживалась в цитоплазматической фракции при тепловом шоке (рис. 146).

Таким образом, процесс развития гибели клеток дрожжей и растений при тепловом шоке имеет активный характер, развивается во времени (рис. 12 и 13), сопровождается выходом цитохрома с из митохондрий (рис. 14), усилением продукции АФК (рис. 9 и 10). Эти признаки, а также повышение термотолерантности 5. cerevisiae при обработке ЦГ (рис. 11) и в результате мутации petite (рис. 5), указывают, что гибель при тепловом шоке развивается программируемым образом.

Белки теплового шока и ПГК

Из данных, представленных выше, следует, что механизм гибели при жестком (50°С) и умеренном тепловом шоке (45°С) различается. При умеренном тепловом шоке гибель клеток дрожжей зависит от митохондриапьной продукции АФК и имеет признаки ПГК. При жестком тепловом шоке, вероятно, агрегация и денатурация клеточных белков вносит основной вклад в гибель клеток. Как следует из рис. 15, несмотря на различные механизмы гибели, индукция синтеза Hspl04p во время теплового стресса при 39°С защищала клетки 5. cerevisiae от гибели как после умеренного (45°С), так и жесткого (50°С) теплового шока. Аналогичным образом, индукция синтеза HsplOlpA thaliana подавляла гибель культуры клеток ара-бидопсиса при тепловом шоке 50°С (представлено в диссертации). Таким образом,

(б) мит цит

26°С 50°С 26°С 50°С

CytC

ldh2p

CytC

(б)

ЗО 60 90

Время при 45"С, мин

120

можно предполагать, что гомологичные белки 5сНзр104р и Л/НврКЛр могут инги-бировать развитие ПГК в клетках дрожжей и растений при тепловом шоке.

Чтобы изучить роль БТШ в развитии ПГК, необходимо было установить, когда синтезируются БТШ и когда происходит гибель клеток. Для этого клетки А. /ИаНапа подвергали тепловым воздействиям различной интенсивности и продолжительности, а затем определяли уровень синтеза БТШ и жизнеспособность. Повышение температуры до 37°С индуцировало синтез НэрКНр, Нзр17.6р (I и II) и Нзр70р. Индукции синтеза этих БТШ не наблюдалось при повышении интенсивности теплового воздействия до 39°С и выше. Напротив, количество НэрбОр возрастало пропорционально увеличению температуры обработки (рис. 16а). Тепловой шок при 37 и 39°С не влиял на жизнеспособность, но обработка при 43, 46 и 50°С прогрессивно снижала жизнеспособность клеток (рис. 166). Таким образом, развитие гибели клеток А. ЛаИапа при тепловом шоке сопровождается повышением уровня НэрбОр и ингибированием синтеза НэрКПр и НврП.бр (I и II).

Для установления зависимости между индукцией синтеза БТШ и жизнеспособностью клетки 5. сегеушае обрабатывали при 39, 42 и 45°С (30 мин), после чего определяли индукцию синтеза БТШ и оценивали жизнеспособность дрожжей. Уровень синтеза НэрбОр, Н5р70-8за1р, Нзр70-8зЫр и цитохромас не изменялся во всех вариантах эксперимента. Повышение температуры инкубации до 39°С вызывало значительное повышение количества Нзр104р. Тепловая обработка при 42°С приводила примерно к такой же индукции синтеза Нзр104р. Но при 45°С индукции синтеза не наблюдалось (рис. 17а). Определение жизнеспособности показало, что тепловое воздействие при 39 и 42°С не имело негативного эффекта на жизнеспособность. Тепловой шок при 45°С (30 мин) подавлял жизнеспособность

(в)

5 10 15 Время при 50°С, мин

Ч'-74-1)694 Іі.чр104А 30 39 30 39 »С

,_, Н$р104р

Рис. 15. Влияние №р104р на развитие индуцированной термотолерантности в зависимости от интенсивности теплового шока. Клетки 5. се/етшае родительского типа (РТ, штамм Ч,-74-Э694) и ІізрІ04А мутанта (М) выращивали на среде с глюкозой, обрабатывали при 30 или 39°С (30 мин) и подвергали тепловому шоку 45°С (а), 50°С (б) или анализировали синтез белков Нзр104р и НэрбОр (в).

(рис. 176). Таким образом, у дрожжей, так же как и у клеток растений, когда тепловое воздействие достигает определенного значения и клетки начинают погибать, синтез Нэр! 04р не индуцируется.

(а) (б) 140

26 37 39 43 46 50 "С С 120

HsplOlp * н н 100

- — - . __ _ . . Hsp70p ÜJ s 80

- „ __ Hsp60p в Ci 60 40

— Hspl7.6p (I) ч а о X сз

— Hspl7.6p (II) н v и о 20

- ли»"« «м» "»i«»» ¿«Ж CytC М 0

26 37 39 43 46 50 "С

Рис. 16. Взаимосвязь между содержанием БТШ и гибелью клеток А. ¡ИаИапа при тепловом шоке. Клетки А. IИаНапа инкубировали при 26, 37, 39°С (120 мин), 43°С (60 мин), 46°С (40 мин), 50°С (10 мин), (а) Вестерн-блотгинг суммарных белков после дополнительной инкубации при 26°С (120 мин), п=3; (б) восстановление ТТХ после дополнительной инкубации при 26°С (48 ч). рассчитываемое на г сырого веса, п=3, т+Б.Е.

(а)

39 42

45°С

(6)

Hspl04p Hsp70p-Ssal

Hsp60p

Cyt с

140 120 100

Hsp70p-Ssbl ы

■ ■ ¡fifi ■ ''Ч" ■

•

;3.

39 42 45°C

Рис. 17. Взаимосвязь между содержанием БТШ и гибелью клеток 5. сегеум/<зе при тепловом шоке.

Клетки штамма 1Р-74-0694 выращивали на среде с глюкозой, подвергали тепловому воздействию при 39, 42 и 45°С (30 мин), (а) Вестерн-блотгинг суммарных белков, п=3. (б) Жизнеспособность клеток, определяемая по количеству КОЕ, п=3, т+Б.Е.

Чтобы изучить, как повышение уровня БТШ повлияет на локализацию мито-хондриапьных белков, изучали распределение цитохрома с, НврбОр, а также других БТШ между митохондриальной и цитоплазматической фракциями белков. Клетки

А. IЬаНапа подвергали предварительному тепловому воздействию при 37°С (120 мин), затем обрабатывали при 50°С (10 мин) и после 120 мин инкубации при 26°С выделяли митохондриапьную и цитоплазматическую фракции белков. В соответствии с ранее полученными результатами (рис. 14), тепловой шок при 50°С вызывал выход цитохромас из митохондрий в цитозоль (рис. 18а). Митохондриальный ша-перон НэрбОр, так же как и цитохром с, выходил из митохондрий в цитозоль после теплового шока.

(Я)

A. thaí'uimi

мит фракция цит фракция 26 37 5« 37-50 26 37 5« 37-50"С

HsplOlp Hsp70p Hsp60p Idh2p Hspl7,6 (I) Cvt c

(6) S. cerevisiae

митфракция цитфракция 30 39 45 45-50 30 39 45 39-45

— — - —=— Hsp104p

--—. —■ Hsp60p

- <*» тт. . •• j¿fc?iSc»t с

Рис. 18. Влияние предварительного теплового стресса на выход цитохрома с и Hsp60p из митохондрий при тепловом шоке.

(а) Клетки A. thaliana обрабатывали при 26 и 37°С (120 мин) и подвергали тепловому шоку 50°С (10 мин). После 120 мин инкубации при 26°С проводили выделение митохондриаль-ной (мит) и цитоплазматической (цит) фракций белков, п=3. (б) Клетки штамма 4'-74-D694 выращивали на среде с глюкозой, обрабатывали при 30 и 39°С (30 мин), подвергали тепловому шоку 45°С (30 мин) и проводили выделение митохондриальной (мит) и цитоплазматической (цит) фракций белков, п=3.

Предварительный тепловой стресс при 37°С значительно ингибировал выход Hsp60p из митохондрий. Выход цитохромас из митохондрий также ингибировапся, но в значительно меньшей степени. Изоцитратдегидрогеназа (Idh2p) локализуется в митохондриальном матриксе. Уровень Idh2p значительно снижался при повышении температуры, но этот белок не обнаруживался в цитоплазматической фракции (рис. 18а). Полученные результаты указывают, что предварительный тепловой стресс, при котором наблюдается повышение количества БТШ, подавляет развитие ПГК в клетках арабидопсиса, блокируя выход цитохрома с и HspóOp из митохондрий.

Цитоплазматические белки HsplOlp и Hspl7.6p (класс 1) были обнаружены в митохондриальной фракции клеток, предварительно обработанных при 37°С. а затем подвергнутых жесткому тепловому шоку 50°С (рис. 18а). При жестком тепловом шоке эти белки образуют олигомерные комплексы с агрегированными белками (Lee et al., 2005). Вероятно, эти комплексы осаждаются вместе с митохондриями. Однако, если Hspl7.6p (класс 1) оказывался в цитоплазматической фракции клеток, подвергнутых тепловому воздействию при 37°С (без последующего теплового шока при 50°С), то HsplOlp в этих же условиях обнаруживался исключительно в митохондриальной фракции (рис. 18а).

Для изучения влияния теплового стресса на выход митохондриальных белков в цитозоль, дрожжи S. cerevisiae обрабатывали при 39°С (30 мин), а затем подвергали повреждающему тепловому воздействию при 45°С (30 мин). Как видно на рис. 186, тепловой шок при 45°С вызывал выход цитохрома с и Hsp60p из митохондрий клеток дрожжей в цитозоль, но если клетки дрожжей предварительно обрабатывали при 39°С, то появления этих белков в цитозоле не наблюдалось. Белок Hspl04p обнаруживался в митохондриальной фракции дрожжей. Но, в отличие от HsplOlp арабидопсиса, Hspl04p распределялся равномерно между митохондриальной и цитоплазматической фракциями. Таким образом, предварительный тепловой стресс, который повышает уровень БТШ, подавляет выход цитохрома с и Hsp60p из митохондрий. Это позволяет предполагать, что БТШ могут ингибировать развитие ПГК в клетках дрожжей и A. lhaliana. Поскольку Hsp 101 p/Hsp 104р обнаруживаются в митохондриальной фракции, возможно, эти белки связываются с митохондриями и модулируют их активность при повышении температуры.

Чтобы изучить, как влияет повышение уровня БТШ на продукцию АФК при умеренном тепловом шоке, клетки дрожжей инкубировали при 39°С (30 мин), затем подвергали тепловому воздействию при 45°С (30 мин). В соответствии с результатами, приведенными выше (рис. 9), повышение температуры до 39°С не вызывало заметного повышения продукции АФК по сравнению с контролем, 30°С (рис. 19а). Но тепловой шок 45°С приводил к значительному увеличению продукции АФК. Повышение продукции АФК в этих условиях теплового шока полностью блокировалось, если клетки предварительно обрабатывали при 39°С (рис. 19 а и б). Таким образом, тепловой стресс при 39°С полностью блокировал как гибель клеток (рис. 15а), так и усиление генерации АФК (рис. 19в). Поскольку тепловой стресс при 39°С приводит к синтезу Hspl04p (рис. 15в) и защищает клетки дрожжей от последующего умеренного теплового шока при 45°С (рис. 15а), полученные данные указывают на отрицательную зависимость между присутствием БТШ и генерацией АФК в клетках дрожжей при тепловом шоке.

Чтобы изучить, как повышение уровня БТШ повлияет на изменение мтДу, клетки дрожжей инкубировали при 39°С (30 мин), затем обрабатывали 10 мин при 45°С в присутствии TMRM. Изменение интенсивности флуоресценции TMRM регистрировали сразу же после теплового шока и спустя 30, 60, 120 и 180 мин инкубации при 30°С. Как видно на рис. 20, обработка при 45°С приводила примерно к одинаковому увеличению флуоресценции TMRM в контрольных клетках и клетках, предварительно обработанных при 39°С, если измерение проводили сразу же после окончания теплового воздействия. Однако у клеток, обработанных при 45°С без предварительного теплового стресса, повышенный уровень флуоресценции TMRM сохранялся в течение 60 мин инкубации при обычной температуре, а у клеток, обработанных при 39°С, через 30 мин инкубации значение мтДу снижалось почти до контрольного уровня (рис. 20). Следовательно, повышение уровня БТШ при 39°С не предотвращает повышения мтД\|/ в клетках дрожжей S. cerevisiae во время теплового шока при 45°С, однако приводит к быстрому его снижению во время восстановительного периода. Таким образом, полученные результаты позволяют предполагать, что БТШ, синтез которых возрастает во время обработки при 39°С, способствуют восстановлению мтД\|/ до нормального уровня после окончания теплового шока.

(а)

ДИК ОСР

(а)

ш V '

с>-г г с >

А <? *

•

€ V •

30»С

(б)

1200

иГ 1000

в 800

X о 600

и Сі а. 400

1 200

45°С

Ч ■ 3, п §

ява

39-45°С

39°С О? Л іМШЬ&ЇШ я а V;

щ ■ ■ ■ ■

45°С 45°С

ДИК

тмнм

ДИК

тмим

39+45°С

30°С 45°С 39°С-45°С

Рис. 19. Влияние предварительного теплового стресса при 39°С на продукцию АФК в клетках 5. сегеуізіае при тепловом шоке 45°С.

Клетки штамма Ч/-74-Б694 выращивали на среде с глюкозой, обрабатывали при 30 или 39°С (30 мин) и подвергали тепловому шоку 45°С (30 мин) в присутствии 50 мкМ Н2ОСР ЭА. (а) Микрофотографии клеток с флуоресценцией Н2ОСР ЭА, п=3. (б) Количественный обсчет данных, п=3, т+5.Е. ДИК -дифференциально-интерференционный контраст.

Масштабная линейка - 10 мкм.

0 30 60 120 180 мин мри 30"С после 45"С

4000

(б)

а.

о #

3000 2000 -1000 0

■ 45°С □ 39+45°С

0 30 60 120 І80МИН при 30"С после 45°С

Рис. 20. Влияние предварительного теплового стресса 39°С на длительность гиперполяризации внутренней митохондриальной мембраны 5. сегеушае при тепловом шоке 45°С.

Клетки штамма Т-74-0694 выращивали на среде с глюкозой, обрабатывали при 30 или 39°С (30 мин) и подвергали тепловому шоку 45°С (10 мин) в присутствии 1 мкМ ТМЯМ. Динамику флуоресценции ТМЯМ анализировали при 30°С спустя 0-180 мин после окончания теплового шока, п=3, т+Б.Е. (а) Микрофотографии клеток с флуоресценцией ТМЯМ. (б) Количественный обсчет полученных данных. ДИК - дифференциально-интерференционный контраст. Масштабная линейка - 10 мкм.

Митохондрии регулируют экспрессию генов БТШ

Митохондриальная регуляция экспрессии гена Hspl04p S. cerevisiae

Конститутивный уровень синтеза Hspl04p в клетках 5. cerevisiae возрастает в условиях окислительного энергетического метаболизма (рис. 3). Нарушение функционирования дыхательной цепи в результате мутации petite ингибирует индукцию синтеза Hspl04p при тепловом стрессе (Рихванов и др., 2004; представлено в диссертации). Эти факты позволили предположить существование связи между индукцией синтеза БТШ и активностью митохондрий. Чтобы подтвердить существование такой зависимости, было изучено влияние митохондриальных ингибиторов и разобщителей на индукцию синтеза БТШ и развитие индуцированной термотолерантности, используя клетки дрожжей S. cerevisiae и культуру клеток A. thali-апа.

Обработка ДНФ при 30°С повышала способность клеток S. cerevisiae выдерживать действие теплового шока (рис. 21а), но не влияла на синтез Hspl04p (рис. 216). Предварительный тепловой стресс при 39°С индуцировал синтез Hspl04p (рис. 216) и более чем в 100 раз повышал термотолерантность дрожжей (рис. 21а). Присутствие ДНФ во время обработки при 39°С приводило к совершенно противоположному результату, чем при 30°С. В этом случае ДНФ ингибировал развитие индуцированной термотолерантности (рис. 21а) и подавлял индукцию синтеза Hspl04p (рис. 216). В отличие от Hspl04p, синтез Hsp60p не изменялся во время предварительной обработки при 39°С, соответственно, не наблюдалось никаких изменений в уровне этого белка при обработке исследуемыми агентами (рис. 216).

(а)

глюкоза

кзо дзо

этанол

К39 Д39 КЗО ДЗО К39

Д39

(б)

8 іШШЗіі

мин при 50™С

глюкоза этанол

КЗО ЛЗО ДЗО КЗ9 Л39 Д39 КЗО А30 ДЗО К39 А39 Д39

Hspl04p Hsp60p

Рис. 21. Эффект азида и ДНФ на индуцированную термотолерантность и синтез Нзр104р в клетках 5. се^ізіае.

Клетки штамма Ч'-74-0694 выращивали на среде с глюкозой или этанолом, инкубировали при 30 или 39°С в присутствии 0,15 мМ азида или 1 мМ ДНФ. (а) Жизнеспособность клеток после теплового шока, (б) Вестерн-блоттинг суммарных белков. п=3. К - контроль, А -азид; Д-ДНФ.

Нарушение митохондриапьных функций во время умеренного теплового шока (45°С) приводило к различному эффекту на термотолерантность в зависимости от окислительного или бродильного энергетического метаболизма дрожжей S. cerevisiae (рис. 4). В данном эксперименте клетки дрожжей после обработки при 30 или 39°С отмывали от ингибиторов перед тем, как подвергнуть их жесткому тепловому шоку при 50°С. Тем не менее, необходимо было изучить, зависит ли способность ДНФ подавлять индукцию синтеза Hspl04p и развитие индуцированной термотолерантности после теплового стресса от типа энергетического метаболизма. Инкубация клеток 5. cerevisiae на несбраживаемом источнике углерода, этаноле, приводила к повышению конститутивного синтеза Hspl04p (рис. 216). Подавляющий эффект ДНФ на индукцию синтеза Hspl04p и развитие индуцированной термотолерантности не зависел от типа энергетического метаболизма. Этот агент ин-гибировал развитие индуцированной термотолерантности и индукцию синтеза Hspl04p после теплового стресса как у дрожжей, выращенных на этаноле, так и выращенных на глюкозе (рис. 21).

Полностью аналогичный результат был получен при изучении действия СССР (карбонил-цианид-3-хлоро-фенилгидразон) и азида натрия. Обработка этими агентами при обычной температуре защищала клетки дрожжей от гибели, но присутствие СССР и азида во время теплового стресса 39°С подавляло индукцию синтеза Hspl04p и развитие индуцированной термотолерантности (рис. 22 и 25, представлено в диссертации). Несколько другой результат был получен при изучении действия цианида натрия (ингибитора комплекса IV) и антимицина А (ингибитора комплекса III). На среде с этанолом антимицин А так же эффективно, как и СССР, ингибировал тепловую индукцию синтеза Hspl04p (рис. 226) и подавлял развитие индуцированной термотолерантности (рис. 22а). Но на среде с глюкозой какого-либо отрицательного эффекта антимицина А и цианида на синтез Hspl04p и развитие индуцированной термотолерантности не наблюдалось (рис. 22). Аналогичный результат был получен при использовании мутанта petite (Rikhvanov et al.. 2005, представлено в диссертации). Следовательно, антимицин А и цианид, в отличие от азида, ДНФ и СССР, специфически ингибируют индукцию синтеза Hspl04p при тепловом стрессе только у активно дышащих клеток, которые используют окислительное фосфорилирование.

Тепловой стресс вызывает гиперполяризацию внутренней митохондриаль-ной мембраны в клетках 5. cerevisiae (рис. 9). Чтобы изучить зависимость между гиперполяризацией и индукцией синтеза Hspl04p, сравнивали способность антимицина А и СССР подавлять повышение мтД\|/ при тепловом стрессе. Эти агенты снижают мтД\|/ на внутренней митохондриальной мембране различным способом. Протонофор СССР, обеспечивая свободный транспорт протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану, деполяризует ее. Антимицин А, являясь ингибитором комплекса III, снижает мтДу, ингибируя транспорт электронов по дыхательной цепи (Slater, 1967).

Повышение температуры инкубации до 39°С индуцировало повышение мтДу в клетках 5. cerevisiae. Антимицин А и СССР при обычной температуре инкубации (30°С) одинаково эффективно снижали мтД\|/ в клетках 5. cerevisiae, выращиваемых на среде с глюкозой и этанолом. Но эффект используемых агентов на повышение мтДу|/ при 39°С резко различался. Добавление СССР подавляло повышение мтДу при тепловом стрессе независимо от типа энергетического метаболизма (рис. 23а). В то же время, антимицин А слабо ингибировал повышение мтДу

(а) глюкоза

К39 СМ39 АА39 С39

мин при 50°С (б) глюкоза

КЗ9 СШ9 АА39 С39

этанол К39 СШ9 АА39 С39

> о • •

> о %

» • &

• *

> #

этанол К39 €N39 АА39 С39

НэрШр-№р60р .

Рис. 22. Эффект цианида, антимицина А и СССР на индуцированную термотолерантность и синтез НэрКМр в клетках 5. сегсушае. Клетки штамма Ч'-74-0694 выращивали на среде с глюкозой или этанолом, инкубировали при 39°С (30 мин) в присутствии 1 мМ цианида, 10 мкМ антимицина А или 20 мкМ СССР, (а) Жизнеспособность клеток, определяемая с помощью репликатора, п=3. (б) Вестерн-блоттинг суммарных белков, п=3. К - контроль, СИ - цианид, АА - антимицин А, С - СССР.

(а)

400

300

= 200

100

300

200 1

100

КЗО ААЗО СЗО К39 АА39 С39

(б)

КЗ0 А АЗО СЗО К39 АА39 СЗО

Н5р104р НярбОр

КЗО ААЗО СЗО КЗ9 АА39 СЗО

Рис. 23. Эффект антимицина А и СССР на гиперполяризацию внутренней митохондриапь-ной мембраны и синтез Н5р104р при тепловом стрессе в клетках 5. сеге\>1$\ае. Клетки штамма Ч/-74-Б694 выращивали на среде с глюкозой или этанолом, инкубировали при 30 или 39°С в присутствии 10 мкМ антимицина А (АА) или 20 мкМ СССР (С), (а) Обсчет интенсивности флуоресценции ТМЯМ. п=3, т+Б.Е. (б) Вестерн-блоттинг суммарных белков, п=3.

Вестерн-блоттинг суммарных белков, п=3. (в) Микрофотографии клеток в присутствии ТМЯМ. п=3. К - контроль; А - азид; Д - ДНФ.

