Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ СКОРОСТЬ РАЗВИТИЯ У КУЛЬТУРНЫХ ФОРМ BRASSICA

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ СКОРОСТЬ РАЗВИТИЯ У КУЛЬТУРНЫХ ФОРМ BRASSICA"

fi -35393

На правах рукописи

МАРТЫНОВ Виктор Викторович

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ СКОРОСТЬ РАЗВИТИЯ У КУЛЬТУРНЫХ ФОРМ

BRASSICA

Специальность 03.00.03 — Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории ДНК маркеров растений ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Научный руководитель: профессор, доктор биологических наук

Э.Е. Хавкнн

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Т.А. Ежова

доктор биологических наук Г. В. Новикова

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет МСХА им. К.А. Тимирязева

Защита диссертации состоится « 2Z » _2005 г.

в_часов на заседании диссертационного совета Д. 006. 027.01

при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550,

г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 42; тел.: 211-38-10; факс: 977-09-47; e-mail:

iab@iab.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан « /2, » $ 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

С. А, Мелнкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Все процессы, определяющие скорость развития и направление морфогенеза у высших растений, берут свое начало в меристемах, где начинается реализация генетической программы развития, которая заключается в избирательном «включении» одних генов и «выключении» других в строго определенные моменты времени (Лутова и др., 2000; Howell, 1998). Доя нормального развития растительного организма очень важно постоянство поддержания недетерминированной апикальной мсристемы побега, которая образует все наземные органы растения, включая меристемы боковых побегов, листья, меристемы соцветий и флоральные меристемы. В определенные моменты своей жизни растение начинает продуцировать детерминированные ф л оральные меристемы, которые формируют органы цветка, после чего прекращают свое существование. Оба процесса: поддержание недетерминированного состояния меристемы и переход к детерминированному развитию, - определяют скорость развития растения и регулируются на генетическом уровне.

В последние годы у модельного растения Arabidopsis thaliana были

охарактеризованы многие гены, контролирующие скорость развития. Так,

была показана роль генов CLA VA ТА 1-CLA VA ТАЗ и WUSCHEL в

поддержании постоянной структуры апикальной меристемы побега

(DeYoung and Clark, 2001; Schoof et al., 2000), были идентифицированы гены

идентичности флоральной меристемы APETALA], САULJFLOWER и LEAFY

(Sharma and Fletcher, 2002; Fletcher, 2002) и гены-активаторы, продукты

которых стимулируют экспрессию генов идентичности флоральной

меристемы (Boss et al., 2004). Кроме того, были охарактеризованы гены,

которые опосредуют различные сигналы, возникающие внутри

растительного организма (например, гормональные факторы индукции

цветения) и поступающие извне (длина дня и качество света, воздействие

низких температур), которые определяют переход ЩйЕгеИйЖДе цветению

фонд научной литературь

но л-Жш

(Henderson et al., 2003; Boss et al., 2004; FutteriU et at., 2004; Corbesier and Coupland, 2005 ; Michaels et al., 2005).

Однако у культурных растений гены, контролирующие скорость развития и, в частности, переход к цветению, изучены совершенно недостаточно. Большинство методов идентификации новых генов у этих растений исходит из консерватизма структуры, позволяющей использовать гены-прототипы систематически близких растений для анализа геномных библиотек или поиска сходных нуклеотндных последовательностей в генетических базах данных и судить о функции генов по аналогии с уже изученными генами. Такой подход получил название концепции генов-кандидатов (Хавкин, 1998). Фенотипическне проявления скорости развития (например, число междоузлий или число дней до цветения) складываются в результате сложных взаимодействия многочисленных генов друг с другом и с факторами внешней среды и являются, как правило, количественными признаками. Для идентификации генов, контролирующих количественный признак у исследуемого растения в конкретных условиях, фенотипический полиморфизм по этому признаку соотносят с полиморфизмом в строении генов-кандидатов, используя методы генетического и физического картирования.

Исследование строения и функции генов, определяющих скорость развития культурных растений, важно с практической точки зрения как путь создания на основе этих генов ДНК-маркеров ранне/позднеспелости и других признаков, существенных для селекции на продуктивность и качество урожая.

