Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная организация гена аланин-богатого белка холодового шока капусты Brassica oleracea

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Баймиев, Андрей Ханифович, Уфа

f fyf* ? j JT**^ i

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УФИМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ОТДЕЛ БИОХИМИИ И ЦИТОХИМИИ

На правах рукописи

БАЙМИЕВ Андрей Ханифович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНА АЛАНИН-БОГАТОГО БЕЛКА ХОЛОДОВОГО ШОКА КАПУСТЫ

BRASSICA OLERACEA

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

(03.00.12. - физиология растений)

Научный руководитель: Канд. биол. наук, ст. научный сотрудник Ф.Р.Гималов

Научный консультант: Доктор биологических наук, профессор, академик АН РБ В.А.Вахитов

Уфа - 1999

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1.1. Развитие неспецифической ответной реакции 9 растений на стрессовый фактор

1.2. Действие низких положительных и отрицательных 12 температур на растения

1.З.. Функции белков холодового шока 22

1.4. Регуляция экспрессии индуцируемых холодом генов 34 растений

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 43

2.1. Объекты исследования .43

2.2. Выделение и очистка ДНК растений 44

2.3. Выделение РНК растений 46

2.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК 46

2.5. Выделение и очистка одноцепочечной фагмидной 49

ДНК

2.6. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами 50

2.7. Аналитический гель-электрофорез ДНК в 51 неденатурирующих условиях

2.8. Препаративный гель-электрофорез ДНК в 53 неденатурирующих условиях

2.9. Полимеразная цепная реакция 54

2.10. Элюция ДНК из агарозных и полиакриламидных 55

гелей

2.11. Перенос ДНК из агарозных гелей на мембранные 57

фильтры (блоттинг)

2.12. Нозерн-блот и дот-блот анализ РНК 58

2.13. Радиоактивное мечение препаратов ДНК 59

2.14. Блот-гибридизация ДНК 61

2.15. Трансформация компетентных клеток Е.соИ 62 плазмидной ДНК

2.16. Секвенирование ДНК ферментативным методом 63

2.17. Электрофоретическое фракционирование ДНК в 65 денатурирующих условиях

2.18. Компьютерный анализ нуклеотидных 67 последовательностей

2.19. Реактивы 67

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ 71

ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Клонирование гена белка холодового шока капусты 71

3.2. Распространенность генов, подобных гену БХШ 79 капусты, в геномах растений различных семейств

3.3. Вариабельность генов БХШ растений семейства 80 крестоцветных

3.4. Экспрессия гена аланин-богатого белка капусты при 84 различных условиях холодовой акклимации

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 92

ВЫВОДЫ 94

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 96

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Аминокислоты: Ala (А) - аланин Arg (R) - аргинин Asn (N) - аспарагиновая кислота Asp (D) - аспарагин Cys (С) - цистеин His (H) - гистидин Ile (I) - изолейцин Gin (Q) - глутаминовая кислота Glu (Е) - глутамин Gly (G) - глицин Leu (L) - лейцин Lys (К) - лизин Met (M) - метионин Phe(F) - фенилаланин Pro (P) - пролин Ser (S) - серин Thr (Т) - треонин Trp (W) - триптофан Туг (Y) - тирозин Val (V) - валин

Нуклеотиды: дАТФ - дезоксиаденозинтрифосфат дГТФ - дезоксигуанозинтрифосфат дТТФ - дезокситимидинтрифосфат дЦТФ - дезоксицитозинтрифосфат дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат

ддАТФ - дидезоксиаденозинтрифосфат ддГТФ - дидезоксигуанозинтрифосфат ддТТФ - дидезокситимидинтрифосфат ддЦТФ - дидезоксицитозинтрифосфат ддНТФ - дидезоксинуклеотидтрифосфат

А.к.о. - аминокислотные остатки АБК - абсцизовая кислота ДТТ — дитиотрейтол пн - пара нуклеотидов тпн - тысяча пар нуклеотидов ПЭГ - полиэтиленгликоль ТАЕ - трис-ацетатный буфер ТЕ - трис-буфер

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота 1РТО - изопропил-|3-В-галактозидаза ЬВ-среда - среда Лурия-Бертани БОБ - додецилсульфат натрия

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Исследование механизмов реализации устойчивости ценных сельскохозяйственных культур к гипотермии является одной из важнейших проблем современной физиологии растений, поскольку известно, что резкое изменение погодных условий, в частности, понижение температуры, достаточно характерно для нашего региона. Многие виды растений приобретают способность переносить значительное понижение температуры окружающей среды, если они предварительно проходят период так называемого закаливания, во время которого в клетках растений наблюдаются различные биохимические изменения, вызванные, в свою очередь, индукцией определенных генов (Касперска-Палач, 1983). В последние годы большое внимание уделяется исследованиям, направленным на выяснение изменений в экспрессии генов, обусловленных воздействием холодового шока. Низкотемпературная индукция генов показана для многих растений, таких, как пшеница (Guo et al., 1992), ячмень (Cattivelli, Bartels, 1990), шпинат (Neven et al., 1993), люцерна (Laberge et al., 1993), арабидопсис (Kurkela, Frank, 1990; Nordin et al., 1991; Lin, Tomashow, 1992; Yamaguchi-Shinozaki, Shinozaki, 1994), рапс (White et al., 1994) и ряда других. Экспрессия некоторых из этих генов носит специфический характер, поскольку вызывается только низкой температурой (Weretilnik, 1993). В то же время другие гены индуцируются, наряду с холодом, также и дегидратацией, солевым стрессом, обработкой абсцизовой кислотой (Kurkela, Frank, 1990; Yamaguchi-Shinozaki, Shinozaki, 1994; Dunn et al, 1994; Leung et al., 1998). В формирование защитных реакций растений вовлекаются также и некоторые конститутивно экспрессирующиеся белки, синтез и количество которых увеличивается при гипотермии (Shen et al., 1993). К настоящему времени в литературе накопилось немало данных о возможных функциях белков холодового шока, которые отличаются большим разнообразием. Некоторые из этих белков представляют собой ферменты, участвующие в преобразовании физико-химических свойств плазматических мембран, а также в фосфорилировании митохондриальных белков. Другие повышают

стабильность мембран и цитоскелета. Обнаружены антифризные белки, влияющие также на устойчивость к фитопатогенам. Но самую большую группу регулируемых холодом белков составляют гидрофильные белки, имеющие альфа-спиральную структуру и выполняющие криопротекторные функции. Вода, связываемая в виде гидратных оболочек этими молекулами, не замерзает и не транспортируется, оставаясь в клетке. Таким образом клетки защищаются от внутриклеточного льда и чрезмерного обезвоживания. Однако, несмотря на значительное количество исследований, еще не вполне ясно, чем обусловлены различия в холодостойкости разных видов растений и как происходит усиление холодостойкости во время закаливания растения. Решение этих вопросов имеет не только определяющее фундаментальное значение для понимания механизмов управления холодоустойчивостью культурных растений, но и важное прикладное значение.

Цель и задачи исследований. Цель данной работы заключалась в

исследовании структурно-функциональной организации гена белка холодового шока капусты Brassica oleracea и механизмов развития холодового закаливания у растений. В связи с этим, перед нами были поставлены следующие задачи:

1) Клонирование гена белка холодового шока (БХШ) капусты и определение его первичной структуры.

2) Сравнительный анализ генов, подобных гену БХШ капусты, у растений разных видов и семейств.

3) Изучение экспрессии гена БХШ при различных стрессовых условиях.

Научная новизна. Значительная индукция экспрессии клонированного нами гена аланин-богатого белка холодового шока капусты и других видов растений семейства крестоцветных наблюдается не только при гипотермии, но также и при дегидратации и обработке АБК, что позволяет предполагать вовлечение белка, кодируемого этим геном, в развитие универсальной неспецифической реакции на стресс.

Впервые показано, что данный тип генов белков холодового шока характерен только для растений семейства крестоцветных, которые, как известно, отличаются повышенной холодостойкостью. Полученные нами данные углубляют представления о структурно-функциональной организации генов БХШ высших растений и некоторых общих механизмах адаптации растений к неблагоприятным условиям среды.

Практическая значимость работы. Знание молекулярных механизмов развития холодостойкости и закаливания растений может послужить основой для развития новых стратегий ' повышения устойчивости к низким температурам и увеличения продуктивности, а также расширения области возделывания сельскохозяйственных культур.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международной конференции "Molecular biology of plants under environmental stress" (Познань, Польша, 1997); на научной конференции студентов и молодых ученых биологического факультета (БГУ, Уфа, 1997), на VI молодежной научной конференции "Актуальные проблемы биологии" (Сыктывкар, 1999).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в пяти печатных работах, а также депонированы в международных банках данных The EMBL Nucleotide Sequence DataBase и GenBank.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающей 140 названий, в том числе 127 работ иностранных авторов. Работа изложена на 111 страницах и содержит 11 рисунков.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Развитие неспецифической ответной реакции растений на стрессовые факторы

Воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды на растения существенным образом изменяет их метаболизм, вызывая тот или иной стрессовый ответ.

Концепция стресса была сформирована во второй половине 30-х годов канадским ученым Г. Селье . По Селье, стресс - это совокупность всех неспецифических изменений, возникающих в организме под влиянием любых сильных воздействий (стрессоров), включающих перестройку защитных сил организма, увеличивающих сопротивляемость к стрессовым факторам (цит. по Пахомовой, 1995).

В физиологии растений под стрессом подразумевается неспецифическая реакция клетки и организма в целом на экстремальные воздействия. В настоящее время убедительно показано, что у большинства растений под действием самых различных неблагоприятных факторов, как правило, развивается особое состояние - фитостресс. Чаще всего фитостресс проходит через фазы: фазу реакции, фазу адаптации и, наконец, в случае продолжительного губительного действия отрицательных воздействий - фазу гибели (истощение ресурсов надежности, повреждения), в течение которой наблюдаются необратимые деструктивные изменения (Генкель,1979; Урманцев, Гудсков, 1986; Урманцев, Пронина, 1986; Полевой, 1989; Веселова и др., 1990; Жадько, 1991; Пахомова, Пахомов, 1992).

К первичным неспецифическим процессам, происходящим в клетках растений при сильном и быстро нарастающем действии стрессора, относится целый комплекс в той или иной степени однотипных реакций, которые можно отнести к общебиологическим, а именно снижение активности синтетических процессов, деградация белоксинтезирующего аппарата, повышение проницаемости мембран, возрастание гидролитических процессов, активация и синтез стрессовых белков, увеличение синтеза этилена и абсцизовой кислоты, торможение деления и роста клеток и некоторые другие изменения (Блехман, Шеламова, 1992; Тарчевский, 1993; Пахомова, 1995; Глянько, 1996; Hughes, Dunn, 1996). Перечисленные реакции наблюдаются при действии любых стрессов. Если действие стресса не достигает пороговых значений, могут возникать обратимые процессы и формируется устойчивость организма к стрессу (фаза адаптации). После прекращения действия отрицательного фактора возможно восстановление функций организма (фаза реституции и восстановления). При усилении стрессового воздействия до летальных пределов наступает фаза повреждения и гибели. Характерно, что вся последовательность реакций сводится к одному - поддержанию гомеостаза растительного организма в экстремальных условиях. Он обеспечивается сложной и до конца еще не изученной системой механизмов адаптации, направленной на ослабление или устранение повреждающего действия стрессора на растение (Шматько, Григорюк, 1992). О переходе жизненных процессов растительного организма на новый уровень, связанный с выживанием в экстремальных условиях, свидетельствуют данные о синтезе так называемых белков теплового и холодового шока, полиморфизме ферментов, изменении их функциональной активности и свойств,

накоплении в клетках соединений, играющих адаптогенную и протекторную роль.

Факторы, способные вызвать стресс у растительных организмов, можно подразделить на три основные группы: а) физические - недостаточная или избыточная влажность, освещенность или температура, радиоактивные излучения, механические воздействия; б) химические - соли, газы, ксенобиотики; в) биологические - поражение возбудителями болезней или вредителями, конкуренция с другими растениями (Вартапетян, 1985; Полевой, 1989; Пахомова, 1993).

Растительные организмы, в отличие от животных, в большинстве случаев реагируют на стрессор не активацией обмена веществ, а, наоборот, снижением своей функциональной активности. Торможение биосинтетических процессов клеток происходит в результате действия ингибиторов и переключения энергетических ресурсов на преодоление неблагоприятных сдвигов. Механизмы ответной реакции растений на воздействие экологических стрессов разнообразны (Levitt, 1972; Sheel, 1988). Стресс в растительном организме вызывает в первую очередь неспецифические реакции устойчивости (изменения проницаемости мембран, структурированности цитоплазмы, смещение рН, падение мембранного потенциала), затем промежуточные (синтез стрессовых белков, торможение роста, фотосинтеза и др.) и специфические (гипоксия, засухо-, морозо- и солеустойчивость) (Саляев, Кефели, 1988). Ответные реакции растений на стресс включают изменения в росте, фотосинтезе, дыхании, гормональной активности и другие регулируемые на молекулярном уровне, включая генную экспрессию (Vaadia, 1985). Описанные изменения взаимосвязаны, протекают как каскадные саморазвивающиеся процессы и служат пусковым звеном

для включения целой цепи различных обменных реакций, первоначальное предназначение которых заключается в восстановлении исходного состояния клетки (Пахомова, 1995).

В фитофизиологии, так же как и в физиологии животных, различают повреждающий и физиологический (закаливающий) стрессы. При физиологическом стрессе в растениях наблюдаются явления суперкомпенсации: увеличение содержания ДНК и РНК, усиление трансляционной активности полисом, интенсификация синтеза белков, усиление обмена веществ, увеличение активности ряда ферментов, в том числе РНКазной активности, возрастание энергетического уровня и др. (Генкель, 1982; Киль и др., 1991).

Способность растений сопротивляться экстремальным условиям произрастания, приспосабливаться к ним и сохранять при этом свой жизненный потенциал является одним из определяющих условий существования растений и зависит от возможности реализовать защитно-приспособительные механизмы, т.е. адаптироваться к разнообразным стрессовым воздействиям.

1.2. Действие низких положительных и отрицательных температур на растения. Стрессовые белки растений

Температура среды - один из основных экологических факторов, отличающихся очень высокой мобильностью. Для нее характерны суточные, сезонные, годовые колебания. Растения, температура которых, как правило, соответствует температуре окружающей среды, вынуждены приспосабливаться к температурным перепадам, так как тепловой режим среды обитания оказывает существенное действие на их метаболизм, рост, развитие

и продуктивность (Pesci, 1987). Они проявляют различную степень устойчивости к повреждающему действию низких температур.

К морозостойким относятся растения, которые выживают после действия отрицательных температур и образования в них межклеточного льда. Морозостойкость связана с определенной подготовкой к восприятию холода (закаливание растений). Холодостойкие растения выносливы к любым низким положительным температурам, если при этом вода в них остается в переохлажденном состоянии. Теплолюбивые растения не устойчивы не только к отрицательным, но и даже к низким положительным температурам (Дроздов, 1984). Различают еще заморозкоустойчивость - способность выдерживать внезапное кратковременное воздействие отрицательных температур без существенного снижения продуктивности (Глянько, 1996).

Проблема холодоустойчивости остро стоит для теплолюбивых культурных растений, длительный рост которых при низкой положительной температуре невозможен. Например, это касается овощных культур (огурцы, томаты), зерновых (кукуруза), зернобобовых (соя).

По-видимому, основной причиной повреждающего действия низкой положительной температуры на теплолюбивые растения является нарушение функциональной активности мембран из-за перехода насыщенных жирных кислот, входящих в их состав, из жидкокристаллического состояния в состояние геля при низкой температуре (Wilson, Crawford, 1974). Это приводит к неблагоприятным сдвигам в обмене веществ и гибели растения. Так, у растений огурца, погибающего уже при 6°С, причиной необратимых повреждений клеток являются изменения в составе мембранных липидов (Карасев и др., 1995). Важное значение

фазовых переходов липидов при холодовом шоке показано �