Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функционирование дыхательной цепи растительных митохондрий при температурных стрессах

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Функционирование дыхательной цепи растительных митохондрий при температурных стрессах"

о

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

Сибирский институт физиологии и биохимии растений

ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ РАСТИТЕЛЬНЫХ МИТОХОНДРИЙ ПРИ ТЕМПЕРАТУРНЫХ СТРЕССАХ

03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

На правах рукописи УДК 581.12:577.3

ПОБЕЖМОВА Тамара Павловна

Иркутск, 1997

Работа выполнена в Сибирском институте физиологии и биохим растений СО РАН, Иркутск.

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор В. К. Войникав.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ю.М.Константинов;

доктор биологических наук, профессс Л.П.Хоклоза;

академик ААО, профессор, доктор биологических наук Н.Э. Шиш.

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО Р/ г.Новосибирск

Зашдта диссертации состоится "АЕ." 199? г.

на заседании диссертационного совета Д 003.25.01 по защите сертаций на соискание ученой степени доктора наук в Сибир институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г.Иркутск, ул.Лерыонтова, 132, а/я 1243

С диссертацией можно ознакомиться в ' библиотеке Сибирс института физиологии и биохимии растений СО РАН.

Автореферат разослан "3 " г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

^ Г.П.Аки

Актуальность проблемы. Изучение внутриклеточных механизмов адаптации растений к неблагоприятным факторам среда является важным направлением физиологии растений. Действительно, температура определяет рост и развитие растений и их географическое распространение. Неблагоприятные температурные условия часто сдерживают применение в практике ценных в хозяйственном отношении сортов и гибридов сельскохозяйственных растений (Коровин, 1984; Родченко, 1988; Кравец, 1996; Крвдцл и др., 1996; Хансен и др., 1996). Это обстоятельство обусловливает актуальность исследований, направленных на познание механизмов, определяющих толерантность растений к жестким температурным условиям.

Важными этапами в понимании природы устойчивости растений к неблагоприятным температурам явились исследования физиологических и биохимических процессов, способствующих выживанию растений в стрессовых температурных условиях (Красавцев, 1972; Туманов, 1979; Браун, 1983; Касперска-Палач, 1983; Кравец, 1996; Levitt, 1966). Было установлено, что реакция растений на температурный стресс сопровондается изменениями структуры клеточных мембран (Kuiper, 1974; Smolenska, Kuiper, 1977; Rivera, Penner, 1978; Horvath et al., 1980), активности ферментов (Войников, Тимина, 1983; Войников и др., 1986), функционирования клеточных органелд (Войников, 1987), экспрессии генов и синтеза белков (Войников, Боровский, 1994; Кузнецов, Рощупкин, 1994; Vierling, 1990, 1991).

Вызванные температурным стрессом изменения в метаболизме клеток требуют соответствующего энергетического обеспечения. Поэтому вполне понятно, что митохондрии и их реакция на изменение температуры находятся в поле зрения исследователей (Семихатова, 1974, 1990; Кравец, 1983; Войников, 1987; Хохлова, 1993; Кислюк и др., 1996; Lin, Markhart, 1990; Madden, Burris, 1995). Митохондрии функционируют в системе целостной клетки и поэтому при изучении регуляции их активности при температурных стрессах на первый план выходят вопросы их интеграции с другими клеточными компарт-ментачи и внутриклеточные механизмы регуляции активности этих ор-ганелл.

Открытие стрессовых белков, белков теплового (БТШ) и холодо-вого (ВХШ) шока, привело к некоторому прогрессу в понимании ядерно-митохондриаль ной интеграции. Установлено, что среди БТШ, обнаруженных как в цитоплазме, так и в митохондриях, имеется ряд бел-

ков, функции которых связаны с митохондриями (Moore et al., 1994; Schatz, 1993, 1995, 199В). Эти белки-шейпероны осуществляют перенос функционально значимых для органелл белков через митохондри-альные мембраны. Вполне понятно, что через синтез стрессовых белков может осуществляться контроль ядерного генома за энергетической активностью митохондрий при температурных стрессах, хотя полностью механизм такого контроля пока неясен.

Кроме синтеза стрессовых белков, видимо, существуют и другие механизмы, с помощью которых осуществляется контроль клетки за энергетической активностью митохондрий при температурных стрессах. Изучение этих механизмов представляется важным. Кроме того, остается неизученным такой важный вопрос, как функциональная автономность растительных митохондрий при температурных стрессах.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение молекулярных механизмов реакций растительных митохондрий на температурные стрессы.

Для достгасения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1) выявить реакцию митохондрий на действие гипо- и гипертермии; 2) определить полиморфизм по этому признаку; 3) изучить генетический контроль за энергетической активностью митохондрий в условиях изменяющейся температуры; 4) определить степень функциональной автономности митохондрий; 5) определить тер-моусгойчивость отдельных комплексов дыхательной цепи; 6) изучить функциональную стабильность этих комплексов в условиях in vitro;

7) изучить причины функциональной нестабильности этих комплексов;

8) определить механизмы, стабилизирующие функционирование отдельных комплексов дыхательной цепи; 9) выяснить роль стрессовых белков в такой стабилизации.

При решении поставленных задач использовали два экспериментальных подхода. Изучение реакции митохондрий на изменение температуры in vivo и анализ энергетической активности митохондрий и отдельных комплексов дыхательной цепи при действии температуры in vitro.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Реакция растительных митохондрий на изменение температуры генетически детерминирована и протекает с участием стрессовых белков.

2. При гипотермии посредником в ядерно-митохондриальных1 от-

ношениях является стрессовый белок 310 кД.

3. Растительные митохондрии в функциональном отношении не являются автономными органеллами.

4. Комплексы дыхательной цепи растительных митохондрий различаются по терюустойчивости и функциональной стабильности.

5. Комплекс I дыхательной цепи и дегидрогеназы, с ним связанные, термочувствительны и функционально нестабильны.

6. Реконструкция энергетической активности инактивированных in vitro митохондрий осуществляется внутриклеточными белками.

Научная новизна. В настоящей работе на большом экспериментальном материале проведено детальное изучение характера изменений окислительной активности митохондрий злаков после действия высокой и низкой температуры.

Получены генетические доказательства существования контроля со стороны ядерного генома за энергетической активностью митохондрий при гнпо- и гипертермии. В частности, при использовании линий озимой пшеницы Безостая 1 с межсортовым замещением хромосом от морозоустойчивой пшеницы Альбидум 114 было установлено, что гены, контролирующие функциональную активность митохондрий при гшотершш локализованы a ID и 6D хромосомах гапенищ Альбидум 114.

При выяснении вопроса о механизмах генетической регуляции активности растительных митохондрий при гило- и гипертермии установлено, что контроль осуществляется через синтез цитоплазмати-ческих белков. Впервые показано, что при гипотермии посредником в осуществлении тасого контроля за функциями митохондрий и термоге-незом является стрессовый белок 310 кД. Этот белок обнаружен в митохондриях и при кратковременной гипотермии вызывает переход органелл в низкоэнергетическое состояние. Количество этого белка при гипотермии в проростках морозоустойчивых озимых злаков резко увеличивается, а в 1 и б хромосомах D-генома пшеницы Альбидум 114 локализованы гены, контролирующие синтез стрессового белка 310 КД.

На примере сукцинатдегидрогеназы изолированных митохондрий озимой ржи показано, что регуляция митохсндриальной активности в меняющихся температурных условиях может осуществляться через изменения кинетических параметров фермента.

Впервые для растительных митохондрий определена степень их функциональной автономности в меняющихся температурных условиях и

изучена термоустойчивость и функциональная стабильность отдельных комплексов дыхательной цепи. Установлено, что комплексы III и IV дыхательной цепи и "внешняя" NADH-дегидрогеназа являются наиболее термоустойчивыми и функционально стабильными. Комплекс I является нестабильным комплексом дыхательной цепи. Впервые изучены причины функциональной нестабильности комплекса I в условиях in vitro и показано, что нестабильность этого комплекса связана с инактивацией а-кетоглутаратдегидрогеназы и с инактивацией самого комплекса I. Инактивация а-кетоглутаратдегидрогеназы, как установлено, объясняется истощением тиаминпирофосфата в изолированных митохондриях в условиях in vitro в результате активации фосфатазы, дефосфоршшрующей этот кофермент. Инактивация комплекса I связана с дефицитом в изолированных митохондриях внутриклеточных белков, в том числе и стрессовых, синтезирующихся в клетке и затем транспортируемых в митохондрии. Впервые установлено, что внутриклеточные белки, стабилизирующие активность митохондрий в условиях in vitro, имеют несколько компонентов. Небольшие пептиды, возможно, связанные с тиаминпирофосфатом (для предотвращения инактивации а-кетоглутаратдегидрогеназы), и белки с массами до 30 кД (для поддержания комплекса 1 в функциональном состоянии). Причем, в клетках растений разных видов имеются сходные белковые компоненты (с мол. массой 14-30 кД), которые необходимы для нормального функционирования митохондрий.

Показана возможность транспорта электронов при окислении ма-лата через ротенон-нечувствительную NADH-дегидрогеназу. Эти результаты подтверждают ранее выдвинутое предположение о разделении • компартментов ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы и комплекса I.

Теоретическая и практическая ценность. Выполненная работа лежит в рамках такой важной проблемы физиологии растений как изучение внутриклеточных механизмов адаптации растений к неблагоприятным факторам среды. Впервые проведенные в работе исследования показали существование значительного полиморфизма по признаку активности митохондрий высших растений в условиях температурного стресса и доказали генетическую детерминацию этого признака. Изучение степени функциональной автономности растительных митохондрий в меняющихся температурных условиях и проведенный анализ термоустойчивости и функциональной стабильности отдельных комплексов

дыхательной цепи позволили получить важную в теоретическом отношении информацию об особенностях функционирования митохондрий высших растений при температурных стрессах. Полученные в работе сведения о механизмах регуляции растительных митохондрий при ги-по- и гипертермии расширяют понимание этого вопроса и доказывают реальность существования информационной связи между ядерным геномом и митохондриями в условиях меняющейся температуры.

Разработанные в лаборатории при участии автора модификации методов выделения и изучения растительных митохондрий широко применяются и могут быть использованы в ряде научно-исследовательских учреждений.

Апробация работы. Основные положения диссертации долсжены на Всесоюзной конференции "Устойчивость к неблагоприятным факторам среды и продуктивность растений" (Иркутск, 1984), на V республиканской конференции "Физиологические основы повышения продуктивности и устойчивости зерновых культур" (Целиноград, 1984), на конференции "Физиолого-биохимические основы продуктивности кукурузы" (Днепропетровск, 1984), на Всесоюзной конференции "Рекомби-ногенез: его значение в эволюции и селекции" (Кишинев, 1985), на Всесоюзной конференции "Онтогенетика высших растений" (Кишинев, 1989), на конференции "Актуальные проблемы физико-химической биологии и биотехнологии" (Алма-Ата, 1989), на Всесоюзной конференции "Генетические механизмы устойчивости растений к стрессам" (Иркутск, 1991), на Третьем съезде ВОФР (Санкт-Петербург,1993), на 9-ом конгрессе РЕБРР (Брно, 1994), на конференции "Физико-химические основы растительной физиологии" (Пувдно, 1996), на 9-ой Европейской биоэнергетической конференции (Бельгия, 1996), на научных сессиях СИФЙБР СО РАН (Иркутск, 1994, 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 401 странице машинописного текста, содержит 58 рисунков, 26 таблиц; состоит из введения, обзора литературы (5 глав), методической части, экспериментальной части (3 главы), заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 453 наименования, из них 170 - на русском языке.

Работа выполнялась в лаборатории физиологической генетики Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН и была частично поддержана грантами Российского Фонда Фундаментальных

Исследований: проект 93-04-21695 "Ядерно-митохондриальная интеграция в растительной клетке при температурном стрессе: роль стрессовых белков в регуляции энергетической активности митохондрий", 1993-1995 г., проект 97-04-48080 "Функции стрессовых белков в растительной клетке при гипотермии", 1997-1999 г.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе были использованы растения кукурузы (Zea mays L.) гибрида Краснодарский 303, сорта ВИР 36 и линий В14, M14RT, 0h56A, W22, W155, а также клетки суспензионной культуры кукурузы (Поликарпочкина и др., 1979; Policarpochkina et al., 1979).

Кроме того, в работе были использованы проростки гороха (Pi-sum sativum L.) и растения озимых злаков-, мягкая пшеница (Triti-cum aestivm L.) сортов Альбидум 11, Альбидум 24, Альбидум 114, Безостая 1, Заларинка; рожь (Secale cereale L.) сортов Тулунская зеленозерная, Омка, Дымка; линии озимой пшеницы Безостая 1 с межсортовым замещением хромосом от зимостойкой пшеницы Альбидум 114, полученные от Е.Г. Жирова (Краснодарский НИИ сельского хозяйства, Краснодар). Линии пшеницы Безостая 1 с межсортовым замещением хромосом от пшеницы Альбидум 114 имели следующие замещенные пары хромосом: ID, 2D, 3D, 4D, 5D, 60, 1А, IB, 6А и были получены с использованием моносомных линий пшеницы Безостая 1 (Puchkov, Zhi-rov, 1978) после 6-7 беккросов.

В экспериментах были использованы 2, 3, 4-дневные этиолированные побеги, 2-3-дневные корни проростков кукурузы 2-2,5-дневные побеги проростков озимых ржи и пшениц и 5-дневные побеги проростков гороха. Клетки суспензионной культуры кукурузы использовали в экспоненциальной фазе роста на 3-4 день после пассажа.

Растительный материал подвергали действии гшо- и гипертермии. Действие низкой температуры изучали на проростках озимой пшеницу и ржи. Для этого побеги проростков охлаждали при температуре 0°С в течение различного времени (от 20 мин до 2 чес). При изучении действия гипертермии использовали проростки кукурузы.

Тепловую обработку проростков кукурузы проводили при температурах 36, 41, 46 и 51 °С в течение 1-3 час и при температуре 41°С в течение 3-24 час. При выборе опытных объектов и температур воздействия учитывалось природное соответствие между выбранными растениями и температурными условиями их жизни (Александров,

1975).

При работе с суспензионной культурой клеток кукурузы колбы с тканью помещали на 1 час в термостатируемый шейкер с заданной температурой (от 0°С до 60°С). В некоторых экспериментах колбы с культурой кукурузы находились при 7° и 45°С в течение 4-5 час или при 41°С в течение 30-60 мин.

Для блокирования зависимого от ядра цитоплазматического синтеза белка использовали цикдогексимид (1 мг/л) (Yang, Scandal ios, 1977; Титов и др., 1981). Фосфолипазу Аг ингибировали местным анестетиком - прокаином (40 мМ) (Scherphof et al., 1972). Для расщепления растительных белков использовали проназу Е (3 мг/мл).

Об угнетении ростовых процессов проростков кукурузы после действия повышенной температуры судили по степени угнетения роста (Иванов, 1974).

Температуру тканей побегов пшеницы при охлаждении (от 20°С до -4°С) регистрировали с . помощью термопары медь-константан, подключенной к выходу высокочувствительного самопишущего потенциометра EZ-7 (ЧССР). Измерения температуры образцов ткани ("живой" и "неживой") регистрировали в течение 1 час. Полученные кривые были проверены на экспоненциальную зависимость (Vojnikov et al., 1984).

Митохондриальные фракции выделяли с помощью дифференциального центрифугирования (Войников, 1980). Очистку митохондрий проводили с помотаю перкола (21%) (Войников и др., 1991).

Окислительную и фосфорилирутацую активность изолированных митохондрий регистрировали полярографически с платиновым электродом закрытого типа на полярографах LP 60 (ЧССР) и ОН 105 (Венгрия).

В экспериментах по изучению влияния гипотермии на кинетические параметры сукцинатдегидрогеназы (СДГ) проростков озимой ржи окислительную активность митохондрий регистрировали при температурах 5, 10, 15, 20 и 25°С. Кажущуюся константу Михазлиса (Км) и максимальную скорость окисления (Vmax) определяли из графиков Лайнуивера-Бэрка (Виноградова, 1978), либо по методу Зйзенталя и Корниш-Боудена (Диксон, ' Уэбб, 1982), либо по средним значениям (Диксон, Уэбб, 1982).

Для определения термоустойчивости отдельных комплексов дыхательной цепи растительных митохондрий была использована модельная система изолированных митохондрий побегов кукурузы, помещенных in

vitro в условия изменяющейся температуры (0-98°С) и окисляющих различные субстраты цикла трикарбоновых кислот. Субстраты были подобраны таким образом, что в транспорте электронов при их окислении участвовали отдельные комплексы дыхательной цепи: сс-кетог-лутарат и малат (I - IV комплексы); сукцинат (II - IV комплексы); NADH (III - IV комплексы); аскорбат плюс TMPD (IV комплекс).

Функциональную стабильность отдельных комплексов дыхательной цепи митохондрий оценивали в системе In vitro при 27°С в течение 1,5 час.

Для выделения легкорастворимых белков использовали побеги и корни проростков кукурузы и побеги ржи, пшеницы, гороха - растений, выросших при 27°С, а также побеги проростков кукурузы, которые были прогреты при температуре 41°С в течение 12 час (Войни-ков и др., 1986). Полученный белковый препарат либо сразу использовали в экспериментах, либо получагш из него термостабильную фракцию (Войников и др., 1990). Белковые фракции (БФ) перед использованием растворяли в среде ресуспендирования (CP) следующего состава: сахароза (250 мМ), КН2Р04 (18 мМ), АТФ (4ыМ), АДФ (6 мЫ), а-кетоглугарат (5 ыМ), малонат (3 мМ), pH 7,4 и использовали в экспериментах по изучению влияния растительных белков на энергетическую активность митохондрий. Соотношение митохондрий и добавляемых белков в суспензиях было 3:1 и 5:1.

При определении зависимости фосфоршшрующего дыхания изолированных митохондрий от концентрации белкового фактора была использована термостабильная белковая фракция, растворенная в СР. БФ добавляли к суспензии изолированных митохондрий в количестве от 40 до 200 мкг на 1 мг митохондрий и получали смеси, содержащие 40 , 60 , 80, 100 и 200 мкг БФ на 1 мг белка митохондрий. Эти смеси инкубировали при 27°С от 1-2 мин (исходный вариант) до 2 час. Одновременно инкубировали суспензию митохондрий, в которую вместо БФ добавляли соответствующий объем СР.

Эффективность взаимодействия митохондрий с БФ характеризовали с помощью параметра, аналогичного К'м (Диксон, Уэбб, 1982; Войников и др., 1991).

При определении способности растительных белков восстанавливать энергетическую активность инактивированных in vitro митохондрий изолированные митохондрии ресуспендировали в растворе, содержащем сахарозу (250 мМ), КН2РО4 (18 мМ), pH 7,4 и делшш на

две части. Обе части инкубировали при 27°С в течение 30 мин. После чего к одной добавляли термостабильную фракцию растительных белков, а к другой - среду, которую использовали для растворения белков. Обе порции митохондриальной суспензии инкубировали при 27°С еще 1 час и использовали для определения энергетической активности (Войников и др., 1991).

Активность фосфатазы, дефосфоршшрующей тиаминпирофосфат, определяли в суспензии разрушенных митохондрий по содержанию фосфора, освобожденного в ходе реакции расщепления субстрата (тиа-минпирофосфата) (Никулина, 1965; Побезпшова и др., 1997) и выражали в мкг неорганического фосфора в мин на мг белка, содержание которого определяли по методу Schafener and Weissman (1971).

Количество тиаминпирофосфата (ТШ) определяли флюорометри-чески с помощью метода, основанного на окислении ТШ красной кровяной солью в щелочной среде (Луковникова, Ярош, 1987). Объектом исследования были свежевыделенные митохондрии проростков кукурузы и митохондрии после 30 и 60 мин инкубации при 27°С в CP, и затем разрушенные ультразвуком (Побежимова и др., 1995).

Разделение термостабильных белков, полученных из побегов 3-дневных проростков кукурузы осуществляли с помощью гель-фильтрации на сефадексе S-25 ("Pharmacia", Швеция) (Остермая, 1985).

Фракция низкомолекулярных компонентов, полученная в результате гель-фильтрации на сефадексе G-25, была разделена с помощью ВЭНХ. Обращенно-фазовая хроматография выполнялась на колонке (2x60 мм) с носителем Nucleosil-Cis, 5 мкм.

Белок холодового шока с мол. массой 310 кД был выделен А.В.Колесниченко (Колесниченко и др., 1996).

Электрофорез белков в ПААГ с ДЦС-Na проводили в блоках поли-акриламидного геля в модифицированной системе Лэммли (Laemmli, 1970), используя прибор для электрофореза Mini-PROTEAN II Elect-rophoretic Cell фирмы BIO-RAD (США).

Расчет полученных данных производили на 1 мг белка (Lowry et al., 1951). При работе, с замещенными линиями озимой пшеницы пов-торность опытов была 3-4 кратная. Во всех остальных случаях пов-торяость 8-10 кратная. Полученные результаты обработаны статистически: рассчитаны средние арифметические значения, ошибки средних и доверительные интервалы согласно t-критерию Стьюдента при р=0,05 (Лакин, 1980).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Исследования энергетической активности митохондрий после действия температурного фактора (гипер- и гипотермии) in vivo и in vitro было проведено на органеллах, полученных с помощью быстрого метода изоляции (Войников, 1980). Целесообразность быстрой изоляции митохондрий в том, что уже через 25-30 мин после окончания температурного воздействия на растительный материал можно регистрировать активность органелл. Кроме того, использование этого способа выделения позволило получить митохондрии хорошего качества из разных объектов (побеги и корни кукурузы, побеги пшеница, ржи и гороха, клетки суспензионной культуры кукурузы). Изолированные митохондрии имели высокий дыхательный контроль и воспроизводимые из опыта в опыт величины окислительной и фосфоршшрувдей активности (рис.1).

зионной культуры кукурузы (Б). Над кривыми указана скорость поглощения кислорода (наномоль Ог/мин/мг белка) и дыхательный контроль, под кривыми - отношение АДФ:0, а-КГ - а-кетоглутарат (5 мМ), М - митохондрии, ДНФ - динитрофенол (39 мкМ). Стрелками обозначены моменты внесения АДФ.

1. ЭНЕРГЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИТОХОНДРИЙ ОЗИМЫХ ЗЛАКОВ ПРИ ГИПОТЕРМИИ

При изучении последействия гипотермии (0°С, 2 часа) на энергетическую активность митохондрий были использованы озимые злаки, так как эти растения зволюционно приспособлены к действию низких температур. Оказалось, что по реакции на низкотемпературное воздействие митохондрии растений, контрастных по морозоустойчивости, значительно различаются. В частности, митохондрии побегов морозоустойчивой пшеницы Альбидум 114 в ответ на охлаждение растений переходят в низкоэнергетическое состояние. Оно характеризуется увеличением окислительной активности, прежде всего увеличением скорости нефосфорилирующего дыхания (состояние 4) и снижением степени сопряженности окисления и фосфоршшрования (дыхательный контроль) (табл.1). В это время митохондрии незимостойкой пшеницы Безостая 1, изолированные из охлажденных побегов, по сравнению с контролем (26°С) не изменили показатели окислительной активности (табл.1). Следует заметить, что эти изменения в митохондриальной активности не обусловлены гибелью или повреждением растений (табл.2).

Переход митохондрий в низкоэнергетическое состояние приводит к термогенезу, в результате чего температура побегов проростков морозоустойчивой озимой пшеницы сорта Альбидум 11 была в течение

Таблица 1

Окислительная активность митохондрий, изолированных из побегов проростков озимых пшениц Альбидум 114 и Безостая 1 после холодового воздействия (0°С, 2 ч). Субстрат окисления - л-кетоглутараг (5 мМ). Указан доверительный интервал при 5% уровне значимости.

Сорт Состояние 4* ДК Состояние 4* ДК

Неохлажденные побеги Охлажденные побеги

Альбидум 114 4,7±0,7 4,85+0,08 8,7+0,4 2,66+0,14

Безостая 1 6,3+0,5 5,21+0,10 6,5+0,2 5,38+0,18

*Наноыоль Ог/мин/мг белка

Таблица 2

Выживаемость (%) незакаленных 2-дневных побегов озимой пшеницы после их охлаждения

Сорт Условия охлаждения

0°С, 1ч 0°С, 24ч ■4°С, 1ч -4°С, 24ч

Альбидум 114 Безостая 1 100 100 100 100 100 100 100 100

Рис.2. Изменение температуры побегов озимой пшеницы Альби-дум 11 при холодовом шоке (-4°С'

1 - инфильтрация водой;

2 - инфильтрация КСН;

3 - инфильтрация прокатом;

4 - пшеница Безостая 1, инфильтрация водой

первых 25-30 мин охлаждения выше 0°С и превышала в это время температуру сравниваемого (неживого) образца на 3,4°С (рис.2). Эксперименты с КСИ подтверждают заключение о том, что термогенез обусловлен теплопродукцией митохондрий (рис. 2,2). Следует заметить, что максимум теплопродукции (через 15 мин) проростков слабозимостойкой пшеницы сорта Безостая 1 (рис.2,4) значительно уступает пику максимальной д°С проростков пшеница Альбидум 11.

Данный признак (переход митохондрий в низкоэнергетическое состояние) генетически контролируется. Соответствующие гены локализованы в ядерном геноме (у озимой пшеницы в 1Е>— и 61)-хромосомах). Этот вывод следует из результатов экспериментов с замещенными линиями пшеницы, в клетках которых хромосомы Б-генома неморозоустойчивой озимой пшеницы Безостая 1 замещены на гомологичные хромосомы Б-генома морозоустойчивой пшеницы Альбидум 114. Митохондрии только двух линий с замещенными Ю и 60-хромосомами имели переход в низкоэнергетическое состояние при гипотермии как и ми-

ВРЕМЯ, мин

тохондрии (рис.3).

донора этих хромосом

пшеницы сорта Альбидум :14

12

. стз -г а;

§ § 10 о

и

с?

с-, о 4

□ КОНТРОЛЬ

Е^0°С,С0 МИН

Г*

гЬ

гЬ

Г*

гЬ

а

Б-1 А-114 1 ИСХОДНЫЕ ФОРШ

3

4

5

ЗАМЕЩЕНИИ ЛИШИ

Рис.3. Влияние отдельных хромосом Б-генома пшеницы Альбидум 114 на переход митохондрий замещенных линий в низкоэнергетическое состояние при гипотермии (0°С, 1 ч). Субстрат окисления - <х-ке-тоглутарат (5мМ). Указан доверительный интервал при 5% уровне значимости.

1-6 - линии пшеницы Безостая 1 с замещенными хромосомами 1,2,3,4,5,6 от 0-генома пшеницы Альбидум 114

Посредником в обнаруженном генетическом контроле выступает белок 310 кД. Этот белок выделен из побегов озимых ржи и пшеницы (Колесниченко и др., 1996). Количество его в проростках морозоустойчивых озимых злаков при гипотермии резко возрастает. Нативный

440

С Я

Рис.4 (слева). Нативный электрофорез белка 310 кД в градиенте плотности (4,5-20%) ПААГ. Слева показан ана-

_- ,4 лизируемый белок 310 кД; справа -

белки-стандарты и их молекулярные 67 массы (кД).

^ «яз» "3 Рис.5 (справа). Денатурирующий

электрофорез белка 310 кД в ПААГ (12,5%) с ДДС-Яа. Слева показан спектр субъединиц (66 и 5Б кД) анализируемого белка; справа - белки-стан-Рис.4. Рис.5. дарты и их молекулярные массы (кД).

10

белок имеет массу 310 кД (рис.4) и содержит два типа субъединиц 66 и 56 кД (рис.5). Этот белок обнаружен в растительных митохондриях (рис.6). При гипотермии он вызывает переход митохондрий в низкоэнергетическое состояние (рис.7).

Преципитация

Рис.6. Двойная иммунодиффузия в ага-розном геле (IX) антисыворотки на белок 310 кД и митохондриальных белков М - белка, полученные из митохондрий

озимой пшеницы; А-иммунная сыворотка на белок 310 кД

60г

40

20

ill

Рис.7. Нефосфорилирующее дыхание (состояние 4) митохондрий озимой пшеницы после их инкубации in vitro с белком 310 кД в условиях гипотермии (0°С) в течение 90 мин 3-без добавления белка ЗЮкД или БСА; 2-в присутствии белка 310 кД (1 иг на 3 иг тт. белка); 3-в присутствии ЕСА (1 иг на 3 иг тт. белка)

+

Косвенное подтверждение зависимости окислительной активности митохондрий в меняющихся температурных условиях от системы целостной клетки было получено при изучении кинетических параметров сукцинатдегидрогеназы (СДГ)- Изучение температурного воздействия (5°, 10°, 15°, 20°, 25°С) на кинетические параметры (Км и Ушах) СДГ было проведено на митохондриях высокоморозоустойчивой озимой ржи, выделенных из охлажденных (-4°С, 1 ч) и неохлажденных проростков.

Для СДГ митохондрий, изолированных из неохлажденных проростков, обнаружен температурный оптимум в области 20°С, именно при

этой температуре данный фермент достигает своего наивысшего сродства к субстрату (судя по обратной величине Км) и обнаруживает большую активность (табл.3). Снижение или повышение температуры от этого значения приводило к уменьшению Ущах. При снижении температуры до 5°С происходило резкое уменьшение фермент-субстратного сродства. У митохондрий, выделенных из предварительно охлажденных проростков, подобные температурные изменения кинети-

Таблица 3

Влияние температуры на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий, изолированных из побегов озимой ржи Тулунская зеленозерная. Указан доверительный интервал при 5% уровне значимости.

Темпе-

ратура, Утах* %(мМ) Ушах* Км(мМ)

°С

Неохлажденные побеги Охлажденные побеги

5 33,0+3,0 7,1 51,2+4,1 2,1

10 50,0+4,0 2,0 54,1+0,5 0,42

15 83,0+5,0 0,66 96,1+0,8 0,39

20 83,0+5,0 0,28 127,1+3,2 0,41

25 50,0+4,0 0,66 132,0+2,1 0,32

*Наномоль СЬ/мин/мг белка

ческих параметров СДГ не обнаружены. Уменьшение сродства фермента происходило только при снижении температуры до 5°С (табл. 3). Обнаруженные различия в температурной чувствительности СДГ дают основание предполагать температурную индукцию изменений активности фермента в целой клетке. Возможно, изменение температуры приводит к нарушению информации молекулы и синтезу новых изоформ фермента (Хочачка, Сомеро, 1988), что автоматически предполагает участие в этом процессе ядерного генома, который, вероятно, кодирует синтез молекул СДГ (Сэджер, 1975). Другое предположение состоит в том, что при охлаждении изолированных митохондрий по каким-то причинам не происходит индукция факторов, приводящих к изменению молекулы СДГ. Среди этих причин могут быть как слишком короткое время эксперимента (около 20 мин охлаждения митохондрий), так и отсутствие

цитоплазматической белоксинтезирующей системы (как впрочем, всех остальных компонентов клетки).

Таким образом, на кратковременную гипотермию in vivo мит< хондрии озимых злаков отвечают изменением энергетической актм ности. Органеллы морозоустойчивых озимых злаков в этих условиз переходят в низкоэнергетическое состояние. Этот переход сопровсю дается термогенезом и генетически контролируется. У озимой пшею цы соответствующие гены локализованы в 1D- и 6D-хромосомах кл< точного ядра. Белок 310 кД является одним из посредников, с п< мощью которого осуществляется генетический контроль ядра за пер< ходом митохондрий в низкознергетическое состояние и термогенезо:

Z. ДЕЙСТВИЕ ТЕПЛОВОГО ШОКА НА АКТИВНОСТЬ МИТОХОНДРИЙ И РОСТ ПРОРОСТКОВ КУКУРУЗЫ

Энергетическая активность митохондрий побегов 3-суточга проростков кукурузы после кратковременной гипертермии (36°, 41' 46°С, 3 ч) достоверно не изменялась (рис.8). Митохондрии, изаш рованные из клеток быстрорастущей суспензии кукурузы в ответ ]

Состояние 3

60

140

X S

г

\

О 20

О

Дыхательный контроль

Состояние 4

¿á

26 36 41 46 51

26 36 41 46

26 36 41 46 51 Температуре ,°С

Рис.8. Влияние температуры инкубации побегов проростков кукуру; на энергетическую активность изолированных митохондрий. Субстр; окисления - а-кетоглутарат (5 Ш). Указан доверительный интерв; при 5Х уровне значимости.

Длительность температурного воздействия составляла 3 ч.

5,0 г

Л

I4'5"

0 X

2 уГ

1 4,0 - /

•О /

2 Щ

ч 1 3,5 -

I-1_I_I_I

о 30 60

Время, мин

йс.9 (слева). Дыхательный контроль митохондрий, изолированных из клеток суспензионной культуры после теплового воздействия (41°С) в течение 0-60 мин. Субстрат окисления - а-кетоглу-тараг (5 мМ). Указан доверительный интервал при 5% уровне значимости.

Не. 10 (справа). Влияние длительности нагревания (41°С) побегов проростков кукурузы на окислительную активность изолированных из них митохондрий. Субстрат окисления: а-кетоглу-тарат (5 мМ). Указан доверительный интервал при 5уровне значимости.

ействие температуры 41°С увеличили сопряженность окисления и осфорилирования (величина дыхательного контроля) (рис.9).

Более длительная инкубация побегав кукурузы при 41°С (от 12 о 24 ч) привела к постепенному снижению окислительной активности итохондрий (рис.10).

Следует заметить, что наблюдаемые изменения в активности ми-охондрий не связаны с гибелью растений. После суточной гипертер-ии при 41 °С проростки кукурузы выжили на 100%. При действии на астительный материал более высокой температуры (51°С) наблюда-ись изменения, выраженные в большей степени, чем при 41°С. Одно-асовая гипертермия при 51°С привела к увеличению дыхания, а за-

¿дг Состояние 3 --

5 40 -

1'

\ ГУ

О 20

Дыхательный контроль

0361218 24 Время.ч

тем (через 3 ч) произошло резкое снижение поглощения кислород митохондриями. Поскольку при 51°С наблюдали гибель растений (че: длительнее воздействие, тем больше процент погибших растений), г резкое снижение активности митохондрий, по-видимому, связано I нарушениями метаболизма растительных клеток при действии очен; высокой температуры.

Высокая температура, вызывающая изменения в функциях митохондрий, оказывает влияние и на последующий рост проростков кукурузы. Темпы изменений ростовых процессов у побегов и корней проростков, как показано, зависят от величины действующей температуры. Повышение температуры от 26° до 41°С в течение 3 ч вызывалс незначительные изменения в росте побегов (рис.11,А). Высокая температура (46° и особенно 51°С) или длительное действие (24 ч) температуры 41°С значительно тормозили рост побегов в течение £ суток после гипертермии.

В отличие от побегов, у корней после действия температурь 36~41°С ингибирования роста не наблюдалось (рис. 11,А). При действии более высокой температуры, такой как 46°С, рост корня сильнс замедлялся, а после 3-часового нагревания проростков при 51°С

корни погибали в течение 5-дневного отрастания растений (рис.11,В

«

Рис.11. Влияние гипертермии на рост побегов и корней кукурузы. А - зависимость степени ингибирования рост (1, %) от повышения температуры, время действия которой составляло 3 ч; Б - степень ингибирования рост при 41°С в зависимости от длительности действия; В - степень ингибирования роста при 51°С. 1-побег, 2- корень. Ростовые параметры были определены через 5 суток после гипертермии

Выя проведен анализ энергетической активности митохондрий проростков побегов линий кукурузы, подвергнутых действию гипертермии (51°С, 1 ч). Изменение окислительной активности органелл

оценивали у гомозиготных линий кукурузы В14, М14СТ, 01156 А, Ш2 и Ы155. Для сравнения использовали митохондрии кукурузы гибрида Краснодарский 303. Обнаружен значительный полиморфизм по этому признаку (рис.12). Можно выделить два крайних варианта в реакции митохондрий на гипертермию. Первый из них - переход в низкоэнергетическое состояние (гибрид Краснодарский 303); второй - увеличение сопряженности окисления и фосфорилирования (линии Ш2, В14).

,20

кг

|15

X

см

о ю

л ч

Состоите 4

№

Ш ^

1 *■

1С

£ „

2 3

Дыхательный контроль

Рис. 12. Окислительная активность митохондрий линий кукурузы под действием гипертермии (51°С, 1 ч). Субстрат окисления - я-кетог-лутарат (5 мМ). Указан доверительный интервал при 5% уровне значимости. 1 - контроль; 2 - гипертермия

** К-303 М4Ш №56 К155 422 ВЦ "

Таким образом, рассмотренные результаты приводят к выводу %о том, что ответная реакция проростков кукурузы на температуру, судя по активности митохондрий и росту побегов и корней проростков, зависит от силы и продолжительности температурного воздействия. Митохондриальная активность при этом значительно изменяется и сохраняется до тех пор, пока не наступает гибель ткани. Существует генетический контроль за митохондриальной активностью при тепловом шоке. Поскольку генетический контроль за любым признаком осуществляется через синтез белков, то полученные результаты позволяют предполагать зависимость митохондриальной активности при тепловом шоке от синтеза белков, в том числе белков теплового шока.

*

3. ЭНЕРГЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИТОХОНДРИЙ ПРИ ДЕЙСТВИИ ТЕМПЕРАТУРЫ IN VITRO

Рассмотренные ранее результаты свидетельствуют о вовлечении митохондрий в ответную реакцию клетки на температурный стресс. Повышенная или пониженная температура, действующая in vivo, вызывает изменения в энергетической активности митохондрий. Причем, в пределах одного вида растений наблюдается значительный полиморфизм в митохондриальной активности, что приводит к заключению о существовании генетического контроля со стороны клеточного ядра за функционированием митохондрий. Это, в свою очередь, подразумевает существование ядерно-митохондриальной интеграции в осуществлении контроля за функциями митохондрий. Полученные результаты однозначно доказывают существование такой интеграции: изменения в энергетической активности митохондрий при температурном стрессе генетически контролируются и соответствующие гены локализованы в ядерном геноме. При этом стрессовые белки являются посредниками в механизме ядерно-митохондриальной интеграции. В то же время вопрос о степени функциональной автономности растительных митохондрий остаются открытым. Выяснить этот вопрос можно в модельных экспериментах с изолированными митохондриями, in vitro подвергнутыми действию неблагоприятной температуры. При таком подходе участие ядра и цитозоля в регуляции митохондриальной активности бь&о бы исключено и это позволило бы: 1) определить температурные и временные диапазоны функционирования изолированных митохондрий; 2) выявить "поломки", происходящие в митохондриях в этих условиях; 3) установить те клеточные компоненты, которые устраняют эти "поломки".

В диапазоне температур 0°~98°С был проведен анализ термоустойчивости отдельных комплексов дыхательной цепи.

Известно, что дыхательная цепь растительных митохондрий содержит четыре мультиферментных комплекса переноса электронов (Moore et al., 1991). При анализе изолированные митохондрии помещали in vitro в условия изменяющейся температуры (0°-98°С) и регистрировали их способность окислять различные субстраты цикла трикар-боновых кислот. Субстраты были подобраны таким образом, что при их окислении в транспорте электронов участвовали отдельные, заранее известные, комплексы дыхательной цепи: ес-кетоглутарат и малаг

(I-IV комплексы); сукцинат (II-IV комплексы); NADH (III-IV комплексы); аскорбат плюс TMPD (IV комплекс).

Оказалось, что комплекс IV (субстрат окисления -аскорбат плюс TMPD, электроны подаются в комплекс IV, минуя другие комплексы дыхательной цепи), "внешняя" NADH-дегидрогеназа и комплекс III (субстрат окисления - экзогенный NADH, электроны в дыхательной цепи переносятся через III и IV комплексы) являются термостабильными и их функционирование не изменяется при повышении температуры до 47°С (рис.13,б,7). Менее устойчивым является комплекс II (субстрат окисления - сукцинат, электроны переносятся через комп-

ас. 13. Влияние температуры In vitro на относительную скорость (%) дыхания митохондрий кукурузы, окисляющих различные субстраты ia 100% принята скорость поглощения кислорода в состоянии 3 све-кевыделенными митохондриями.

Субстрат окисления: 1 - а-кетоглутарат; 2 - л-кетоглутарат + ТШ; 3 - малая; 4 - малат + СоА + NAD+ + ротенон; 5 - сукцинат; б -ШН; 7 - аскорбат + TMPD

хексы II, 111 и IV). Функционирование этого комплекса оставалось стабильным в течение 30 мин инкубации митохондрий in vitro при J7°C (рис.13,5). Наименьшей температурной устойчивостью в изоли-юванных митохондриях отличался комплекс I дыхательной цепи, ког-(а окислялись NAD-зависимые субстраты (л-кетоглутарат или малат) i электроны переносились через всю дыхательную цепь. Окисление (алата и а-кетоглутарата резко снижалось в результате инкубирова-[ия in vitro при 17°-27°С (рис.13,1,3).

Следует отметить, что при добавлении в суспензию митохондрий 'оА и NAD+ значительного снижения скорости окисления маната не

100

20 40 (50 30

Температура, °С

наблюдалось (рис. 13,4). Объясняется это тем, что кроме малатде-гидрогеназы, связанной с комплексом I, в растительных митохондриях имеется малик-энзим (Douce, 1985) и "ыатриксная" ротенон-нечувствительная NADH-дегидрогеназа (Шугаев, 1991; Moore and Sie-dow, 1991). При инактивации комплекса I во время инкубации митохондрий при 27°С добавление СоА и NAD+ активирует малик-энзим и поступление электронов в дыхательную цепь через ротенон-нечувс-твительную NADH-дегидрогеназу, минуя комплекс I. Сохранение высокой скорости окисления малата в присутствии СоА и NAD+ во время инкубации митохондрий in vitro при 27°С и нечувствительность этого окисления к ротенону в наших экспериментах подтверждают предположение о разделении коыпартментов ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы и комплекса I (Mol1er, Palmer, 1982; Rustin, Lance, 1986) и показывают возможность транспорта электронов при окислении NAD-зависимых субстратов, в частности палата, минуя комплекс I, через "ыатриксную" ротенон-нечувствительную NADH-дегидрогеназу.

Функциональную стабильность отдельных комплексов дыхательной цепи изолированных митохондрий оценивали в системе in vitro при 27°С в течение 0-90 мин. Оказалось, что комплексы II, III, IV и "внешняя" NADH-дегидрогеназа являются функционально стабильными в этих условиях (рис. 14). В то же время комплекс I не является функционально стабильным. Нестабильность этого комплекса в системе in vitro связана с двумя факторами: 1) с инактивацией ct-кетог-лутаратдегидрогеназного комплекса и 2) с инактивацией самого комплекса I.

X 120г

100

о

О с=

о ьз о

20

Рис. 14. Функциональная устойчивость отдельных комплексов дыхательной цепи митохондрий кукурузы in vitro (27°С, 90 мин)

За 100% принята скорость поглощения кислорода в состоянии 3 свежевыде-ленными митохондриями. Субстрат окисления: 1 - аскорбат + TMPD; 2 - NADH; 3 - сукцинат; 4 - малат; 5 - а-кетогвутарат. I-IV - комплексы дыхательной цепи

о

Снижение дегидрогеназной и электронтранспортной активности у митохондрий, хранящихся во льду, как известно, обусловлено истощением никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) и тиаминлирофосфата (ТПФ), двух кофакторов а-кетоглутаратдегидрогеназы (Douce, 1985). Принимая во внимание эти сведения бил проведен анализ вклада NAD+, ТШ и АТФ в сохранение энергетической активности митохондрий во время их инкубации in vitro при 27°С и было определено содержание тиаминлирофосфата в изолированных митохондриях. Оказалось, что количество ТПФ в органеллах снижается во время инкубации митохондрий в течение 0-60 мин при 27°С. Так, свежевыделенные органеллы содержали 480 нг ТПФ/мг белка, а после 60-минутной инкубации - 350 нг ТПФ /мг белка. Также было показано, что NAD+, АТФ и ТПФ по отдельности не предотвращают инактивацию органелл (рис.15). В то же время не наблюдалась инактивация митохондрий, инкубировавшихся в среде, содержащей ТИФ и АТФ одновременно (рис.15). Следует заметить, что ТО2 активирует й-кетоглутаратде-гидрогеназный комплекс только в присуствии АТФ, т.е. этот процесс энергозависимый. По-видимому, активный транспорт ТПФ внутрь митохондрий требует энергетических затрат. Этот транспорт либо напрямую связан с гидролизом АТФ, либо обеспечивается энергией трансмембранного потенциала, который митохондрии генерируют за счет использования АТФ и субтрата окисления, присутствующих в среде инкубации.

90

70

50

30

Г ДУ&?Р

лтштр ,Ш)ТРГ

HAD

Буфер*™ Uh ТРР

JMïÎll

-v-—

30 кинут

ВРЕМЯ ИНКУБАЦИИ

Рис.15. Влияние условий инкубации in vitro на дыхание митохондрий (состояние 3) Субстрат окисления - а-ке-тоглутарат (5 ыМ)

Таким образом, инактивация а-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса связана с дефицитом тиаминпирофосфата (ТПФ), одного из кофакторов этого комплекса. Дефицит ТПФ в этих условиях может быть вызван активностью фосфатазы, отщепляющей фосфат от молекулы тиаминпирофосфата и, таким образом, уменьшающей пул коэнзима в митохондриях, инкубируемых in vitro в условиях повышенной температуры.

Активность фосфатазы определяли в суспензии разрушенных митохондрий, как свежевыделенных органелл, так и после их инкубации при 27°С в течение 30 мин. Для активации фермента использовали 30 мМ MgCl2 (активатор фосфатазы), для ингибирования - 3 мМ (NH4) 6^7024'4Нг0 (молибдат аммония - ингибитор фосфатазы) (Leigh, Walker, 1980).

Результаты, представленные в табл.4, свидетельствуют о наличии в митохондриях кукурузы фосфатазы, дефосфоршшрующей тиашш-пирофосфат. Этот фермент активируется во время инкубации изолированных органелл при 27°С, в результате возникает дефицит ТПФ и митохондрии теряют способность окислять й-кетоглутарат из-за инактивации а-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса.

Таблица 4

Активность фосфагазы (мкг Рн/мин/мг белка), дефосфоршшрующей тиашнпирофосфат в суспензии свежевыделенных митохондрий кукурузы и органелл, инкубируемых in vitro при 27°С, х ± ш, п=6

Активность фермента

Среда ----------------------------------------

инкубации 0°С, 0 кош 27°С, 30 мин

Буфер + ТПФ 0,6 ± 0,1 1,7 ± 0,2

Буфер + ТПФ + MgCl2 2,6 ± 0,1 5,7 + 0,3

Буфер + Ж + молибдат 0,0 ± 0,0 0,3 + 0,1 аммония

В то же время обращает на себя внимание тот факт, что окисление ct-кетоглутарата в присутствии ТПФ митохондриями, инкубировавшимися при 27°С в течение 30-60 мин, не достигает того уровня, который был отмечен для свежевыделенных органелл. Этот факт позволяет предположить, что инкубация митохондрий при 27°С in vitro

приводит к нарушениям не только а-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса, но и других структур, участвующих в окислении а-кетог-лутарата и в транспорте электронов, поступивших в дыхательную цепь в результате окисления этого субстрата.

Известно, что в структурном отношении митохондрии не являются полностью автономными органеллами. Значительная часть их белков кодируется ядром клетки и синтезируется в цитоплазме (Douce, 1985; Schatz, 1995). Что касается функционирования митохондрий, то ранее проведенное исследование с использованием разных генотипов кукурузы и пшеницы позволило установить, что энергетическая активность митохондрий при пшо- и гипертермии находится под генетическим контролем. Возможно, часть белков, в том числе и стрессовых, синтезирующихся в цитоплазме и транспортируемых затем в митохондрии, может выполнять регуляторную функцию или быть необходимой для обеспечения нормального функционирования этих орга-нелл. С этой целью было изучено влияние этих белков на функционирование митохондрий. Митохондриальную активность определяли после инкубации органелл в системе In vitro при 27°С и Зб°С.

Оказалось, что внутриклеточные белки, выделенные из побегов проростков кукурузы, выросших как при 27°С (Б27), так и из растений, подвергнутых тепловому moicy при 41 °С (Б41), обладают способностью сохранять в системе in vitro энергетические функции у изолированных митохондрий (рис.16, 3,4). Наблюдаемое в данном случае сохранение активности митохондрий, очевидно, связано с какими-то определенными белками (в том числе и с БТШ), которые в этих температурных условиях ассоциируют с митохондриями (Войников, Руди-ковский, 1988). При определении характеристик этих белков было

г - CP С ЕСА; 3 - CP С Б27; 4 - CP с В41

Рис.16. Зависимость скорости фос-форилирующего дыхания митохондрий от условий ресуспендирования и времени инкубации при 27°С.

1 - среда ресуспендирования (CP) без БСА и белков;

установлено, что в регуляции митохондриадьной активности принимают участие термостабильные белки, имеющие несколько компонентов. При делении на сефадексе G-25 термостабильных внутриклеточных белков проростков кукурузы было получено три отдельных фракции (рис.17). Две из них обладали способностью сохранять энергетические функции у изолированных митохондрий в условиях in vitro (табл.5). Содержание белка в I фракции было 340 мкг, во П-ой -60 мкг и в Ш-ей - 210 мкг белка на мг сухого веса. Эдектрофоре-тическое исследование показало в I фракции наличие широкого спектра полипептидов. Пептиды II и III фракций с помощью электро-

Влияние белковых фракций, полученных при делении на сефадексе 6-25, на сопряженность окисления и фосфорилирования в митохондриях in vitro при 27°С

Номера фракций Время инкубации, мкн Дыхательный контроль

Рис.17. Разделение общей термостабильной фракции белков на колонке с сефадексоы G-25 I - III - номера фракций

ВРЕМЯ, ч

Таблица 5

Без белков

О 30 О 30 О 30 О 30

о

30

4,12 ± 0,18

нет

Общая фракция

4.21 ± 0,18 2,28 ± 0,31 3,94 ± 0,24 2,38 ± 0,20 4,12 ± 0,21

Фракция I

Фракция II

нет

Фракция III

4,12 ± 0,21 3,36 + 0,15

фореза в 14% ПААГе с ДДС-Na разделить не удалось. Тестирование III фракции на наличие в ней тиаминпирофосфата (рис. 18) и фосфора дало положительный результат. Совокупность этих результатов позволила заключить, что III фракция является низкомолекулярными пептидами, возможно, связанными с тиаминпирофосфатом.

' 1 2 3 4

Рис. 18. Качественное определение тиаминпирофосфата (ТШ>) в белковых фракциях, полученных при разделении на сефадексе G-25 1 -тамияпирсфосфат, Z -I фракция, 3 -II фракция, 4 -III фракция. Эпределение ТПФ основано на свечении продуктов реакции в ультро-$иолете.

Другим компонентом (I фракция) термостабильных внутриклеточных белков, принимающих участие в регуляции митохондриальной активности, являются белки с мол. массами до 30 кД. Это заключение :делано на основании следующих результатов. В клетках растений эазных видов имеются сходные белковые компоненты (полипептиды с юл. массой 14-30 кД) (рис. 19), которые необходимы для вормаль-юго функционирования митохондрий. Добавление к изолированным ми-■охондриям побегов кукурузы термостабильных белков из корней ку-урузы, побегов гороха, пшеницы и ржи всегда приводило к сохране-гаю высокой энергетической активности у органелл во время их ин-

Рис.19. Спектры полипептидов белковых фракций побегов гороха (1), кукурузы (2), пшеницы (3) и ржи (4). Справа указаны молекулярные массы белков-стандартов (кД)

кубации при 27°С. Кроме того, с митохондриями в этих условиях ас социируют в основном низкомолекулярные полипептиды (Войников, Ру диковский, 1988). Таким образом, в регуляции митохондриальной ак тивности принимают участие внутриклеточные белки, в том числе стрессовые, имеющие несколько компонентов. Один из них - небольшие пептида, возможно, связанные с тиаминпирофосфатом (фракци: III). Другой компонент - белки с мол. массами до 30 кД (фракци:

Сохранение функциональной активности у митохондрий в систем! in vitro с помощью внутриклеточных - растительных белков позволяем осуществлять реконструкцию функциональной активности уже у инак-тгазированных in vitro органелл. Это достигается путем добавленю к инактивированным митохондриям белковой фракции, обогащенно] белками теплового шока. При этом в значительной степени восстанавливается энергетическая активность предварительно инактивиро-ванных митохондрий (рис.20). Из графика, построенного с помощь» двойных обратных координат (рис. 21), было определено, что реконструкция на 50% происходит при концентрации белков 10~2 - 10~3 мг на 1 мг ыитохондриального белка. Причем эта реконструкция является процессом энергозависимьы и для ее протекания необходимс присутствие не только самих белков, но и соединений, необходимы? для генерации трансмембранного потенциала (рис. 20,4): АТФ или

I).

60

I 10

Рис.20. Влияние стрессовых белков на дыхание митохондрий in vitro (состояние 3, 27°С, 90 ката 1 - буфер; 2 - буфер + АТФ;

■} 2 4 - буфер + стрессовые белки + А

3 - буфер + стрессовые белки;

с

1 Стрелкой обозначен момент внесения белкового фактора.

о

о

30 60

Время, мин

90

ф

0.08

120 МИН

Рис.21. Зависимость фосфорили-рующей активности митохондрий (V, нмоль Ог/мин/мг белка) от концентрации белкового фактора (мг БФ/мг белка митохондрий) после инкубации смеси "мито-хондрии+БФ" при 27°С в течение 1 мин (1), 60 (2), 120 (3) мин

О 10 20 3 О //[6Ф]

:уострата окисления. Энергозависимость этого процесса связана с ¡еобходимостью транспорта внутрь митохондрий внутриклеточных бел-юв, в том числе и стрессовых. Местом действия этих белков при »конструкции митохондриальной активности in vitro являются комп-гекс I дыхательной цепи и ее- кетоглутаратдегидрогеназа.

В данной работе для оценки энергетической активности расти-'ельных митохондрий при температурных стрессах использовали два жепериментальных подхода. Изучение реакции митохондрий на измените температуры in vivo и анализирование. энергетической актив-гости органелл и отдельных комплексов дыхательной цепи при действии температуры in vitro. Это позволило получить достаточно пол-[ую информацию о характере изменений в. функциях митохондрий в от-¡ет на действие температурных стрессов (гипо- и гипертермии), вышить определенные закономерности в реакции митохондрий на дейс-•вие неблагоприятных температур и установить некоторые механизмы >егуляции митохондрий в меняющихся температурных условиях.

Предварительное прогревание растительного материала, как ползало, приводит к существенным изменениям в митохондриальной ак-■ивности. Установлено, что имеется как температурный (51°С, 1 ч), ■ак и временной (41°С, 12-24 ч) эффект гипертермии на активность штохондрий. Установлена связь между изменениями в активности ми-■охондрий и ростом побегов и корней проростков кукурузы. Ингиби-ювание роста проростков резко усиливалось при повышении темпера-уры от 41° до 51 °С и при увеличении продолжительности гипертер-ии. Окислительная активность митохондрий при этом значительно нижалась, но снижалась в меньшей степени, чем рост растений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сопряженность окисления и фосфорилирования сохранялась в ми: хондриях даже тех проростков, рост которых был значительно уп тен неблагоприятной температурой. Эти данные хорошо согласуют» выводами О.А.Семихатовой и других авторов, что энергетическая : фективность дыхания сохраняется довольно долго и у интактных i тохондрий механизм сопряжения окисления и фосфорилирования устс чив к действию высокой температуры (Семихатова, 1974, 1990; Ron ni, Ozelkok, 1973; Lin, Markhart, 1990).

При изучении влияния гипотермии (0°С, 2 ч) оказалось, t митохондрии морозоустойчивой пшеницы Альбидум 114 в ответ на с лаждение растений переходят в низкоэнергетическое состояние (yi личение нефосфорилирующего дыхания и снижение сопряженности ога ления и фосфорилирования). У митохондрий незимостойкой шпени Безостая 1 подобных изменений в активности не наблюдалось. Пер ход митохондрий в низкоэнергетическое состояние приводит к терн генезу и генетически контролируется. Соответствующие гены локал зованы в 1D и 6D хромосомах пшеницы Альбидум 114 и их действ опосредовано через синтез стрессового белка 310 кД.

Эффект холодового разобщения дыхания и фосфорилирования х рошо известен для митохондрий животного происхождения (Скулачев др., 1963; Скулачев, 1989) и, как показано, сопровождается выд лением тепла (Скулачев, 1972, 1989). У растений активация нефо форилирующего дыхания, сопровождающаяся термогенезом, обнаруже в основном только у ароидных лилий и у некоторых других цветков растений во время цветения (Скулачев, 1989-, Knutson, 1974; Мее se, 1975). Механизмы, с помощью которых растения продуцируют те ло, в принципе те же, что и у животных. Это разобщение и включ ние шунтов несопряженного окисления в дыхательной цепи (Скулаче: 1989). Роль разобщителей у растений, как и у животных, по-видим! му, выполняют свободные жирные кислоты (Войников и др., 198: Скулачев, 1989), которые накапливаются в результате активац фосфолипазы Az (Рахимов, Джанбаева, 1977; Scarpa, Lindsay, 1971 Scherphof et al., 1972; Zarska-Maclejwska, Lewak, 1976; Zar: ka-Maciejwska et al., 1980).

В нашем случае переход митохондрий в низкоэнергетическс состояние после кратковременной гипотермии, как показали опыты блокированием фосфолипазы Аг, также обусловлен активацией это] фермента и действием свободных жирных кислот. Однако кроме фосфс

липазы Аг и свободных жирных кислот, по-видимому, имеются еще какие-то факторы. Причем, наличие и функционирование этих факторов, возможно, генетически детерминировано. Действительно, использование в экспериментах гомозиготных линий кукурузы и линий пшеницы с межсортовым замещением хромосом позволило установить, что функциональная активность митохондрий при гипер- и гипотермии находится под контролем ядерных генов.

Полученные нами данные хорошо согласуются с предложенной ранее схемой ядерно-митохондриальных взаимоотношений при регуляции энергетической активности митохондрий высших растений в ответ на действие температурного фактора (Войников, 1987). Более того, эти данные показывают не только существование генетического контроля за активностью растительных митохондрий при изменении температуры, но и демонстрируют участие конкретного белка в реализации такого контроля при гипотермии, доказывая тем самым реальность су-цествования информационной связи между ядерным геномом и митохондриями в условиях действия низкой температуры.

В то же время вопрос о степени функциональной автономности растительных митохондрий и, особенно, стабильности отдельных комплексов дыхательной цепи изучен недостаточно. С этой целью были проведены модельные эксперименты с изолированными митохондриями, in vitro подвергнутыми действию неблагоприятной температуры (0-98°С).

Оказалось, что наиболее термоустойчивыми при инкубации in /itro являются "внешняя" NADH-дегидрогеназа и комплексы III и IV дыхательной цепи. Менее термоустойчив комплекс II. Еще менее тер-гаустойчивнми оказались комплекс I и дегидрогеназы NAD-зависимых :убстратов трикарбоновых кислот, связанные с комплексом I.

Анализируя эти результаты необходимо иметь в виду, что они Зыли получены с использованием митохондрий, которые инкубирова-шсь in vitro и во время инкубации не контактировали с содержимым тетки. Поэтому полученные данные свидетельствуют не только о зазличной термоустойчивости четырех комплексов дыхательной цепи, го и о разной степени их автономности. Вероятно, комплексы II, II и IY не только термоустойчивы, но и способны функционировать начительное время (даже при повышенной температуре) без цитозоля летки. Наоборот, комплекс I и дегидрогеназы, с ним связанные, ля нормального функционирования нуждаются в постоянном контакте

с компонентами цитоплазмы.

Следует отметить, что при добавлении в суспензию митохондрм СоА и NAD+ значительного снижения скорости окисления малата hi наблюдалось. Объясняется это тем, что кроме малатдегидрогеназы связанной с комплексом I, в растительных митохондриях имеется малик-энзим, который активируется СоА и NAD+ (Douce, 1985), и "мат-риксная" ротенон-нечувствительная NADH-дегидрогеназа (Шугаев; 1991; Moore and Siedow, 1991). Возможно, что ротенон-нечувствительная NADH-дегидрогеназа функционирует при инактивации комплекса I и позволяет митохондриям обойти поврежденный первый "пунк' сопряжения" и поставлять электроны в дыхательную цепь при окислении малата на уровне коэнзиыа Q.

Функциональную стабильность отдельных комплексов дыхательно! цепи изолированных митохондрий оценивали в системе in vitro npi 27°С в течение 0-90 мин. Оказалось, что комплексы II, III, IV i "внешняя" NADH-дегидрогеназа являются функционально стабильными ] этих условиях. В то же время комплекс I не является функциональнс стабильным. Эта нестабильность в системе in vitro связана с двум5 факторами: 1) с инактивацией сс-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса и 2) с инактивацией самого комплекса I.

Инактивация а-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса связана с дефицитом тиаминпирофосфата (ТИФ), одного из кофакторов этого комплекса (Douce, 1985). Дефицит ТИФ в этих условиях (27°С), как показано, происходит в результате активации фосфатазы, отцепляющей фосфат от молекулы тиаминпирофосфата и, таким образом, уменьшающей пул коэнзима в суспензии митохондрий. Возможное!! функционирования такой фосфатазы в растительных и дрожжевых клетках показана ранее (Nichimura et al., 1984; Mitsunaga et al., 1987; Kawasaki et al., 1990) и установлено, что дефосфоршшрова-ние ТИФ является одним из этапов при транспорте тиаминпирофосфата через мембрану (Iwashima, 1988). Поэтому функционирование тако1 фосфатазы в растительных митохондриях представляется весьма вероятным. Однако вопрос о ее специфичности остается пока открытым. Это может быть как специфичная тиаминпирофосфатаза, так и неспецифичная фосфатаза. Кроме того, полученные результаты позволяю'] предполагать, что путем изменения активности фосфатазы, дефосфо-рилирующей ТПФ, может осуществляться контроль за способностью митохондрий окислять а-кегоглутарат.

Как ухе отмечалось, нестабильность комплекса I в системе in vitro связана не только с инактивацией а-кетоглутаратдегидрогена-зы, но и с инактивацией самого комплекса I. Растительный комплекс I, как известно, имеет сложную структуру ( Herz et al., 1994; So-ole, Menz, 1995) и находится под двойным генетическим контролем. Значительная часть полипептидов комплекса I кодируется ядерным геномом (Soole, Menz, 1995) и, следовательно, транспортируется в митохондрии из цитоплазмы. Возможно, что деградация некоторых из этих белков, с одной стороны, и нарушение их поступления в изолированные митохондрии, с другой, привели к низкой функциональной стабильности комплекса I в наших экспериментах. И, наконец, в-третьих, инактивация комплекса I, вероятно, может быть связана с перестройками в липидах, окружающих этот комплекс во внутренней митохондриальной мембране. Изменение липидного окружения может происходить во время экспериментов с изолированными митохондриями (Douce, 1985).

Инактивацию комплекса 1, как показано в нашей работе, можно избежать с помощью добавления в суспензию инкубируемых in vitro митохондрий внутриклеточных белков, в том числе и стрессовых. При определен™ характеристик этих белков было установлено, что в регуляции митохондриальной активности принимают участие термостабильные внутриклеточные белки, имеющие несколько компонентов. Один из них - небольшие пептиды, возможно, связанные с тиаминпи-рофосфатом, другой компонент - белки с мол. массами до 30 кД. Причем, в клетках растений разных видов имеются сходные белковые компоненты (полипептиды с мол. массами 14-30 кД), которые необходимы для нормального функционирования митохондрий (Войников и др., 1991).

Сохранение функциональной активности у митохондрий в системе in vitro с помощью внутриклеточных растительных белков позволило нам осуществить реконструкцию функциональной активности уже инак-тивированных in vitro органелл. Причем, эта реконструкция является процессом энергозависимым и для ее протекания необходимо присутствие не только самих белков, но и соединений, необходимых для генерации трансмембранного потенциала: АТФ или субстрата окисления. Энергозависимость этого процесса связана с необходимостью транспорта внутрь митохондрий стрессовых белков. Местом действия [этих белков при реконструкции митохондриальной активности in vit-

го являются комплекс I дыхательной цепи и а-кетоглутаратдегидро-геназа.

Проведенный в данной работе анализ термоустойчивости и функциональной стабильности отдельных комплексов дыхательной цеп] растительных митохондрий после инкубации in vitro при повышенно] температуре носит характер новизны и в литературе не освещен. Более того, представленные нами данные о причинах функционально! нестабильности митохондрий в этих условиях и механизмах, стабилизирующих активность отдельных комплексов дыхательной цепи, ране« были неизвестны.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о функциональной неавтономности растительных митохондрий и доказываю: существование тесной ядерно-митохондриальной интеграции в осуществлении регуляции энергетической активности митохондрий в условиях температурного стресса.

6. ВЫВОДЫ.

1. Митохондрии морозоустойчивой озимой пшеницы при гипотермии переходят в низкоэнергетшеское состояние, связанное с увеличением окисления и снижением его сопряженности с фосфорилировани-ем. Этот переход сопровождается термогенезом. Он генетически детерминирован. Гены, контролирующие этот признак локализованы i хромосомах 1D и 6D ядерного генома морозоустойчивой озимой пшеницы.

2. Сигнал о переходе в низкоэнергетическое состояние може1 передаваться из ядра в митохондрии с помощью стрессового белка, БХШ-310. Нативный белок имеет молекулярную массу 310 кД, содержш два типа субъединиц 66 и 56 кД и вызывает переход митохондрий i низкоэнергетическое состояние, снижая протонный контроль дыхания.

3. При гипертермии в растениях кукурузы наблюдается значительный полиморфизм по признаку энергетической активности митохондрий. Этот признак генетически контролируется. При повышенной температуре происходит ассоциация белков теплового шока с митохондриями. Эти белки сохраняют высокую энергетическую актив нос та изолированных митохондрий в условиях повышенной температуры.

4. В системе целостной клетки растительные митохондрии сохраняют энергетическую активность при значительном повышении темпе

затуры. Однако в поддержании энергетической активности при гипер-гермии митохондрии не автономны и требуют присутствия внутриклеточных белков, в том числе белков теплового шока.

5. С помощью внутриклеточных растительных белков можно осуществлять реконструкцию энергетической активности инактивирован-1ых in vitro митохондрий. Эта реконструкция является процессом шергозависимым из-за необходимости транспорта этих белков через штохондриальные мембраны и требует присутствия не только белков, го и соединений, необходимых для генерации трансмембранного потенциала (АТФ или субстрата окисления).

7. Термоустойчивость и функциональная стабильность изолиро-¡анных митохондрий относительно невысока. Действие повышенной 'емпературы на изолированные митохондрии приводит к нарушениям >аботы дыхательной цепи. Анализ термоустойчивости отдельных комп-[ексов дыхательной цепи показал, что комплексы II, III, IV и 'внешняя" NADH-дегидрогеназа термоустойчивы и функционально стабильны при значительной гипертермии (до 47°С). В то же время юмплекс I дыхательной цепи и дегидрогеназы, с ним связанные, •ермочувстЕительны и не обладают функциональной стабильностью в словиях действия гипертермии in vitro. В результате - функционирование всей дыхательной цепи лимитировано стабильностью комплек-:а I.

8. При гипертермии происходит инактивация сс-кетоглутаратде-идрогеназы,' связанной с комплексом I. Показано, что митохондрии укурузы имеют фосфатазу, которая дефосфорилирует тиачинпирофос-ат во время инкубации изолированных органелл в условиях гипер-ермии. В результате активации этого фермента в митохондриях воз-икает дефицит тиаминпирофосфата и инактивируется а-кетоглутарат-егидрогеназа.

9. Для поддержания функционирования комплекса I при гипер-ермии необходимы внутриклеточные белки, в том числе белки тепло-ого шока: небольшие пептиды, возможно, связанные с тиаминпиро-осфатом (для предотвращения инактивации й-кетоглутаратдегидроге-азы), и белки с массами до 30 кД (для поддержания комплекса I в /нкциональном состоянии).

10. Показана возможность транспорта электронов при окислении VD-зависимых субстратов, в частности малата, минуя комплекс I три его инактивации), с использованием ротенон-нечувствительной

NADH- д егидрог еназы.

11. Действие повышенной или пониженной температуры приводи к существенным изменениям в энергетической активности митохонд рий. Эти изменения зависят от силы и длительности температурног воздействия и генетически детерминированы. Полученные результат свидетельствуют о функциональной неавтономности растительных ми тохондрий и доказывают существование тесной ядерно-митохондриаль ной интеграции в осуществлении регуляции энергетической активное ти митохондрий в условиях температурного стресса.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Варакина H.H., Побежимова Т.П., Войников В.К. Последействие теплового и холодового шока на энергетическую активность митохондрий проростков кукурузы // Опер, информ. материалы СТШБР С( АН СССР. - Иркутск. - 1983. - С. 17-19.

2. Vojnikov V., Korzun A.M., Pobezhimova Т., Varakina N. Effect of cold shock on the mitochondrial activity and on the temperature of winter wheat seedlings // Biochem.Physiol.Pflanzen, -1984. - Y.179. - P.327-330.

3. Варакина H.H., Побежимова Т.П., Войников B.K. Влияние теплового шока на активность митохондрий проростков кукурузы // Физиолога-биохимические основы повышения продуктивности кукурузы. Днепропетровск. - 1984. - С.25.

4. Войников В.К., Варакина H.H., Побежимова Т.П. Влияние экспериментальных факторов на энергетическую активность митохондрий растений: I. Концентрация солей, сахарозы и ЭДТА в среде выделения и инкубации // Опер, информ.материалы СИФИБР СО АН СССР. -Иркутск. - 1985. - С.16-19.

5. Войников В.К., Побежимова Т.П., Варакина H.H. Действие холода на жирнокислотный состав и энергетическую активность митохондрий клеток растений // Физиол. и биохим. культурных растений. - 1985. - Т.17, N5. - 431-435.

6. Войников В.К., Побежимова Т.П., Варакина H.H., Лузова Г. Свободные жирные кислоты и энергетическая активность митохондрш растений // Условия среды и продуктивность растений. Часть II. -Иркутск, 1985. - С.35-41.

7. Войников В, К., Варакина H.H., Побежимова Т.П., Жиров Е.Г

Влияние хромосом Д-генома морозоустойчивой мягкой пшеницы на функциональную активность митохондрий при гипотермии // Доклады АН СССР. - 1986. - Т.288, N6. - С.1488-1491.

8. Войников В.К., Варакина H.H., Побежимова Т.П. Роль отдельных хромосом Д-генома мягкой морозоустойчивой пшеницы в регуляции энергетической активности митохондрий при гипотермии // В кн.: Рекомбиногенез: его значение в эволюции и селекции. - Кишинев: Штиница - 1986. - С.197-199.

9. Войников В.К., Побежимова Т.П., Варакина H.H., Жиров Е.Г. Влияние отдельных хромосом морозоустойчивой мягкой озимой пшеницы на морозоустойчивость растений и энергетическую активность митохондрий при гипотермии // Генетика.- 1987. - Т.23, N1. - С.41-50.

10. Побежимова Т.П., Войников В.К., Варакина H.H.' Влияние гипотермии на кинетические параметры сукцинатдегидрогеназы проростков озимой ржи // Физиол. и биохим. культурных растений. -1987. - Т.19, N 4. - С.384-389. -

11. Войников В.К., Рудиковский A.B.," Побежимова Т.П., Варакина H.H. Влияние белков, выделенных из проростков кукурузы после теплового шока, на энергетическую активность митохондрий кукурузы ff Физиол. растений. - 1988. - Т.35, вып.5. - С.837-840.

12. Yojnikov V.K., Pudikovsky A.N., Pobezhimova Т.P., Vara-■cina N.N. The effect of heat shock proteins on maize mitochondria activity // Plant Physiol. (Life Sei.Adv.). - 1989. - V.8. - P.l-4.

13. Побежимова Т.П., Войников B.K., Варакина H.H. Энергети-юская активность изолированных митохондрий и дыхание интактных •слеток суспензионной культуры кукурузы при гипертермии // Физиол. 4 биохим. культурных растений. - 1990. - Т.22, N6. - С. 537-542.

14. Войников В.К., Варакина H.H., Побежимова Т.П., Рудиковс-сий A.B. Восстановление под действием белковых факторов клеток сукурузы энергетической активности интактных митохондрии // Док-гады АН СССР. - 1990. - Т.311, HI. - С.253-256.

15. Войников В.К., Побежимова Т.П., Варакина H.H., Боровский '.Б. Энергетическая активность митохондрий кукурузы в присутствии юлковых факторов из клеток гороха, кукурузы, пшеницы и ржи // >изиол. и биохим. культурных растений. - 1991. - Т.23, N 2. -'. 173-177.

16. Войников В.К., Варакина H.H., Побежимова Т.П., Рудиковс--ш A.B. Реконструкция энергетической активности ивактивированных

in vitro митохондрий проростков кукурузы // Физиол. растений. 1991. - Т.38, вып.З. - С. 530-537.

17. Варакина Н.Н., Побежимова Т.П., Ванников В.К. Действ! гипертермии на энергетическую активность митохондрий и рост прс ростков кукурузы // Физиод. растений. - 1991. - Т.38, вып.2. С.304-311.

18. Боровский Г., Варакина Н., Побежимова Т., Войников В. Низкомолекулярные белки теплового шока и активность митохондр! при тепловом шоке // Тез.докл. Третий съезд ВОФР. Санкт-Пете[ бург. - 1993. - Т.1. - 0.68.

19. Pobezhimova Т., Voinikov V., Yarakina N.. Borovsky G The dependence of mitochondrial activity in vitro on proteins ar energy. Abstracts 9th Congr. FESPP, Brno, 3-8 July, 1994 // Bi ol.Plant. - 1994. - V.36. - Suppl. - P.181.

20. Побежимова Т.П., Войников В.К., Варакина Н.Н. Энергоза висимость восстановления активности in vitro инактивированных ми тохондрий кукурузы // Физиол. растений. - 1995. - Т.42,КЗ. С.476-479.

21. Побежимова Т.П., Войников В.К., Варакина Н.Н. Инактива ция комплекса I дыхательной цепи митохондрий кукурузы, кнкубируе мых in vitro при повышенной температуре // Доклады АН. - 1995. Т.343,N5. - С.695-698.

22. Побежимова Т.П., Войников В.К., Варакина Н.Н. Действи температуры на энергетическую активность митохондрий кукурузы инкубируемых in vitro // Физиол. и биохим. культурных растений. 1995. - Т. 27, N5-6. - С. 389-394.

23. Побежимова Т.П., Войников В.К., Варакина Н.Н. Анали функциональной стабильности отдельных комплексов дыхательной цеп: митохондрий кукурузы, инкубируемых in vitro при повышенной температуре // Биол.мембраны. - 1996. - T.13,N3. - С.252- 257.

24. Pobezhimova Т., Voinikov V., Yarakina N. The effect oi temperature on the energetic activity of maize mitochondria /, Plant Science. - 1996. - Y.114. - P.29-33.

25. Pobezhimova T., Voinikov V., Varakina N. Inactivation ol complex I of the respiratory chain of maize mitochondria incubated in vitro by elevated temperature // J.Thermal Biology.-1996.-Y.21,N5/6. - P.283-288.

26. Pobezhimova Т., Voinikov V., Varakina N. The effect of

emperature on the energetic activity of mai2e mitochondria // hysical-chemical basis of plant physiology. Pushchino: RSPP. -Э96. - P.98.

27. Pobezhimova T., Voinikov V., Varakina N. Inactivation of smplex I of the respiratory chain of maize mitochondria incuba-3d in vitro under enhanced temperature // Tan же, p.34.

28. Побежимова Т.П., Колесниченко А.В., Войников В.К., Вара-;ша Н.Н., Боровский Г.Б. Стрессовый белок 310 кД при гипотермии ¡шяет на энергетическую активность растительных митохондрий // жлады АН. - 1996. - Т. 350, N 5. - С.715-718.

29. Побежимова Т.П., Войников В. К., Варакдаа Н.Н., Прадедова .В., Озолина Н.В. Активация фосфатазы, дефосфорилирующей тиамин-фофосфат, снижает способность изолированных митохондрий окис-?ть а-кетоглутарат // Физиол.растений. - 1997. - Т.44, N2. -.222-227.

30. Побежимова Т.П., Войников В.К., Варакина Н.Н. Термоус-жчивостъ и функциональная стабильность отдельных комплексов дн-ательной цепи митохондрий кукурузы, инкубируемых in vitro // юкол, растений. - в печати.

31. Колесниченко А.В., Войников В.К., Побежимова Т.П., Вара-гаа Н.Н. Первая и шестая хромосомы D-генома озимой мягкой пшени-j контролируют синтез стрессового белка с молекулярной массой .0 кД // Физиол. растений. - в печати.

32. Побежимова Т.П., Войников В.К. Биохимические и физиоло-гческие аспекты функционирования убихинона // Биол. мембраны. -печати.

33. Voinikov V., Pobezhimova Т., Kolesnichenko A., Varakina and Borovskii G. Stress protein 310 kD affects the energetic

:tivity of plant mitochondria under hypothermia // J.Thermal Bi-ogy. - in press.