Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм генов, контролирующих скорость развития у культурных форм Brassica

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм генов, контролирующих скорость развития у культурных форм Brassica"

На правах рукописи

МАРТЫНОВ Виктор Викторович

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ СКОРОСТЬ РАЗВИТИЯ У КУЛЬТУРНЫХ ФОРМ

BRASSICA

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории ДНК маркеров растений ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Научный руководитель:

профессор, доктор биологических наук Э.Е. Хавкин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Т.А. Ежова

доктор биологических наук Г.В. Новикова

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет МСХА им. К. А. Тимирязева

в_часов на заседании диссертационного совета Д. 006. 027. 01

при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 42; тел.: 211-38-10; факс: 977-09-47; e-mail: iab@iab.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан « /2- » qUaA._2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Защита диссертации состоится «22 »

2005 г.

кандидат биологических наук

С.А. Меликова

244&H

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Все процессы, определяющие скорость развития и направление морфогенеза у высших растений, берут свое начало в меристемах, где начинается реализация генетической программы развития, которая заключается в избирательном «включении» одних генов и «выключении» других в строго определенные моменты времени (Лутова и др., 2000; Howell, 1998). Для нормального развития растительного организма очень важно постоянство поддержания недетерминированной апикальной меристемы побега, которая образует все наземные органы растения, включая меристемы боковых побегов, листья, меристемы соцветий и флоральные меристемы. В определенные моменты своей жизни растение начинает продуцировать детерминированные флоральные меристемы, которые формируют органы цветка, после чего прекращают свое существование. Оба процесса: поддержание недетерминированного состояния меристемы и переход к детерминированному развитию, - определяют скорость развития растения и регулируются на генетическом уровне,

В последние годы у модельного растения Arabidopsis thaliana были охарактеризованы многие гены, контролирующие скорость развития. Так, была показана роль генов CLAVATA1-CLAVATA3 и WUSCHEL в поддержании постоянной структуры апикальной меристемы побега (DeYoung and Clark, 2001; Schoof et al., 2000), были идентифицированы гены идентичности флоральной меристемы APETALA1, CAULIFLOWER и LEAFY (Sharma and Fletcher, 2002; Fletcher, 2002) и гены-активаторы, продукты которых стимулируют экспрессию генов идентичности флоральной меристемы (Boss et al., 2004). Кроме того, были охарактеризованы гены, которые опосредуют различные сигналы, возникающие внутри растительного организма (например, гормональные факторы индукции цветения) и поступающие извне (длина дня и качество света, воздействие низких температур), которые определяют перехс ~ >

(Henderson et al., 2003; Boss et al., 2004; Putterill et al., 2004; Corbesier and Coupland, 2005 ; Michaels et al., 2005).

Однако у культурных растений гены, контролирующие скорость развития и, в частности, переход к цветению, изучены совершенно недостаточно. Большинство методов идентификации новых генов у этих растений исходит из консерватизма структуры, позволяющей использовать гены-прототипы систематически близких растений для анализа геномных библиотек или поиска сходных нуклеотидных последовательностей в генетических базах данных и судить о функции генов по аналогии с уже изученными генами. Такой подход получил название концепции генов-кандидатов (Хавкин, 1998). Фенотипические проявления скорости развития (например, число междоузлий или число дней до цветения) складываются в результате сложных взаимодействия многочисленных генов друг с другом и с факторами внешней среды и являются, как правило, количественными признаками. Для идентификации генов, контролирующих количественный признак у исследуемого растения в конкретных условиях, фенотипический полиморфизм по этому признаку соотносят с полиморфизмом в строении генов-кандидатов, используя методы генетического и физического картирования.

Исследование строения и функции генов, определяющих скорость развития культурных растений, важно с практической точки зрения как путь создания на основе этих генов ДНК-маркеров ранне/позднеспелости и других признаков, существенных для селекции на продуктивность и качество урожая.

В обширном семействе Brassicaceae (Hall et al., 2002) к роду Brassica относятся наиболее важные с экономической точки зрения овощные, масличные, пряно-вкусовые и кормовые культуры. По скорости развития растения Brassica представляют широкий спектр форм, от ранних яровых до поздних двулетников.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выделение и сравнительный анализ фрагментов генома растений семейства Brassicaceae, гомологичных важнейшим генам, которые определяют скорость развития у А. thaliana, и использование полученных фрагментов для изучения полиморфизма генов развития у широкого круга хозяйственно ценных форм рода Brassica, чтобы установить связь структурного полиморфизма генов с фенотипическим полиморфизмом форм Brassica по признакам скорости развития. В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. выбрать гены-кандидаты, гомологичные генам, определяющим скорость развития у А. thaliana, получить эти гомологи путем прямой амплификации геномной ДНК растений Brassica методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими праймерами и клонировать полученные фрагменты генома;

2. идентифицировать эти фрагменты генома как гомологи генов развития А. thaliana путем анализа их нуклеотидных и производных аминокислотных последовательностей;

3. сравнить полученные гомологи с уже известными генами развития цветковых растений путем компьютерного анализа с использованием генетических баз данных;

4. изучить возможность использования полученных гомологов генов развития в качестве гибридизационных зондов в RFLP анализе;

5. провести RFLP анализ разнообразия генов развития у хозяйственно ценных форм растений рода Brassica)

6. сопоставить полиморфизм генов развития с фенотипическими проявлениями скорости развития исследуемых форм Brassica.

Научная новизна. Из растений Brassica и Camelina клонированы и охарактеризованы 13 новых гомологов генов развития А. thaliana, которые

принадлежат к четырем структурным классам генов. Получены новые данные о структурном полиморфизме этих генов у растений Brassicaceae, в частности, ранее отсутствовавшие за пределами A. thaliana сведения о строении интронов. Для гомологов генов CONSTANS, FLOWERING LOCUS С и LEAFY показана связь структурного полиморфизма этих генов со временем перехода растений к цветению.

Практическая значимость. Доказана пригодность полученных гомологов генов развития в качестве гибридизационных зондов для RFLP анализа в функциональных и систематических исследованиях растений рода Brassica. Показана принципиальная возможность создания на основе полученных гомологов ДНК маркеров признака ранне/позднеспелости сельскохозяйственных растений.

Основные положения работы были представлены на конференциях МОГиС в Москве в 2002 и 2003, съезде ВОГиС в Москве в 2004 гг. и на Втором и Третьем Международном Конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» в Москве в 2003 и 2005 гг.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение» и «Заключение», выводов и списка литературы, включающего 107 библиографических ссылок. Работа изложена на 131 машинописных страницах, содержит 40 рисунков и 8 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе был использован растительный материал из трех генетических коллекций: Centre for Genetic Resources (CGN), Вагенинген, Нидерланды, Всероссийский институт растениеводства (ВИР), С. Петербург, и ВНИИ кормов, ст. Луговая, Московская обл.

Геномную ДНК выделяли из зеленых листьев проростков с помощью модифицированного СТАВ метода (Saghai-Maroof et al., 1984). Все генно-

6

инженерные манипуляции проводились по стандартным методикам (Sambrook and Rüssel, 2001). Для клонирования фрагментов ДНК использовали лабораторный штамм Е. coli DH5ct. Саузерн-блотганг и гибридизацию фрагментов ДНК проводили по протоколу фирмы Amersham (Великобритания).

Для идентификации клонированных последовательностей, нахождения ближайших гомологов фрагментов генов, множественного выравнивания и построения дендрограмм использовали базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/) и EMBL (http://www.ebi.ac.uk/embl/) и программы DNASTAR, Oligo, GeneDoc, ClustalW и TREECON (Van de Peer and de Wächter, 1994). Последовательности охарактеризованных гомологов депонировали в Генбанке NCBI.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Клонирование и идентификация гомологов генов развития A. thaliana. По литературным данным и на основе множественного выравнивания последовательностей были сконструированы олигонуклеотиды, которые распознают консервативные участки в последовательностях предполагаемых генов-кандидатов, регулирующих скорость развития (табл. 1 и 2, рис. 1). Эти олигонуклеотиды служили праймерами для амплификации геномной ДНК. В результате из растений Brassica, и Camelina удалось выделить и идентифицировать по первичной структуре 13 новых структурных гомологов шести генов развития А. thaliana, которые принадлежат к четырем классам генов и по своему строению весьма сходны с генами-прототипами (81-95% гомологии, см. табл. 1).

В производной аминокислотной последовательности двух гомологов гена CONSTANS-LIKE1 участок, соответствующий домену цинкового пальца, содержит характерную для В-box домена белка CONSTANS последовательность CXsCX7CX2CXiHXsH (Robson et al., 2001). От гена-прототипа гомологи FLOWERING LOCUS С из Б. junceae отличаются длиной итронов и заменами во всех шести экзонах: 54 замены в гомологе AY266265

Таблица 1 Гомологи генов развития арабидопсиса, полученные в ходе исследования

Название гена Структурный класс Функции гена Источник Размер, п.н. % гомологии с прототипом по нуклеот. поел. Номер регистрации

CLAVATAI (CLV1) Ген рецепторной протеинкиназы Поддержание баланса между стволовыми клетками в центральной зоне апикальной меристемы побега и клетками на ее периферии, (Clark, 2001; Sharma, Fletcher, 2002). В. тара 509 91-93 AY130759

С. sativa 509 AF467952

В. napus 509 AY130760

В. napus 3008 81 AY2S3519

CONSTANS-LIKE1 (COL1) Ген с доменом цинкового пальца Контроль индукции цветения длиной дня (Hayama and Coupland, 2004). В. гара 705 87 AY379531

705 AY379532

FLOWERING LOCUS С (FLC) МАОЭ-Ьох ген Контроль перехода к цветению после холодовой индукции (яровизации). (Michaels and Am as ¡no, 2000). В. juncea 1588 84 AY266265

1688 AY268931

LEAFY (LFY) Ген с уникальной структурой Контроль индукции цветения и поддержания идентичности флорапьной меристемы (Blazquez et al., 1997). В. juncea 303 91-93 AY472112

303 AY472113

SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1 СSOC1) МАПЭ-Ьох ген Интегратор четырех путей индукции цветения (Lee et al., 2000; Hepworth et al., 2002; Moon et al., 2003). В. juncea 488 94-95 AY507668

489 AY507669

SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP) МАСБ-Ьох ген Репрессор индукции цветения по автономному пути (Hartmann et al., 2000; Garcia-Maroto et al., 2003). С. sativa 521 94 AY177710

и 49 замен в гомологе AY268931, в обоих случаях 16 замен были синонимическими. Два гомолога из В. juncea различаются между собой по общей длине, главным образом, за счет интронов 2 и 6; в кодирующей части два гомолога различаются на 24 нуклеотида, причем только шесть замен являются синонимическими. В случае гомолога гена SHORT VEGETATIVE PHASE длина экзонов оказалась консервативной, а длины интронов сильно различались, что повлияло на различия в общей длине между полученным фрагментом и прототипом - 521 п.н и 556 п.н. соответственно.

Таблица 2. Праймеры, использованные для амплификации гомологов

генов, определяющих скорость развития у различных видов растений.

Ген-прототип Домен белка Прай мер 5'-3' последовательность прямого (F) и обратного (R) праймера Темпер, отжига, °C

SOC1 К-Ьох AF AR atttgaaacatgaagcagcaaa gcttctygttttctgcagct 52

SVP К-Ьох BF BR ttgagaacagtgatcacgcccgaa ttgctgcctcaaccgcttgttctc 68

FLC 1-домен С-домен CF CR gatccttgatcgatatgggaaa gctaattaagtagtgggagagtcac 58*

LFY Экзон III DF DR gacgaaccaagtrttcaggtacgc cgctccaaatggcaaagctg 55

СО B-box ССТ-домен EF ER tcatgtgagccwgcccc tgaagcataccttatygtcttctc 50

CLV1 LRR- домен Киназа FF FR aggacaaacctccgatcacaatcac ctctatgtctcgtctcccattgaag 64

Тот же тоже GF GR atggcgatgagacttttgaagactc ttaggagggttagtgagcatgtgc 54

* - Schranz et al., 2002; остальные праймеры сконструированы автором

Различия в кодирующей части между гомологами гена БиРШЗБОК ОР ОУЕЯЕХРШЗБЮМ ОР СО№ТА№1 АУ507668 и АУ507669 связаны с пятью нуклеотидными заменами, четыре из которых являются синонимическими, причем четыре замены из пяти, включая несинонимическую замену, находятся в четвертом экзоне, что говорит о его

высокой вариабельности. Интроны обладают значительно большим полиморфизмом. У гомологов гена LEAFY различия между клонированными

it m jv v yi ун

SOC1 '

AF I . -т—I AR

I It III IV V VI Vtl УШ IX

svp Ииииню—иМи ий Д-Дшии >ДД|и \тп

1Я Я 9 Я В ш ВН и

BFt ' • „■ ИЗ BR

I и BIVV VI VJ

-I-—Ш—I

CF Г". , , . , .ICR

lfy

DF1...........'—I OR

В-йохоз ССТ

B1 В2 Вориаболыоя часть ДОМОН

cou HEl^HjffSI—■■" ..................<...'.. >—

FFr— ■ ■■ "о. - .. ; .• -f-iPB

cl vi

lllllllllllllllllllll

FFC

□ FR

GFC

] GR

Рис. 1. Строение генов арабидопсиса, определяющих скорость развития. АР-АВ. - ОР-ОЯ - праймеры, использованные для амплификации гомологов генов.

фрагментами АУ472113 и АУ472112 связаны с 24 нуклеотидными заменами, из которых 18 являются синонимическими, а б несинонимическими, причем все синонимические замены находятся в положениях, которые полиморфны и у других гомологов. Гомолог гена СЫУАТА! из В. парш АУ283519

отличается от прототипа транслируемой вставкой (21 п.н.) и различиями по длине интрона - у рапса он короче на семь нуклеотидов. Гомологи из В. napus AY130760 и В. rapa AY130759 оказались более сходными между собой (23 замены, из них шесть несинонимических), чем два гомолога из рапса AY130759 и AY283519 (72 замены, из них 15 несинонимических), поэтому можно предположить, что эти последовательности принадлежат разным аллелям гена CLAVATA1.

RFLP анализ разнообразия генов развития позволяет охарактеризовать полиморфизм генов Brassica по рестриктным сайтам. В экспериментах использовали две эндонуюхеазы: ХЬа\ (рис. 2 а, б; рис. 3 а) и Mspl (рис. 2 в, г; рис. 3 б, в) и гибридизационные зонды на основе полученных гомологов генов развития. В результате мы обнаружили от двух до девяти сигналов гибридизации на трек, в том числе зоны, общие для двух и более видов растений, и зоны, специфичные для геномов А, В или С (рис. 2 и 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

Структурные особенности полученных гомологов. Наличие в последовательностях генов, определяющих скорость развития, консервативных участков позволяет использовать прямую амплификацию геномной ДНК для получения гомологов этих генов. Используя этот подход, нам удалось выделить и охарактеризовать 13 новых гомологов генов развития у культурных растений семейства Brassicaceae. В генетических базах большинство гомологов генов развития арабидопсиса представлено кДНК, между тем с полиморфизмом интронов связана си-регуляция многих генов развития и характерные особенности морфогенеза растений (Fletcher, 2002; Sharma and Fletcher, 2002; Michaels et al., 2003; Prasad et al., 2003; Fu et al., 2005). Поэтому принципиально важным результатом нашей работы является характеристика интронов генов-кандидатов. В частности, мы впервые охарактеризовали интроны генов SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANSI и SHORT VEGETATIVE PHASE у видов Brassica и Cornelina и интроны генаFLOWERING LOCUS Су В. júncea.

,, i -г". .'?. -4 тЖ. 'f'7- 8 ■> Wll; 12" 13 ' 14 Тб"Тв~WTfOe ~20Г И "22 1

Ai3r_ f ■ _ i • . . . ■ v .j

Bf* V • - ^ '' ¥ ' 44*-' 1 Г i

XI-1- . . ''i^A , ^ «Ш ^

B2-* ■ ... 'л''*«»;.;. ■ 'Л.'- -l/'-'l

ВТ*. \ , . ' " Л„; . '■* '.Л^, .

а

з-,<тг т»-.«•; ¿sr.igr-?^. -да-лчв-да; w^g .го ..

. ' '"»». ' ..V ■ ■ ,:' . V l ВС?

1 " ' ■'.'.: . *"■'- ' ".'.. ". У'-"' ,'

IT 'at -#>'■ e?f".TR » Г-; lOv «-^«- ?t4- :1B.' "iev; 118419,Л0' & Ж?'

If ..vi/is1;;: KM^

••' M-'J Л «-АВС1

C1-»S",,.v у,**»*чЦ<, .fA^. . , г Y , .»ч, ;V "i

^ r,. -" v- •««» W'W yii'.-v^.^,-.^..; fl-.,.': ^ л:-.'' <~^,BC2

- -. к...... 1 *• , - •- . '■« -'.".V . .,«.»",..•-!• «-ВЗ

(,*■-■ '•"•'ij.' \ i ' ■'}-» " ■ • ' ■ n't.- . .

в

"'i?.' ;Э"" w 11 « 1Л 15 10 17 и ча м 21 ,22

" ' ,''.''- Ш

, ■ „ . , »-АС1?

АВС1-* ■ • i ,.....■. ' 1 I 1 - - , . 1 _

АВС2-». 1 : . 'V ; : ' ." •' .v. «.дсг?

С1-» ••

•-ВС?

В1— " V ......' . ' .

V - . , .. 1 - - - ' ' ' ■ I ' У .

н ч ' " ' ' ' ', АВСЗ

♦-В2

Рис. 2. RFLP спектры генов SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF C0NSTANS1 (а), SHORT VEGETATIVE PHASE (6), LEAFY {в) и CLAVATA1 (г) у видов Brassica. 1-5 - В. oleracea: 1,2- var. capitata, 3-5 - var. gemmifera\ 6,1 -В. rapa\ б - яровая форма из США, 7 - озимая форма из Швеции; 8-11 - В. juncea: 8,9- масличные формы из Европы, 10,11 — листовые формы из Южного Китая; 12-15 - В. carinata, африканские формы; 16-19 - В. nigra: 16,17 - из Греции, 18,19 - из Эфиопии; 20-22 - В. napus. Стрелками показаны зоны, специфичные для геномов А, В и С, и зоны, принадлежность которых к определенному геному не установлена.

С1-» АВ1—t

С2-»

ABC-» В1-»

AB3-»i

• ' ' - J. '' ~ *'4-B2

* ~ \ *', . •" '' * I

- - \ ,, . -J

«¿«»'«-At

б в

Рис. 3. RFLP спектры генов CONSTANS (а) и FLOWERING LOCUS С (б, в) у видов Brassica. (а, б) 1-4 - В. oleracea; 5,6-В, гара\ 7-10 - B.juncea; 11-14 - В. carinata; 15-18 - В. nigra; 19,20 - 5. napus. Стрелками показаны зоны, специфичные для геномов А, В и С. (в) 1-4 - яровые формы В. napus - сорта В 1-02, Викрос, Ханна и Урал; 5, б - озимые формы В. napus - сорта В 10-02, 14-02; Черная и белая стрелки указывают на полиморфную зону А1 у яровых и озимых форм соответственно.

Наше исследование расширило представления о структурном полиморфизме гена FLOWERING LOCUS С: у В. juncea был идентифицирован новый структурный гомолог этого гена (AY268931) с

уникальным строением, который нельзя однозначно отнести к одному из локусов FLC, связанных с геномами А и С (Schranz et al., 2002). Мы полагаем, что этот гомолог принадлежит геному В. В полученных нами гомологах CONSTANS-LIKE1 из В. гара мы обнаружили микросателлитный мотив (ААС)„, полиморфизм которого отчетливо связан с географическим происхождением В. nigra (Lagercrantz et al., 2002). Наши результаты показывают, что такой повтор имеется и у других видов Brassica.

Мы впервые охарактеризовали гомологи гена CLAVATA1 арабидопсиса у культурных растений семейства Brassicaceae и обнаружили полиморфизм интрона этого гена. Другие рецепторные киназы арабидопсиса, сои, риса и кукурузы, обладающие структурной гомологией с белком CLAVATA1 (Yamamoto et al., 2000; Kim et al., 2000; Bommert et al., 2005), очевидно, не являются его функциональными гомологами.

Результаты RFLP анализа. Использование полученных гомологов в-качестве зондов для RFLP анализа позволило нам оценить полиморфизм генов развития у хозяйственно ценных форм растений рода Brassica. Число сигналов гибридизации в различных образцах растений колебалось, в зависимости от зонда, от двух до девяти, причем у видов с простыми геномами (В. гара, В. nigra и В. oleracea) число этих сигналов было примерно в два раза меньшим, чем у тетраплоидных видов В. juncea, В. napus и В. carinata. Очевидно, такая зависимость связана с числом копий гена, так как последовательности использованных нами зондов не содержали сайтов рестрикции эндонуклеаз ХЬа\ и Mspl, и удвоение сигнала из-за взаимодействия зонда с двумя частями одного и того же гена не происходило. Наиболее важным результатом этого этапа исследования стало выявление геном-специфичных зон в спектрах всех исследованных генов-кандидатов. Этот факт свидетельствует о том, что различия между локусами генов развития в геномах А, В и С сформировались уже после дивергенции видов, несущих эти геномы. Присутствие зон, геномную принадлежность которых нельзя установить однозначно, можно объяснить тем, что часть

локусов сохранила геномную организацию, присущую общей предковой форме Brassica. Наличие уникальных зон в отдельных образцах связано с внутривидовым разнообразием и отражает внутривидовую дивергенцию каждого генома.

В ряде случаев прослеживается отчетливая связь полиморфизма отдельных зон гибридизации с физиологическими характеристиками исследованных образцов. Дендрограмма генов семейства CONSTANS (рис. 4а) обнаруживает наглядную связь рестриктного полиморфизма с географическим происхождением исследованных растений. Формы В. nigra, B.juncea и В. rapa разделились: тропические и субтропические африканские формы В. nigra образовали кластер, отдельный от европейских форм, точно так же разделились формы В. juncea из Европы и Юго-Восточной Азии и образцы В. rapa родом из США и Северной Европы; при этом тропические формы В. nigra образовали общий кластер с формами В. carinata из Эфиопии. Ранее аналогичное наблюдение было сделано при сравнении последовательностей гена CONSTANS-LIKE1 у В. nigra: эфиопские и европейские формы этого вида растений образуют отдельные кластеры (Lagercrantz et al., 2002). С географическим происхождением растений В. juncea и В. nigra можно определенно связать зоны В1 и В2: первая характерна для растений умеренных широт, а вторая - для форм, происходящих из тропиков и субтропиков. В случае гомологов гена CONSTANS, контролирующего фотопериодическую индукцию цветения растений (Науаша and Coupland, 2004), есть все основания соотнести подобное распределение форм Brassica с адаптацией растений к короткому или длинному дню и считать эти формы аллелями гомолога CONSTANS. Более неожиданной оказалась подобная связь между полиморфизмом гена LEAFY и географическим происхождением образцов видов В. juncea и В. nigra. Зона ВЗ была обнаружена у двух образцов В. nigra европейского происхождения и у европейских образцов В. juncea, но отсутствует у эфиопских форм В. nigra и тропических образцов В. juncea. Напротив, зона

В2 характерна для В. carinata и присутствует только в тропических формах В. nigra и В. júncea, но отсутствует у европейских форм этих видов. В результате на дендрограмме (рис. 46), представители вида В. júncea не образуют общего видоспецифичного кластера, а попарно распределяются на два кластера в соответствии со своим географическим происхождением и хозяйственной формой. Возможно, что в силу ключевой роли гена LEAFY в переходе к цветению он также участвует в адаптации растений к длине дня в различных регионах земного шара. В пользу этого предположения говорят опыты по трансформации самых различных растений геном LEAFY арабидопсиса и его гомологами: во многих случаях эктопическая экспрессия этого гена ускоряла переход к цветению (Blazquez et al., 1997).

Зоны Al и А2 гомологов LEAFY присутствуют только у форм В. júncea европейского происхождения, у тропических форм их нет, однако, в отличие-от зон В2 и ВЗ, зоны Al и А2 присутствуют также в обоих образцах В. rapa, один из которых имеет более южное происхождение (США), а другой происходит из Северной Европы (Швеция). Поэтому полиморфизм зон Al и А2, скорее всего, связан не с географическим происхождением исследуемых образцов, а с их хозяйственными формами, различающимися по морфологии: оба образца В. rapa и европейские формы В. júncea являются масличными растениями, в то время как образцы В. júncea из Южного Китая представляют собой овощные листовые формы. Вполне возможно, что, помимо регуляции перехода к цветению, ген LEAFY у В. júncea принимает участие и в формировании габитуса растения: известно, что гомологи LEAFY у гороха и томата UNI и FA участвуют в морфогенезе сложных листьев (Hofer et al., 1997; Molinero-Rosales et al., 1999).

При RFLP анализе локусов гена FLOWERING LOCUS С нам удалось выявить зоны, соответствующие различиям растений В. rapa и В. napus по скорости зацветания: у В. rapa зоны BRS1 и BRS2 характерны только для яровой формы, а у В. napus полиморфизм зоны Al соответствует различию яровых и озимых форм (рис. 36, в).

Mj BJ15W1* BJ1S193« Brt832* IMSIS BnaVikros ' BnaKhanna

— BO14069

— BollI59

— П06998

— BO7O04

4b'

60

41

, Пс3950" 39J Bc3976* 46J ßc4025* Bc3946* Bni6634° 25 . ; Bn(66I8

, Bnf6619

l. BJ15191*

' BJ15193*

- Bo7022 ; B0111S9

1 38 ! Bo6998 (Bo7004 Bol4069

- Bj6615

- BJ71S4 S2_--Br6832«

- Br6818

— —-BnI6635* : BnaUral BnaVikros BnaKhanna

4!_

I--

100

Рис. 4. Дендрограмма рода Brassica, построенная по результатам RFLP анализа гомологов CONSTANS (а) и LEAFY (б). Bol 1159 - В. oleracea var. capitata L. (Нидерланды), Bo7022 - В. oleracea var. capitata L. (Египет); Воб998, Bol4069 - В. oleracea var. gemmifera Zenker (Нидерланды); Bo7004 - В, oleracea var. gemmifera Zenker (Великобритания); Br6832 - В. rapa L. (США); BröSlS - В. rapa L. (Швеция); Bj6615 - B. junceaL. Czera(Германия); Bj7154-В. junceaL. Czern. (Россия); Bj 15191 -B. junceaL. Czcrn. (Южный Китай); Bj 15193 - В. juncea L. Czern. (Тайвань); Вс394б, Bc3950 и Вс4025 - В. carinata А. Braun, var. abyssinica (Эфиопия); Вс397б - В. carinata А. Braun, var. abyssinica (Сан-Томе и Принсипи); Bni6618 - В. nigra var. abyssinica (Германия); Bni6619 -В. nigra L. Koch (Греция); Bni6634 и Bni6635 - В. nigra L. Koch (Эфиопия); BnaUral, BnaVikros и BnaKhanna - B. napus var. oleifera (Delile) Sinskaya (Россия), Звездочкой выделены субтропические и тропические формы В. carinata, В. juncea, В. nigra и В. rapa.

Анализ экспрессии генов SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1, CONSTANS-LIKE1, FLOWERING LOCUS С и LEAFY методом дот-гибридизации с препаратами тотальной РНК не выявил резких различий, связанных с возрастом растений или жизненными формами.

Использование рестриктных фрагментов для систематики рода Brassica. RFLP анализ шести видов Brassica с использованием в качестве зондов фрагментов описанных генов позволил выявить 110 полиморфных

-"Г

92' L

98Г

• Вс3950 "1 ■ Вс397б Bc401S

- Bc394i J

- BJ66I5 -

ЛГ

l- - BJ7I54

98 j--BJ15191

1-BJI5I93_

----Bnl6635"

--Bnl6634

-----Bn!6618

99i

Bnl6619_

— Br6832

— ВГ6818 J

— B0III59-Bo6998

j 86-Bo7004

!-Bol4069_

BnaVlkros'

-Ч"юГ1«сс

— BnaKhanniU

Рис. 5. Дсндрограмма рода Brassica, построенная по результатам RFLP анализа локусов SUPRESSOR OF ОVEREXPRESSION OF CONSTANS1, SHORT VEGETATIVE PHASE, LEAFY, CONSTANS-LIKE1, FLOWERING LOCUS С и CLAVATA1. Обозначения как на рис. 4.

зон (дескрипторов). Эти дескрипторы были объединены в общую матрицу генетических расстояний, на основе которой затем была построена дендрограмма (рис. 5). На этой дендрограмме все виды Brassica образуют четкие видоспецифичные кластеры. У арабидопсиса исследованные нами

гены расположены на разных хромосомах: SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANSI и SHORT VEGETATIVE PHASE - на второй, CONSTANS-LIKE2 - на третьей, a CLAVATA1, FLOWERING LOCUS С, CONSTANS-LIKE1 и LEAFY - на пятой. У растений рода Brassica, в результате полиплоидизации, произошло увеличение числа копий этих локусов, и они независимо распределились по геномам этих растений (Osbom, 2004). Таким образом, суммирование данных RFLP анализа различных локусов для каждого конкретного вида позволило более полно охватить весь геном этого вида, отразить его видовые особенности и в тоже время нивелировать особенности организации данного участка генома у отдельных образцов растений, равно как и особенности,

связанные с неодинаковой скоростью и направлением эволюции разных локусов.

Полученные нами данные хорошо согласуются с филогенией и историей кариотипов Brassica-, диплоидный вид В. nigra (геном ВВ) образовал общий кластер с аллотетрагогаидными видами В. juncea (ААВВ) и В. carinata (ВВСС), для которых вид В. nigra служил одной из родительских форм. Виды В. rapa (АА) и В. oleracea (СС) дивергировали вместе на более позднем этапе эволюции Brassica, соответственно, эти виды образуют общий кластер. Примечательно, что оценка фенотипических показателей у этих видов (Murren et al., 2002) коррелирует с филогенией хуже, чем результаты молекулярной систематики. Этот факт наглядно показывает, что при изучении эволюционных процессов методы, основанные на исследовании генома, существенно дополняют традиционные ботанические методы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами новые данные о структурном полиморфизме тринадцати новых гомологов генов арабидопсиса, предположительно принимающих участие в регуляции скорости развития у Brassica и Camelina, существенно расширяют представления о регуляции активности ключевых генов развития у растений Brassicaceae за пределами хорошо изученного арабидопсиса. Для трех исследованных генов обнаружена отчетливая связь структурного полиморфизма генов с фенотипическими признаками растений, определяющими время перехода к цветению. По ряду объективных причин, шесть видов Brassica представлены в нашей работе ограниченными выборками генотипов. Поэтому выявленный полиморфизм геномов А, В и С по генам развития не исчерпывает всего разнообразия аллелей и локусов исследованных генов у шести видов Brassica.

Исследованные формы Brassica очень важны в хозяйственном отношении. Поэтому перспективно использование полученных гомологов генов развития для создания на их основе ДНК маркеров такого агрономически важного признака, как ранне/позднеспелость, и зондов для генетического и физического картирования этих генов и признаков. Такие маркеры и зонды будут способствовать ускорению селекции, в частности, переносу перспективного материала генома В из растений горчицы (В. carinata, В. juncea и В. nigra) в растения рапса и капусты, а также молекулярно-систематическим исследованиям рода Brassica.

ВЫВОДЫ

1. Методом прямой амплификации геномной ДНК В. rapa, В. napus, В. juncea и С. sativa получены новые фрагменты структурных гомологов генов CLAVATÂ1, CONSTANS-LIKE1, FLOWERING LOCUS С, LEAFY, SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANSl и SHORT VEGETATIVE PHASE, которые определяют скорость развития у растений арабидопсиса. Сходство охарактеризованных гомологов с генами арабидопсиса составляет 81-95%.

2. Получены новые данные о структуре генов развития: впервые получены сведения о нуклеотидной последовательности гомологов гена CLV1 у растений семейства Brassicaceae за пределами арабидопсиса; у растений В. juncea был идентифицирован новый структурный гомолог гена FLO, впервые охарактеризованы интроны генов SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANSl и SHORT VEGETATIVE PHASE у видов Brassica и Camelina и интроны гена FLOWERING LOCUS С у В. juncea-, у гомологов гена CONSTANS-LIKE1 из В. rapa был найден полиморфный микросателлитный мотив, ранее идентифицированный только у В. nigra.

3. Использование полученных фрагментов ДНК в качестве гибридизационных зондов при RFLP анализе позволило выявить мультилокусную природу гомологов исследованных генов, которая хорошо соотносится с плоидностью исследованных форм Brassica, и идентифицировать локусы, специфичные для А, В и С геномов.

4. RFLP анализ локусов генов CONSTANS-LIKE, FLOWERING LOCUS С и LEAFY у шести видов Brassica позволил связать рестриктный полиморфизм с проявлениями фенотипического полиморфизма: временем перехода к цветению и фотопериодической реакцией растений. Такая связь открывает возможность использовать специфически гибридизующиеся фрагменты гомологов генов развития для создания ДНК маркеров ранне/позднеспелости.

5. Результаты RFLP анализа шести исследованных видов Brassica полностью соответствуют ботанической и цитогенетической классификации этих видов и могут быть использованы для решения задач молекулярной систематики рода Brassica.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мартынов В.В., Цветков И.Л., Хавкин Э.Е. Ортологи гена арабидопсиса CLAVATA1 у культурных форм Brassicaceae // Онтогенез. 2004. Т. 35. с. 41—46.

2. Мартынов В.В., Хавкин Э.Е. Два гомолога гена FLOWERING LOCUS С из растений сарептской горчицы (Brassica jimcea Thell.) // Физиология растений. 2004. Т. 51. с. 262-268.

3. Мартынов В.В., Хавкин Э.Е. Полиморфизм гена CONSTANS у растений Brassica // Физиология растений. 2005. Т. 52. с. 274-281.

4. Мартынов В.В., Хавкин Э.Е. RFLP анализ гена FLOWERING LOCUS С у шести видов растений Brassica // Физиология растений. 2005. Т. 52. с. 399-405.

5. Martynov V.V., Khavkin Е.Е. DNA markers of developmental genes in Brassicaceae crop plants // Biotechnology and Agriculture and the Food Industry. Hauppauge, N.Y.: Nova Science Publ.. 2004. P. 71-77.

Усл. печ. л. 1,16

Зак. 284.

Тираж 100 экз.

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО МСХА им. КА. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

t

РНБ Русский фонд

2007-4 11459

09 I1I0H 2005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мартынов, Виктор Викторович

Сокращения.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Введение.

1.2. Строение и функции генов, принимающих участие в регуляции скорости развития растений арабидопсиса.

1.2.1. Гены, управляющие формированием и поддержанием меристем.

1.2.2. Строение и функции генов, принимающих участие в индукции цветения у арабидопсиса.

1.3. Гомологи генов скорости развития у других растений.

1.4. Гомологи генов, определяющих скорость развития у растений рода Brassica.

1.5. Патенты, основанные на использовании генов, контролирующих скорость развития растения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Полиморфизм генов, контролирующих скорость развития у культурных форм Brassica"

Общая характеристика работы. Развитие живого организма можно рассматривать как возникновение, усложнение или редукцию различных органов и тканей и изучать этот процесс как изменения во времени методами морфологии, биохимии или молекулярной генетики.

У высших животных подавляющее большинство органов, присущих взрослому организму, формируется на стадии эмбриогенеза. Органы взрослого растения формируются уже на стадии постэмбрионального развития, и источником этих органов служат апикальная меристема побега и корня. Способность меристем постоянно продуцировать новые органы в течение всей жизни растения позволяет растительному организму гибко изменять свое строение в зависимости от условий внешней среды. Благодаря тому, что меристемы являются источником всех органов взрослого растения и способны постоянно продуцировать эти органы, их роль в развитии растительного организма очень высока. Поэтому, говоря о развитии растений вообще и о скорости развития в частности, необходимо помнить, что все эти процессы напрямую связаны с состоянием и функциональной активностью меристем.

Апикальная меристема побега (shoot apical meristem, SAM) состоит из группы стволовых клеток, которые постоянно делятся и дают начало латеральным органам. Постоянная дифференцировка стволовых клеток и превращение их в клетки латеральных органов требуют непрерывного возобновления этих клеток путем деления. Поддержание баланса между клеточными делениями и клеточной дифференцировкой служит залогом правильного функционирования SAM. На стадии вегетативного развития растения SAM дает начало фитомерам, повторяющимся структурным единицам побега. Каждый фитомер состоит, как правило, из одних и тех же элементов: узла, к которому прикрепляется лист, междоузлия и придаточной почки у основания листа, однако размеры этих элементов могут значительно варьировать в зависимости от расположения фитомера на стебле. Временной интервал между формированием отдельных фитомеров, который называют пластохроном, часто используют как показатель скорости развития (Howell, 1998). Меристемы придаточных почек по своему строению сходны с апикальной меристемой и могут служить источником боковых побегов.

В определенный момент времени растение переходит от вегетативного к репродуктивному развитию, то есть начинает продуцировать генеративные органы. Этот переход также осуществляется на уровне SAM, которая дает начало флоральным меристемам (FM). Эти меристемы отличаются от SAM тем, что в них блокируется процесс возобновления недифференцированных стволовых клеток путем деления; конечного числа этих клеток в FM достаточно только для того, чтобы сформировать органы цветка, после чего она прекращает свое существование.

Таким образом, вегетативное и репродуктивное развитие растения связано с активностью недетерминированных и детерминированных меристем (SAM и FM), а продолжительность вегетативной фазы и время перехода к цветению определяют общую скорость развития.

Процессы, связанные со скоростью развития, регулируются на генетическом уровне (Лутова и др., 2000; Howell, 1998). Избирательное «включение» одних и «выключение» других генов в определенные моменты времени обеспечивает на стадии вегетативного развития постоянство структуры SAM, а при переходе к цветению активирует формирование и дифференциацию FM. Многие гены, принимающие участие в этих процессах, были идентифицированы у модельного растения Arabidopsis thaliana и еще нескольких видов растений (рис, кукуруза, томаты и т.п.). Однако у подавляющего большинства хозяйственно ценных растений процесс идентификации генов, определяющих скорость развития, и изучение их строения и конкретного места в процессах развития находится еще в самом начале.

Большинство методов идентификации новых генов у этих растений основаны на том, что многие гены очень медленно изменяются в процессе эволюции. Такой консерватизм структуры позволяет использовать уже исследованные у других растений гены для анализа геномных библиотек или искать сходные нуклеотидные последовательности в генетических базах данных и судить о функции генов по аналогии с уже изученными генами. Такой подход получил название концепции генов-кандидатов (Хавкин, 1998). Эта концепция широко применяется и для идентификации генов развития. Однако сложность состоит в том, что фенотипические проявления скорости развития складываются в результате сложных взаимодействия многих генов друг с другом и факторами внешней среды и являются, как правило, количественными признаками. Генов-кандидатов на ключевую роль в формировании такого признака может быть несколько, и для того чтобы определить вклад конкретного гена в формирование количественного признака в определенных условиях роста растения необходимо соотнести фенотипический полиморфизм по этому признаку с^полиморф1т геномной организации. Результатом такого соотнесения является обнаружение в геноме локусов количественных признаков (quantitative trait loci, QTL). Эти локусы картируют, соответствующие QTL фрагменты генома клонируют и секвенируют, и в полученных последовательностях идентифицируют гены-кандидаты. Решающим фактором успеха такой стратегии является наличие как можно более насыщенных генетических карт, поэтому использование фрагментов предполагаемых генов-кандидатов в качестве ДНК маркеров позволяет наиболее точно картировать QTL, а в случае высокой степени косегрегации такого ДНК маркера с QTL доказать роль этого гена в формировании признака без клонирования и секвенирования.

Генетические и молекулярно-генетические исследования скорости развития культурных растений очень важны для практической селекции, поскольку с этими генами связан такой важный агрономический признак, как ранне/позднеспелость.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выделение и сравнительный анализ фрагментов генома растений семейства Brassicaceae, гомологичных важнейшим генам, определяющим скорость развития у A. thaliana, и использование полученных фрагментов для изучения полиморфизма этих генов у широкого круга хозяйственно ценных форм рода Brassica, чтобы установить связь структурного полиморфизма генов с фенотипическим полиморфизмом форм Brassica по признакам скорости развития. В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. выбрать гены-кандидаты, гомологичные генам, определяющим скорость развития у A. thaliana, получить эти гомологи путем прямой амплификации геномной ДНК растений Brassica методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими праймерами и клонировать полученные фрагменты генома;

2. идентифицировать эти фрагменты генома как гомологи генов развития A. thaliana путем анализа их нуклеотидных и производных аминокислотных последовательностей;

3. сравнить полученные гомологи с уже известными генами развития цветковых растений путем компьютерного анализа с использованием генетических баз данных;

4. изучить возможность использовать полученные гомологи генов развития в качестве гибридизационных зондов в RFLP анализе;

5. провести RFLP анализ разнообразия генов развития у хозяйственно ценных форм растений рода Brassica.

6. сопоставить полиморфизм генов развития с фенотипическими проявлениями скорости развития исследуемых форм Brassica.

Научная новизна. Из растений Brassica и Camelina клонированы и охарактеризованы 13 новых гомологов генов развития A. thaliana, которые принадлежат к четырем структурным классам генов. Получены новые данные о структурном полиморфизме этих генов у растений Brassicaceae, в частности, ранее отсутствовавшие сведения о строении интронов Brassicaceae за пределами A. thaliana. Для гомологов генов CONSTANS, FLOWERING LOCUS С и LEAFY показана связь структурного полиморфизма этих генов со временем перехода растений к цветению

Практическая значимость. Доказана пригодность полученных гомологов генов развития как гибридизационных зондов для RFLP анализа в функциональных и систематических исследованиях растений рода Brassica. Показана принципиальная возможность создания на основе полученных гомологов ДНК маркеров признака ранне/позднеспелости сельскохозяйственных растений.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Мартынов, Виктор Викторович

ВЫВОДЫ

1. Методом прямой амплификации геномной ДНК В. rapa, В. napus, В. juncea и С. sativa получены фрагменты структурных гомологов генов CLAVATA1, CONSTANS-UKE1, FLOWERING LOCUS С, LEAFY, SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1 и SHORT VEGETATIVE PHASE, которые определяют скорость развития у растений арабидопсиса. Сходство охарактеризованных гомологов с генами арабидопсиса составляет 81-95%.

2. Получены новые данные о структуре генов развития: впервые получены сведения о нуклеотидной последовательности гомологов гена CLV1 у растений семейства Brassicaceae за пределами арабидопсиса; у растений В. juncea был идентифицирован новый структурный гомолог гена FLC; впервые охарактеризованы интроны генов SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1 и SHORT VEGETATIVE PHASE у видов Brassica и Camelina и интроны гена FLOWERING LOCUS С у В. juncea', у гомологов гена CONSTANS-LIKE1 из В. rapa был найден полиморфный микросателлитный мотив, ранее идентифицированный только у В. nigra.

3. Использование полученных фрагментов ДНК в качестве гибридизационных зондов при RPLP анализе позволило выявить мультилокусную природу гомологов исследованных генов, которая хорошо соотносится с плоидностью исследованных форм Brassica, и идентифицировать локусы, специфичные для А, В и С геномов.

4. RFLP анализ локусов генов CONSTANS-LIKE, FLOWERING LOCUS С и LEAFY у шести видов Brassica позволил связать рестрикционный полиморфизм с проявлениями фенотипического полиморфизма: временем перехода к цветению и фотопериодической реакцией растений. Такая связь открывает возможность использовать специфически гибридизующиеся фрагменты гомологов генов развития для создания ДНК маркеров ранне/позднеспелости.

5. Результаты RFLP анализа шести исследованных видов Brassica полностью соответствуют ботанической и цитогенетической классификации этих видов и могут быть использованы для решения задач молекулярной систематики рода Brassica.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы выделили и охарактеризовали тринадцать новых гомологов генов, принимающих участие в регуляции скорости развития растительного организма, из геномной ДНК видов В. гара, В. napus, В. juncea и С. sativa. Охарактеризованные последовательности принадлежат к четырем различным структурным классам генов. Анализируя выделенные последовательности, мы получили новые данные о структуре генов развития у растений Brassicaceae, существенно расширяют представления о полиморфизме их строения за пределами арабидопсиса. На основе этих данных в дальнейшем могут быть созданы ДНК маркеры для молекулярной селекции и генотипирования Brassica.

Мы показали, что полученные гомологи обладают способностью к Саузерн-гибридизации. Это позволяет использовать их в качестве зондов при изучении рестрикционного полиморфизма и генетическом картировании. В результате RFLP анализа была показана мультилокусная природа генов развития у Brassica, что согласуется с современными представлениями об эволюции этого рода. Выявленный рестрикционный полиморфизм обладает ярковыраженной видоспецифичностью, но в тоже время внутривидовой полиморфизм также имеет место. Идентификация разных аллелей одного гена в двух популяциях одного вида может быть связана с различными климатическими условиями, существующими в ареалах распространения этих популяций. При адаптации растения к этим условиям действие одного аллеля может играть положительную роль, а другого - отрицательную, и поэтому один аллель подхватывается отбором, в то время как другой отсекается им. В случае генов развития такое развитие событий вполне вероятно, особенно если учесть роль этих генов в регуляции времени перехода к цветению, а также то обстоятельство, что время перехода к цветению является одним из самых важных спсобов приспособления растения к условиям окружающей среды.

Данные результаты показывают пригодность полученных гомологов для целей генотипирования различных видов и форм рода Brassica с использованием RFLP анализа, и, на наш взгляд, свидетельствуют о высокой разрешающей способности RFLP анализа при использовании функционально значимых гибридизационных зондов.

По необходимости, шесть видов Brassica представлены в нашей работе ограниченными выборками генотипов. Поэтому выявленный полиморфизм генов у геномов А, В и С не исчерпывает всего разнообразия аллелей и локусов у шести видов Brassica.

Полученные данные о связи рестрикционного и фенотипического полиморфизма доказывают принципиальную возможность использования поученных нами гомологов генов развития для создания ДНК маркеров хозяйственно полезных признаков на основе RFLP анализа. Такие маркеры будут способствовать ускорению селекции, в частности, переносу перспективного материала генома В в растения рапса и капусты, а также молекулярно-систематическим исследованиям рода Brassica.

Наши данные о функции полученных гомологов были бы существенно более полными, если бы мы получили сведения о паттернах экспрессии этих генов. С этой целью мы провели анализ экспрессии генов SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1, CONSTANS-LIKE1, FLOWERING LOCUS С и LEAFY методом дот гибридизации с препаратами тотальной РНК из разновозрастных растений В. гара (от 3-дневных проростков до дня перехода к цветению (10 дней)) и 14-дневных проростков озимой и яровой форм В. napus. Результаты этого эксперимента приведены в приложении 2. Мы показали наличие экспрессии указанных генов, но нам не удалось выявить ожидаемых различий в ее уровне, связанных с жизненными формами или возрастом растений. Это может быть объяснено тем, что выбранный нами метод оказался, с одной стороны, слишком чувствительным, и мы получали сигнал при «фоновом» уровне экспрессии, а с другой, не слишком избирательным, и по этой причине сигнал мог быть получен в результате гибридизации зонда с транскриптами других генов, гомологичных по структуре. Исходя из этих результатов, целесообразно в дальнейшем оптимизировать условия эксперимента для повышения специфичности данного метода.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мартынов, Виктор Викторович, Москва

1. Jlymoea JI.A., Тиходеев О.Н., Тихонович И.А., Проворов Н.А., Шишкова С.О., Ходжайова Л. Т. Генетика развития растений // JI. Наука. 2000.

2. Хавкин Э.Е. Генетическая регуляция морфогенеза растений // Физиол. растений. 1998. Т. 45. С. 676-690.

3. Холл М.А., Новикова Г.В., Мошков И.Е., Дж. Мур Л.А., Смит А.Р. Протеинкиназы растений в трансдукции абиотических и биотических сигналов // Физиол. растений. 2002. Т. 49. С. 121-135.

4. Achard P., HerrA., Baulcombe D. С., Harberd N. P. Modulation of floral development by gibberellin-regulated microRNA // Development. 2004. V. 131. P. 3357-3365.

5. Ahearn K.P., Johnson H. A., Weigel D., Wagner D. R. NFL1, a Nicotiana tabacum LEAFY-Like Gene, Controls Meristem Initiation and Floral Strucure // Plant Cell Physiol. 2001. V. 42. P. 1130-1139.

6. Axelsson Т., Shavorskaya O., Lagercrantz U. Multiple flowering time QTLs within several Brassica species could be the result of duplicated copies of one ancestral gene // Genome. 2001. V. 44. P. 856-864.

7. Blazquez M.A., Soowal L. N., Lee I., Weigel D. LEAFY expression and flower initiation in Arabidopsis // Development. 1997. V. 124. P. 3835-3844.

8. Bolle C. The role of GRAS proteins in plant signal transduction and development // Planta. 2004. V. 218. P. 683-692.

9. Bomblies K., WangR-L., Ambrose В. A., Schmidt R. J., MeeleyR. В., DoebleyJ. Duplicate FLORICAULA!LEAFYhomologs zfll and zfl2 control inflorescence architecture and flower pattering in maize // Development. 2003. V. 130. P. 23852395.

10. Bommert P., Lunde C., Nardmann J., Vollbrecht E., Running M., Jackson D., Hake S., Werr W. Thick tassel dwarf encodes a putative maize ortholog of the

11. Arabidopsis CLAVATA1 leucine-rich repeat receptor-like kinase // Development. 2005. V. 132. P. 1235-1245.

12. Brill E. M., Watson J. M. Ectopic expression of a Eucalyptus grandis SVP orthologue alters the flowering time of Arabidopsis thaliana II Functional Plant Biol. 2004. V. 31. P. 217-224.

13. Carmona M-J., Ortega N., Garcia-Maroto F. Isolation and molecular characterization of a new vegetative MADS-box gene from Solanum tuberosum L. //Planta. 1998. V. 207. P. 181-188.

14. ClarkS.E. Cell signalling at the shoot meristem //Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2001. V. 2. P. 276-284.

15. Clark S.E., Running M.P., Meyerowitz E.M. С LA VATA1, a regulator of meristem and flower development m Arabidopsis// Development. 1993. V. 119. P. 397-418.

16. ClarkS. E., WilliamsR. W., MeyerowitzE. M. The CLAVATA1 gene encodes a putative receptor kinase that controls shoot and floral meristem size in arabidopsis //Cell. 1997. V. 89. P. 575-585.

17. CoenE., Romero J., Doyle S., Elliot A., Murphy G., Carpenter R. Floricaula: a homeotic gene required for flower development in Antirrhinum majus // Cell. 1990. V. 63. P. 1311-1322.

18. DanylukJ., KaneN.A., Breton G., LiminA.E., Fowler D. В., SarhanF. TaVRT-1, a putative transcription factor associated with vegetative to reproductive transition in cereals // Plant Physiol. 2003. V. 132. P. 1849-1860.

19. DeYoung B. J., Clark S.E. Signaling through the CLAVATA1 receptor complex// Plant Mol. Biol. 2001. V. 46. P. 505-513.

20. Doonan J. Social controls on cell proliferation in plants // Curr. Opin. Plant Biol. 2000. V. 3. P. 482-487.

21. Dornelas M.C., Neves do Amaral W.A., Rodriguez A.P.M. EgLFY, the Eucalyptus grandis homolog of the Arabidopsis gene LEAFY is expressed in reproductive and vegetative tissues //Braz. J. Plant Physiol. 2004. V. 16. P. 105-114.

22. Fletcher J. C. Shoot and floral meristem maintenance in arabidopsis // Annu. Rev. Plant Biol. 2002. V. 53. P. 45-66.

23. Gale M.D., Devos KM. Plant compartive genetics after 10 years // Science. 1998. V. 282. P. 656-659.

24. Garcia-Maroto F., Carmona M-J., Garrido J-A., Vilches-Ferron M., Rodriguez-Ruiz J., Lopez Alonso D. New roles for MADS-box genes in higher plants // Biologia Plantarum. 2003. V. 46. P. 321-330.

25. Garcia-Maroto F., Ortega N., Lozano R.t Carmona M-J. Characterization of the potato MADS-box gene STMADS16 and expression analysis in tobacco transgenic plants // Plant Mol. Biol. 2000. V. 42. P. 499-513.

26. Grofi-Hardt R., Laux T. Shoots and buds // Encyclopedia of Life Sciences. Macmillan. 2001. P. 1-4.

27. Hall A. E., FiebigA., Preuss D. Beyond the arabidopsis genome: opportunities for comparative genomics // Plant Physiol. 2002. V. 129. P. 1439-1447.

28. Hartmann U., Hohmann S., Nettesheim K, WismanE., Saedler H., Huijser P. Molecular cloning of SVP: a negative regulator of the floral transition in Arabidopsis // Plant J. 2000. V. 21. P. 351-360.

29. Hayama R., Coupland G. The molecular basis of diversity in the photoperiodic flowering responses of arabidopsis and rice // Plant Physiol. 2004. V. 135. P. 677684.

30. He Y., Amasino R.M. Role of chromatin modification in flowering-time control // Trends Plant Sci. 2005. V. 10. P. 30-35.

31. Henderson I.R., Shindo C., Dean C. The need for winter in the switch to flowering//Annu. Rev. Genet. 2003. V. 37. P. 371-392.

32. Hepworth S., Valverde F., Ravenscroft D., Mouradov A., Coupland G. Antagonistic regulation of flowering-time gene SOC1 by CONSTANS and FLC via separate promoter motifs// EMBO J. 2002. V. 21. P. 4327-4337.

33. Hofer J., Turner L., Hellens R., Ambrose M., Matthews P., Michael A., Ellis N. UNIFOLIATA, regulates leaf and flower morphogenesis in pea // Curr. Biol. 1997. V. 7. P. 581-587.

34. HongR.L., Hamaguchi L., Busch M.A., Weigel D. Regulatory elements of floral homeotic gene AGAMOUS identified by phylogenetic footprinting and shadowing //Plant Cell. 2003. V. 15. P. 1296-1309.

35. Johanson U., West J., Lister C., Michaels S. D., Amasino R. M, Dean C. Molecular analysis of FRIGIDA, a major determinant of natural variation in Arabidopsis flowering time // Science. 2000. V. 290. P. 344-347.

36. Kayes J.M., Clark S.E. CLAVATA2, a regulator of meristem and organ development in Arabidopsis II Development. 1998. V. 125. P. 3843-3851.

37. Kelly A. J., Bonnlander M.B., Meeks-Wagner D.R. NFL, the tobacco homolog of FLORICAULA and LEAFY, is transcriptionally expressed in both vegetative and floral meristems // Plant Cell. 1995. V. 7. P. 225-234.

38. Kim C.H., Jeong D.H., An G.H. Molecular cloning and characterization of OsLRKl encoding a putative receptor-like protein kinase from Oryza sativa II Plant Sci. 2000. V. 152. P. 17-26.

39. Kim S-H., MizunoK, Fujimura T. Isolation of MADS-box genes from sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) expressed specifically in vegetative tissues // Plant Cell Physiol. 2002. V. 43. P. 314-322.

40. Meyerowitz E.M. Genetic control of cell division patterns in developing plants // Cell. 1997. V. 88. P. 299-308.

41. Michaels S.D., Amasino R.M. FLOWERING LOCUS С encodes a novel MADS domain protein that acts as a repressor of flowering // Plant Cell. 1999. V. 11 P. 949-956.

42. Michaels S.D., Amasino R.M. Memories of winter: vernalization and competence to flower // Plant, Cell and Environment. 2000. V. 23. P. 1145-1153.

43. Michaels S.D., Amasino R.M. Loss of FLOWERING LOCUS С activity eliminates the late-flowering phenotype of FRIGIDA and autonomous pathway mutations but not responsiveness to vernalization // Plant Cell. 2001. V. 13 P. 935-941.

44. Michaels S.D., Ditta G., Gustafson-Brown C., PelazS., Yanofsky M, Amasino R.M. AGL24 acts as promoter of flowering in Arabidopsis and is positively regulated by vernalization // Plant J. 2003 V. 33. P. 867-874.

45. Molinero-Rosales N. Jamilena M., ZuritaS., Gomez P., CapelJ., Lozano R. FALSIFLORA, the tomato orthologue of FLORICA ULA and LEAFY, controls flowering time and floral meristem identity // Plant J. 1999. V. 20. 685-693.

46. Moon J., Suh S., Lee H., Choi K., Hong С. В., Раек N., Kim S. The SOC1 MADS-box gene integrates vernalization and gibberellin signals for flowering in Arabidopsis II Plant J. 2003. V. 35. P. 613-623.

47. Mouradov A., Cremer F., Coupland G. Control of flowering time: interacting pathways as a basis for diversity // Plant Cell. 2002. Supplement. P. SI 11-S130.

48. MuraiK., Miyamae M., Kato H., TakumiS., Ogihara Y. WAP1, a weat APETALA1 homolog, plays a central role in the phase transition from vegetative to reproductive growth // Plant Cell Physiol. 2003. V. 44. P. 1255-1265.

49. Murren C.J., Pendleton N., Pigliucci M. Evolution ofphenotypic integration in Brassica (Brassicaceae) // Am. J. Bot. 2002. V. 89. P. 655-663.

50. Oh S-H., Potter D. Phylogenetic utility of the second intron of LEAFY in Neillia and Stephanandra (Rosaceae) and implications for the origin of Stephanandra II Mol. Phylogenet. Evol. 2003. V. 29. P. 203-215.

51. Oh S-H., Potter D. Molecular phylogenetic systematics and biogeography of tribe Neillieae (Rosaceae) using DNA sequences of cpDNA, rDNA, and LEAFY II Am. J. Bot. 2005. V. 92. P. 179-192.

52. Osborn T.C. The contribution of polyploidy to variation in Brassica species // Physiol. Plant. 2004. V. 121. P. 531-536.

53. Osborn T.C., Kole C., Parkin I.A.P., SharpeA.G., Kuiper M., LydiateD.J., Trick M. Comparison of flowering time genes in Brassica гара, B. napus and Arabidopsis thaliana II Genetics. 1997. V. 146. P. 1123-1129.

54. Osterberg K.M., Shavorskaya O., Lascoux M., Lagercrantz U. Naturally occurring indel variation in the Brassica nigra COL1 gene is associated with in flowering time//Genetics. 2002. V. 161. P. 299-306.

55. Pires J.C., Zhao J., Schranz M.E., Leon E.J., Quijada P.A., Lukens L.N., Osborn T.C. Flowering time divergence and genomic rearrangements in resynthesized Brassica polyploids (Brassicaceae) // Biol. J. Linn. Soc. 2004. V. 82. P. 675-688.

56. Prasad K., Kushalappa K., Vijayraghavan U. Mechanism underlying regulated expression of RFL, a conserved transcription factor, in the developing rice inflorescence//Mechanisms of Development. 2003. V. 120. P. 491-502.

57. Putterill J., Laurie R., Macknight R. It's time to flower: the genetic control of flowering time // BioEssays. V. 26 P.363-373.

58. Ratcliffe O.J., Kumimoto R.W., Wong B. J., Riechmann J.L. Analysis of the Arabidopsis MADS AFFECTING FLOWERING gene family: MAF2 prevents vernalization by short periods of cold 11 Plant Cell. 2003. V. 15. P. 1159-1169.

59. Robert L.S., RobsonF., SharpeA., LydiateD., Coupland G. Conserved structure and function of the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS in Brassica napus I/ Plant Mol. Biol. 1998. V. 37. P. 763-772.

60. Sagai Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A., AllardR. W. Ribosomal DNA Spacer-Length Polymorphism in Barley: Mendelian Inheritance, Chromosomal Location, and Population Dynamics // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 8014—8018.

61. Sambrook, Russel Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001.

62. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. P. 5463-5467.

63. Schlappi M. RNA levels and activity of FLOWERING LOCUS С are modified in mixed genetic backgrounds of Arabidopsis thaliana II Int. J. Plant Sci. 2001. V. 162. P. 527-537.

64. SchoofH., LenhardM., Haecker A., Mayer K., Jurgens G., Laux T. The stem cell population of arabidopsis shoot meristems is maintained by a regulatory loop between the CLAVATA and WUSCHEL genes // Cell. 2000. V. 100. P. 635-644.

65. Schranz M.E., Osborn T.C. De novo variation in life-history traits and responses to growth conditions of resynthesized polyploids Brassica napus (Brassicaceae) // Am. J. Bot. 2004. V. 91. P. 174-183.

66. Schranz M.E., Quijada PA., SungS-B., Lukens L.N., Amasino R.M., Osborn T.C. ф Characterization and effects the replicated flowering time gene FLC in Brassicaгара II Genetics. 2002. V. 162. P. 1457-1468.

67. Scortecci K.C. Michaels S.D., Amasino R.M. Identification of a MADS-box gene, FLOWERING LOCUS M, that represses flowering II Plant J. 2001. V. 26. P. 229236.

68. Searle I.R., MenA.E., Laniya T.S., Buzas D.M., Iturbe-Ormaetxe I., Carroll B.J., GresshoffP.M. Long-distance signaling in nodulation directed by a CLAVATA 1-like receptor kinase // Science. 2003. V. 299. P. 109-112.

69. Sharma V.K., Fletcher J.C. Maintenance of Shoot and Floral Meristem Cell

70. Proliferation and Fate // Plant Physiol. 2002. V. 129. P. 31-39.

71. Shavorskaya O.A. Identification of genes affecting flowering time variation in Brassica species // PhD dissertation. 2004. Swedish University of Agricultural Sciences. Uppsala

72. Sheldon C.C., ConnA.B., Dennis E.S., Peacock W.J. Different regulatory regions are required for the vernalization-induced repression of FLOWERING LOCUS С and for the epigenetic maintenance of repression // Plant Cell. 2002. V. 14. P. 2527-2537.

73. Simpson G.G., Dean C. Arabidopsis, the ftosetta Stone of flowering time? //

74. Science. 2002. V. 296. P. 285-289.

75. Souer E., van der Krol A., Kloos D., Spelt С., BliekM., Mol J., Koes R. Genetic control of branching pattern and floral identity during Petunia inflorescence development//Development. 1998. V. 125. P. 733-742.

76. Stone J.M., TrotochaudA.E., Walker J.C., ClarkS.E. Control ofmeristem development by CLAVATA1 receptor kinase and kinase-associated phosphatase interactions // Plant Physiol. 1998. V. 117. P. 1217-1225.

77. Sung S., Amasino R. M. Vernalization and epigenetics: how plants rememberwinter // Curr. Opin. Plant Biol. 2004. V. 7. P. 4-10.

78. TadegeM., Shaldon C.C., Helliwell C.A., StoutjesdijkP., Dennis E.S., Peacock W.J. Control of flowering time by FLC orthologues in Brassica napus II Plant J. 2001. V. 28. P. 545-553.

79. Tadege M., Shaldon C.C., Helliwell C.A., Upadhyaya N.M., Dennis E.S., Peacock W.J Reciprocal control of flowering time by OsSOCl in transgenic Arabidopsis and by FLC in transgenic rice // Plant Biotech. J. 2003. V. 1. P. 361-369.

80. Taguchi-Shiobara F., Yuan Z, Hake S., Jackson D. The facsiated ear2 gene encodes a leucine-rich repeat receptor-like protein that regulates shoot meristem proliferation in maize // Genes Dev. 2001. V. 15. P. 2755-2766.

81. Trevaskis В., Bagnall D.J., Ellis M.H., Peacock W.J., Dennis E.S. MADS box genes control vernalization-induced flowering in in cereals // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 13099-13104.

82. UN. Genome analysis in Brassica with special reference to the experimental formation of B. napus and peculiar mode of fertilization // Jpn. J. Bot. 1935. V. 7. P. 389-452.

83. Van de Peer Y, de Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the microsoft windows environment//Сотр. Appl. BioSci. 1994. V. 10. P. 569-570.

84. Waites R., Simon R. Signaling cell fate in plant meristems: three clubs on one tousle // Cell. 2000. V. 103. P. 835-838.

85. Westman A.L., Kresovich S. Simple sequence repeat (SSR)-based marker variation in Brassica nigra genebank accessions and weed populations // Euphytica. 1999. V. 109. P. 85-92.

86. Yamamoto E., Karakaya H.C., Knap H. T. Molecular characterization of two soybean homologs of Arabidopsis thaliana CLA VATA1 from the wild type and fasciation mutant // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1491. P. 333-340.

87. Yamamoto E., KnapH.T. Soybean receptor-like protein kinase genes: paralogous divergence of a gene family // Mol. Biol. Evol. 2001. V. 18. P. 1522-1531.

88. Yan L., Loukoianov A., Tranquilli G., Helguera M, Fahima Т., Dubkovsky J. Positional cloning of the weat vernalization gene VRN1II Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2003. V. 100. P. 6263-6268.

89. Yanovsky M, Kay S. Living by the calendar: how plants know when to flower // Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2003. V. 4. P. 265-275.

90. YuK, Ito Т., Wellmer F., Meyerowitz E.M. Repression of AGAMOUS-LIKE 24 is a crucial step in promoting flower development // Nature Genet. 2004. V. 36. P. 157-161.