В обширном семействе Brassicaeeae (Hall et al., 2002) к роду Brassica относятся наиболее важные с экономической точки зрения овощные, масличные, пряно-вкусовые и кормовые культуры. По скорости развития растения Brassica представляют широкий спектр форм, от ранних яровых до поздних двулетников.

Цели н задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выделение и сравнительный анализ фрагментов генома растений семейства Brassicaceae, гомологичных важнейшим генам, которые определяют скорость развития у А, thaliana, и использование полученных фрагментов для изучения полиморфизма генов развития у широкого круга хозяйственно ценных форм рода Brassica, чтобы установить связь структурного полиморфизма генов С фенотипическим полиморфизмом форм Brassica по признакам скорости развития, В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. выбрать гены-кандидаты, гомологичные генам, определяющим скорость развития у А. thaliana, получить эти гомологи путем прямой амплификации геномной ДНК растений Brassica методом полимеразиой цепной реакции (ПЦР) со специфическими праймерамн и клонировать полученные фрагменты генома;

2. идентифицировать зги фрагменты генома как гомологи генов развития А. thaliana путем анализа их нуклеотидных и производных аминокислотных последовательностей;

3. сравнить полученные гомолога с уже известными генами развития цветковых растений путем компьютерного анализа с использованием генетических баз данных;

4. изучить возможность использования полученных гомологов генов развития в качестве гибридизационных зондов в RFLP анализе;

5. провести RFLP анализ разнообразия генов развития у хозяйственно ценных форм растений рода Brassica;

6. сопоставить полиморфизм генов развития с фенотипическими проявлениями скорости развития исследуемых форм Brassica.

Научная новизна. Из растений Brassica и Camelina клонированы и охарактеризованы 13 новых гомологов генов развития А. thaliana, которые

принадлежат к четырем структурным классам генов. Получены новые данные о структурном полиморфизме этих генов у растений Brassicaceae, в частности, ранее отсутствовавшие за пределами A. thaliana сведения о строении нитронов. Для гомологов генов CONSTANS, FLOWERING LOCUS С и LEAFY по казана связь структурного полиморфизма этих генов со временем перехода растений к цветению.

Практическая значимость. Доказана пригодность полученных гомологов генов развития в качестве гибридизационных зондов для RFLP анализа в функциональных и систематических исследованиях растений рода Brassica. Показана принципиальная возможность создания на основе полученных гомологов ДНК маркеров признака ранне/позднеспелости сельскохозяйственных растений.

Основные положения работы были представлены на конференциях МОГиС в Москве в 2002 и 2003, съезде ВОГиС в Москве в 2004 гг. и на Втором и Третьем Международном Конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» в Москве в 2003 и 2005 гг.

Структура » объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение» и «Заключение», выводов и списка литературы, включающего 107 библиографических ссылок. Работа изложена на 131 машинописных страницах, содержит 40 рисунков и 8 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе был использован растительный материал из трех генетических коллекций: Centre for Genetic Resources (CGN), Вагенинген, Нидерланды, Всероссийский институт растениеводства (ВИР), С. Петербург, и ВНИИ кормов, ст. Луговая, Московская обл.

Геномную ДНК выделяли из зеленых листьев проростков с помощью модифицированного СТАВ метода (Saghai-Maroof et al., 1984). Все генно-

6

инженерные манипуляции проводились по стандартным методикам (Sam brook and Rüssel, 2001). Для клонирования фрагментов ДНК использовали лабораторный штамм К coli DH5a. Саузерн-блоттинг и гибридизацию фрагментов ДНК проводили по протоколу фирмы Amersham (Великобритания).

Для идентификации клонированных последовательностей, нахождения ближайших гомологов фрагментов генов, множественного выравнивания и построения дендро грамм использовали базы данных NCBI (http7/www.nebí.nlm.nih.gov/GenBank/) и EMBL (http://www.ebi.ac.uk/embl/) и программы DNASTAR, Oligo, GeneDoc, ClustalW и TREECON (Van de Peer and de Wächter, 1994). Последовательности охарактеризованных гомологов депонировали в Генбанке NCBI.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Клонирование и идентификация гомологов генов развития А, thaliana. По литературным данным и на основе множественного выравнивания последовательностей были сконструированы о ли гону клеоти ды, которые распознают консервативные участки в последовательностях предполагаемых генов-кандидатов, регулирующих скорость развития (табл. 1 и 2, рис. I). Эти олигонуклеотиды служили праймерамн для амплификации геномной ДНК. В результате из растений Brassica и Camelina удалось выделить и идентифицировать по первичной структуре 13 новых структурных гомологов шести генов развития А. thaliana, которые принадлежат к четырем классам генов и по своему строению весьма сходны с генами-прототипами (81-95% гомологии, см. табл. 1).

В производной аминокислотной последовательности двух гомологов гена CONSTANS-LIKE1 участок, соответствующий домену цинкового пальца, содержит характерную для В-box домена белка CONSTANS последовательность CXgCXiCXiCX+HXgH (Robson et al., 2001). От гена-прототипа гомологи FLOWERING LOCUS С из В. junceae отличаются длиной интронов и заменами во всех шести экзонах; 54 замены в гомологе AY266265

Таблица 1 Гомологи генов развития арабидопсиса, полученные в ходе исследования

00

Название гена Структурный класс Функции гена Источник Размер, п.н. % гомологии с прототипом по нуклеот. поел. Номер регистрации

CLAVATA1 (CLVI) Ген реиепторяой протеин кипазы Поддержание баланса между стволовыми клетками в центральной зоне апикальной меристем 14 побега и клетками на ее периферии, (Clark, 2001; Shaima, Fletcher, 2002). В. гора 509 91-93 AY130759

С. sativa 509 AF467952

В. napus 509 AY130760

В. naptts 3008 81 AY2S3519

CCWSTAS'S-LIKE 1 {COL1) Ген с доменом цинкового пальца Контроль индукции цветения длиной дня (Hayama and Coupland, 2004). В, rapa 705 87 A Y379531

705 AY379532

FLOWERING LOCUSCiFLC) МАС5-Ьох ген Контроль перехода к цветению после холодовой индукции (яровизации). (Michaels and Amasino, 2000). Я juncea 1588 84 AY266265

1688 AY268931

LEAFY {LFY) Гене уникальной структурой Контроль индукции цветения н поддержания идентичности флоралькой меристемы (Blazquez ei al., 1997). В. juncea 303 91-93 AY4721I2

303 AY472113

SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANSJ (.SOC1) \lADS-box ген Интегратор четырех путей индукции цветения (Lee et al., 2000; Hepworth ei al, 2002; Moon et a)., 2003). В. juncea 4 SS 94-95 AY507668

489 AY507669

SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP) МАОЗ-Ьох ген Репрсссор индукция цветения по автономному пути (I lanmann et al., 2000; Garcia-Maroto et al-, 2003). С. saliva 521 94 AY177710

и 49 замен в гомологе AY268931, в обоих случаях 16 замен были синонимическими. Два гомолога из В, juncea различаются между собой по общей длине, главным образом, за счет интронов 2 н б; в кодирующей части два гомолога различаются на 24 нуклеотида, причем только шесть замен являются синонимическими. В случае гомолога гена SHORT VEGETATIVE PHASE длина экзонов оказалась консервативной, а длины интронов сильно различались, что повлияло на различия в общей длине между полученным фрагментом и прототипом - 521 п.н и 556 п.н. соответственно.

Таблица 2, Праймеры, использованные для амплификации гомологов

генов, определяющих скорость развития у различных видов растений.

Ген-прототип Домен белка Прай мер З'-З' последовательность прямого (F) И обратного (R)праймера Темпер, отжига, "С

SOCI К-Ьох AF AR atttgaaacatgaagcagcaaa gcttctygttttctgcagct 52

SVP К-Ьох BF BR itgagaacagtgatcacgcccgaa ttgctgcctcaaccgcttgttctc 68

FLC 1-домен С-домен CF CR gatccttgatcgatatgggaaa Kctaattaa^tagtgg^agagtcac 58*

LFY Экзон III DF DR gacgaaccaagtrttcaggtacgc cgctccaaatggcaaagctg 55

СО B-box ССТ- домен EF ER tcatgtgagccwgcccc tgaagcataccttatygtcttctc 50

CL VI LRR- домен Киназа FF FR aggacaaacctccgatcacaatcac ctctatgtctcgtctcccattgaag 64

Тот же тоже GF GR atggcgatgagacttttgaagactc ttaggagggttagtgagcatgtgc 54

* - Scbranz et al,, 2002; остальные праймеры сконструированы автором

Различия в кодирующей части между гомологами гена ЗиРРЕБЗОН ОР ОГЕНЕХРИЕЗЗЮЫ ОР СОК5ТЛ№! АУ507668 и ЛУ507669 связаны с пятью нуклеотидными заменами, четыре из которых являются синонимическими, причем четыре замены из пяти, включая несинонимическую замену, находятся в четвертом экзоне, что говорит о его

высокой вариабельности. И нтроны обладают значительно ббльшим полиморфизмом. У гомологов гена ЬЕАРУ различия между клонированными

Н » И Г* V V*

^ И Ч1Н"1

ве иа^эдя да вв

I Я •№<( « щ

-I--ИНН

в-ы»«» ест

81 В2 ппймнш ДИНМ

ССЧ.1 —К&РШШ! ' ........... <1 *>—

ре со

сип

шштшштш ишшшшшни

(Т1

I РЙ

СРЕЗ

ЮН

Рис. 1. Строение генов арабидопсиса, определяющих скорость развития. АР-АЯ - СР-вЯ - праймгры, использовании« для амплификации гомологов генов.

фрагментами АУ472113 и АУ472112 связаны с 24 нуклеотидными заменами, из которых 18 являются синонимическими, а б несинонимическими, причем все синонимические замены находятся в положениях, которые полиморфны и у других гомологов, Гомолог гена С1АУАТА1 из В. парих АУ283519

отличается от прототипа транслируемой вставкой (21 п.н.) и различиями по длине нитрона - у рапса он короче на семь нуклеотидов. Гомологи из В. пария AYI30760 и В. rapa AY130759 оказались более сходными между собой (23 замены, из них шесть несинонимических), чем два гомолога из рапса AY130759 н AY283519 (72 замены, из них 15 несинонимических), поэтому можно предположить, что эти последовательности принадлежат разным аллелям гена CLAVATA1.

RFLP анализ разнообразия генов развития позволяет охарактеризовать полиморфизм генов Brassica по рестриктным сайгам. В экспериментах использовали две эндонуклеазы: Xbál (рис. 2 а, б; рис. 3 а) и Mspl (рис. 2 в, г, рис. 3 б, в) и гибридиз ационные зонды на основе полученных гомологов генов развития. В результате мы обнаружили от двух до девяти сигналов гибридизации на трек, в том числе зоны, общие для двух и более видов растений, и зоны, специфичные для геномов А, В или С (рис. 2 и 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

Структурные особенности полущенных гомологов. Наличие в последовательностях генов, определяющих скорость развития, консервативных участков позволяет использовать прямую амплификацию геномной ДНК для получения гомологов этих генов. Используя этот подход, нам удалось выделить и охарактеризовать 13 новых гомологов генов развития у культурных растений семейства Brassicaceae. В генетических базах большинство гомологов генов развития арабидопсиса представлено к ДНК, между тем с полиморфизмом интронов связана сй-рсгуляция многих генов развития и характерные особенности морфогенеза растений (Flctcher, 2002; Sharma and Fletcher, 2002; Míchaels et al., 2003; Prasad et al., 2003; Fu et al., 2005). Поэтому принципиально важным результатом нашей работы является характеристика интронов генов-кандидатов. В частности, мы впервые охарактеризовали интроны генов SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS! и SHORT VEGETATIVE PHASE у видов Brassica и Cornelina и интроны гена FLOWFJRING LOCUS Су В. júncea.

г

Рис. 2. RFLP спектры генов SUPRESSOR OF О VEREXPRESSION OF CONSTANSt (а), SHORT VEGETATIVE PHASE (6), LEAFY (в) и CU VA TAI (г) у видов Brassica, I -5 - В oleráceo: 1,2- var, capitata, 3-5- vai, gemmifera; 6,7 -В. rapa: 6 - яровая форма из США, 7 -озимая форма из Швеции; S-11 - В. juncea: 8,9 - масличные формы из Европы, 10, П -листовые формы из Южного Китая; 12-15 - В. carinata, африканские формы; 16-19 - В. nigra: 16, 17 - из Греции, 18,19-из Эфиопии; 20-22 -В. napus. Стрелками показаны зоны, специфичные для геномов А, В и С, и зоны, принадлежность которых к определенному геному не установлена.

+ А2

+ 62 + 63

В

Рис. 3. RFLP спектры генов CONSTASSiа) и FLOWERING LOCUS С (б. в) у видов Brassica. (а,б) 1-4 - В. oleracea; 5,6 - В, гора, 7-10-3. juneea-, 11-14 - В, carinata, 15-18 -В. nigra', 19,20 - В. napus. Стрелками показаны зоны, специфичные для геномов А, В и С. (в) 1-4-яровые формы В, rtapus - сорта В 1-02, Викрос, Ханна и Урал; 5, б-озимые формы В. napus - сорта В 10-42, 14-02; Черная и белая стрелки указывают на полиморфную зону А1 у яровых и озимых форм соответственно.

Наше исследование расширило представления о структурном полиморфизме гена FLOWERING LOCUS С: у В. juncea был идентифицирован новый структурный гомолог этого гена (AY268931) с

уникальным строением, который нельзя однозначно отнести к одному из локусов FLC, связанных с геномами А и С (Schranz et al., 2002). Мы полагаем, что этот гомолог принадлежит геному В, В полученных нами гомологах CONSTANS'LÍKEl из В. rapa мы обнаружили микросателлитиын мотив (ААС)„, полиморфизм которого отчетливо связан с географическим происхождением В. nigra {Lagercrantz et al., 2002). Наши результаты показывают, что такой повтор имеется и у других видов Brassica.

Мы впервые охарактеризовали гомологи гена CLAVATAI арабидопсиса у культурных растений семейства Brassicaceae и обнаружили полиморфизм интрона этого гена. Другие рецепторные киназы арабидопсиса, сои, риса и кукурузы, обладающие структурной гомологией с белком CLAVATAI {Yamamoto et aL, 2000; Kim et al., 2000; Bommert et al., 2005), очевидно, не являются его функциональными гомологами.

Результаты RFLP анализа. Использование полученных гомологов в -качестве зондов для RFLP анализа позволило нам оценить полиморфизм генов развития у хозяйственно ценных форм растений рода Brassica, Число сигналов гибридизации в различных образцах растений колебалось, в зависимости от зонда, от двух до девяти, причем у видов с простыми геномами (В. rapa, В, nigra и В. oleráceo) число этих сигналов было примерно в два раза меньшим, чем у тетраплоидных видов В. juncea, В. парт и В. carinóla. Очевидно, такая зависимость связана с числом копий гена, так как последовательности использованных нами зондов не содержали сайтов рестрикции эндонуклеаз ХЬа] и Msp\, и удвоение сигнала из-за взаимодействия зонда с двумя частями одного и того же гена не происходило. Наиболее важным результатом этого этапа исследования стало выявление геном-специфичных зон в спектрах всех исследованных генов-кандидатов. Этот факт свидетельствует о том, что различия между локусами генов развития в геномах А, В и С сформировались уже после дивергенции видов, несущих эти геномы. Присутствие зон, геномную принадлежность которых нельзя установить однозначно, можно объяснить тем, что часть

локусов сохранила геномную организацию, присущую общей лредковой форме Brassica. Наличие уникальных зон в отдельных образцах связано с внутривидовым разнообразием и отражает внутривидовую дивергенцию каждого генома,

В ряде случаев прослеживается отчетливая связь полиморфизма отдельных зон гибридизации с физиологическими характеристиками исследованных образцов. Дендрофамма генов семейства CONSTANS (рис. 4а) обнаруживает наглядную связь рестриктного полиморфизма с географическим происхождением исследованных растений. Формы В. nigrat Bjuncea и В. кара разделились: тропические и субтропические африканские формы В. nigra образовали кластер, отдельный от европейских форм, точно так же разделились формы В juncea из Европы и Юго-Восточной Азии и образцы В. гара родом из США И Северной Европы; при этом тропические формы В. nigra образовали общий кластер с формами В. carinata из Эфиопии. Ранее аналогичное наблюдение было сделано при сравнении последовательностей гена CONSTANS-UKEI у В. nigra: эфиопские и европейские формы этого вида растений образуют отдельные кластеры (Lagercrantz et al., 2002). С географическим происхождением растений В. juncea и В. nigra можно определенно связать зоны В] и В2: первая характерна для растений умеренных широт, а вторая - для форм, происходящих нз тропиков и субтропиков. В случае гомологов гена CONSTANS, контролирующего фотопериодическую индукцию цветения растений (Hayama and Coupland, 2004), ссть все основания соотнести подобное распределение форм Brassica с адаптацией растений к короткому или длинному дню и считать эти формы аллелями гомолога CONSTANS. Более неожиданной оказалась подобная связь между полиморфизмом гена LEAFY и географическим происхождением образцов видов В. juncea и В. nigra. Зона ВЗ была обнаружена у двух образцов В. nigra европейского происхождения и у европейских образцов В. juncea, но отсутствует у эфиопских форм В. nigra и тропических образцов В. juncea. Напротив, зона

В2 характерна для В. carínata и присутствует только в тропических формах В. nigra и В. júncea, но отсутствует у европейских форм этих видов, В результате на дендрограмме (рис. 46), представители вида В. júncea не образуют общего видоспецифичного кластера, а попарно распределяются на два кластера в соответствии со своим географическим происхождением и хозяйственной формой. Возможно, что в силу ключевой роли гена LEAFY в переходе к цветению он также участвует в адаптации растений к длине дня в различных регионах земного шара. В пользу этого предположения говорят опыты по трансформации самых различных растений геном LEAFY арабндопсиса и его гомологами: во многих случаях эктопическая экспрессия этого гена ускоряла переход к цветению (Blazquez et al., 1997).

Зоны Al и А2 гомологов LEAFY присутствуют только у форм В. júncea европейского происхождения, у тропических форм их нет, однако, в отличие -от зон В2 и ВЗ, зоны Al и А2 присутствуют также в обоих образцах В. rapa, один из которых имеет более южное происхождение (США), а другой происходит из Северной Европы (Швеция). Поэтому полиморфизм зон Al и А2, скорее всего, связан не с географическим происхождением исследуемых образцов, а с их хозяйственными формами, различающимися но морфологии: оба образца В. rapa и европейские формы В. júncea являются масличными растениями, в то время как образцы В. júncea из Южного Китая представляют собой овощные листовые формы. Вполне возможно, что, помимо регуляции перехода к цветению, ген LEAFY у В. júncea принимает участие и в формировании габитуса растения: известно, что гомологи LEAFY у гороха и томата UNI и FA участвуют в морфогенезе сложных листьев (Hofer et al., 1997; Molinero-Rosales et al., 1999).

При RFLP анализе локусов гена FLOWERING LOCUS С нам удалось выявить зоны, соответствующие различиям растений В. rapa и В. napus но скорости зацветания,* у В. rapa зоны BRS1 и BRS2 характерны только для яровой формы, а у В. napus полиморфизм зоны Al соответствует различию яровых и озимых форм (рис. 36, в).

«б I

Ec»JO»

.а

»c

L^J

-BtWi*

--- BfcW«*

-B»>M34*

— eniwjj*

■164 IS BJT1S4

- BnIMlB

- BhiMtG

Uj 44""

BjlSIM»

J4M

Boll - ВоМЗД

J?J BcMTS* 44 J ' Bc4015* JT_j '— BcJStt*

liOt^6434* . | Bniä613

'Bni6il9

BjUlll*

Bj 15193*

i—---BiTOll

i L4tJ ;B«1US»

I Bt6»98

] вотом

j Bol4»W

' . U ,-- BJM15

- '_25J BjilM

[ «-

-J*

-joo.

— ВгШ2"

— Вт«]*

" Bni6i35* BmUri) B«aVilir44 BiuKhAdna

Рис. 4, Дендрограмма рода Brassica, построенная по результатам RFLP анализа гомологовCONSTAKS(а) и LEAFY(б). Boll 159-Я oleracea var. capitata L (Нидерланды), Bo7022 - В. oleracea var. capitata L (Египет); Воб998, Во14069 - Ii. oleracea var, gemmifera Zenker (Нидерланды); Bo7004 - B. oleracea var. gemmifera Zenker (Великобритания); Br6832-ß. rapa L, (СШЛ); Br6S 1R - Я, rapa L. (Швеция); Bj6615-ß, juncea L. Czern (Гермалня); BJ7154-& juncea L, Czern. (Россия); Bjl5l9! - Я juncea h. Crem, (Южный Китай); Bj 15193 - В. juncea L, Czern. (Тайвань); Bc3946, Bc3950 и Bc4025 - B. carinata A. Braun, var. abyssinica (Эфиопия); Bc3976 — ß. carinata A. Braun, var. abyssinica (Сан-Томе и Принсипи); Bni66l8-ß, nigra var, abyssinica (Германив); Bni6619-B. nigra L, Koch (Греция); Bni6634 и Bm6i35 — В nigra L, Koch (Эфиопия); BnaUrat, BnaVikros и BnaKhanna - B. napus var. oleifera (Delilc) Sinskaya (Россия). Звездочкой выделены субтропические и тропические формы В, carinata, В. juncea, В. nigra и й rapa.

Анализ экспрессии генов SVPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1, CONSTANS-LIKE1, FLOWER1NG LOCUS С и LEAFY методом дот-гибридизации с препаратами тотальной РНК не выявил резких различий, связанных с возрастом растений или жизненными формами.

Использование рестриктных фрагментов для систематики рода Brassica. RFLP анализ шести видов Brassica с использованием в качестве зондов фрагментов описанных генов позволил выявить 110 полиморфных

• В(7Ч< ----Bjiiiii

- BJ1J193_

- B»i«55-1

L.

til

----B«i«19j

_------BrfBJl -1

-----BrtBK J

- B|>III»-|

5---BoMM

^__ttr--Bardo«

--Bal4ÛM_

_IMj—■ BMVth

Рис, 5. Дендрограмма рода Brasska, построенная по результатам RFLP анализа локусов SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANSI, SHORT VECETA TIVE PHASE, LEAFY, CONSTANS-LIKEl, FLOWERING LOCUS CuCLA VAT AI. Обозначения как на рис, 4.

зон (дескрипторов). Эти дескрипторы были объединены в общую матрицу генетических расстояний, на основе которой затем была построена дендрограмма (рис. 5). На этой дендрограмме все виды Brassica образуют четкие видоспецифичные кластеры, У арабидопсиса исследованные нами

гены расположены на разных хромосомах: SUPRESSOR OF ОVEREXPRESSION OF CONSTANS1 и SHORT VEGETATIVE PHASE - на второй, CONSTANS-L1KE2 - на третьей, a CLAVATAÎ, FLOWERING LOCUS С, CONSTANS-LIKEl и LEAFY - на пятой. У растений рода Brassica, в результате полиплоидизации, произошло увеличение числа копий этих локусов, и они независимо распределились по геномам этих растений (Osbom, 2004). Таким образом, суммирование данных RFLP анализа различных локусов для каждого конкретного вида позволило более полно охватить весь геном этого вида, отразить его видовые особенности и в тоже время нивелировать особенности организации данного участка генома у отдельных образцов растений, равно как и особенности,

связанные с неодинаковой скоростью и направлением эволюции разных локусов.

Полученные нами данные хорошо согласуются с филогенией и историей кариотипоа Brassica: диплоидный вид В. nigra (геном ВВ) образовал общий кластер с аллотетраплоидными видами В. juncea (АЛВВ) и В. carinara (ВВСС), для которых вид В. nigra служил одной из родительских форм. Виды В. rapa (АА) и В. oleracea (СС) дивергировали вместе на более позднем этапе эволюции Brassica, соответственно, эти виды образуют общий кластер. Примечательно, что оценка фенотипических показателей у этих видов (Murren et al., 2002) коррелирует с филогенией хуже, чем результаты молекулярной систематики. Этот факт наглядно показывает, что при изучении эволюционных процессов методы, основанные на исследовании генома, существенно дополняют традиционные ботанические методы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами новые данные о структурном полиморфизме тринадцати новых гомологов генов арабидопсиса, предположительно принимающих участие в регуляции скорости развития у Brassica и Camelina, существенно расширяют представления о регуляции активности ключевых генов развития у растений Brassicaceae за пределами хорошо изученного арабидопсиса. Для трех исследованных генов обнаружена отчетливая связь структурного полиморфизма генов с фенотипическими признаками растений, определяющими время перехода к цветению. По ряду объективных причин, шесть видов Brassica представлены в нашей работе 01раниченными выборками генотипов. Поэтому выявленный полиморфизм геномов А, В и С по генам развития не исчерпывает всего разнообразия аллелей и локусов исследованных генов у шести видов Brassica„

Исследованные формы Brassica очень важны в хозяйственном отношении. Поэтому перспективно использование полученных гомологов генов развития для создания на их основе ДНК маркеров такого агрономически важного признака, как ранне/позднеспелость, и зондов для генетического и физического картирования этих генов и признаков. Такие маркеры и зонды будут способствовать ускорению селекции, в частности, переносу перспективного материала генома В из растений горчицы {В. carírtata, В. juncea и В. nigra) в растения рапса и капусты, а также молекулярно-систематическим исследованиям рода Brassica.

ВЫВОДЫ

1. Методом прямой амплификации геномной ДНК В. rapa, В. napus, В, juncea и С. sativa получены новые фрагменты структурных гомологов генов CLAVÂTAI, CONSTANS-LIKEI, FLOWERING LOCUS С, LEAFY, SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1 и SHORT VEGETATIVE PIUSE, которые определяют скорость развития у растений арабидопсиса. Сходство охарактеризованных гомологов с генами арабидопсиса составляет 81-95%.

2. Получены новые данные о структуре генов развития: впервые получены сведения о нуклеотидной последовательности гомологов гена CLV1 у растений семейства Brassicaceae за пределами арабидопсиса; у растений В. juncea был идентифицирован новый структурный гомолог гена FLC; впервые охарактеризованы интроны генов SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS! и SHORT VEGETATIVE PHASE у видов Brassica и Camelina И интроны гена FLOWERING LOCUS С у В. juncea-, у гомологов гена CONSTANS-UKEI из В. rapa был найден полиморфный микросателлитный мотив, ранее идентифицированный только у В. nigra.

3. Использование полученных фрагментов ДНК в качестве гибридизационных зондов при RFLP анализе позволило выявить мультилокусную природу гомологов исследованных генов, которая хорошо соотносится 1 с плоидностью исследованных форм Brassica, и идентифицировать локусы, специфичные для А, В и С геномов.

4. RFLP анализ локусов генов CONST4NS-LJKE, FLOWERING LOCUS С и LEAFY у шести видов Brassica позволил связать рестрикггный полиморфизм с проявлениями фекотипического полиморфизма: временем перехода к цветению и фотопериодической реакцией растений. Такая связь открывает возможность использовать специфически гибридизуюшиеся фрагменты гомологов генов развития для создания ДНК маркеров ранне/позднеспелости.

5. Результаты RFLP анализа шести исследованных видов Brassica полностью соответствуют ботанической и цитогенетической классификации этих видов и могут быть использованы для решения задач молекулярной систематики рода Brassica.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мартынов В.В., Цветков И.Л., Хавкин Э.Е. Ортологи гена арабидопсиса CLAVATAÎ у культурных форм В rassîcaceae//Онтогенез. 2004. Т. 35. с. 41-46.

2. Мартынов В.В., Хавкин Э.Е. Два гомолога гена FLOWFJUNG LOCUS С из растений сарептской горчицы {Brassica juncea Thell.) // Физиология растений. 2004. Т. 51. с. 262-268.

3. Мартынов В.В., Хавкин Э.Е. Полиморфизм гена CONSTATS у растений Brassica Н Физиология растений. 2005. Т. 52. с, 274—281.

4. Мартынов В.В., Хавкин Э.Е. RFLP анализ гена FLOiVERING LOCUS С у шести видов растений Brassica П Физиология растений. 2005, Т. 52. с. 399—405.

5. Martynov V.V., Khavkin Е.Е. DNA markers of developmenial genes in Brassicaceae crop plants // Biotechnology and Agriculture and the Food lndustry. Hauppauge, N.Y.: Nova Science Publ.. 2004. P. 71-77.

Усл. печ. л. 1,16

Зак. 284.

Тираж 100 экз.

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО МСХА им. К.А, Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44