Создание ДНК маркеров геномов A, B и C Brassica

Панкин, Артем Андреевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание ДНК маркеров геномов A, B и C Brassica
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Создание ДНК маркеров геномов A, B и C Brassica"

0034В3923

На правах рукописи

ПАНКИН Артем Андреевич СОЗДАНИЕ ДНК МАРКЕРОВ ГЕНОМОВ А, В И С BRASSICA

Специальность 03.00.23. - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

< ¿Up¿::з

Москва 2009

003463923

Работа выполнена в лаборатории ДНК маркеров растений ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Эмиль Ефимович Хавкин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Виталий Анатольевич Пухальский

кандидат сельскохоз. наук Анна Майевна Артемьева

Ведущая организация: Московский государственный университет

им. М.В. Ломоносова, биологический факультет

Защита диссертации состоится__2009 г. в _часов на

заседании диссертационного совета Д006.027.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская 42; тел. (495) 977-65-44, факс (495) 977-09-47; e-mail: iab@iab.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии

Автореферат разослан_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

С.А. Меликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. ДНК маркеры, основанные на методе полимеразной цепной реакции (ПЦР), просты в использовании, экономически эффективны и дают быстрые результаты по сравнению с маркерами, основанными на методах гибридизации (например, RFLP). Однако, в силу высокой стоимости анализов, большинство созданных к настоящему времени ПЦР маркеров (AFLP, SSR), трудно использовать для массового обследования селекционного материала (например, анализа расщепляющихся популяций). Для селекционеров особенно удобны SCAR (sequence characterized amplified region) маркеры: в отличие от ПЦР методов, генерирующих многочисленные фрагменты ДНК, SCAR маркеры дают однозначно интерпретируемые результаты (единственный фрагмент ДНК или его отсутствие).

Рис. 1. Взаимоотношения В, juncea — В. nigra ' —>■ B.camata геномов Brassica (треугольник

U). Тетраплоидные виды с хромосомными наборами ААВВ, ААСС и ВВСС происходят от диплоидных видов с геномами АА, ВВ и СС.

AB В ВС

(1п=18) (Тп=8) (1п=17)

В. гара В. oleracea

А С

(1п=10) 0п=9)

В. napus АС

(1п=19)

В соответствии с моделью треугольника U (U, 1935), тетраплоидные виды (В. juncea, геномы ААВВ, 2п=36; В. carinata, ВВСС, 2п=34; В. napus, ААСС, 2п=38) возникли в результате природной гибридизации исходных диплоидных видов Brassica (В. rapa, АА, 2п=20; В. nigra, ВВ, 2п=16; В. oleracea, СС, 2п=18). Все эти виды Brassica, предположительно, произошли от одного общего предка, однако многие исследователи считают, что виды,

содержащие геномы А и С, выделились из одной линии Brassica, а виды, содержащие геном В, - из другой (Schranz et al., 2006).

ДНК маркеры трех геномов являются незаменимыми инструментами для быстрой и надежной идентификации видов Brassica. На сегодняшний день не существует интегрированного набора геном-специфичных SCAR маркеров Brassica, позволяющих решать широкий спектр практических и фундаментальных задач. Для решения различных селекционных задач, связанных с применением метода интрогрессивной гибридизации, необходим набор различных ДНК маркеров. В частности, в селекции рапса (В. napus), сурепицы и овощных форм В. rapa и капусты (В. oleráceo) важную роль играет интрогрессия генетического материала генома В, который несет гены/признаки устойчивости к таким грибным и бактериальным болезням, как черная ножка рапса (патоген Leptosphaeria maculans; Christianson et al., 2006) и сосудистый бактериоз (патоген Xanthomonas campestris pv. campestris-, Vicente et al., 2002), а также к засухе и повышенным температурам (Kumar, 1984) и осыпаемости семян (Prakash and Chopra, 1988). Поэтому создание надежных и простых в использовании ДНК маркеров генома В позволит значительно ускорить процесс интрогрессии этих и других хозяйственно ценных генов/признаков в новые сорта. Чтобы эффективно проследить за переносом генома В такой набор должен содержать ДНК маркеры, рассеянные по всем хромосомам генома В, и маркеры отдельных хромосом или участков хромосом генома В.

Геном-специфичные SCAR маркеры являются полезными инструментами для решения проблем сравнительной генетики и геномики, молекулярной систематики и таксономии, поддержания и оценки коллекций семян Brassica в генетических банках.

помощью маркеров (marker-assisted selection, MAS), и верифицировать их путем анализа широкого круга близкородственных и отдаленных форм трибы Brassiceae. Оценить возможность использования полученных маркеров в исследованиях по молекулярной систематике, сравнительной геномике, в работе по поддержанию генетических коллекций и при решении задач интрогрессивной селекции.

Научная новизна исследования. Получены новые данные о структурном полиморфизме и хромосомной локализации трех типов повторяющихся последовательностей и локусов/аллелей шести генов Brassica. Созданы и подробно охарактеризованы восемнадцать новых SCAR маркеров геномов А, В и С Brassica, основанных на анонимных и транслируемых последовательностях генома. Подтверждена гипотеза о близком родстве генома S. arvensis с геномом В Brassica.

Практическая значимость работы. Показана принципиальная возможность использования геном-специфичных SCAR маркеров для эффективного мониторинга генетического материала в интрогрессивной селекции рапса, безошибочной идентификации видов Brassica и филогенетических исследований в пределах трибы Brassiceae. Уточнена видовая принадлежность трех образцов Brassica и трех образцов Sinapis, полученных из трех генетических банков. В одном случае была соотнесена номенклатура групп сцепления и дополненных хромосом В. nigra.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение» и «Заключение», выводов и списка литературы, включающего 228 названий. Работа изложена на 145 машинописных страницах, содержит 27 рисунков и 11 таблиц.

Работа была поддержана грантами РФФИ (проект №06-04-48932) и ИНТ АС (проект YSF 06-1000014-5717).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе был использован растительный материал шести культурных видов Brassica и одиннадцати дикорастущих видов трибы Brassiceae, а также Cornelina sativa в качестве отдаленной родственной формы. Семена были получены из шести генетических коллекций: Всероссийского института растениеводства имени Н.И. Вавилова (ВИР), Санкт-Петербург, Россия, Centre for Genetic Resources (CGN), Вагенинген, Нидерланды, Universidad Politécnica de Madrid (UPM), Мадрид, Испания, Research Centre - AAFC (CN), Саскатуун, Канада, Warwick Horticulture Research International (WHRI), Уеллесборн, Великобритания и UMR INRA (INRA), Ренн, Франция. Для локализации ДНК маркеров были использованы хорошо охарактеризованные дополненные линии В. nigra - В. napus (Chevre et al. 1991) для пяти хромосом В. nigra. Автор благодарит всех коллег, предоставивших этот материал в его распоряжение.

Геномную ДНК выделяли из свежесобранных или высушенных листьев с помощью модифицированного СТАВ метода (Sagai-Maroof et al., 1984). Амплификацию ДНК и электрофорез фрагментов ДНК проводили по стандартным методикам (Sambrook and Russel, 2001). Рестрикцию ДНК для CAPS анализа проводили с использованием эндонуклеазы М1у\ по стандартным методикам. Для клонирования фрагментов ДНК использовали лабораторный штамм Е. coli DH5a и pGEM®-T Vector System (Promega). Дот-гибридизацию фрагментов ДНК проводили с помощью AlkPhos Direct™ labelling system (GE Healthcare) с последующей детекцией результатов с помощью ECF™ субстрата (GE Healthcare). Для сканирования и анализа мембран был использован Typhoon 9200 Variable Mode Imager с программным пакетом Image Quant (GE Healthcare).

Для идентификации клонированных последовательностей, их анализа, поиска гомологии в базах данных, множественного выравнивания, подбора и оптимизации ПЦР праймеров были использованы следующие программы:

NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), Lasergene 7.0 (DNASTAR) и Oligonucleotide Properties Calculator

(http://www.basic.northwestern.edu/biotools). Поиск гомологии осуществлялся по базам данным NCBI GenBank (CoreNucleotide, EST, GSS), JCVI (http://www.jcvi.org/cms/research/groups/plant-genomics/resources) и BrassicaDB (http://brassica.bbsrc.ac.uk).

Генетическое картирование проводили путем генотипирования картирующих популяций В. oleracea AGDH (136 дигаплоидных линий) и NGDH (96 дигаплоидных линий; Sebastian et al., 2000, Pink et al., 2008). Программный пакет Joinmap 4.0 (Stam, 1993) был использован для анализа данных и картирования маркеров на интегрированной карте В. oleracea (Sebastian et al., 2000). Алгоритм картирования Joinmap 4.0 был настроен для дигаплоидных картирующих популяций. Для расчета расстояний между маркерами на генетической карте использовали функцию Косамби (Kosambi, 1944).

Маркеры, полученные в данной работе, обозначали следующим образом: GenX.N.Y, где GenX (А, В или С) - геномная специфичность маркера; N - источник SCAR маркера: микросателлитные локусы, повторяющиеся последовательности или гены (М, R или название гена, соответственно) и Y - хромосомная локализация геном В-специфичных маркеров на дополненных хромосомах В. nigra. В случае геном В-специфичных SCAR маркеров, преобразованных из микросателлитных локусов, локализация которых не известна, Y соответствует наименованию микросателлитного локуса. В качестве примера приведем маркер GenB.M.l -геном В-специфичный маркер, преобразованный из микросателлитного локуса, локализованный на дополненной хромосоме Nil. Обозначения локусов генов и соответствующих им локус-специфичных маркеров соответствуют номенклатуре, предложенной Ostegaard and King (2008).

Для геномов А и С названия и нумерация групп сцепления Brassica, используемые в данной работе, соответствуют оригинальной номенклатуре

цитируемых авторов, а в скобках указана нумерация, предложенная MBGP (http://www.brassica.info/resource/maps/lg-assignrnents.php). Для генома В номенклатура групп сцепления Gx соответствует данным Lagercrantz and Lydiate (1995), а Вх - Panjabi et al. (2008). Хромосомы В. nigra в дополненных линиях В. nigra - В. napus обозначаются в данной работе как Ni+номер хромосомы, например Nil.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Алгоритм создания геном-специфичных маркеров был следующим. Клонированные и секвенированные, а в некоторых случаях извлеченные из Генбанка NCBI куклеоткдные последовательности, принадлежащие В-геномным видам Brassica, были использованы для построения множественных выравниваний с гомологичными последовательностями из геномов А и С, обнаруженными при поиске с помощью программы BLAST. Такие выравнивания позволили выявить полиморфные участки (моно-, ди-, три- нуклеотидные замены, инделы), присущие каждому из трех геномов. ПЦР праймеры, комплементарные этим геном-специфичным полиморфизмам, были созданы и оптимизированы для амплификации геном-специфичных SCAR маркеров. ПЦР праймеры подбирались по следующим параметрам: температура отжига 60-70°С, отсутствие вторичных структур (шпилек), отсутствие самокомплементарности. Проверка праймеров с помощью программы BLAST по базам NCBI минимизировала возможность случайной (не относящейся к прототипу) амплификации. Оптимизация условий специфичной ПЦР реакции включала в себя подбор оптимальной температуры отжига праймеров, продолжительности денатурации, отжига праймеров и синтеза, а также числа циклов реакции.

SCAR маркеры генома В. Анализ полиморфизма шести видов Brassica, образующих треугольник U, с помощью фрагментов генома, амплифицируемых PawS праймерами (Rogowsky et al., 1992), в применении к различению видов и подвидов дает результаты, которые хорошо согласуются с общепризнанной таксономией этих видов. Анализ спектров, полученных с

помощью праймера PawS5, обнаружил геном B-специфичный фрагмент размером 390 п.н. Нуклеотидные последовательности этого фрагмента, клонированного из В. carinata, В. juncea и В. nigra, оказались идентичными на 95%. Выравнивание этих последовательностей с гомеологами из геномов А и С обнаружило полиморфные участки, характерные для генома В. Один из таких участков был использован для создания специфичного ПЦР праймера, который, в сочетании со вторым неспецифичным праймером, был использован для амплификации геном B-специфичного SCAR маркера GenB.R. 1-8. Соответствие нуклеотидной последовательности GenB.R.1-8 прототипу было верифицировано клонированием и секвенированием.

Для проверки специфичности гибридизации фрагмент GenB.R.1-8 был использован в качестве зонда для дот-гибридизации с шестью видами Brassica. Зонд GenB.R.1-8 связывался только с ДНК видов Brassica, содержащих геном В.

При исследовании дополненных линий В. nigra - В. napus SCAR маркер GenB.R.1-8 был найден на всех пяти доступных нам дополненных хромосомах В. nigra (рис. 2). Для проверки специфичности и локализации GenB.R.1-8 на всех хромосомах В. nigra был проведен FISH анализ (Г.И. Карлов и М.Г. Дивашук, неопубликованные данные). Сигналы от GenB.R.1-8 были обнаружены на всех 16 хромосомах В. nigra, на 16 из 34 хромосомах В. carinata (геном ВВСС), предположительно, соответствующих геному В, но отсутствовали на хромосомах В. napus (геном ААСС).

Из базы данных Brassica Microsatellite Information Exchange DB (http://www.brassica.info/resource/markers/ssr-exchange.php; Lowe et al., 2004) и из публикации Hopkins et al. (2007) были отобраны 12 предполагаемых геном B-специфичных микросателлитных маркеров (SSR). Характерные для генома В фрагменты удалось получить только для четырех локусов (NÍ2-B01, Ni2-Н06, NÍ2-E04, NÍ2-E12). Эти фрагменты были клонированы из В. carinata, В. juncea и В. nigra и секвенированы (табл. 1). Нуклеотидные последовательности SSR локуса PBCESSRJU8 (Hopkins et al., 2007) из В.

juncea (локус генома В), а также локуса Nal2-A02 (Lowe et al., 2004) из В. nigra, В. juncea и В. carinata были извлечены из Генбанка NCBI (табл. 1). Идентичность нуклеотидных последовательностей для каждого микросателлитного локуса в трех B-геномных видах Brassica составляла 82100%. Изменчивость обуславливалась числом микросателлитных повторов, также наблюдались мононуклеотидные замены и ивделы во фланкирующих последовательностях. Сравнение микросателлитных локусов из генома В с их гомеологами из геномов А и С позволило выявить несколько полиморфных участков, специфичных для генома В. ПЦР праймеры, комплементарные полиморфным участкам, позволили преобразовать шесть SSR локусов в геном B-специфичные SCAR маркеры, генерирующие одиночные фрагменты ДНК.

С помощью дополненных линий SCAR маркеры GenB.M.l, GenB.M.2, GenB.M.3 и GenB.M.5, полученные из SSR локусов Ni2-B01, Ni2-H06, Nal2-A02 and Ni2-E12, были локализованы, соответственно, на хромосомах В. nigra Nil, №2, Ni3 и №5 (рис. 2). SCAR маркеры GenB.M.E04 и GenB.M.JU8, соответствующие локусам Nil-E04 и PBCESSRJU8, не удалось связать ни с одной из хромосом В. nigra в пяти имеющихся в нашем распоряжении дополненных линиях; предположительно, эти маркеры находятся на трех других хромосомах.

ДНК фрагмент, амплифицируемый с праймером OPF-IO и локализованный на хромосоме Ni4, был отобран из RAPD маркеров, описанных Chèvre et al. (1996). Гомологичные RAPD фрагменты были клонированы из трех B-геномных видов Brassica. Путем сравнения нуклеотидных последовательностей из генома В с их гомеологами из геномов А и С были выделены вариабельные участки, характерные для генома В, и на них были подобраны специфичные ПЦР праймеры, амплифицирующие SCAR маркер GenB.R.4. Ассоциация GenB.R.4 с хромосомой Ni4 была установлена с помощью дополненных линий В. nigra -В. napus (рис. 2).

Поиск гомологии гена устойчивости к черной ножке Lml из В. nigra (Wretblad et al., 2003) выявил 37 EST последовательностей из гй/л?, oleráceo и fi. napus со значительным уровнем гомологии. Выравнивание последовательности Lm¡ с этими EST клонами позволило сконструировать геном В-специфичные праймеры. SCAR маркер GenB.Lml не удалось связать ни с одной из пяти дополненных хромосом В. nigra.

I Хромосомы генома В I п.н. М Nil Ni2 Ni3 Ni4 Ni5 Bna 500

mmm тшт mm mm0 GenB.R.1-8

250

300 200

GenB.M.1

500 —» *"*_GenB.COL1.1

— GenB.M.2

250

GenB.M.3 GenB.R.4 GenB.M.5

GenB.LFYa.5

500 —

250 — *

Рис. 2. Хромосомная локализация геном В-специфичных SCAR маркеров с помощью дополненных линий В. nigra - В. napus. М - Маркеры молекулярной массы GeneRuler, Nil - Ni5 -хромосомы В. nigra 1-5, дополненные линии В. nigra - В. napus, Bna - В. napus (геном АС), в качестве отрицательного контроля.

Полноразмерные нуклеотидные последовательности интрона 2 гена идентичности меристем LEAFY (LFY) и последовательности вариабельных участков интрона 2 LFY были выравнены со всеми фрагментами LFY, доступными в базах данных, а также с гомологичными GSS клонами,

извлеченными из Генбанка. Обнаруженные таким образом полиморфные последовательности позволили создать геном B-специфичный SCAR маркер GenB.LFYa.5. SCAR маркер GenB.LFYa.5 был локализован на хромосоме Ni5 (рис. 2).

Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей генов семейства CONSTANS (СО) позволило выявить полиморфные участки, присущие генам COLI и СОЬ из В. nigra. Индел длиной 35 п.н., специфичный для COLI, и мононуклеотидные замены, характерные для СОЬ из В. nigra, были использованы для создания специфичных ПЦР праймеров. SCAR маркер GenB.COLl.l был локализован на хромосоме Nil (рис. 4), тогда как GenB.COb не удалось связать ни с одной из пяти дополненных хромосом.

SCAR маркеры геномов А и С. Помимо характерных для генома В полиморфизмов, множественные выравнивания нуклеотидных последовательностей генов LFY и COLI с их гомологами позволили сконструировать геном А- и С-специфичные праймеры. Таким образом, были получены SCAR маркеры GenA.LFYa, GenC.LFYa, GenA.COLl и GenC.COLl, различающие гомеологи генов LFY и COLI из геномов А и С и отличающие их от гомеологов из генома В. Соответствие нуклеотидных последовательностей маркеров GenA.LFYa и GenC.LFYa прототипам было верифицировано прямым секвенированием. Нуклеотидные последовательности GenA.LFYa и GenC.LFYa из дигаплоидных родительских линий картирующих популяций AGDH и NGDH идентичны, что лишило нас возможности провести генетическое картирование этих маркеров. Анализ выравнивания гомологов LFY показал, что маркеры GenA.LFYa и GenC.LFYa являются локус-специфичными и соответствуют LFYa, одному из двух локусов LFY.

Так как данные о местоположении локусов LFY на группах сцепления В. oleracea не опубликованы, их локализация была проведена путем ассоциации LFY с RFLP маркерами Brassica (Parkin et al., 2005), картированными на хромосомах арабидопсиса.

Таблица 1. Хромосомная локализация и последовательности-прототипы геном-специфичных 5 Полужирным шрифтом выделены нуклеотидные последовательности, клонированные авторо\

Маркер Хромосомная локализация Источник прототипа Регистр.№ прототипа в Генбанке Маркер Хромосомная локализация Ист про-

GenB.R.1-8 Nil-Ni8 В. nigra DQ517336" GenB.LFYa.5 Ni5 В.

В. juncea DQ516717 GenB.M.JU8 не устан. В-,)

В. carinata DQ516716 GenB.Lml не устан. в.

GenB.M.l Nil В. nigra DQ665816 GenB.M.E04 не устан. в.

В. juncea DQ665817 в-J

В. carinata DQ665818 В. с

GenB.COLl.l Nil (B2) В. nigra AF510449-AF510489 GenB.COb не устан. В.

GenB.M.2 Ni2 В. nigra EF196659 GenA.LFYa А2 или А6 в.

В. juncea EF196658 GenC.LFYa СЗ В. о

В. carinata EF196657 GenC.KASl С2 В. о

GenB.M.3 Ni3 В. nigra DQ327821 GenC.KAS2 С6 В.

В. juncea DQ327824 GenA.COLl А2 B.I

В. carinata DQ327822 В.

GenB.R.4 Ni4 В. nigra EF526097 В.

В. juncea EF526098 GenC.COLl С2, СЗ, С9 В. о

В. carinata EF526099

GenB.M.5 Ni5 В. nigra EF094544

В. juncea EF094545

В. carinata EF094546

В результате ген LFY был локализован на расстоянии 42 т.п.н. upstream от маркера pW141 в пределах консервативного блока F; по-видимому, этот ген сцеплен с RFLP маркером pW141, картированным на группах сцепления В. oleracea 02 (С2; Sebastian et al., 2000) и 08 (С8; как Wg7A8; Saal et al., 2001), а также на группах сцепления В. rapa R2 (А2) и R6 (А6) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/mapview/map_search.cgi?taxid=3711). Локус-специфичность SCAR маркеров GenA.COLl и GenC.COLl не была проверена, а их связь с группами сцепления В. rapa R2 (А2; Axelsson et al., 2001) и В. oleracea 02, ОЗ и 09 (С2, СЗ и С9; Axelsson et al., 2001 и неопубликованные данные М. Kearsey) нуждается в дальнейшем уточнении.

Поиск гомологов нуклеотидных последовательностей генов 3-KETOACYL-ACYL CARRIER PROTEIN SYNTH ASE I и 2 (КAS! и KAS2) из В. napus обнаружил гомологичные EST и GSS. Специфичные для генома С SCAR маркеры GenC.KASl и GenC.KAS2 были сконструированы на основе полиморфизмов, выявленных путем анализа множественных выравниваний KAS1 и К AS2 с их гомеологами (Табл. 1). Секвенирование и анализ нуклеотидных последовательностей GenC.KASl и GenC.KAS2 из дигаплоидных линий В. oleracea показали, что эти SCAR маркеры диморфны и соответствуют двум локусам генов KASI (соответственно, BolC.Kasl.a и BolC.Kasl.b) и KAS2 (BolC.Kas2.a и BolC.Kas2.b). Для генетического картирования этих локусов на интегрированной карте В. oleracea (Sebastian et al. 2000) были созданы три локус-специфичных SCAR маркера и один CAPS маркер. Локусы BolC.Kasl.a и BolC.Kasl.b, составляющие GenC.KASl, были локализованы в нижней части группы сцепления С2 между маркерами pR72Jl and pR20El в позиции 75.51 сМ, a BolC.Kas2.a и BolC.Kas2.b, входящие в состав GenC.KAS2, были картированы на нижней части группы сцепления С6 между маркерами AC-CTAJ06 и рОЮЕ2 в положениях 63.45 сМ и 66.61 сМ, соответственно (рис. 5).

С2

С6

AA-CATR;4

AA-CATE2'

PRS6J1 рО'ЗбЕ*

AVCATE07

pWW2E2

PW.56E3

SR25E'

pNSSEl

AC-CTAJÖ3

pO-mj:

pD'.TE' АС-САТЕЭ6 ^-IAC-CTAJ02 PR34E2 PW.54J-,

~ AA-CATR'4 AA-CATJM pW161 J1 AA-CATJ10 pWIOUJ AC-CTCR2Q AC-CATS 12 AA-CATHM

pNsosEjki мят

AC-CACR'i

AC-CTCE'2

pWISOUl

PVV577E3N

pW"2öE2

pW148£2N

ptyZ'bJ-

AA-CA7E23 AC-CATE02

AA-CA7E0" AA.-CATJ02 AC-CAAJ02 AA-CATJ85 AC-CTAJO'i

AC-CAAR07 AC-CATJ04 AC-CATJ03 AI-CTAR05 PO-25E2

ac-ctcr:-

P055E2 AA-CA7R.26

AC-CATR-0

pR72J-

BolC.Kaslb BolC.Kssl.3

pR20E! pWS67£! P012DE1 jf-pWt41E1 pOt13E2 AACATRS6 ас-стаей

AC-CTCE01 AC-CAGJ01 AA-CATE05 AC-CTCE07 SVAC-CACRÜ7 -"-Е- AC-CTCR08 S- pVV10lE4N AC-CTCR03 AA-CATEÜ4 .Л pRSJEWM ;Kac-cacei3

л pN180£4 pRME2 »AC-CTAR08 AC-CTAR07 pVY221Et AC-CTCJ05 Р0124Е1 pW103E 1 pVV228J1 tAC-CATElO AC-CACE06 p010E1 AA-CATJ08 pRME1 plV180R2 p012SE2 рОШЕЗ AC-CACE12 pW197E2 pS29 pW134J 1 mMGAt11.i1 AC-CATE18 AC-CACR06 ACCTAR18 mBNMB4 p01ME2 AC-CTAJ06 BoiC.Kas2.fl BolC.Kas2.b p010E2 mCa72

Рис. 5. Интегрированная генетическая карта групп сцепления В. о1егасеа С2 и Сб. Маркеры, картированные в данной работе, указаны стрелками и выделены полужирным шрифтом.

Верификация SCAR маркеров. Геном-специфичные SCAR маркеры были верифицированы путем скрининга расширенной выборки (118 образцов), представляющей шесть культурных видов Brassica. Восемь из двенадцати геном B-специфичных SCAR маркеров (GenB.R. 1-8, GenB.M.l, GenB.M.2, GenB.M.3, GenB.R.4, GenB.M.5, GenB.M.E04 и GenB.COb) были

проверены по всей описанной выше выборке образцов растений. Четыре остальных SCAR маркера генома В и все маркеры геномов А и С были проверены по ограниченной выборке образцов (два образца каждого из шести культурных видов Brassica). Маркеры GenA.LFYa, GenC.LFYa, GenC.KASl и GenC.KAS2 были дополнительно верифицированы по 39 дигаплоидным линиям В. rapa, В. oleráceo и В. napus. Все SCAR маркеры оказались строго геном-специфичными. Следует отметить, что в образцах В. nigra CGN06635, CGN06628, помимо маркеров, присущих геному В, был обнаружен геном С-специфичный SCAR маркер GenC.LFYa. Все маркеры, характерные для геномов В и А, были найдены в образце В. rapa CGN07213.

Изучение филогенетических взаимоотношений видов трибы Brassiceae. С этой целью мы исследовали образцы видов Coincya, Erucastrum, Sinapis и Trachystoma, входящих в так называемую линию генома В (В genome lineage; Warwick and Sauder, 2005). Для скрининга мы использовали выборку из девяти геном B-специфичных маркеров, геном А-специфичный маркер GenA.COLl и геном С-специфичный маркер GenC.LFYa. Геном B-специфичные SCAR маркеры были обнаружены только в образцах S. arvensis. Пять созданных нами геном B-специфичных SCAR маркеров (GenB.R.1-8, GenB.M.2, GenB.M.3, GenB.M.5 и GenB.LFYa.5) были найдены во всех 15 исследованных образцах S. arvensis, тогда как в образцах S. arvensis CN111341, ВИР4166 и ВИР4262 были обнаружены девять геном-В специфичных SCAR маркеров. Следует отметить, что фрагменты SCAR маркеров у S. arvensis отличались по длине от соответствующих фрагментов В. nigra. Три образца S. arvensis отличались от остальных образцов этого вида: так, в образце S. arvensis ВИР4166 был обнаружен геном С-специфичный SCAR маркер, а образцы S. arvensis CN111341 и ВИР4262 содержали геном A-специфичный маркер.

ОБСУЖДЕНИЕ

Универсальный SCAR маркер генома В. ПЦР праймеры PawS5, использованные для создания маркера GenB.R.1-8, были сконструированы Rogowsky et al. (1992) для амплификации фрагментов семейства повторяющихся последовательностей R173 (Guidetet al., 1991), специфичных для ржи, которые в дальнейшем использовались как гибридизационные зонды для идентификации хромосом ржи. В случае Brassica эти ПЦР праймеры были успешно использованы для различения видов, входящих в треугольник U. На основе одного из таких фрагментов (PawS5-390) был создан универсальный SCAR маркер GenB.R.1-8.

Специфичная гибридизация GenB.R.1-8 доказывает его уникальность для генома В по всей длине нуклеотидной последовательности зонда, а не только в местах, комплементарных ПЦР праймерам. Локализация GenB.R.1-8 на всех хромосомах В. nigra была установлена с помощью FISH анализа; кроме того, GenB.R.1-8 был найден на пяти доступных для" анализа дополненных хромосомах В. nigra.

Обнаружение нескольких копий GenB.R.1-8, рассеянных по хромосомам В. nigra, и отсутствие гомологий с известными повторяющимися последовательностями и мобильными элементами подтверждают, что GenB.R.1-8 относится к уникальным, ранее не описанным повторяющимся элементам генома В.

Хромосом-специфичные SCAR маркеры генома В. Генетическое разнообразие микросателлитных локусов было использовано для поиска характерных для генома В ампликонов, которые были затем преобразованы в SCAR маркеры, распознающие отдельные хромосомы В. nigra. Нуклеотидные последовательности SSR локусов из В. nigra, В. carinata и В. juncea, описанные в данной работе, различались количеством динуклеотидных повторов, а также многочисленными заменами и инделами в областях, фланкирующих микросателлиты.

Четыре SCAR маркера GenB.M.l, GenB.M.2, GenB.M.3 и GenB.M.5, преобразованные из SSR локусов, пригодны для анализа интрогрессии хромосом Nil, Ni2, Ni3 и Ni5. Два других микросателлитных SCAR маркера, по-видимому, располагаются на хромосомах В. nigra Ni6, Ni7 и/или №8, для которых отсутствуют дополненные линии.

Маркер GenB.Lml был создан на основе последовательности гена Lml устойчивости к черной ножке из В. nigra. Ранее Wretblad et al. (2003) локализовали этот ген на группах сцепления В. nigra G3 (В7) и G8 (ВЗ). Однако нам не удалось связать SCAR маркер GenB.Lml, отличающий Lml В. nigra от его гомеологов из А и С геномов, ни с одной из пяти дополненных хромосом В. nigra.

Chèvre с соавторами (1996) обнаружили несколько RAPD маркеров, сцепленных с дополненной хромосомой Ni4, ассоциированной с устойчивостью к черной ножке как на стадии семядолей, так и на стадии взрослого растения. Один их этих маркеров (OPF-10.400) был преобразован в SCAR маркер GenB.R.4, и его расположение на хромосоме Ni4 было подтверждено с помощью дополненных линий.

Локализация двух независимых маркеров GenB.Lml и GenB.R.4 на разных дополненных хромосомах косвенно подтверждает существование в геноме В нескольких генетических локусов устойчивости к черной ножке.

Три геном B-специфичных SCAR маркера GenB.COLl.l, GenB.COb и GenB.LFYa.5 были получены на основе последовательностей генов COLI, COb и LFV, контролирующих переход к цветению. Геном-специфичные полиморфные участки интрона 2 LFY были использованы нами для создания SCAR маркеров, различающих гомеологи LFY из А, В и С геномов Brassica.

В геноме арабидопсиса гены LFY и COLI находятся на противоположных концах хромосомы 5, тогда как у В. nigra маркеры GenB.COLl.l и GenB.LFYa.5 были локализованы на разных хромосомах -№2 и Ni5, соответственно. Маркер GenB.COb не удалось связать с

определенными дополненными хромосомами В. nigra. Axelsson et al. (2001) картировали COLI на группе сцепления G2 (В8), а СОЪ на группе сцепления G8 (ВЗ). Локализация LFY на группах сцепления В. nigra на сегодняшний день неизвестна.

Таким образом, все геном B-специфичные SCAR маркеры, за исключением GenB.R.1-8, оказались специфичными для отдельных хромосом В. nigra. Ни в одном случае мы не наблюдали перекрестной локализации, когда один и тот же SCAR маркер обнаруживался на двух или более хромосомах.

SCAR маркеры геномов А и С. Использование картирующих популяций В. rapa, В. oleracea и В. napus позволяет не только установить хромосомную принадлежность маркеров, но и сравнительно точно определить их положение на группах сцепления по отношению к ранее картированным маркерам. Геном А- и С-специфичные маркеры были получены на основе последовательностей генов LFY, COLI, KAS1 и KAS2. В этом случае уже известные сведения о локализации генов-прототипов позволяют установить те участки хромосом (групп сцепления), интрогрессия которых может быть прослежена с помощью геном-специфичных маркеров.

Долгое время считалось, что ген LFY является однокопийным, однако, по сообщению G. Teakle, LFY представлен в диплоидных геномах Brassica, как минимум, двумя полиморфными локусами. Нуклеотидные последовательности двух локусов LFY значительно отличались друг от друга. Однако остается открытым вопрос, связан ли определенный локус с фенотипическими проявлениями экспрессии LFY или каждый из двух локусов ад дитивно вносит свой вклад в разнообразие функций LFY.

Один из локусов LFY был картирован на группе сцепления В. rapa R6 (Аб) с помощью AthLFY (At5g61850) в качестве RFLP зонда (Kim et al. 2006). Маркеры GenA.LFYa и GenC.LFYa специфичны для локуса LFYa, который был картирован на группе сцепления В. oleracea СЗ, тогда как локус LFYb

находится на группе сцепления С2 (G. Teakle, персональное сообщение). Полученные другими авторами данные частично подтверждены в нашей работе с помощью in silico гибридизации RFLP маркеров Brassica на хромосомах арабидопсиса. С помощью такого подхода LFY был локализован на расстоянии 40 т.п.н. от маркера pW141, который находится на группах сцепления В. rapa R2 (А2) и R6 (А6) и В. oleracea 02 (С2) и 08 (С8). В масштабах генома расстояние в 40 т.п.н. считается небольшим. По-видимому, в ходе эволюции геномов Brassiceae LFY и pW141 оказались сцеплены и наследовались в составе одного из консервативных блоков (Schranz et al., 2006), однако для надежного обоснования такого предположения потребуются прямые доказательства. Подтвердить данные о локализации LFY, а, следовательно, и производных SCAR маркеров GenA.LFYa и GenC.LFYa, с помощью генетического картирования не удалось, так как последовательности интрона 2, клонированные из родительских линий, оказались идентичными. Хотя интрон 2 LFY высокополиморфен и различается у видов Brassica и других растений, он неожиданно оказался очень консервативным у подвидов В. oleracea и линий В. г ара.

COLI в геномах А и С был картирован Axelsson et al. (2001) на группах сцепления R2 (А2), 09 (С9), а по неопубликованным данным группы М. Kearsey, еще два локуса COLI расположены на группах сцепления 02 (С2; АМ295779) и ОЗ (СЗ; АМ295781). У арабидопсиса гены LFY и COLI расположены на хромосоме 5, однако у Brassica LFY и COLI лишь в некоторых случаях сохранили такую связь (группы сцепления R2 (А2), 03 (СЗ) и 06 (С6)), тогда как в геноме В они оказались диссоцициироваными эволюционными процессами трипликации геномов Brassica и хромосомными транслокациями.

Гены KASI и KAS2 функционируют на начальных этапах пути биосинтеза всех жирных кислот растения (Barker et al., 2007). На основании

полиморфизма нуклеотидных последовательностей KASI и KAS2 нами были созданы геном С-специфичные SCAR маркеры, соответственно, GenC.KASl и GenC.KAS2. Верификация путем секвенирования показала, что полосы SCAR маркеров GenC.KASl и GenC.KAS2 содержат по две последовательности, соответствующие двум локусам генов KAS1 и KAS2. Интегрированная карта Sebastian et al. (2000) была использована для определения локализации локусов KAS1 и KAS2, составляющих геном С-специфичные SCAR маркеры GenC.KASl и GenC.KAS2, так как генетическое картирование этих маркеров было проведено с использованием разных картирующих популяций. GenC.KASl был локализован в одном положении на нижней части группы сцепления С2. Очевидно, локусы KAS1, составляющие GenC.KASl, располагаются тандемом на небольшом расстоянии друг от друга. Маркер GenC.KAS2 был картирован на нижней части группы сцепления Сб. Локусы KAS2 также оказались тандемно солокализованы на расстоянии 3,1 сМ.

Верификация SCAR маркеров. Геном-специфичные SCAR маркеры были верифицированы путем сопоставления нуклеотидных последовательностей маркера и фрагмента генома, послужившего его прототипом, и с помощью скрининга расширенной выборки образцов шести культурных видов Brassica. Во всех случаях нуклеотидные последовательности SCAR маркеров соответствовали прототипу (степень соответствия 95-100%). Меж- и внутривидовые вариации по длине амплифицируемых фрагментов и обнаруженные различия в нуклеотидных последовательностях SCAR маркеров и прототипов, полученных из разных образцов Brassica, свидетельствуют о полиморфной природе исследуемых фрагментов генома.

Скрининг расширенных выборок образцов шести видов Brassica показал, что SCAR маркеры являются строго геном-специфичными.

Изучение филогенетических взаимоотношений видов трибы Brassiceae. На основании анализа хлоропластной ДНК Warwick и Black (1991) разделили трибу Brassiceae на полифилетические группы генома В (В. nigra) и геномов А/С (В. rapa/B. oleracea). В последующей работе Warwick et al. (2005) использовали разнообразные ДНК маркеры для построения филогении Brassiceae. Во всех случаях В. nigra образовывала общую кладу с S. arvensis со значениями бутстрепа более 95%. Филогенетический анализ, основанный на полиморфизме генов самонесовместимости Brassica (S-locus related genes), также выявил монофилетический кластер, объединяющий В. nigra и S. arvensis (Inaba and Nishio, 2002).

С целью проверить гипотезу близкого родства диких видов Brassiceae, входящих в группу В генома, с В геномом Brassica мы отобрали 26 образцов, принадлежащих десяти видам Brassiceae, для скрининга с геном-специфичными SCAR маркерами. Этот скрининг показал, что за пределами трех видов Brassica, содержащих геном В, только геном S. arvensis содержит характерные для генома В участки (footprints), что подтверждает данные Warwick et al. (2005). Судя по различиям в электрофоретической подвижности одних и тех же маркеров у В. nigra и S. arvensis, межвидовая консервативность общих фрагментов генома не является полной. Во всех образцах S. arvensis были обнаружены только пять из девяти геном В-специфичных SCAR маркеров, что подтверждает значительные отличия геномов В. nigra и S. arvensis.

Культурные виды Brassica и дикорастущие виды Brassiceae могут перекрестно опыляться в естественных условиях, образуя межвидовые гибриды (Jorgensen and Andersen, 1994). S. arvensis и дикорастущие В. rapa и В. oleracea - широко распространенные сорные растения, часто произрастающие в местах культивирования генетически модифицированных линий рапса и сурепицы. Таким образом, перекрестная гибридизация культурных и диких видов Brassiceae может приводить к переносу

чужеродного гена (трансгена), встроенного в геном культурных видов Brassica, в природные популяции. Мониторинг популяций дикорастущих Brassiceae с помощью геном-специфичных SCAR маркеров позволяет эффективно отслеживать возможное образование межвидовых гибридов и, следовательно, распространение трансгена в природных популяциях. Следует отметить, что созданные в данной работе SCAR маркеры позволяют отличать В геном Brassica от генома S. arvensis.

Идентификация образцов Brassica в генетических коллекциях. В большинстве случаев подлинность образцов, депонированных в генбанках Brassica, оценивают с помощью фенотипических признаков растений. Набор геном-специфичных SCAR маркеров, созданный в данной работе, позволяет ускорить валидизацию образцов в генбанках Brassica.

Верификация геном-специфичных SCAR маркеров позволяет считать, что все полученные в данной работе маркеры являются строго специфичными для геномов А, В или С. Однако в некоторых случаях принадлежность исследуемого образца к определенному виду Brassica или S. arvensis была поставлена под сомнение. Так, в образце В. rapa ssp. nipposinica CGN07213 (геном А) мы нашли все маркеры, характерные для геномов А и В, что заставляет рассматривать этот образец как В. juncea. Zhao с соавторами (2005) также обнаружили значительные отличия CGN07213 от остальных В. rapa по фенотипу и спектрам AFLP маркеров. Таким образом, на основании комплексных данных образец CGN07213 был реклассифицирован в В. juncea. В образцах В. nigra CGN06635 и CGN06628, помимо маркеров генома В, был найден геном С-специфичный SCAR маркер GenC.LFYa. Эти данные позволили определить образцы CGN06635 и CGN06628 как В. carinata. Три из пятнадцати образцов S. arvensis CN111341, ВИР4166 и ВИР4262 содержали все геном B-специфичные SCAR маркеры, что позволяет предположить принадлежность этих образцов к В-геномным видам Brassica. Помимо этого, образцы CN111341 и ВИР4262 содержали

геном A-специфичные, а образец ВИР4166 - геном С-специфичные маркеры. Совокупность этих данных позволила переопределить CN111341 и ВИР4262 как В. juncea, а ВИР4166 - как В. carinata. Эти результаты были подтверждены и приняты кураторами соответствующих генетических коллекций.

Приведенные результаты указывают на эффективность использования геном-специфичных SCAR маркеров при поддержании генетических коллекций Brassica.

Номенклатура хромосом и групп сцепления генома В. Эффективное использование таких генетических ресурсов, как генетические карты и ДНК маркеры, возможно только при наличии общедоступной унифицированной номенклатуры, принятой исследователями, работающими с определенным родом или видом растений. В случае геномов А и С такая номенклатура создана для большинства генетических ресурсов (Multinational Brassica Genome Project; http://www.brassica.info/resource/maps/lg-assignments.php) и эффективно используется исследователями в различных лабораториях. В случае генома В общепринятая номенклатура пока отсутствует; существуют четыре системы нумерации хромосом и групп сцепления. Нумерации групп сцепления Gx (Lagercrantz and Lydiate, 1995) и Bx (Panjabi et al., 2008) не совпадают, однако их соответствие было установлено с помощью маркеров, общих для двух карт. Две другие системы, используемые для локализации маркеров на хромосомах В. nigra, - это хромосомы дополненных линий В. nigra - В. napus (Chèvre et al., 1991) и хромосомы, кариотипированные с помощью FISH с использованием маркеров 5S и 45S рДНК (Maluszynska and Hasterok, 2005), Неотложной задачей является установление соответствия между двумя последними системами и номенклатурой групп сцепления В. nigra.

Геном B-специфичный SCAR маркер GenB.COLl.l, отличающий локус COLI из генома В от его гомеологов из геномов А и С, был локализован на

дополненной хромосоме Nil, тогда как ген COLI был картирован на группе сцепления В. nigra G2. Исходя из полученных данных, можно утверждать, что дополненная хромосома Nil соответствует группе сцепления G2 (В8). Соответствие других дополненных хромосом группам сцепления В. nigra пока установить не удалось, так как геном-специфичные SCAR маркеры, сконструированные на основе генов с известным положением на генетической карте, не были обнаружены на хромосомах дополненных линий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Созданные в данной работе SCAR маркеры, специфичные для трех геномов культурных видов Brassica и их отдельных хромосом, позволяют решать многие проблемы сравнительной геномики, эволюции и филогении растений и селекции, включая поиск перспективных источников хозяйственно ценных генов/признаков и картирование соответствующих локусов, скрининг большого количества образцов (например, в расщепляющихся популяциях) с наименьшими затратами ресурсов, а также проверку подлинности образцов в генетических банках и решение различных задач семеноводства и защиты авторских прав селекционеров.: Геном-специфичные SCAR маркеры, равномерно рассеянные по геному, позволяют выявить дикие виды Brassiceae, родственные видам Brassica, что ставит вопрос о необходимости уточнения и, возможно, пересмотра современной классификации видов трибы Brassiceae. В частности, с помощью маркеров генома В было подтверждено близкое родство S. arvensis и В. nigra, что косвенно подтверждает модель разделения видов трибы Brassiceae на линии геномов В и А/С с независимой эволюционной историей. Наконец, набор SCAR маркеров, специфичных для трех геномов культурных видов Brassica, уже удалось использовать для установления подлинности нескольких образцов семенного материала.

Геном- и локуе-специфичные SCAR маркеры, созданные на основе последовательностей генов, могут стать ценными инструментами для мониторинга интрогрессии гомеологических локусов и аллелей этих генов в практической селекции. Однако для эффективного использования этих SCAR маркеров в программах MAS необходимо установить прямую связь маркеров с фенотипическими проявлениями хозяйственно-ценных признаков (устойчивость к черной ножке, время зацветания, содержание масла).

В отсутствие общедоступных картирующих популяций для генома В, обязательным условием успешного применения созданных нами маркеров для решения задач геномики и селекции Brassica является установление связи между принятой научным сообществом номенклатурой групп сцепления и нумерацией дополненных хромосом В. nigra. Мы показали, что набор хромосом-специфичных SCAR маркеров генома В позволяет эффективно решать и такую задачу.

ВЫВОДЫ

1. Получены новые данные о строении недостаточно исследованного генома В Brassica, в том числе о структурном полиморфизме и хромосомной локализации анонимных повторяющихся последовательностей PawS, микросателлитных локусов и локусов/аллелей генов COLI, СОЬ, KAS1, KAS2, LFY w Lml.

2. Созданы и подробно охарактеризованы восемнадцать новых SCAR маркеров, позволяющих обнаружить геном В в целом и отдельные хромосомы и участки хромосом геномов А, В и С Brassica, в частности, созданы и картированы локус-специфичные SCAR и CAPS маркеры генов семейства KAS.

3. На основе последовательностей нескольких генов созданы SCAR маркеры, которые могут стать полезными инструментами для

молекулярной селекции на хозяйственно-ценные признаки (устойчивость к черной ножке, время зацветания, содержание масла).

4. Вновь созданные маркеры пригодны для использования в исследованиях по молекулярной эволюции Brassicaceae: в частности, с помощью маркеров генома В была подтверждена гипотеза о близком родстве генома S. arvensis с геномом В Brassica.

5. Впервые получены данные о соответствии дополненной хромосомы Nil группе сцепления G2 (В8) на генетической карте В. nigra.

6. Вновь созданные маркеры пригодны для практического использования при описании и оценке генетических коллекций Brassica: в частности, с их помощью была уточнена номенклатура трех образцов Brassica и трех образцов S. arvensis.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Анискина Ю.В., Бирюкова В.А., Велишаева Н.С., Панкин А.А., Прибылова Т.А., Хавкин Э.Е., Шилов И.А. ДНК генотипирование растений Brassica и Solanum II Сельскохоз. биология. 2005. № I.e. 111-120.

2. Воробьев В.А., Мартынов В.В., Панкин А.А., Хавкин Э.Е. Полиморфизм гена LEAFY у растений Brassica I/ Физиология растений. 2005. Т. 52. с. 814820.

3. Анискина Ю.В., Панкин А.А., Хавкин Э.Е., Шилов И.А. ДНК-маркер хромосомы III генома В Brassica. II Доклады РАСХН. 2006. №. 4. с. 15-16.

4. Панкин А.А., Воробьев В.А., Хавкин Э.Е. Полиморфизм интрона 2 гена FLORICAULA/LEAFYу растений рода Brassica II Физиология растений. 2008. Т. 55. с. 507-512.

5. Khavkin Е.Е., Martynov V.V., Pankin А.А., Vorobiev V.A. Homologs of Arabidopsis flowering genes in Brassica species. // Flowering Newsletter. 2005. №39. p. 38-43.

6. Aniskina Yu.V., Martynov V.V., Pankin A.A., Khavkin E.E., Shilov I.A. Three methods for DNA fingerprinting of Brassica Crops. In: Biotechnology, agriculture

and the food industry (G.E. Zaikov, ed.): Nova Science Publishers, New York. 2006. p. 1-6.

7. Pankin A.A., Khavkin E.E. DNA Markers of Brassica В genome may facilitate introgressing drought tolerance. The 2nd International Conference on Integrated Approaches to Sustain and Improve Plant Production Under Drought Stress (InterDrought II). 2005. Rome, Italy.

8. Панкин A.A., Хавкин Э.Е. Видоспецифичные фрагменты генома

как инструмент анализа межвидовых гибридов Brassica. Пятое международное совещание по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений. 2005. Санкт-Петербург, Россия.

9. Панкин А.А., Хавкин Э.Е. ДНК маркер В генома Brassica. Международная конференция «Актуальные проблемы генетики». 2005. Минск, Беларусь.

10. Pankin A.A., Chèvre A.M., Karlov G.I., Khavkin E.E. A suite of DNA markers for Brassica genome В. XV Federation of European Societies of Plant Biology (FESPB) Congress. 2006. Lyon, France.

11. Панкин А.А., Шевре A.M., Дивашук М.Г., Карлов Г.И., Хавкин Э.Е. ДНК маркеры генома В в растениях Brassica. Вторая Вавиловская международная конференция «Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке: состояние, проблемы, перспективы». 2007. Санкт-Петербург, Россия.

12. Pankin A.A., Khavkin Е.Е., Chèvre A.M., Divashuk M.G., Karlov G.I. A Suite of SCAR Markers for Brassica Genomes and Its Individual Chromosomes. International Conference "Molecular Mapping and Marker Assisted Selection in Plants". 2008. Vienna, Austria.

13. Pankin A.A. DNA markers of Brassica genome B. UK-Brassica Research Community Meeting. 2008. Wellesbourne. Great Britain.

http://www.brassica.info/ukbrc/meetings/may08/12_ArtemPankin_WHRI_UKBR C_May08.pdf

14. Pankin A.A., Khavkin E.E., Chèvre A.M., Divashuk M.G., Karlov G.I. A Suite of SCAR Markers for Brassica Genome В and Its Individual Chromosomes. 5th ISHS International Symposium on Brassicas and the 16th Crucifer Genetics Workshop. 2008. Lillehammer, Norway.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Объем 1,5 печ.л. Заказ 4574 Тираж 100 экз.

Бумага для множительных аппаратов. Печать офсетная. Формат 60x84/16. Типография ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Панкин, Артем Андреевич

Сокращения.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Систематика и таксономия Brassicaceae (Cruciferae).

1.2. Геномы видов Brassica.

1.3. Молекулярные инструменты для выявления полиморфизма, различения и идентификации геномов Brassica.

1.4. Патенты, основанные на использовании ДНК маркеров Brassica и методах получения растений, устойчивых к заболеваниям.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание ДНК маркеров геномов A, B и C Brassica"

Актуальность проблемы. ДНК маркеры, основанные на методе полимеразной цепной реакции (ПЦР), просты в использовании, экономически эффективны и дают быстрые результаты по сравнению с маркерами, основанными на методах гибридизации (например, RFLP). Однако, в силу высокой стоимости анализов, большинство созданных к настоящему времени ПЦР маркеров (AFLP, SSR), трудно использовать для массового обследования селекционного материала (например, анализа расщепляющихся популяций). Для селекционеров особенно удобны SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) маркеры: в отличие от ПЦР методов, генерирующих многочисленные фрагменты ДНК, SCAR маркеры дают однозначно интерпретируемые результаты (единственный фрагмент ДНК или его отсутствие).

Многочисленные виды семейства Brassicaceae включают широко распространенные овощные, масличные, кормовые и технические культуры, в том числе капусту (Brassica oleracea L.) во всем многообразии ее подвидов и разновидностей, листовые овощи (главным образом, В. rapa L.) и масличный рапс {В. napus L.); значение последней культуры быстро возрастает в связи с производством биотоплива. В соответствии с моделью треугольника U (U, 1935), тетраплоидные виды (ß. juncea, геномы ААВВ; В. carinata, ВВСС; В. napus, ААСС) возникли в результате природной гибридизации исходных диплоидных видов Brassica {В. rapa, АА; В. nigra, ВВ; В. oleracea, СС). Все эти виды Brassica предположительно произошли от одного общего предка, однако многие исследователи считают, что виды, содержащие геномы А и С, выделились из одной линии Brassica, а виды, содержащие геном В, - из другой (Schranz et al., 2006; Warwick and Sauder, 2005).

ДНК маркеры трех геномов являются незаменимыми инструментами для быстрой и надежной идентификации видов Brassica. Для решения различных селекционных задач, связанных с применением метода интрогрессивной гибридизации, необходим набор различных ДНК маркеров. В частности, в селекции рапса {В. napus), сурепицы и овощных форм В. rapa и капусты (В. oleráceo) важную роль играет интрогрессия генетического материала генома В, который несет гены/признаки устойчивости к таким грибным и бактериальным болезням, как черная ножка рапса, фомоз, или сухая гниль капусты (патоген Leptosphaeria maculans; Christianson et al., 2006; Delourme et al., 2006) и сосудистый бактериоз (патоген Xanthomonas campestris pv. campestris; Vicente et al., 2002), а также к засухе и повышенным температурам (Kumar, 1984) и осыпаемости семян (Prakash and Chopra, 1988). Поэтому создание надежных и простых в использовании ДНК маркеров генома В позволит значительно ускорить процесс интрогрессии этих и других хозяйственно ценных генов/признаков в новые сорта. Чтобы проследить за переносом генома В в целом такой набор должен содержать ДНК маркеры, равномерно рассеянные по всем восьми хромосомам генома В. Маркеры отдельных хромосом или участков хромосом генома В, несущих гены хозяйственно ценных признаков, позволяют провести более детальный анализ результатов гибридизации, а также проследить за переносом хозяйственно ценных генов/признаков, если эти маркеры картированы на конкретных хромосомах. В инрогрессивной селекции рапса в большинстве случаев используются тетраплоидные виды Brassica, содержащие геном В (В. carinata и В. juncea), так как формирование жизнеспособного потомства при слиянии родственных видов с одинаковой плоидностью более вероятно, чем при скрещивании диплоидного и тетраплоидного родителей (Warwick et al., 2006). В связи с этим применение геном-специфичных SCAR маркеров, различающих гомеологические локусы тетраплоидных геномов, значительно упрощает отбор интрогрессивных линий.

Геном-специфичные SCAR маркеры являются вспомогательными инструментами для решения проблем сравнительной генетики и геномики, молекулярной систематики и таксономии, под держания и оценки коллекций семян Brassica в генетических банках.

Цель и задачи исследования. Провести сравнительные исследования полиморфизма анонимных и транслируемых участков геномов видов Brassica, входящих в треугольник U. Создать на этой основе геном-специфичные SCAR маркеры, пригодные для использования в селекции с помощью маркеров (marker-assisted selection, MAS), и верифицировать их путем анализа широкого круга близкородственных и отдаленных форм трибы Brassiceae. Оценить возможность использования полученных маркеров в исследованиях по молекулярной систематике, сравнительной геномике, в работе по поддержанию генетических коллекций и при решении задач интрогрессивной селекции.

Практическая значимость работы. Показана принципиальная возможность использования геном-специфичных SCAR маркеров для эффективного мониторинга генетического материала в интрогрессивной селекции рапса, безошибочной идентификации видов Brassica и филогенетических исследований в пределах трибы Brassiceae. В ходе работы была исправлена видовая принадлежность трех образцов Brassica и трех образцов Sinapis, полученных из трех генетических банков. В одном случае была соотнесена номенклатура групп сцепления и дополненных хромосом В. nigra.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Панкин, Артем Андреевич

выводы

Получены новые данные о строении недостаточно исследованного генома В Brassica, в том числе о структурном полиморфизме и хромосомной локализации анонимных повторяющихся последовательностей PawS, микросателлитных локусов и локусов/аллелей генов COLI, СОЪ, KÄS1, KAS2, LFYnLml. Созданы и подробно охарактеризованы восемнадцать новых SCAR маркеров, позволяющих обнаружить геном В в целом и отдельные хромосомы и участки хромосом геномов А, В и С Brassica, в частности, созданы и картированы локус-специфичные SCAR и CAPS маркеры генов семейства KAS.

На основе последовательностей нескольких генов созданы SCAR маркеры, которые могут стать полезными инструментами для молекулярной селекции на хозяйственно-ценные признаки (устойчивость к черной ножке, время зацветания, содержание масла). Вновь созданные маркеры пригодны для использования в исследованиях по молекулярной эволюции Brassicaceae: в частности, с помощью маркеров генома В была подтверждена гипотеза о близком родстве генома S. arvensis с геномом В Brassica.

Впервые получены данные о соответствии дополненной хромосомы Nil группе сцепления G2 (В8) на генетической карте В. nigra. Вновь созданные маркеры пригодны для практического использования при описании и оценке генетических коллекций Brassica: в частности, с их помощью была уточнена номенклатура трех образцов Brassica и трех образцов S. arvensis.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Среди селекционных задач, решаемых с использованием геном-специфичных ДНК маркеров, следует выделить поиск перспективных источников хозяйственно ценных генов/признаков и картирование соответствующих локусов, скрининг большого количества образцов (например, в расщепляющихся популяциях) с наименьшими затратами ресурсов, а также проверку подлинности семенного материала в генетических банках и решение задач защиты авторских прав селекционеров.

Мы создали и охарактеризовали 18 SCAR маркеров, присущих трем геномам Brassica. В качестве исходного материала для создания этих маркеров использовали последовательности повтора PawS5-390, RAPD маркера OPF10-400, шести микросателлитных локусов и локусов/аллелей генов COLI, COb, KAS1, KAS2, LFYvl Lml, клонированные нами или извлеченные из Генбанка NCBI. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гомеологичных и гомологичных локусов исследованных нами элементов генома, полученных из диплоидных и полиплоидных Brassica, позволил сделать вывод об их полиморфной природе. Помимо полиморфизмов, характерных для видов и отдельных образцов Brassica, во всех случаях были обнаружены геном-специфичные полиморфные участки, которые были использованы для создания геном-специфичных SCAR маркеров. Соответствие нуклеотидных последовательностей пяти геном-специфичных SCAR маркеров их прототипам было верифицировано клонированием и секвенированием, в остальных случаях мы руководствовались совпадением фактического размера SCAR маркеров с теоретическим размером, предсказанным на основании анализа последовательностей-прототипов. Полосы SCAR маркеров содержали как единственный локус гена, в случае маркеров, полученных из LFY, так и два гомологичных локуса, в случае маркеров, полученных из генов KAS.

Геномная специфичность полученных SCAR маркеров была проверена скринингом расширенной выборки шести культурных видов Brassica и, в случае GenBRl-1, гибридизацией на хромосомы Brassica. Теоретически, расширенная выборка из 114 образцов Brassica охватывала большую часть аллельного разнообразия исследованных нами фрагментов генома. Однако разнообразие отобранных нами образцов Brassica специально не оценивалось, поэтому нельзя исключить, что для каждого вида Brassica можно найти генотипы, лишенные полученных нами геном-специфичных SCAR маркеров.

Геном B-специфичный SCAR маркер GenB.R.1-8, полученный из повторяющейся последовательности PawS5-350, рассеян по всем хромосомам

В. nigra. Остальные геном-специфичные SCAR маркеры, локализацию которых нам удалось установить с помощью дополненных линий или генетического картирования, оказались специфичными для отдельных хромосом и ни в одном случае не были обнаружены более чем на одной хромосоме. Локализация нескольких геном-специфичных маркеров не была установлена из-за отсутствия дополненных линий для хромосом Ni6, Ni7, Ni8 и/или невозможности проведения генетического картирования с

103 предоставленными в наше распоряжение популяциями В. oleracea AGDH и NGDH. Анализ литературных данных о локализации нескольких генов Brassica позволил предположительно связать полученные нами маркеры с определенными хромосомами, однако такие предположения должны быть в дальнейшем подтверждены прямым генетическим или физическим картированием.

Созданные в данной работе SCAR маркеры трех геномов культурных видов Brassica и их отдельных хромосом, позволяют решать многие проблемы сравнительной геномики, эволюции и филогении растений и селекции.

Геном-специфичные SCAR маркеры, равномерно рассеянные по геному, позволяют выявить дикие виды Brassiceae, родственные видам Brassica, что ставит вопрос о необходимости уточнения и, возможно, пересмотра современной классификации видов трибы Brassiceae. В частности, с помощью маркеров генома В было подтверждено близкое родство S. arvensis и В. nigra, что подкрепляет модель разделения видов трибы Brassiceae на линии геномов В и А/С с независимой эволюционной историей. Однако геном S. arvensis содержит только часть маркеров, характерных для генома В, причем их размер у S. arvensis заметно отличается от размера этих маркеров в геноме В. Такие отличия свидетельствуют о существенном расхождении геномов S. arvensis и В. nigra уже после разделения этих видов.

Геном- и локус-специфичные SCAR маркеры, созданные на основе последовательностей генов, могут стать ценными инструментами для мониторинга интрогрессии гомеологических локусов и аллелей этих генов в практической селекции. Однако для эффективного использования этих SCAR маркеров в программах MAS необходимо установить прямую связь этих маркеров с фенотипическим проявлением хозяйственно-ценных признаков (устойчивость к черной ножке, время зацветания, содержание масла).

Для удобства проведения научной и практической работы и стандартизации данных по геномике видов Brassica, содержащих геном В, в дальнейшем необходимо связать систему нумерации групп сцепления и дополненных хромосом В. nigra. Мы показали, что набор хромосом-специфичных SCAR маркеров генома В позволяет эффективно решать и такую задачу.

Наконец, набор SCAR маркеров, специфичных для трех геномов культурных видов Brassica, уже удалось использовать для установления подлинности нескольких образцов семенного материала.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Панкин, Артем Андреевич, Москва

1. Гончаров Н.П. Центры происхождения культурных растений. // Вест. ВОГиС. 2007. Т. 21. С. 561-574.

2. Дорофеев В.И. Тераты крестоцветных: их место в эволюции и систематике семейства. // Turczaninowia. 2002. V. 5. Р. 23-30.

3. Жуковский П.М. Культурные растения и их сородичи. // JI. Колос. 1971.

4. Синская Е.Н. Историческая география культурной флоры (На заре земледелия). // JI. Колос. 1969.

5. Aagaard J.E., Olmstead R.G., Willis J.H., Phillips P.C. Duplication of floral regulatory genes in the Lamiales. // Am. J. Bot. 2005. V. 92. P. 1284-1293.

6. Adams K.L., Wendel J.F. Polyploidy and genome evolution in plants. // Curr. Opin. Plant. Biol. 2005. V. 8 P. 135-141.

7. AGI, The Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. //Nature. 2000. V. 408. P. 796-815.

8. Ahearn K.P., Johnson H.A., Weigel D., Warner D.R. NFLl, a Nicotiana tabacum LEAFY-Wks, gene, controls meristem initiation and floral structure. // Plant Cell Physiol. 2001. V. 42. P. 1130-1139.

9. Ainouche M.L., Baumel A., Salmon A. Spartina anglica: a natural model system for studying early evolutionary changes that affect allopolyploid genomes. // Biol. J. Linn. Soc. Lond. 2004. V. 82 P. 475-484.

10. Alix K., Joets J., Ryder C., Moore J., Barker G., Bailey J., King G., (Pat) Heslop-Harrison J.S. The CACTA transposon 2?oi7played a major role in Brassica genome divergence and gene proliferation. // Plant J. 2008. V. 56. P. 1030-1044.

11. Alix K., Ryder C., Moore J., King G., Pat Heslop-Harrison J. The genomic organization of retrotransposons in Brassica oleracea. II Plant Mol. Biol. 2005. V. 59. P. 839-851.

12. Al-Shehbaz I.A. The genera of Brassiceae (Cruciferae; Brassicaceae) in the southeastern United States. // J. Arnold Arbor. Harv. Univ. 1985. V. 66 P. 279351.

13. Al-Shehbaz I., Beilstein M., Kellogg E. Systematics and phylogeny of the Brassicaceae (Cruciferae): an overview. // PL Syst. Evol. 2006. V. 259. P. 89-120.

14. Altschul S.F., Madden T.L., Schäffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs //Nucleic Acids Res. 1997. V. 25 P. 3389-3402.

15. Appel O. The so-called 'beak', a character in the systematic of Brassicaceae? // Bot. Jahr. Syst. Pflanzengesch. Pflanzengeogr. 1999, V. 121 P. 85-98.

16. Axelsson T., Bowman C.M., Sharpe A.G., Lydiate D.J., Lagercrantz U. Amphidiploid Brassica juncea contains conserved progenitor genomes. // Genome. 2000. V. 43. P. 679-688.

17. Babula D., Kaczmarek M., Barakat A., Delseny M., Quiros C.F., Sadowski J. Chromosomal mapping of Brassica oleracea based on ESTs from Arabidopsis thaliana: complexity of the comparative map. // Mol. Genet. Genomics. 2003. V. 268. P. 656-665.

18. Bailey C.D., Koch M.A., Mayer M., Mummenhoff K., O'Kane S.L., Warwick S.I., Windham M.D., Al Shehbaz I.A. Toward a global phylogeny of the Brassicaceae. //Mol. Biol. Evol. 2006. V. 23 P. 2142-2160.

19. Bailey C.D., Price R.A., Doyle J J. Systematics of the Halimolobine Brassicaceae: evidence from three loci and morphology. // Syst. Bot. 2002. V. 27. P. 318-332.

20. Baldwin B.G. Phylogenetic utility of the internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA in plants: An example from the compositae. // Mol. Phyl. Evol. 1992. V. l.P. 3-16.

21. Bansal V.K., Kharbanda P.D., Stringam G.R., Thiagarajah M.R., Tewari J.P. A comparison of greenhouse and field screening methods for blackleg resistance in doubled haploid lines of Brassica napus. // Plant Dis. 1994. V. 78. P. 276-281.

22. Baum D., Yoon H.-S., Oldham R. Molecular evolution of the transcription factor LEAFY in Brassicaceae. // Mol. Phylogenet. Evol. 2005. V. 37. P. 1-14.

23. Beilstein M.A., Al-Shehbaz I.A., Kellogg E.A. Brassicaceae phylogeny and trichome evolution. // Am. J. Bot. 2006. V. 93. P. 607-619.

24. Beilstein M., Al-Shehbaz I., Mathews S., Kellogg E. Brassicaceae phylogeny inferred from phytochrome A and ndhF sequence data: tribes and trichomes revisited. //Am. J. Bot. 2008. V. 95. P. 1307-1327.

25. Bing, D. J., Downey R.K., Rakow G.F.W. Potential of gene transfer among oilseed Brassica and their weedy relatives. // GCIRC 1991 Congress. 1991. P. 1022-1027.

26. Bing D.J., Downey R.K., Rakow G.F.W. Hybridizations among Brassica napus, B. rapa and B. juncea and their two weedy relatives B. nigra and Sinapis arvensis under open pollination conditions in the field. // Plant Breed. 1996. V. 115. P. 470-473.

27. Bohuon E.J.R., Keith D.J., Parkin I.A.P., Sharpe A.G., Lydiate D.J. Alignment of the conserved С genomes of Brassica oleracea and Brassica napus. II Theor. Appl. Genet. 1996. V. 93 P. 833-839.

28. Bomblies K., Wang R.-L., Ambrose B.A., Schmidt R.J., Meeley R.B., Doebley J. DuplicateFLORICAULA/LEAFYhomologszfll andzfl2 control inflorescence architecture and flower patterning in maize. // Development. 2003. V. 130. P. 2385-2395.

29. Brun H., Ruer D., Levivier S., Somda I., Renard M., Chèvre A.M. Presence in Leptosphaeria maculans populations of isolates virulent on resistance introgressed into Brassica napus from the В. nigra B-genome. I I Plant Pathol. 2001. V. 50. P. 69-74.

30. Carlsson A., Labrie S., Kinney A., von Weitstein-Knowies P., Browse J. A KAS2 cDNA complements the phenotypes of the Arabidopsis fab I mutant that differs in a single residue bordering the substrate binding pocket. // Plant J. 2002. V. 29. P. 761-770.

31. Cavell A.C., Lydiate D.J., Parkin I.A., Dean C., Trick M. Collinearity between a 30-centimorgan segment of Arabidopsis thaliana chromosome 4 and duplicated regions within the, Brassica napus genome. // Genome. 1998. V. 41 P. 62-69.

32. Chen B.Y., Simonsen V., Lannèr-Herrera C., Heneen W.K. A Brassica campestris-alboglabra addition line and its use for gene mapping, intergenomic gene transfer and the generation of trisomies. // Theor. Appl. Genet. 1992. V. 84. P. 592-599.

33. Chèvre A.M., Eber F., Barret P., Dupuy P., Brace J. Identification of the different Brassica nigra chromosomes from both sets of B. oleracea-B. nigra and B. napus

34. B. nigra addition lines with a special emphasis on chromosome transmission and self-incompatibility. //Theor. Appl. Genet. 1997. V. 94. P. 603-611.

35. Chèvre A.M., Eber F., This P., Barret P., Tanguy X., Brun H., Delseny M., Renard M. Characterization of Brassica nigra chromosomes and blackleg resistance in B. napus B. nigra addition lines. II Plant Breed. 1996. V. 115 P. 113-118.

36. Chèvre A.M., This P., Eber F., Deschamps M., Renard M., Delseny M., Quiros

37. C.F. Characterization of disomic addition lines Brassica napus Brassica nigra by isozyme, fatty acid and RFLP markers. // Theor. Appl. Genet. 1991. V. 81 P. 4349.

38. Choi S.R., Teakle G.R., Plaha P., Kim J.H., Allender C.J., Beynon E., Piao Z.Y., Soengas P., Han T.H., King G.J., Barker G.C., Hand P., Lydiate D.J., Batley J.,

39. Edwards D., Koo D.H., Bang J.W., Park B.S., Lim Y.P. The reference genetic linkage map for the multinational Brassica rapa genome sequencing project. // Theor. Appl. Genet. 2007. V. 115. P. 777-792.

40. Christianson J.A., Rimmer S.R., Good A.G., Lydiate D.J. Mapping genes for resistance to Leptosphaeria maculans in Brassica juncea. II Genome. 2006. V. 49. P. 30-41.

41. Chuang H.-Y., Tsao S.-J., Lin J.-N.J, Chen K.-S., Liou T.-D., Chung M.-C., Yang Y.-W. Genetic diversity and relationship of non-heading Chinese cabbage in Taiwan. //Bot. Bull. Acad. Sinica. 2004. V. 45. P. 331-337.

42. Chujo A., Zhang Z., Kishino H., Shimamoto K., Kyozuka J. Partial conservation of LFY function between rice and Arabidopsis. 11 Plant Cell Physiol. 2003. V. 44. P. 1311-1319.

43. Clarke L.A., Rebelo C.S., Gongalves J., Boavida M.G., Jordan P. PCR amplification introduces errors into mononucleotide and dinucleotide repeat sequences. //Mol. Pathol. 2001. V. 54. P. 351-353.

44. Collard B., Jahufer M., Brouwer J., Pang E. An introduction to markers, quantitative trait loci (QTL) mapping and marker-assisted selection for crop improvement: The basic concepts. // Euphytica. 2005. V. 142. P. 169-196.

45. Collard B.C., Mackill D.J. Marker-assisted selection: an approach for precision plant breeding in the twenty-first century. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2008. V. 363. P. 557-572.

46. Cooke R., Reeves J. Plant genetic resources and molecular markers: variety registration in a new era. // Plant Genet. Resour. 2003. V. 1. P. 81-87.

47. Crespo M.B., Lledo M.D., Fay M.F., Chase M.W. Subtribe Vellinae (Brassiceae, Brassicaceae): a combined analysis of ITS nrDNA sequences and morphological data. // Ann. Bot. 2000. V. 86. P. 53-62.

48. Crouch J.H., Lewis B.G., Mithen R.F. The effect of A-genome substitution on the resistance of Brassica napus to infection by Leptosphaeria maculans. II Plant Breed. 1994. V. 112. P. 265-278.

49. Delourme R., Chèvre A.M., Brun H., Rouxel T., Balesdent M., Dias J., Salisbury P., Renard M., Rimmer S. Major gene and polygenic resistance to Leptosphaeria maculans in oilseed rape (Brassica napus). II Eur. J. Plant Pathol. 2006. V. 114. P. 41-52.

50. Divaret I., Margalé E., Thomas G. RAPD markers on seed bulks efficiently assess the genetic diversity of a Brassica oleracea L. collection. // Theor. Appl. Genet. 1999. V. 98. P. 1029-1035.

51. Dixelius C. Inheritance of the resistance to L. maculans of B. nigra and B.juncea in near isogenic lines of B. napus. II Plant Breed. 1999. V. 118. P. 151-156.

52. Dixelius C., Wahlberg S. Resistance to L. maculans is conserved in a specific region of Brassica B genome. // Theor. Appl. Genet. 1999. V. 99. P. 368-372.

53. Dusabenyagasani M., Fernando W.G.D. Development of a SCAR marker to track canola resistance against blackleg caused by Leptosphaeria maculans pathogenicity group 3. // Plant Dis. 2008. V. 92. P. 903-908.

54. Fluhr R. Sentinels of disease. Plant resistance genes. // Plant Physiol. 2001. V. 127. P. 1367-1374.

55. Ford C.S., Allainguillaume J., Grilli-Chantler P., Cuccato G., Allender C.J., Wilkinson M J. Spontaneous gene flow from rapeseed {Brassica napus) to wild Brassica oleracea. // Proc. R. Soc. B. V. 273. P. 3111-3115.

56. Fukuda H., Kondo A., Noda H. Biodiesel fuel production by transesterification of oils. //J. Biosci. Bioeng. 2001. V. 92 P. 405—416.

57. Fukui K., Nakayama S., Ohmido N., Yoshiaki H., Yambe M. Quantitative karyotyping of three diploid Brassica species by imaging methods and localization of 45SrDNA loci on the identified chromosomes. // Theor. Appl. Genet. 1998. V. 96. P. 325-330.

58. Gaeta R.T., Pires J.C., Iniguez-Luy F., Leon E., Osborn T.C. Genomic changes in resynthesized Brassica napns and their effect on gene expression and phenotype. // Plant Cell. 2007. V. 19 P. 3403-3417.

59. Getinet A., Rakow G., Raney J.P., Downey R.K. Glucosinolate content in interspecific crosses of Brassica carinata with B. juncea and B. napus. II Plant Breeding. 1996. V. 116 P. 39 46.

60. Gómez-Campo C. Taxonomy. // In C. Gómez-Campo ed. The biology of Brassica coenospecies. 1999. Elsevier Science B.V., Amsterdam. P. 3-32.

61. Graham S.W., Olmstead R.G. Utility of 17 chloroplast genes for inferring the phylogeny of the basal angiosperms. // Am. J. Bot. 2000. V. 87. P. 1712-1173.

62. Green E.D. Strategies for the systematic sequencing of complex genomes. // Nat. Rev. Genet. 2001. V. 2. P. 573-583.

63. Grob G.B.J., Gravendeel B., Eurlings M.C.M. Potential phylogenetic utility of the nuclear FLORICAULA/LEAFYsecond intron: comparison with three chloroplast DNA regions in Amorphophallus (Araceae). // Mol. Phylogenet. Evol. 2004. V. 30. P. 13-23.

64. Guidet F., Rogowsky P., Taylor C., Song W., Langridge P. Cloning and "characterisation of a new rye-specific repeated sequence. // Genome. 1991. V. 34. P. 81-87.

65. Gupta V., Lakshmisita G., Shaila M.S., Jagannathan V., Lakshmikumaran M.S. Characterization of species-specific repeated DNA sequences from B. nigra. II Theor. Appl. Genet. 1992. V. 84. P. 397-402.

66. Hansen L.N., Earle E.D. Transfer of resistance to Xanthomonas campestris pv campestris into Brassica oleracea L. by protoplast fusion. // Theor. Appl. Genet. 1995. V. 91. P. 1293-1300.

67. Hasterok R., Jenkins G., Langdon T., Jones R.N., Maluszynska J. Ribosomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes. // Theor. Appl. Genet. 2001. V. 103. P. 486-490.

68. Hayek A. Entwurf eines Cruciferensystemes auf phylogenetischer Grundlage. // Beiheifte Botanisches Centraiblatt. 1911. V. 27 P. 127-335.

69. Harrison G.E., Heslop-Harrison J.S. Centromeric repetitive DNA sequences in the genus Brassica. II Theor. Appl. Genet. 1995. V. 90. P. 157-165.

70. Hong C.P., Kwon S.J., Kim J.S., Yang TJ., Park B.S., Lim Y.P. Progress in understanding and sequencing the genome of Brassica rapa. II Int. J. Plant Genomics. 2008. V. 2008. doi: 10.1155/2008/582837.

71. Jahier J., Chèvre A.M., Tanguy A.M., Eber F. Extraction of disomic addition lines of Brassica napus B. nigra. I I Genome. 1989. V. 32. P. 408-413.

72. Janchen E. Das System der Cruciferen. // Österreichische Botanische Zeitschrift (Plant. Syst. EvoL). 1942. V. 91 P. 1-21.

73. Jeong G.T., Park D.H. Batch (one- and two-stage) production of biodiesel fuel from rapeseed oil. // Appl. Biochem. Biotechnol. 2006. V. 131. P. 668-679.

74. Jiang Y., Tian E., Li R., Chen L., Meng J. Genetic diversity of Brassica carinata with emphasis on the interspecific crossability with B. rapa. II Plant Breed. 2007. V. 126. P. 487-491.

75. Johnston J.S., Pepper A.E., Hall A.E., Chen Z.J., Hodnett G., Drabek J., Lopez R., Price H.J. Evolution of genome size in Brassicaceae. // Ann. Bot. 2005. V. 95. P. 229-235.

76. Jorgensen R.B., Andersen B. Spontaneous hybridization between oilseed rape (Brassica napus) and weedyBrassica campestris (Brassicaceae)—a rise of growing genetically-modified oilseed rape. // Am. J. Bot. 1994. V. 81. P. 1620-1626.

77. Kapila R., Negi M.S., This P., Delseny M., Srivastava P.S., Lakshmikumaran M. A new family of dispersed repeats from Brassica nigra-, characterization and localization. // Theor. Appl. Genet. 1996. V. 93. P. 1123-1129.

78. Kosambi D.D. The estimation of map distances from recombination values. // Ann. Eugen. 1944. V. 12 P. 172-175.

79. Koch M., Al-Shehbaz I.A. Molecular systematics of the Chinese Yinshania (Brassicaceae): evidence from plastid and nuclear its DNA sequence data. // Ann. Missouri Bot. Gard. 2000. V. 87. P. 246-272.

80. Koch M., Al-Shehbaz I.A., Mummenhoff K. Molecular systematics, evolution, and population biology in the mustard family (Brassicaceae). // Ann. Missouri Bot. Gard. 2003. V. 90. P. 151-171.

81. Koch M., Dobes C., Kiefer C., Schmickl R., Klimes L., Lysak M.A. Supernetwork identifies multiple events of plastid trn F (GAA) pseudogene evolution in the Brassicaceae. // Mol. Biol. Evol. 2007. V. 24 P. 63-73.

82. Koch M.A., Kiefer M. Genome evolution among cruciferous plants: a lecture from the comparison of the genetic maps of three diploid species Capsella rubella, Arabidopsis lyrata subsp. petraea, and A. thaliana. II Am. J. Bot. 2005. V. 92 P. 761-767.

83. Kresovich, S., Williams J.G.K., McFerson J.R., Routman E J., Schaal B.A. Characterization of genetic identities and relationships of Brassica oleracea L. via a random amplified polymorphic DNA assay. // Theor. Appl. Genet. 1992. V. 85. P. 190-196.

84. Kruskopf-Osterberg M., Shavorskaya O., Lascoux M., Lagercrantz U. Naturally occurring indel variation in the Brassica nigra COLI gene is associated with variation in flowering time. // Genetics. 2002. V. 161. P. 299-306.

85. C.X., Cowling W.A. Identification of a single dominant allele for resistance to blackleg in Brassica napus 'Surpass 400'. II Plant Breed. 2003. V. 122. P. 485488.

86. G., Gao M., Yang B., Quiros C.F. Gene for gene alignment between the Brassica and Arabidopsis genomes by direct transcriptome mapping. // Theor. Appl. Genet. 2003. V. 107 P. 168-180.

87. McNabb W.M., Van Den Berg C. G. J., Rimmer S. R. Comparison of inoculation methods for selection of plant resistance to Leptosphaeria maculans in Brassica napus. II Can. J. Plant Sci. 1993. V. 73. P. 1199-1207.

88. Madlung A., Tyagi A.P., Watson B., Jiang H., Kagochi T., Doerge R.W., Martienssen R., Comai L. Genomic changes in synthetic Arabidopsis polyploids. //Plant J. 2005. V. 41 P. 221-230.

89. Malik R.S. Prospects for Brassica carinata as an oilseed crop in India. // Exp. Agrie. 1990. V. 26. P. 125-129.

90. Maluszynska J., Hasterok R. Identification of individual chromosomes and parental genomes in Brassica júncea using GISH and FISH. // Cytogenet. Genome Res. 2005. V. 109. P. 310-314.

91. Márquez-Lema A., Fernández-Martínez J., Pérez-Vich B., Velasco L. Development and characterisation of a Brassica carinata inbred line incorporating genes for low glucosinolate content from B. júncea. II Euphytica. 2008. V. 164. P. 365-375.

92. Matasyoh L.G., Wachira F.N., Kinyua M.G., Thairu Muigai A.W., Mukiama T.K. Leaf storage conditions and genomic DNA isolation efficiency in Ocimum gratissimum L. from Kenya. // Afr. J. Biotech. 2008. V. 7. P. 557-564.

93. Mithen R.F., Lewis B.G. Resistance to Leptosphaeria maculans in hybrids of Brassica oleracea and Brassica insularis. II J. Phytopathology. 1988. V. 123. P. 253-258.

94. Morgante M., Olivieri A.M. PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics. //Plant J. 1993. V. 3. P. 175-182.

95. Moyes C.L., Lilley J.M., Casais C.A., Cole S.G., Haeger P.D., Dale P.J. Barriers to gene flow from oilseed rape {Brassica napus) into populations of <Sinapis arvensis. //Mol. Ecol. 2002. V. 11. P. 103-112.

96. Mummenhoff K., Franzke A., Koch M. Molecular data reveal convergence in fruit characters used in the classification of Thlaspi s J. (Brassicaceae). // Bot. J: Linn. Soc. 1997. V. 125. P. 183-199.

97. Negi M.S., Sabharwal V., Bhat S.R., Lakshmikumaran M. Utility of AFLP, markers for the assessment of genetic diversity within Brassica nigra germplasm. //Plant Breed. 2003. V. 123 P. 13-16.

98. Newman P.L., Bailey D.J. Screening for resistance to canker {Leptosphaeria maculans) in winter oilseed rape {Brassica napus ssp. oleifera). II Plant Pathol. 1987. V. 36. P. 346-354.

99. Oh S.-H., Potter D. Phylogenetic utility of the second intron of LEAFY in Neillia and Stephanandra (Rosaceae) and implications for the origin of Stephanandra. II Mol. Phylogenet. Evol. 2003. V. 29. P. 203-215.

100. O'Neill C.M., Bancroft I. Comparative physical mapping of segments of the genome of Brassica oleracea var. alboglabra that are homoeologous to sequenced regions of chromosomes 4 and 5 of Arabidopsis thaliana. II Plant J. 2000. V. 23 P. 233-243.

101. Ozkan H., Levy A.A., Feldman M. Allopolyploidy-induced rapid genome evolution in the wheat (Aegilops-Triticum) group. // Plant Cell. 2001. V. 13. P. 1735-1747.

102. Pang E.C.K., Halloran G.M. The genetics of adultplant blackleg (Leptosphaeria maculans) resistance from Brassica juncea in B. napus. II Theor. Appl. Genet. 1996. V. 92. P. 382-387.

103. Parkin I.A.P., Gulden S.M., Sharpe A.G., Lukens L., Trick M., Osborn T.C., Lydiate D.J. Segmental structure of the Brassica napus genome based on comparative analysis with Arabidopsis thaliana. 11 Genetics. 2005. V. 171. P. 765781.

104. Parkin I.A., Lydiate D.J., Trick M. Assessing the level of collinearity between Arabidopsis thaliana and Brassica napus for A. thaliana chromosome 5. // Genome. 2002. V. 45 P. 356-366.

105. Piepho H.-P., Koch G. Codominant analysis of banding data from a dominant marker system by normal mixtures. // Genetics. 2000. V. 155. P. 1459-1468.

106. Pink D., Bailey L., McClement S., Hand P., Mathas E., Buchanan-Wollaston V., Astley D., King G., Teakle G. Double haploids, markers and QTL analysis in vegetable Brassicas. // Euphytica 2008. V. 164 P. 509-514.

107. Pires J.C., Zhao J., Schranz M.E., Leon E.J., Quijada P.A., Lukens L.N., Osborn T.C. Flowering time divergence and genomic rearrangements in resynthesized Brassica polyploids (Brassicaceae). // Biol. J. Linn. Soc. Lond. 2004. V. 82. P. 675-688.

108. Plieske J., Struss D., Rôbbelen G. Inheritance of resistance derived from the B-genome of Brassica against Phoma lingam in rapeseed and the development of molecular markers. // Theor. Appl. Genet. 1998. V. 97. P. 929-936.

109. Prakash S., Chopra V.L. Introgression of resistance to shattering in Brassica napus from Brassica juncea through non-homologous recombination. // Plant Breed. 1988. V. 101. P. 167-168.

110. Prakash S. and Hinata K. Taxonomy, cytogenetics and origin of crop Brassicas, a review. // Opera Bot. 1980. V. 55 P. 3-57.

111. Purugganan M.D., Boyles A.L., Suddith J.I. Variation and selection at the CAULIFLOWER floral homeotic gene accompanying the evolution of domesticated Brassica oleracea. II Genetics. 2000. V. 155. P. 855-862.

112. Putterill J., Robson F., Lee K., Simon R., Coupland G. The CONSTANS gene of Arabidopsis promotes flowering and encodes a protein showing similarities to zinc finger transcription factors. // Cell. 1995. V. 80. P. 847-858.

113. Quiros C.F., This P., Laudie M., Benet A., Chèvre A.M., Delseny M. Analysis of a set of RAPD markers by hybrisdisation and sequencing in Brassica: a note of caution. //Plant Cell Rep. 1995. V. 14. P. 630-634.

114. Rana D., Boogaart T., O'Neill C.M., Hynes L., Bent E., Macpherson L., Park J.Y., Lim Y.P., Bancroft I. Conservation of the microstructure of genome segments in Brassica napus and its diploid relatives. // Plant J. 2004. V. 40. P. 725-733.

115. Ratnasingham S., Hebert P.D.N. BOLD : The Barcode of Life Data System. // Mol. Ecol. Notes. 2007. V. 7. P. 355-364.

116. Rimmer S.R., Van den Berg C. G. J. Resistance of oilseed Brassica spp. to blackleg caused by Leptosphaeria maculans. II Can. J. Plant Pathol. 1992. V. 14. P. 56-66.

117. Röbbelen G. Beiträge zur Analyse de Brassica-Genomes. // Chromosoma. 1960. V. 11. P. 205-228.

118. Robert L.S., Robson F., Sharpe A., Lydiate D., Coupland G. Conserved structure and function of the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS in Brassica napus. II Plant Mol. Biol. 1998. V. 37. P. 763-772.

119. Rogowsky P.M., Liu J.Y., Manning S., Taylor C., Langridge P. Structural heterogeneity in the R173 family of rye-specific repetitive DNA sequences. // Plant Mol. Biol. 1992. V. 20 P. 95-102.

120. Roy N.N. Interspecific transfer of Brassica juncea-type high blackleg resistance to Brassica napus. //Euphytica. 1984. V. 33. P. 295-303.

121. Saal B., Brun H., Glais I., Struss D. Identification of a Brassica juncea-derived recessive gene conferring resistance to Leptosphaeria maculans in oilseed rape. Plant Breed. 2004. V. 123. P. 505-511.

122. Saal B., Wricke G. Clustering of amplified fragment length polymorphism markers in a linkage map of rye. // Plant Breed. 2002. V. 121. P. 117-123.

123. Sablowski R. Flowering and determinacy in Arabidopsis. 11 J. Exp. Bot. 2007. V. 58. P. 899-907.

124. Sacristan M.D., Gerdemann M. Different behavior of Brassica juncea and Brassica carinata as sources of Phoma Ungarn resistance in experiments of interspecific transfer to Brassica napus. I I Plant Breed. 1986. V. 97. P. 304-314.

125. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. //Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1977. V. 74 P. 5463-5467.

126. Schelfhout C.J., Snowdon R., Cowling W.A, Wroth J.M. A PCR based B-genome-specific marker in Brassica species. // Theor. Appl. Genet. 2004. V. 109. P. 917-921.

127. Schelfhout C J., Snowdon R., Cowling W.A., Wroth J.M. Tracing B-genome chromatin in Brassica napus x B. juncea interspecific progeny. // Genome. 2006. V. 49. P. 1490-1497.

128. Schierwater B., Ender A. Different thermostable DNA polymerases may apply to different RAPD products. //Nucleic Acids Res. 1993. V. 21 P. 46474648.

129. Schranz M.E., Lysak M.A., Mitchell-Olds T. The ABC's of comparative genomics in the Brassicaceae: building blocks of crucifer genomes. // Trends Plant. Sei. 2006. V. 11 P. 535-542.

130. Schranz M.E., Osborn T.C. Novel flowering time variation in the resynthesized polyploid Brassica napus. II J. Hered. 2000. V. 91. P. 242-246.

131. Schranz M.E., Osborn T.C. De novo variation in life-history traits and responses to growth conditions of resynthesized polyploid Brassica napus (Brassicaceae). // Am. J. Bot. 2004. V. 91. P. 174-183.

132. Schranz M.E., Song B.H., Windsor A.J., Mitchell-Olds T. Comparative genomics in the Brassicaceae: a family-wide perspective. // Curr. Opin. Plant Biol. 2007. V. 10. P. 168-175.

133. Schulz O.E. Cruciferae. // In A. Engler and H. Harms eds., Dienatürlichen Pflanzenfamilien. 1936. P. 227-658. Wilhelm Engelmann, Leipzig,1. Germany.

134. Sebastian R.L., Howell E.C., King G.J., Marshall D.F., Kearsey M.J. An integrated AFLP and RFLP Brassica oleracea linkage map from two morphologically distinct doubled-haploid mapping populations. // Theor. Appl. Genet. 2000. V. 100 P. 75-81.

135. Simillion C., Vandepoele K., Van Montagu M.C.E., Zabeau M., Van de Peer Y. The hidden duplication past of Arabidopsis thaliana. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2002. V. 99. P. 13627-13632.

136. Sjödin C., Glimelius K. Transfer of resistance against Phoma lingam to B. napus by asymetric somatic hybridization combined with toxin selection. // Theor. Appl. Genet. 1989. V. 78. P. 513-520.

137. Sjödin P., Hedman H., Osterberg K.M., Gustafsson S., Lagercrantz U., Lascoux M. Polymorphism and divergence at three duplicate genes in Brassica nigra. II J. Mol. Evol. 2008. V. 66. P. 581-590.

138. Sliwinski M., White M., Maizel A., Weigel D., Baum D. Evolutionary divergence of LFY function in the mustards Arabidopsis thaliana and Leavenworthia crassa. II Plant Mol. Biol. 2006. V. 62 P. 279-289.

139. Smith L.B., King G.J. The distribution of BoCAL-a alleles in Brassica oleracea is consistent with a genetic model for curd development and domestication of the cauliflower. // Mol. Breed. 2000. V. 6. P. 603-612.

140. Snowdon R. Cytogenetics and genome analysis in Brassica crops. // Chrom. Res. 2007. V. 15. P. 85-95.

141. Snowdon R.J., Friedrich T., Friedt W., Kohler W. Identifying the chromosomes of the A- and C-genome diploid Brassica species B. rapa (syn. campestris) and B. oleracea in their amphidiploid B. napus. II Theor. Appl. Genet. 2002. V. 104. P. 533-538.

142. Snowdon R.J., Winter H., Diestel A., Sacristan M.D. Development and characterisation of Brassica napus-Sinapis arvensis addition lines exhibiting resistance to Leptosphaeria maculans. II Theor. Appl. Genet. 2000. V. 101. P. 1008-1014.

143. Soengas P., Hand P., Vicente J., Pole J., Pink D. Identification of quantitative trait loci for resistance to Xanthomonas campestris pv. campestris in Brassica rapa. II Theor. Appl. Genet. 2007. V. 114. P. 637-645.

144. Song K., Lu P., Tang K., Osborn T.C. Rapid genome change in synthetic polyploids of Brassica and its implications for polyploid evolution. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1995. V. 92. P. 7719-7723.

145. Song K. and Osborn T.C. Polyphyletic origins of Brassica napus: new evidence based on organelle and nuclear RFLP analyses. // 1992. Genome. V. 35 P. 9921001.

146. Song K.M., Osborn T.C., Williams P.H. Brassica taxonomy based on nuclear restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) 1. Genome evolution of diploid and amphidiploid species. // Theor. Appl. Genet. 1988a. V. 75. P. 784-794.

147. Spooner D., van Treuren R., de Vicente M.C. Molecular markers for genebank management. // IPGRI Technical Bulletin. 2005. V. 10.

148. Stam P. Construction of integrated genetic linkage maps by means of a new computer package: JoinMap. // 1993. Plant J. V. 3 P. 739-744.

149. Struss D., Beilin U., Röbbelen G. Development of B-genome chromosome addition lines of B. napus using different interspecific Brassica hybrids. // Plant Breed. 1991. V. 106. P. 209-214.

150. Taylor J.D., Conway J., Roberts S.J., Astley D., Vicente J.G. Sources and origin of resistance to Xanthomonas campestris pv. campestris in Brassica genomes. // Phytopathology. 2002. V. 92. P. 105-111.

151. This P., Ochoa O., Quiros C.F. Dissection of the Brassica nigra genome by monosomic addition lines. // Plant Breed. 1990. V. 105. P. 211-220.

152. Tongu9 M., Earle E., Griffiths P. Segregation distortion of Brassica carinata derived black rot resistance in Brassica oleracea. II Euphytica. 2003. V. 134. P. 269-276.

153. Tongu? M., Griffiths P.D. Development of black rot resistant interspecific hybrids between Brassica oleracea L. cultivars and Brassica accession A 19182, using embryo rescue. // Euphytica. 2004. V. 136. P. 313-318.

154. U N. Genomic analysis in Brassica with special reference to the experimental formation of B. napus and peculiar mode of fertilization. // Jpn. J. Bot. 1935. V. 7 P. 389-452.

155. Valerik M., Bartos J., Kovarova P., Kubalakova M., de Jong J.H., Dolezel J. High resolution FISH of super-stretched flow-sorted plant chromosomes. // Plant J. 2004. V. 37. P. 940-950.

156. Velasco L., Nabloussi A., De Haro A., Fernández-Martínez J.M. Development of high-oleic, low-linolenic acid Ethiopian-mustard (Brassica carinata) germplasm. // Theor. Appl. Genet. 2003. V. 107. P. 823-830.

157. Vicente J.G., Taylor J.D., Sharpe A.G., Parkin I.A.P., Lydiate D.J., King G.J. Inheritance of race-specific resistance to Xanthomonas campestris pv. campestris in Brassica genomes. 11 Phytopathology. 2002. V. 92. P. 1134-1141.

158. Wang R., Ripley V.L., Rakow G. Pod shatter resistance evaluation in cultivars and breeding lines of Brassica napus, B. juncea and Sinapis alba. II Plant Breed. 2007. V. 126. P. 588-595.

159. Warwick S.I., Black L.D. Molecular systematics of Brassica and allied genera (Subtribe Brassicinae, Brassiceae) chloroplast genome and cytodeme congruence. // Theor. Appl. Genet. 1991. V. 82 P. 81-92.

160. Warwick S., Gugel R., McDonald T., Falk K. Genetic variation of Ethiopian mustard (Brassica carinata A. Braun) germplasm in Western Canada. // Genet. Resour. Crop Evol. 2006. V. 53. P. 297-312.

161. Warwick S.I., James T., Falk K.C. AFLP-based molecular characterization of Brassica rapa and diversity in Canadian spring turnip rape cultivars. // Plant Genet. Resour. 2008. V. 6. P. 11-21.

162. Warwick S.I., Sauder C.A. Phylogeny of tribe Brassiceae (Brassicaceae) based on chloroplast restriction site polymorphisms and nuclear ribosomal internal transcribed spacer and chloroplast trnL intron sequences. // 2005. Can. J. Bot. V. 83. P. 467-483.

163. Weigel D., Alvarez J., Smyth D.R., Yanofsky M.F., Meyerowitz E.M. LEAFY controls floral meristem identity in Arabidopsis. II Cell. 1992. V. 69. P. 843-859.

164. Wretblad S., Bohman S., Dixelius C. Overexpression of a Brassica nigra cDNA gives enhanced resistance to Leptosphaeria maculans in B. napus. II2003. Mol. Plant Microbe Interact. V. 16. P. 477-484.

165. Wu J., Lightner J., Warwick N., Browse J. Low-Temperature damage and subsequent recovery offabl mutant arabidopsis exposed to 2°C. // Plant Physiol. 1997. V. 113. P. 347-356.

166. Yang Y.W., Lai K.N., Tai P.Y., Li W.H. Rates of nucleotide substitution in angiosperm mitochondrial DNA sequences and dates of divergence between Brassica and other angiosperm lineages. // J. Mol. Evol. 1999. V. 48 P. 597-604.

167. Yoon H.-S., Baum D.A. Transgenic study of parallelism in plant morphological evolution. //Proc. Nat. Acad. Sei. USA 2004. V. 101. P. 6524-6529.

168. Yu F., Lydiate D.J., Rimmer S.R. Identification of two novel genes for blackleg resistance in Brassica napus. II Theor. Appl. Genet. 2005. V. 110 P. 969-979.

169. Zhang Z., Schwartz S., Wagner L., Miller W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. // 2000. J. Comput. Biol. V. 7 P. 203-214.

170. Zhao J., Wang X., Deng B., Lou P., Wu J., Sun R., Xu Z., Vromans J., Koornneef M., Bonnema G. Genetic relationships within Brassica rapa as inferred from AFLP fingerprints. // Theor. Appl. Genet. 2005. V. 110. P. 1301-1314.

171. Zhu J.S., Struss D., Röbbelen G. Studies on resistance to Phoma Ungarn in Brassica napus-Brassica nigra addition lines. // Plant Breed. 1993. V. 111. P. 192— 197.

172. Ziolkowski P.A., Kaczmarek M., Babula D., Sadowski J. Genome evolution in Arabidopsis/Brassica: conservation and divergence of ancient rearranged segments and their breakpoints. // Plant J. 2006. V. 47. P. 63-74.

173. Ziolkowski P.A., Sadowski J. FISH-mapping of rDNAs and Arabidopsis BACs on pachytene complements of selected Brassicas. // Genome. 2002. V. 45 P. 189-197.

Информация о работе

Панкин, Артем Андреевич
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Создание ДНК маркеров геномов A, B и C Brassica - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы