Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние света на дыхание и соотношение дыхательных путей в листьях растений

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние света на дыхание и соотношение дыхательных путей в листьях растений"

На правах рукописи

ШЕЛЯКИН Михаил Анатольевич

ВЛИЯНИЕ СВЕТА НА ДЫХАНИЕ И СООТНОШЕНИЕ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ В ЛИСТЬЯХ РАСТЕНИЙ

03.01.05 - Физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ф ЯНВ 2214

Санкт-Петербург - 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук

Научный руководитель ГОЛОВКО Тамара Константиновна

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты ЧИРКОВА Тамара Васильевна

доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии и биохимии растений ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»

МАМУШИНА Наталья Сергеевна кандидат биологических наук с.н.с. лаборатории экологической физиологии ФБГУН Ботанический институт им. В. Л. Комарова Российской академии наук

Ведущая организация ФГАОУ «Уральский федеральный

университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина»

Защита состоится 27 декабря 2013 г. в « ¡¿[ » ч на заседании диссертационного совета Д 002.211.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Ботаническом институте им. В.Л. Комарова Российской академии наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 2. Тел. (812) 372-54-42, факс (812) 372-54-43.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Ботанического института им. В.Л. Комарова Российской академии наук.

Автореферат разослан «¿£~» ноября 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

О.С. Юдина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Свет - ведущий фактор внешней среды, является источником энергии для осуществления фотосинтеза, запускает процесс фотоморфогенеза, участвует в регуляции метаболизма растительных клеток (Карначук и др., 2001; Кулаева, 2001). Световая энергия, запасенная зеленым листом в конечных продуктах фотосинтеза, извлекается в процессе дыхания и используется растением на рост (новообразование), поддержание целостности клеточных структур и их функциональной активности (Головко, 1999; Семихатова, Чиркова, 2001). Довольно долго проблема влияния света на дыхание рассматривалась через «призму» фотосинтеза. Дыхание снабжает клетки теми же продуктами, что и фотосинтез (АТФ, восстановительные эквиваленты, углеродные скелеты), но по интенсивности оно намного уступает фотосинтезу. Представление о темновом дыхании в фотосинтезирующей клетке менялись от отрицания самой возможности дыхания на свету (Заленский, 1957; Heber, 1974) или частичном ингибиро-вании (Мамушина и др., 1997) до активации светом (Мурей, 1984; Чмора и др., 1992; Atkin е. а., 2000). Позже преобладающим стало мнение, что процессы фотосинтеза и дыхания у фототрофных тканей на свету тесно скоординированы (Семихатова, 2000). Поддержание баланса между процессами фотосинтеза и дыхания служит основой адаптации растений (Головко, 1983; Рахманкулова и др., 2013). Изменение углеводного статуса и редокс-состояния фотосинтезирующей клетки влияет на экспрессию генов и активность дыхательных ферментов (Rasmusson, Escobar, 2007). На му-тантных растениях и зеленеющих проростках показано вовлечение энергетически малоэффективного альтернативного пути дыхания (АП) на свету (Ribas-Carbo е. а., 2008; Zhang е. а., 2010). Полагают, что АП участвует в окислении избытка восстановителей, поступающих из хлоропластов, и защите фотосинтетического аппарата от фотодеструкции (Raghavendra, Pad-masree, 2003; Noguchi, 2005, 2008; Yoshida, 2007; Xu е. a., 2011; Zhang е. a., 2011, 2012).

Однако остается неясным, в какой мере эффекты света на дыхание проявляются у растений в природе при длительной адаптации к световым условиям обитания. Комплексное эколого-физиологическое изучение растений из природных биоценозов позволяет уточнить выявленные в лабораторных условиях закономерности и углубить понимание механизмов регуляции процессов жизнедеятельности при взаимодействии растений со средой (Заленский, 1977). Данная работа выполнена для уточнения и расширения существующих представлений о механизмах адаптации растений к световым условиям, выявления возможной физиологической роли дыхания и его компонентов на основе экспериментов, проведенных в контролируемых и естественных условиях, на листьях модельных растений в разные периоды роста и развития.

Цель работы - выявить закономерности изменения дыхания и соотношения дыхательных путей в листьях при адаптации растений к световым условиям обитания.

В задачи исследования входило:

1. Дать характеристику дыхания и изучить вовлечение альтернативного пути дыхания при зеленении проростков пшеницы в контролируемых условиях.

2. Выявить возрастные изменения дыхания и дыхательных путей в листьях Rubus chamaemorus в условиях естественного освещения и при длительном затенении растений.

3. Провести сравнительное изучение дыхания и соотношения дыхательных путей в листьях растений НуШе1ерЫит ЬпркуИит, культивируемых при разной освещенности.

4. Определить содержание растворимых углеводов в листьях и проанализировать связь дыхания с углеводным статусом исследуемых растений.

Научная новизна. Впервые исследованы закономерности функционирования дыхания и дыхательных путей в листьях растений природной флоры при адаптации к разным световым условиям. Вклад альтернативного (цианидустойчивого) дыхания варьировал от 25 до 50% в зависимости от возраста листа и фазы развития растений. Старение листьев сопровождалось снижением дыхательной активности, повышением доли альтернативного и немитохондриального (остаточного) дыхания. Не выявлено прямой связи между дыханием и динамикой фонда растворимых углеводов. Изменение освещенности не приводило к существенному нарушению соотношения дыхательных путей, что свидетельствует о поддержании устойчивого функционирования дыхательной системы листьев при длительной адаптации растений к световым условиям произрастания.

Выявлены синхронные изменения скорости дыхания и альтернативного пути транспорта электронов в первом листе проростков пшеницы в процессе деэтиоляции на непрерывном свету. Активность АП возрастала на фоне значительного уменьшения количества растворимых углеводов, что указывает на сложный характер зависимости дыхания от содержания дыхательного субстрата. Обосновано предположение об участии АП в поддержании гомеостаза фотосинтезирующих органов во время формирования фотосинтетического аппарата (ФСА).

Практическая значимость работы. Полученные результаты существенно дополняют и углубляют представления о динамике дыхательной активности и соотношении дыхательных путей в листьях в зависимости от возраста, фонда растворимых углеводов и световых условий произрастания растений. Данные могут быть рекомендованы для комплексной характеристики исследованных видов, прогнозирования их поведения в различных эколого-ценотических условиях. Результаты работы могут быть использованы в ВУЗах при составлении курсов лекций по физиологии и экологии растений, региональной флоре.

Положения, выносимые на защиту.

1. Закономерности изменения дыхания и соотношения дыхательных путей в листьях в зависимости от их возраста, углеводного статуса и адаптации к световым условиям произрастания.

2. Динамика дыхания и активность альтернативного пути транспорта электронов в проростках пшеницы в процессе их деэтиоляции.

Личный вклад автора. Участвовал в разработке темы и планировании исследований, выполнении наблюдений и постановке экспериментов, сборе, обработке и интерпретации экспериментальных данных, формулировке выводов, подготовке публикаций и представлении результатов на тематических конференциях.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены и доложены на XVIII и XIX Всерос. молод, науч. конф. « Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2011 и 2012 гг.); III школе-конф. молод, ученых Волго-Уральского региона по физ.-хим. биол. и биотехнол. «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2012 г.); X Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием «Биодиагностика состояния природных и природно-техногенных систем» (Киров, 2012). Всерос. научн. конф «Физиология растений и микроорганизмов - взгляд в будущее» (Томск, 2013). II Всерос. молод, научн. конф. «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2013).

Всерос. науч. конф. с междунар. участием «Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва, 2013).

Связь с научными и научно-прикладными программами. Работа выполнена в Лаборатории экологической физиологии растений Института биологии Коми научного центра УрО РАН в период прохождения курса аспирантуры (2010-2013 гг.). Является разделом плановой темы НИР «Фи-зиолого-биохимические механизмы адаптации растений к неблагоприятным воздействиям природных и антропогенных факторов» (№ ГР 01201150200), поддержана грантами УрО РАН (№ 12-С-4-1015 и № 12-У-4-1008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе статья в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 117 страницах, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, содержит 10 таблиц и 33 рисунка. Список цитируемой литературы включает 222 источника, в том числе, 153 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. РОЛЬ ДЫХАНИЯ В ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ РАСТЕНИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

В главе на основе имеющихся в литературе сведений рассматриваются ключевые вопросы дыхания как источника метаболитов и энергии (Головко, 1999). Дан обзор дыхательной сети растительной клетки. Показано, что наличие дополнительных нефосфорилирующих путей (внешних НАД(Ф)Н дегидрогеназ, альтернативной оксидазы и разобщающих белков) в ЭТЦ растительных митохондрий делает ее пластичнее и устойчивее к воздействию стрессовых факторов (Lambers, Ribas-Carbo, 2005; Van Dongen е. a., 2011). Критически разобраны представления о возможной роли АП в не-термогенных тканях растений (Vanlerberghe, Mcintosh, 1997; Шугаев, 1999; Maxwell е. а., 1999; Mackenzie, Mcintosh, 1999; Noguchi, 2005; Yoshida е. a., 2006; Gupta e. a., 2009; Van Dongen e. a., 2011). Представлены сведения о функциональных составляющих дыхания, их связи с процессами роста и поддержания. Обсуждена информация о влиянии света на дыхание, изменения скорости дыхания и соотношения дыхательных путей в процессе деэти-оляции проростков. Обоснована необходимость изучения регуляции дыхания при адаптации растений к свету в природных условиях.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве модельных объектов использовали проростки Triticum, aesti-vum L. (сорт Иргина) и растения природной флоры Hylotelephium triphyllum (Haw.) Holub и Rubus chamaemorus L. Растения морошки приземистой произрастали на хорошо освещенном участке мезо-олиготрофного кустарнич-ково-сфагнового болота, растения очитка пурпурного культивировали на делянке в окрестностях г. Сыктывкара. Часть растений получала полный солнечный свет, другие затеняли экраном, снижающим освещенность на 50%. Деэтиоляцию пятисуточных проростков пшеницы проводили в контролируемых условиях на непрерывном свету 190 мкмоль ФАР/ (м2с) в течение 48 ч.

Интенсивность дыхания листьев определяли по поглощению 02 при 20 °С в 2011 г. манометрическим методом на аппарате Варбурга (Германия) (Се-михатова, Чулановская, 1965), в последующие годы полярографически с

использованием электрода Кларка («Охуtherm system», Hansatech Inst., Англия). Скорость дыхания выражали в наномолях (нмоль) 02 / г сухой массы мин.). Определения видимого фотосинтеза листьев проводили по поглощению С02 с помощью газометрической системы ADC LCPro-l- (ADC, Англия).

Соотношение дыхательных путей изучали с помощью специфических ингибиторов (Bahr, Bonner, 1973; Lambers, 1985; Möller е. а., 1988). В качестве ингибитора альтернативной оксидазы (АОХ) использовали растворы салицилгидроксамовой (СГК) (Sigma, США) или бензгидроксамовой кислоты (БГК) (Lancaster, Англия). Активность цитохромоксидазы подавляли KCN (Sigma, США) или NaN3 (ДиаэМ, Украина). Расчет способности дыхательных путей проводили в абсолютных (нмоль 02) и в относительных (% от дыхания в контроле) величинах. Для выявления неспедифического действия СГК и БГК на дыхание и оптимальных концентраций ингибиторов применяли метод «прямого титрования» (Bahr, Bonner, 1973), адаптированный для растительных тканей (Theologis, Laties, 1978; Lambers, 1985; M0ller е. а., 1988).

Содержание растворимых углеводов и их состав определяли методом нормальнофазовой ВЭЖХ после экстракции этиловым спиртом. Хлорофиллы (Хл) и каротиноиды определяли на спектрофотометре UV-1700 (Shimadzu, Япония) в ацетоновой вытяжке при 662 и 644 нм для Хл а и Ь соответственно (Шлык, 1971), каротиноиды - при 470 нм (Маслова и др., 1986). Антоцианы из листьев очитка экстрагировали 1%-ным раствором HCl при 45 °С и определяли при 510 нм с поправкой на поглощение Хл (Муравьева и др., 1987).

Все образцы отбирали в трех-пяти биологических повторностях. Опыты с проростками повторяли трижды, полевые опыты проводили в течение двух-трех вегетационных сезонов. Анализ результатов проведен с использованием однофакторного дисперсионного и корреляционного анализов, статистических параметрических и непараметрических критериев. Статистическая обработка данных проведена с помощью программы Statistica 6.1 (Statsoft Inc., США). Значимость влияния фактора на дыхание листьев растений в полевых опытах оценена с помощью MANOVA («Main effects of ANOVA») с использованием критерия Уиллкса. Все статистические расчеты осуществляли при заданном уровне значимости Р < 0.05. В таблицах и на графиках представлены средние арифметические значения и их стандартные ошибки.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Динамика дыхания и соотношение дыхательных путей в зеленеющих проростках яровой пшеницы

Интенсивность поглощения 02 в пятисуточных этиолированных проростках составляла около 1500 нмоль 02/(г мин.). Во время зеленения скорость общего дыхания (Rt) повышалась и в последующие 4 ч увеличилась почти вдвое, достигая к 6 ч деэтиоляции максимального за весь период значения, 3000 нмоль 02/(г мин.) (рис. 1). Изменения скорости поглощения 02 в течение первых суток экспозиции проростков на свету были связаны, главным образом, с модуляцией способности АП (Val[). Величина Valt первого листа пятисуточных этиолированных проростков составляла всего 200 нмоль 02/(г мин.). После включения света, в течение первых 6 ч зеленения, скорость Vаи увеличилась в среднем в 9 раз и достигла максимального значения. К концу 12 ч световой экспозиции скорость Ve(( снизилась вдвое и в дальнейшем изменялась незначительно.

Рис. 1. Активность 5«И1

общего дыхания (А), ци- 3110«

тохромного (У ) и аль- 2«(№

тернативного пути дыха- 21101!

ния (\/а„) (Б) в первом ли- X | 150«

сте проростков пшеницы Ъ II»»

в процессе их деэтиоля- 8 га Е Я№

ции. 0

2 4 6 П 24

время экспозиции на свету, ч

(I » 2 4 « 12 24

Дыхание этиолированного листа осуществлялось в основном по ЦП (V ) (70%). С началом де-этиоляции доля ЦП в дыхании снижалась и стабилизировалась на уровне 40-50% после 4-6 ч экспозиции проростков к свету. В отличие от ЦП, вклад АП в дыхание листа возрастал от 25 до 50% в первые 6 ч зеленения, а затем снизился до 30%. Доля немитохондриального, остаточного дыхания (Уге) варьировала в диапазоне 10-20% от на протяжении всего эксперимента.

Содержание растворимых углеводов в первом листе пятисуточных этиолированных проростков составляло в среднем 40 мг/г. В процессе деэтио-ляции их концентрация снижалась и к завершению эксперимента уменьшилась вдвое. В пуле Сахаров превалировали моносахара (77-85%), на ди-сахара приходилось 10%, но к концу эксперимента, когда полностью исчезали олигосахариды, их доля возрастала до 22%. Содержание хлорофил-лов, наоборот, постоянно возрастало и спустя 48 ч воздействия светом достигало 9 мг/г сухой массы. За первые сутки зеленения концентрация хло-рофиллов увеличилась в 17 раз, за вторые — в 2 раза.

Таким образом, нами установлена динамика изменения дыхания. Показано, что повышение дыхания в первые 6 ч зеленения связано с активацией АП. Доля ЦП в первом листе проростков в течение 4-6 ч экспозиции на свету снизилась в среднем на 20-30%, а затем достоверно не изменялась.

3.2. Физиолого-биохимические характеристики листьев ЯиЬих скатае-тогив при длительном затенении растений

На протяжении трех сезонов определяли интенсивность поглощения 02 и исследовали активность дыхательных путей в листьях морошки. Наиболее полные данные были получены в 2013 г., что позволило выявить возрастные и онтогенетические закономерности и реакцию дыхания на затенение растений. Опыты начинали со второй половины мая, когда площадь листьев еще не достигла окончательных размеров, и продолжали до конца вегетации. Динамика дыхания листьев имела сложный характер: максимумы дыхательной активности были отмечены в начале цветения и в период плодоношения растений (рис. 2). Способность ЦП изменялась синхронно динамике общего дыхания листьев. В период от фазы вегетативного роста до конца цветения скорость АП и ЦП снижалась примерно вдвое. В фазу плодоношения повышение скорости ЦП было выражено сильнее, чем Ап. К концу вегетации цитохромное дыхание отмирающих листьев падало более значительно, чем АП. Вклад АП варьировал в пределах 30-

Рис. 2. Динамика общего дыхания (А), цитохромного {\/су1) и альтернативного пути дыхания (\/а(() (Б) в листьях морошки приземистой: 1 -вегетативный рост; 2 - начало цветения; 3 - массовое цветение; 4 -конец цветения; 5 - плодоношение; 6 - конец плодоношения; 7 - старение.

45% в зависимости от фазы роста и развития растений (рис. 3). В стареющих листьях резко возрастала доля остаточного (немитохондриального) дыхания, до 50-60%.

Затенение не оказало влияния на сезонную динамику дыхательной способности листьев, однако снижало поглощение 02 в среднем на 25-30% . Уровень освещенности существенно не повлиял на соотношение дыхательных путей, вклад компонентов дыхания у затененных и контрольных растений был примерно одинаковым (табл. 1, рис. 3). Можно отметить несколько более высокую долю ЦП в дыхании листьев затененных растений в фазе плодоношения. В конце вегетации доля остаточного дыхания в листьях опытных растений была столь же высокой, как и у контрольных, произрастающих при естественной освещенности.

Содержание растворимых углеводов в листьях морошки в фазу вегетативного роста было минимальным, 15 мг/г. По мере развития растений отмечали увеличение содержания растворимых углеводов в листьях, максимум накопления Сахаров (80 мг/г) был отмечен в конце фазы цветения. В стареющих листьях содержалось 70% Сахаров от максимального значения. Растворимые углеводы были представлены моно- и дисахарами. Доля дисахаридов варьировала от 50 до 70%. Условия освещения оказали влияние на содержание растворимых углеводов, их концентрация в листьях затененных растений была в среднем на 30% ниже. Эта разница практически нивелировалась в стареющих листьях.

Максимум накопления Хл (5-6 мг/г) и каротиноидов (1.0-1.2 мг/г) отмечали в начале цветения. К фазе плодоношения их содержание уменьшилось в 1.5 раза, а к концу вегетации снижалось в 2 раза. Затенение не оказало заметного влияния на пигментный фонд растений.

Таким образом, нами было установлено, что длительное затенение растений существенно не повлияло на динамику дыхания и соотношение дыхательных путей, но снижало общую дыхательную активность в среднем

на 25-30%. Вклад дыхания по ЦП и АЛ изменялся синхронно динамике общего дыхания.

Рис. 3. Соотношение дыхательных путей в листьях морошки приземистой в разные фазы роста и развития растений. Обозначения: 1, 2, 3... как на рис. 2.

# 200

100 so 60

>

40

20

*

Таблица 1

Интенсивность общего дыхания (нмоль 02 / г сухой массы мин.) и вклад дыхательных путей (% от общего дыхания) в листьях затененных растений морошки приземистой

Дыхание Фаза развития

3 4 5 6 7

Общее ([*,) 1073±61 633±67 1276±55 1557±80 960±36

ЦП (V,*) 52 41 52 59 12

АП (V,,) 26 30 34 24 29

Остаточное (\/ге8) 23 30 14 17 58

Обозначения: 3, 4, 5... как на рис. 2.

3.3. Физиолого-биохимические характеристики листьев растений Ну1о1е-1ерЫит Мрку11ит, культивируемых при разной освещенности

Как видно из данных табл. 2, дыхание листьев верхнего и нижнего ярусов растений очитка существенно снижалось к фазе плодоношения. В зависимости от погодных условий сезона, максимум дыхания листьев отмечали в период вегетативного роста (2011 г.) или в фазу цветения (2012 г.). В 2011 г. в фазе вегетативного роста листья верхнего яруса световых и теневых растений дышали в среднем на 10-15% интенсивней листьев нижнего яруса. В фазу цветения скорость поглощения 02 в верхних листьях снижалась примерно в 1.5 раза, а различия в скорости дыхания между листьями верхнего и нижнего ярусов уменьшались. В период плодоношения скорость дыхания верхних листьев была ниже, чем в фазу вегетативного роста в 2.2-2.4 раза, а различия в дыхательной способности листьев верхнего и нижнего ярусов нивелировались.

Листья верхнего и нижнего яруса теневых (Т) растений дышали более интенсивно по сравнению с листьями световых (С) растений. В фазу вегетативного роста и цветения разница в скорости поглощения 02 листьями С- и Т-растений составляла в среднем 20-25%, но к плодоношению она практически исчезала.

В период вегетативного роста дыхание по ЦП в верхних и нижних листьях С-растений составляло 1000-1200 нмоль 02/(г мин.) и значительно превышало способность АП (рис. 4). По мере развития растений происходило снижение способности ЦП в 3-5 раз, тогда как дыхание по АП увеличивалось до 500-600 нмоль 02. У адаптированных к затенению растений,

Таблица 2

Дыхание листьев Ну/о(е/ер/7/шт7 Мр/1у11ит в зависимости от положения на стебле и фазы развития растений, нмоль 02 / г сухой массы мин.

Растения Ярус Вегетативный рост Цветение Плодоношение

листьев 2011 г. 2012 г. 2011 г. 2012 г. 2011 г. 2012 г.

Световые Верхний 2234±213* 1599±261 1421±70* 1762±58 999±7& 870±58

Нижний 1380±122 1369±267 1131±103 1789±62 937±41 646±35

Теневые Верхний 2688±191 1458±94 1883±134 2315±101 1130±25 1166±90

Нижний 2178±426 1386±79 1707±96 2149±66 1046±69 824±102

* разница в интенсивности дыхания листьев верхнего и нижнего яруса статистически достоверна при Р < 0.05.

Вегетативный Цветение Плодоношеине Вегетативный Цветение Плодоношение

|>ОСТ

рост

Рис 4 Интенсивность цитохромного (Усу() и альтернативного (Уй() дыхательных путей в листьях световых (А) и теневых (Б) растений НуЫе1ерЫит МрЬуИит. В верхнем ряду представлено дыхание листьев верхнего яруса, в нижнем - нижнего яруса (данные за 2011 г.).

динамика дыхания листьев верхнего яруса не отличалась от таковой С-растений. В нижних листьях Т-растений способность ЦП была сравнительно низкой, 400-600 нмоль 02 тогда как дыхание по АП в фазу вегетативного роста и цветения было выше в 2-3 раза по сравнению с ЦП. В оба сезона динамика соотношения дыхания по ЦП и АП была довольно сходной. В 2012 г. вклад ЦП в дыхание листьев верхнего и нижнего яруса был наибольшим в фазу вегетативного роста (рис. 5). При переходе растений к цветению и плодоношению выявили снижение дыхания по ЦП и увеличение способности к дыханию по АП.

П\Ш

ОГп?5

Вегетативный рост

Цветение Пяодоиешекне

Вегетатнви ын

рост

Цветение Плоде кошение

Рис. 5. Соотношение дыхательных путей в листьях световых (А) и теневых (Б) растений НуЫе1ерЫит МрИуНит. В верхнем ряду изображено дыхание листьев верхнего яруса, в нижнем - нижнего яруса (данные за 2012 г.).

Листья очитка характеризовались сравнительно высоким накоплением растворимых углеводов, 200-300 мг/г сухой массы. У С- растений фонд углеводов заметно снижался в течение вегетации, тогда как у Т- растений оставался на одном и том же уровне. Достоверные различия в суммарном содержании растворимых Сахаров в листьях С- и Т-растений имели место только в фазе вегетативного роста. Пул растворимых углеводов в листьях был представлен в основном моносахаридами. Доля дисахаридов не превышала 6%.

Наибольшее содержание Хл в листьях С-растений отмечали в фазу вегетативного роста - 5 мг/г. В фазе цветения их количество снизилось в 1.5 раза и к плодоношению не превышало 1 мг/г. Концентрация каротиноидов снижалась в меньшей степени, чем Хл В результате их относительное содержание возросло в 10 раз. В листьях Т-растений концентрация зеленых и желтых пигментов оставалась практически неизменной на протяжении всей вегетации и составляла соответственно 3.0 и 0.7 мг/г. Важно отметить, что листья С-растений накапливали значительно больше внепластид-ных пигментов - антоцианов.

Таким образом, результаты опытов с очитком выявили возможность сдвига максимума дыхательной способности листьев под влиянием погодных условий. Листья верхнего яруса дышали интенсивнее нижних. Световые условия не повлияли существенно на сезонную динамику общего дыхания и дыхательных путей, при том, что листья затененных растений дышали заметно интенсивней по сравнению со световыми. Листья обеих групп растений характеризовались высокой способностью к дыханию по АП.

Глава 4. РОЛЬ ДЫХАНИЯ И ЕГО КОМПОНЕНТОВ

В АДАПТАЦИИ ЛИСТЬЕВ РАСТЕНИЙ К СВЕТОВЫМ УСЛОВИЯМ ПРОИЗРАСТАНИЯ (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ)

Свет - основной фактор, определяющий жизнедеятельность фотосинте-зирующих организмов. Вместе с тем, его избыток, особенно в сочетании с другими неблагоприятными воздействиями, способен вызвать нарушения в работе ФСА (Demming-Adams, Adams, 1992; Long е. a., 1994; Muraoka е. a., 1998; Osmond, Foster, 2006). Хотя в процессе эволюции у растений сформировались защитные механизмы, в природе они нередко испытывают стресс, вследствие избыточного поглощения световой энергии, нереализуемой в фотохимических реакциях (Demming-Adams, Adams, 1992; Hartmut е. а., 1999; Murata е. а., 2007; Головко и др., 2011). Исследованные нами растения очитка пурпурного и морошки приземистой, произраставшие в условиях естественного местообитания, могли получать избыточное количество света (особенно в солнечный полдень), так как насыщение видимого фотосинтеза у обоих видов происходит при ФАР 400-600 мкмоль/(м2с). Мы ожидали, что длительное произрастание в разных световых условиях (естественное освещение и уменьшение поступления световой радиации вдвое) может сказаться на дыхании и соотношении дыхательных путей. Такие эффекты ранее наблюдались в опытах с теневыносливыми растениями при воздействии высоким уровнем освещенности (Noguchi е. а., 2001, 2005; Головко, Пыстина, 2001).

4.1. Изменение дыхательной активности, углеводного статуса и содержания фотосинтетических пигментов в первом листе проростков в процессе деэтиоляции

Несмотря на то, что зеленение - естественный процесс, при переносе этиолированных проростков из темноты на свет, в них происходят серьезные морфологические и физиолого-биохимические изменения, направленные на адаптацию к световым условиям произрастания (Ohashi е. а., 1989; Adamska е. а., 1992; Krol е. а., 1995; Reinbothe е. а., 1999; Kravtsov е. а., 2011). Процесс деэтиоляции детально исследован с точки зрения развития хлоропластов и становления фотосинтетической функции (Reinbothe е. а., 1999), однако сведения об изменении дыхания в процессе зеленения не столь исчерпывающи (Ribas-Carbo е. а., 2000; Feng е. а., 2007). Зеленеющие проростки являются удобной моделью для выяснения вопросов регуляции дыхания в фотосинтезирующей клетке и анализа связи дыхания с углеводами при переходе растения от гетеротрофного к фототрофному типу питания.

Выявлено, что этиолированные проростки яровой пшеницы интенсивно дышали, но сразу после переноса на свет их дыхание снижалось на 1525%, что, по-видимому, было обусловлено адаптацией к новым условиям. Подъем дыхания, наблюдаемый к 6 ч зеленения, происходил за счет возрастания АП (рис. 1) и, скорее всего, свидетельствовал о превалировании процессов декарбоксилирования, связанных с активацией цикла Кребса и, возможно, фотодыхания (Atkin е. а., 2000; NunesNesi, 2011). Спустя 12 ч от начала деэтиоляции лист уже мог функционировать как донор ассими-лятов (Garmash е. а, 2013). С переходом листа к донорной функции величина Valt снижалась сильнее, чем V В процессе зеленения содержание растворимых углеводов в первом листе постоянно снижалось. При этом основную часть фонда углеводов составляли моносахара.

Ход дыхания листа в процессе деэтиоляции не зависел от содержания в нем растворимых углеводов (рис. 6). Динамика общего дыхания и АП имела сходный характер, а активность ЦП изменялась независимо от АП. Как и следовало ожидать, активность ЦП тесно коррелировала с содержанием растворимых углеводов. Полученные результаты согласуются с представлениями о том, что в молодых, быстро растущих тканях, фонд углеводов в большей степени используется на энергоемкие процессы роста и развития (Головко, 1999), а цитохромное дыхание является функцией дыхания роста (Florez-Sarasae. а., 2007). При смене функции листа на донорную связь между ЦП и содержанием углеводов сохранялась, что отражает потребности в АТФ на поддержание функциональной активности существующих структур и реализацию донорной функции листа. Связь ЦП с содержанием углеводов через функцию роста подтверждается результатами, полученными ранее в исследованиях на молодом и зрелом листе пшеницы (Гармаш и ДР., 2011).

Активность АП первого листа возрастала значительно на фоне снижения содержания растворимых углеводов в первые 6 ч экспозиции проростков к свету и в этот период была сопоставима со скоростью ЦП. По-видимому, вовлечение АП в процессе роста и зеленения листа контролируется несколькими факторами. Поддержание интенсивного роста в темноте за счет запасов семени сопряжено поставкой метаболитов ЦТК для синтезов de novo. Возможно, что АП участвует в окислении части образующегося в цикле Кребса НАДН, что позволяет не только обеспечить высокую активность цикла, но и предотвращает образование избыточного количества АФК в митохондриях (Millenaar, Lambers, 2003; Nunes-Nesi, 2011). В фототрофных клетках основным источником образования АФК считаются хлоропласты.

Рис. 6. Общее дыхание (А), цитох-ромное (залитые кружки) и альтернативное (незалитые кружки) дыхание (Б) как функция содержания растворимых углеводов в первом листе проростков пшеницы в процессе деэтиоляции.

В условиях повышенной освещенности усиление активности АОХ в листьях некоторых видов растений происходило на фоне увеличения концентрации Сахаров, АТФ и степени восстановленнос-ти пула убихинона, что, по мнению авторов (Noguchi, Terashima, 1997; Noguchi е. а., 2001), способствовало защите от фотоокислительного стресса и поддержанию редокс-статуса фотосинтезирую-щих клеток.

Известно, что процессы фотосинтеза и дыхания у фототрофных тканей на свету тесно скоординированы (Мамушина и др., 1997) благодаря существованию сложной сигналлинговой сети. Изменения фонда углерода (углеводов, аминокислот) и редокс-состояния клетки при фотосинтезе влияют на экспрессию генов и активность дыхательных ферментов (Rasmusson, Escobar, 2007). Полагают, что митохондриальное дыхание на свету, помимо основных функций, может также участвовать в создании оптимальных для фотосинтеза условий (Noguchi, Yoshida, 2008; Dinakar е. а., 2010).

Таким образом, нами выявлены закономерности изменения дыхания и соотношения дыхательных путей в процессе деэтиоляции и становления фотосинтетической функции первого листа проростков пшеницы. Ход дыхания листа был тесно связан с модуляцией активности АП. Активность АП не зависела от содержания растворимых углеводов. Это указывает на существование, помимо субстратного, других более сложных механизмов, регулирующих вовлечение АП.

4.2. Влияние длительного затенения на физиолого-биохимические характеристики листьев растений Rubus chamaemorus

В опытах с морошкой установлены закономерности изменения дыхания и соотношения дыхательных путей по мере роста и развития растений в условиях естественного и пониженного освещения (рис. 2 и 3, табл. 1). Феноменологии онтогенетического изменения дыхания листьев посвящено немало работ (см. Головко,1999), изменения в соотношении дыхательных путей до сих пор освещены неполно (Collier, 1995; Searle, Tumbull, 2011). Особенно это касается завершающих этапов, связанных со старением (Gui-boileau е. а., 2010).

Листья морошки имели сложный возрастной ход дыхания с двумя максимумами (начало цветения и начало плодоношения). Мы связываем временное падение дыхательной способности листьев в середине вегетации (конец цветения) с физиологическими особенностями развития рамет, а

3500 3000 2500

2000

О И 1500

и 1000

I 500

о г

Í а А 0

О у

V В я 2 2000

i Jff 1S00

а Ф г* 1600

9 1400

К

1200

1000

S00

600

-too

200

А

4н

а

+

1

20

30

40

50

£0

y = 2.1x + ««.S г = 0.32 (Р-0.007)

Содфжантуглгеодов. мг г сухойма«ы

именно необходимостью накопления углеводов для реализации генеративной функции (плодообразования) и запасания углерода в подземных побегах.

Процесс старения листьев морошки сопровождался снижением активности ЦП, активность АП изменялась в меньшей степени. Полученные результаты согласуются с представлениями о том, что дыхание молодых органов и тканей связано с ростовыми процессам. Цитохромное дыхание является функцией дыхания роста, тогда как АП относят в основном к функциональной компоненте дыхания поддержания (Florez-Sarasa е. а., 2007; Priault е. а., 2007; Гармаш и др., 2011). На завершающих этапах вегетации в стареющих листьях наблюдали сильные изменения в соотношении путей дыхания: способность ЦП и АП снижалась, а вклад немито-хондриального (остаточного) дыхания увеличивался до 50-60%. Феномен остаточного дыхания исследован недостаточно. Его связывают с активностью цитозольных оксидаз (см.Джеймс, 1956), РНК-аз и ДНК-аз (Сытник и др., 1978), липоксигеназ (Pinot, Beisson, 2011; Топоркова и др., 2013) и ферментов, участвующих в разрушении хлорофилл-белковых комплексов (Grennan, Ort, 2013). Повышение вклада Vra в листьях морошки в конце вегетации, по нашему мнению, связано с процессами гидролиза и окисления, которые происходят при деструкции компонентов клетки и, возможно, с усилением синтеза антоцианов и других фенольных соединений, которые накапливаются в стареющих листьях морошки в значительных количествах (Захожий и др., 2012). В литературе приводятся данные, подтверждающие связь между увеличением активности Vrea и накоплением фенольных соединений в листьях Salvinia minima при адаптации к неблагоприятным условиям среды (Prado е. а., 2013).

Изменения общего дыхания и способности дыхательных путей не были прямо связаны с динамикой содержания растворимых Сахаров в листьях морошки приземистой. В фазу вегетативного роста, когда интенсивность дыхания была довольно высокой, в листьях растений содержалось минимальное количество растворимых углеводов (около 15 мг/г). В конце фазы цветения при максимальном содержании неструктурных Сахаров (75-80 мг/г), скорость дыхания листьев была низкой. Снижение общего дыхания и активности ЦП в конце вегетации совпадало с уменьшением количества Сахаров в листьях, что, скорее всего, было обусловлено их оттоком, чем использованием в качестве дыхательного субстрата. Старение листьев характеризовалось сильным снижением, в 2.0-2.5 раза, количества фотосинтетических пигментов. Снижение концентрации Хл и начало разрушения хлоропластов считается одним из первых признаков начала процессов старения (Zapata е. а., 2005; Zimmermann, Zentgraf, 2005; Guiboileau е. а., 2010, Zhang е. а., 2011; Grennan, Ort, 2013).

Длительное затенение растений не оказало влияния на динамику дыхания и соотношение дыхательных путей в листьях морошки. Не изменялся качественный состав пула растворимых углеводов, фотосинтетических пигментов. Это свидетельствует о широкой экологической норме реакции листьев данных растений по отношению к световому фактору. Можно полагать, что характер изменения дыхания и соотношения дыхательных путей в большей мере контролировались онтогенетическими факторами внутренней природы, чем условиями внешней среды. Анализ с применением MANOVA и критерия Уиллкса показал, что на скорость дыхания статистически значимо влияли уровень освещенности (Р = 0.003) и возрастное состояние растений (Р = 0.000005), но возраст растений оказывал влияние в большей степени. Динамика дыхания и соотношение дыхательных путей не зависели от световых условий.

Таким образом, динамика общего дыхания и соотношения дыхательных путей в листьях растений Л. скатаетогиз, длительно экспонируемых к разной освещенности, обусловлена возрастными изменениями. Снижение дыхания в процессе старения листьев не связано с уменьшением количества Сахаров как дыхательного субстрата. Основной вклад в поглощение 02 стареющих листьев морошки вносило остаточное дыхание, обусловленное работой немитохондриальных оксидаз.

4.3. Дыхание, соотношение дыхательных путей и другие физиолого-биохимические характеристики листьев растений ПуЫЬеЫрМит МркуИит при разной освещенности

Листья очитка пурпурного характеризовались довольно высокой скоростью поглощения 02, несмотря на их суккулентную природу. Максимальные величины интенсивности дыхания доходили до 2700 нмоль 02/(г мин.). Это эквивалентно 4-5 мг С02/г ч, что свойственно активно дышащим растениям (Головко, 1999). Такие же данные были получены для листьев очитка ранее (Головко и др., 2007).

В период вегетативного роста листья верхнего яруса световых и теневых растений дышали интенсивней листьев нижнего яруса. В фазу цветения различия в скорости дыхания между листьями верхнего и нижнего ярусов уменьшались и нивелировались в фазу плодоношения. Исчезновение градиента дыхания листьев от верхушки побега к основанию с возрастом растений вполне закономерно (Головко, 1999). В фазу вегетативного роста в верхних листьях очитка продолжались ростовые процессы, требующие энергетических затрат для образования и активного обновления структур, тогда как более зрелые нижние листья выполняли донорную функцию. В период цветения и плодоношения в зрелых листьях верхнего яруса функциональная компонента дыхания поддержания превалировала над дыханием роста.

Установлено, что световые условия произрастания не оказали влияния на онтогенетический ход дыхания и соотношение дыхательных путей в листьях растений. Вместе с тем, в фазу вегетативного роста и цветения листья Т-растений дышали активней, листьев С-растений. Однако верхние и нижние листья С- и Т-растений значимо не отличались по доле АП в общем дыхании и, в целом, характеризовались высокой способностью к транспорту электронов с участием АОХ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Неослабный интерес фитофизиологов к дыханию обусловлен его фундаментальным значением для устойчивой жизнедеятельности растений. В настоящее время сформировано представление о функциональных составляющих дыхания, дыхательном метаболизме и путях транспорта электронов в растительных митохондриях. Однако вопросы регуляции функциональной активности и соотношения компонентов дыхательной сети все еще остаются не до конца понятыми.

Основной целью нашей работы было выявить закономерности изменения дыхания листьев при адаптации растений к световым условиям обитания. Эта проблема считается одной из наиболее актуальных в связи со значением света для растения как автотрофного организма. Дыхание играет немаловажную роль в клетках фотосинтезирующих органов растений на свету, а поддержание баланса между двумя основополагающими процессами — фотосинтезом и дыханием является основой адаптации растений в

ответ на воздействие стрессовых факторов. Появились сведения в пользу гипотезы об участии митохондриального дыхания в создании оптимальных условий для функционирования фотосинтетического аппарата при изменении световых условий. Считается, что вовлечение АП способствует окислению избытка восстановительных эквивалентов, образовавшихся на интенсивном свету в ЭТЦ хлоропластов, и предотвращает накопление АФК в клетках. В большинстве случаев активация АП наблюдалась на фоне повышения содержания дыхательного субстрата - углеводов.

В опытах на зеленеющих проростках пшеницы нами установлено, что синхронные изменения скорости общего дыхания и дыхания по альтернативному пути происходили на фоне постоянного снижения содержания растворимых углеводов. Вклад АП в общее дыхание на начальных этапах деэтиоляции составлял 20-25%, а на более поздних достигал 50%. Обнаружена прямая связь цитохромного пути, энергетически обеспечивающего ростовые процессы, с количеством углеводов, являющихся источником С-скелетов и субстратом для окислительных превращений в процессе дыхания. Изменения способности АП не подчинялись линейной зависимости. Можно предположить, что изменения АП были связаны с процессами регуляции редокс-баланса и создания оптимальных условий для формирования фотосинтетического аппарата. Экспериментальное подтверждение взаимодействия пластид и митохондрий в клетках первого листа зеленеющих проростков пшеницы представлены в работе (Garmash е. а., 2013). Установленные нами закономерности изменения дыхания в зеленеющих проростках согласуются с приводимыми в литературе данными, полученными на проростках риса и сои (RibasCarbo е. а., 2000; Feng е. а., 2007).

В литературе мало информации об изменении дыхания и соотношения дыхательных путей при адаптации растений природной флоры к световому режиму местообитаний (Kumar е. а., 2007). Нами проведено сравнительное изучение дыхания листьев двух видов растений в условиях естественного освещения и при двукратном уменьшении освещенности. Установлено и статистически обосновано, что изменения дыхательной активности и вовлечение альтернативного пути дыхания в листьях умеренно светолюбивых растений Hylotelephium triphyllum и Rubus chamaemorus в большей мере контролируются внутренними факторами, чем внешними условиями, и не зависят от фонда растворимых углеводов. Вклад альтернативного (цианидустойчивого) дыхания варьировал от 25 до 50% в зависимости от возраста листа и фазы развития растений. Старение листьев сопровождалось снижением их дыхательной активности, повышением вклада не-фосфорилирующего альтернативного пути и немитохондриального (остаточного) дыхания.

Снижение поступления солнечного света к растениям на 50% приводило к уменьшению скорости поглощения 02 в функционально активных листьях Rubus chamaemorus на 25-30%, тогда как у листьев Hylotelephium triphyllum отмечали повышение дыхательной активности в среднем на 25%. При этом изменение уровня освещенности не оказывало существенного влияния на соотношение дыхательных путей. Это свидетельствует о поддержании устойчивого функционирования дыхательной системы листьев при длительной адаптации растений к световым условиям произрастания.

выводы

1. Выявлены закономерности изменения дыхания и вовлечения альтернативного пути транспорта электронов в первом листе проростков пшеницы в процессе деэтиоляции на непрерывном свету. Установлено, что максимум поглощения 02, наблюдаемый после 6 ч зеленения, обусловлен повышением активности альтернативного пути дыхания. Вклад АП в общее дыхание в первые часы зеленения не превышал 20%, на более поздних этапах достигал 50%. Вовлечение АП происходило на фоне снижения содержания растворимых углеводов, что указывает на сложный характер зависимости дыхания от содержания дыхательного субстрата.

2. Выявлены возрастные изменения дыхания и дыхательных путей в листьях Дмбмв скатаетогив в условиях естественного освещения и при длительном затенении. Снижение освещенности вдвое от естественного уровня приводило к снижению поглощения 02 в листьях на 25-30%, но не оказало существенного влияния на динамику дыхания и соотношение дыхательных путей. В функционально зрелом листе превалировал цитохром-ный путь дыхания. Вклад альтернативного пути варьировал от 25 до 45% в зависимости от возраста листа и фазы развития растений. Старение листьев сопровождалось снижением дыхательной активности и увеличением вклада немитохондриального дыхания до 50-60%. Не выявили прямой связи между динамикой дыхания листьев и содержанием растворимых углеводов в процессе роста и развития растений.

3. Установлены закономерности изменения дыхания листьев НуШе1е-рЫит МрНуИит в зависимости от возраста, положения на стебле и фазы развития растений. В сухом и теплом году максимум дыхательной активности листьев наблюдался в фазу вегетативного роста, в более прохладном и влажном - смещался к фазе цветения. Дыхание листьев верхнего яруса было на 10-15% активней по сравнению с листьями нижнего яруса. Листья очитка характеризовались сравнительно высокой способностью к альтернативному пути дыхания. Его вклад увеличивался по мере роста и развития растений и достигал 50-60% к фазе плодоношения.

4. Дыхательная активность листьев растений НуШе1ерМит МрНуЫит, культивируемых на полном солнечном свету была на 25% ниже, чем у растений, получавших вдвое меньше световой энергии. Листья затененных растений дольше сохраняли повышенную скорость дыхания и способность к вовлечению альтернативного пути по сравнению со световыми растениями. Листья световых растений быстрее теряли хлорофилл и накапливали антоцианы. Изменения дыхания и содержания растворимых углеводов носили независимый характер.

5. В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что изменения дыхания и вовлечение альтернативного пути контролируются внутренними факторами в большей степени, чем внешними условиями. Изменение освещенности не приводило к существенному нарушению соотношения дыхательных путей, что свидетельствует о поддержании устойчивого функционирования дыхательной системы листьев при длительной адаптации растений к световым условиям произрастания. В долгосрочных экспериментах дыхание и вовлечение альтернативного пути слабо зависело от модуляции фонда неструктурных углеводов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В журналах, рекомендованных ВАК:

1. Шелякин М.А. Функциональные характеристики листьев растений Hylotelephium triphyllum (Haw.) при разной освещенности // Известия Самарского НЦ РАН. 2012. Т. 14. № 1 (9). - С. 2313-2315.

В других изданиях:

2. Шелякин М.А. Дыхание проростков пшеницы сорта «Иргина» при деэтиоляции // Актуальные проблемы биологии и экологии: Матер, докл. XVIII Всерос. молод, научн. конф. Сыктывкар, 2011. - С. 278-281.

3. Шелякин М.А., Коковкина Е.В. Антиоксидантная роль альтернативного дыхания при деэтиоляции листа пшеницы // Актуальные проблемы биологии и экологии: Матер, докл. XIX Всерос. молод, научн. конф. Сыктывкар, 2012. - С. 258-260.

4. Шелякин М.А. Физиологические аспекты дыхания стареющих листьев Rubus chamaemorus L. // Третья Школа-конференция молодых ученых Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 29 октября - 1 ноября 2012 г.). Уфа, 2012. - С. 121-123.

5. Головко Т.К., Захожий И.Г., Далькэ И.В., Малышев Р.В., Шелякин М.А., Коковкина Е.В. Ультрафиолетовая радиация и ее воздействие на растения и экосистемы // Биодиагностика состояния природных и природно-техногенных систем: Матер. X Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. Киров: ООО «Любань», 2012. Кн. 1. - С. 166-169.

6. Гармаш Е.В., Шелякин М.А., Малышев Р.В., Головко Т.К. Фотосинтез, дыхание и соотношение дыхательных путей в процессе деэтиоляции проростков пшеницы // Физиология растений и микроорганизмов - взгляд в будущее: Матер, докл. Всерос. научн. конф. Томск, 2013. - С. 57-58.

7. Шелякин М.А. Дыхание и его компоненты в зрелых и стареющих листьях морошки приземистой (Rubus chamaemorus L.)// Молодежь и наука на Севере: Матер, докл. II (XVII) Всерос. молод, научн. конф. Сыктывкар, 2013. Т. 1. - С. 152-153.

8. Шелякин М.А. Вовлечение альтернативного (цианидустойчивого) пути дыхания в листьях Hylotelephium triphyllum при разной освещенности // Инновационные направления современной физиологии растений: Тез. докл. Всерос. науч. конф. с междунар. участием. М., 2013. - С. 350.

В печати:

9. Гармаш Е.В., Малышев Р.В., Шелякин М.А., Головко Т.К. Активность дыхательных путей и фонд неструктурных углеводов в листе зеленеющих проростков яровой пшеницы // Физиология растений. 2014. Т. 61. № 2.

У

Лицензия № 19-32 от 26.11.96 г. КР 0033 от 03.03.97 г.

Тираж 100 Заказ 21(13)

Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН 167982, г. Сыктывкар, ул. Коммунистическая, д. 28

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шелякин, Михаил Анатольевич, Сыктывкар

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ КОМИ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

04201454001

Шелякин Михаил Анатольевич

ВЛИЯНИЕ СВЕТА НА ДЫХАНИЕ И СООТНОШЕНИЕ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ В ЛИСТЬЯХ РАСТЕНИЙ

(03.01.05 - физиология и биохимия растений)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Т.К. Головко

Сыктывкар 2013

Список сокращений:

ФСА - фотосинтетический аппарат

ГТВК - пировиноградная кислота

АТФ - аденозинтрифофат

АДФ - аденозиндифосфат

НАДН - никотинамиддинуклеотид фосфат

ФАДН2 - флавин аденин динуклеотид

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот

ЭТЦ - электрон-транспортная цепь

АФК - активные формы кислорода

ПОЛ - перекисное окисление липидов

АП - альтернативный путь дыхания

ЦП - цитохромный путь дыхания

БГК - бензгидроксамовая кислота

СГК - салицил гидроксамовая кислота

KCN - цианид калия

NaN3 - азид натрия

Rt - общее дыхание

AjiH+ - потенциал градиента движения протонов

АОХ - альтернативная оксидаза

ЦО - терминальная цитохром оксидаза

Wtotal - способность общего дыхания

Wcyl - способность цитохромного пути дыхания

Wait - способность альтернативного пути дыхания

Wres - способность остаточного дыхания

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................................4

ГЛАВА 1. РОЛЬ ДЫХАНИЯ В ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ РАСТЕНИЙ

(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) .............................................................................................................6

1.1. Дыхание растений как источник метаболитов и энергии .................................................6

1.2. Дыхательная сеть растительной клетки..............................................................................9

1.3.Связь дыхания с процессами роста и развития

(онтогенетический аспект) ........................................................................................................16

1.4. Зависимость дыхания от внешних факторов....................................................................23

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................................37

2.1. Характеристика объектов исследования и условия проведения эксперимента............37

2.2. Методы изучения дыхания.................................................................................................44

2.3. Определение содержания растворимых углеводов, фотосинтетических

пигментов и антоцианов ...........................................................................................................51

2.4. Статистическая обработка данных....................................................................................52

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ..........................................................................................................53

3.1 Динамика дыхания и соотношения дыхательных путей

в зеленеющих проростках яровой пшеницы ...........................................................................53

3.2. Физиолого-биохимические характеристики листьев растений КиЬиб сЪатаетогт

при длительном затенении ........................................................................................................57

3.3. Физиолого-биохимические характеристики листьев растений НуШекрЫит МркуПгтг, культивируемых при разной освещенности ............................................................................67

ГЛАВА 4. РОЛЬ ДЫХАНИЯ И ЕГО КОМПОНЕНТОВ В АДАПТАЦИИ ЛИСТЬЕВ РАСТЕНИЙ К СВЕТОВЫМ УСЛОВИЯМ ПРОИЗРАСТАНИЯ

(ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ)...........................................................................................76

4.1. Изменение дыхательной активности и соотношения дыхательных путей

в первом листе проростков яровой пшеницыв процессе деэтиоляции.................................77

4.2. Влияние длительного затенения на физиолого-биохимические характеристики листьев растений КиЬш скатаетогт.......................................................................................81

4.3. Дыхание, соотношение дыхательных путей и другие физиолого-биохимические характеристики листьев растений НуШе1ерЫит ичркуНит

при разной освещенности..........................................................................................................88

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ..........................................................................................................................93

ВЫВОДЫ ....................................................................................................................................96

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................................98

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Свет - ведущий фактор внешней среды, к которому адаптируются все растительные организмы. Является источником энергии для осуществления фотосинтеза. Запускает процесс фотоморфогенеза, контролирует экспрессию множества генов, взаимодействует с сигнальными системами, участвует в регуляции метаболизма растительных клеток (Карначук и др., 2001; Кулаева, 2001).

Довольно долго проблема влияния света на дыхание рассматривалась через «призму» процесса фотосинтеза. Дыхание снабжает клетки теми же продуктами, что и фотосинтез (АТФ, восстановительные эквиваленты, углеродные скелеты), но по интенсивности оно намного уступает фотосинтезу. Представление о дыхании в фотосинтезирующей клетке менялись от отрицания возможности темпового дыхания на свету (Заленский, 1957; Heber, 1974) или его частичном ингибировании (Мамушипа и др., 1997) до активации дыхания светом (Мурей, 1984; Чмора и др., 1992; Atkin е. а., 2000). Позже преобладающим стало мнение, что процессы фотосинтеза и дыхания у фототрофных тканей на свету тесно скоординированы (Семи-хатова, 1982, 2000). Поддержание баланса между процессами фотосинтеза и дыхания служит основой адаптации растений (Головко, 1983; Рахманкулова и др., 2013). Изменения углеводного статуса и редокс-состояния фотосинтезирующей клетки влияют на экспрессию генов и активность дыхательных ферментов (Rasmusson, Escobar, 2007). В экспериментах па мутантных растениях и зеленеющих проростках показано вовлечение энергетически малоэффективного альтернативного пути дыхания (АП) на свету. Полагают, что АП участвует в окислении избытка восстановителей, поступающих из хлоропластов, и защите фотосинтетического аппарата от фотодеструкции (Raghavendra, Padmasree, 2003; Noguchi, 2005; Yoshida, 2007; No-guchi, 2008; Xu e. a., 2011; Zhang e. a., 2011; Zhang e. a. 2012). Ведутся исследования по установлению механизмов активации альтернативной оксидазы (АОХ) светом (Ribas-Carbo е. а., 2008; Zhang е. а., 2010).

Однако остается неясным, в какой мере эффекты света на дыхание проявляются у растений в природе при длительной адаптации к световым условиям обитания.

Комплексный эколого-физиологический подход исследования растений из природных биоценозов позволяет не только уточнять закономерности, выявленные в лабораторных условиях, но и углубить понимание механизмов регуляции процессов жизнедеятельности при взаимодействии растений со средой (Заленский, 1977).

4

Данная работа выполнена для уточнения и расширения существующих представлений о механизмах адаптации растений к условиям разной освещенности, выявления возможной физиологической роли дыхания и его компонентов на основе экспериментов, проведенных па листе,ях растений, произраставших в контролируемых и естественных условиях в разные периоды их роста и развития.

Цель и задачи исследования

Целыо работы было выявить закономерности изменения дыхания и соотношения дыхательных путей в листьях при адаптации растений к световым условиям обитания.

В задачи работы входило:

1. Дать характеристику дыхания и изучить вовлечение альтернативного пути дыхания при зеленении проростков пшеницы в контролируемых условиях.

2. Выявить возрастные изменения дыхания и дыхательных путей в листьях Rabus chamaemorus в условиях естественного освещения и при длительном затенении растений.

3. Провести сравнительное изучение дыхания и соотношения дыхательных путей в листьях растений Hylotelephium Iriphyllum, культивируемых при разной освещенности.

4. Определить содержание растворимых углеводов в листьях и проанализировать связь дыхания с углеводным статусом исследуемых растений.

Работа выполнена в лаборатории экологической физиологии растений Института биологии Коми научного центра УрО РАН в период прохождения курса аспирантуры (2010-2013 гг.) и является разделом плановой темы НИР «Физиолого-биохимические механизмы адаптации растений к неблагоприятным воздействиям природных и антропогенных факторов» (№ ГР 01201150200), поддержана фантами УрО РАН № 12—С—4—1015 и № 12-У-4-1008.

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д.б.н., проф. Т.К. Головко. Сотрудникам лаборатории экологической физиологии растений, в особенности к.б.н. Е.В. Гармаш. Выражаю признательность сотрудникам отдела лесобиологических проблем Севера М.Н. Мигловцу и O.A. Михайлову за помощь при отборе образцов растений морошки приземистой и предоставление данных по микроклиматическим условиям па территории болота «Мэдла-Пэв-Нюр».

ГЛАВА 1. РОЛЬ ДЫХАНИЯ В ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ РАСТЕНИЙ

(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Дыхание растений как источник метаболитов и энергии

Дыхание - одно из важнейших условий и проявлений жизни. Его изучению посвящено немало работ. Вместе с тем, менялось и представление о самом содержании процесса дыхания, его границах и взаимоотношении с общим обменом веществ, связи с основными физиологическими функциями и зависимости от состояния организма. IIa протяжении истории физиологии растений большее значение исследователями уделялось процессу фотосинтеза, и только в последнее время возникла необходимость использовать показания дыхания при анализе реакции растений в ответ на изменение условий среды (Семихатова, 1982, 2000).

Дыхательная сеть растений, сформировавшаяся и закрепившаяся в ходе эволюции, сложна и многокомпонентна. Дыхательные пути компартментированы в органеллах и цитоплазме. Первый этап дыхания — гликолиз — протекает в цитоплазме. Это процесс анаэробного распада глюкозы до образования ПВК. Гликоли-тическое окисление одной молекулы глюкозы дает 2 молекулы ПВК, 2 молекулы АТФ и 2 молекулы ПАДН. IIa в юром этапе ПВК проникает в митохондрии, где вступает в цикл ди- и грикарбоновых кислот (цикл Кребса). При полном окислении в цикле Кребса одной молекулы Г1ВК образуются соединения с высоким восстановительным потенциалом - ПАДН (4 молекулы), ФАДН2 (1 молекула) и 1 молекула АТФ. На заключительном этапе дыхания восстановительные эквиваленты окисляются с образованием энергии в ЭТЦ митохондрий.

Потенциально возможное образование энергии при окислении одной молекулы глюкозы составляет 36 молекул АТФ (с учетом использования двух молекул при активном транспорте ПАДИ в митохондрии) (Головко,1999 [с. 7 - 14]).

Электрон-транспортная цепь растительных митохондрий

Основной процесс, происходящий в митохондриальной электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) - синтез АТФ. Образование АТФ происходит за счет обратного тока протонов по градиенту своего потенциала (A|uHf) через внутреннюю мембрану митохондрий и связан с потоком электронов от доноров - восстановительных эквивалентов (НАДН и ФАДП2) по системе трансмембранных белков и переносчи-

ков к акцептору (Ог). Переносчики расположены по своему окислигельно-восста-новителыюму потенциалу в порядке возрастания от донора (НАДИ, Е°' = -0.32 В) к акцептору (Ог, Е°" = +0.82 В). Транспорт электрона на всём протяжении цепи протекает самопроизвольно (Физиология растений..., 2005).

В настоящее время усыновлены последовательность переносчиков в дыхательной цепи и ошосительное расположение точек входа электронов в цепь (Ьат-Ьегэ, ШЬаз-СагЬо, 2005; Войников, 2013). Дыхательная цепь включает два десятка переносчиков и других белков. Основная ЭТЦ растительных митохондрий (рис. 1) состоит из 4-х трансмембранных белковых мультиферментных комплексов, двух небольших по молекулярной массе лабильных компонентов - убихинона и цито-хрома с, выполняющих функцию переносчиков электронов между комплексами. За систему синтеза АТФ ответственна АТФаза.

External NADH dehydrogeneses

4 Н* 2Н* ЗН'

Matrix

InternafNADH dehydrogeneses

/Т\

ADP 4, ATP

ATP synthase

Рис. 1. Схема электронтранспортной цепи на внутренней мембране митохондрии растения (рисунок по: Taiz, Zeiger, 2002 с модификациями Garmash, 2014).

Комплекс I (НАДТ12-убихинон-оксидоредуктаза) - первый участок вытеснения протонов в межмембранное пространство митохондрий. Связан с синтезом АТФ. Осуществляет перенос электронов от НАДН к убихипону ((2), при этом в межмембранное пространство поступает 411+.

Комплекс II (ФАД-зависимая сукцинат-убихинон-оксидоредуктаза) функционирует как часть цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) и как компонент дыхательной цепи. Электронный транспорт от сукцината к С через комплекс не сопровождается генерацией ДрН+.

Комплекс III (убихинол-цитохром с-оксидоредуктаза) - второй участок вытеснения протонов, он переносит электроны от убихинона на цитохром с, вытесняя 4 11+ на пару электронов через межмембранное пространство.

Комплекс IV (цитохром с-кислород-оксидоредуктаза) - терминальная окси-даза цитохромного пути. Принимает электроны от цитохрома с и 07дает их кислороду. Этот комплекс также генерирует протондвижущую силу, что делает его третьим сайтом вытеснения 2 Н\

АТФ-синтетаза состоит из девяти различных полипептидов. Комплекс содержит каталитический компонент (Fi), гидрофобные нолипептиды, погруженные в мембрану (F0), и белок, обеспечивающий чувствительность к олигомицииу с молекулярной массой 18 кДа, соединяющий эти две части.

Механизмы использования протонного электрохимического потенциала АТФ-сингетазой для образования АТФ до конца не ясны. Согласно одной из гипотез, синтез АТФ из АДФ и Фц происходит за счет ротационного механизма работы фермен та (Boyer, 1997), когда протоны переносятся за счет энергии Др1-Г через F0b активный центр Fi, в котором происходит спонтанное образование АТФ за счет конформационных перестроек. Энергия ДрТГ используется не для синтеза АТФ, а для освобождения АТФ из активного центра.

По представлениям других исследователей протоны через F0 поступают в активный ценр Fi и вступают во взаимодействие с кислородным атомом в фосфате. Образующееся при этом очень реакционноспособиое производное Pi взаимодействует с АДФ, образуя АТФ (Mitchell, 1974; Войников, 2013).

Итак, при передаче электронов от НАДН по ЭТЦ в межмембрапное пространство перекачивается 10 протонов. Освобождаемая свободная энергия используется для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата (Фц)- Синтез АТФ сопряжен с обратным потоком протонов (за счет созданного на мембране AjiH+, являющегося протондвижущей силой) из межмембранного пространства в матрикс. Считается, что перенос пары электронов по полной цепи (через все комплексы, работающие как протонные помпы - I, III и IV) приводит к синтезу трех молекул АТФ. Для синтеза одной молекулы АТФ достаточно 311+. Молекула АТФ как универсальный источник энергии заключает около - 60 кДж/моль (при гидролизе АТФ

с отщеплением двух остатков фосфорной кислоты) (Шугаев, 1999; Lambers, Ribas-Carbo, 2005; Войпиков, 2013).

1.2. Дыхательная сеть растительной клетки

Дыхательная сеть растительных митохондрий устроена сложнее и многообразнее, в отличие от животных. Наличие дополнительных пефосфорилирующих путей (внешних НАД(Ф)Н дегидрогеназ, альтернативного пути транспорта электронов через АОХ и разобщающих белков) в ЭТЦ растительных митохондрий делает ее пластичнее и устойчивее к воздействию стрессовых факторов (Головко, 1999; Lambers, Ribas-Carbo, 2005; Van Dongen е. а., 2011)

В целом, общее поглощение кислорода растительными тканями может быть представлено следующим уравнением (Moller е. а., 1988):

У total = У al, I" Vcyt + V rest (1)

где Wtota¡ - общее дыхание. VC)l - дыхание, идущее по основному энергетическому пути через цигохром оксидазу (ЦП), V„/; - способность альтернативного пути дыхания, Уres - остаточное дыхание.

АП - путь устойчивый к действию цианида, поэтому назван цианидустойчи-вым (альтернативным). Транспорт электронов через альтернативную оксидазу (АОХ) минует два участка генерации мембранного потенциала (комплексы III и IV). Лишь при окислении эндогенного НАДН градиент протонов может устанавливаться в комплексе I. Основная часть энергии диссипирует в виде тепла, поэтому АП считают энергетически малоэффективным путем дыхания (Siedow, Berthlod, 1986; Mcintosh, 1994; Vanlerberghe, Mcintosh, 1997; Lambers, Ribas-Carbo, 2005).

АП выявлен у растений, некоторых грибов (Neurospora crassa, Hansemila anómala), мхов, папоротников и даже одноклеточных простейших животных (Eiig-lena gracilis, Acanthamoeba castellana, Paramecium íetraurelia) (Sharpless, Butov, 1970; Vanderleyden e. a., 1980; Doussiere; Vignais, 1984; Jarmuszkievicz e. a., 2001). У простейших одноклеточных организмов, как и у растений, цианидустойчивый путь дыхания может регулировать энергетический баланс клеток через соотношение НАДИ / НАД4, участвовать в процессах, предотвращающих образование избытка опасных для организмов активных форм кислорода (АФК). Полагают, что основ-

ной функцией АП в клетках грибов и простейших является адаптация к низким температурам путем термогенеза (Jarmuszkievicz с. а., 2001).

У растений энергетически малоэффективный альтернативный путь дыхания был выявлен в 30-х годах прошлого века (Okunuki, 1932, 1939; Van Herk, 1937, цит. по Meeuse, 1975). После идентификации белка АОХ (Rich, 1978; Elton, Mcintosh, 1986) началось изучение его свойств. Установлено, что АОХ растений кодируется небольшим семейством ядерных генов, которое делится на два подсемейства Аох 1 и Аох2 (Mcintosh, 1994). Причем гены обоих подсемейств обнаружены только у двудольных растений, тогда как у однодольных выявлены ген