при 39°С у дрожжей на среде с глюкозой, но на среде с этанолом степень ингиби-рования была такая же, что и в случае с СССР (рис. 23а). Агенты, способные подавлять повышение мтДу при тепловом стрессе, одновременно подавляли индукцию синтеза Hsp104p при тепловом стрессе. Присутствие СССР ингибировало синтез Hspl04p при 39°С у дрожжей на обеих средах, а антимицин А подавлял тепловую индукцию синтеза Hspl04p на среде с этанолом, но не имел никакого эффекта на этот процесс на среде с глюкозой (рис. 236). Следовательно, наблюдается положительная зависимость между способностью используемых агентов подавлять повышение мтДу при тепловом стрессе и ингибировать тепловую индукцию синтеза Hspl04p. Поскольку азид ингибировал индуцированную термотолерантность в клетках мутанта hspI04A S. cerevisiae (представлено в диссертации), очевидно, что тепловая индукция сиитеза других БТШ также подавляется у дрожжей при подавлении гиперполяризации внутренней митохондриапьной мембраны.

Известно, что БТШ накапливаются в большом количестве в клетках S. cerevisiae в стационарной фазе роста (Klosinska et al., 2011). В соответствии с этими результатами, клетки штамма 51. cerevisiae в стационарной фазе синтезировали большое количество Hspl04р (рис. 246) без теплового стресса и отличались повышенной базовой термотолерантностью (рис. 24а). В отличие от клеток дрожжей в логарифмической фазе роста (рис. 21а), в стационарной фазе гибель наблюдалась только после 60 мин обработки при 50°С (рис. 24а). Тепловой стресс при 39°С не приводил к повышению уровня Hspl04p в клетках стационарной культуры (рис. 246), соответственно, не наблюдалось дополнительного повышения термотолерантности (рис. 24а). Азид и ДНФ в стационарной фазе не влияли ни на уровень синтеза Hspl04p (рис. 246), ни на термотолерантность дрожжей (рис. 24а). Следовательно, азид и ДНФ не имеют отрицательного эффекта на термотолерантность, если Hspl04p изначально присутствует в клетках в большом количестве. Поэтому подавление индуцированной термотолерантности в клетках S. cerevisiae, находящихся в логарифмической фазе роста (рис. 21а), определяется подавлением синтеза Hspl04p (рис. 216), а также, вероятно, других БТШ.

В отличие от дрожжей, находящихся в логарифмической фазе, тепловой стресс 39°С не вызывал повышения флуоресценции TMRM в клетках 5. cerevisiae, находящихся в стационарной фазе (рис. 24в). Следовательно, отсутствие повышения мтД\|/ при тепловом стрессе в клетках дрожжей, находящихся в стационарной фазе, сопровождается отсутствием дополнительной индукции синтеза Hspl04р. Полученный результат подтверждает зависимость между активацией экспрессии Hspl04p при тепловом стрессе и повышением мтД*|/, а также показывает, что усиление флуоресценции TMRM в клетках дрожжей не является следствием неспецифического накопления красителя в клетке при повышении температуры.

Азид, ДНФ и СССР вызывают повышение уровня цАМФ в клетках дрожжей S. cerevisiae (Thevelein, de Winde, 1999), а экзогенный цАМФ подавляет индукцию синтеза БТШ при тепловом стрессе (Boy-Marcotte et al., 1998). цАМФ активирует протеинкиназу А (цАМФ-ПКА), которая у дрожжей состоит из каталитических субъединиц, кодируемых генами TPKI, ТРК2 и TP КЗ, и регуляторной субъединицы, кодируемой геном BCYI (Thevelein, de Winde, 1999). У мутанта S7-7A. несмотря на делецию генов двух каталитических субъединиц ТРК1 и ТРК2 (TPKI tpk2A tpk3A BCY1), активность цАМФ-ПКА не отличается от дикого типа (Cameron et al.. 1988). В клетках этого мутанта азид ингибировал индукцию синтеза Hspl04p (рис. 256) и индуцированную термотолерантность (рис. 25а) после теплового стресса

(а)

КЗО К39 АЗ9 Д39

(В) 30«С

ФК ТМЯМ

лог. фаза ц

стац. фаза В

39°С

ФК гмкм

ш 4

(б)

мин при 50°С КЗО К39 А39 Д39

Н^рШр НярбОр

Рис. 24. Эффект азида и ДНФ на индуцированную термотолерантность, синтез НврКМр и изменение мтД\|< в стационарной культуре 5. сегеушае.

Клетки штамма Ч,-74-Э694 выращивали на среде с этанолом 48 ч, инкубировали при 30 или 39°С (30 мин) в присутствии 0,15 мМ азида или 1 мМ ДНФ. (а) Жизнеспособность клеток после теплового шока, определяемая с помощью репликатора, п=3. (б) Вестерн-блоттинг суммарных белков, п=3. (в) Микрофотографии клеток в присутствии ТМЯМ. К -контроль, А - азид, Д- ДНФ, ФК - фазовый контраст. Масштабная линейка - 10 мкМ.

(а)

87-7А

ТРК11рк2А іркЗА ВСУ1 КЗО АЗО КЗ 9 АЗ 9

К813-58А-1 Іркію 1рк2А ІркЗА ЬсуІА КЗО АЗО К39 А39

0 • • • • 0 • • •

2 ♦ # • 10 о •

4 • •*• 20 * 'і в *

6 • # Т' 30 ■ »г Я

8 40 V

(б)

мин п|)и 50"С

ТРКІ 1рк2А ІркЗА ПСУ і КЗО АЗО К39 А39

іркік Грк2& ІркЗА ЬсуІА КЗО АЗО К39 АЗ9

Н$р104р

Рис. 25. Эффект азида на индуцированную термотолерантность в клетках 5. сегеуізіае с пониженной активностью цАМР-ПКА.

Клетки мутантов 57-7А и Я513-58А-1 выращивали на среде с глюкозой, инкубировали при 30 или 39°С (30 мин) в присутствии 0,15 мМ азида, (а) Жизнеспособность клеток после теплового шока 50°С. п=3. (б) Вестерн-блоттинг суммарных белков, п=3.

39°С, так же как и в клетках штамма lF-74-D694. У мутанта RS13-58A-1. который отличается от S7-7A дополнительной делецией гена ВСУ1 и миссенс мутацией в гене ТРК1 (tpklw tpk2A 1ркЗА bcylД), активность цАМФ-ПКА понижена (Cameron et al., 1988). В клетках мутанта с пониженной активностью цАМФ-ПКА азид не ин-гибировап индукцию синтеза Hspl04p и индуцированную термотолерантность после теплового стресса 39°С. В отличие от штамма S7-7A, а также других штаммов S. cerevisiae с нормальной активностью цАМФ-ПКА. обработка азидом при 30°С индуцировала синтез Hspl04p в клетках мутанта с пониженной активностью цАМФ-ПКА (рис. 256).

Митохондриальная регуляция экспрессии генов БТШ A. thaliana

Максимальная индукция синтеза БТШ в клетках A. thaliana наблюдается при температурной обработке 37°С (рис. 16). Чтобы изучить эффект митохондриапьных ингибиторов и разобщителей на экспрессию генов БТШ растений, культуру клеток A. thaliana обрабатывали азидом натрия и СССР при 26 или 37°С и определяли экспрессию генов методом полуколичественного ОТ-ПЦР анализа.

Тепловой стресс (37°С) увеличивал уровень транскриптов HSPI01 и HSPI7.6C-CI. Азид и СССР ингибировапи экспрессию HSP101. индуцированную тепловым стрессом. Обработка азидом и СССР при обычной температуре инкубации несколько увеличивала экспрессию HSPI7.6C-C1 (рис. 26а). Таким образом, с одной стороны, обработка митохондриальными ингибиторами и разобщителями при обычной температуре инкубации (26°С) может активировать экспрессию БТШ, а с другой стороны, эти агенты подавляют экспрессию генов БТШ, индуцированную тепловым стрессом.

Тепловой стресс (37°С, 120 мин) оказывал протекторный эффект на жизнеспособность клеток A. thaliana после обработки при 50°С (10 мин) (рис. 266). Присутствие азида и СССР во время теплового стресса подавляло индуцированную термотолерантность (рис. 266). Поскольку использованные концентрации агентов сами по себе не оказывали отрицательного влияния на жизнеспособность (представлено в диссертации), очевидно, что азид и СССР специфически подавляют защитную реакцию клеток A. thaliana на тепловой шок. Способность азида и СССР подавлять индуцированную термотолерантность объясняется их способностью подавлять активацию экспрессии генов БТШ при тепловом стрессе (рис. 26). Аналогичным образом, обработка ДНФ и антимицином А ингибировала экспрессию генов БТШ и индуцированную термотолерантность (представлено в диссертации).

Чтобы изучить эффект азида и СССР на изменение мтД\|/, клетки A. thaliana инкубировали 10 мин при 26 или 37°С в присутствии JC-1 и регистрировали интенсивность флуоресценции. Тепловой стресс при 37°С увеличивал флуоресценцию JC-1 в красном канале, подтверждая, что повышение температуры вызывает повышение мтДу. Антимицин А и СССР эффективно подавляли флуоресценцию JC-1 в красном канале при 26 и 37°С (рис. 26в). Таким образом, гиперполяризация внутренней митохондриапьной мембраны в клетках A.thaliana при тепловом стрессе сопровождается активацией экспрессии генов БТШ. Способность митохондриальных ингибиторов и разобщителей подавлять развитие индуцированной термотолерантности и активацию экспрессии БТШ при тепловом стрессе коррелирует с их способностью подавлять повышение мтДу.

(Я)

К26 Л26 С26 К37 А37 С37

HSP101 E1F4A1 HSP60 HSP17.6C-I

(б)

о 12

>»

X н 10

н 8

V Ч 6

о Е 4

V о 2

ю 0

4000

~ 3000

I 2000

о.

I 1000

К26 К37 К26 Л26 С26 К37 Л37 С37

_ Ш....._ вв i § Ю

К26 ЛЛ26 С26 К37 АА37 С37

Рис. 26. Эффект митохондриальных ингибиторов на экспрессию БТШ, индуцированную термотолерантность и флуоресценцию JC-1 в культуре клеток A. thaliana. Клетки обрабатывали при 26 или 37°С (120 мин) в присутствии 50 мкМ азида и 4 мкМ СССР, (а) Данные ОТ-ПЦР анализа, (б) Жизнеспособность после теплового шока 50°С, n=3, m+S.E. (в) Обсчет интенсивности флуоресценции JC-1, n=3, m+S.E. К - контроль; А - азид; С -СССР.

Обработка экзогенной салициловой кислотой и фторидом натрия, так же как и обработка митохондриальными ингибиторами и разобщителями, ингибировапа повышение мтД*|/ при тепловом стрессе в культуре клеток A. thaliana, что сопровождалось подавлением экспрессии генов БТШ и развитием индуцированной термотолерантности (представлено в диссертации).

Кальций и ответ дрожжей S. cerevisiae на тепловой стресс

Есть основание полагать, что существует связь между гиперполяризацией внутренней митохондриальной мембраны и гомеостазом внутриклеточного Са2+. Обработка клеток дрожжей амиодароном, вызывающая кратковременное повышение уровня кальция в цитозоле [Са2+]су1 (Gupta et а!., 2003), приводила к повышению мтДу в клетках S. cerevisiae (Pozniakovsky et al„ 2005). Аналогичным образом, повышение [Ca2+]cyi в клеггках млекопитающих при тепловом стрессе сопровождалось повышением мтД\|/ (Balogh et al., 2005).

Чтобы выяснить возможную зависимость между гомеостазом Са2+ и повышением мтД\|/ при тепловом стрессе, изучали эффект теплового стресса на изменение [Са2+]су, в клетках S. cerevisiae. Повышение уровня Са2+ в цитозоле дрожжей может происходить за счет поступления кальция из внутриклеточных компартмен-тов или за счет его транспорта через плазматическую мембрану (Cunningham, 2011). Белки Cchlp и Midiр S. cerevisiae участвуют в поступлении Са2+ через плазматическую мембрану (Cunningham, 2011). В эксперименте использовали штамм Н207 родительского типа S. cerevisiae, РТ, а также изогенные ему мутанты: cchlA (штамм Н311), inidlA (штамм Н317), midlAcchlA (штамм Н319). Клетки трансформировали плазмидой pGAPAQl, содержащей ген апоэкворина. Апоэкворин при обработке целентеразином превращается в экворин, белок, люминесцирующий в

присутствии ионов Са"+. Для изучения влияния теплового стресса на изменение уровня внутриклеточного Са2+ дрожжи выращивали либо на минимальной среде SC, либо на полной среде YEPD, помещали в ячейку люминометра и после 60 с измерения люминесценции повышали температуру до 39°С путем добавления заранее нагретой до 70°С питательной среды.

При выращивании на среде SC тепловой стресс приводил практически к мгновенному повышению люминесценции экворина в клетках штамма РТ. Максимум люминесценции регистрировался через 120 с, затем наблюдалось снижение, а спустя ещё 400 с значение люминесценции возвращалось на контрольный уровень (рис. 27а). В клетках одиночных мутантов cchlA и midi А, а также двойного мутанта midlAcchlA люминесценция экворина на среде SC возрастала при тепловом стрессе гораздо слабее, чем у штамма РТ. Полученные результаты свидетельствуют, что тепловой стресс приводит к повышению уровня [Са~+]су1 в клетках дрожжей на среде SC, и это повышение зависит от функционирования белков Cchlp и Midlp.

(а)

(б)

0,004

0,003

0,002

0,001

mit!l\

midis ccftlA

100 200 300 400

Время при 39"С, с

0,003 -рт

•ссЫ&

0,002

0,001

tllitilA

шЫ1,\ гс/;/Л

100 200 300 400 Время при 39"С, с

Рис. 27. Люминесценция экворина в цитозоле £ ееггуи/ае при тепловом стрессе. Клетки штамма 5. се/гушае родительского типа Н207 (РТ) и изогенных ему мутантов т1с!1А (Н311), сс/г/Л (Н317), пМАссМА (Н319), трансформированные плазмидой рСАРА<31 с геном апоэкворина, выращивали на среде 5С (а) или УЕРО (б), вносили в ячейку люминометра и через 60 с инкубации подвергали действию теплового стресса при 39°С. Люминесценция экворина, п=5, т+Б.Е.

На среде YEPD тепловой стресс при 39°С, точно так же как и на среде SC. вызывал временное повышение люминесценции экворина в клетках штамма РТ (рис. 276). Однако на среде YEPD не наблюдалось статистически значимой разницы между уровнем повышения [Са2+]су, в клетках штамма РТ и мутантов с нарушением функционирования белков Cchlp и Midlp (рис. 276).

Анализ динамики люминесценции экворина показал, что при тепловом стрессе наблюдается два пика повышения [Ca2+]cyt. Наиболее четко это можно увидеть в клетках, инкубированных на среде YEPD, с нарушением функционирования Cchlp и Midlp белков (рис. 276). Сравнение данных, представленных на рис. 27 а и б, показывает, что на среде SC в мутантных клетках специфически блокируется второй пик люминесценции экворина, тогда как первый пик остается неизменным. Выращивание клеток на среде YEPD восстанавливает второй пик люминесценции практически до уровня родительского типа. Полученные данные указывают на существование в клетке 5. cerevisiae, по крайней мере, двух механизмов поступления кальция внутрь клетки при тепловом стрессе, один из которых зависит от функционирования Cchlp и Midlp, а другой —нет.

Чтобы изучить, как влияют делеции генов ССН1 и MIDI на изменение мтД\|/, клетки родительского типа и мутантов инкубировали при 30 и 39°С в присутствии 5 мкМ TMRM. При обычной температуре инкубации (30°С) не наблюдалось статистически значимой разницы в уровне флуоресценции TMRM между штаммом родительского типа и одиночными мутантами midi А и cchlA (рис. 28а). В то же время, значение мтДу у двойного мутанта midlAcchlA было гораздо ниже, чем у родительского типа. Тепловой стресс 39°С повышал мтДу у всех исследованных штаммов, но динамика повышения и относительные величины мтДу были различными (рис. 286). После 10 и 20 мин теплового воздействия у одиночных мутантов midi А и cchlA наблюдалось значительно меньшее повышение мтДу, чем у штамма родительского типа. Однако после 30 мин обработки при 39°С статистически достоверной разницы между родительским типом и одиночными midi А и cchlA мутантами уже не отмечалось. В то же время, у двойного мутанта midlAcchlA значение мтД\|/ было ниже, чем у родительского типа на протяжении всего эксперимента (рис. 286).

(а)

200 150 100 50

(б)

(il

Л*

1200 1000 800 600 400 200 0

ОРТ О midi Д □ cch 1А □ midl&cch M

10 20 30

Время при 39°С, мин

Рис. 28. Влияние midlA и cchlA мутаций на флуоресценцию TMRM при тепловом стрессе в клетках S. cerevisiae.

Клетки штамма родительского типа Н207 (РТ) и изогенных ему мутантов midlA (Н311), cchlA (Н317), midlAcchlA (Н319) выращивали на среде YEPD, обрабатывали при 30 (а) или 39°С (б) в присутствии 5 мкМ TMRM. Обсчет интенсивности флуоресценции TMRM, n=3, m+S.E.

Рис. 29. Влияние midi А и cchlA мутаций на поглощение кислорода клетками S. cerevisiae. Клетки штамма родительского типа Н207 (РТ) и изогенных ему мутантов midi А (Н311), cchlA (Н317), midi A cchlA (Н319) выращивали на среде YEPD и инкубировали при 30°С в присутствии 0,15 мМ NaN.i (А). Скорость потребления кислорода выражали в нмолях От в мин на 107 клеток, п=3.

Измерение уровня поглощения кислорода у исследуемых мутантов показало, что интенсивность дыхания при 30°С была одинаковой у родительского типа и одиночных мутантов mid!А и cchlA. В то же время, отсутствие обоих белков Cchlp и Midlp приводило к значительному снижению скорости поглощения кислорода (рис. 29). Таким образом, понижение дыхательной активности в клетках двойного мутанта midlAcchlA сопровождается снижением мтД\|/. В целом, полученные данные позволяют предполагать, что нарушение гомеостаза [Са_+]су, в результате отсутствия белков Cchlp и Midlp оказывает значительное влияние на функционирование митохондрий. Это выражается в снижении дыхания и значения потенциала на внутренней митохондриапьной мембране у двойного midlAcchlA мутанта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате сравнения способности различных видов дрожжей, а также мутантов S. cerevisiae переносить повреждающее действие теплового шока и расти при температуре выше оптимальной, впервые было показано, что между этими двумя явлениями отсутствует зависимость. Клетки дрожжей, неспособные поддерживать рост при повышенной температуре, могут лучше сохранять жизнеспособность после кратковременного жесткого теплового шока (рис. 1 ). Поэтому предлагается под термином «термотолерантность» понимать способность организма выдерживать повреждающее воздействие теплового шока, а под термином «теплолю-бивость» - способность к росту при температурах выше оптимальной. Поскольку эффективность производства АТФ, как правило, возрастает при повышении температуры, которое не оказывает мгновенного негативного эффекта на жизнеспособность растений и дрожжей (Семихатова, 1974; Postmus et al., 2011), предполагается, что теплолюбивость сопровождается активацией окислительного фосфорилирова-ния.

Сравнение скорости роста дрожжей при обычной температуре инкубации подтвердило литературные данные об обратной зависимости между скоростью роста и термотолерантностью (Lu et al., 2009). Чем медленнее скорость роста дрожжей при обычной температуре инкубации, тем лучше они переживают повреждающее действие теплового шока (рис. 1). Поскольку замедление скорости роста, как правило, сопровождается, повышением конститутивного синтеза БТШ (Brauer et al., 2008), очевидно, что активация экспрессии генов БТШ в клетках дрожжей и.

вероятно, в клетках растений может осуществляться не только в результате повышения температуры, но и замедления или полной остановки роста.

Впервые проведено сравнение базовой термотолерантности клеток дрожжей, различающихся по типу энергетического метаболизма. Результаты показали, что способность дрожжей переживать повреждающее действие теплового шока определяется функциональной активностью митохондрий. Клетки облигатного аэроба D. vanrijiae утилизируют как глюкозу, так и галактозу в ходе окислительного фос-форилирования. Соответственно, не обнаружено никаких различий в термотолерантности дрожжей D. vanrijiae, растущих на галактозе или глюкозе (рис. 2). Клетки факультативного анаэроба 5. cerevisiae при росте на среде с глюкозой получают энергию преимущественно за счет сбраживания глюкозы до этанола, а на среде с галактозой используют окислительное фосфорилирование. При выращивании на среде с галактозой клетки 5. cerevisiae лучше переживали тепловой шок, чем клетки этого же вида, выращенные на среде с глюкозой (рис. 2). Следовательно, клетки дрожжей, использующие окислительное фосфорилирование, оказываются гораздо более термотолерантными, чем такие же клетки, но использующие брожение. Повышенная термотолерантность клеток, использующих окислительный энергетический метаболизм, сопровождается повышением конститутивного синтеза Hspl04p (рис. 3) и увеличением активности антиоксидантных ферментов (представлено в диссертации). Таким образом, повышение уровня Hspl04p является одним из факторов повышения базовой термотолерантности клеток дрожжей, использующих окислительный энергетический метаболизм.

Впервые показано, что нарушение митохондриальных функций в клетках 5. cerevisiae, использующих бродильный энергетический метаболизм, в результате утраты мтДНК (мутации petite) и в результате обработки митохондриальным ингибитором азидом натрия, приводило к одному и тому же эффекту - повышению термотолерантности (рис. 4 и рис. 5) и подавлению генерации АФК при умеренном тепловом шоке (рис. 6 и рис. 7). Наоборот, обработка азидом натрия усиливала продукцию АФК (рис. 7) и снижала термотолерантность клеток 5. cerevisiae (рис. 4), использующих окислительный энергетический метаболизм. Полученные данные указывают, что наблюдается прямая зависимость между усилением генерации АФК и гибелью клеток при умеренном тепловом шоке. Повышение генерации АФК происходит за счет функционирования митохондрий дрожжей, поскольку нарушение их функций либо усиливает, либо ингибирует продукцию АФК. Очевидно, что митохондрии, генерируя токсичные АФК, играют активную роль в запуске механизма гибели дрожжевой клетки при умеренном тепловом шоке.

Механизм генерации АФК при тепловом шоке в клетках дрожжей и растений неизвестен. Однако с использованием изолированных митохондрий показано, что генерация АФК происходит тогда, когда на внутренней митохондриапьной мембране повышается потенциал (мтД\|/) (Skulachev, 1998). Полученные данные впервые показали, что повышение генерации АФК при тепловом шоке в целых клетках S. cerevisiae и A. thaliana зависит от гиперполяризации внутренней митохондриапьной мембраны. Это дало основание предполагать причинно-следственную связь между мтДу и генерацией АФК. Такая зависимость подтверждается следующими фактами. Во-первых, в клетках дрожжей и растений наблюдается прямая зависимость между повышением мтДу и усилением продукции АФК при тепловом шоке (рис. 9 и рис. 10). Во-вторых, умеренный тепловой шок при 45°С вызывал повышение мтДу в клетках дрожжей, и это событие сопровождалось

значительным усилением продукции АФК. Напротив, не было зарегистрировано повышения мтД\|/ в клетках S. cerevisiae при жестком тепловом шоке 50°С, одновременно, продукция АФК в этих условиях лишь незначительно превышала контрольный уровень (рис. 9). В-третьих, подавление повышения мтД\|/ при тепловом шоке в результате обработки азидом натрия и ДНФ ингибировапо усиление продукции АФК в клетках S. cerevisiae, выращенных на среде с глюкозой (рис. 7). Тем не менее, зависимость между мтДу и усилением генерации АФК не всегда выполняется. Обработка азидом натрия и ДНФ клеток дрожжей, выращенных на среде с этанолом, подавляла повышение мтД*|/ при тепловом шоке, но не ингибировапа, а, наоборот, усиливала продукцию АФК (рис. 7). Предполагается, что образование АФК митохондриями в клетках растений и дрожжей происходит за счет функционирования внутренних и внешних НАДН дегидрогеназ, которые продуцируют АФК как в результате перевосстановления компонентов дыхательной цепи (то есть, при повышении мтДу), так и в результате нарушения функционирования одного из ее компонентов (то есть, при снижении мтД\у). Будет или нет наблюдаться образование АФК при тепловом шоке в результате функционирования внешних НАДН дегидрогеназ зависит от соотношения НАДН/НАД+ в цитозоле. В свою очередь, соотношение НАДН/НАД+ в цитозоле снижается при активации бродильного метаболизма, что вызывает снижение митохондриальной продукции АФК. Можно предположить, что одним из механизмов снижения продукции АФК при умеренном тепловом шоке в клетках дрожжей и растений и, соответственно, повышения термотолерантности является перенаправление метаболических путей, что приводит к снижению эффективности окислительного фосфорилирования и активации процессов гликолиза и брожения. Таким образом, если теплолюбивость сопровождается повышением эффективности производства АТФ митохондриями, то термотолерантность, вероятно, сопровождается снижением митохондриальной продукции АТФ.

Вероятно, гиперполяризация внутренней митохондриальной мембраны при повышении температуры в клетках дрожжей и растений происходит за счет двух механизмов, которые не исключают друг друга. Первый, за счет повышения уровня внутриклеточного Са2+ и последующей активации митохондриапьных ферментов. Второй, за счет нарушения функционирования АДФ/АТФ транслокатора, в результате чего подавляется поступление АДФ в митохондрии, ингибируется синтез АТФ и повышается мтДу.

Механизм гибели клеток животных различается в зависимости от интенсивности теплового воздействия. При умеренном тепловом шоке гибель клеток происходит активным образом, в результате ПГК, а при более жестком тепловом воздействии клетки гибнут пассивно, в результате некроза (Gabai, Sherman, 2002). В данной работе впервые показано, что точно такая же ситуация наблюдается и в клетках дрожжей при тепловом шоке. Если при умеренном тепловом шоке 45°С гибель клеток дрожжей зависит от повышения мтДу и усиления генерации АФК, то при более жестком тепловом шоке 50°С этого не происходит (рис. 9). Мутация petite повышает жизнеспособность клеток S. cerevisiae после действия умеренного теплового шока и, наоборот, снижает жизнеспособность после жесткого теплового шока (рис. 5). Следовательно, механизмы гибели клеток дрожжей различаются в зависимости от интенсивности теплового воздействия.

Поскольку повышение генерации АФК митохондриями непременно предшествует развитию ПГК, а мутация petite ингибирует ПГК в клетках S. cerevisiae во

всех описанных в литературе случаях, то результаты, приведенные выше, дали основания предполагать, что умеренный тепловой шок может активировать развитие ПГК. Последующие исследования подтвердили это предположение. На активный характер гибели клеток дрожжей при умеренном тепловом воздействии указывает способность ЦГ повышать термотолерантность. Такого эффекта не наблюдается при жестком тепловом шоке (рис. II). Таким образом, гибель при умеренном тепловом шоке требует синтеза белков de novo, необходимых для развития ПГК. Динамика снижения жизнеспособности клеток дрожжей и A. thaliana после действия умеренного теплового шока также свидетельствует об активном характере гибели. Непосредственно после теплового шока клетки остаются живыми. Но во время восстановительного периода при обычной температуре инкубации клетки погибают (рис. 12 и рис. 13а), что сопровождается деградацией ДНК (рис. 136) и усилением продукции АФК (представлено в диссертации). Цитохром с, освобождаемый из митохондрий, является важным фактором развития ПГК (Wang, Youle, 2009). Соответственно, умеренный тепловой шок приводил к выходу цитохрома с из митохондрий в цитозоль в клетках 5. cerevisiae и A. thaliana (рис. 14). Таким образом, вся совокупность полученных результатов указывает, что гибель клеток дрожжей и растений при умеренном тепловом шоке имеет признаки ПГК. Ранее было известно, что тепловой шок может вызывать развитие ПГК в культуре клеток растений и животных (Sherman, 2002; Reape, McCabe, 2010), но то, что такое же событие происходит в клетках S. cerevisiae показано впервые.

Как правило, развитие ПГК у млекопитающих, дрожжей и растений сопровождается деполяризацией внутренней митохондриальной мембраны. Считается, что при развитии ПГК выход белков, вызывающих развитие ПГК, из митохондрий происходит при открытии митохондриальной поры, что является результатом снижения мтАу (Wang, Youle, 2009). Как следует из результатов данной работы, развитие программы самоубийства в клетках дрожжей и растений при тепловом шоке сопровождается значительным повышением мтДу (рис. 9 и рис. 10). На основании полученных результатов и ряда литературных данных (Weir et al., 2003; Pozniakovsky et al., 2005) предполагается, что гиперполяризация внутренней митохондриальной мембраны при тепловом шоке является индикатором ранней стадии ПГК, а на более поздней стадии наблюдается ее деполяризация.

Известно, что БТШ защищают клетки от гибели при тепловом шоке, восстанавливая денатурированные и агрегированные при нагревании белки. В то же время показано, что БТШ млекопитающих, модулируя выход про-апоптозных белков из митохондрий и активацию каспазного каскада, могут как ингибировать, так и стимулировать развитие ПГК (Arya et al., 2007). В ходе данной работы впервые показано, что БТШ могут выполнять аналогичную функцию в клетках растений и дрожжей. Нарушение функционирования Hspl04p снижало жизнеспособность клеток S. cerevisiae после умеренного и жесткого теплового шока, несмотря на различные механизмы гибели (рис. 15). Повышение количества БТШ в результате предварительного теплового стресса ингибировало все наблюдаемые признаки развития ПГК в клетках дрожжей и арабидопсиса, включая выход митохондриальных белков из митохондрий в цитозоль (рис. 18), повышение продукции АФК (рис. 19), атакже снижало длительность гиперполяризации внутренней митохондриальной мембраны (рис. 20).

Изучение зависимости между индукцией синтеза БТШ и развитием ПГК при тепловом шоке позволило впервые показать, что когда клетки растений и дрожжей

начинают погибать, синтез БТШ ингибируется (рис. 16 и рис. 17). Следовательно, клетки дрожжей и растений не пытаются противостоять повреждению, синтезируя необходимые для своей защиты белки, когда тепловой шок переходит определенный порог. Таким образом, развитие ПГК и синтез БТШ - взаимоисключающие явления в растительной и дрожжевой клетке.

Известно, что выход HspôOp из митохондрий может активировать развитие ПГК в клетках человека (Xanthoudakis et al., 1999; Chandra et al., 2007). Впервые показано, что аналогичное явление наблюдается в клетках растений и дрожжей. Развитие ПГК при тепловом шоке в клетках A. thaliana и 5. cerevisiae сопровождалось выходом митохондриального белка HspôOp из митохондрий в цитозоль (рис. 18). Поскольку подавление выхода HspôOp из митохондрий приводило к повышению термотолерантности и ингибировало появление признаков ПГК, предполагается, что HspôOp может стимулировать развитие ПГК в клетках дрожжей и растений.

Впервые показано, что цитоплазматический белок HsplOlp yi. thaliana локализуется преимущественно в митохондриальной фракции белков после теплового стресса (рис. 18а). Гомологичный ему белок Hspl04p также обнаруживается в митохондриальной фракции клеток S. cerevisiae (рис. 186). Такой результат позволяет предполагать, что Л/HsplOlp и ScHspI04p могут связываться с митохондриями при тепловом стрессе и модулировать их активность. Это предположение подтверждается тем, что инактивация гена HSP104 приводила к повышению дыхательной активности дрожжей S. cerevisiae (представлено в диссертации). Предполагается, что /4/Hsp 101 p/ScHsp 104р связывается с компонентами актинового цитоскелета, что влияет на процесс слияния и деления митохондрий, формирование митохондриальной сети и продукцию АФК митохондриями.

Полученные результаты указывают, что не только /liHspl01p/5cHspl04p может модулировать активность митохондрий, но и митохондрии регулируют экспрессию генов БТШ. Установлена положительная связь между повышением уровня конститутивной экспрессии Hspl04p и активацией окислительного фосфорилиро-вания (рис. 3). Нарушение дыхательной цепи митохондрий S. cerevisiae в результате мутации petite подавляет экспрессию Hspl04p при тепловом стрессе (представлено в диссертации). Впервые показано, что нарушение митохондриальных функций в результате обработки митохондриальными ингибиторами и разобщителями подавляет активацию экспрессии генов БТШ при тепловом стрессе в клетках дрожжей (рис. 21 и рис. 22) и растений (рис. 26). Способность митохондрий регулировать экспрессию генов Hspl04p в клетках S. cerevisiae при тепловом стрессе, вероятно, зависит от функционирования транскрипционных факторов Msn2p и Msn4p. В клетках с пониженной активностью цАМФ-ПКА (то есть тогда, когда факторы Msn2/Msn4p находятся постоянно в активированном состоянии) обработка азидом натрия не приводила к ингибированию тепловой индукции синтеза Hspl04p (рис. 25).

Показано, что способность митохондриальных ингибиторов и разобщителей подавлять активацию генов БТШ при тепловом стрессе зависит от их способности подавлять повышение мтД\|» (рис. 23). Антимицин А и цианид не подавляли повышение мтД*|/ при тепловом стрессе в клетках S. cerevisiae, использующих бродильный энергетический метаболизм, одновременно, отсутствовал подавляющий эффект этих агентов на тепловую индукцию синтеза Hspl04p и развитие индуцированной термотолерантности. Напротив, в клетках S. cerevisiae, использующих

окислительный энергетический метаболизм, способность антимицина А и цианида подавлять повышение мтД*|/ при тепловом стрессе сопровождалась ингибировани-ем индукции синтеза Hspl04p (рис. 23) и индуцированной термотолерантности после теплового стресса (рис. 22). Таким образом, наблюдается прямая зависимость между гиперполяризацией внутренней митохондриапьной мембраны и активацией экспрессии генов БТШ при тепловом стрессе. Агенты, которые при данных экспериментальных условиях подавляют повышение мтДу, одновременно подавляют тепловую активацию экспрессии генов БТШ. Подобная зависимость предполагает наличие причинно-следственной связи между этими явлениями и указывает, что повышение мтДу в клетках дрожжей и растений при тепловом стрессе является необходимым этапом в активации экспрессии генов БТШ. Следует подчеркнуть, что данная закономерность выполняется только в условиях теплового стресса, поскольку деполяризация митохондриапьной мембраны при обычной температуре инкубации также может приводить к активации экспрессии генов БТШ.

Результаты, показывающие, что обработка экзогенной салициловой кислотой подавляет повышение мтДу при тепловом стрессе в культуре клеток A. thaliana и одновременно ингибирует тепловую экспрессию генов БТШ, указывают, что регулятором уровня БТШ у растений in situ может быть изменение в уровне эндогенной салициловой кислоты (представлено в диссертации).

Фторид натрия, являющийся одним из компонентов атмосферных выбросов, подавляет повышение мтД\|/ при тепловом стрессе в культуре клеток A. thaliana и ингибирует тепловую экспрессию генов БТШ. Следовательно, этот загрязнитель, в условиях, когда он сам не оказывает отрицательного действия, может подавлять адаптивную реакцию растений на экстремальные факторы внешней среды, ингиби-руя экспрессию генов БТШ (представлено в диссертации).

В клетках S. cerevisiae при самых различных стрессовых воздействиях повышается уровень кальция в цитозоле (Cunningham, 2011). В этом процессе участвуют низкоаффинная и высокоаффинная системы транспорта Са2+ через плазматическую мембрану. Известно, что тепловой стресс вызывает временное повышение уровня Са2+в цитозоле растений (Saidi et al., 2011) и животных (Balogh et al., 2005). Существуют косвенные данные, указывающие, что повышение [Са2+]су1 наблюдается при тепловом стрессе и в клетках S. cerevisiae (Paidhungat, Garrett, 1997; Birch-wood et al., 2001). Чтобы установить зависимость между повышением уровня кальция в цитозоле и гиперполяризацией внутренней митохондриапьной мембраны, был исследован механизм повышения [Са ^^ в клетках 5. cerevisiae при тепловом стрессе. Впервые показано, что в условиях пониженной концентрации питательных веществ и Са2+ в среде инкубации, повышение [Са2+]су| при тепловом стрессе определяется функционированием высокоаффинной системы транспорта Са2+ через плазматическую мембрану (рис. 27а). Нарушение функционирования известных компонентов этой системы, белков Midlp и Cchlp, подавляло этот процесс. Когда в среде инкубации концентрация питательных веществ и Caz+ повышена, поступление Са2+ в цитозоль при тепловом стрессе не зависит от присутствия Midlp и Cchlp и, вероятно, определяется функционированием низкоаффинной системы транспорта Са2+ (рис. 276). Анализ динамики повышения кальция показал, что наблюдаются два пика повышения [Са2+]су1 (рис. 276). Делеция генов MIDI и ССН1 специфически ингибировапа второй пик повышения [Ca2+]cyt (рис. 27а). Этот результат позволяет предположить, что существует и третий механизм поступления кальция в ци-

тозоль дрожжевой клетки. Этот механизм, вероятно, определяется поступлением Са2+ в цитозоль из клеточных компартментов.

Повышение [Ca2+]mil в митохондриях млекопитающих стимулирует активность дыхательных ферментов, приводит к повышению сопряжения между дыханием и окислительным фосфорилированием и, соответственно, повышает мтДу (Denton, 2009). Система транспорта Са2+ в митохондрии функционирует и у растений (Медведев, 2005). Но неизвестно, может ли повышение [Ca2+]mit вызывать гиперполяризацию внутренней митохондриапьной мембраны у растений. В клетках дрожжей отсутствует система активного транспорта кальция в митохондрии. Несмотря на это обстоятельство, полученные данные однозначно свидетельствуют, что нарушение гомеостаза внутриклеточного кальция оказывает значительное влияние на функционирование митохондрий S. cerevisiae. Утрата белков Midlp и Cchlp, определяющих транспорт кальция через плазматическую мембрану, приводит к снижению потенциала на внутренней митохондриапьной мембране (рис. 28) и к подавлению дыхательной активности (рис. 29) в клетках S. cerevisiae. Представленные данные позволяют предполагать, что повышение [Са2*]^ в дрожжевой клетке может косвенно, модулируя функционирование сигнальных систем TOR и цАМФ-ПКА, влиять на активность митохондрий.

В целом, вся совокупность полученных результатов, позволяет предложить следующую упрощенную гипотетическую схему участия дрожжевых и растительных митохондрий в ответе клетки на тепловое воздействие. Повышение температуры вызывает открытие кальциевых каналов на плазматической мембране. Что это за каналы и как они функционируют, неизвестно. Полученные в данной работе результаты показывают, что при тепловом стрессе, в условиях низкой концентрации питательных веществ, транспорт кальция через плазматическую мембрану S. cerevisiae зависит от белков Midlp и Cchlp.

Кратковременное повышение [Са2+]су1 как непосредственно, так и косвенно, активирует экспрессию генов БТШ. Длительное повышение уровня кальция в ци-тозоле может иметь неблагоприятные последствия для клетки. Это может, наоборот, ингибировать экспрессию БТШ и стимулировать гибель. Поэтому из цитозоля кальций транспортируется либо в митохондрии, либо в другие клеточные компар-тменты. Поступление кальция в митохондрии и, вероятно, в другие клеточные компартменты зависит от значения мтДу. Если мтДу понизить в результате обработки митохондриальными ингибиторами, то транспорт Са2+ в митохондрии подавляется, он аккумулируется в цитозоле до критического уровня, при котором активация экспрессии БТШ не происходит. В свою очередь, обработка митохондриальными ингибиторами при обычной температуре инкубации повышает уровень кальция в цитозоле за счет его выхода из клеточных компартментов, что, в отсутствии теплового стресса, также может приводить к активации экспрессии генов БТШ.

Далее, кальций, либо косвенным образом, модулируя активность сигнальных систем, либо непосредственно, оказавшись в митохондриях, вызывает повышение уровня НАДН. Повышенный уровень НАДН стимулирует транспорт электронов по дыхательной цепи, усиливает продукцию АТФ, что в результате приводит к гиперполяризации внутренней митохондриальной мембраны и усилению продукции АФК. Повышение генерации АФК до определенного уровня также играет важную роль в активации экспрессии генов БТШ. Митохондрии, таким образом, выступают как «передатчик» и «реле» кальциевого сигнала. Если повышение температуры

достигает определенного порога, то нарушается функционирование АДФ/АТФ транслокатора. В результате, поступление АДФ в митохондрии прекращается, синтез АТФ ингибируется, что приводит к чрезмерному повышению мтД\|/. В этом состоянии генерация АФК митохондриями достигает критического уровня, экспрессия БТШ ингибируется, и активируются процессы гибели. Если тепловой шок не прекращается, повышенный уровень кальция в митохондриях и непрекращающаяся генерация АФК вызывают открытие митохондриальных пор, деполяризацию внутренней митохондриальной мембраны, выход цитохрома с и НврбОр из митохондрий в цитозоль, и, в конечном счете, активацию программы самоубийства.

Следовательно, программа адаптации, включающая в себя активацию экспрессии генов БТШ, и программа самоубийства имеют ряд общих знаменателей при повышении температуры: повышение уровня кальция в цитозоле, гиперполяризация внутренней митохондриальной мембраны и усиление продукции АФК. Митохондрии, таким образом, модулируя уровень кальция в цитозоле и продукцию АФК, определяют жизнь и смерть клетки при тепловом шоке.

ВЫВОДЫ

1. Теплолюбивость дрожжей (способность к росту при температурах выше оптимальной) и термотолерантность дрожжей (способность выдерживать кратковременный повреждающий тепловой шок) определяются различными механизмами. Наблюдается обратная зависимость между скоростью роста и термотолерантностью, чем медленнее скорость роста, тем больше устойчивость дрожжей к повреждающему действию теплового шока.

2. В условиях активного окислительного метаболизма в клетках дрожжей повышается конститутивный синтез белков теплового шока (БТШ) и возрастает активность антиоксидантных ферментов, что определяет повышение базовой термотолерантности.

3. Митохондрии 5. сегеушае образуют активные формы кислорода (АФК) при умеренном тепловом шоке, что является одним из факторов гибели клеток.

4. В клетках 5. сегеушае и А. /ИаНапа наблюдается прямая зависимость между гиперполяризацией внутренней митохондриальной мембраны и генерацией АФК при умеренном тепловом шоке.

5. Гиперполяризация внутренней митохондриальной мембраны, усиление продукции АФК, выход цитохрома с и НэрбОр из митохондрий сопровождают гибель клеток 5. сегеушде и А. (ИаПапа после умеренного теплового шока. Гибель клеток развивается во времени и имеет признаки программированной гибели. Механизм гибели клетки после теплового шока различается в зависимости от интенсивности теплового воздействия.

6. Повышение уровня БТШ подавляет развитие признаков программированной гибели в клетках 5. cerevisiae и А. (ИаНапа, что выражается в повышении жизнеспособности, в подавлении выхода из митохондрий цитохрома с и НврбОр, в снижении уровня продукции АФК и длительности гиперполяризации внутренней митохондриальной мембраны. Полученные результаты по-

зволяют предполагать, что БТШ растений и дрожжей, так же как БТШ животных, могут модулировать активность митохондрий и ингибировать развитие программированной гибели.

7. Тепловой стресс, активирующий экспрессию генов БТШ и развитие индуцированной термотолерантности в клетках S. cerevisiae и A. thaliana, сопровождается кратковременным повышением уровня Са2+ в цитозоле и гиперполяризацией внутренней митохондриальной мембраны. Гиперполяризация внутренней митохондриальной мембраны является необходимым условием для активации экспрессии БТШ при тепловом стрессе.

8. Повышение уровня Са2+ в цитозоле S. cerevisiae при тепловом стрессе определяется функционированием низкоаффинной и высокоаффинной (Midlp и Cchlp) системами транспорта Са2+ через плазматическую мембрану. Нарушение гомеостаза внутриклеточного кальция в клетке S. cerevisiae в результате одновременной утраты белков Midlp и Cchlp приводит к ингибирова-нию дыхательной активности и деполяризации внутренней митохондриальной мембраны, что указывает на существование связи между гомеостазом внутриклеточного кальция и функциями митохондрий в клетках дрожжей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Монография

Войников В.К., Боровский Г.Б., Колесниченко А.В., Рихванов Е.Г. Стрессовые белки растений. - Иркутск: Изд-во Института географии СО РАН, 2004. - 129 с. Статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Rikhvanov E.G., Varakina N.N., Sozinov D.Yu., Voinikov V.K. Association of bacteria and yeasts in hot springs // Appl. Environ. Microbiol. - 1999. - V.65, №9. - P.4292-4293.

2. Rikhvanov E.G., Varakina N.N., Rusaleva T.M., Rachenko E.I., Voinikov V.K. Sodium azide reduces the thermotolerance of respiratively grown yeasts // Curr. Microbiol. - 2002. - V.45, №6. - P.394-399.

3. Rikhvanov E.G., Rachenko E.I., Varakina N.N., Rusaleva T.M., Borovskii G.B., Voinikov V.K. Heat-shock-induced synthesis of Hspl04 Saccharomyces cerevisiae is regulated by mitochondrial activity // Eur. J. Biochem. - 2003. - V.270 (si). - P.138.

4. Rikhvanov E.G., Varakina N.N., Rusaleva T.M., Rachenko E.I., Knorre D.A., Voinikov V.K. Do mitochondria regulate the heat-shock response in Saccharomyces cerevisiae? // Curr. Genet. -2005. - V.48, №1. - P.44-59.

5. Rikhvanov E.G., Gamburg K.Z., Varakina N.N., Rusaleva T.M., Fedoseeva I.V., Tauson E.L., Stupnikova I.V., Stepanov A.V., Borovskii G.B., Voinikov V.K. Nu-clear-mitochondrial cross-talk during heat shock in Arabidopsis cell culture // Plant J. -2007. - V.52, №4. - P.63-78.

6. Rikhvanov E.G., Romanova N.V., Chemoff Y.O. Chaperone effects on prion and nonprion aggregates // Prion. - 2007. - V. 1, №4. - P.217-222.

7. Рихванов Е.Г., Войников В.К. Эффект внеклеточного белка, продуцируемого Bacillus sp., на термотолерантность дрожжей Debaryomyces vanriji // Прикладная биохимия и микробиология. - 1995. - Т.31, №3. - С.329-333.

8. Рихванов Е.Г., Боровский Г.Б., Войников В.К. Синтез белков теплового шока дрожжами Debaryomyces vanriji при различных температурах инкубирования // Физиология растений. - 1997. -Т.44, №1. - С.59-63.

9. Рихванов Е.Г., Созинов Д.Ю., Варакина H.H., Войников В.К. Стимулирующее действие Bacillus sp. на рост дрожжей Debaryomyces vanriji II Микробиология. - 1998. - Т.67, №5. - С.643-648.

10. Созинов Д.Ю., Рихванов Е.Г., Варакина H.H., Раченко Е.И., Войников В.К. Влияние температуры послешоковой инкубации на выживаемость дрожжей Debaryomyces vanriji II Физиология растений. - 1999. - Т.46, №2. - С.276-281.

11. Рихванов Е.Г., Варакина H.H., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Киселева В.А., Войников В.К. Влияние азида натрия на устойчивость к тепловому шоку дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Debaryomyces vanriji Н Микробиология. - 2001. - Т.70, № 3. - С.300-304.

12. Рихванов Е.Г., Варакина H.H., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Киселева В.А., Войников В.К. Изменение дыхания при действии теплового шока на дрожжи Saccharomyces cerevisiae И Микробиология. - 2001. - Т.70, № 4. - С.531-535.

13. Рихванов Е.Г., Варакина H.H., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Войников

B.К. Изучение действие азида натрия на термоустойчивость дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans Н Микробиология. - 2002. - Т.71, №6. -

C.768-772.

14. Рихванов Е.Г., Варакина H.H., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Войников В.К. Действие малоната натрия на термотолерантность дрожжей II Микробиология. -2003 - Т.72, №5. - С.616-620.

15. Рихванов Е.Г., Варакина H.H., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Войников В.К. Отсутствие прямой зависимости между способностью дрожжей расти при повышении температуры и их выживаемостью после летального теплового шока // Микробиология. -2003. - Т.72, №4. - С.476-481.

16. Рихванов Е.Г., Варакина H.H., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Войников

B.К. Действие ингибиторов цитохром оксидазного комплекса на термоустойчивость дрожжей // Микробиология. - 2003. -Т.72, №2. - С.174-179.

17. Рихванов Е.Г., Варакина H.H., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Боровский Г.Б., Войников В.К. Индукция синтеза Hspl04 Saccharomyces cerevisiae при тепловом шоке находится под контролем митохондрий // Генетика. - 2004. - Т.40, №4. -

C.341-347.

18. Раченко Е.И., Рихванов Е.Г., Варакина H.H., Русалева Т.М., Боровский Г.Б., Войников В.К. Действие азида натрия на базовую и индуцированную термотолерантность дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Физиология растений. - 2004. -Т.51, № 2. - С. 198-202.

19. Рихванов Е.Г. Войников В.К. Функции Hspl04p в развитии индуцированной термотолерантности и прионном наследовании у дрожжей Saccharomyces cerevisiae //Успехи современной биологии. - 2005. - Т. 125, №1. - С. 115-128.

20. Рихванов Е.Г., Лукина Е.А., Варакина H.H., Русалева Т.М., Гамбург К.З., Кнорре Д.А., Боровский Г.Б., Войников В.К. Митохондрии, как критическое звено в развитии ответа на тепловой шок у дрожжей с различным типом энергетического метаболизма // Физиология растений. - 2006. - Т.53. №5. - С.695-702.

21. Федосеева И.В., Гамбург K.M., Варакина H.H., Русалева Т.М., Таусон Е.Л., Ступникова И.В., Боровский Г.Б., Степанов A.B., Давыденко Е.А., Рихванов Е.Г., Войников В.К. Действие азида натрия и 2,4-динитрофенола на развитие инду-

цированной термотолерантности и индукцию синтеза БТШ101 в суспензионной культуре Arabidopsis thaliana II Физиология растений. - 2008. - Т.55, № 2. - С.245-252.

22. Павлова Е.Л., Рихванов Е.Г., Таусон E.JL, Варакина H.H., Гамбург К.З., Русапева Т.М., Боровский Г.Б., Войников В.К. Влияние салициловой кислоты на развитие индуцированной термотолерантности и индукцию синтеза БТШ в культуре клеток Arabidopsis thaliana II Физиология растений. - 2009. - Т.56, №1. -С.78-84.

23. Федосеева И.В., Варакина H.H., Русалева Т.М., Боровский Г.Б., Рихванов Е.Г., Войников В.К. Эффект ионов кальция на синтез Hspl04 и термотолерантность дрожжей Saccharomyces cerevisiae //Микробиология. - 2010. - Т.79, № 2. -С.173-179.

24. Пуляевская М.А., Варакина H.H., Гамбург К.З., Русалёва Т.М., Степанов A.B., Войников В.К., Рихванов Е.Г. Фторид натрия подавляет синтез БТШ в культуре клеток Arabidopsis thaliana, подвергнутых воздействию теплового стресса // Физиология растений. - 2011. -Т.58, №4. - С.533-541.

25. Гамбург К.З., Варакина H.H., Русалева Т.М., Таусон E.JL, Рихванов Е.Г., Боровский Г.Б., Войников В.К. Сравнение устойчивости к высокой температуре суспензионных культур арабидопсиса (Arabidopsis thaliana) и теллунгиеллы (:Thellungiella salsuginea) //Докл. Акад. Наук. - 2011. - Т.439, №3. - С.421-424.

26. Федосеева И.В., Пятрикас Д.В., Варакина H.H., Русалёва Т.М., Степанов A.B., Рихванов Е.Г., Боровский Г.Б., Войников В.К. Эффект амиодарона на термотолерантность и синтез Hspl04p у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Биохимия. - 2012. - Т.77, №1. - С.99-109.

Подписано к печати 05.06.2012 г. Формат 60*84/16. Объем 2,6 п.л. Тираж 150 экз. Заказ № 556. Издательство Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН. 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 1.

12-17093

2011355696

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Рихванов, Евгений Геннадьевич, Иркутск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ СИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

05201350645

Рихванов Евгений Геннадьевич

Митохондрия как критическое звено в ответе растительной и дрожжевой клетки на тепловое воздействие

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Войников Виктор Кириллович

Иркутск-2012

Оглавление

1. ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................10

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................................................17

2.1. Роль синтеза белков de novo в развитии индуцированной термотолерантности................17

2.1.1. Механизмы гибели клетки при тепловом шоке.............................................................17

2.1.2. Теплолюбивость и термотолерантность.........................................................................17

2.1.3. Индуцированная термотолерантность............................................................................18

2.1.4. Индуцированная термотолерантность и синтез БТШ...................................................19

2.1.5. Факторы, влияющие на индуцированную термотолерантность...................................20

2.1.6. Механизмы индуцированной термотолерантности, независимые от синтеза БТШ...23

2.2. Общая характеристика БТШ....................................................................................................25

2.3. Белок теплового шока Hspl04p/Hspl01p................................................................................28

2.3.1. Общая характеристика Hspl04p S. cerevisiae и HsplOlp A. thaliana............................28

2.3.2. Роль Hspl04p/Hspl01p в индуцированной термотолерантности.................................29

2.3.3. Hsp 104p/Hsp 101 р восстанавливает агрегированные белки...........................................29

2.3.4. Роль Hspl04p/Hspl01p в обычных условиях..................................................................30

2.3.5. Структура Hsp 104p/Hsp 10lp............................................................................................31

2.3.6. Механизм функционирования Hspl04p/Hspl01p...........................................................35

2.4. Семейство белков Hsp70p.........................................................................................................40

2.4.1. Общая характеристика белков семейства Hsp70p..........................................................40

2.4.2. Разнообразие и локализация белков семейства Hsp70p................................................41

2.4.3. Роль белков семейства Hsp70p в индуцированной термотолерантности....................41

2.4.4. Структурные и функциональные особенности семейства белков Hsp70p..................42

2.4.5. Механизм функционирования Hsp70p............................................................................44

2.5. Hsp90p........................................................................................................................................46

2.6. Низкомолекулярные (малые) белки теплового шока............................................................50

2.7. Регуляция экспрессии генов БТШ. Транскрипционные факторы........................................53

2.7.1. Фактор теплового шока....................................................................................................53

2.7.2. Транскрипционные факторы Msn2p и Msn4p S. cerevisiae...........................................57

2.8. Механизм активации транскрипционных факторов при тепловом стрессе........................59

2.8.1. Денатурационная теория активации ФТШ.....................................................................59

2.8.2. Фосфорилирование ФТШ.................................................................................................65

2.8.3. Другие механизмы транскрипционной активации ФТШ..............................................67

2.8.4. Регуляция активности транскрипционных факторов Msn2p/Msn4p S. cerevisiae.......68

2.9. цАМФ-зависимая сигнальная система....................................................................................72

2.9.1. Компоненты цАМФ-зависимого сигнального пути.......................................................73

2.9.2. Фенотипические проявления понижения и повышения активности цАМФ-ПКА.....73

2.9.3. Изменение уровня цАМФ при тепловом стрессе и связь с синтезом БТШ.................75

2.9.4. Как регулируется цАМФ-ПКА?......................................................................................76

2.9.5. Сигнальная система цАМФ-ПКА и активность митохондрий....................................79

2.9.6. Сигнальная система цАМФ-ПКА и программированная гибель клеток.....................81

2.10. Активация экспрессии генов БТШ в результате генерации АФК....................................81

2.10.1. Повышение уровня АФК сопровождается экспрессией генов БТШ............................81

2.10.2. АФК и активация транскрипционных факторов............................................................82

2.10.3. Источники генерации АФК..............................................................................................82

2.10.4. АФК как активатор экспрессии БТЯЕ-регулируемых генов 5. сегеч'тае...................84

2.11. Кальциевая сигнальная система...........................................................................................84

2.11.1. Кальций-связывающие белки...........................................................................................84

2.11.2. Тепловой стресс вызывает повышение уровня кальция в цитозоле.............................85

2.11.3. Повышение уровня кальция сопровождается развитием индуцированной термотолерантности и экспрессией БТШ.......................................................................................86

2.11.4. Кальций влияет на активность транскрипционных факторов......................................87

2.11.5. Связь между гомеостазом внутриклеточного кальция и экспрессией ЗТЯЕ-регулируемых генов у дрожжей......................................................................................................88

2.11.6. Механизм поступления кальция в клетку.......................................................................90

2.12. Роль фитогормонов в регуляции экспрессии генов БТШ.................................................92

2.12.1. Салициловая кислота........................................................................................................92

2.12.2. Монооксид азота...............................................................................................................96

2.12.3. Абсцизовая кислота, жасмоновая кислота и этилен......................................................97

2.13. Выводы из обзора литературы, постановка цели и задач исследования.........................99

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................................................................104

3.1. Объект исследования и условия культивирования..............................................................104

3.2. Определение температурных параметров роста..................................................................104

3.3. Определение жизнеспособности............................................................................................105

3.4. Концентрации агентов............................................................................................................106

3.5. Определение дыхательной активности.................................................................................106

3.6. Схема обработки митохондриальными ингибиторами и разобщителями при изучении их эффекта на термотолерантность и экспрессию БТШ......................................................................106

3.7. Определение активности каталазы........................................................................................107

3.8. Выделение суммарного белка................................................................................................107

3.9. Выделение цитоплазматической и митохондриальной белковых фракций......................108

3.10. Одномерный электрофорез................................................................................................109

3.11. Окраска и обесцвечивание гелей.......................................................................................109

3.12. Вестерн-блоттинг................................................................................................................109

3.13. В ыделение суммарной ДНК...............................................................................................110

3.14. ОТ-ПЦР-анализ...................................................................................................................110

3.15. Измерение потенциала на внутренней митохондриальной мембране...........................111

3.16. Измерение продукции АФК...............................................................................................111

3.17. Люминесценция экворина..................................................................................................112

3.18. Статистическая обработка данных....................................................................................112

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.................................................................................................................................ИЗ

4.1. Зависимость между скоростью роста и базовой термотолерантностью дрожжей...........113

4.1.1. Сравнение термотолерантности и теплолюбивости у различных видов дрожжей... 113

4.1.2. Влияние тиамина на теплолюбивость и термотолерантность дрожжей D. vanrijiae 115

4.1.3. Сравнение термотолерантности и теплолюбивости у мутантов S. cerevisiae с нарушением Са2+гомеостаза...........................................................................................................117

4.2. Митохондрии и тепловой шок...............................................................................................120

4.2.1. Эффект митохондриальных ингибиторов на дыхательную активность дрожжей.... 121

4.2.2. Сравнение термотолерантности видов дрожжей, различающихся по типу энергетического метаболизма........................................................................................................124

4.2.3. Эффект митохондриальных ингибиторов на термотолерантность дрожжей............128

4.2.4. Эффект альтернативной оксидазы на термотолерантность дрожжей........................131

4.2.5. Эффект мутации petite на термотолерантность S. cerevisiae.......................................134

4.3. Активность митохондрий при тепловом шоке.....................................................................138

4.3.1. Влияние теплового шока на продукцию АФК.............................................................138

4.3.2. Влияние повышения температуры на уровень дыхательной активности..................142

4.3.3. Влияние повышения температуры на изменение потенциала внутренней митохондриальной мембраны........................................................................................................146

4.4. Параметры гибели клетки при тепловом шоке....................................................................150

4.4.1. Влияние циклогексимида на термотолерантность дрожжей S. cerevisiae.................150

4.4.2. Динамика гибели клеток A. thaliana и S. cerevisiae после теплового шока...............152

4.4.3. Тепловой шок вызывает выход цитохрома с из митохондрий...................................156

4.5. Протекторная роль БТШ при тепловом шоке......................................................................158

4.5.1. Роль Hspl01p/Hspl04p в развитии индуцированной толерантности.........................158

4.5.2. Гибель клеток A. thaliana при тепловом шоке и синтез БТШ.....................................160

4.5.3. Гибель клеток S. cerevisiae при тепловом шоке и синтез БТШ..................................163

4.5.4. Влияние теплового стресса на выход цитохрома с и Hsp60p из митохондрий при тепловом шоке.................................................................................................................................163

4.5.5. Влияние теплового стресса на продукцию АФК и длительность гиперполяризации внутренней митохондриальной мембраны при тепловом шоке в клетках дрожжей S. cerevisiae

169

4.6. Митохондриальная регуляция экспрессии генов БТШ.......................................................173

4.6.1. Митохондриальная регуляция экспрессии гена Hspl04p 5. cerevisiae......................173

4.6.2. Митохондриальная регуляция экспрессии генов БТШ A. thaliana............................188

4.6.3. Эффект салициловой кислоты на индуцированную термотолерантность и синтез БТШ в культуре клеток A. thaliana................................................................................................198

4.6.4. Эффект фторида натрия на индуцированную термотолерантность и синтез БТШ в культуре клеток A. thaliana............................................................................................................204

4.7. Кальций и ответ дрожжей S. cerevisiae на тепловой стресс................................................210

4.7.1. Эффект мутаций в генах ССН1 и MIDI на повышение уровня кальция в цитозоле клетки S. cerevisiae при тепловом стрессе....................................................................................210

4.7.2. Эффект обработки азидом на повышение уровня кальция в цитозоле S. cerevisiae при тепловом стрессе.............................................................................................................................212

4.7.3. Эффект мутаций в генах ССН1 и MIDI на гиперполяризацию внутренней митохондриальной мембраны при тепловом стрессе..................................................................214

4.7.4. Эффект Midlp и Cchlp белков на синтез Hspl04p и развитие индуцированной термотолерантности........................................................................................................................216

5. Обсуждение.....................................................................................................................................219

5.1. Теплолюбивость и термотолерантность...............................................................................219

5.2. Организация дыхательной цепи у дрожжей.........................................................................225

5.3. Зависимость конститутивного синтеза БТШ от энергетического метаболизма...............226

5.4. Митохондриальная генерация АФК и гибель дрожжей при тепловом шоке....................228

5.4.1. Нарушение функционирования митохондрий снижает термотолерантность дрожжей, использующих окислительный энергетический метаболизм.....................................................228

5.4.2. Нарушение функционирования митохондрий приводит к противоположному эффекту на термотолерантность и продукцию АФК при тепловом шоке в клетках дрожжей, использующих бродильный и окислительный энергетический метаболизм............................229

5.5. Роль альтернативной оксидазы в термотолерантности дрожжей.......................................234

5.6. Механизм генерации АФК при тепловом шоке...................................................................235

5.6.1. Сайты продукции АФК при тепловом шоке.................................................................235

5.6.2. Причины образования АФК при повышении температуры........................................242

5.6.3. Механизм гиперполяризации внутренней митохондриальной мембраны................246

5.7. Механизмы гибели клетки при тепловом шоке...................................................................249

5.7.1. Типы клеточной смерти..................................................................................................249

5.7.2. Развитие ПГК при тепловом шоке.................................................................................250

5.7.3. Роль синтеза белков de novo в развитии ПГК...............................................................253

5.7.4. Динамика снижения жизнеспособности, как критерий активного характера процесса 254

5.7.5. Тепловой шок вызывает выход цитохрома с из митохондрий...................................255

5.7.6. Гиперполяризация внутренней митохондриальной мембраны как индикатор ранней стадии развития ПГК......................................................................................................................255

5.8. Роль белков теплового шока при развитии ПГК..................................................................256

5.8.1. Hspl04p и HsplOlp ингибируют развитие ПГК при тепловом шоке.........................256

5.8.2. Зависимость между синтезом БТШ и развитием ПГК................................................258

5.8.3. Тепловой стресс ингибирует выход дитохрома с и Hsp60p........................................259

5.8.4. Тепловой стресс ингибирует генерацию АФК и длительность гиперполяризации внутренней митохондриальной мембраны при тепловом шоке.................................................260

5.8.5. Ассоциация Hspl01p/Hspl04p с митохондриями........................................................261

5.9. Роль митохондрий в регуляции экспрессии генов БТШ.....................................................263

5.9.1. Эффект митохондриальных ингибиторов и разобщителей на термотолерантность и синтез БТШ при обычной температуре инкубации.....................................................................265

5.9.2. Эффект митохондриальных ингибиторов и разобщителей на индуцированную термотолерантность и синтез БТШ при тепловом стрессе.........................................................267

5.9.3. Экспрессия генов БТШ A. thaliana при воздействии салициловой кислотой...........272

5.9.4. Экспрессия генов БТШ A. thaliana при воздействии фторида натрия.......................274

5.10. Зависимость между гомеостазом внутриклеточного кальция и гиперполяризацией внутренней митохондриальной мембраны.......................................................................................274

5.10.1. Механизмы повышения концентрации кальция в цитозоле S. cerevisiae..................275

5.10.2. Влияние азида на гомеостаз внутриклеточного кальция при тепловом стрессе в клетках S. cerevisiae........................................................................................................................276

5.10.3. Влияние Mid 1 р и Cch 1 р на гиперполяризацию внутренней митохондриальной мембраны, индукцию синтеза Hspl04p и развитие индуцированной термотолерантности при тепловом стрессе в клетках 5. cerevisiae.......................................................................................277

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ...............................................................................................................................280

7. ВЫВОДЫ.........................................................................................................................................289

8. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................291

9. ПРИЛОЖЕНИЕ...............................................................................................................................359

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АА - антимицин А АБК - абсцизовая кислота АОХ - альтернативная оксидаза; АФК - активные формы кислорода БГК - бензгидроксамовая кислота БТШ - белки теплового шока

ДИК - дифференциально-интерференционный контраст

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНФ - 2,4-динитрофенол

ЗК - зеленый канал

КОЕ - колониеобразующая единица

КК - красный канал

мтДНК - митохондриальная ДНК

НАДН - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный НАДФН - никотинамиддинуклеотидфосфат восстановленный нмБТШ - низкомолекулярные белки теплового шока ОП - оптическая плотность

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

ПИ - пропидий иодид

ПКА - протеинкиназа А

ПГК - программированная гибель клеток

РТ - штамм родительского типа

СГК - салицилгидроксамовая кислота

СК - салициловая кислота

ТСБ - Трис-солевой буфер

Трис - 1М-трис-[гидроксиметил]-аминометан

ТТХ - 2,3,5 - трифенилтетразолиум хлорид

ЭГТА - (Этилендиокси) диэтилендинитротетрауксусная кислота

ЭДТА -Этилендиаминтетрауксусная кислота

ФАД - флавинадениндинуклеотид

ФДА - флуоресцеин диацетат

ФК - фазовый контраст

ФМСФ - фенилметилсульфонилфлюорид

ФТШ - фактор теплового шока

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

цАМФ-ПКА - цАМФ-зависимая протеинкиназа А

ЦГ - циклогексимид

ЭПР - эндоплазматический ретикулум 2+

[Са ]cyt - цитоплазматический кальций 2+

[Са ]mit - митохондриальной кальций

ААА+ - АТФазы, связанные с различными активностями клеток (ATPases associated with

various cellular activities)

BiP - связывающий белок (binding protein)

CaM - кальмодулин

СССР - карбонил-цианид-3-хлоро-фенилгидразон (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone)

CDRE - кальценеврин-зависимый элемент ответа (calcineurin-dependent responsive element) CHIP - белок, взаимодействующий с С-кон�

Информация о работе

Рихванов, Евгений Геннадьевич
доктора биологических наук
Иркутск, 2012
ВАК 03.01.05

Диссертация

Митохондрия как критическое звено в ответе растительной и дрожжевой клетки на тепловое воздействие - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы