Митохондриальные энергорассеивающие системы растений при действии низких температур

Грабельных, Ольга Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Митохондриальные энергорассеивающие системы растений при действии низких температур
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Митохондриальные энергорассеивающие системы растений при действии низких температур"

На правах рукописи

00553894О

Грабельных Ольга Ивановна

МИТОХОНДРИАЛЬНЫЕ ЭНЕРГОРАССЕИВАЮЩИЕ СИСТЕМЫ РАСТЕНИЙ ПРИ ДЕЙСТВИИ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

21 НОЯ 2013

Иркутск-2014

005538946

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Сибирского института физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук, г. Иркутск

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Войников Виктор Кириллович Официальные оппоненты:

Тимофеева Ольга Арнольдовна, доктор биологических наук, доцент, Федеральное государственное автономное учреждение высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет», зав. кафедрой физиологии и биохимии растений Института фундаментальной медицины и биологии

Илли Иван Экидиусович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия», профессор кафедры агроэкологии, агрохимии, физиологии и защиты растений

Власов Борис Яковлевич, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН, старший научный сотрудник лаборатории патофизиологии репродукции

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет», кафедра генетики, цитологии и биоинженерии

Защита диссертации состоится «05» февраля 2014 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317.

Факс (3952) 510754; e-mail: matmod@sifibr.irk.ru Официальный сайт СИФИБР СО РАН: http://www.sifibr.irk.ru/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Сибирского института физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук.

Автореферат разослан «. М> Uj2j£jLt8r-2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Д 003.047.01,

кандидат биологических наук

Г.П. Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Низкие температуры (низкие положительные и отрицательные) являются одним из важных физических факторов внешней среды, ограничивающих рост, продуктивность и географическое распространение растений, особенно в условиях резко континентального климата, когда в своем онтогенезе растения могут подвергаться значительным перепадам температур, заморозкам и морозам. Энергорассеивающие системы митохондрий снижают энергетическую эффективность окислительного фосфорилирования путем рассеивания в виде тепла части энергии, генерируемой электрон-транспортной цепью (ЭТЦ) митохондрий, как до (несопряженное дыхание), так и после преобразования ее в энергию трансмембранного градиента (разобщенное дыхание) [Скулачев, 1989]. В связи с этим их функция может быть важна при низкотемпературном стрессе. У растений среди систем, которые регулируют степень сопряжения окислительного фосфорилирования в митохондриях, выделяются антимицин А- и цианидрезистентная альтернативная оксидаза (АО) [Millenaar, Lambers, 2003; Vanlerberghe, 2013], «внешние» и «внутренние» альтернативные НАД(Ф)Н-дегидрогеназы (НАД(Ф)Н-ДГ II типа) [Rasmusson et al., 2004, 2008], свободные жирные кислоты (СЖК) [Войников, 1987, 2011] и связанные с ними разобщающие белки (plant Uncoupling proteins, pUCPs) [Hourton-Cabassa et al., 2004; Vercesi et al., 2006], подобные UCP животных, и АТФ/АДФ-антипортер [Popov et al., 2002]. Термогенез в генеративных тканях представителей некоторых семейств растений (Araceae, Nelumbonaceae и др.), обусловленный активностью АО, делает процесс цветения независимым от температуры окружающей среды [Seymour, 2001]. Проростки озимых злаков при низкотемпературном стрессе также способны генерировать тепло [Войников, 1987], однако термогенная функция энергорассеивающих систем митохондрий в «нетермогенных» растениях до сих пор является предметом научной дискуссии. АО и pUCPs вовлечены в регуляцию образования активных форм кислорода (АФК) в клетках растений [Purvis et al., 1995; Popov et al., 1997; Brandalise et al., 2003; Smith et al., 2004; Sugie et al., 2006; Begcy et al., 2011] и представляют собой первую линию защиты от генерации АФК [Wagner, Moore, 1997; Maller, Kristensen, 2004]. Активация АО и pUCPs, экспрессия генов, кодирующих эти белки, и увеличение их содержания при действии низких закаливающих температур показаны на различных растительных объектах (в этиолированных и зеленых тканях, суспензионной культуре клеток), однако их связь с холодо- и морозоустойчивостью до сих пор не установлена, так же как и их функциональная роль в этих условиях. В нефотосинтезирующих частях растений митохондрии вносят основной вклад в продукцию АФК в клетках [M0ller, 2001]. Образование АФК повышается при действии низких температур на растения [Xu et al., 2013], при этом в низких концентрациях АФК запускают экспрессию ряда холодо-регулируемых генов (cold-regulated, COR-генов) и участвуют в защитных реакциях [Suzuki, Mittler, 2006], а в высоких - приводят к ухудшению энергетического метаболизма, дисфункции митохондрий и гибели клеток [Weir et al., 2003]. Передача сигнала из митохондрий в ядро и индукция ядерных генов под _

v3^

действием митохондриального сигнального пути, по-видимому, позволяют растениям поддерживать клеточный гомеостаз в изменившихся внешних условиях [Rhoads et al., 2006]. Предотвращение генерации АФК при низкотемпературном воздействии на растения может быть одной из функций энергорассеивающих систем митохондрий [Purvis, Shewfelt, 1993; Popov, 2003; Sugie et al., 2006]. Очень мало работ посвящено изучению функционирования в митохондриях растений при низкой температуре НАД(Ф)Н-ДГ II типа и АТФ/АДФ-антипортера. Возможно, что их функции являются сходными с АО и pUCP. Функционируя совместно с АО, НАД(Ф)Н-ДГ II типа образуют дыхательную цепь, способную окислять цитозольный или матриксный НАД(Ф)Н, что может быть жизненно необходимо при высоком соотношении [НАД(Ф)Н]/[НАД(Ф)+] [Michalecka et al., 2003]. У животных АТФ/АДФ-антипортер участвует в образовании высокопроницаемой митохондриальной поры (Permeability Transiton Роге, РТР) [Tikhonova et al., 1994], открытие которой вызывается СЖК и ионами Са2+ [Zoratti, Szabo, 1995; Rasóla, Bernardi, 2011]. Для растений такие данные отсутствуют, хотя существование РТР у них установлено [Arpagaus et al., 2002]. Не решен вопрос и о регуляции многообразия энергорассеивающих систем в митохондриях растений при действии низких температур. Есть основания полагать, что в механизмах регуляции задействованы АФК, СЖК и ионы Са2+, которые являются непосредственными участниками в ответных реакциях на низкотемпературный стресс. Повышение уровня цитозольного Са2+ в начальный период действия низкой температуры индуцирует экспрессию COR-генов у растений [Whalley et al., 2011]. Поскольку активация АО и pUCP у растений может происходить при холодовом закаливании, с помощью которого повышается холодо- и морозоустойчивость растений, то изучение функционирования энергорассеивающих систем митохондрий представляется особенно важным для сельскохозяйственных культур, таких как озимые злаки. Для биологии озимых культур характерно, что они проходят закаливание в природных условиях при низких положительных и неповреждающих отрицательных температурах и развивают высокую морозоустойчивость [Туманов, 1979; Трунова, 2007]. Комплекс адаптивных реакций формируется и у этиолированных проростков озимых злаков при закаливании в лабораторных условиях [Туманов, 1979].

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении функционирования энергорассеивающих систем в митохондриях этиолированных проростков растений и определении их функциональной роли в адаптации к низким температурам. В задачи исследования входило: 1) оценить роль митохондрий как возможных источников генерации АФК у растений при низкотемпературном стрессе; 2) выявить роль свободных жирных кислот в функциональной активности митохондрий и морозоустойчивости озимой пшеницы, а также определить взаимосвязь между изменениями жирнокислотного состава митохондрий, интактностью их мембран и митохондриальной продукцией АФК; 3) изучить изменение экспрессии генов, кодирующих энергорассеивающие системы митохондрий (альтернативные пути транспорта электронов, pUCP и

АТФ/АДФ-антипортер) при холодовом закаливании этиолированных проростков озимой пшеницы; 3) изучить способность альтернативной оксидазы к транспорту электронов по дыхательной цепи митохондрий этиолированных проростков растений, зависимость ее функционирования от субстрата окисления, содержания свободных жирных кислот и действия низких температур; 4) определить активность альтернативных НАД(Ф)Н-дегидрогеназ в митохондриях озимой пшеницы в процессе низкотемпературной адаптации; 5) выяснить роль риСР и АТФ/АДФ-антипортера в разобщении окислительного фосфорилирования свободными жирными кислотами в митохондриях озимой пшеницы при низкотемпературном стрессе; 6) изучить функционирование в митохондриях злаков неспецифической митохондриальной поры, чувствительной к циклоспорину А, ионам Са2+ и свободным жирным кислотам, и изменение ее свойств в проростках озимой пшеницы при действии низких температур; 7) охарактеризовать механизм разобщающего действия белкового комплекса с мол. массой 310 кДа в митохондриях растений; 8) определить термогенную и антиоксидантную функции изученных энергорассеивающнх систем митохондрий при действии низких температур и возможные механизмы их регуляции.

Положения, выносимые на защиту

1. Интактность мембран и функциональная активность митохондрий в этиолированных тканях растений при низкотемпературном стрессе зависят от содержания активных форм кислорода и активности процесса перекисного окисления липидов и определяются составом жирных кислот, среди которых важную роль играет а-линоленовая кислота.

2. Снижение степени сопряжения процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях растений осуществляется посредством различных механизмов, среди которых механизмы универсальные для клеток животных и растений -свободные жирные кислоты и индуцируемые ими разобщающие белки, АТФ/АДФ-антипортер, неспецифическая митохондриальная пора; и характерные для растений - альтернативная оксидаза, ротенон-нечувствительные НАД(Ф)Н-дегидрогеназы, белковый комплекс с мол. массой 310 кДа. Митохондриальные энергорассеивающие системы играют важную роль в защитно-приспособительных реакциях растений при низкотемпературном стрессе.

3. Механизмы разобщения процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях растений насыщенными и ненасыщенными свободными жирными кислотами различаются. Разобщение насыщенными жирными кислотами обеспечивается в основном за счет АТФ/АДФ-антипортера, в то время как в разобщении ненасыщенными жирными кислотами большая роль принадлежит иСР-подобному белку. В митохондриях этиолированных побегов злаков насыщенные жирные кислоты и ионы Са2+ приводят к открытию циклоспорин А-чувствительной высокопроницаемой поры, изменение свойств которой происходит при низкотемпературном стрессе.

Научная новизна. Изучено функционирование у растений систем, снижающих степень сопряжения процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях, определены возможные механизмы их взаимодействия, пути регуляции и функциональная роль при действии низких температур.

Подтверждено, что митохондрии являются основным источником генерации АФК в тканях этиолированных проростков озимых злаков при низкотемпературном стрессе, при этом показано, что уровень АФК определяет содержание в митохондриях продуктов ПОЛ, жирнокислотный состав митохондрий, интактность их мембран, окислительную и фосфорилирующую активность органелл, а весь комплекс этих параметров влияет на морозоустойчивость растений.

Впервые установлено, что в начальный период действия закаливающей низкой положительной температуры в побегах этиолированных проростков озимой пшеницы происходит увеличение транскриптов AOXlc, NAD7 и АТРб и увеличение содержания в митохондриях альтернативной оксидазы. Индукция синтеза альтернативной оксидазы и сохранение ее способности к транспорту электронов по дыхательной цепи в начальный период действия закаливающей температуры позволяет сохранять высокий уровень синтеза АТФ при окислении митохондриями малата, а также снижать генерацию АФК митохондриями при последующем холодовом шоке.

Впервые в митохондриях из проростков озимой пшеницы показаны различия в активности альтернативных «внешних» и «внутренних» НАД(Ф)Н-дегидрогеназ, при этом в период действия закаливающих температур высокая активность «внешней» НАДН-дегидрогеназы, возможно, компенсирует снижение скоростей окисления малата и сукцината, а также позволяет сохранить необходимый уровень НАД+ в цитоплазме.

Впервые показано, что разобщающий эффект насыщенных жирных кислот в митохондриях растений обусловлен, главным образом, функционированием АТФ/АДФ-антипортера, а ненасыщенных - активностью UCP-подобных белков. Выявлено, что высокая концентрация свободных жирных кислот обусловливает их использование в качестве субстрата окисления для митохондрий, а наличие ионов Са2+ - их участие в открытии высокопроницаемой митохондриальной поры.

Впервые показано, что активация АТФ/АДФ-антипортера и UCP-подобных белков в митохондриях происходит при кратковременном холодовом стрессе, не снижающем выживаемость растений. В то же время холодовой шок, сопровождающийся частичной или полной гибелью проростков, вызывает повреждение процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях, опосредованное накоплением АФК и снижением содержания цитохрома с в митохондриях.

Впервые выявлено участие митохондрий в процессе программируемой клеточной гибели колеоптилей этиолированных проростков озимой пшеницы в ходе естественного старения и после обработки экзогенной перекисью водорода. Для митохондрий этиолированных побегов злаков характерна регулируемая модель открытия неспецифической поры, зависимой от ионов Са2+ и свободных

жирных кислот (пальмитиновой) и чувствительной к циклоспорину А, ингибитору митохондриальной поры животных. Функциональным компонентом поры, вероятно, является АТФ/АДФ-антипортер, активация которого вызывается пальмитиновой кислотой. Показано, что холодовое закаливание проростков успешно предотвращает развитие окислительного стресса и тормозит программу клеточной гибели в колеоптиле злаков.

Установлен механизм разобщающего действия белкового комплекса с мол. массой 310 кДа, который заключается в переносе электронов по дыхательной цепи в обход убихинона и комплекса III через комплекс I на ассоциированный с наружной мембраной митохондрий БХШ 310 и далее на цитохром с и комплекс IV. Такой би-трапс-мембранный перенос электронов активируется в митохондриях злаков при кратковременном холодовом стрессе.

Показано, что термогенез и антиокислительная защита клетки могут быть функциями систем, снижающих энергетическую эффективность дыхания митохондрий в тканях растений с гетеротрофным метаболизмом при действии низких температур.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные расширяют и углубляют современные представления о механизмах функционирования и регуляции нефосфорилирующих путей транспорта электронов в дыхательной цепи митохондрий растений и роли митохондрий в процессах адаптации и гибели растительных клеток при низких температурах. Полученные результаты о возможности холодового закаливания предотвращать развитие программируемой клеточной гибели у растений открывают перспективы для дальнейших исследований в области изучения механизмов клеточной гибели растений.

Новизна механизма разобщающего действия белкового комплекса с мол. массой 310 кДа и способа его получения подтверждены патентом РФ на изобретение «Способ получения биологически активного вещества для регуляции энергетического баланса» № RUS 2257907 от 30.09.2003.

Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете ФГБОУ ВПО «Иркутского государственного университета». Основные результаты исследований вошли в курс лекций по «Биохимии дыхания». Методические подходы к изучению митохондрий растений включены в монографию «Методы изучения митохондрий растений. Полярография и электрофорез» (М.: «Промэкобезопасность», 2004) и используются при проведении практических занятий в рамках курсов «Молекулярно-генетические методы исследования» и «Большой практикум», а также в научно-исследовательской практике студентов и аспирантов, специализирующихся в области физиологии и биохимии растений. Материалы диссертации могут быть включены в курсы лекций по экологии, физиологии и биохимии растений, использоваться в профильных научно-исследовательских институтах РАН.

Связь работы с плановыми исследованиями н научными программами. Исследования проводились в рамках тематических планов НИР лаборатории физиологической генетики СИФИБР СО РАН в период с 2000 по 2013 гг.

Автор являлся руководителем проектов РФФИ (№ 02-04-46096-мас и № 05-04-97231-р_байкал_а), гранта Президента РФ для государственной поддержки молодых российских ученых — кандидатов наук и их научных руководителей МК-1876.2007.4 (2007-2008), грантов СО РАН для молодых ученых (2003-2004, 20062007), а также исполнителем проектов РФФИ (№ 00-04-48093-а, № 01-04-48953-а, № 03-04-48151_а, № 05-04-48966-а, № 07-04-01055-а, № 08-04-01037-а, № 10-04-00921-а), гранта Президента РФ для государственной поддержки ведущих научных школ РФ НШ-4812.2006.4 (2006-2007), междисциплинарного интеграционного проекта СО РАН № 45 (2009-2011), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (№ 2012-1.1-12-000-2008-023) (2012-2013), при поддержке которых выполнялась данная работа.

Личное участие автора. В диссертационной работе использованы экспериментальные материалы, полученные лично автором, а также совместно с коллегами лаборатории физиологической генетики СИФИБР СО РАН. Автор лично принимал участие в планировании и проведении экспериментов, в статистической обработке, обобщении и интерпретации полученных данных, а также в написании статей, опубликованных по результатам работы.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены и обсуждались на российских и международных съездах и конференциях, в том числе: международных симпозиумах «Signalling systems of plant cells» (Москва, 2001) и «Plant under environmental stress» (Москва, 2001), Гордоновской конференции «Temperature stress in plants» (California, 2001), международной конференции «International Conference in Plant Mitochondria Biology» (Obernai, France, 2005), FEBS Congress «Mechanisms in Biology» (St. Petersburg, 2013), Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, 2010), IV, V и VII Съездах Всероссийского общества физиологов растений (Москва, 1999; Пенза, 2003; Нижний Новгород, 2011), III, IV и V конференциях молодых ученых, посвященных М.А. Лаврентьеву (Новосибирск, 2003, 2004, 2007), Всероссийских научных конференциях «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004), «Структура и экспрессия митохондриального генома растений» (Иркутск, 2006), «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2008), «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009), «Факторы устойчивости растений в экстремальных природных условиях и техногенной среде» (Иркутск, 2013), а также научных сессиях СИФИБР СО РАН (Иркутск, 2000, 2002, 2004,2006, 2008, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано более 120 научных работ, в том числе 34 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ для защиты докторских диссертаций, две монографии и один патент на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Список цитированной литературы включает 797 работ, из них 160 отечественных. Работа изложена на 483 страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы и 90 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. В работе использовали растения озимой пшеницы (Triticum aestivum L., сортов Заларинка и Иркутская), озимой ржи (Secale cereale L., сорта Чулпан), кукурузы (Zea mays L., гибрида ВИР 36 и сорта Российская 1), гороха (Pisum sativum L., сорта Марат). Проростки выращивали гидропонным способом в темноте при температуре 25+1 °С до возраста 2,5 или 3-х сут (озимая пшеница), 3-х сут (кукуруза и озимая рожь) и 6-ти сут (горох). Также использовали гетеротрофную суспензионную культуру клеток озимой пшеницы Triticum aestivum (L.), которую выращивали при 26 °С на МС-среде [Murashige, Scoog, 1962], содержащей сахарозу (3%), тиамин (1,0 мг/л), пиридоксин (0,5 мг/л), никотиновую кислоту (0,5 мг/л), 2,4-Д (2,5 мг/л), инозитол (0,01%) и дитиокарбамат натрия (0,0005 %).

Методы. Закаливание проростков озимой пшеницы проводили при 3±1 °С в течение 7 сут (Хол. зак. 1 этап) и последующей обработке -2 - -3 °С в течение 2 сут (Хол. зак. 2 этапа). Отрицательными температурами (-4 °С, 1 ч или -8 °С, 1 - 6 ч) воздействовали на 3-х сут проростки озимой пшеницы или закаленные. Закаливание суспензионной культуры клеток проводили на 8-е сут культивирования при 8 °С (7 сут), а обработку отрицательной температурой на 15-е сут культивирования при -8 °С (6 ч).

Морозоустойчивость проростков определяли по их отрастанию после промораживания. Выживаемость клеток суспензионной культуры определяли с помощью Эванса голубого сразу и через 3, 6 или 10 сут после воздействия. Количество окрашенных клеток подсчитывали в 5 полях, содержащих не менее 50 клеток в 3-х повторностях с помощью светового микроскопа Axiostar plus ("Carl Zeiss", Германия). Выживаемость клеток колеоптилей определяли с помощью Эванса голубого [Baker, Mock, 1994] или 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида (ТТХ) [Еникеев и др., 1995].

Водорастворимые углеводы определяли с антроновым реактивом [Дише, 1967], используя абсолютно сухой растительный материал. Общее содержание SH-групп определяли в гомогенате ткани с помощью реактива Эллмана (5,5-дитиобис(2-нитробензойной) кислоты) [Ellman, 1959], содержание рассчитывали по калибровочной кривой, построенной с использованием восстановленного глутатиона, принимая, что 1 мкМ глутатиона соответствует 1 мкМ SH-rpynn.

Температуру тканей побегов проростков (3 г) регистрировали с помощью термопары медь-константан, подключенной к входу дифференциального микровольтметра по модифицированному методу Войникова и Корзуна [1984]. О термогенерации судили по разнице температур между живыми и «убитыми» с помощью нагревания образцами ткани (At, °С).

Общее содержание АФК в интактных побегах и изолированных митохондриях определяли с помощью 2,7-дихлородигидрофлуоресцеин диацетата (H2DCF-DA) на спектрофлуорофотометре RF-5301 PC ("Shimadzu", Япония) [Грабельных и др., 2011а]. В качестве контроля специфичности действия H2DCF-DA оценивали изменение его флуоресценции в ответ на добавление Н2Ог или аскорбиновой кислоты. Содержание пероксида водорода определяли

спектрофотометрически с помощью 3,3 -диаминобензидина (ДАБ) по методике [Tarasenko et al., 2012] в нашей модификации [Корсукова и др., 2013а].

Уровень ПОЛ в суспензии митохондрий оценивали по флуоресценции его продуктов по методу [Fletcher et al., 1973] в модификации И.В. Жигачевой с соавт. [2008]. Определение флуоресценции проводили при длине возбуждения 360 нм и длине испускания 440 нм.

Выделение митохондрий из этиолированных побегов проводили методом дифференциального центрифугирования с последующей очисткой в градиенте плотности 23/35% (объем/объем) перколла по методике [Грабельных и др., 2011]. Для оценки полученной фракции митохондрий использовали критерии, как в работах [Звягильская, Котельникова, 1991; Шугаев, 2003].

Целостность наружной мембраны митохондрий определяли полярографически по скорости поглощения кислорода митохондриями при окислении аскорбата в присутствии экзогенного цитохрома с в отсутствие и в присутствии 0,04% Тритона Х-100 [Davy de Virville et al., 1994]. Активность гидроксипируватредуктазы (маркер пероксисом) оценивали по окислению НАДН при 340 нм [Schwitzguebel, Siegenthaler, 1984]. Активность глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (маркер пластид и цитоплазмы) оценивали по восстановлению НАДФ+ при 340 нм по методу [Muto, Uritani, 1974]. Активность «внешних» НАД(Ф)Н-ДГ в суспензии митохондрий оценивали по окислению экзогенных НАДН и НАДФН при 340 нм по методу [Svensson, Rasmusson, 2001]. Активность «внутренней» ротенон-нечувствительной НАДН-ДГ оценивали по окислению НАДН при 340 нм после пермеабилизации мембран митохондрий с помощью осмотического шока [Svensson, Rasmusson, 2001]. Коэффициент экстинкции для НАДН принимали равным 6,22х103 моль"1 см"1 [Bergmeyer, 1965].

Интенсивность дыхания культуры клеток, интактных побегов и изолированных из них митохондрий регистрировали полярографически с платиновым электродом закрытого типа (электрод Кларка) [Трушанов, 1973] в ячейке объемом 1,4 мл при 26 °С на полярографе ОН-105 (Венгрия). Субстратами для дыхания митохондрий служили: 10 мМ малат в присутствии 10 мМ глутамата, 8 мМ сукцинат в присутствии 5 мМ глутамата, 1 мМ НАДН, 1 мМ НАДФН. Глутамат добавляли для устранения оксалоацетатного ингибирования. Для активации «внешней» ротенон-нечувствительной НАД(Ф)Н-ДГ в среду инкубации включали 0,06 мМ СаС12 [Moller et al., 1981], для активации сукцинатдегидрогеназы (СДГ) - 200 мкМ АТФ. Скорости поглощения кислорода, коэффициенты дыхательного контроля (ДК) и отношения АДФ/О рассчитывали по методу [Chance, Williams, 1956]. Для связывания СЖК в реакционную среду включали 0,1-0,5% бычий сывороточный альбумин (БСА), свободный от жирных кислот. Для ингибирования комплекса I ЭТЦ использовали 3 мкМ ротенона или 50 мкМ реина, комплекса III ЭТЦ - 20 мкМ антимицина А, комплекса IV ЭТЦ -0,4 мМ KCN, АТФ-синтазы — 2,5 мкг/мг белка олигомицина, АТФ/АДФ-антипортера - 1 - 2 мкМ карбоксиатрактилозида (Катр), неспецифической поры митохондрий - 1 мкМ циклоспорина А (цикА), UCP-подобных разобщающих белков - 0,5 - 2,0 мМ ГТФ, ГДФ, АТФ и АДФ. Максимальную скорость

окисления субстратов измеряли в присутствии 50 - 200 мкМ АДФ (состояние 3) или 0,5 мкМ карбонилцианид т-хлорфенилгидразона (КЦХФ). Потенциальную активность АО в митохондриях оценивали как часть дыхания в состоянии 3 или 4, ингибируемого бензгидроксамовой кислотой (БГК) (0,5 - 3,0 мМ) в присутствии KCN (0,4 - 1,2 мМ), в культуре клеток и побегах как часть дыхания, ингибируемого БГК или СГК (салицилгидроксамовая кислота) (2 мМ) в присутствии KCN (0,8 мМ). Максимальную активность АО в митохондриях оценивали в присутствии 1 мМ пирувата и 5 мМ дитиотрейтола (ДТТ). Для определения разобщающей активности экзогенные СЖК добавляли к митохондриям в состоянии 4. Карнитиновый цикл и митохондриальное ß-окисление активировали добавлением 0,5 мМ L-карнитина, 0,2 мМ АТФ, 10 мкМ Со А, 0,1 мМ MgCl2 и 10 мМ малата. KCN и БГК использовали для оценки способности СЖК служить субстратом окисления для митохондрий [Dieuaide et al., 1993; Masterson, Wood, 2001]. В работе использовали С12:0, С16:0, С18:0, С20:0, С22.-0, С24:0, 16:1(Д9), 18:1(Д9) цис- и трат-изомеры, 18:2(Д9-12), 18:3(Д9'12'15), 20:1(ДП), 22:1(Д13) и 24:1(Д15) кислоты в концентрациях от 0,056 до 1 мМ.

Мембранный потенциал в изолированных митохондриях (Д\1/Мнт) определяли с помощью 2,5 мкМ сафранина О [Pastore et al., 1999] на спектрофлуорофотометре RF-5301 ("Shimadzu", Япония).

Набухание митохондрий измеряли спектрофотометрически при 540 нм в среде, содержащей 200 мМ KCl и 20 мМ MOPS-KOH (pH 7,4). Данные рассчитывали в виде разницы оптической плотности (АОП54о), равной (Ont0-0nti)*100, где Onto-начальная оптическая плотность, ОШгоптическая плотность через определенное время.

Общую фракцию липидов митохондрий экстрагировали смесью хлороформ:метанол (2:1) [Bligh, Dyer, 1959]. Анализ метиловых эфиров жирных кислот проводили методом газожидкостной хроматографии с использованием хромато-масс-спектрометра 5973N/6890N MSD/DS ("Agilent Technologies", США), а их идентификацию с помощью расчета эквивалентной длины алифатической цепи (ECL). Относительное содержание жирных кислот определяли в вес. процентах от общего их содержания в исследуемом образце.

Тотальную клеточную РНК выделяли с помощью набора "SV Total RNA Isolation System" ("Promega", США). Построение первой цепи осуществляли с помощью набора «РЕВЕРТА» (АмплиСенс, ФГУН ЦНИИ эпидемиологии, Россия) согласно рекомендациям фирмы производителя с некоторыми модификациями. ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) проводили на приборе CFX96 ("BioRad", США), используя SYBR Green I ("Sigma", США) и реактивы фирмы "Fermentas" ("ThermoScientific", Литва). В работе использовали ген-специфичные праймеры к генам COR14, NAD7, СОВ, СОХ2, АТРб, UCPla, UCPlb, AOXla, AOXlc, ANT1, NDA2, NDB2, Ta2291 и Ta2776 (представлены в диссертации). Подбор праймеров к пшеничным генам, гомологичным по последовательности генам ANT1, NDA2 и NDB2 арабидопсиса, осуществляли на основе сборных транскриптов (ТА - transcript assembly) из базы данных

Института геномных исследований (TIGR, США) [Childs et al., 2007]. Подбор праймеров осуществляли с помощью программы Vector NT1 v.5.1 (InforMax™Invitrogen™Life Science Software, США). В качестве референсных генов использовали Та2291 (фактор рибозилирования АДФ) и Та2776 (белок, подобный ингибитору рибонуклеазы L) [Paolacci et al., 2009]. Значение порогового цикла реакции (Ct - threshold cycle) определяли автоматически с использованием программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager, версия 1.6.541.1028 (Bio-Rad, США). Данные представлены как Qm - нормализованный уровень экспрессии гена в опытном образце ткани относительно контрольного образца (до закаливания).

Общую белковую фракцию выделяли из побегов проростков по методу [Побежимова и др., 2004]. Митохондриальную и цитоплазматическую фракции выделяли из гомогенатов ткани с помощью дифференциального центрифугирования. Белковый комплекс с мол. массой 310 кДа (БХШ 310) выделяли из 3-х дневных побегов озимой ржи, не подвергнутых и подвергнутых обработке -1 °С (1 ч), согласно методу [Колесниченко и др., 1996]. Концентрацию белка определяли по методу Лоури [Lowry et al., 1951].

Электрофорез белков в ПААГе с ДДС-Na проводили в модифицированной системе Лэммли [Laemmli, 1970], используя прибор для электрофореза Mini-PROTEAN III Electrophoretic Cell (Bio-Rad, США). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану ("Amersham", США) и обработку антителами проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. В работе использовали вторичные антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой. Порин был использован как внутренний контроль. Для определения мол. масс полипептидов использовали в качестве стандартов наборы белков (NS8320 и NM3913, Sigma, США).

Проводили не менее 3-х независимых экспериментов, в каждом из которых повторность была 2-6 кратной. Для статистической обработки количественных данных пользовались общепринятыми методами: рассчитывали среднее арифметическое и стандартное отклонение или ошибку средней [Лакин, 1973]. В работе обсуждаются статистически значимые различия при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Физиолого-биохимические показатели, характеризующие холодовое закаливание этиолированных проростков озимой пшеницы и изолированных из них митохондрий

В этиолированных проростках дыхание является основным процессом, обеспечивающим клетки энергией. Общий характер развития проростков злаков и изменение интенсивности их дыхания известны давно, при этом показано, что в течение первых 2-3 дней зародыш потребляет запасные вещества из собственных запасов, а затем использует запасы эндосперма [Джеймс, 1956]. Первая фаза (или первый этап) холодового закаливания озимых злаков может протекать в темноте при условии, если находящиеся на холоде растения обеспечиваются в качестве источника энергии сахарами или если они не исчерпали запасные вещества эндосперма [Трунова, 1963; Туманов, 1979]. Основываясь на этих фактах,

закаливанию подвергали этиолированные проростки озимой пшеницы морозоустойчивого сорта «Иркутская» в возрасте 2,5 или 3-х сут, а температурами первой фазы закаливания служили температуры +2 - +4 °С (7 сут), температурами второй фазы закаливания -2 - -3 °С (2 сут). Выбор температур обоснован тем, что в диапазоне температур 0-5 °С при продолжительности обработки 7 сут проростками озимой пшеницы достигается максимальная холодо-и морозоустойчивость [Титов и др., 2006], а последующее прохождение проростками закаливания при -3 °С в течение 1-3 дней обеспечивает дополнительный прирост морозоустойчивости на 2-5 °С [Herman et al., 2006].

Для проростков озимой пшеницы под действием закаливающих температур было характерно значительное ингибирование удлинения побегов (на 94±2%) и биомассы (на 88±3%), повышение содержания сухого вещества (на 29-39%) и некоторое увеличение содержания водорастворимых углеводов (на 10-20%). Торможение ростовых процессов сопровождалось повышением морозоустойчивости проростков (рис. 1, а). В отличие от контрольных проростков, которые имели слабую морозоустойчивость (LTjo=-3 °С), закаливание проростков при 2 °С приводило к повышению морозоустойчивости до LT50=-8,2 °С, а последующее закаливание при температуре -2 °С сопровождалось дальнейшим повышением морозоустойчивости до LT50=-9,8 °С (рис. 1, а). Повышение морозоустойчивости проростков озимой пшеницы сопровождалось синтезом дегидринов, о чем свидетельствуют результаты иммуноблоттинга белков из побегов проростков с антителами К-сегмента дегидринов (рис. 1, б).

а б

-2 -4 -6 -8-10-12-14-16 Температура, °С

Рис. 1. Морозоустойчивость контрольных и закаленных проростков озимои пшеницы (а) и содержание дегидринов в побегах нророегков (б) и изолированных из них митохондриях (в). Выживаемость проростков анализировали через 7 сут после промораживания (24 ч обработка). Обозначения: 1 -- контроль, 2 - хол. зак. 1 этап, 3 — хол. зак 2 этапа, к Да мол. массы изучаемых белков, - дегедрвпы, Роли - нории Использованы поликлопальные аптитела против К-сегмента дегидринов фирмы (США). М+8-П>_, л-3.

Благодаря высокой гидрофильности белковой молекулы дегидрины во время обезвоживания препятствуют потере клеткой воды и стабилизируют клеточные

белки [Sahran, Perras, 1987; Guy et al., 1992; Close, 1996], а также выполняют криопротекторную функцию и защищают липиды мембран от перекисного окисления [Rorat, 2006; Нага, 2010; Kosová et al., 2010; Hanin et al., 2011]. Дегидрины могут принимать участие в стабилизации мембранных структур митохондрий озимых злаков во время холодового закаливания [Романенко и др., 2010; Borovskii et al., 2002]. В митохондриях из побегов закаленных проростков озимой пшеницы нами выявлена индукция синтеза белка с мол. массой около 52 кДа (рис. 1, в), что согласуется с ранее полученными G.B. Borovskii с соавт. [2002] данными о значительном увеличении содержания в митохондриях озимой пшеницы при холодовом закаливании дегидрина со сходной мол. массой.

Несмотря на достижения последних лет в области изучения механизмов низкотемпературной адаптации у растений, обзор которых проведен в работе Т.Н. Труновой [2007], связь между развитием окислительного стресса, жирнокислотным составом, функциональной активностью митохондрий и их энергорассеивающих систем при действии закаливающих и повреждающих низких температур на растения до конца не изучена. В связи с этим нами был проведен анализ этих параметров у митохондрий, изолированных из контрольных и закаленных проростков озимой пшеницы, подвергнутых действию отрицательной температуры -8 °С, при которой различия в морозоустойчивости контрольных и закаленных проростков озимой пшеницы были хорошо выражены (рис. 2, а). Продолжительность воздействия температурой -8 °С в течение 6 ч была летальной для незакаленных проростков, в то время как закаленные проростки успешно противостояли губительному действию отрицательной температуры (рис. 2, а). Двумя методами (с помощью H2DCF-DA и ДАБ) показано, что закаливание проростков озимой пшеницы, сопровождающееся повышением морозоустойчивости, при последующем холодовом шоке предотвращало развитие в тканях побегов окислительного стресса (рис. 2, б). Содержание АФК (рис. 2, в) и уровень флуоресценции продуктов ПОЛ (рис. 2, г) в митохондриях из закаленных проростков озимой пшеницы, подвергнутых холодовому шоку, были меньше, чем в митохондриях незакаленных проростков. Анализ жирнокислотного состава выявил наибольшее содержание в митохондриях озимой пшеницы пальмитиновой (14,6%), линолевой (46%) и а-линоленовой (26,1%) кислот (данные представлены в диссертации). Такое распределение в содержании жирных кислот является характерным свойством растительных митохондрий [Lyons et al., 1963; Edman, Ericson, 1987; Cantrel et al., 2000; Stupnikova et al., 2006; Matos et al., 2007, 2009]. При этом содержание a-линоленовой кислоты сохранялось на высоком уровне в митохондриях из закаленных проростков, подвергнутых холодовому шоку, в то время как снижалось в митохондриях незакаленных проростков после холодового шока (рис. 2, д). Более высокому содержанию a-линоленовой кислоты в митохондриях соответствовала более высокая интактность внешней мембраны (рис. 2, е). Из полученных данных следует, что содержание a-линоленовой кислоты является критическим фактором для сохранения криорезистентности мембран. Согласно данным А.Г. Верещагина [2007] меньший расход a-линоленовой кислоты в

проростках пшеницы к концу яровизации, по сравнению с другими жирными кислотами (например, линолевой), свидетельствует, что липиды, включающие а-линоленовую кислоту, имеют жизненно важное значение для поддержания нормальной структуры мембран и дальнейшего ускоренного развития проростков.

а б в

1 2 3 4 6 Продолжительность обработки, часы

Контроль Ход. зак. Ход. зак.

1 этап 2 этапа

КошрольХол. зак. Ход. зак.

1 этап 2этана

Контроль Хол. зак. Ход. зак.

1 этап 2 этапа

Контроль Ход. зак. Хол. зак.

1этап 2 этапа

КошрольХол. зак. Хал. зак.

140

г; 0» 120

Л *о

о к о Й 100 80

й>

§ 60

1 о 40

Е О л е о 20

С 0

пуз

I ¥4

безХШ

Рис. 2. Морозоустойчивость контрольных и закаленных нроростков озимой пшеницы (а), содержание АФК в побегах (б) и параметры структурной и функциональной активности изолированных из них митохондрий (в - ж) до (светлые столбики) и после холодового шока (ХШ), вызванного обработкой проростков температурой -8 "С (6 часов) (темные столбиш).

ХШ

а - выживаемость цророспсов при температуре --8 "С (I - контроль, 2 - хол. зак. 1 этап, 3 - хол. зак. 2 этапа), б содержание АФК в побегах щюроспсов, в - содфжалие АФК в митохондриях при окислении суюдавата, г уровень флуоресценции продуктов ПОЛ, д содержание а-линолешвой кислоты в митохондриях, е - галантность наружной мембраны митохондрий, ж - скорость окислепня сукцината мнтоховдршми в присутствии АДФ (УЗ) и в его отсутствие (У4) (/. 4 - контроль, 2, 5 - хол. зак. 1 этап, 3.6- хол зак. 2 этапа)- МтХЛ)., п=3-10.

Снижение продукции АФК митохондриями, возможно, защищает их мембраны от развития ПОЛ и способствует сохранению их интактности, что, должно обеспечивать возможность протекания процесса окислительного

фосфорилирования во внутренней мембране митохондрий. Действительно, если действие отрицательной температуры на незакаленные проростки приводило к значительному снижению окислительной и фосфорилирующей активности в изолированных из них митохондриях, то скорости дыхания и энергетическая активность в митохондриях закаленных проростков, подвергнутых холодовому шоку, оставались стабильными (рис. 2, ж). Следует отметить, что закаливание проростков озимой пшеницы сопровождалось снижением скоростей дыхания митохондрий, но не снижением степени сопряжения процессов окисления и фосфорилирования (рис. 2, ж), что согласуется с работами [Нарийчук, Бабенко, 1981; Хохлова и др., 1993]. Снижение скоростей поглощения кислорода митохондриями холодоустойчивых сортов озимой пшеницы в процессе закаливания, наряду с сохранением энергетический эффективности дыхания, придает большую стабильность митохондриям и позволяет обеспечивать синтетические процессы в клетке при закаливании [Нарийчук, Бабенко, 1981]. Такая стратегия реализуется при длительном действии закаливающих к холоду температур, что наблюдается в природных условиях в осенний период, когда озимые злаки приобретают обратимую морозоустойчивость. Что будет происходить при резком снижении температуры окружающей среды, имитирующей заморозки? В этом случае повышение скорости дыхания за счет активации энергорассеивающих систем приведет к термогенезу. С использованием этиолированных проростков различных злаков (озимая пшеница, озимая рожь, кукуруза) и двудольных растений (горох) нами показано, что термогенез является одним из способов защиты растений при низкотемпературном стрессе [Войников и др., 2001а, б; вгаЬеЬусЬ Ш а1., 2003; Ко^шсИепко й а1., 2003а; ТоигсЬашпоуа е1 а1., 2005]. При этом установлено, что термогенез более выражен при действии отрицательной температуры на незакаленные проростки растений, чем на закаленные (рис. 3) [Войников и др., 2001а; Ко^вшсИепко е! а1., 2003а].

Время охлаждения, мин

Рис. 3. Разница температур между живыми и «убшыми» незакаленными (1) и закаленными ори 4 °С в течение 7 суток (2) побегами этиолированных проростков озимой пшеницы при действии отрицательной температуры -4 °С. М+вЛХ, я-3

Так, при холодовом стрессе, индуцируемом помещением проростков в камеру с температурой -4 °С, наблюдали более существенное увеличение разницы температур между живыми и «убитыми» незакаленными проростками, чем закаленными (рис. 3). Полученные данные позволили нам предположить, что в закаленных проростках озимых злаков функции систем, обеспечивающих снижение степени сопряжения окислительного фосфорилирования в митохондриях, другие, в частности, они могут быть связаны с участием в антиокислительной защите клетки. Снижение скоростей дыхания при действии низкой температуры может приводить к повышению генерации АФК, связанному с перевосстановлением пула убихинона, при этом переключение на нефосфорилирующие пути дыхания может предотвращать такую ситуацию.

2. Механизмы и функции энергорассеивающих систем в митохондриях растений и роль митохондрий в процессах адаптации и гибели растительных клеток при низких температурах

Методом иммуноблоттинга нами показано присутствие в белковом спектре митохондрий озимой пшеницы белков, ответственных за альтернативные пути транспорта электронов и нефосфорилирующее дыхание: АО, UCP1/2, NDA («внутренняя» ротенон-нечувствительная НАД(Ф)Н-ДГ), NDB («внешняя» ротенон-нечувствительная НАД(Ф)Н-ДГ). АО представлена в митохондриях озимой пшеницы белками с мол. массой 31 и 32 кДа, UCP1/2 одиночным белком с мол. массой около 32 кДа, NDA белками с мол. массами 63 и 56 кДа, a NDB белком с мол. массой 64 кДа (рис. 5, е). Учитывая присутствие в митохондриях озимой пшеницы NDA, NDB и АО, возможно, по меньшей мере, восемь различных путей транспорта электронов по дыхательной цепи: NDA - убихинон -комплекс III - комплекс IV; NDB - убихинон - комплекс III - комплекс IV; NDA

- убихинон - АО; NDB - убихинон - АО; комплекс I - убихинон - комплекс III -комплекс IV; комплекс I - убихинон - АО; комплекс II - убихинон - комплекс III

- комплекс IV; комплекс II - убихинон - АО. Альтернативные ферменты растений не являются протон-транслоциирующими и, следовательно, не способны к трансмембранной транслокации протонов, что позволяет им избежать лимитирования скорости переноса электронов генерируемым протонным потенциалом, т.е. эффекта дыхательного контроля [цит. по: Скулачев и др., 2010]. Кроме того, нами была показана ассоциация с митохондриями злаков цитоплазматического белка с мол. массой 310 кДа [Kolesnichenko et al., 2000; 2002]. Данный белок вызывает интерес в связи с его участием в регуляции степени сопряжения процессов окисления и фосфорилирования в растительных митохондриях при низких температурах [Побежимова и др., 1996], однако механизм его разобщающего действия не известен. Изучение функционирования АО и БХШ 310, а также выяснение роли СЖК в энергетическом метаболизме проростков озимой пшеницы проводили в состоянии 4 (скорость дыхания в отсутствие АДФ), поскольку уровень дыхания в состоянии 4 отражает утечку протонов, и в этом состоянии пул убихинона наиболее восстановлен [James et al. 2004].

2.1. Функционирование в митохондриях озимой пшеницы альтернативной цианидрезистентной оксидазы

Альтернативная оксидаза была первой из обнаруженных у растений систем диссипации энергии в митохондриях. Хотя существует большое число работ относительно индукции альтернативного пути (АП) дыхания в растениях низкими температурами [Мс Nulti, Cummins, 1987; Stewart et al., 1990; Ribas-Carbo et al., 2000; Atkin et al., 2002; Calegario et al., 2003; Kurimoto et al., 2004; Fiorani et al., 2005; Sugie et al., 2006; Covey-Crump et al., 2007; Matos et al, 2007; Armstrong et al., 2008; Mizuno et al., 2008; Aken et al., 2009; Macfarland et al., 2009] однозначного ответа на вопрос о связи АП с холодоустойчивостью растений нет. Наряду с данными о важной роли АО при адаптации к холоду [Calegario et al, 2003; Matos et al., 2007; Mizuno et al., 2008] показано отсутствие положительной корреляции между активностью АО и холодоустойчивостью растений [Stewart et al., 1990; Ribas-Carbo et al., 2000]. После действия закаливающих температур на проростки озимой пшеницы наблюдали некоторое снижение интенсивности дыхания в тканях побегов (рис. 4, а), а с увеличением длительности охлаждения (на 3-7 сут) возрастало цианидрезистентное (ЦРД) дыхание, чувствительное к БГК, которое снижалось при последующем действии закаливающей отрицательной температуры (рис. 4, б). Механизм активации АО на пострансляционном уровне связан с переходом неактивной формы фермента, существующей у растений в виде гомодимера, у которого мономеры ковалентно связаны дисульфидным мостиком, в активную, у которой дисульфидная связь восстановлена, а также во взаимодействии с а-кетокислотами, особенно пируватом [Millenaar, Lambers, 2003].

2°С -2°С 2°С -2°с

Рис. 4. Интенсивность дыхания (а) и отношение альтернтивного пути (АП) дыхания к циггохромшму (ЦП) (б) в побегах этиолированных проростков озимой пшеницы до и после холодового закаливания.

Обозначения: К(кошроль)- 3 сут этиолированные проростки, выращенные при 25±1 "С. По оси абсцисс сутки закаливания при соответствующих температурах, а - различия между котрольньдш и закаленными проростками значимы. M rS D-, п 3

В то же время in vivo активность АО очень сильно зависит от содержания белка альтернативной оксидазы, а, следовательно, и степени экспрессии его гена, а также от концентрации его субстрата - восстановленного убихинона [Siedow, Umbach, 2000; Millenaar et al., 2003]. У озимой пшеницы АО кодируется двумя генами AOXla и AOXlc [Takumi et al., 2002], экспрессия которых возрастает после обработки низкой положительной температурой [Takumi et al., 2002; Mizuno et al., 2008]. В наших экспериментах в этиолированных проростках озимой пшеницы в начальный период закаливания наблюдали накопление транскриптов гена AOXlc (рис. 5, а) и увеличение содержания белка АО в митохондриях (рис. 5, в). Наряду с AOXlc индуцировалась экспрессия генов NAD7 и АТР6 (рис. 5, б).

2,5 г " 3,5 г 6

1,5

0,5

К 1

3 ,5 7, L3

3,5 3 2,5 2

г,

1,5 1

0,5 0

ЛТР6

К J_

2 °С

-2°С

2°С

—1—1 -2°С

Холодовое закаливание, сут

NDB NDA UCP

АО Poriii

кДа « е-

61 О hí о S

63 о О РГ

56 ж а л ь

32 SQ

32 О о

31 к <5

250

200

150

100

1-31 кДа

2-32 кДа

К 1

2"С -2°С

Рис. 5. Измепепие экспрессии генов (а, 6) и содержания мигоховдриальпых белков (в, г) в побегах этиолированных проростков озиыойпшеницы до и после холодового закаливания. Обозначения: К (комтроль) - 3 сут этиолированные щюроспоа, выращенные при 25±1 °С. По оси абсцжс сутки закаливания при соответствующих температурах. Ml S.D., и=3-6. Ашитела на NDA в NDB (от Prof. А. Rasmusson, Lund Universily, Швеция), UCP (AS12 1850, Agrisera, Швеция), АО (ASIO «99, Agrisera, Швеция), Polin (нории, от Prof. Т. Elflian, University of Nebraska, США).

Как показано на митохондриях, изолированных из мягкой и твердой пшеницы, функционирование АО при окислении малата позволяет поддерживать потенциал на внутренней митохондриальной мембране за счет первого пункта

сопряжения в дыхательной цепи [Абдрахимова и др., 2011; Pastore et al., 2001]. Эти данные могут объяснить наблюдаемый нами скоординированный характер экспрессии генов AOXlc, NAD7, АТРб в начальный период закаливания, поскольку при согласованной работе комплекса I, АТФ-синтазы и АО сохраняется возможность генерации Лрн+ в первом пункте сопряжения и возможность синтеза АТФ, необходимого для эффективного закаливания. В дальнейшем мы провели изучение окислительной и фосфорилирующей активности митохондрий озимой пшеницы и оценили способность АО к транспорту электронов при окислении малата, сукцината и НАДН. При изучении окислительной и фосфорилирующей активности митохондрий, изолированных из контрольных проростков озимой пшеницы оказалось, что наиболее активно митохондрии окисляют малат, с большей скоростью сукцинат и самая высокая скорость поглощения кислорода характерна для митохондрий, окисляющих экзогенный НАДН (рис. 6). При этом обнаружилась сильная зависимость скорости окисления малата, по сравнению с сукцинатом и НАДН, от присутствия БСА в средах (рис. 6), что может свидетельствовать о большем сродстве комплекса 1 к СЖК. В присутствии БСА во всех средах, отношение АДФ/О при окислении малата и сукцината было близким к теоретически возможному (около 3 для малата и 2 для сукцината), а коэффициент ДК был равен не менее 3,50 для малата и 1,60 для сукцината.

180 |_.160

g" к 140

s 1 Ё -go"

s ё 2 °

120 100 80 60 40 20 0

av3

I V4

rti

, Малат Сукцинат НАДН I

без БСА

Малат Сукцинат НАДН ;

с БСА в средах гомогенизации и промывания

Рис. 6. Окислительная активность митохондрий озимой пшеницы, изолированных в средах без БСА и присутствии БСА в средах гомогенизации и промывания.

Концентрация БСА составляла 0,1% в среде гомогенизации и 0,2% в среде промывания. MfcS-D.,ji=3-4.

Поскольку существуют данные об ингибировании альтернативной оксидазы свободными жирными кислотам [Sluse et al., 1998; Almeida et al., 1999], с использованием малата как субстрата окисления мы провели изучение влияния БСА на способность АО к транспорту электронов. Митохондрии, выделенные в отсутствие БСА, не обладали активностью АО, дыхание в состоянии 4 было

полностью цианид-чувствительным, а добавление БСА в среду инкубации вызывало активацию ЦРД (данные представлены в диссертации). Данное обстоятельство, возможно, связано с тем, что СЖК, высвобождающиеся при разрушении ткани в процессе гомогенизации, ингибируют активность АО. Способность АО к транспорту электронов в изолированных митохондриях зависела от субстрата окисления: была максимальной при окислении маната (около 47%) и наименьшей при окислении НАДН (около 14%) (рис. 7). После первой фазы холодового закаливания в митохондриях проростков озимой пшеницы наблюдалось снижение скорости потока электронов по цитохромному пути, в то время как сохранялся транспорт электронов по альтернативному пути (рис. 7). Эти изменения были характерны для митохондрий озимой пшеницы при окислении ими малата, сукцината и НАДН в отсутствие активаторов АО. Сохранение способности АО к переносу электронов в митохондриях озимой пшеницы на первом этапе холодового закаливания, как было показано, сопровождается накоплением транскриптов АОХ1с и увеличением содержания белка АО (рис. 5).

120%

100% 80% -60% -40% -20% 0%

Малах

и АП □ ЦП

1 2 3 1 2 3

Сукцинаг НАДН

Рис. 7. Вклад ЦП и АП в дыхание при окислении различных субстратов митохондриями из контрольных (1) и закаленных (2, 3) проростков.

Мигоховдрин выделяли в присутствии БСА в среде гомогенизации (0,1%) и промывания (0,2%), дыхание определяли в отсутствие пиру вата и ДТТ. МЬв-О., п=3. Обозначения; 1 - Кошроль, 2 - Хол. зак. 1 этап, 3 -Хол. зак_ 2 этапа. За 100% принята скорость дыхания митохондрий в состоянии^.

Поскольку термогенерация тканями закаленных проростков озимой пшеницы незначительна (рис. 3), возможно, основное назначение АО в период низкотемпературной адаптации заключается в поддержании синтеза АТФ, обеспечении синтетических процессов в клетке и предотвращении развития окислительного стресса. Для проверки способности компонентов ЭТЦ митохондрий озимой пшеницы к образованию АФК и выявления антиоксидантной способности АО оценивали изменения в уровнях АФК в митохондриях в присутствии различных ингибиторов ЦП и АП (рис. 8) [Грабельных и др., 2011а]. При этом использовали подход, который был применен другими исследователями при изучении способности АО регулировать образование АФК в митохондриях [Попов и др., 2003]. Согласно данным ингибиторного анализа ротенон не вызывал достоверных изменений уровня АФК, тогда как антимицин А и БГК усиливали генерацию АФК в митохондриях из

контрольных проростков (рис. 8, а). В отличие от антимицина А и БГК, КСЫ подавлял образование АФК митохондриями (на 41%), а КЦХФ не влиял на уровень продукции АФК (рис. 8, а). В то же время антимицин А не усиливал образование АФК в митохондриях из побегов проростков, прошедших первый этап холодового закаливания, по сравнению с митохондриями незакаленных проростков, инкубация с БГК еще больше повышала содержание в них АФК, а добавление КСЫ и КЦХФ приводило к снижению продукции АФК (рис. 8, б). Такие изменения в содержании АФК в ответ на добавление митохондриальных ингибиторов указывают на то, что основным сайтом генерации АФК в митохондриях в данных условиях является С>-цикл, а функционирование АО позволяет предотвращать генерацию АФК.

зоо

О « 250 -) | £ 200 -Ь 150 -100 -50 -0

о ч

М!

О я О й

600 500 -400 300 -200 100 0

Я Л

Рис. 8. Влияние ингибиторов дыхания иа содержание АФК в митохондриях озимой пшеницы из контрольных (а) и закаленных (6) проростков.

Обозначения: К (контроль) и К (Чах. 1) - митохондрии из побегов контрольных проростков и проростков после первого этапа закаливании, соответственно, в отсутствие ингибиторов. Рот - 3 мкМ ротенон, АягА -20 мкМ аотамипри А, БГК - 1 мМ бевзтядроксамовая кислота, КСЫ - 0,4 мМ КСЛ, КЦХФ - 1 мкМ карбонилцнаиид т-хлорфешшпадразон, Аск - 60 мМ аскорбиновая кисдота, П20, - 1 мМ перекись водорода- а - различия между вариантами в отсутствие и присутствии ингибиторов значимы, б - различия между митохондриями контрольных и закаленных проростков значимы. Мьв -Е-, и=3—8.

При кратковременном низкотемпературном стрессе АО может вносить вклад в термогенез проростков озимой пшеницы, что показано нами в экспериментах с использованием ингибитора АО - БГК и ингибитора ЦО - KCN (рис. 9) [СгаЬе1пус11 е! а1., 2003]. Установлено, что инфильтрация проростков озимой пшеницы БГК снижает интенсивность поглощения кислорода тканями побегов на 30% по отношению к контролю, в то время как одновременная инфильтрация проростков КСИ и БГК снижает скорость поглощения кислорода побегами проростков на 76%. Инфильтрация проростков БГК снижала разницу температур живых и «убитых» побегов проростков примерно на один градус по сравнению с контролем в первые 15-20 мин холодового воздействия (рис. 9). Одновременная инкубация проростков КСИ и БГК снижала генерацию тепла проростков более значительно, в первые 15 мин холодового стресса разница между живыми и «убитыми» побегами составляла менее 0,5 °С, а затем уменьшалась практически до 0 °С (рис. 9) [СгаЬе1пус11 й а1„ 2003]. Чтобы выяснить участие АО в антиокислительной защите клеток растений при холодовом стрессе в другой

серии экспериментов было изучено влияние БГК и активатора АО - пирувата на содержание диеновых коньюгатов в побегах проростков озимой пшеницы при холодовом стрессе (-4 °С, 1 ч) и показано, что образование диеновых конъюгатов снижалось на 30% под действием пирувата, и увеличивалось на 30% под действием БГК [КоквтсИепко й а1., 2001с]. 2,5

о <1

Время охлаждения, мин

Рис. 9. Разница температур между инфильтрованными водой и «убитыми» (1), ипфнльтрованпыми КГК и «убитыми» (2), инфильтровапными БИС+КСТ«Г и «убитыми» (3) побегами этиолированных проростков озимой пшеницы при действии отрицательной температуры^ °С. М+вЛО., я=3_

о м

н а § &

а £

к ^ о «;

100 80 60 -40

20 -

* Контроль —♦— Контроль+XIII

-О- К °С I хш

ДО

обработки

10,

160 ! 140

з В

О в} 1 О, \о

0 ь

8 я юо -§ ¿.

1 | 80

15 б°

В Й 40 -

е §

Н 20 -

ВАЛ □ ЦП

Контроль 8 °С

Время после воздействия, сут. Рис. 10. Морозоустойчивость клеток коптролыюй и закаленной суспензионной культуры озимой пшеницы (а) и вклад в дыхание альтернативною (АЛ) и цитохромного (ЦП) путей транспорта электронов (б).

Обозначения: Контроль - культура клеток, выращенная при температуре 26 "С; 8 "С - культура клеток после экспозиции при 8 "С в течение 7 суток; XIII - холодовой ток (-8 °С, 6 часов). М±8Х>., п=3-10.

Альтернативный путь дыхания, связанный с функционированием АО, может быть одним из механизмов, защищающих клетки суспензионной культуры озимой пшеницы от гибели при действии повреждающих отрицательных

температур (рис. 10). Из рис. 10 видно, что отрицательная температура -8 °С (6 ч) вызывает развитие клеточной гибели в суспензионной культуре озимой пшеницы, а предварительное холодовое закаливание предотвращает этот процесс, при этом при холодовом закаливаниия активируется альтернативный путь дыхания [Любушкина и др., 2010; Lyubushkina et al, in press]. Таким образом, альтернативная оксидаза принимает участие в процессе адаптации клеток растений к низким температурам.

2.2. Альтернативные ротенон-нечувствительные НАД(Ф)Н-дегидрогеназы в митохондриях озимой пшеницы

В отличии от животных, растения способны окислять цитоплазматический НАДН, а также матриксный НАДН в обход комплекса I дыхательной цепи [M0ller, 2001; Rasmusson et al., 2004, 2008]. В митохондриях этиолированных проростков озимой пшеницы присутствуют NDB и NDA, содержание которых при холодовом закаливании значительно не изменяется (рис. 5, в). Чтобы выявить участие альтернативных НАД(Ф)Н-ДГ при адаптации к холоду, мы изучили активность «внутренней» и «внешней» ротенон-нечувствительных НАД(Ф)Н-ДГ в митохондриях озимой пшеницы и изменение их активности при закаливании. Наиболее высокой в митохондриях озимой пшеницы из контрольных проростков была активность «внешней» НАДН-ДГ, которая возрастала при действии низкой положительной температуры на проростки и сохранялась на уровне контрольных митохондрий при действии закаливающей отрицательной температуры (рис. 11). Активность «внешней» НАДФН-ДГ была ниже и снижалась при действии низких температур (рис. 11). Эти результаты подтверждаются данными полярографического анализа (представлены в диссертации) и свидетельствуют, что на наружной стороне внутренней митохондриапьной мембраны митохондрий озимой пшеницы локализованы, по меньшей мере, две различные «внешние» дегидрогеназы, одна специфичная для НАДН, другая для НАДФН, первая из них наиболее стабильна при действии низких температур.

4000 1

3500 -

'S'

« 3000 -

О Контроль □ Хол. зак. 1 этап ■ Хол. зак. 2 этапа

Рис. 11. Влияние закаливающих температур на активность альтернативных «внешних» и «внутренней» НАД(Ф)Н-дегидрогеназ в митохондриях озимой шленицы. М±8ЛЭ.,я=3.

й> ю

g Ь 2500 -

о Г

g В 2000 -

1500 -

1000 -

500 -

Внешняя Внешняя Внутренняя НАДН-ДГ НАДФН-ДГ рохнеч.

НАДН-ДГ

Что касается активности внутренней ротенон-нечувствительной НАДН-ДГ, то она была очень низкой по сравнению с окислением экзогенного НАДН и снижалась при действии закаливающих температур (рис. 11). Высокая активность «внешней» НАДН-дегидрогеназы в митохондриях из закаленных проростков озимой пшеницы, вероятно, связана с необходимостью компенсировать снижение скоростей окисления малата и сукцината, сохранить необходимый уровень НАД+ в цитоплазме, чтобы не допустить торможение работы гликолиза и цикла Кребса.

2.3. Роль свободных жирных кислот в энергетическом метаболихче митохондрий растений: разобщители окислительного фосфорилирования и субстраты окисления

Свободные (не-этерифицированные) жирные кислоты в энергетическом метаболизме животных выполняют двоякую роль: с одной стороны, СЖК вызывают рассеивание энергии, выступая в качестве разобщителей окислительного фосфорилирования, с другой - СЖК являются источником энергии (субстратом дыхания митохондрий) [Скулачев, 1989; Schulz, 2002]. В классическом понимании путей катаболизма ЖК ß-окисление у животных протекает как в митохондриях, так и пероксисомах, а у растений только в пероксисомах [Schulz, 2002]. Однако существуют доказательства, что у растений митохондрии также участвуют в деградации СЖК посредством ß-окисления [Masterson and Wood, 2000; Salon et al„ 1988; Raymond et al„ 1992; Theologis, Larties, 1980]. На основании результатов исследований о значительном увеличении содержания СЖК (как насыщенных, так и ненасыщенных) в митохондриях растений в стрессовых условиях [Vojnikov et al., 1983; Войников, 1987; Laus et al., 2011] мы предположили, что СЖК в митохондриях проростков озимых злаков могут выступать как в качестве разобщителей, так и в качестве субстратов окисления. Чистота митохондриальной фракции оценивалась с использованием фермента маркера пероксисом гидроксипируватредуктазы и была очень низкой после очистки митохондрий в градиенте перколла (не более 8-10% от активности фермента в грубой фракции). С использованием ряда насыщенных и ненасыщенных ЖК в данной работе показано, что наибольшим разобщающим действием в митохондриях озимой пшеницы обладают лауриновая (12:0), пальмитиновая (16:0), линолевая (18:2(Д912)) и линоленовая (18:3(Д9'1215)) кислоты [Грабельных и др., 2009], разобщающий эффект некоторых из них представлен на рис. 12. Ингибиторный анализ показал, что увеличение скорости поглощения кислорода, вызванное СЖК, блокируется ингибиторами цитохромного и альтернативного цианидрезистентного путей переноса электронов, не связано с активностью липоксигеназы и АТФ-чувствительного К+-зависимого канала, а обусловлено функционированием АТФ/АДФ-антипортера и UCP-подобных белков [Грабельных и др., 2009] (данные представлены в диссертации). При этом обнаружилось, что в разобщении насыщенными ЖК кислотами в основном принимает участие АТФ/АДФ-антипортер, а ненасыщенными - UCP-подобные белки. Эти переносчики принимают участие в механизмах «мягкого» разобщения [Скулачев, 1994; Скулачев и др., 2010]. Индукция карнитинового механизма и использование ингибитора карнитин О-пальмитоилтрансферазы I - этомоксира

позволили нам выявить, что СЖК могут выступать субстратами окисления для митохондрий озимой пшеницы (рис. 13).

а 6

цщ]

«г» о о о о о о ^ чп О О О In

<( (

[Лннолевая кислота], мкМ

[Жирная кислота], мкМ

Рис. 12. Влияние насыщенпых жирных кислот (а) и ненасыщенной линолевой кислоты (б) на скорость поглощения кислорода в состоянии 4 у митохондрии озимой пшеницы, окисляющих малаи и-З 4.

90 -80 -М 70 Й 60 Н S 50

I 40 "

^ 30 -

0 20

1 10

S о

^ 90 1 и 80 £ 70 Й 60 4 В 50 S 40

о~3<Ч

g 20

1 10 Й 0

□ 1

□ 2

а3

я 4

1 5 10 50 100 500 [Пальмитиновая кислота], мкМ

□ доЖК

ожк

■ ЖК+Этм

Пальмитиновая кислота

Стеариновая кислота

5 50

Й 40

1 30

^ 20

g о

□ 1 □ 2 ■ 3

5 10 50 100 [Стеариновая кислота], мкМ

Рис. 13. Использование насыщенных ЖК как субстратов дня дыхания митохондрии озимой пшеницы. M±S.D., и=3—4.

а, б: 1 - в присутствии добавок (0,5 мМ L-карнигина, ОД мМ АТФ, 10 мкМ СоА, 0,1 мМ MgCl2 и 10 мМ малага); 2 - в присутствии добавок и после внесения различных концентраций жирной кислоты; 3 — в присутствии добавок, жирной кислоты и 0,4 мМ KCN 4 — в присутствии добавок, жирной кислоты, KCN и 1 мМ БГК.

е: до ЖК - в прюугствии добавок (0,5 мМ 1^карннгана, ОД мМ АТФ, 10 мкМ СоА, 0,1 мМ MgCl2 и 10 мМ малага); ЖК - в присутствии добавок и после внесения 50 мкМ пальмитиновой и стеариновой кислот; ЖК+Этм - в щшеугствии добавок, ЖК и 37,5 мкМ этомоксира.

Нами показано, что СЖК и активируемые ими системы разобщения участвуют в адаптации к кратковременному холодовому стрессу и длительной

низкотемпературной адаптации [Грабельных и др., 2013]. С помощью антител против 11СР1/2 показано некоторое повышение содержания иСР в митохондриях озимой пшеницы после 1 ч обработки проростков температурой -8 °С, которое сопровождалось увеличением скоростей дыхания в состояниях 3 и 4 у митохондрий, выделенных из побегов этих проростков, и стимуляцией скорости нефосфорилирующего дыхания линолевой кислотой, что было связано с возрастанием активности как АТФ/АДФ антипортера, так и риСР (рис. 14). В то же время холодовой шок, вызванный обработкой проростков температурой -8 °С в течение 3 и 6 ч, которая приводила к частичной (3-х часовое воздействие) (30%) или полной (6-ти часовое воздействие) гибели проростков, вызывал повреждение окислительной и фосфорилирующей активности митохондрий, опосредованное действием АФК, которое сопровождалось снижением содержания цитохрома с в митохондриях (рис. 14).

-8°С, ч

d К tí <L> ю 100 80

й 60

Я 40

о л 20

о 0

80 70 -60 50 40 30 -20 10 0

□ ÍT

П -8 "С, 1ч ■ -8 "С, Зч

Им

олито ЛК Катр ГДФ АТФ

0 1 2 3 4 5 6 Длительность воздействия, ч

Рис. 14, Изменения в содержании мигохондриальных белков (а), скорости дыхания в состояниях 3 и 4 (6) и линолеаг-индуцированной скорости нефосфорилирующего дыхания в митохондриях озимой пшеницы (в) после действия па проростки отрицательной температуры -8 "С.

Субстрат окисления 10 мМ манит. Последовательность добавления соединений па к указана слева направо Представлены данные типичпого эксперимента. На 5указаны \ttSJJ, п 3

Обозначения: К (контроль) - до воздействия отрицательной температурой, олиго - олнгомнцнп (2.5 мет/мт белка митохондрий), ЛК - линолевая кислота (10 мкМ), Катр - карбокснатрактилозкд (2 мкМ) ГДФ, АТФ - 2 мМ ГДФ или 2 мМ АТФ. Ашитела на UCP1/2 (AS12 1850, Agrisera, Швеция), Рогтп (торнн, от Prof. Т. ЕМюн, University of Nebraska, США), Cyt С (цигохром с, 7Н8.2С12, Pharmmgen,

Таким образом, стимуляция дыхания ненасыщенными СЖК может представлять собой защитный механизм, обеспечивающий выживание растений на начальном этапе действия отрицательной температуры. При действии отрицательной температуры на незакаленные проростки показано участие СЖК в

термогенерации [СгаЬе1пусЬ е! а1., 2003] и снижении образования диеновых коньюгатов в проростках растений [КоЬзвшсИепко а а1, 2001с]. Участие СЖК в термогенерации доказано в экспериментах с прокаином (ингибитором фосфолипазы А2 в митохондриях животных) и КСЫ [Войников и др., 2001а; ОгаЬе1пусЬ е1 а1„ 2003]. Установлено, что при холодовом стрессе живые проростки озимой пшеницы поддерживали температуру на 2 °С выше, по сравнению с «убитыми» проростками, инфильтрация проростков прокаином уменьшала генерацию тепла проростками с 2 до 1,5 °С, а инфильтрация КСЫ -с 2 до 1 °С в 15 - 20 мин с начала холодовой обработки (рис. 15).

Время охлаждения, мин

Рис. 15. Разница температур между инфильтрованными водой живыми и «убитыми» (/), инфицированными прокаином живыми и «убшыми» (2), инфильтрованными КСЫ живыми и «убитыми» (3) проростками озимой пшеницы при действии отрицательной темпера1уры -А °С. М±вЛ>., и=6.

Снижение посредством инфильтрации прокаином генерации тепла проростками указывает на участие в термогенерации разобщающих систем, связанных с СЖК. На основании данных о сниженном содержании диеновых конъюгатов в проростках озимой пшеницы при холодовом стрессе после действия линолевой кислоты [КоквшсИепко е1 а1., 2001с] сделано заключение, что механизмы разобщения окислительного фосфорилирования в митохондриях растений посредством СЖК участвуют в антиокислительной защите клетки при холодовом стрессе. Одним из механизмов снижения АФК в митохондриях, в который могут быть вовлечены СЖК, в том числе у растений, является открытие неспецифической митохондриальной поры.

2.4. Функционирование высокопроницаемой митохондриальной поры в проростках злаков и участие митохондрий в развитии программируемой клеточной гибели в колеоптиле

Из литературных данных известно, что «мягкое» разобщение является эффективным механизмом системы антиоксидантной защиты клеток [Скулачев. 1995; Скулачев и др., 2010]. Если система утечки протонов и механизм «мягкого» разобщения оказываются недостаточными для снижения образования АФК в

митохондриях, то происходит открытие высокопроницаемых митохондриальных пор (РТР), рассеивание Ацн+ и увеличение скорости дыхания до максимальных величин, которые лимитируются только активностью дыхательных ферментов [Скулачев, 1994; Papa et al., 1997]. Когда концентрация кислорода падает, и скорость накопления АФК уменьшается, пора закрывается [Скулачев, 1994; Papa et al., 1997]. Таким образом, открытие и закрытие РТР, по-видимому, носит флуктуирующий характер и может быть физиологическим механизмом защиты клетки от окислительного стресса. О функционировании РТР в побегах этиолированных проростков злаков неизвестно. У 3-х суточных этиолированных проростков озимой пшеницы, используемых в данной работе, основную массу побега занимает колеоптиль (около 76%) и 24% листья. Колеоптиль и первый лист побегов проростков озимой пшеницы подлежат запрограммированной в онтогенезе клеточной гибели [Ванюшин, 2001; Vanyushin et al., 2004], поэтому возможно ожидать наличие РТР в этих органах. Чтобы изучить функционирование митохондриальной поры, мы использовали ингибитор РТР животных циклоспорин А (цикА) и индукторы открытия РТР ионы Са2+, пальмитиновую (16:0) и линолевую кислоты (18:2(Д9'12)).

60 -i

g I 50 -о о о, «О

g § 40 -I

lo" В й á §

8 о.

40 1

и о

(=3

izr с

i ч

Ы к « <-> и с с с:

А"

Митохондрии

Са Ж А ~~~Са~ ПК

CytC

Супернатант

+ ЦикА

К Са ПК к" ~Са ПК

Рис. 16. Влияние ионов Са2+, циклоспорина Л, пальмитиновой и линолевой кислотна скорость нефосфорилирующеш дыхания митохондрий озимой пшеницы (а), их набухание (б) и выход цигохрома с. из митохондрий (в).

Субстрат окисления 10 мМмалат. Для иммуноблогганга использовали мвтохондриальные белки н белки супернятанта, полученные после инкубации митохондрий с нонами Са2+, ПК и ЦикА в течение 10 мин. Обозначения: ЦикА - 1 мкМ циклоспорин А, Са2+- 1,75 мМ Са2' в составе СаС^, ПК - 50 мкМ пальмитиновая кислота, ЛК - 50 мкМ линолевая кислота.

Как оказалось, цикА в присутствии ЭДТА в среде инкубации не влияет на дыхание митохондрий из этиолированных проростков злаков (кукурузы, озимой пшеницы и озимой ржи), однако без хелаторов Са2+ в реакционной среде или в присутствии экзогенно добавленных ионов кальция, цикА снижает скорость нефосфорилирующего дыхания [Грабельных и др., 2004]. Как известно, переход митохондрий в состояние высокой проницаемости характеризуется набуханием митохондрий и потерей мембранного потенциала, при этом ведущую роль в этих процессах играют ионы Са2+ и СЖК [Arpagaus et al., 2002; Fortes et al., 2002; Virolainen et al., 2002]. В связи с этим, были проведены эксперименты по изучению влияния ионов Са2+, пальмитиновой и линолевой кислот на дыхание и набухание митохондрий озимой пшеницы. Ионы Са + и пальмитиновая кислота стимулировали нефосфорилирующее дыхание и индуцировали высокоамплитудное набухание митохондрий озимой пшеницы, которое почти полностью ингибировалось предварительной инкубацией митохондрий с цикА (рис. 16, а, б) [Грабельных и др., 2007; Павловская и др., 2007, 2010]. Индукция дыхания и набухания митохондрий озимой пшеницы происходила и в присутствии полиненасыщенной линолевой кислоты, однако цикА в меньшей степени влиял на процесс дыхания и набухания митохондрий (рис. 16, а, 6) [Грабельных и др., 2007; Павловская и др., 2010]. Разобщение окислительного фосфорилирования и набухание митохондрий в присутствии ионов Саи пальмитиновой кислоты сопровождались выходом цитохрома с из митохондрий в цитоплазму и эти события предотвращались предварительной инкубацией митохондрий с цикА (рис. 16, в). Влияние цикА на функционирование РТР описывается как «десенсибилизация» [Bernardi, 2013] митохондриальной РТР к ионам Са2+ и Ф„, т.е. в присутствии данного ингибитора митохондрии становятся резистентными к индукторам РТР. Полученные нами данные указывают на функционирование в митохондриях проростков озимой пшеницы цикА-чувствительной, Са2+/пальмитат-зависимой митохондриальной поры. Поскольку колеоптиль занимает основную часть побега у изучаемых нами проростков, то представлялось важным выяснить участие митохондрий в процессе естественного старения колеоптилей озимой пшеницы. Полученные результаты показали, что снижение жизнеспособности клеток колеоптилей этиолированных проростков озимой пшеницы сопровождается увеличением содержания АФК в митохондриях, снижением степени сопряжения процессов окисления и фосфорилирования (снижение коэффициента ДК), снижением интактности митохондрий и выходом цитохрома с из митохондрий в цитоплазму (рис. 17) [Грабельных и др., 2009; Корсукова и др., 2013а]. Частичный выход цитохрома с указывает, что часть митохондрий при развитии ПКГ в колеоптилях озимой пшеницы оставалась неповрежденной, что позволяло осуществлять синтез АТФ и обеспечивать энергией процесс клеточной гибели (рис. 17, г). Окислительный стресс, вызываемый обработкой проростков 10 мМ Н202 (в течение 4 ч), ускорял развитие клеточной гибели в колеотиле, а холодовое закаливание задерживало этот процесс (рис. 18) [Грабельных и др., 2009; Корсукова и др., 2013а].

8 3

£9 й П 2

А,

ю Й

Т I

2250 -, в? 2000 а I 1750 1500 @ £ 1250 1000 750

я „

и "~>

500

250 0

¿1

120 100 80 /о 60

20 0

3 6 8 10

Возраст проростков, сутки

3 6 8 10

Возраст проростков, сутки

3 6 8 10

Возраст проростков, сутки

Сутки роста 6 8

Общ 4ИМШ щшмми Мит Цит

Рис. 17. Изменение жизнеспособности клеток колеотнлей озимой пшеницы с возрастом (о) и параметры функциональной активности

изолированных из них митохондрий (6~г). ШЯ !) а — жизнеспособность клеток колеоптилей по Эвансу (и=18); б - содержание АФК в митохондриях (л=8-10); в - коэффициент ДК митохондрий из колеоптилей 3-х суточных проростков 633±1,13 принят за 100% (и=3-7); г - вестерп-блотпшг общего (Общ), митохопдриальпого (Мит) и циготгазматтиеского (Цит) белков из клеток колеадггален этиолированных щюростков озимой пшеницы разного возраста с антителами против цнтохрома с, представлен типичный иммуноблотт,и=3.

Окислительный стресс, вызванный обработкой проростков перекисью водорода, приводил к более значительному снижению коэффициента ДК в изолированных из колеоптилей митохондриях по сравнению с митохондриями контрольных проростков (рис. 18, б). Снижение коэффициента ДК в митохондриях из колеоптилей проростков сопровождалось частичным высвобождением цитохрома с из митохондрий в цитоплазму сразу же после обработки проростков перекисью водорода (рис. 18, д). Способность холодового закаливания предотвращать развитие клеточной гибели в колеоптилях кукурузы, вызванной обработкой проростков перекисью водорода, была обусловлена снижением содержания АФК и отсутствием фрагментации тотальной ДНК [Корсукова и др., 2013б]. Полученные нами результаты показывают, что генерация АФК регулирует функционирование митохондриальной РТР в клетках растений и запуск программы клеточной гибели.

Закаливание проростков озимой пшеницы и мягкий холодовой стресс приводили к отсутствию чувствительности набухания изолированных из них митохондрий к цикА (рис. 19). Ингибирование набухания митохондрий из стрессированных и закаленных проростков озимой пшеницы к цикА проявлялось только в присутствии пальмитиновой кислоты (рис. 19) [Павловская и др., 2007, 2010], что могло быть связано с временной деполяризацией внутренней митохондриальной мембраны из-за кратковременного открытия РТР [У1апе11о е! а1., 2012], вызванного повышением концентрации пальмитиновой кислоты.

" иитактпость коэффициент ДК

я g

«t

8 &

H O

üj x

«G e<

к o

& a й ca

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

¿1.

8 -7 -

Ё 5 -I

■а ч

-в" i 0>

¡s 2 1 -

—С1— котроль(К)

-О-К+ЮмМ Н202.4Ч

контроль

Возраст проростхов, сутки

Возраст проростков, сутки

¿» Мит

Су! С 1 2

Су! С <■*

■

Цдал д I 2

0 3

Сутки отрастания проростков

Рис. 18. Влияние обработки перекисью водорода (10 мМ, 4 ч) на жизнеспособность клеток колеотилей этиолированных иезакалепных (а, в) и закаленных (г) проростов озимой пшеницы, коэффициент ДК в изолированных из контрольных проростков митохондриях (б) и распределение цитохрома с в мигохондриалыюй и цигоплазмагаческои фракциях белков колеопхилей (д). М±Б.О.

а-п=6-18;в- изменение коэффициент ДК по Чапеу и Вильямсу (л=3-4); в, г - (п=8). Обозначения: ^ - жшиестюсобностьклеток ко леошилен без обработки перекисью водорода, 2 - жизнеспособность клеток ко леоптилен после обработки 10 мМ Н202в течение 4 ч.

На этиолированных проростках пшеницы было установлено, что цикА значительно ингибирует рост проростков во время развития, при этом он снижает продукцию супероксида как в первом листе, так и в колеоптиле и ингибирует фрагментацию ДНК в апикальных частях первого листа 6-ти суточных проростков рИкШе, Бауюка, 2009]. Эти данные подтверждают, что цикА может предотвращать развитие клеточной гибели, блокируя открытие РТР и выход цитохрома с из митохондрий.

Оч й>

С О

о,

60 л 50 40 -30 -20 10 0

35 1

Рис. 19. Влияние циклоспорина А, ионов Са2+ и пальмитиновой кислоты (16:0) па набухание митохондрии из холодострессированных (а) и закаленных (б) щюроспюв озимой пшеницы.

Обозначения: как на рис. 16. К - митохондрии из контрольных проростков, ХС - митохондрии из проростков, подвигнутых холодовому стрессу (-4 "С, 1 час), ХЗ митохондрии из щюроспсов подвергнутых холодовому закаливанию (А "С, 7 (уток). MIS.D. и=3-8_

На других растительных объектах также показан защитный эффект цикА, который заключался в снижении продукции Н202 клетками, предотвращении гибели клеток, фрагментации ДНК и выхода цитохрома с из митохондрий, вызываемых фузикокцином [Contran et al., 2007], снижении продукции HiOi и предотвращении клеточной гибели, вызванных окислительным стрессом [Tiwari et al., 2002], защите от потери митохондриального трансмембранного потенциала, снижении набухания митохондрий и гибели, вызванной метилжасмонатом [Zhang' Xing, 2008]. Выявленные нами эффекты циклоспорина А (снижение скорости дыхания, предотвращение набухания митохондрий и выхода из них цитохрома с под действием Са~+ и пальмитиновой кислоты) позволяют предполагать, что функционирование РТР в митохондриях озимой пшеницы может быть важным событием при развитии ПКГ в результате естественного старения колеоптилей или первого листа этиолированных проростков озимой пшеницы.

2.5. Механизм разобщающего действия молекулярной массой 310 «Да - БХШ 310

Еще одной системой, способной вызывать снижение степени сопряжения окислительного фосфорилирования в митохондриях, является цитоплазматический белок холодового шока с мол. массой 310 кДа обозначенный как БХШ 310. БХШ 310 был выделен из проростков озимой ржи и было установлено, что в нативном состоянии белок имеет мол. массу 310 кДа и содержит два типа субъединиц с мол. массами 56 и 66 кДа [Колесниченко и др.. 1996]. БХШ 310 конститутивно синтезируется в проростках злаков, а его

белкового комплекса

количественное содержание коррелирует с уровнем морозоустойчивости [Колесниченко и др., 1996; Мишарин и др., 1997]. Было обнаружено, что БХШ 310 вызывает частичное разобщение окислительного фосфорилирования в митохондриях озимой пшеницы [Побежимова и др., 1996; Уо1шкоу е1 а!., 1998], однако механизм его действия оставался неизвестным. Одна из задач нашего исследования состояла в том, чтобы выяснить, происходит ли вызываемое БХШ 310 разобщение по одному из уже известных механизмов или отличается от них, и, в таком случае, установить механизм разобщающего действия БХШ 310.

В ходе изучения выяснилось, что в цитоплазме озимой ржи существует две формы БХШ 310 - «конститутивно синтезируемая», связанная с нуклеиновой кислотой, и «стрессовая», не связанная с нуклеиновой кислотой [Колесниченко и др., 2002- Колесниченко и др., 2005]. Стрессовая форма белка обладает более сильной разобщающей активностью, по сравнению с конститутивно-синтезируемой [РоЬегЫшоуа й а1„ 2001], а ее разобщающий эффект выше при использовании малата в качестве субстрата [СгаЬе1пусЬ й а1., 2001]. В наших экспериментах при окислении малата митохондриями озимой пшеницы в отсутствие БХШ 310 значение отношения АДФ/О было близко к теоретическому и составляло 2,82±0,07, но через 90 мин инкубации с БХШ 310 оно снижалось до 2,04±0,10 (представлено в диссертации). Используя стрессовую форму БХШ 310 и изучив возможность его функционирования посредством различных механизмов, мы установили, что разобщающий эффект БХШ 310 отличается от существующих механизмов разобщения [Войников и др., 2006; Ко^шсИепко ег а1., 2002, 2005].

Для того, чтобы определить взаимодействие разобщающего белка БХШ310

с комплексами дыхательной цепи митохондрий, необходимо было исследовать

влияние ингибиторов отдельных комплексов дыхательной цепи на

функционирование БХШ 310.

к Таблица 1

Влияние ингибиторов комплекса III ЭТЦ и альтернативной оксидазы на скорость поглощения

кислорода в состоянии 4 у митохондрий озимой пшеницы, изолированных из побегов

контрольных проростков и проростков, подвергнутых холодовому стрессу [Колесниченко и др.,

2004]

Нмоль О? / (мин мг белка)

Вариант опыта Контроль Холодовой стресс

10 мМ малат + 10 мМ глутамат

32.05±3.15 46.09±2.87

Уд+АнтА + БГК 10.11±2.45 13.88+1.42

8 мМ сукцинат + 5 мМ глутамат

60.55+1.78 63.20±2.87

Уд + АнтА + БГК 3.87±2.77 4.54+1.42

1 мМ НАДН

У4 96.39±5.59 83.60+6.11

Уд + АнтА + БГК 2.24±0.93 9.08±2.99

Из данных табл. 1 видно, что добавление антимицина А и БГК к митохондриям озимой пшеницы в состоянии 4, окисляющим как сукцинат, так и НАДН, вызывало почти полное ингибирование поглощения ими кислорода. В то

же время при окислении ими малата, являющегося субстратом комплекса 1 дыхательной цепи, как в митохондриях, выделенных из контрольных проростков, так и в митохондриях, выделенных из стрессированных проростков, после добавления ингибиторов сохранялось около 30% от дыхания в состоянии 4. Последующее добавление КСЫ полностью блокировало дыхание митохондрий независимо от субстрата окисления. Поскольку в белковом спектре двудольных отсутствуют субъединицы БХШ 310, то мы провели ингибиторный анализ в митохондриях гороха, инкубируя их с БХШ 310 (рис. 20, а).

□ Контроль

□ + БХШ 310

£ 45 -

§ 40 -&

8 35

I 30 -

I 25

I 20

I 15

g 10 m

S 5 0

AhiA БПС KCN/анга-310

0 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 [ЕХШ 310],мг/мл

Рис. 20. Влияние ингибиторов дыхательной цени на скорость поглощения кислорода в состоянии 4 в митохондриях гороха, инкубируемых в отсутствие и присутствии ЕХШ 310 (а) и степень восстановления окисленною цигохрома с в зависимости от концентрации ЕХШ 310 при pH 6.0 (6).

а - Лита - 20 мжМ ангашщин а; БПС - 1 мМ НТК; KCN/анги-310 - 0,4 мМ KCN или 1 ыг/мл антисыворотки против БХШ 310. Последовательность добавления ингибиторов слева направо. Субстрат окисления: 10 мМ малат + 10 мМ гаутамат. Копцептрация БХШ 310 равна 0,5 мт/мг белка митохондрий. NfctSJD., я=6-12.

6- концентрация цитохромас составляла 30 мкМ. Длина волны 550 им. M±SD.,n=3.

Эти факты указывают на то, что при функционировании комплекса 1 дыхательной цепи в митохондриях озимой пшеницы или в митохондриях гороха, инкубируемых с экзогенным БХШ 310, функционирует еще один путь переноса электронов, не связанный ни с активацией АО, ни с функционированием ЦП через комплекс III. Поскольку, как показано выше, наиболее значительное разобщающее действие БХШ 310 проявляется при окислении малата [Grabelnych et al., 20016; Колесниченко и др., 2002], мы изучили влияние ингибиторов комплекса I, действие которых направлено на разные участки цепи переноса электронов в комплексе I: ротенон (действует на железосерные центры комплекса I дыхательной цепи) и реин (конкурентный ингибитор НАДН-ДГ, действует на участок дыхательной цепи между субстратом и ФМН), на разобщающий эффект

БХШ 310. Оказалось, что в присутствии ротенона добавление БХШ 310 вызывало некоторое увеличение скорости поглощения кислорода, в то время как в присутствии реина последующее добавление БХШ 310 не приводило к изменению скорости нефосфорилирующего дыхания, что позволило предположить, что в присутствии БХШ 310 электроны переносятся от комплекса I (с участка транспорта электронов между ФМН и железосерными центрами) на стрессовый белок БХШ 310, который ассоциирован с наружной митохондриальной мембраной (показано в диссертации). Основываясь на результатах ингибиторного анализа, можно предположить, что не ингибируемая антимицином А и БГК скорость поглощения кислорода в митохондриях озимой пшеницы при окислении малата зависит не только от транспорта электронов через комплекс I ЭТЦ, но и от транспорта электронов через комплекс IV, поскольку транспорт электронов полностью блокировался KCN. Поскольку эти результаты получены в присутствии в среде инкубации митохондрий антимицина А, то нами было выдвинуто предположение о существовании альтернативного пути переноса электронов между комплексами I и IV. Если это так, то БХШ 310 должен восстанавливать цитохром с. Действительно обнаружилось, что стрессовая форма БХШ 310 способна восстанавливать экзогенно добавленный окисленный цитохром с, способность данного белка восстанавливать окисленный цитохром с зависела от значения рН реакционной среды, при этом БХШ 310 был способен восстанавливать окисленный цитохром с в диапазоне значений рН 3,0-7,5 с максимумом при рН 6,0 [Колесниченко и др., 2004; Kolesnichenko et al„ 2005]. При увеличении концентрации БХШ 310 его способность восстанавливать цитохром с возрастает (рис. 20, б).

Эксперименты по восстановлению цитохрома с стрессовым белком БХШ 310 in vitro были подтверждены in organelle [Колесниченко и др., 2004; Kolesnichenko et al„ 2005]. Добавление цитохрома с к митохондриям, изолированным из побегов озимой пшеницы и гороха не вызывало значительных изменений в скорости поглощения кислорода, что свидетельствует о целостности наружной мембраны митохондрий (табл. 2).

Таблица 2

Влияние БХШ 310 и цитохрома с на скорость поглощения кислорода в состоянии 4 митохондриями озимой пшеницы и гороха [Колесниченко и др., 2004]

Вариант опыта Поглощение кислорода, нмоль О2 / (мин • мг белка)

v4 Vuht с Vsximio УБХШЗЮ/цигс УантиЗЮ

Озимая пшеница 32.41+5.18 30.82±3.02 41.48 ±0.16 50.08±0.91 32.41±0.22

Горох 31.84±2.17 30.55±2.17 42.22±0.04 46.39±2.42 31.84+2.42

Примечание. Субстрат окисления: 10 мМ малат + 10 мМ глутамат. M±S.D., л=3. БХШ 310 (0,5 мг/мг белка митохондрий); цитохрома с (30 мкМ); антисыворотки против БХШ 310 (1 мг/мл).

Добавление БХШ 310 вызывало увеличение скорости нефосфорилирующего дыхания в митохондриях этих растений (на 28% у пшеницы и на 33% у гороха), а последующее добавление цитохрома с приводило к дальнейшему усилению поглощения кислорода митохондриями - на 21% у

пшеницы и на 10% у гороха (табл. 2). Добавление к митохондриям антисыворотки против БХШ 310 снижало скорость поглощения кислорода митохондриями озимой пшеницы и гороха до скорости дыхания в состоянии 4 до добавления белка (табл. 2). Полученные данные можно интерпретировать как трансмембранную утечку электронов с комплекса I дыхательной цепи через стрессовый белок БХШ 310 на экзогенно добавленный цитохром с. Функциями данного белка являются, так же как и в случае других энергорассеивающих систем, термогенерация и участие в антиокислительной защите клетки [Колесниченко и др., 2004].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании исследования механизмов, снижающих степень сопряжения окислительного фосфорилирования в митохондриях, нами показано, что в митохондриях злаков разобщение окислительного фосфорилирования может происходить, по меньшей мере, с участием семи систем: антимицин А- и цианидрезистентной оксидазы, внешних и внутренних ротенон-нечувствительных НАД(Ф)Н-дегидрогеназ, СЖК, UCP-подобных белков, АТФ/АДФ-антипортера,; белкового комплекса с мол. массой 310 кДа, а также неспецифической митохондриальной поры, характеристики которых представлены в обзорах [Колесниченко и др., 2004; Грабельных, 2005; Грабельных и др., 2006]. Функционирование энергорассеивающих систем в митохондриях растений играет важную роль как при кратковременном холодовом воздействии, так и при длительной адаптации к холоду. Нами показано, что сохранение функциональной активности митохондрий при адаптации озимых злаков к низкой температуре связано с изменениями жирнокислотного состава, синтезом стрессовых белков дегидринов, сохранением (в побегах) или активацией (в культуре клеток) альтернативного пути дыхания, связанного с функционированием альтернативной оксидазы, а также высокой активностью «внешней» НАДН-дегидрогеназы.

Как известно, мембранные системы клетки представляют собой мишени первичного стрессового воздействия и первую линию защиты от них [Чиркова, 2002], от состава и соотношения липидов мембран, их жирнокислотного состава зависит вязкость мембран, определяющая структуру и функции мембранных белков и, таким образом, активность мембранно-связанных процессов [Тарчевский, 2001; Чиркова, 2002; Верещагин, 2007; Murata, Los, 1997; Theocharis et а!., 2012]. В суспензионной культуре клеток озимой пшеницы при закаливании к холоду в 2 раза возрастало содержание а-линоленовой кислоты [Любушкина и др., 2013]. В митохондриях, изолированных из закаленных проростков озимой пшеницы, подвергнутых холодовому шоку, уровень а-линоленовой кислоты был выше, чем в митохондриях контрольных проростков и контрольных проростков, подвергнутых действию отрицательной температуры [Грабельных и др., 2011в]. Полученные нами данные согласуются с ведущей ролью а-линоленовой кислоты в процессе криоадаптации растений [Верещагин, 2007] и указывают, что содержание а-линоленовой кислоты является маркером устойчивости

митохондриальных мембран к действию отрицательной температуры. С использованием ингибиторов транспорта электронов нами впервые показано, что митохондрии, изолированные из побегов проростков озимой пшеницы после холодового закаливания, меньше генерируют АФК в присутствии ингибитора комплекса III дыхательной цепи - антимицина А (рис. 8) [Грабельных и др., 2011а] Возможно, это связано с антиоксидантной способностью АО, сопряженной с накоплением транскриптов AOXlc, увеличением содержания белка АО в митохондриях и сохранением способности АО к транспорту электронов при действии закаливающих температур на растения. Участие AOXlc или других генов семейства АОХ в процессе низкотемпературной адаптации показано на арабидопсисе и томатах [Armstrong et al., 2008; Zhu et al., 2012]. Нами показана высокая способность АО к транспорту электронов при окислении малата в митохондриях из побегов контрольных и прошедших первый этап закаливания проростков озимой пшеницы. У растений малат, возможно, является основным субстратом для митохондрий, а в его окислении участвуют два фермента: малатдегидрогеназа и НЛД'-зависимый малик-энзим (МЭ) [Lambers et al., 2005J. Если в превращениях малата участвует малатдегидрогеназа, то конечными продуктами реакции являются оксалоацетат и НАДН, а если задействован МЭ, то - пируват, НАДН и С02. При этом при окислении малата достигается максимальная активность АО, по-видимому, связанная с активацией в этих условиях НАД+-МЭ. На первом этапе холодового закаливания на фоне общего падения скоростей дыхания при окислении малата и сукцината митохондриями ЦРД было высоким, и в этот период одновременно с индукцией экспрессии гена AOXlc при закаливании наблюдали усиление экспрессии генов АТР6 и KAD7, продукты которых играют ведущую роль при функционировании АТФ-синтазы rCapaldi Aggeler, 2002; Zhang et al., 2006, 2008; Moghadam et al., 2012] и комплекса I [Pineau et al., 2005], соответственно. Сохранение энергетической активности митохондрий при закаливании этиолированных проростков озимои пшеницы видится в одновременной с индукцией экспрессии АТР6 и AOXlc индукции гена NAD7, кодирующего субъединицу NAD7 комплекса I Э1Ц. Функционирование АО при окислении малата митохондриями этиолированных проростков пшеницы позволяет поддерживать Ду на внутренней митохондриальной мембране за счет пункта сопряжения в комплексе I ЭТЦ ГАбдрахимова и др., 2011; Pastore et al., 2001]. Экспрессия генов NDA2 и NDB2 выше в гетеротрофных тканях [Michalecka et al., 2003]. В работе А.Ф. Армстронга с соавт. [2008] выявлена ко-экспрессия NDB2 и UCP1 при длительном действии на растения арабидопсиса низкой температуры и увеличение в этих условиях альтернативного пути дыхания, что свидетельствует о возможной защитной роли «внешней» НАДН-дегидрогеназы при закаливании растении к холоду. В прорастающих семенах гороха при использовании экзогенного НАДН в качестве субстрата показана высокая окислительная и фосфорилирующая активность митохондрий, которая коррелировала с низким содержанием продуктов ПОЛ и меньшим содержанием ненасыщенных жирных кислот в липидах митохондрии [Stupnikova et al., 2006].

В экспериментах по влиянию эндогенных СЖК на активность АО нами установлено, что элиминация СЖК с помощью БСА способствует повышению активности АО. Эти данные согласуются с данными F.E. Sluse с соавт. [1998] и A.M. Almeida с соавт. [1999], которые выявили механизм регуляции активности АО и pUCPs с помощью СЖК. Однако нами впервые показано, что этот механизм наиболее эффективно реализуется при окислении митохондриями маната. При окислении малата СЖК оказывают более значительное разобщающее действие на митохондрии озимой пшеницы, а в больших концентрациях они, возможно, вызывают инактивацию комплекса I. Впервые показано, что вклад UCP и АТФ/АДФ-антипортера в разобщение окислительного фосфорилирования, вызванного насыщенными и ненасыщенными жирными кислотами, в митохондриях растений различается: в индуцированном ненасыщенными СЖК разобщении в большей степени участвуют pUCPs, а насыщенными - АТФ/АДФ-антипортер [Грабельных и др., 2009]. Важная роль данного процесса в защитно-приспособительных реакциях растений заключается в их участии в термогенезе, снижении генерации АФК путем «мягкого» разобщения и за счет открытия РТР.

Программируемая клеточная гибель в колеоптиле злаков, как нами установлено, осуществляется с участием митохондрий, при этом на начальном этапе развития ПКГ происходит снижение интактности внешней мембраны митохондрий и выход цитохрома с в цитоплазму, сопровождающийся значительным снижением степени контроля сопряжения процессов окисления и фосфорилирования [Корсукова и др., 2013а]. Выход цитохрома с из митохондрий сопровождает развитие клеточной гибели в суспензионной культуре озимой пшеницы, вызванной действием отрицательной температуры -8 °С (б ч) [Lyubushkina et al., in press]. При этом, открытие классической митохондриальной поры, одним из функциональных компонентов которой, как предполагается, является АТФ/АДФ-антипортер, возможно, вносит вклад в развитие ПКГ. Эти данные основываются на установленном факте функционирования в митохондриях этиолированных проростков озимой пшеницы Са2+/пальмитат-зависимой, циклоспорин А-чувствительной митохондриальной поры [Павловская и др., 2007, 2010]. Согласно современным представлениям большую роль в индукции РТР играет липидное окружение мембран. Предполагается, что пероксидация карднолипина цитохромом с начинает цепь событий, приводящих к выходу цитохрома с из митохондрий и запуску апоптоза у животных [Владимиров и др., 2006; Kagan et al., 2005; Huttemann et al., 2011]. Повышение содержания ненасыщенных жирных кислот в митохондриях озимой пшеницы в процессе закаливания к холоду и активация в этих условиях энергорассеивающих систем могут объяснять снижение гибели клеток колеоптиля озимой пшеницы при окислительном стрессе [Корсукова и др., 2013а]. Влияние циклоспорина А описывается как «десенсибилизация» [Bernardi, 2013] митохондриальной РТР к ионам Са + и Ф„, т.е. в присутствии данного ингибитора митохондрии становятся резистентными к индукторам РТР. В нашей работе ионы Са2+ проявляли разобщающий эффект, а цикА частично или полностью ингибировал вызванную

ионами Са2+ стимуляцию скорости нефосфорилирующсго дыхания в митохондриях озимой пшеницы, озимой ржи и кукурузы.

Независимо от действия СЖК и связанных с ними механизмов функционирует белковый комплекс БХШ 310, который позволяет обходить комплекс III дыхательной цепи митохондрий злаков, снижать эффективность окислительного фосфорилирования и генерацию АФК митохондриями [Колесниченко и др., 2004; Ко^тсЬепко е! а!., 2005] в начальный период охлаждения.

Присутствие многочисленных энергорассеивающих систем в митохондриях проростков озимых злаков, возможно, связано с особенностями жизненного цикла этих культур. На начальном этапе закаливания, когда затормаживаются ростовые процессы, снижаются энергетические затраты на рост и остается дыхание, направленное на поддержание структуры клеток и на обеспечение энергией биосинтезов при закаливании. При этом на фоне достаточной обеспеченности субстратом могут функционировать энергорассеивающие системы, чтобы не допустить избыточного образования АФК в митохондриях. В другом случае, при кратковременных заморозках повышение интенсивности дыхания, разобщение окисления и фосфорилирования в митохондриях и связанная с этим процессом термогенерация позволяют растениям за счет локального повышения температуры не допустить образования льда и повреждения клеток. Переход митохондрий в низкоэнергетическое состояние у морозоустойчивых озимых злаков был установлен почти 30 лет назад [Войников, 1987; Усушкот с1 а1., 1984], и, как предполагалось, он связан с разобщающим действием СЖК, увеличение которых происходит в митохондриях при «изкотемпературном стрессе, В настоящей работе впервые установлено, что свободные жирные кислоты при кратковременном холодовом стрессе могут активировать разобщающие белки, подобные иСР животных, а также АТФ/АДФ-антипортер и вызывать переход митохондрий в низкоэнергетическое состояние. По-видимому, эти факторы обеспечивают выживание проростков. Комплексный ответ на действие низкой температуры возможен при непосредственном взаимодействии энергорассеивающих систем митохондрий с сигнальными системами клеток растений, поставляющими сигнальные молекулы для участия в метаболических реакциях.

В заключение целесообразно представить обобщение полученных результатов в рамках основных направлений собственных исследований и с привлечением данных, имеющихся в научной литературе. Схема участия энергорассеивающих систем в адаптации растений к низким температурам осуществляется по двум сценариям: первый включает последовательность реакций на кратковременное воздействие отрицательными температурами и будет зависеть от интенсивности и продолжительности действия низкой температуры, второй на длительное воздействие температурами из области закаливающих. При ответе на кратковременное воздействие реализуется цепь событий: повышение уровня кальция в цитоплазме - повышение уровня кальция/повышение уровня АФК в митохондриях - активация фосфолипазы А2 - накопление свободных

жирных кислот: 1) при таком содержании ионов кальция/АФК/СЖК- активация митохондриальных . энергорассеивающих систем - «мягкое» разобщение окислительного фосфорилирования - термогенез/снижение образования АФК -выживание клеток; 2) при высоком содержании ионов кальция/АФК/СЖК -активация АТФ/АДФ-антипортера - открытие высокопроницаемой поры -набухание митохондрий - выход цитохрома с — нарушение окислительной и фосфорилирующей активности митохондрий - гибель клеток. При ответе на низкие закаливающие температуры последовательность реакций представляется следующей: повышение уровня кальция в цитоплазме - повышение уровня кальция/повышение уровня АФК в митохондриях - индукция альтернативной оксидазы/«внешней» НАДН-дегидрогеназы - снижение образования АФК/поддержание синтеза АТФ - успешное закаливание - выживание клеток при последующем холодовом шоке.

ВЫВОДЫ

1. Митохондрии являются основным источником генерации АФК в тканях этиолированных проростков озимых злаков при низкотемпературном стрессе. Уровень АФК определяет жирнокислотный состав митохондрий, интактность их мембран, содержание в митохондриях продуктов ПОЛ, окислительную и фосфорилирующую активность органелл, а весь комплекс этих параметров влияет на морозоустойчивость растений.

2. В начальный период действия закаливающей низкой положительной температуры происходит накопление транскриптов AOXlc, NAD7 и АТР6 в тканях этиолированных проростков озимой пшеницы и увеличение содержания в митохондриях альтернативной оксидазы и UCP1/2. Индукция синтеза альтернативной оксидазы и сохранение ее способности к транспорту электронов по дыхательной цепи в начальный период действия закаливающей температуры позволяет поддерживать высокий уровень синтеза АТФ при окислении митохондриями малата, а также снижать генерацию АФК митохондриями при последующем холодовом шоке.

3. Лауриновая (12:0), пальмитиновая (16:0), линолевая (18:2(Д9,12)) и линоленовая (18:3(Д9,12,15)) кислоты в микромолярных концентрациях обладают сильным разобщающим действием в митохондриях озимой пшеницы. Разобщающий эффект насыщенных жирных кислот связан, главным образом, с функционированием АТФ/АДФ-антипортера, а ненасыщенных - с активностью UCP-подобных белков. Предполагается, что функционирование АТФ/АДФ-антипортера и UCP-подобных белков происходит при низком содержании свободных жирных кислот в митохондриях, в то время как при их высоком содержании свободные жирные кислоты сами вызывают эффективное разобщение окислительного фосфорилирования в митохондриях, а также служат субстратом окисления для этих органелл.

4. Активация АТФ/АДФ-антипортера и UCP-подобных белков в митохондриях происходит при кратковременном холодовом стрессе, что отражает адаптивную реакцию озимых злаков на действие неповреждающей отрицательной температуры. В то же время холодовой шок, сопровождающийся частичной или

полной гибелью проростков, вызывает повреждение процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях, опосредованное накоплением АФК и снижением содержания цитохрома с в митохондриях.

5. Митохондрии из побегов этиолированных проростков озимой пшеницы с наибольшей скоростью окисляют экзогенный НАДН, скорость окисления которого сохраняется на высоком уровне и при действии низких закаливающих температур, что компенсирует снижение скоростей окисления маната и сукцината.

6. Митохондрии вовлечены в процесс программируемой клеточной гибели в побегах этиолированных проростков злаков в естественных и индуцируемых внешними стимулами условиях. Для митохондрий злаков характерна регулируемая модель открытия неспецифической поры, зависимой от ионов Са и свободных жирных кислот и чувствительной к циклоспорину А. Холодовое закаливание проростков предотвращает окислительный стресс и развитие гибели клеток колеоптиля злаков. Функциональным компонентом поры, вероятно, является АТФ/АДФ-антипортер, активация которого вызывается пальмитиновой кислотой.

7. Механизм разобщающего действия белкового комплекса с мол. массой 310 кДа (БХШ 310) в митохондриях растений заключается в шунтировании переноса электронов по дыхательной цепи, таким образом, что электроны в обход убихинона и комплекса III через комплекс I поступают на ассоциированный с наружной мембраной митохондрий БХШ 310 и далее на цитохром с и комплекс IV. Такой бм-трянс-мембранный перенос электронов активируется в митохондриях злаков при кратковременном холодовом стрессе.

8. Полученные результаты и данные литературы указывают, что в механизмах регуляции энергорассеивающих систем в митохондриях растений принимают участие свободные жирные кислоты, ионы кальция и АФК, увеличение содержания которых сопряжено с изменением функциональной

активности митохондрий.

9. Совокупность полученных экспериментальных данных позволяет заключить, что наличие у растений систем, снижающих энергетическую эффективность дыхания митохондрий, цианидрезистентной оксидазы, ротенон-нечувствительных НАД(Ф)Н-дегидрогеназ, свободных жирных кислот, иСР-подобных белков, АТФ/АДФ-антипортера, белкового комплекса с мол. массой 310 кДа и Са2+/пальмитат-зависимой циклоспорин А-чувствительной неспецифической митохондриальной поры, и координация их функционирования посредством сигнальных молекул представляют собой важнейший компонент адаптивного механизма, обеспечивающего выживаемость растений при действии неблагоприятных низких температур. В тканях растений с гетеротрофным метаболизмом термогенез и антиокислительная защита клетки могут быть функциями энергорассеивающих систем митохондрий при действии низких температур.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Монографии и патенты

1. Стрессовый белок БХШ 310: характеристика и функции в растительной клетке / А.В. Колесниченко, О.И. Грабельных, Т.П. Побежимова, В.В. Колесниченко, В.К. Войников. -Иркутск: Издательство института географии СО РАН, 2004. - 225 с.

2. Побежимова Т.П. Методы изучения митохондрий растений. Полярография и электрофорез / Т.П. Побежимова, А.В. Колесниченко, О.И. Грабельных; отв. ред. Р.К. Саляев. - М.: ООО «НПК Промэкобезопасность», 2004. - 98 с.

3. Пат. 2257907 Российская Федерация, МПК7 А 61 К 35/78, 9/64, А 61 Р 39/06. Способ получения биологически активного вещества для регуляции энергетического баланса / В.К. Войников; А.В. Колесниченко, Т.П. Побежимова, О.И. Грабельных, В.В. Колесниченко; Патентообладатель Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук. 2003129256/15; заявл. 30.09.03; опубл 10 08 05 Бюл №22.

Статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ

4. Стрессовый разобщающий белок БХШ 310 индуцирует перекисное окисление липвдов в митохондриях при гипотермии / В.В. Зыкова, О.И. Грабельных, С.В. Владимирова, Н.А. Королева, А.В. Колесниченко, В.К. Войников // Доклады РАН. -2000. -Т.372, №4. -С.562-564.

5. Plant stress-related uncoupling protein CSP 310 caused lipid peroxidation in winter wheat mitochondria under chilling stress / V.V. Zykova, O.l. Grabelnych, A.I. Antipina, N.A. Koroleva, S.V. Vladimirova, A.V. Kolesnichenko, T.P. Pobezhimova, V.K. Voinikov U J. Thermal Biology - 2000 -V.25, N5. - P.323-327.

6. The association of plant stress uncoupling protein CSP 310 with winter wheat mitochondria during hypothermia / A.V. Kolesnichenko, O.I. Grabelnych, T.P. Pobezhimova, V.K. Voinikov // J Plant Physiology. - 2000. - V.156, N5-6. - P.805-807.

7. Локализация белков, иммунохимически родственных субъединицам стрессового белка 310 кД, в митохондриях озимой пшеницы / Т.П. Побежимова, О.И. Грабельных, А.В. Колесниченко, О.Н. Сумина, В.К. Войников // Физиология растений. - 2001. - Т 48 №2 - С 238244.

8. Белок холодового шока 310 кД разобщает окислительное фосфорилирование в растительных митохондриях / В.К. Войников, О.И. Грабельных, А.В. Колесниченко, Т.П. Побежимова // Физиология растений. -2001. - Т.48, №1. - С. 106-112.

9. Влияние различных термогенных систем митохондрий на температуру проростков озимой пшеницы во время холодового шока / В.К. Войников, О.И. Грабельных, Т.П. Побежимова, A.M. Корзун, В.В. Турчанинова, А.В. Колесниченко II Доклады РАН - 2001а - Т378 №5 -С.700-702. ■ • , .

10. Влияние стрессового белка БХШ 310 на активность цианидрезистентной альтернативной оксидазы в митохондриях озимой пшеницы / О.И. Грабельных, Т.П. Побежимова, А.В. Колесниченко, В.К. Войников // Вестник Башкирского университета. - 2001. - №2 (1). - С.26-28. И. Стрессовый разобщающий белок БХШ 310 индуцирует термогенез в митохондриях пшеницы при гипотермии in vitro / В.К. Войников, О.И. Грабельных, Т.П. Побежимова, A.M. Корзун, О.Н. Сумина, В.В. Турчанинова, А.В. Колесниченко //Доклады РАН -20016 - Т377 №4. - С.565-567.

12. An influence of antiserum against winter wheat stress uncoupling protein CSP 310, on energetic activity of some plant species mitochondria / A.V. Kolesnichenko, O.I. Grabelnych, O.N. Sumina, T.P. Pobezhimova, V.K. Voinikov // J. Immunoassay Immunochemistry. - 2001a. - V.22, N1. - P.75-83,

13. An influence of stress protein CSP 310 and antiserum against this protein on lipid peroxidation in cereal mitochondria / A.V. Kolesnichenko, O.I. Grabelnych, V.V. Tourchaninova, V.V. Zykova, N.A. Koroleva, T.P. Pobezhimova, V.K. Voinikov // J. Immunoassay Immunochemistry. - 2001b -

14 Complex I of in «inter wheat mitochondria respiratory chain is the most sensitive to uncoupling action of plant stress related uncoupling protein CSP 310 / O.I. Grabe.nych T.P. Pobezh.mova, A.V. Kolesnichenko V К Voinikov II J. Thermal Biology. -2001a. - V.26, N1. - P.47-53.

15 Influence of CSP 310 and CSP 310-like proteins from cereals on mitochondrial energetic activity and lipid peroxidation in vitro and in vivo I A.V. Kolesnichcnko, V.V. Zykova, O.I Grabelnych N.A. KorE, TP Pobezhimova, Yu.M. Konstantinov, V.K. Voinikov // BMC Pltot Biolpgy. - 2001c. -

161 'Plant' stress uncoupling protein CSP 31« caused therms genesis in winter wtet mitochondria in ILlV Voinikov, О Grabelnych, T. Pobezhimova, A. Korzun, O. Sumina, V. Tourchaninova, A. KoWnichenko II J Plant Physiology. - 2001,- V.158, N6. - P.807-810.

^ Stfess protein CSP^310Causes oxidation and phosphorylation uncouplmg tomg low-temperatoe stress only in cereal but not dycotyledon mitochondria / O.I Crabdnyc^Ti-. Pobezhunov^ ^V Kolesnichenko, V.K. Voinikov // J. Immunoassay Imiminochcrmstry. - 20tMb. - V.22, N3. r.zn

Й7 The comparison of uncoupling activity of constituently synthesized and sjrcss-induced forms of winter rye stress uncoup.ing protein CSP 310 / TP Pobe^.mova,pO.1 Grabelnych, A.V. Kolesnichenko, V.K. Voinikov // J. Thermal Biology. - 2001. - V.26, N2. - P.95-101.

19 Влияние белка холодового шока 310 на перекисное окисление липидов и дыхательную ти» 0^ь митохондрий озимой пшеницы / В.В. ЗыкОва, O.II. Грабельных В.ВТурчанинова,

А И А°™пина° Н А Королева, А.В. Колесниченко, Т.П. Побежимова, Ю.М. Константинов,

В К Войников//Физиология растений,-2002.-Т.49, №5.-С.703-710 .

20 Stress-induced protein CSP 310: a third uncoupling system in plants / АЛЛ Kolesmchenko, TP. Pobezhimova, O.I. Grabelnych, V.K. Voinikov // Planta. - 2002. - V.215. - P.279-286.

^ Механизм разобщающего действия стрессового белка БХШ 310 отличается от механизма д« известных разобщающих белков / А.В. ^Г '

Гоабельных В К. Войников II Физиология растении. - 2003. - Т.50, №2. - С.251 2ЭУ. 22Differenc'e between the temperature of non-hardened and hardened winter wheat seedling shoo s during rold stress / A.V. Kolesnichenko, T.P. Pobezhimova, O.I. Grabelnych V.V. Tourchamnov , A.M. Korzun, N.A. Koroleva, V.V. Zykova, V.K. Voinikov Hi. Thermal B.alogy. - 2003a. - V.28,

21' lnfluence'of stress protein CSP 310 and antiserum against this protein on oxygen uptake lipid ргошГпала\1ТегаШге of winter wheat seedling shoots during cold stress / A.V. Kolesnichenko,

0 I Grabelnych, V.V. Tourchaninova, V.V. Zykova, N.A. Koroleva, T.P. Pobezhimova, A.M. Korzun V K. Voinikov // J. Immunoassay Immunochemistry. - 2003b. - V.24, N1. - P.41-55.

24 The role of different plant seedling shoots mitochondrial uncoupling systems in thermogenesis during low-temperature stress / O.I. Grabelnych, A.V. Kolesnichenko, T P. Pobezhimova УЛ'. Tourchaninova, A.M. Korzun, N.A. Koroleva, V.V. Zykova, V.K. Voimkev // У Thermal Biology. -

2003 - V.28,N8.-P. 571-580. ...

25. The distribution of electron transport between the main cytochrome and altcraat.ve pathways m plant mitochondria during short-term cold stress and cold hardening / О 1 Grabelnych^ O^N. Sumina, S.P. Funderat, T.P. Pobezhimova, V.K. Voinikov, A.V. Kolesnichenko // J. Thepnal Biology. - 2004. -

5б2 Природа л^вда; связанного с разобщающим белком БХШ 310 / А.В. Колееюиенко, Е.Л. Таусон, В В. Зыкова, Е.С. Клименко, О.И. Грабельных, Т.П. Побежимова // Физиология

растений,-2005.-Т.52, №2.-С.216-220. ,,.,т,„

27. Non-phosphorylating bypass of the plant mitochondrial respiratory chain by stress protein CSP310

1 A.V. Kolesnichenko, O.I. Grabelnych, T.P. Pobezhimova, V.K. Voinikov // Planta. - 2005. - V.221. -P 113-122

28.' Механизмы и функции нефосфорилирующего транспорта электронов в дыхательной цепи митохондрий растений I О.И. Грабельных, А.В. Колесниченко, Т.П. Побежимова, В.В. Зыксва, В.К. Войников // Физиология растений. - 2006. - Т.53, №3. - С.468-480.

29. Функционирование митохондрий озимой пшеницы in vitro в присутствии ионов Са2+ и стрессового разобщающего белка БХШ 310 / A.B. Колесниченко, О.И. Грабельных, Т.П. Побежимова, В.В. Турчанинова, В.К. Войников // Физиология растений - 200б - Т 53 Лг<>3 -С.380-386. • . , - .

30. Функционирование стрессового белка БХШ 310 связано с шунтированием транспорта электронов по дыхательной цепи митохондрий озимой пшеницы / В.К. Войников, A.B. Колесниченко, Т.П. Побежимова, О.И. Грабельных // Физиология растений - 2006 - Т 53 №3

- С.371-379. '

31. Циклоспорин А-чувствительная митохондриальная пора озимой пшеницы при низкотемпературном и окислительном стрессах / Н.С. Павловская, О.В. Савинова, О.И. Грабельных, Т.П. Побежимова, H.A. Королева, В.К. Войников // Доклады АН - 2007 - Т 417 №2. - С.283-285.

32. Роль свободных жирных кислот в энергетическом метаболизме митохондрий проростков озимой пшеницы / О.И. Грабельных, Н.Ю. Пивоварова, Т.П. Побежимова, A.B. Колесниченко, В.К. Войников// Физиология растений. - 2009. - Т.56, №3. - С.369-381.

33. Развитие программируемой клеточной гибели в суспензионной культуре клеток озимой пшеницы Triticum aestivum (L.) при действии низкой положительной и отрицательной температур / И.В. Любушкшга, О.И. Грабельных, Т.П. Побежимова, И.В. Федосеева, A.B. Степанов, Н.С. Павловская, A.B. Федяева, H.A. Королева, В.К. Войников // Известия Иркутского государственного университета. Серия «Биология. Экология». - 2010. - Т.З, №8. -0.10— 1S.

34. Чувствительность дыхания и набухания митохондрий злаков к соединениям, изменяющим проницаемость мембран / Н.С. Павловская, О.И. Грабельных, Т.П. Побежимова, H.A. Королева, В.К. Войников // Вестник Томского государственного университета Биология -2010. - №3(11). - С. 119-132.

35. Антиоксидантная функция альтернативной оксидазы в митохондриях озимой пшеницы при холодовом закаливании / О.И. Грабельных, Т.П. Побежимова, Н.С. Павловская НА Королева, O.A. Боровик, И.В. Любушкина, В.К. Войников // Биологические мембраны - 20Па

- Т.28, №4. - С.274-283.

36. Роль активных форм кислорода и участие митохондрий в развитии программируемой клеточной гибели в колеогтгилях озимой пшеницы / A.B. Корсукова, О.И. Грабельных И В Любушкина, Т.П. Побежимова, H.A. Королева, Н.С. Павловская, И.В. Федосеева,' В.К. Воиников // Известия Иркутского государственного университета. Серия «Биология Экология». -2013а. - №2. (принята к печати)

37. Winter wheat cells subjected to freezing temperature undergo death process with features of programmed cell death / I.V. Lyubushkina, O.I. Grabelnych, T.P. Pobezhimova, A.V. Stepanov A V Fedyaeva, I.V. Fedoseeva, V.K. Voinikov// Protoplasma (in press), doi.10.I007/s00709-013-0562-3

Статьи « других рецензируемых журналах и материалах конференций

38. Грабельных О.И. Изучение митохондриальных термогенных систем / О.И. Грабельных // Материалы III конференции молодых ученых, посвященной М.А. Лаврентьеву Часть II. Науки о жизни, науки о Земле, экономические науки, гуманитарные науки. - Новосибирск- РИЦ "Поайс-курьер",2003.-С. 120-124.

39. Изучение влияния циклоспорина А и ионов Са2+ на функционирование растительных митохондрий / О.И. Грабельных, Н.С. Павловская, Т.П. Побежимова, О Н. Сумина, В.К. Войников, A.B. Колесниченко // Вестник Харьковского национального аграрного университета. Серия Биология. - 2004. - №2 (5). - С.33-38.

40. The study of mitochondrial systems, those regulates the coupling degree of oxidative phosphorylation, in winter wheat / O.I. Grabelnych, T.P. Pobezhimova, A.V. Kolesnichenko О N Summa, N.S. Pavlovskaya, N.Yu. Pivovarova, V.K. Voinikov // Abstracts of meeting "International Conference in Plant Mitochondria Biology" (28 May - 2 June 2005, Obemai, France). - 2005. - P37

41 Грабельных О.И. Энергетические функции растительных митохон^ий в прессовых условиях / О.И. Грабельных // Журнал Стресс-физиологии и биохимии. - 2005. - Т.1, №1. - С.J /42. The importance of oxidative phosphorylation uncoupling systems functum for survivmg of w wheat seedling shoots during short-term cold stress / V V. Tourcbmmova, A.V. Kolesmc№ О I Grabelnych, T.P. Pobczhimova, A.M. Korzun, V.V. Kolesnichenko, V.K. Vomikov // Stress

Phvsioloev¿Biochemistry. -2005. - V.l,N.l.-P.21-29. .

43 The role of fatty acid in oxidative phosphorylation uncoupling of wmter wheat m.tochondna ar^d the participation of ADP/ATP-antiporter and the plant uncoupling rmtochondnal protein (PUMP) m thU process / O.I. Grabelnych, N.Yu. Pivovarova, T.P. Pobezlnmova A.V. Kolesn.chenko^VX Voinikov // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - B.oenergct.cs, - 2006. - V.1757, 1.5-6. Suppl.

^Проницаемость митохондриальных мембран растений в стрессовых условиях / О.И. ГрабГьных Н.С. Павловская"Н.Ю. Пивоварова, О.В. Савинова// Материалы V конференции мотодах ученых СО РАН, посвященной М.А. Лаврентьеву (Новосибирск, 20-22 ноября, 2007 г ) Ча<ль П. Гуманитарные науки, науки о жизни, науки о земле, экономические науки. Новосиб Гос Ун-т, Новосибирск, 2007. - С.92-94.

45 Регуляция активности альтернативной оксидазы и разобщающих белков в проростках озимой пшеншда низкой положительной и отрицательной температурами/ О.И. Грабельных, тТпобежимова, Н.А. Королева, Н.С. Павловская, И.В. Любушкина, Т.Е. Путилина ВХ Войников // Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внеш.,ей среды. Материалы Всеросс. научн. конф., 24-28 августа 2009 г. Иркутск: НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН, 2009 - С 95-99

46 Функционирование митохондрий в стареющем колеоптиле этиолированных проростков озимой пшеншГ/ О.И. Грабельных, Т.П. Побежимова, НА Королева Н.С. Пяловская, И.В. Любушкина, И.В. Федосеева, Т.Е. Пугилина, В.К. Воиников// Там же. -С.100-104. __

47 Участие цианидрезисгенгного дыхания в термогенерации и антиокисшгтелыюи защите клетки в проростках озимой пшеницы при холодовом воздействии / О.И. Грабельных, 1.1 По^сжимоТа А.М. Корзун, С.А. Возненко, Н.А. Королева, О.А Боровик, В.К. Воиников // Журнал Стресс-физиологии и биохимии. - 20116. - Т.7, №4. - С.446-456

48 Изменение жирнокислотного состава липидов м.ггохондрий озимои пшеницы в процессе холодового закаливания и последующего действия отрицательной температуры / О.И. Грабельных Т.П. Побежимова, К.А. Кириченко, О.А. Боровик, Н.С. Павловская Н.А. Королева, Н А. Соколова, В.К. Войников // VII Съезд Общества физиологов растении России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологии» и М™аРодная научим школа «Инновации в биологии для развития биоиндустрии

венной продукции». Материалы докладов (в двух частях). 4.1. (Нижнии Новгород, 4-10 июля 2011 г.).-Нижний Новгород, 2011в.-С. 197-198.

49 Устойчивость проростков озимой пшеницы к кратковременному действию отрицательной температуры можеГ быть обусловлена активацией разобщающих белков и АТФ/АДФ ™оДа / О.И. Грабельных, О.А. Боровик, Н.С. Павловская, Т.П. Побежимова, И.В.

А.В. Корсукова, Е.Л. Таусон, В.К. Войников // Журнал Стресс-физиологии и

5o'0,Activities^of ^ternativifoxidase, uncoupling proteins and adenine nucleotide translatorin winter wheat mitochondria during cold hardening / O. Grabelnych, O-Borovik, I. Lyubushkma, T. Pobezhimova, V. Vomikov // FEBS J. -2013. - V.280, Suppl. 1. -P.522. M Холодовое закаливание предотвращает индуцировавшую

программируемую клеточную гибель в колес,гтилях кукурузы / А.В. Корсукова, О.И. Грабмьных ТП Побежимова, Н.А. Королева, И.В. Федосеева, Н.С. Павловская, И.В Еу" О.А. Боровик, А.В. Федяева, С.А. Возненко Э.М. Ильюшнева, В.К. Воиников // Журнал Стресс-физиологии и биохимии. -20136. -Т.9, №1. -С.246-25/.

52. Роль изменений жирнокислотного состава клеток в процессе повышения морозоустойчивости суспензионной культуры озимой пшеницы / И.В. Любушкина, К.А. Кириченко, О.И. Грабельных, Т.П. Побежимова, A.B. Федяева, A.B. Степанов, В.К. Войников // Журнал Стресс-физиологии и биохимии. - 2013. - Т.9, .N«4. - С.219-229.

Список сокращений АО - альтернативная антимицин А и цианидрезистентная оксидаза АП - альтернативный путь дыхания, связанный с функционированием АО АФК - активные формы кислорода БГК — бензгвдроксамовая кислота БСА - бычий сывороточный альбумин Катр - карбоксиатрактилозид КЦХФ - карбонилцианид от-хлорфенилгидразон НАДН - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный НАДФН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный ПОЛ - перекисное окисление липидов СЖК - свободные жирные кислоты цикА - циклоспорин А ЦО — цитохром с оксидаза

ЦП - цитохромный путь дыхания, связанный с функционированием ЦО NDA — «внутренняя» ротенон-нечувствительная НАД(Ф)Н-дегидрогеназа NDB - «внешняя» ротенон-нечувствительная НАД(Ф)Н-дегидрогеназа РТР (Permeability Transiton Pore) - высокопроницаемая митохондриальная пора pUCP (plant Uncoupling protein) - растительный разобщающий белок

Подписано к печати 05.11.2013 г. Формат 60*84/16. Объем 2,8 п.л. Тираж 150 экз. Заказ Ка 611. Издательство Инст итута географии им. В.Б. Сочавы СО РАН, 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 1.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Грабельных, Ольга Ивановна, Иркутск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ЕОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ СИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

052СИ 450576 Грабельных Ольга Ивановна

МИТОХОНДРИАЛЬНЫЕ ЭНЕРГОРАССЕИВАЮЩИЕ СИСТЕМЫ РАСТЕНИЙ ПРИ ДЕЙСТВИИ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Войников Виктор Кириллович

Иркутск -2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...........................................................................................................И

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................23

1.1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ МИТОХОНДРИЙ И ИХ ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНОЙ ЦЕПИ...........................23

1.1.1. Структурная организация митохондрий...................................................23

1.1.2. Комплексы и суперкомплексы ЭТЦ митохондрий..................................32

1.1.2.1. Комплекс I дыхательной цепи митохондрий (НАДН: убихинон оксидоредуктаза) и окисление малата................................................................36

1.1.2.2. Комплекс II дыхательной цепи митохондрий (сукцинат: убихинон оксидоредуктаза) и окисление сукцината...........................................................44

1.1.2.3. Убихинон..................................................................................................48

1.1.2.4. Комплекс III дыхательной цепи митохондрий (убихинол: цитохром с редуктаза) или ¿с 1-комплекс................................................................................51

1.1.2.5. Цитохром с................................................................................................53

1.1.2.6. Комплекс IV дыхательной цепи митохондрий (цитохром с оксидаза или цитохромоксидаза).........................................................................................56

1.1.2.7. Комплекс V дыхательной цепи митохондрий (НГ-АТФ-синтаза)......58

1.1.2.8. Суперкомплексы дыхательной цепи митохондрий..............................60

1.1.3. Альтернативные ферменты в ЭТЦ митохондрий растений...................64

1.1.3.1. Альтернативная убихинол-оксидаза......................................................66

1.1.3.2. Альтернативные ротенон-нечувствительные НАД(Ф)Н-дегидрогеназы........................................................................................................74

1.2. МИТОХОНДРИИ КАК ИСТОЧНИК АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА И АНТИОКСИДАНТНЫЕ СИСТЕМЫ МИТОХОНДРИЙ.............................79

1.3. ПЕРЕНОСЧИКИ И КАНАЛЫ ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ..................................................................................................85

1.3.1. АТФ/АДФ-антипортер................................................................................87

1.3.2. К атр канал...................................................................................................89

1.3.3. Разобщающие белки...................................................................................91

1.4. КОНТАКТНЫЕ УЧАСТКИ ВНУТРЕННЕЙ И НАРУЖНОЙ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ МЕМБРАН..............................................................95

1.4.1. Система импорта белков через мембраны митохондрий........................95

1.4.2. Высокопроницаемая митохондриальная пора.........................................98

1.5. УЧАСТИЕ МИТОХОНДРИЙ В ОКИСЛЕНИИ ЖИРНЫХ КИСЛОТ... 103

1.6. НИЗКОТЕМПЕРАТУРНЫЙ СТРЕСС И МЕХАНИЗМЫ ПОВЫШЕНИЯ МОРОЗОУСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ.......................................................106

1.6.1. Ответ растений на низкотемпературный стресс....................................106

1.6.2. Липиды и жирные кислоты клеточных мембран: десатуразы и фосфолипазы растений.......................................................................................112

1.6.3. Стрессовые белки растений.....................................................................116

1.6.4. Роль ионов кальция при адаптации к холоду.........................................118

1.6.5. Дыхание растений и альтернативные пути дыхания в ответной реакции растений на низкотемпературный стресс.........................................................122

1.7. ВЫВОДЫ ИЗ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ, ПОСТАНОВКА ЦЕЛИ

ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................................................................127

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................................131

2.1. Объект исследования...................................................................................131

2.2. Температурная обработка............................................................................132

2.3. Определение изменений ростовой реакции проростков..........................133

2.4. Определение выживаемости.......................................................................133

2.5. Определение содержания углеводов..........................................................136

2.6. Определение содержания SH-групп.............................................136

2.7. Определение общего содержания активных форм кислорода................137

2.8. Определение пероксида водорода..............................................................140

2.9. Определение диеновых конъюгатов..........................................................140

2.10. Определение температуры тканей............................................................141

2.11. Выделение митохондрий...........................................................................142

2.12. Очистка митохондрий................................................................................143

2.13. Получение субмитохондриальных фракций...........................................145

2.14. Определение активности ферментов.......................................................146

2.14.1. Гидроксипируватредуктаза....................................................................146

2.14.2. Каталаза....................................................................................................147

2.14.3. Глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа.........................................................147

2.14.4. «Внешняя» НАД(Ф)Н-дегидрогеназа типа II.......................................147

2.14.5. «Внутренняя» НАДН-дегидрогеназа типа II........................................147

2.15. Полярографический анализ.......................................................................148

2.16. Определение мембранного потенциала митохондрий (Д\|/мит)..............151

2.17. Получение и анализ метиловых эфиров жирных кислот.......................152

2.18. Определение продуктов перекисного окисления липидов....................153

2.19. Определение набухания митохондрий....................................................154

2.20. Получение препаратов стрессового белка БХШ 310 и проведение экспериментов с БХШ 310.................................................................................154

2.20.1. Выделение цитоплазматических белков...............................................154

2.20.2. Фракционирование белков сульфатом аммония..................................155

2.20.3. Фракционирование белков с помощью гель-фильтрации..................155

2.20.4. Подготовка к работе неиммунной сыворотки и антисыворотки против БХШ 310...............................................................................................................156

2.20.5. Определение влияния конститутивно синтезируемой и стрессовой форм БХШ 310 на активность митохондрий озимой пшеницы.....................156

2.20.6. Определение влияния БХШ 310 и БСА на активность митохондрий разных видов растений.......................................................................................156

2.20.7. Определение ассоциации БХШ 310 с митохондриями озимой пшеницы...............................................................................................................157

2.20.8. Определение способности БХШ 310 восстанавливать цитохром с... 158

2.20.9. Определение термогенерации изолированными митохондриями в присутствии БХШ 310........................................................................................158

2.21. Определение разобщающей активности экзогенных свободных жирных кислот и их способности быть субстратом окисления....................................159

2.22. Выделение РНК и получение кДНК.........................................................161

2.23. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).........................................................................................................................162

2.24. Экстракция белков.....................................................................................164

2.25. Электрофорез в ПААГ с ДДС-NA............................................................165

2.26. Вестерн-блоттинг.......................................................................................166

2.26.1. Процедура иммуноблоттинга.................................................................166

2.26.2. Используемые антитела..........................................................................168

2.27. Определение молекулярных масс полипептидов...................................169

2.28. Статистическая обработка данных...........................................................169

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ......................................................170

3.1. ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИЕ ХОЛОДОВОЕ ЗАКАЛИВАНИЕ ЭТИОЛИРОВАННЫХ ПРОРОСТКОВ И СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ......................................................................170

3.1.1. Связь морозоустойчивости этиолированных проростков озимой пшеницы с синтезом дегидринов, содержанием АФК, интенсивностью дыхания и вкладом в дыхание альтернативного пути.....................................171

3.1.1.1. Повышение морозоустойчивости этиолированных проростков озимой пшеницы в процессе холодового закаливания.................................................171

3.1.1.2. Синтез COR-белков в побегах этиолированных проростков озимой пшеницы под влиянием закаливающих температур.......................................174

3.1.1.3. Содержание АФК в побегах этиолированных проростков озимой пшеницы после воздействия закаливающих к холоду температур...............176

3.1.1.4. Изменение интенсивности общего и устойчивого к цианиду дыхания в побегах проростков озимой пшеницы после действия закаливающих к-холоду температур..............................................................................................177

3.1.1.5. Влияние отрицательной температуры на содержание АФК в незакаленных и закаленных проростках озимой пшеницы............................178

3.1.1.6. Влияние отрицательной температуры на термогенез незакаленных и закаленных проростков озимой пшеницы........................................................180

3.1.2. Изучение морозоустойчивости суспензионной культуры клеток озимой пшеницы и параметров, определяющих эффективность холодового закаливания..........................................................................................................183

3.1.2.1. Влияние низких положительных температур на морозоустойчивость клеток суспензионной культуры озимой пшеницы.........................................184

3.1.2.2. Влияние холодового шока на содержание АФК, интенсивность дыхания и вклад альтернативного пути в дыхание в клетках контрольной и закаленной суспензионной культуры озимой пшеницы.................................186

3.1.3. Сравнительный анализ реакции этиолированных проростков и гетеротрофной суспензионной культуры озимой пшеницы на действие низких положительных и отрицательных температур....................................189

3.2. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПАРАМЕТРЫ МИТОХОНДРИЙ, ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ ПОБЕГОВ ЭТИОЛИРОВАННЫХ ПРОРОСТКОВ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ ДО И ПОСЛЕ ХОЛОДОВОГО ЗАКАЛИВАНИЯ.. 190

3.2.1. Содержание в митохондриях озимой пшеницы компонентов альтернативных путей транспорта электронов и нефосфорилирующего дыхания................................................................................................................190

3.2.2. Активность митохондрий из побегов этиолированных проростков озимой пшеницы при окислении различных субстратов................................191

3.2.3. Влияние холодового закаливания на относительный уровень экспрессии генов, кодирующих митохондриальные белки, в побегах проростков озимой пшеницы.............................................................................197

3.2.4. Влияние холодового закаливания на активность митохондрий озимой пшеницы при окислении различных субстратов.............................................203

3.2.5. Изменение жирнокислотного состава митохондрий озимой пшеницы в процессе холодового закаливания.....................................................................209

3.2.6. Изменение интактности митохондрий озимой пшеницы в процессе холодового закаливания и последующего воздействия отрицательной температуры.........................................................................................................217

3.2.7. Изменение содержания АФК в митохондриях озимой пшеницы после холодового закаливания проростков.................................................................219

3.2.8. Окислительная и фосфорилирующая активность митохондрий озимой пшеницы после холодового закаливания проростков и последующего действия отрицательной температуры..............................................................223

3.3. МЕХАНИЗМЫ И ФУНКЦИИ НЕФОСФОРИЛИРУЮЩЕГО ТРАНСПОРТА ЭЛЕКТРОНОВ В МИТОХОНДРИЯХ РАСТЕНИИ............226

3.3.1. Функционирование в митохондриях озимой пшеницы альтернативной цианид-устойчивой оксидазы и изменение ее потенциальной активности при действии низких температур..............................................................................226

3.3.1.1. Потенциальная активность альтернативной оксидазы в митохондриях озимой пшеницы зависит от субстрата окисления..........................................227

3.3.1.2. Изменение потенциальной активности альтернативной оксидазы в митохондриях растений при закаливании к холоду........................................232

3.3.1.3. Функции альтернативной оксидазы.....................................................235

3.3.1.3.1. Термогенная и антиоксидантная функции альтернативной оксидазы в проростках озимой пшеницы при кратковременном холодовом стрессе ..235

3.3.1.3.2. Антиоксидантная функция альтернативной оксидазы в митохондриях озимой пшеницы при холодовом закаливании......................238

3.3.2. Альтернативные ротенон-нечувствительные НАД(Ф)Н-дегидрогеназы

в митохондриях озимой пшеницы.....................................................................245

3.3.3. Роль свободных жирных кислот в энергетическом метаболизме митохондрий растений: разобщители окислительного фосфорилирования и

субстраты окисления...........................................................................................248

3.3.3.1. Функционирование жирных кислот как разобщителей окислительного фосфорилирования в митохондриях озимой пшеницы:

влияние длины углеводородной цепи, степени ненасыщенности, положения двойной связи и ее конфигурации.....................................................................249

3.3.3.2. Изменение разобщающей активности СЖК в митохондриях, изолированных из проростков озимой пшеницы, подвергнутых действию низких температур..............................................................................................282

3.3.3.3. Использование свободных жирных кислот в качестве субстратов окисления для митохондрий озимой пшеницы................................................288

3.3.3.4. Участие свободных жирных кислот в термогенезе растений при кратковременном холодовом стрессе и антиокислительная активность с участием СЖК.....................................................................................................300

3.3.4. Функционирование митохондриальной поры в этиолированных проростках озимой пшеницы.............................................................................306

3.3.4.1. Влияние ионов кальция, свободных жирных кислот и циклоспорина А на скорость нефосфорилирующего дыхания митохондрий из контрольных проростков злаков...............................................................................................307

3.3.4.2. Набухание митохондрий озимой пшеницы в присутствии ионов Са2+, свободных жирных кислот и циклоспорина А.................................................321

3.3.4.3. Участие митохондрий в процессе естественного старения

колеоптилей этиолированных проростков озимой пшеницы........................325

3.3.4.4. Влияние циклоспорина А, ионов Са и пальмитиновой кислоты на дыхание и набухание митохондрий озимой пшеницы, изолированных из проростков, подвергнутых действию низкой температуры...........................328

3.3.4.5. Влияние холодового закаливания на жизнеспособность клеток колеоптиля озимой пшеницы при окислительном стрессе и роль митохондрий в развитии индуцированной пероксидю водорода клеточной гибели...................................................................................................................336

3.3.4.6. Сравнительный анализ чувствительности к циклоспорину А митохондрий озимой пшеницы из контрольных проростков и проростков, подвергнутых действию низких температур....................................................339

3.3.5. Механизм разобщающего действия белкового комплекса с молекулярной массой 310 кДа (БХШ 310).......................................................346

3.3.5.1. Характеристика механизма разобщающего действия белка с мол. массой 310 кДа в митохондриях растений in vitro и in vivo............................347

3.3.5.2. Участие БХШ 310 в переносе электронов по дыхательной цепи митохондрий........................................................................................................361

3.3.5.3. Термогенная и антиоксидантная функция БХШ 310 в клетках

растений при низкотемпературном стрессе.....................................................378

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................384

ВЫВОДЫ............................................................................................................399

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................402

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ - аденозин-5-дифосфат

АДФ/О - отношение фосфорилированного АДФ к количеству утилизированного при этом кислорода

АО - альтернативная антимицин А- и цианид-устойчивая оксидаза

АП - альтернативный путь дыхания

АТФ - аденозин-5-трифосфат

АФА - активные формы азота

АФК - активные формы кислорода

БГК - бензгидроксамовая кислота

БСА - бычий сывороточный альбумин

БХШ 310 - белок холодового шока с молекулярной массой 310 кДа

ГДФ - гуанозин-5-дифосфат

ГТФ - гуанозин-5-трифосфат

ДАБ - 3,3 -диаминобензидин

ДДС-№ - додецилсульфат натрия

ДК - дыхательный контроль

ДТТ - дитиотреитол

ДФИ - дифенилен йодониум

ЖК - жирные кислоты

ИДС — индекс двойной связи

Катр - карбоксиатрактилозид

кДНК — комплементарная ДНК

КоА - кофермент А

КоС> (иС>), Ко(2Н2 (иС)Н2) - убихинон (кофермент <3) и его полностью

восстановленная форма убихинол

КЦХФ - карбонилцианид га-хлорфенилгидразон

МДА - малоновый диальдегид

МДГ - малатдегидрогеназа

митК+дтф канал - митохондриальный АТФ-чувствительный калиевый канал мРНК - матричная РНК

МРР - митохондриальная ретроградная регуляция мтДНК - митохондриальная ДНК МЭЖК - метиловые эфиры жирных кислот НАД+-МЭ - НАД+-зависимый малик-энзим

НАД, НАД+, НАДН - никотинамидадениндинуклеотид, его окисленная и восстановленная формы

НАДФ, НАДФ+, НАДФН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат, его

окисленная и восстановленная формы

НЖК - насыщенная жирная кислота

ННЖК - ненасыщенная жирная киcлota

ПААГ - полиакриламидный гель

ПКГ - программируемая клеточная гибель

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПФП - пентозофосфатный путь

ПЦР-РВ - полимеразная цепна�

Информация о работе

Грабельных, Ольга Ивановна
доктора биологических наук
Иркутск, 2013
ВАК 03.01.05

Диссертация

Митохондриальные энергорассеивающие системы растений при действии низких температур - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы