Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ТЕХНОЛОГИЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КУЛЬТУРНЬГХ И ДИКОРАСТУЩИХ ФОРМ BRASSICA НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА МИКРОСАТЕЛЛИТОВ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ТЕХНОЛОГИЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КУЛЬТУРНЬГХ И ДИКОРАСТУЩИХ ФОРМ BRASSICA НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА МИКРОСАТЕЛЛИТОВ"

■2>6&P

На правах рукописи

АНИСКИНА ЮЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ТЕХНОЛОГИЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КУЛЬТУРНЫХ И ДИКОРАСТУЩИХ ФОРМ BRASSICA НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА МИКРОСАТЕЛЛИТОВ

Специальность 03.00Л3 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН (г. Москва),

Научный руководитель;

ведущий научный сотрудник

кандидат химических наук Шялоа Илья Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологическая наук, профессор Иванов Павел Леонидович

кандидат сельскохозяйственных наук Монзхос Григорий Федорович

Везущая организация:

Всероссийский научно- исследовательский институт фитопатологии РАСХН.

Защита состоится 5 декабря 2006 г. в 13.00 на заседании диссертационного совета Д 006.027.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии по адресу. 127550, г, Москва, ул. Тимирязевская, д. 42; тел.: (495) 976-65-44; факс: (495) 977-09-47; e-maiJ: iab@iab.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-иссясдматепьского института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.027,01 кандидат биологических наук

Меликова С. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Род Brassica отличается большим морфологическим разнообразием форм н является источником ценных масличных, овошных, пряных, кормовых п декоративных культур, широко используемых по всему миру. Большинство культурных форм Brassica произошло от шести основных видов: В. napus (масличный рале, брюква), В. гара (азиатские листовые капусты, репа и турнепс), й, oleracea (кочанная, брюссельская н цветная капуста, брокколи, кольраби), В. juncea (горчица сарептская) В. cannula (горчица эфиопская) и В. nigra (горчица черная). Филогенетические взаимосвязи между этими видами хорошо описаны моделью так называемого «U-треу го льника» [U, 1935]. Согласно этой модели в результате естественной гибридизации трех диплоидных видов В. тра, В. nigra. В, окгасеа. геномы которых условно обозначены как АА, ВВ, СС, соответственно, возникли алшотетраплоидные формы В. juncea (ААВВ), 8 napus (ААСС), В. саппаш (ВВСС). Таким образом, род Brassica представляет собой удобную модель для исследования генетического разнообразия и нитрогрессии генетического материала в результате межвидовой и межродовой гибридизации.

Исследование генетического разнообразия культурных и дикорастущих видов Brassica и родственных представителей семейства Brassicaceae представляет большое научное значение для выяснения филогенетических взаимосвязей и эволюции геномов, уточнения границ таксонов и практическое значение для выявления потенциальных источников новых культур и доноров важных агрономических признаков, которые могут быть включены в различные селекционные программы.

Важной сферой описания и использования растительных генетических ресурсов является регистрация растительных форм. Новые сорта культурных растений должны пройти ряд тестов иа отличимость, однородность и стабильность (DUS - Distinctness, Uniformity, Stability), которые составляют основу защиты интеллектуальной собственности селекционеров. Современная система диагностирования, основанная на ряде стандартизованных морфологических характеристик, требует длительных полевых испытаний и многочисленных статистических исследований. Кроме того, в связи с широким применением в селекции новейших биотехнологий растительные коллекции значительно пополнились гибридными сортами и генетически модифицированными формами, которые невозможно надежно различать и идентифицировать, используя ограниченное число морфологических характеристик. Для быстрого и надежного различения и идентификации растительных форм возникла необходимость анализа полиморфизма на генетическом

уровне.

Наиболее перспективным подходом для исследования генетического полиморфизма представляется использование методов молекулярного анализа, основанных на анализе полиморфизма ДНК, позволяющих получить индивидуальную характеристику отдельного генотипа - ДНК-профиль. Существующие методы анализа геномов отличаются по сложности, надежности и объему получаемой информации. Метод анализа полиморфизма микросателлитов, позволяющий получать воспроизводимые, информативные профили известных фрагментов генома, является наиболее перспективным для эффективного решения различных задач современной селекции, таких как идентификация, паспортизация и сертификация сортов, поддержание генетических коллекций, составление родословных, зашита интеллектуальной собственности, подбор родительских пар при скрещивании, контроль интрогрессии генетического материала, и решения проблем молекулярной систематики и эволюции. В связи с этим, большое практическое значение представляет разработка надежной, высокопроизводительной и удобной в эксплуатации технологии генотипирования растений рода Brassica на основе анализа полиморфизма микросателлитов. Цель работы. Разработка технологии генотипирования культурных и дикорастущих форм Brassica на основе анализа полиморфизма микросателлитов.

Для выполнения работы были поставлены следующие ЗАДАЧИ;

1. Исследовать возможность применения метода микросателлитного анализа для генотипирования растений рода Brassica и родственных представителен семейства Brassicaceae. Разработать универсальную технологию для генотипирования растений рода Brassica на основе анализа полиморфизма мнкросатедлитов. Отобрать оптимальный набор праймеров к полиморфным микросателлитным локусам для различения и идентификации растений рода Brassica.

2. Применить технологию микросатеялитного анализа для исследования генетического разнообразия представителей семейства Brassicaceae на родовом, видовом и внутривидовом уровне, а также для генотипирования близкородственных сортов и гибридов Brassica.

3. Изучить природу межвидового и внутривидового полиморфизма микросателлитных локусов.

4. Исследовать возможность применения технологии микросателлитиого анализа для исследования филогенетических взаимосвязей видов Brassica и родственных представителей семейства Brassicaceae на модели «треугольника Ш, а также для осуществления контроля интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды при межродовых, межвидовых и внутривидовых скрещиваниях.

Научная нпвизиа. На основании проведенных исследований нами были отобраны 18 пар праймеров к микросателлитным локусам. являющиеся перспективными для идентификации

видов, сортов и дикорастущих форм Brassica. С применением технологии микросателлитиого анализа били получены уникальные генетические профили 98 растительных форм родов Brassica* Sinapis. Raphanus и Camelina. В результате мм кросателл итного анализа впервые были идентифицированы фрагменты, специфичные для геномов А, В и С диплоидных видов Brassica и подтверждена их интрогрессии в амфидиплоидные виды, а также межвидовые и межродовые гибриды. Впервые показана возможность контроля интрогрессии генетического материала родительских форм {сортов В. гора) в гибриды с помощью технологии ми кросателл итно го анализа. В результате клонирования и секвенирования микросателлитных фрагментов локусов Nal2-A02 и BRMS-042 было установлено, что исследуемые фрагменты представляют собой сложные микросателлитные повторы, включающие несколько вариабельных областей. На основе сравнительного анализа микроеателлитных фрагментов локусов было установлено, что полиморфизм между геномами А, В и С определяется числом микросатадлнтных повторов и ннсерциями/делеииями во фланкирующих участках генома, а полиморфизм внутри геномов определяется исключительно числом ми кросателл итных повторов. Результаты анализа полиморфизма микросателлитов на генетическом уровне подтвердили филогенетические взаимосвязи шести видов Brassica, описанные моделью «U-треугольника», тесную взаимосвязь А и С-ген омов (В. rapa/B. oleráceo) и более отдаленную связь с В-геиомом {В. nigra).

Практическая значимость работы. Предлагаемая технология генотипирования на основе микросателлитного анализа позволяет надежно различать рода, виды и сорта, в том числе п близкородственные, выявлять генетическую разнородность фенотипически однородного материала, осуществлять контроль интрогрессии генетического материала от родительских форм в межразовые, межвидовые н сортовые гибриды. Показана перспективность применения технологии для идентификации, генетической паспортизации и сертификации, подбора генетически однородного материала для скрещиваний и контроля селекционной работы, а также для решения проблем молекулярной систематики и эволюции. В результате микросателлитного анализа выявлены фрагменты, специфичные для геномов А, В и С, которые могут быть использованы в качестве маркеров интрогрессии генетического материала при межвидовых и межродовых скрещиваниях. На основе специфичной последовательности микросателлитного локуса Ма12-А02 создан локус-спецнфичный SCAR-маркер генома В Brassica, который может бьггъ эффективен для контроля интрогрессии генома В при создании форм Brassica, устойчивых к болезням и неблагоприятным условиям среды, а также для исследования филогенетических взаимосвязей н эволюции видов Brassica.

Публикации я апооОяпня работы. По результатам диссертации опубликовано б печатных работ. Основные результаты исследований были представлены на Ш Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 19 октября, 2004), 1П Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития« (Москва, I -4-1S марта, 2005) и на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 19 - 22 мая, 2005).

Структура и »Ими работы. Диссертация состоит нз введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 204 библиографические ссылки. Работа изложена на 144 страницах печатного текста, содержит 17 таблиц и 30 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

t. Материалы и методы исследования.

В работе использовали олигонуклеотиды, синтезированные ЗАО "Синтол" (г. Москва, Россия), дНТФ фирмы «Медиген» (Россия), ДНК-полимеразу ThermoStar, обеспечивающую «горячий старт» при проведении ПНР, производство ВНИИСБ (лаб. Молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций, зав. лаб, Лунин В.Г.), термосеквеназу фирмы Amersham Biosciences (CILIA), зидонуклеазьг рестрикции Map I, £coRI, T4 ДНК-лигазу и соответствующие буферные растворы фирмы MB! Fermentas (Литва).

Растительный материал был получен из коллекций Всероссийского НИИ растениеводства им. H.H. Вавилова, Всероссийского НИИ кормов им. В.Р, Вильямса, Всероссийского НИи'1 И рапса и Centre for Genetic Resources (CGN), Нидерланды. Геномную ДИК выделяли из зеленых листьев проростков с помощью модифицированного СТАВ метода [Kidwell, Osbom, 2001], а также с помощью метода выделения ДНК на силикагслевом сорбенте [Boom et а!., 1990).

Полимеразную цепную реакцию осуществляли с помощью локус-специфичных пар пранмеров, представленных в Табл. I. Реакции проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 20-50 нг ДНК, по Юпмоль каждого из праймерое (один нз праймерое был помечен флуоресцентным красителем Су5), буферный, содержащий 100 мМ Трис-HCI (pH 8.3), 25 мМ MgCh, 500 мМ KCl, 400 мкМ каждого дезоксинуклеозндгрифосфата и 1 ед. ДНК-полимеразу ThermoStar. Активация термостабильной ДНК-пояимеразы происходила в результате экспозиции реакционной смеси при 95"С в течение 10 мин перед проведением ПЦР. Амплификация осуществлялась при следующих температурных условиях: 1 цикл: 95ПС

- 10 мин, Î0 циклов: 94°С - 30 сек, Т„„ - 30 сек. 1 цикл: 72°С - S мин. Температура отжига праймеров (То») указана в Табл. I. Для амплификации использовали термоциклеры «Mastercycler gradient фирмы «Eppendorf» (Германия), GeneAmp PCR System 2400 фирмы <<Perkiii Elmer» (США) и мТерцикм фирмы «ДНК-технология» (Россия).

Анализ флуоресцентно-меченых ПЦР-фрагментов проводили методом электрофореза в денатурирующих условиях с помощью автоматического анализатора ALFexpress II Ainersham Biosciences (США). Полученные данные анализировали с помощью пакета прикладных программ ALFwin Software Fragment Analyser,

Амшифицированые фрагменты ДНК клонировали в состав вектор« pG ЕМ-Т Easy (Promega, США). Секвенирование фрагментов ДНК осуществляли по методу Сэнгера с использованием автоматического анализатора ALFexpress II Amersham Biosciences (США).

Для множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали программы Clustat \V и GenDoc, для построения деилро грамм использовали пакет прикладных программ TREECON (Van de Peer, de Wächter, 1994),

2. Микросателлнтиый анализ межвидового и внутривидового генетического разнообразия porta Braxxica.

В основе предлагаемой технологии генотипирования лежит полиморфизм длин микросателлитных локусов, выявляемый посредством ПЦР-амплификашш с использованием пар праймеров, комплементарных последовательностям, фланкирующим ми!фосателлиты. Для эффективного различения и идентификации генотипов определяющее значение имеет отбор пар праймеров, специфичных к полиморфным мнкросателлитным л оку сам.

За последние годы число публично доступных праймеров к микросателлитным локусам Brassica значительно увеличилось, однако уступает другим важным культурным видам, В настоящий момент в международной базе данных Brassica Microsatellite Information Exchange I hi tpr//www.^|-jssica.jr)fb/ssrfSS Rinfo.html представлено 628 пар праймеров к фланкирующим областям мнкросателлнтных локусов В. парии, В. rapa, В, nigra и В, olerácea. Следует отметить, что не все мнкросателлнтные локусы эффективны для исследования межвидового и внутривидового генетического разнообразия, интрогрессии генов и филогенетических взаимосвязей. Некоторые из них являются мономорф ними или выявляют незначительный полиморфизм. При выборе оптимальных пар праймеров для исследования полиморфизма микросателдитов растений Brassica мы использовали праймеры к известным микросателлитным локусам, опубликованные Kresovich и соавт. (1995), Szewc-McFadJen н соавт. ( 1996), Suwabe и соавт. (2002), Lowe и соавт. (2004).

Выбор праймеров определялся дин нон амплнфицируемых микросателлитных фрагментов и количеством выявляемых аллелей. Различие длин аллелей микросателлитного локуса определяется главным образом числом повторяющихся единиц, представляющих собой ди-, три-, гетра-, пента- и гексануклеотиды. Для надежного различения ПЦР-фрагментов, отличающихся на несколько нуклеотидов, даже с помошью электрофореза высокого разрешения, их длина не должна быть большой (желательно не более 300 нуклеотидов). Важным критерием при выборе праймеров также является количество выявляемых ими аллелей, определяющее полиморфизм микросателлитного локуса. Поэтому на основании литературных данных были выбраны ттраймеры, позволяющие детектировать более трех аллелей.

На основе перечисленных критериев из 459 пар праймеров для исследования полиморфизма микросателлитных локусов Brassica первоначально были отобраны 40 пар праймеров. Эти праймеры мы предварительно тестировали на наличие/отсутствие ГЩР-продуктов. Кроме того, каждую пару праймеров тестировали на возможность образования П1 IP-продуктов при амплификации с использованием одного (прямого или обратного) праймера, чтобы исключить из исследования инвертированные последовательности.

Следующим этапом работы являлось исследование возможности использования отобранных пар праймеров для анализа генетического разнообразия растений шести видов рода Brassica^. В. olerácea (кочанная, цветная, брюссельская и португальская капуста), В. napas (масличный рапс). В. rapa (сурепица, турнепс, листовые формы капусты). В, juncea (горчица сарептская), В. nigra (горчица черная) и В. carinata (горчица эфиопская), а также родственных представителей семейства Brassicaceae - Sinapis alba (горчица белая), Raphanux sativas (редька, редис), Camelina sativa (рыжик полевой).

На рис. I в качестве примера представлены электрофореграммы разделения ПЦР-фрагментов, полученных в результате амплификации с парами праймеров Nal0-D09, Nal2-А02, Ol 12-ACM, демонстрирующие межвидовой н внутривидовой полиморфизм. По данным парам праймеров для каждого исследуемого вида выявлен определенный набор фрагментов, отличающий его от других видов. Пара праймеров NalO-DCW (рис. I, А) позволяет различать все шесть видов Brassica, а также обнаруживает небольшой внутривидовой полиморфизм у видов В. nigra, В, carinata и В, olerácea. Данная пара праймеров позволяет выявить фрагменты, специфичные для геномов А, В и С. Электрофореграмма разделения ПЦР-фрагментов, полученных при амплификации с парой праймеров Na)2-A02 (рис.1. Б), иллюстрирует пример значительного внутривидового и межвидового полиморфизма. С помошью данной пары праймеров можно выявить четыре зоны фрагментов с различной эяектрофоретической подвижностью, специфичные для генома А; четыре зоны.

алсс а а а abi) вв йвсс гс

Н. нврм* & rape II. fun eta В. nigra £ iurinula П. oJi'Tütt'a

4 s * ? в"» 10 011 13 1415 it it i» ti га'п и гз 14 мгл'пмгщп м я'и я 35 з* атм'з»

А 2 А Г С"

Bi......>

а,

АГ СГ

ш п. н.

I_в

*-с

1<Ю и. II, 250 н. н.

ВЗ

F=B2 Zoe II, н.

в

С2_

С|_о

А_

С1 ISOII, н.

150 м. и.

:_В

100 iL 11,

Рис. 1, Электрофоре граммы раиелеиня в 8 %-иом полиакрклаинлиом геле ПЦР-фрагментов, полученных в результате амплификации с парши праймеров Nal0-D09 {A), Nal2-A02 (Б) и OII2-A04 (В), В качестве матриц для ПНР испольмвапк образцы ДНК растений Sino/ih alba 4232 (2), В. napus: Bnal-02 (3), BnaVikcos (4), ВпаКЬнша (5), BnaUral (6), Una [0-02 (7). Bna 14-02 (S). B. rapa: BD 14 (9), Brl07(l0), Br350 (11), Br548J57 (12), Ш№ (13), ВгбШ (14), В. juncea: Bj458S (15). B)4594 (Ii). BJ6615 (17), Bj7l54 (IS), Bj1519[ (19), BJI5I93 (20), B. nigra.- Bni66l8 (21), Bni66l9 (22), ВЫЛ620 (23), Üiu662£ (24), ВЫ6ЙЭ4 (Ii). Bni6635 (26), B. carinaia: Bc3946 (27), Gc3950 (28). Bc39S2 (29), Bc3976 (30), Bc4025 (Jl), Bc4035 (32). B. oteraee0: n/t botiyrir. Bob699 (33), лttcostuta: Boc22IS (34), nit gemmi/era-. Bog6998 (35). п/в capitata Boca 192 (36), Boca2432 (37), Boca7022 (38). Дорожки 1 и 39 - маркер молекулярной массы. Фрагменты, специфичные для геномов А, В и С, обозначены разными стрелками.

специфичные для генома В. и две зоны, специфичные для С-генома. Внутривидовой полиморфизм, выявленный в результате амплификации праймеров ON2-A04 (рис. I, В) у видов В. napus, В. гора, B.juncea и В. oUracea. обусловлен полиморфизмом длин А* и С-геном-специфичных фрагментов.

В ходе данного исследования выяснилось, что полиморфизм длин микросатеялитиого локуеа не всегда позволяет различать виды и отдельные формы Brassica, поскольку выявляемые по некоторым парам праймеров аллели не являются внао- или геном-специфичными и присутствуют у всех или нескольких видов Brassica. При анализе с некоторыми парами праймеров, ПЦР-фрагменты детектировались не во всех образцах. В этих случаях наличне/отсутствие продукта определялось видовой принадлежностью.

По результатам проведенного нами микросателлитого анализа растений рода Brassica было отобрано 18 пэр праймеров (Табл. I), позволяющих выявлять межвидовой и внутривидовой полиморфизм. Данные пары праймеров позволяют выявлять фрагменты, специфичные для простых геномов А, В и С, которые кодоминантно сочетаются в тетрэплонлных формах, а также фрагменты, общие для всех или нескольких видов «треугольника U». Каждая пара праймеров позволяет выявлять в сумме от 4 до 19 аллелей у видов рола Brassica, Диапазон длин получаемых фрагментов составляет от SO до 320 п.н.

Существенным моментом в изучении интрогрессии генетического материала в результате межвидовых скрещиваний является универсальность (transferability) -консервативность праймеров для всех или нескольких видов Brassica^ образующих «треугольник U». Среди выбранных IS пар праймеров оказались универсальными, т.е. позволяли различать все шесть видов Brassica. одна пара (BRMS-043) - специфичной для генома А, две (BRMS-006 и Ni2-F02) - для геномов А и С. Двенадцать универсальных пар праймеров одновременно выявляют фрагменты, специфичные для геномов А, В и С, у исследуемого спектра видов, что позволяет проследить распределение генетического материала у видов Brassica. Исследованные нами пары праймеров выявляют внутривидовой полиморфизм у большинства видов, образующих треугольник U. Три универсальные пары праймеров (Na] 2-А02, Ni2-F02 и bfems-046) обнаруживают полиморфизм у всех тести видов Brassica. Для некоторых праймеров универсальность распространяется за пределы рода, что позволяет провести сравнительный анализ и оценить генетические расстояния между формами рода Brassica и такими отдаленными формами, как Sinapis, Raphaniis и Camelirta.

В данной роботе в качестве моделей для исследования интрогрессии генетического материала мы использовали известный межродовой гибрид капусты (В. Ыегасеа) и реаькн (Д. saiivtis) - Raphanobroxsica (RRCC) [Карпеченко, 1971] и межвидовой гибрид B. *-compoxtta

Таблица I. Ilpaiíucpti для гсиотипироваиия видов и разновидностей Brassica.

f» JlaiHuiK Лослл>#Ая т£-1 ьи i>f 1 и првНиеров т огни •с Лишают â.iKii ПДР-ф|Мгм«нюе, П. и. ftlern» ftlMtl-гмцнфнчиоггь кЧяячесг» »Tip.ifH

NtlO-WW Г-ЛАСЛА« гсмслгссгсго: г-кгемглгеггмгнжгъ 49 IJO.ITO ÍCTlu AHС 6

2 Mali-AK F-АЬССГГС—ьстг^сллсс- 53 160-2)8 <CTfc ABC W

i NiU-Fl! « tîOIW (CCCI, ABC «

4 F - .с v. 77Л.А.7; AAA.; 7 S-rCTCÍTÍC'C^C AMlCAÍC 49 во-i to (COO, ABC M

i Nií-CJl Г-WÄT~C ТТСбЛТСГГСЛГГСС 49 >12-150 (CA^, AC 6

6 Ni2-fl02 Г-ТССМССШилССАГСДСС R .7_АА777Av. л д 7Л C"~Ç'i —'T 49 Iii. 19Й (CTb ВС S

7 Ntf-GIMB «-ел дел—тле 55 SO-14« (AG). ABC IS

CHIÎ-AW f--ccc:w>t'.*Ac:^7Cí7&c<: 55 г lo-1 jo (СИ, ABC к

4 »•2-CI2 Г- ТСГСЛСТЬСО-ССЛСТТССС Р-«hOkCWWCCMriAi сглсмс- 55 1И-165 {CA», ADC (0

M В-АГГССЛЛСССГЛЛТГЛЛМС 51 140-173 <слц ABC s

ti BRMS4H4 r-Ct?CCf,77CCT7-rTICCí7C7t и-слтс-сСААсес^ллгадл^л? 55 125-145 (CAILICAL A j

II ttRMSJMÎ Г-СЬЛТСАЬТТЛЯТССЛССЛСАЛ 43 8МЗЛ (AATWCTUTWCT), АЭС я

II BRMWHM Г-ЛССТССССЛСЛССЛЛСШЛСЛ И-Г^ГССГГССТТ'^ТСТСССЛЛГС 55 2M-2J5 (CAJUCU А *

14 BRMSJM.I f-ütart~ .»,:тст:см.:сгс И--" ЛА77|"'"7Л'"'" Л 48 2№JI0 (AMTUÛT1, А 4

lí BtMSJi+d Г-ТТСЬССТТССГЛГТЛССЛСССС »- í-o v-A» .-.-'••■-лд-—7':л' 48 12S-210 {C.A\(CAUGA)Í АОС 19

JA MM.UI.4I ССЛСГСАТГГТТ К-—07" АЛ-'"-7ЛА А - # j 63-m iAATndc^fTTcu. AB S

17 bnóa: r-C77TC7C71XAC777:iitjA;iCr.7A к -С 77* 7 Гхг "СТА":"'" 55 W-IIO (GATT)» ABC

1» ÍNKJflt »-СССГТТС^СЛСЛЛСГСЛТЛССТЛЛ 48 [70-230 (CAWAAC.), ADC m

(ААВВСС) {Монахос и др., 2001], полученный в результате гибридизации В carinata (ВВСС) и В, гора (АА). В геноме аллогексаплоида В, *сomposita по отобранным парам праймеров был« выявлены фрагменты, специфичные для геномов А. В н С, В геноме аллотетрашюида Raphanobrassica с помощью большинства исследованных пар праймеров были выявлены фрагменты, специфичные для генома С {В. Ыегасея). Большинство выбранных нами праймеров оказались универсальными для рода Raphanus, что позволило идентифицировать в геноме Raphanobrassica характерные для этого рода фрагменты.

В микросателлитных профилях, получаемых по каждой паре праймеров, каждый аллель с известной молекулярной массой можно рассматривать как дескриптор генетического разнообразия. Для различения отдельных форм растений дескрипторов, выявляемых по одному локусу, часто оказывается недостаточно, так как в пределах вида генотипы повторяются (рис. I - Б, дорожки 4 и 5, 10 и 12 и т.п.), поскольку в процессе эволюции происходит накопление полезны* аллелей. Выявленный в данном исследовании полиморфизм определяется частотой встречаемости аллелей у отдельных форм конкретного вида и ограничивается выборкой растительных форм. Микросателлитный анализ всей панелн локусов позволяет получить набор дескрипторов, уникальный для каждого вида, подвида, сорта, на основе которого может быть составлен индивидуальный «генетический паспорт». Полученная информация о наличии/отсутствии каждого дескриптора может быть представлена в графической форме, в качестве набора аллелей всех локусов, в виде своеобразного штрих-кода, или s математической форме, в виде матрицы, представляющей совокупный цифровой профиль дескрипторов, выявленных по всем исследуемым локусам, где I означает наличие фрагмента в геноме, а 0 - его отсутствие.

Б данной работе для исследуемого спектра видов с использованием 18 пар праймеров было выявлено 222 дескриптора генетического разнообразия. На основе полученных дескрипторов была создана матрица, которую вводили в программу TRHECON для расчета генетических расстояний между генотипами в соответствии с алгоритмом, предложенным Nei и Li (1979). Далее на основе полученной матрицы генетических расстояний проводили кластерный анализ, используя алгоритм UPGMA fSneath, 1973]. Результаты кластерного анализа были получены в виде дендрограммы, отражающей родственные связи между исследуемыми формами.

Дендрограмма видов и разновидностей Brasska (рис. 2>, построенная на основе результатов микросателлитного анализа, соответствует ботанической классификации и цнтогенетическим взаимосвязям, описанным моделью «треугольника U» [U, 1935). Кластеризация растений в целом соответствует видовой принадлежности. Исключение

составляют две формы В. nigra - Bni6635 и Bni662S из Эфиопии, которые оказались в одном кластере с В. carinóla (ВВСС).

i

— Во ЫШ

— ВоЬ762

— Воьтм

— воЬбот

— Воьыа - ВоЬШ

— ВоЬМЗ

— BoeAÍWS

— Вос2218

- Bt>Ci7022

-- Bob57S

— Boc25GS

— Вон 7004

— Bog 141)«)

— Bocal 1159

— Вос*142 —■ Вое» 15778

— - Bata2«2 - Bn<M35

— ВсЗОД!

— Bni6628 - Be 4035

— Be 4025 Bc3976 Bci952 Bc3WÓ Bc4530 BrI 14 Brt8l8

-t

■ &350

- Brt8J2

■ Brl07

• ВгЯШ7

- П x comporto

cc

-Ё

¡с

4

Л i

П

j-ri

—- BnaVikrps

— BnaKfianna

— BnaS065

—- Bnalhal

— Bnal-02

— Bna 10-02

— Bna4405

— Bna 14-02 - Bna464l

— Bnift6lS

-Bni26S6

-Bni6fó4

— bniM.20

- 80Í6619

— BjH 191 Bjl5l93

- BÍ45M

- BÍ45SS

- B456IS

- K7I54 _

— Sa4232

-Rnptianobrassica

■ RS2068 RslB91 Rs2W2

■ Rj2M4

■ Rs2073 Rs2W Cs-1144 04149 Ш1М Cs4185

BBCC

AA

AACC

BB

AABB

Рис. 2. Дендро грамма видов Вгатка и родственных представителей семейства Вгшзкакше. Жирным шрифтом отмечены формы В. п'^га, оказавшиеся в одном кластере с представителями В. сапгкиа.

В результате микросателлитнопо анализа по 18 отобранным парам прайм еров в геномах данных форм нарчду с фрагментами, характерными для В. nigra (ВВ), были также выявлены фрагменты, специфичные для генома С, что соответствует генотипу В, carinóla (ВВСС) (рис. 3. А- Г, дорожки 5,7). Чтобы подтвердить наше предположение о том, что эти фрагменты являются С-геном-спеиифичными. мы клонировали и секвенировалн фрагменты, специфичные для генома С, выявленные у представителей В. carinata и В. olerácea, а также фрагменты соответствующей длины, выявленные в образцах Bni6628 и Bni6635 в результате амплификации с парами праймеров Nal2-A02 (рис, 3 Б, дорожки 5, 7, 9 и 17) и NÍ2-F02 (рис, 3 Г, дорожки 5,7,9 и 16),

ВВ ВВСС сс

& R- cariníit* ¿LefiMCM

Рис, 3. Электрофореграммы разделения в 8 %-ном полнахриламидном геле ПЦР-фрагмеигов, полученных с помощью пары праймеров NÍ3-G04b (A); Na 12-А02 (Б); Nal0-D09 (В); - NÍ2-F02 (Г). В качестве матриц для ПЦР использовали образны ДНК растений В, nigra (ВВ): Вшбб i £ (2). Вш6619 (3), Bni6620 (4), Bni6623 (5), Bni6634 (6), Bni66J5 <7», В. carinara (ВВСС): Bc3946 (8), Вс3950 (9), Ве3952 (10), Вс3976 (II), Вс4025 (12), Вс4035 (13), В. olerácea (СС): и/в boinits; ВоЬ699 (14), п/в costosa-, Вос22 IS (15), п/в gemmi/era: Bog6998 (16), п/в сарШег, boca 192 (17), Воса2432 (IS), Воса7022 (19). Дорожки I, 20 • маркер молекулярной массы. Стрелка>.™ отмечены фрагменты, специфичные для генома С.

Оказалось, что нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК Втб628 и ВЫ6635 и С-геном-спеиифмчных фрагментов ДНК В, саНпаш и В.о1егасеа идентичны. Следовательно, формы Вп<6628 и Вш6635 действительно имеют генотип ВВСС, что

1 1 J * ! I 7 1 * 19 I1111)11 »1« IT 1*

объясняет их объединение в один кластер вместе с В. connota. Таким образом, метод анализа полиморфизма микросателлитов позволяет надежно различать и идентифицировать виды Brassica,

Интересно отметить, что формы растений с геномами Л и С - В. olerácea, В. carinata, В, тара и В. napas - образуют общий кластер, а формы с геномом В - В. juncea и В nigra выделены в отдельный кластер. Полученные результаты согласуются с результатами геномных исследований видов Brassica, в которых установлено близкое родство геномов Л и С и более отдаленная связь с геномом В [Schelfhout et al, 2004, Warwick et al, 2005], Представители родов Camelina, Raphanus и Sinapis образуют отдельные кластеры. Ранее методом RFLP-анализа хлоропластной и митохондриальной ДНК было показано, что Raphanus принадлежит генеалогической ветви В. rapa/B. oleráceo, тогда как анализ ядерной ДИК показал, что Raphanus принадлежит ветви В. nigra [Yang et al. 1999]. Согласно дендро грамме. построенной на основе данных микросателлнтного анализа, растения рода Raphanux равноудалены от В. rapa/B. olerácea н В. nigra, и образуют отдельный кластер.

Следует также подчеркнуть, что метод микросателлнтного анализа также позволяет различать подвиды и разновидности Brassica, Так, например, отдельно кластеризуются масличные (Bj4J88, Bj4594, BJ66I5 и Bj7154) и овощные (Bjl519l и Bj 15193) разновидности В. junceae.

Таким образом, технология микросателлитного анализа позволяет исследовать генетическое разнообразие представителей семейства Brassicaceae и устанавливать филогенетические взаимосвязи на родовом, видовом и внутривидовом уровне.

3. Исследование природы полиморфизма микросателлитных локусов и интрогрессни микросателлнтов. специфичных для геномов А. ВнС диплоидных видов Brassica, в тетра плоиля ы е.

Для исследования природы межвидового н внутривидового полиморфизма микросателлитных л оку со в и подтверждения интрогрессни генетического материала диплоидных видов в тетраплоидные, мы установили первичные структуры фрагментов, специфичных для геномов А, В и С, выявленных у представителей В. napas, В. rapa, В. juncea, В. nigra, В. carinata и В. Ыегасеа в результате амплификации с парами праймеров BRMS-042 и Nal2-A02. На рис, 4 приведена электрофореграмма разделения П1ДР-фрагментов, полученных в результате амплификации с парой праймеров NaJ2-A02. В результате амплификации с этой парой праймеров был выявлен значительный полиморфизм длин фрагментов, специфичных для геномов A (168, 172, 174 и 176 п.н.), В (208, 210 и 212 п.н.) и С (160 п.н,).

Анализ первичных структур этих геном-специфичных фрагментов показал, что исследуемые фрагменты представляют собой сложные микросателлитиые повторы, включающие три вариабельные зоны: At, (СТ)„ и (GAT)„(piic. 5). Последовательности А- и

Рис. 4, Змектрофорегромма разделения в 8%-ном полиакриламидном теле ПЦР-фрагментов, полученных в результате амплификации с парой праймеров Nal2-A02. В качестве матриц дл* ПЦР использовали образцы ДНК* видов В. oleracea (СС) п/в iUpilaro - Boca 192 (дорожки 2, 10), В. napus (ААСС) - BnaVikros (дорожка 3), В, гора (АА> BriSO (дорожка 4), B.jancea (AABBV Bj4594 (дорожка 5), Bj7154(аорожка 6), В. nigra (ВВ),* Bn16620 (дорожка 7), Bni6634 {дорожка 8), В. carinala (ВВСС) - Вс3950 (дорожка 9), Дорожки I, И - маркер молекулярной массы. Фрагменты, специфичные дл* геномов А, В и С, обозначены разными стрелками.

С-геномов обнаруживают наибольшую гомологию по сравнению с геномом В. Различие длин фрагментов, принадлежащих к геномам А и С, определяется количеством повторов CT и 8-нуклеотидной ннсерцией/делецией во флаикируюшей области. Фрагменты, специфичные для B-генома, отличаются от гомеологичных фрагментов А- и C-пекомов числом повторов А, CT, GAT и инсерцией в 18 нуклеотдов во фланкирующей области (рис. 5). Более ранние исследования геном-специфичных последовательностей, выявленных у видов Brassica, также свидетельствуют о высокой гомологии между последовательностями А- и С-re номов и структурных различиях с последовательностями В-геиома {Hosaka et al., 1990, Chevre et al., 1991]. Следует отметить, что полиморфизм длин аллелей в пределах каждого из трех геномов определяется исключительно количеством повторов СТ. Последовательности фрагментов, выявленных в результате амплификации с парой праймеров Ыа|2-А02 зарегистрированы в Генбанке под номерами DQ327820 - DQ327833.

Выравнивание нуклестндных последовательностей фрагментов каждого из исследуемых локусов показало, что первичная структура фрагментов ДНК амфидиплоидных видов В. napus. В. juncea и В. carinóla идентична фрагментам ДНК соответствующей длины диплоидных видов В. rapa, В. nigra н В. olerácea (рис. 5). Полученные данные свидетельствуют об интрогрессии генетического материала диплоидных видов в тетраплондные.

I 1_У_ 5 6 7 8 9 19 IJ

—&-111 — lt. iL о В-2М 1<ю и и.

Л-|7«_ А-П1-Л-|Ы!_ C-IM.

_С -160

15(1 к. к.

Микросанлшние фрагменты, специфичные для геилча В

ВВ-ЛП16620.Ш лееемсттссштсахсетсАСАсг—А _

м eB.Bj4SM.iM лвссттвггистттталсстсАСАст--АтдАстстАттсАсстт^АмссбссАттсамссэттт^^

ВВСС-Вс 3450-1К АбССГГСТТССТТТТСЛХССТСАгаСТ— А1МСТСТАТТСАССТТАт{ХОССАТТ*а0иССТ1теТТ1ЛСЬИСМ;ТТТТТССТСТТТС

М-ВяЛ««»« ЛвССТТвТТвСТТТТаЛСОТСАСДСТ --АТМСТеТАТТСДСТТТАДМССС^САПеААЛсеТТСТТТТТАСССЛСЛСГГГГГССТСТ'ГТСССМССАААМААААД алвв-в)7|34.:м йгссмстмсгтсмсстсасасг- - йтаастстатгсастталагссссаггсаа&чггт «всс-ЭсЗЧЯ!-»! асссттсттвсггтт«*с<ЖАСАСТ--АТААСТСГАТГСАССПДАМ^

вв-011|6М(1.и 1 ¿АМСССТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСССу^ AABHJj4W4.il» ОАААССйТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТ--С;:СДТГ.ДТй»ТСАта

ВВСС-В^МЛ-И» САААСССТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТ-^ССЛТСДТСАТОАТСАтАТССССССССД^ААОТС^СЛСССТтеАСААСбеСЗДИтаТС^

ВВ-втМИ-ИЧ САААССОТСТСТСТСТСТСТСТСТСТС ТСТ----ССОАТОАТСА ТОЙ

АЛгВ-В|Т!М.Щ« ОАААСССТСТСТСТСТСТСТСТСТС ТС ЮТ----ВСЙЛТСАТСАТаАТОАТ'.АГа^ЕеСОСАКААдТССАСАСССТОСАСААС!^^^^?^!^^;^^

С.АААСОЗТСТСТСТСТСТСТСТСТСТС ТСТ----Сте*ТОАТСАГСАТСАТМТтеССдС»т^ААОТССА6ЛСС6ТСО^>ЛСС6С^^

Мнкросятеллятиы* фрагменты, специфичные зля генома Л

AA-Briw.ni АСССТТС Т Т ¿СТ Т1Т СААС5ТС АСАСТСГ Л Т ААС Т СТА ТТСАССТ ТААААСС6 С С А ТТ ---------лАСАСТТ—ТССТСТТТСССАЛи-АААААА -

ла-ВгММТб ОЦШССАТСТСТСТСТМСТСССГСТСТ-

АЛ-В^МИ САМССЛТС тстстстстстстст-----

ААВВВ]Т1Я-Ш САААССЛТСТСТСТСТСТСТСТСТ-----

AACC.BnaVlrK.nl (ДААССДТС ТСТСТСТСТСТСТСТ-----

ЛЛ-ВгИМ*! САААССЛТСТСТСТСТСТСТ---------

—СССАТ--ТОАТСАТСДТС------ССвОСССААОТСОАОАТССТОЗАСМССеССАйАТСАКаИТСАСТ

- -ОССАТ~ТСЛТДДТ<аДте------0СЮС«^ЛСТССА<»ТКТС0АСААСтМ5Л»ТСМ0»'ИС»С*

"ССЙЙСОСААОТСОАОАТССТССАСМСООССАСАТСАКСАТТСАСТ - -(КСОС^ААСТССАЙАТССМеАСААСввааиИТОкТССЛТТСАИ —ССейСОСААСТССАСАТСОТеСАСААСеССаХЕАТСАТСОАТТСАСТ

-ОССАТ —ТСДТС'Л-ТОАТО-

-сеадт—т^лтслтдАта-

-»ГСАТ—ТМТГзАТСАТС-

1- : 107

- ! 107

; 107

- ; 107

: 107

- : 107

: 212

I 210

; 210

; 208

) 209

1 209

т I 85

т : 85

т ; 85

т : 85

т : 85

: 176

) 172

: 172

; 172

: 168

Микроспеллятны» фрагменты, специфичные для геном»С

СС-Вля 1к-1и авссгтвгтвсгтттсалсетса--------СЛСТСТАТТСАССТТЛААЛСССССАТТ-»

АЛСОВмУ*™-!« ХСсеТТСТТСЯ-тсААСеТСА--------САСТОТАТТСАССТТААТЛСССССАТТ-»--

в всс-вс?«»- г и жксттсттест тттоасстса--------сасютаттсассттмаасссссаттт-'т--"-

—-----'АСЛСТ1--ТССТСТТТСССМС-ААЛДАЛ---Т : 82

-тг-т^-АСАСТТ—ТССТСТТГСССААС-ААААМ----Т : 32

...--. - . .тдсдстт—■ТСС1СТТТСССДАО-АААААЛ----т ;

ССАомИИМ СТкАДССДТСТСОЖТСТСТ -ЛАСС-Ом^ДгаИ«» СЯААССДГСТСКТСТСТСТ-BBCC.Bc39ie.li» СТААССДТСТСбСТСТСТСТ -

: 160

__I 160

-ССЕАТ--ТСАТСАТСАТС------ССО;СОСА/ЮТ<К;АОАТССТОСАСЛАСвКЖМ*ТС*1С»ТТС11С1 : 160

-ЕСГ.АТ-- ТСАТСАТОАТС--ССОАТ--ТС АТОАТЛАТО-

-ОССССССААОТОСАиАТСС тсеасаасоосйайлтсатсгаттсасг -ОССССКМвТОАС1АТСеТСЯЛСЛАСССССА£атСАТСа*ТТСАСТ

Гнс, 5. Первичная структура А-, В- и С-сневдфичных фрагментов локуса Ыа12-А02, китрогрессирусмых в тетраплондные вили. Вариабельные мнкросателлкткые области - А(, |СТ)ТО (САТ)„ - подчеркнуты. Олконуклеотндные замены в последовательностях А-, н С-геиомов выделены жирным шрифтом и курсивом. Последовательности праймеров выделены жирным шрифтом. Последовательность отмеченную цветом, планируется использовать > качестве прямого праймера для идентификации В- специфичные фрагментов.

4. Создание PCAR-маркера для анализа иитрогресени В-геиома.

Па основе инссрции длиной IS нуклсотидных пар, выявленной в последовательностях

В-геном-спсиифичиых микросатсллитных фрагментов локуса Ма12-А02 (рис. 5), был

сконструирован прямой п рай мер Fb для специфичной амплификации фрагментов.

характерных для генома В. Прайм ер Fa в сочетании с обратным праимером Nal2-A02:

Fa b'-GAAACCTTCTTTTTACCCAC-З' ft 5' -AGTG AATCG ATG АТСTCGCC- У

использовали для анализа представителей шести видов Brassica и межвидового гибрида

B.xcomposita. Полученная электрофоре грамма (рис, 6) свидетельствует о специфичности

лраймеров по отношению к B-геному. ПЦР-фрагменты соответствующей длины были

выявлены только в образцах, содержащих геном В: В. nigra (ВВ), В. juncea (ААВВ),

В. carinaia (ВВСС) и аллогексаплоиде В. 'composite (ААВВСС).

АД ВВ СС АЛ В В АЛСС UliCC ii- еаря Ь. nigra 8. окглtva Н. jutiLCa Н. й. varinuhi

<—-n " " " 1 i | i > |--1 г-----i

1 2 3 4 5 б 7 в Ч (• П 12 13 14 IS 16 17 1» 14 20 21 22

Рис. & Электрофореграмма разделения в 2 %-ком атарозном геле ПЦР-фрагментов, полученных в результате амплификации с граймерами FB н R ¡Nal2-A02). В качестве матриц для ПНР использовали образцы ДНК растений В. rapa: ВШ4 (2>. Вг107 (3), Вг350 (4), ß. nigra: ВшШ8 (5), Bní6620 (6). Bni6634 (7), В, oleráceo-. ВоЬбМ (8), Boc2218 (9), Boca 192 (10). В,juncea: B)45£S (II), Bj4594 (12), Bj7l54 (13), В. »opus: Bnal-02 (t4). BnaVikros (IS). BnaKhanna (16), B. carinala: Bc395Q (17), Bc4035 (18), Вс4530 (19), В. "com/nsira (20), Дорожки 1, 22 - маркер молекулярной массы pUCIS/Mspl. Дорожка 21 - отрицательный контроль. Стрелкой отмечены фрагменты, специфичные для генома В.

В результате анализа первичной структуры были определены точные длины исследуемых фрагментов: 156 п.н. (Bni662ö), 154 п.н, (Bj4594, Вс3950) и 152 п.н, (Bni6634, Bj7l54 н Вс3950). Было установлено, что первичная структура полученных исследуемых фрагментов идентична соответствующим участкам полноразмерных микросателлитиых фрагментов, выявленных в результате амплификации с парой праймеров Ка12-А02. Полиморфизм длин выявленных аллелей определяется количеством повторов CT, Таким образом, эти фрагменты представляют серию аллелей, характерных для генома В. Необходимо подчеркнуть, что полиморфизм этих фрагментов генома не связан с видовой специфичностью Brassica. Серия аллелей, выявленная в геномах видов В. nigra, В. juncea и В. carínatei, зарегистрирована в Генбанке под номерами DQ465979 - DQ465984.

Для определения хромосомной локализации полученного маркера B-генома в лаборатории ДНК-маркеров ВНИИ СБ был проведен анализ серии генотипов В. napas с

добавленными хромосомами В. nigra [Jahier et al., 1989]. Анализ дополненных линий В. парт - В. nigra показал, что этот маркер локализован на хромосоме ГТТ генома В.

Таким образом, нами был идентифицирован амплифицируемый В-геном-специфичный участок с известкой последовательностью (SCAR- Sequence Characterized Amplified Region), на основе которого возможно создание тест-системы для первичного мониторинга интрогрессии генетического материала при межвидовых скрещиваниях. В настоящее время B-геном широко используется в качестве донора генов устойчивости к различным болезням, засухе и холоду [Plieske, Siruss, 2001, Saal et ai, 2005 Yu et ai, 2005]. Применение прямого теста на интрогрессию В-тенома позволит значительно ускорить селекционный процесс. Данный SCAR-маркер также может быть полезен в исследовании филогенетических взаимосвязей в семействе Braxsicaceae. Согласно онтогенетическим исследованиям В. nigra филогенетически ближе видам Sinapis, чем диплоидным геномам Д и С Brassica [Warwik ef ai. 2005]. Использование SCAR-маркера позволит получить новые сведения об эволюции геномов Brassica,

9. Практическое применение метода микросателлитного анализа в селекции. 5.1. Различение близкородственных сортов рапса (В. иииг»),

Важное значение для селекции представляет различение близкородственных сортов растений. ВН1ГПТИ рапса были предоставлены 12 высокопродуктивных сортов ярового рапса (В. парт), обладающих сходными морфологическими характеристиками, но различающихся по таким признакам как урожайность, содержание масла, эрукоеой кислоты и глюкозннолятов, устойчивость к фузариозу, полеганию и осыпанию. Поскольку проявление количественных признаков определяется сложным взаимодействием многих генов и в значительной степени зависит от условий выращивания растений, различение и идентификация сортов по фенотипу представляются ненадежными. В свят с этим важное методологическое и практическое значение представляет исследование возможности применения технологии микросателлитного анализа для различения близкородственных сортов на генетическом уровне.

В результате микросателлитного анализа по шести парам праймеров были получены индивидуальные генетические профили, позволяющие надежно различать сорта рапса, в том числе близкородственные: Аргумент (Sr-150-87 *Глобаль), Рубеж (В. napus*В. rapa; ГлобальхШШ] 727), Вшит (Глобаль*Моиета) и Ратник [Fl (Глобаль*Sr-150-87) * Fl (Sr-110-87*Глобаль)]. в селекции которых в качестве одной нз родительских форм использовали сорт Глобаль (рис. 8). Полученные генетические профили в перспективе могут быть использованы для идентификации, генетической паспортизации и сертификации сортов.

ti 3 4 sí 7 í » 19 п ii 13 11 ij

ZOO я. и.

lío II. Я.

Б —

_ lí« II. II.

KH> я. H.

ISO II. H.

г

£

Рис. К. Элестрофореграмми разделения в 8%-ном полиакриламкэном геле ПЦР-фрагментов, полученные в результате амплификации с парами праймеров №12-А02 (А), 0112-А04 (Б), ВКМЭ-ОЗб (В), В ЯМ 3-041 (Г), N810-009 (Д)> №2-Р02 (Е>. В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК сортов рапса (В, пари!): Аргумент (2). Визит (3), Лира (4 К Мадригал (5), Ратник (6), Ритм (7), Рубеж (8), Форум (9),Фрегат Эввин (11),

Топаз (¡2), №1 (13), Хана (14). Дорожки 1 и 15 - маркер молекулярной массы

5.1. Исследование интрогрессни ал цельных форм микросателлитных л о кусов листовых овощных сортов В. rtata в их гибриды.

Для генотипирования листовых овощных сортов В. гора (подвидов pekinemte. narinosa, chinensis и nipposinica) были использованы праймеры, выявляющие высокий полиморфизм в пределах генома A: BRMS-036, BRMS-Q42-2, BRMS-043 и BRMS-050. Совокупный генетический профиль, полученный в результате анализа вышеперечисленных локусов, позволил надежно различать и идентифицировать подвиды и сорта В. гари.

В результате амплификации с парой праймеров BRMS-Ü50 был выявлен значительный полиморфизм длин микросателлитов, позволяющий различать подвиды и сорта В. rapa. В связи с этим особый интерес представляло исследование характера

наследовании аллельных форм микросателлнтного локуса BRMS-050 в поколении гибридов F1 исследуемых сортов. В результате микросателлнтного анализа у каждого исследуемого гибрида были выявлены аллеям обеих родительских форм (рис, 9).

I II 111 IV V VI УГГ VIII IX

I 1 3 4 S 6 ? S чти 1113 14 15 и П 18 19 ID 31 II 13 24 В М 27 í* »3031 32 »34

¿99 п. я. п. и.

Рис. 9. Электрофоре грамма разделении в 8 %-ном полиакриламндиом геле ПЦР-фрагыентов, полученных в результате амплификации с парой прайм еров BRMS-050. В качестве матриц для ПЦР испольювали образцы ДНК подвидов В, rapa pekinemis: Osaka Market (2, б, 10, 13), Nakafe Shirona (17, 20, 23, 31); В. rapa ttarmosa: Syan-hai-taHai (16, 23), Ta-gu-ltai (5, 28); B. rapa chinemis: Chins Pang Ju-Tsai (19), Nicanme Tai-sai (12,22, 26); B. rapa nipposinica: Senstubi Kio Mizuna (9, 30, 33) и их гибридов. Дорожки I, 34 - маркер молекулярной массы. Фигурными скобками выделены скрещиваемые родительские формы (выделены жирным шрифтом) и их гибриды,

Для подтверждения интрогрессии генетического материала из родительских форм в гибриды нами было провезено определение нуклеогидных последовательностей микросателлитных фрагментов, выявленных у сортов Osaka Market (п/в pekinesis) и SensuJzi Kio hfízuna (п/в nipposimká) и их рецилрокных гибридов (рис.9, группа II). Анализ исследуемых фрагментов показал, что первичная структура фрагментов ДНК гибридов идентична первичной структуре фрагментов соответствующей длины родительских форм Osaka Market и Sensuifci Kio Шгипа, что свидетельствуют об интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды. Исследуемые микросателлитные локусы представляют собой простые динукдеотидные повторы (СТ)„, числом которых определяется различие длин аллелей.

Однако следует отметить, что не все выявленные у родительских форм аплели наследовались в гибридах (рис, 9, группы t, II, Ш, V, VI). В некоторых случаях у гибридов были выявлены аллели, отсутствующие, у обеих родительских форм (рис, 9, группа, X),

Для более детального исследования передачи аллелей по наследству были получены и проанализарованы образцы ДНК индивидуальных растений Osaka Market и Sensvdzi Kio Mtzima и их реципрокных гибридов (рис. 10). Оказалось, что некоторые родительские формы являются генетически неоднородными. В смеси ДНК растений Osaka Market были выявлены два фрагмента (дорожка 4), тогда как генотипы индивидуальных растений Osaka Market могут быть представлены как двумя (дорожка 2). так и одним аллелем (дорожка 3). Генотипы индивидуальных растений Senswki Kio Mizuna представлены одним аллелем (дорожки 9, 10).

Однако в смеси ДНК растений Semuiki Kio Mizuna помимо аллея* 174 л.н. в следовых количествах присутствуют дополнительные аллели (дорожка 11), что свидетельствует о генетической неоднородности растений Sensiuizi Kio Mizuna, Предпочтительная амплификация аллеля 174 п.и. предположительно может быть связана с повышенной концентрацией этого аллеля в смеси ДНК.

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 11

21Н> п. н.

*_1*0

«-174

«_IM

150 л, к.

Рис. 10. Электрофореграмма разделения в 8 %-ком полнакркламндном геле ПЦР-фрагментов, полученных в результате амплификации с парой праймеров BRMS-050. В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК сортов Osuta Market (2 н 3 - индивидуальные растения, 4 • смешанный образец) и Sunsuthi Kio АИгипа (9 и 10 - индивидуальные растения, 11 - смешаииый образец» и их гибридов: Опака Market 'SemuJzi Kio Mizuna (5 и 6), Sensudzi Kio Mizuna* Osah> Market (7 н 8), Дорожки 1, Ii - маркер молекулярной массы. Стрелками указаны иитрогресснруемые фрагменты. 178,174, 166 и 162 - молекулярная масса фрагментов, л. н.

Неоднородность родительского материала является причиной формирования различных генотипов реиипрокных гибридов сортов Osaka Market и SensuJzi Kio Mizuna вопреки ожидаемому единообразию первого поколения гибридов (рис. 10, дорожки 5-8). Неоднородностью скрещиваемого материала можно объяснить появление у гибридов Fl аллелей, отсутствующих у родительских форм, например, появление аллеля ISO п.н. у гибрида $ Osaka Market" ¡¡Sensudzi Kio Mizuna (дорожка 5). Для дальнейшего изучения характера наследования аллелей микросателлнтного локуса необходим тщательный анализ и последующий отбор генетически однородного родительского материала для скрещивания.

Таким образом, технология генотипирования на основе микросателлитного анализа может являться мощным инструментом для селекционеров, который позволит отбирать генетически однородный материал для скрещиваний и контролировать селекционную работу, что представляет особую важность для селекции перекрестно опыляемых растений, таких как Brassica.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Описанная в данной работе технология генотипирования на основе микросателлитного анализа позволяет надежно различать рода, виды, сорта, выявлять генетическую неоднородность селекционного материала и осуществлять контроль интрогрессии генетического материала от родительских форм в межродовые, межвидовые и

сортовые гибриды. Данная технология предназначена для решения таких задач, как поддержание генетических коллекций, анализ родословных, подбор родительских пар для скрещивания, регистрация новых сортов, контроль генетической подлинности сортов и зашита авторских прав селекционеров, а также для мониторинга транс генов и филогенетических исследований.

Предлагаемая технология микросателлитного анализа видов Вгонка разработана на основе использования современных методологических подходов, таких как выделение ДНК на силикагелевом сорбенте, ПЦР с «горячим стартом», автоматическая детекция ПЦР-продуктов, которые позволяют значительно ускорить скрининг большого числа растительных образцов и повысить воспроизводимость результатов, В результате проведенной работы нами был отобран ряд информативных микросателлитных локусов для надежного различения растений Brassica и оптимизированы условия их амплификации.

По результатам данной работы были подготовлены методические рекомендации для специалистов-биотехнологов, сельскохозяйственных бистехнологическнх и селекционных центров, научно-исследовательских институтов.

ВЫВОДЫ

/. Разработана универсальная технология генотипирования культурных и дикорастущих растений рода Brassica на основе анализа полиморфизма микросате.тлигов. По результатам анализа 98 генотипов с помощью 40 пар праймеров предложен оптимальный набор из 18 пар праймеров для генотипирования растений рода Brassica.

2. Показано, что разработанная технология микросателлитного анализа позволяет различать н идентифицировать растения рода Brassica, составляющие треугольник U, и представителей других родов семейства Braisicaceae (Sinapis, Raphanus. Camelina) на родовом, видовом и внутривидовом уровне. Предложенная технология позволяет производить типирование отдельных сортов рапса (fl. napas) и листовой овощной капусты (В. rapa).

3. Результаты микросателлитного анализа шести исследованных видов В. rapa. В. nigra, В, olerácea, В. juncea, В. napas и В, carinala полностью соответствуют их ботанической и цнтогенетической классификации и могут быть использованы для решения задач молекулярной систематики представителей семейства Brassicaceae.

4. Впервые показано, что предлагаемая технология микросателлитного анализа позволяет осуществлять контроль интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды при межродовых, межвидовых и внутривидовых скрещиваниях, С помощью анализа нуклеотидных последовательностей микросателлитных локусов показана

интрогрессия генетического материала, специфичного дл* геномов А, В и С, в адлотетрзшюидные виды Brassica, а также интрогрессия генетического материала сортов Osaka Marke! и Sensiuki Kio Kfixuna вида Д. гара в их реиипрокные гибриды,

5. Анализом первичной структуры микросателлитных л оку со в BRMS-042 и Na12-A02 впервые установлено, что полиморфизм между геномами А, В и С определяется числом микросателлитных повторов и ннсерциями/делециями во фланкирующих участках, а полиморфизм внутри геномов определяется исключительно числом микросателлитных повторов.

6. На основе структурных различий, выявленных в результате секвенирования фрагментов мнкросателлнтного локуса NaI2-A02, специфичных для геномов А, В и С, создан локус-специфичный SCAR-маркер генома В Brassica, который может быть использован в селекции для контроля ннтрогрессии генетического материала, а также для исследования филогенетических взаимосвязей и эволюции видов Brassica,

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Анискина Бирюкова В.А., ВелншаеваН.С., Мартынов В.В., Панкин A.A., Прибылова Т.А., Хавкин D.E., Шилов H.A. ДНК - генотипнрование растений Brassica и Solanum // Сб. трудов III международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». Москва. 19 октября 2004, С, 119-120.

2. Анискина Ю.В.. Мартынов В.В., Панкин A.A., Хавкин Э.Е., Шилов H.A. Три метода ДНК генотипирования культурных форм Brassica И Материалы Ш Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. 14-18 марта 2005. Т. I, С. 221.

3. ДннрЕрраJftß,. Шилов H.A., Хавкин Э.Е Использование метода анализа полиморфизма мнкросателлитов для оценки генетического разнообразия форм Brassica // Материалы всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». Суздаль 19-22 мая 2005. С. 319-321.

4. Анискина Ю.В.. Бирюкова В.А., Велншаева И.С., Панкин A.A., Прибылова Т.А., Хавкин Э.Е., Шилов H.A. ДИК - генотип нрование растений родов Brassica н Soianum // Сельскохозяйственная биология. 2005. -Nil. С. 110-119.

5. Анискина Ю.В.. ВелншаеваН.С., Шилов U.A., Хавкии Э.Б, Генотипирование пасленовых и крестоцветных растений методом мнкросателлнтного анализа. Методические рекомендации. В НИМ СБ Москва. 2005.21 С.

6. Анискина Ю.р,. Панкин A.A., Хавкин Э.Е., Шилов И.А, ДНК-маркер хромосомы Ш генома В Brassica. //Доклады РАСХН. 2006. „Vs 4. С, 15-16.