НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ДЕТЕКЦИИ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ И АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОМОВ

Шилов, Илья Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ДЕТЕКЦИИ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ И АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОМОВ
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ДЕТЕКЦИИ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ И АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОМОВ"

На правах рукописи

ШИЛОВ ИЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВИЧ

НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ДЕТЕКЦИИ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ И АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОМОВ

Специальность 03.00*23 - Биотехнологию

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РЛСХН (г. Москва),

Научный консультант:

доктор биологических наук

Карягина-Жулина Анна Станиславовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Морозов Сергей Юрьевич

доктор биологических наук, профессор

Зиновьева Наталья Анатольевна

доктор химических наук, профессор

Каплун Александр Петрович

Ведущая (фтмнэяцмя:

Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина н Ю.А. Овчинникова РАН (г, Пущино)

совета Д 006.027.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 42; теп.: (495}-97б-б544; факс: (495>977-0947; E-mail: iab@iab.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Зашита состоится 2007 г. в 11.00 часов на заседании диссертационного

2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.027.01 кандидат биологических наук

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Анализ известных точечных мутаций в ДНК является одним из основных направление современной ДНК-диагностики и находит широкое применение при выявлении предрасположенности человека к различным наследственным заболеваниям, при анализе устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам, в миграционных исследованиях, а также в фармакогеномнке.

Существующие метода детекции известных точечных мутаций можно разделить на две группы. В одной группе методов анализ мутаций проводится после амплификации исследуемого участка ДНК, Точечные мутации обнаруживают по расщеплению анализируемых фрагментов ДНК соответствующими рестриктазами, с помощью аллель-специфической гибридизации или удлинения праймера на один нуклеотвд, Ко второй группе методов относятся те, в которых амплификация является частью системы детекции. Эти методы основаны на лигировании специфических олигонуклеогидных зондов в месте потенциальной мутации и аллель-специфической полимеразной цепной реакции. Тем не менее, при всем существующем многообразии методов не один из них пока не является полностью подходящим для клинического использования. К общим недостаткам методов первой группы, ограничивающим их применение в клинической практике н крупномасштабных исследованиях, можно отнести трудоемкость, наличие стадии постреакционной обработки продуктов амплификации (это способствует контаминации), долгое время анализа и низкую производительность. Кроме того, наиболее используемый в клинической диагностике метод первой группы, основанный на анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, имеет существенные ограничения по применению, поскольку требует наличия сайта рестрикции в месте предполагаемой мутации. Методы второй группы являются более предпочтительными с точки зрения использования их в клинической практике, т.к. они позволяют проводить генотнпнрование в одну стадию, что сокращает время анализа и значительно упрощает анализ. Однако, эта методы также являются малопроизводительными, что ограничивает их широкое применение. Кроме того, метод аллель-специфического олигонуклеотидного литерования характеризуется низким выходом продукта реакции. Таким образом, разработка новых, удобных в эксплуатации, быстрых, высокопроизводительных и надежных методов детекции известных точечных мутаций в ДНК является актуальной задачей современной биотехнологии.

Результаты многочисленных научных исследований, полученные при изучении структуры и организации геномной ДНК животных, растений и микроорганизмов, существенным образом отразились на методологии их систематизации, ранее основанной, главным образом, на анализе фенотипическнх призн

конкретного организма к той или иной группе не является чисто академической. Основанная на точных критериях систематика живых организмов, определяющая эволюционное родство между ними, помимо чисто теоретического представляет н большой практический интерес. В частности, определение источника патогенных микроорганизмов при больничных инфекциях позволило бы выработать эффективные меры защиты против их распространения. Идентификация микроорганизмов важна не только для медицинской практики, но также и в других областях, например, при сертификации продуктов питания, при определении экологической чистоты воды и почвы и т.д. В настоящее время молекулярно-генетические методы позволяют осуществлять идентификацию личности в судебно-медицинских исследованиях, а также решать в спорных случаях проблему определения отцовства. Применение технологий генотигшровання в сельском хозяйстве открывает новые возможности для эффективного решения различных задач современной селекции, таких как поддержание генетических коллекций, подбор родительских форм для скрещивания, составление родословных, контроль интрогрессни генетического материала, паспортизация и сертификация сортов. создание «генетических паспортов» сельскохозяйственных растений, представляющих собой основу защиты интеллектуальной собственности селекционеров.

Наиболее важным подходом для исследования генетического полиморфизма представляется использование методов молекулярного анализа, позволяющих получать индивидуальную характеристику отдельного генотипа - ДНК-профиль. Существующие методы ДНК-типирования геномов отличаются по сложности, надежности и объему получаемой информации. Для надежного различения и идентификации генотипов, исследования филогенетических взаимосвязей и интрогрессни генетического материала, наиболее перспективным является метод анализа полиморфизма мнкросателлнтов, позволяющий получать воспроизводимые, информативные профили известных фрагментов генома.

Целью данной работы явилась разработка новых подходов для детекции точечных мутаций, а также разработка принципов стандартизации технологий генотипирования. основанных на анализе полиморфизма мнкросателлнтов. Исследования были направлены на создание конкретных технологических решений, обеспечивающих применение разработанных подходов к идентификации геномов в практике клинических, судебно-медицинских исследований и в сельском хозяйстве.

Для выполнения работы были поставлены следующие ЗАДАЧИ: I. Исследовать возможность применения лнгазной цепной реакции (ЛЦР) для детекции

однонуклеотидных полиморфизмов.

2. Разработать технологию детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ролнмеразиой цепной реакции (АС-ПЦР) с последующим анализом продуктов реакции с помощью автоматического анализатора ДНК на основе электрофореза высокого разрешения,

3. Разработать методологию конструирования аллель-специфических праймеров для выявления мутаций в любых интересующих генах путем анализа продуктов АС-ПЦР на автоматическом анализаторе ДНК.

4. Применить разработанную технологию для выявления нуклеоткдных замен в генах метнлснтетрагидрофолатредуктазы (677С—»T), факторов II (20210G—»A) и V (169IG—свертываемости крови, для анализа полиморфизмов M23ST, TI74M, С(-6)А в гене ангнотензиногена человека, а также нуклеотидных замен в генах al-коллагена тина 1 (2046G—>Т). рецептора витамина D3 (4S0S2G—»A) и эстрогенового рецептора« (938Т-^С « 9В4А—G).

5. Разработать методические подходы, позволяющие стандартизировать технологию молекулярно-генетической идентификации личности, основанную на анализе количества тандемных повторов в мнкросателлитных локусэх геномной ДНК человека.

6. Исследовать возможность применения метода микросателлитного анализа дня генотипировання растений родов Solanum и Brassica, Разработать универсальную технологию дня генотипировання картофеля, культурных и дикорастущих форм Brassica на основе анализа полиморфизма микросателлитов. Отобрать оптимальные наборы праймероа к полиморфным микросателлитным локусам для различения и идентификации растений родов Solanum и Brassica, соответственно,

7. Применить технологию микросателлитного анализа для исследование генетического разнообразия представителей родов Solanum и Brassica как на внутри- и межвидовом уровне, так и для генотипировання сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции, а также близкородственных сортов и гибридов Brassica.

8. Изучить природу межвидового и внутривидового полиморфизма исследуемых микросатеплитных локусов.

9. Исследовать возможность применения технологии микросателлитного анализа для осуществления контроля интрогрессин генетического материала родительских форм в гибриды/сорта при межродовых, межвидовых и внутривидовых скрещиваниях.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Технология детекции мутаций на основе АС-ПЦР с последующим анализом продуктов реакции с помощью автоматического анализатора ДНК на основе капиллярного электрофореза.

2, Методология конструирования аллель-специфических прай мерой дня выявления мутаций в любых интересующих генах путем аналии продуктов АС-ПЦР на автоматическом анализаторе ДНК.

Разработанные тест-системы лля выявления нуклеотидных замен в генах мегилентетрагидрофолатредуктааы (677С—»Т), факторов II (202) СЮ—»А) и V (169Ю—*А) свертываемости крови, для анализа полиморфизмов М235Т, Т174М, 0(-6)А в гене ангиотензиногена человека, а также нуклеотидных замен в генах а1-коллагена типа 1 (204(Ю—»Т), рецептора витамина ИЗ (450$2С-+А), эетрогенового рецептора в <938Т-*С и 984А-+0.

4. Основные принципы стандартизации технологии молекул ярно-генетнческой идентификации личности, основанной на анализе количества тандемных повторов в мнкросателлитных локусах геномной ДНК человека.

Технология генотипирования картофеля н его дикорастущих сородичей на основе анализа 20 микросателлитных локусов.

6, Технология генотипирования культурных н дикорастущих растений рода Вга.шса на основе анализа 18 микросателлнтных локусов.

Научнвя новизна ваВоты. В настоящей работе осуществлено комплексное исследование вопросов идентификации геномных полиморфизмов. В процессе выполнения исследования соадан ряд научно обоснованных технологических решений, имеющих приоритетное значение для современной ДНК-диагностики:

1. Впервые разработана методология создания тест-систем для детекции мутаций на основе АС-ПЦР и капиллярного электрофореза, адаптированная для использования в клинической практике. На основе предложенной технологии разработаны диагностические наборы реагентов для выявления нуклеотидных замен в генах метнлентетрагидрофояатрелуктазы (677С—*Т), факторов II (2021 СЮ—'А) н V (169Ю—»А) свертываемости крови, полиморфизме« М235Т, Т174М, й(-6)А в гене ангиотензиногена человека, а также для нуклеотидных замен в генах а!-коллагена типа 1 (20460—»Т), рецептора витамина 03 (450826—»А) и эетрогенового рецептора в (««Т—С и 984Л—

2. В рамках задачи создания технологии детекции точечных мутаций, адаптированной для использования в клинической практике, разработан и создан прибор для

автоматизированного анализа фрагментов ДНК методом капиллярного электрофореза «Мультигеи». Генетический анализатор «Мультиген» основан на оригинальной оптической схеме, защищен патентом на изобретение (Шилов И.А. и др., 2000) н рекомендован для применения в медицинской практике Комитетом по новой медицинской технике Министерства здравоохранения Российской Федерации.

3. fia основании комплексного исследования источников возможных ошибок при проведении молекулярио-генетической идентификации личности разработаны основные подходы к стандартизации этой технологии, а именно принцип единого технологического цикла, принципы создания наборов реагентов для идентификации личности, а также способы, обеспечивающие однозначную идентификацию аллелей при проведении генетических экспертиз с использованием автоматических анализаторов.

4. В результате проведенных исследований были отобраны 20 микросателлитиых локусов, являющихся перспективными для идентификации видов и сортов картофеля. С применением технологии микросаггеллитиоги анализа были получены уникальные генетические профили 85 образцов растений рода Solanum, 44 из которых являются сортами картофеля отечественной и зарубежной селекции.

5. Впервые показано, что предлагаемая технология микросотсллитного анализа позволяет осуществлять контроль и (Прогрессии генетического материала родительских форм в гибриды/сорта. На основе экспериментального анализа первичных структур ряда микросателлитиых локусов показана возможность контроля ннтрогрессии генетического материала дикого вида S. bulbocastanum н сорта Ласунак в гибрид L 4- П, а также интрогрессни генетического материала родительских форм, участвовавших в селекции сорта Скороплодный.

6. На основании проведенных исследований были отобраны IB микросателлнтных локусов. являющиеся перспективными для идентификации видов, сортов и дикорастущих форм Brassica. Показано, что с помощью технологии микросателлитного анализа можно различать и идентифицировать растения рода Brassica, составляющие треугольник U, а также представителей других родов семейства Brassicaceae {Sinapis. Raphanus, Camelina) на родовом, видовом и внутривидовом уровне,

7. В результате микросателлитного анализа впервые были идентифицированы фрагменты, специфичные для геномов А, В и С диплоидных видов Brassica и подтверждена их интрогрессия в амфнднплондние виды, а также межвидовые н межродовые гибриды. Впервые показана возможность контроля интрогрессни

генетического материала родительских форм (сортов В. rapa) в гибриды с помощью технологии микросателлитного анализа.

Нвучно-гшактнчигкое значение работы. В результате проведенной работы созданы наборы реагентов ЛСП-МТГФР, АСП-ЛР и АСП-Ф5Л цля детекции мутаций в генах метнлентетрагидрофолатредуктазы (677С—>Т), факторов II (20210G—«А> и V (169IG—>А) свертываемости крови, соответственно. Завершены медицинские испытания наборов, инструкции по применению наборов утверждены Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации. С использованием разработанных наборов реагентов было проведено обследование пациенток с нормальным течением беременности и гестозом; при этом выявлена более высокая частота встречаемости вышеупомянутых мутаций у пациенток с гестозом. Также была выявлена высокая частота встречаемости данных мутаций в ДНК беременных женщин с варикозной болезнью. Данные результаты свидетельствуют о связи этих мутаций с предрасположенностью к гестозу и варикозной болезни во время беременности.

Разработанная технология может служить основой для создания новых тест-систем для выявления мутаций в любых интересующих генах.

На основании разработанных в данной работе технологических подходов созданы наборы реагентов для идентификации личности CTWA и FFTL. Эти наборы реагентов зарегистрированы Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации и внесены в государственный реестр изделий медицинского назначения и медицинской техники.

Показана перспективность применения технологии микро сателлита ого анализа для исследования генетического разнообразия сельскохозяйственных культур, а также их идентификации, генетической паспортизации и сертификации, подбора генетически однородного материала для скрещиваний и контроля селекционной работы, а также для решения проблем молекулярной систематики и эволюции.

Продемонстрирована возможность различения близкородственных сортов картофеля Альтаир и Аксамит, в селекции которых участвовали одни и те же родительские формы; различения сортов отечественной н зарубежной селекции (сорт Скороплодный и Wauseon); различения близкородственных генотипов - сортов Голубизна и Скороплодный, являющихся полусестринскими сортами картофеля. На примере сорта Голубизна показано, что предлагаемая технология микросателлнтного анализа позволяет отслеживать и подтверждать сортовую подлинность экспертных образцов, сохраняемых и поддерживаемых в различных опытно-пронзводствениых хозяйствах.

Полученные в работе результаты м и кросателл итного анализа шести исследованных видов В, гора, В. nigra, В. oteracea, В, juncea, В. парт и В. carinala полностью соответствуют их ботанической н цитогенетической классификации и могут быть использованы для решения задач молекулярной систематики представителей семейства Brassicaceae. Б результате микросателлитного анализа выявлены фрагменты, специфичные для геномов А, В и С, которые могут быть использованы в качестве маркеров интрогресснн генетического материала при межвидовых и межродовых скрещиваниях.

Личный вклад автора. В цикле исследований, включенных в диссертацию, автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке экспериментальных подходов и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, личный в клал автора заключался в непосредственном участии во всех этапах исследования - от постановки задачи, проведения молекулярно-биологических и физико-химических экспериментов до обсуждения и литературного оформления полученных результатов.

Апробация диссертации. Разработанные методики апробированы и применяются в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН (г. Москва), Российском государственном медицинском университете (г. Москва), Приморском краевом клиническом центре охраны материнства н детства (г. Владивосток). Центральном институте травматологии и ортопедии (ЦИТО) им, H.H. Приорова (г. Москва). Российском центре судебно-медицинской экспертизы (г. Москва), Бюро СМЭ Московской области. Бюро СМЭ департамента здравоохранения г. Москвы, Республиканском Бюро СМЭ Татарстана. Республиканском Бюро СМЭ Башкортостана, Бюро СМЭ Новосибирской области. Бюро СМЭ Комитета по здравоохранению Ленинградской области. Бюро СМЭ г. Санкт-Петербурга, Бюро СМЭ Рязанской области. Бюро СМЭ Воронежской области, Бюро СМЭ Саратовской области, Бюро СМЭ Иркутской области, Алтайском краевом Бюро СМЭ (г. Барнаул), Приморском краевом Бюро СМЭ (г. Владивосток), Бюро СМЭ Новгородской области, Бюро СМЭ Самарской области, Бюро СМЭ Тюменской области, Бюро СМЭ Ярославской области. Республиканском Бюро СМЭ Северной Осетии-Алании, Красноярской государственной медицинской академии, Оренбургской государственной медицинской академии и в ряде других учреждений.

Структура н оЯъеи работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы н приложения. Рабата изложена на 283 страницах печатного текста, содержит 30 таблиц и 70 рисунков. Список литературы включает 284 источника.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Исслеаовяин« возможности применении лигазиой цепной ренкивя (ЛЦР) для детекинн точечных мутаций. В рамках задачи создания технологии детекции точечных мутаций, которая может быть пригодной для клинического использования, на первоначальном этапе было проведено исследование возможности применения для згой цели лигазной цепной реакции (ЛЦР).

С теоретической точки зрения метод ЛЦР представляется достаточно перспективным для детекции точечных мутаций, поскольку реакция происходит только в случае, если в месте лигирования праймеров не происходит локального нарушения вторичной структуры ДНК, т.е. в условиях полной комплементарное™ праймеров матрице. Кроме того, в отличие от аллель-специфического олнгонуклеотндного лигирования метод ЛЦР является амплификацнонным, что делает его значительно более чувствительным и открывает возможность детекции малых количеств ДНК,

Высокая точность работы фермента является основным фактором, определяющим возможность применения ЛЦР для детекции точечных мутаций. Из литературных источников известно, что ни одна ДНК-лигаза не обладает ¡00 %-ной специфичностью при лигирования субстратов, имеющих неспаренньге основания в сайте лигирования (Ьио I. с( а!., 199Й).

Как видно из рис. I В, эффективность действия обеих ДНК-лигаз примерно одинакова (дорожки I и 2; 3 и 4; 5 и 6; 7 и 8), В дальнейшем, в работе использовали препарат ПЬ ДНК-л и газы. Кроме того, на электрофореграмме видно, что лигирование происходит также и в случаях использования матриц с заменой одного нухлеотида в сайте лигирования. хотя и с меньшей эффективностью (дорожки 3 - 8), Таким образом, имеет место проблема неспецифн чес кого лигирования. Так как ЛЦР - процесс экспоненциальный, то даже в случае значительно меньшей эффективности неспецифическое лигирование недопустимо для поставленной цели - идентификации точечных мутаций, поскольку вновь образовавшиеся •»неправильные» ДНК-матрицы могут далее амплнфицироватьея и давать ложный сигнал.

Для преодоления неспеиифнческого лигирования была предложена система с коррекцией лигирования при помощи специального фермента - термостабильной структуре-специфической эндонуклеазы (так называемой Оеауазе). Этот фермент представляет собой Тщ ДНК-полимеразу, в которой путем замены одной аминокислоты в активном центре инахтивирована полимер азная активность.

Фермент С1еа\а5е удаляет выступающие (некомплементарные) одногяжевые 5'-концевые участки в ДНК-дуплексах в результате гидролиза фосфодиэфирной связи, происходящего строго после первого спаренного основания.

QL-Э OL-1

5'-р*GCACTGTAG AAT AAACGCGC A pG TGACTCTCTCGTTAGCTCTTC -3'

3•- CGTGACATCTTATTTGCGCGT—CACTGAGAGAGCAATCGAGAAG -5' (матрица >

3'- CGTGACATCTTATTTGCGCGT--GACTGAGAGAGCAATCGAGAAG -b' (Tenfl-G)

3 ' - CGTGACATCTTAWTGCGCGT--AACTGAGAGAGCAATCGAGAAG - 5 ' {Tempi-A)

3' - CGTGACATCTTATTTGCGCGT--TACTGAGAG AGCA ATCG AGAAG -5 ' {Tempi-T)

место расщеплен ня Clea vas«

5'-cgcctatatg / 0L3-1 31 -g /J OLl-lO

V-p*GCACTGTAGAATAAACGCGCA// GTGACTCTCTCGTTAGCTCTTC -Э' 3'- CGTGACATCTTATTTGCGCGT—CACTGAGAGAGCAATCGAGAAG -5*

Рис, 1. Исследование специфичности действия to и 12 if 1. Ii lo к Tuq и Tth ДНК-лигаз Л, Контрольная система доя лигироаандо на мазрице. Б. Система дпл ф 4P нитрования с коррекцией Cleavase. В. Анализ

лигирования на природной и мутаытных матрицах * контрольной системе (дорожки I -в) и в системе для датирования с коррекцией Cleavase {дорожки 9 — 16), Для лигнрования праймеров OL-3 и OL-I использовали Taq ДНК-лигазу (дорожки t, 3, 5 а 7) и Tth Д1Ж-лигазу (дорожки 2, 4, 6 и 8). Дня лигнрования праймеров OL3-I и OLI-1Q использовали Tth ДНК-лигазу (дорожки 9 - 16), В реакциях лигирования использовали природную матрицу (дорожки I, 2, 9 н 10), матрицу Ttmpl-C (дорожки 1, 4, II и 12), матрицу Teinpl-A (дорожки 5, 6, 13 и L4) и матрицу Templ-T (дорожки 7, 8, 1S и 16), Реакцию лнгировшия праймеров OL3-I и OLI-10 проводили как с добавлением Cleavase (дорожки 10, 12, 14 и 16}, так и без добавления Cleavase (дорожки 9, I), 13н 15). Дарожха К - контроль длины продукт» дигироваиил.

Поэтому Cleavase называют структур о-специфической эндонуклеазой. Необходимость использования именно термостабильного фермента обусловлена тем, что реакция ЛЦР происходит при достаточно высоких температурах (60 - 94 °С). Для изучения действия термостабильной Cleavase был синтезирован специальный субстрат (рис. 2, А).

Действие Cleavase проверяли при различных концентрациях фермента (1, 5 и 50 ед ), различном времени воздействия на данную структуру (2 н 10 мин), в разных буферных растворах (буферном растворе для Taq ДНК-пол имеразы и Taq ДНК-лигазы). Изучаемая вилкообразная структура содержала радиоактивную метку на 5'- конце. Для того, чтобы убедиться в том, wo Cleavase расщепляет эту структуру специфично, т.е. после первого

спаренного нуместила (в данном случае - после С), была проведена реакция метилирования по О и последующее расщепление модифицированной ДНК пиперидином (рис. 2, Б).

Как видно из рис. 2 Б, С1еа1'а$е - действительно специфичный фермент (расщепление идет после первого спаренного основания). Кроме того, очень важным оказалось и то обстоятельство, что фермент одинаково хорошо «работает» как в полнмеразном (дорожки I - 6), так и в лмгшном буферных растворах (дорожки 7 - 12). Это открывает перспективы создания тест-системы, в которой реакции лигирования ДНК-лигазоЙ и коррекции С1еауа$е проводятся в одной пробирке.

вместо расщепления Cleivase

5' -ATAGGGAGA«: У С

^"~~CGGAATTCGAGCTCGC С 3'-ATCGTTATGTGCCTTAAGCTCGAGCG G

i2343fi7 в э с

.............. ^швшяшмшшШ»

Рис, 2. Анализ специфичности терм о* стабильной структуро-специфической зндо-нукпеаэы (Cleavase). А, Олнгоиуклеотмдный субстрат для анализа специфичности Cleavase. Б. Электрофоретический анализ продуктов расщепления субстрата с помощью Cleavase. К 20 пмоль ,:Р-меченого 56-звенното субстрата для Cleavase добавляли 1 ед. (дорожки 3, 6, 9 и 12). 5 ед. (дорожки 2, 5, 8 и 11) и 50 ед. Cleavase (дорожки 1, 4, 7 и 10) в буфере для Тел? ДНК-полимеразы (дорожки 1 - 6) и в буфере для ЛЦР (дорожки 7 - 12). Реакцию вели 2 мин (дорожки 1 - 3; 7 - 9) и 10 мин (дорожки 4 -6; 10 - 12). Дорожка G соответствует реакции растепления пиперидином субстрата, модифицированного димет ил сульфатом.

Основываясь иа полученных данных о свойствах Оеачаве была создана система для лигирования с использованием этого фермента. Проводили лигнрование двух праймеров: праймера ОЫ-Ю, который имеет 5'-концевой некомплементарный матрице десятизвенный участок (его длина соответствует длине однотяжевого участка в исследованной вилкообразной структуре), н праймера ОЬЗ-1, содержащего неспаренный нуклеотид (в),

который займет место G - первого спаренного с матрицей нуклеотида в соседнем праймере, удаляемого при действии С lea vase (рис. 1, Б).

Система была проверена на природной и трех мутантных матрицах (Tempt-C, Tempi-А и Tempi-Т). Результаты электр оф еретического разделения продуктов реакции лигирования представлены на рис. 1, В. Из этого радиоавтографа видно, что в отсутствие Cleavase лнгирования не происходит (дорожки 9, II, 13 и 15); в присутствии Cleavase лигированне проходит только на природной матрице (дорожка 10). Таким образом, с применением Cleavase удается значительно повысить точность и специфичность реакции лигирования.

Одним из перспективных способов детекции продуктов ЛЦР (ДНК-дуплексов) является колориметрический метод. Для колориметрической детекции используются две пары лраймеров, причем праймер из одной пары содержит на í'-конце дополнительный некомплементарный матрице участок (UP-участок), Праймер из другой пары содержит на 5'-конце биотин, который связывается со стрептавндином, находящимся в лунках микропланшета. В результате ЛЦР образуется ДНК-дуплекс, который содержит и биотин, и однотяжевой UP-участок. К этому UP-участку далее гнбрндизуют олнгонуклеотид, несущий на 3'-конце, например, щелочную фосфатазу, Субстратом для щелочной фосфат азы является NADPH, который в результате ее действия превращается в NADH. NADH, в свою очередь, принимает участие в окислительно-восстановительной реакции: окисляясь до NAD* он восстанавливает формазановый краситель, в результате чего последний меняет цвет (регистрируется поглощение при 490 нм), Если лигирования не прошло, то изменения цвета не происходит.

С использованием метода колориметрической детекции в данной работе была предложена система д ля ЛЦР, исключающая нематричное лигирование. Дня этого пран меры были спланированы таким образом, что после их отжига на матрице «разрывы» в верхней и нижней цепях окажутся «сдвинутыми» друг относительно друга (рис. 3). В этом случае, при отжиге комплементарных праймеров друг на друга после действия Cleavase получаются ДНК-дуплексы С некомплементарными 3' -концам и. Это исключает возможность нематричного лигирования. Лигирование (и сама реакция ЛЦР) может происходить только в результате отжига праймеров на ДНК-мишени.

Праймер OL2-5UP содержит на 3'-конце UP-участок (для гибрнднзицни с олигонуклеоткдом, несущим щелочную фосфатазу), а на 5'-конце содержит 5-звенный некомплементарный матрице участок (удаляемый при действии Cleavase); праймер OL1-5B содержит биотин на J'-конце н пентануклеогндный некомплеменгарный матрице участок на 5*-конце (удаляемый при действии Cleavase). Праймеры OL4~1 и OL3-I на Í'-конце содержат неспаренный с матрицей нуклеотид, который займет место нуклеотида, удаленного

Cleavase из соседнего гграймера (рис. 3). Для сравнения ЛЦР с коррекцией Clcavase на описанной выше системе с обычной ЛЦР была использована система праймеров, предложенная в коммерческом наборе реагентов AmpliTck LCR Kit фирмы Bio-Rad (США).

Место растепления Cleavase

у/ OL2-SW А

UP,

3' .1 5J

Место iHcmeiuKiiirii Cíe avise

OL4-1

Phí. 3. Модифицированный метол ЛЦР с колориметрической детекцией продуктов реакции.

Следует отметить, что в отличие от обычного метопа ЛЦР использование такой специальной системы праймеров с коррекцией С lea vase действительно исключает нематричное лнгнрование (Табл. I).

Однако, несмотря на высокую специфичность, чувствительность этого модифицированного метода ЛЦР оказалась небольшой (Табл. 1). Поэтому перспективы развития метода ЛЦР с коррекцией С lea va se для диагностических целей могут быть связаны либо с применением специализированных высокочувствительных приборов для детекции, либо с проведением предварительной стадии оценки количества исследуемой ДНК (например, с помощью ПЦР в реальном времени).

Табл. I. Результаты колориметрической детекции продуктов обычной ЛЦР и ЛЦР с коррекцией

Clavase.

Количество ДНК-матрицы, моль Поглощение прн 490 нм после обычной ЛЦР Поглощение прн 490 нм после ЛЦР с коррекцией GcaitKt

3 х 10 м - o.a±o.io

3 х 10 15 - 031 ±0,05

Зх 10'™ 1,05 ±0.15 0,2 В ± О.05

3x10'" i,:i±o,ifi 0,12*0.02

Зх 10" 1,15 ± 0,15 0

3 х It*"'4 1,04 ± 0.15 0

О 0.42 ± O.flfi 0

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о необходимости комплексного подхода для решения задач идентификации генетических полиморфизмов.

Этот подход должен включать в себя не только разработку принципа диагностики, но н обязательную апробацию методики с помощью существующих аппаратных средств, позволяющих надежно детектировать тот или иной полиморфизм.

В рамках этого подхода следующим этапом работы явилась разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР (АС-ПЦР) с применением автоматических анализаторов ДНК, адаптированной .для использования в клинической практике, и ее апробация для выявления ряда практически значимых нуклестидных замен в генах человека.

2Л, Разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР (АС-ПЦР) с применением автоматических анализаторов ДНК.

В основе АС-ПЦР лежит та особенность полимеразной цепной реакции, что для ее эффективного осуществления J'-концевой нуклеотид праймера должен быть комплементарен соответствующему нуклеотиду ДНК-матрицы. В противном случае эффективность удлинения праймера во время ПЦР резко снижается и при определенных сочетаниях нуклеотидов может отсутствовать вообще (Goodman M.F., 1995; Патрушев Л.И., 2000). Поэтому, в АС-ПЦР используются два аллель-специфических праймера, 3'-концевые нуклеогиды которых соответствуют месту расположения детектируемой нукяеоткдной замены в ДНК. При этом, З'-концевой нуклеотид у одного из праймеров комплементарен «мутантному» нуклеотиду ДНК-матрицы, а у другого - соответствующему нуклеотиду «нормальной» ДНК-матрицы, не несущей мутацию. Следовательно, в зависимости от наличия или отсутствия мутации в ДНК происходит удлинение соответствующего аллель-специфического праймера. Последующий же анализ образующихся при этом продуктов реакции позволяет идентифицировать нуклеотедную замену.

Преимуществом АС-ПЦР является то, что она позволяет получать информацию не только о наличии мутации в геномной ДНК, но также и об ее аллельном распределении. Тем не менее, данный метод редко используется в клинической практике. Это связано, прежде всего, с тем, что продукты АС-ПЦР, как правило, мало различаются подлине, что затрудняет их идентификацию с помощью электрофореза в агарозном геле и делает метод неудобным для использования.

Применение автоматических анализаторов ДНК на основе электрофореза в ПААГ и капиллярного электрофореза (КЗ) обеспечивает ряд преимуществ: очень высокое разрешение, простоту детектирования фрагментов ДНК в режиме реального времени, короткое время анализа. Эти достоинства делают автоматические анализаторы более

подходящими для идентификации продуктов ПЦР в клинической практике» нежели классический электрофорез в ara розном геле.

Л; Гочспнгот* "кормиьнт4

Б: roMtrtHitn "мутантнв«"

«I „^

Аллель 1> 1

В: Грг»рошп>Т1

Аллель t

Аллель Z

1L__* !

Г не. 4. Принцип выявлении точечных мутаций с помощью АС-ПЦР при использовании капиллярного электрофореза. П1, ГО - флуоресцентно-меченные с помощью красителя ФI праймеры, специфичные к к нормальному» аллелю и аллелю, несущему нуклеотндную замену, соответственно. ИЗ - общий праймер. Пики, обозначенные цифрами 1 и 2 на зотектрофеграммах соответствуют продуктам ПЦР, полученным удлинением праймеров П1 в П2, соответственно. Пик, обозначенный пунктиром, соответствует маркеру длины, меченному красителем Ф2. Стрелками на схемах А, Б н В обозначено направление удлинении праймеров, черным треугольником обозначена иуклеотндная замена. А, В случае '(нормальной» ДНК происходит удлините прайм ера П1 с образованием продукта 1 н отсутствует удлинение прайнера Ш. Б. В том случае, если нуклеотидная замена присутствует в обоих аллелях, удлиняется праймер П2 с образованием продула 2 н не происходят удлинение праймера П1. П. Если нуклеотндная замена присутствует только в одном из аллелей, то происходит удлинение обоях аллель-специфичееклх праймеров П1 и П2 с образованием двух продуктов реакции I и 2.

Предлагаемая в данной работе технология детекции точечных мутаций заключается в том, что ПЦР проводится с тремя л рай мерами: двумя аллель-специфическим и П1 и П2, меченными по 5'-концам флуорофором ФI, и одним общим праймером ПЗ (рис. 4), При этом используемые аллель-специфические праймеры П1 и П2 различаются по длине их 5'-концевых последовательностей, что приводит к образованию ПЦР-продукгов разной длины. Перед электрофорезом ПЦР-продукты смешивают с маркером длины, т.е. со специально синтезированным фрагментом ДНК, длина которого является промежуточной между длинами продуктов АС-ПЦР, и меченным при этом флуорофором Ф2. Далее проводят анализ продуктов с помощью капиллярного электрофореза. При этом на электр офореграмме

наблюдается один инк (рис. 4, Л и Б), «ели ДНК является гомозиготной по -«нормальному» аллелю (мутация отсутствует в обоих аллелях) или гомозиготной по «мутантному» аллелю (мутация содержится в обоих аллелях), соответственно, и два пика (рис. 4, В) - в случае, если ДНК гетерозиготна по анализируемой мутации.

1.2.1. Разработка методологии конструирование аллель-спец ифнческих праймеров для АС-ПЦР в сочетании с капиллярным электрофорезом.

Для того чтобы идентифицировать в ДНК человека конкретные мутации, для каждой из них было разработано два аллель-спеии фнческих праймера: AS-fN)-WT (где N -уникальное для каждой мутации обозначение), специфичный к «нормальному» аллелю, н AS4M)-MT, специфичный к ДНК, содержащей мутацию, а также один общий праймер. которые использовали в одной реакционной смеси. Праймеры AS-(N)-WT и AS-(N)-MT различались 3*-концевыми нуклеогндами. При этом, их специфичность зависит от того, насколько сильно ннгибирует удлинение праймера некомплементарная пара, которую образуют З'-концевой нуклеотид праймера и соответствующий нуклеотид ДНК-матри цы. Так, наиболее неблагоприятными для продолжения синтеза ДНК являются пары нуклеотидов пурин-пурин и пиримидин-пиримидин (Goodman M.F., Патрушев Л.И., 2000). Тем не менее, вероятность удлинения праймера сохраняется даже в случае образования самой неблагоприятной для удлинения пары нуклеотидов. Поэтому, для того, чтобы увеличить аплельную селективность праймеров, были введены дополнительные некомплементарные матрице нуклеотнды иа их 3'-концах. Они вводились в одно и тоже положение (-1 или >2), что важно дэя получения сравнимой эффективности амплификации для двух аллель-спецнфнческих праймеров (Ulvik A. et а]., 1998). Кроме того, дополнительные иеспаренные нуклеотнды на 3'-конце, в случае, если они различаются для парных аллель-специфических праймеров, приводят к большему различию образуемых ПЦР-продуктов, что также снижает вероятность несцецнфнческого отжига праймеров на них.

Чтобы выявить гетерозиготное состояние мутации праймеры AS-(N)-MT, определяющие специфичность к мутантному аллелю, были удлинены на 12 нуклеотидов (некомплементарных матрице) с 5'-конца, что приводит к образованию ПЦР-продуктов большей длины. При этом, в структуре праймеров AS-(N}-WT два 5'-концевых нуклеотида были заменены на некомплементарные матрице с тем, чтобы в случае образования гетеродуплексов между короткими и длинными ПЦР-продуктами не происходило «ложного« накопления более длинного «мутаитного» ПЦР-продукта.

Для того, чтобы иметь возможность разделять продукты разных реакций в одном капилляре, что повышает производительность процесса и сокращает время анализа.

праймеры планировались таким образом, чтобы длины продуктов разных реакций лежали в разных диапазонах длин, В рамках данной работы были выбраны три диапазона длин предполагаемых амплификаяов: 120-140 п.н., 170-190 п,н. и 230-250 п.к.

2.1.2. Создание систем детекции мутаций <iï!02IOA) н (G169IA) в генах факторов It н V свертываемости крови человека; (С677Т) в гене метилент«тр»гидрофолатреду«стазы;

Cl 01ST, TII98C и С(-6)А в гене япгиотетиногша; (С2046Т) в гене аI-коллагена типа ]; (G4S082A) в гене рецептора витамина Ш н (Т938С н A984G) в гене

эстрогенового рецептора а человека методом АС-ПЦР. В рамках шиной работы проводилась разработка систем детекции ряда значимых с диагностической точки зрения мутаций в генах человека. Нуклеотидные замены 677С—»Т, 2O2I0G—>Д и I69IG—»А в генах метидентетрагидрофолаггредактазы (МТГФР), факторов II и V свертываемости крови, соответственно, могут определять предрасположенность к таким патологиям, как например, тромбофнлия или варикозная болезнь (Rosendaal F.R. et al., 1995; Ertdler G. et al„ 2001; Poon S.R. et al., 19%). Три мутации в гене анпютензнногена человека (AGT) наиболее значимы с точки зрения их связи с предрасположенностью к гесгозу и первичной гипертонии (Jeunemaitre X, et al., 1992; Inoue 1. et al., 1997). Это две мутации, приводящие к аминокислотным заменам - M23ST и TI74M и одна мутация С(-6)А в промоторной области гена ангиотензиногена. На основе литературных данных также были определены наиболее значимые мутации в генах at-коллагена типа 1 (COLIA1), рецептора витамина D3 (VDR) и эстрогенового рецептора a (ER) человека для связи с предрасположенностью к остеопорозу (Stewart T.L. et al., 2000; Gram S. etal,, 1996; Kobayashi S. et al-, 1996). Это мутация в 1-ом и игрой е генаСОи.М, приводящая к замене гуанозинана тим и дин в 2046-м положении в сайте узнавания белка Spl; мутация в 8-м нитроне гена VDR, приводящая к замене тунозина на аденозин в 45082-м положении в сайте рестрикции В.чпil, а также мутация 938Т—»С в сайте рестрикции PvwII и мутация 984А—>G в сайте рестрикции А7ю1 гена ER,

Создание системы детекции мутаций на основе АС-ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК предполагало следующие этапы работы:

1) амплификацию соответствующего фрагмента генома, и отбор нормального, гетерозиготного и мутантного генотипов с помощью секвенировання ПЦР-фрагментов;

2) создание aim ель-специфических праймеров согласно разработанной методологии и оптимизациям условий АС-ПЦР;

3) анализ образцов с использованием автоматического анализатора ДНК, в частности, прибора для капиллярного электрофореза;

4) подтверждение результатов анализа методом прямого секвенировання.

Первый этап работы, как отмечено выше, заключайся в амплификации фрагментов образцов геномной ДНК, содержащих области с предполагаемыми мутациями, и в последующем определении их генотипов с помощью секвеннрования. Образцы ДНК с известными генотипами далее использовались дня последующего подбора праймеров и оптимизации условий АС-ПЦР.

Следующая стадия работы заключалась в создании аллель-специфических праймеров согласно разработанной методологии их конструирования. Для усиления специфичности действия праймеров в ряде случаев некомплементарные матрице нуклеотиды были введены в -2, а не в -I позиции от 3'-конца. Это связано с тем, что пары пуринов А-0 и О-О, которые образуются между некомплементарным нукпеотндом в -2 позиции и иуклеотидом ДНК-матрицы, лучше ингибируют амплификацию, чем пары пиримндинов Т-Т и Т-С, которые образовывались бы а случае некомплементарного взаимодействия нуклеотндов в -1 позиции. Конечные варианты последовательностей праймеров, размеры ПЦР-продуктов н маркера длины приведены в Табл. 2.

С целью исключения ложных результатов необходимо было подобрать такие условия реакции, при которых происходило бы сравнимое по эффективности удлинение обоих аллсль-специфических праймеров при сохранении их специфичности. Для этого варьировали температуру и время денатурации ДНК, гибридизации и удлинения праймеров, а также концентрации Ме24", дНТФ и ДНК-полимеразы. Поскольку праймер А5-(Ы)-МТ, специфичный к ДНК, несущей мутацию, за счет большей длины вступает в реакцию эффективнее праймера АЭ-СЮ-^Т, специфичного к «нормальной» ДНК, то варьировали также н концентрации аллель-специфических праймеров с целью подобрать их оптимальное соотношение, при котором в случае гетерозиготной ДНК образовывались бы одинаковые по интенсивности сигналы во время разделения продуктов ПЦР с помощью капиллярного электрофореза. В итоге, оптимальными были признаны условия, при которых реакционная смесь включала в себя 20 пмоль общего обратного праймера, 10 пмоль праймера А5-(Ы)-\УТ и К пмоль праймера А5-(М)-МТ, Оптимальные условия циклирования представлены в Табл.2.

Для создания технологии детекции точечных мутаций, адаптированной для использования в клинической практике, на базе научно-производственной фирмы «АТГ* Еиотех» (Россия) был создан отечественный прибор для автоматизированного генетического анализа на основе капиллярного электрофореза - «Мудьтиген».

Табл. 2. Праймеры я условия ПЦР, используемые для детекции точечных мутаций с помощью АС-ПЦР,

!>■ Мугама Назвалвэ примеров" Последомтмьаость ораСиероа (5*-}') Гамер продукта* АС-ПЦР я маркера длины (п.и.) Уелокяк цнынровама

ТОЙ С45082-»А АЛ-Ввп1-ПТ Вгм1-МТ Кик1-Р ЗОЕ - СЮСАОАОССТОАСТАТТСООААГСС ЗОЕ ■ А АТТТТСАТОТТС АОСАаЛОССТЛАСТАГТООСААТСТ АСТОСССТТАОСГСГСССТТС 1М» 137 131 «'С-13 миг, 30 пилок 94'С-ЗОсек, 60*С-З0сек, (62*С-30се*, » случае мутации С4МИА), 72'С-ЗО сек; 72*С-5 мкк

М1ТФР С677-+Т А$-МТНЕК-)¥Т ЛЗ-МТИГК-МТ МТНРЯ-К ЗОЕ ■ ШЗАЛ«5ТСТСГОС£ЮО£СС ЗОЕ - б АССТООАТСОТСОАОААООТаТСТОСООСТаТ ААСАТСССОССЮАССАТСЮ 125 138 131

Фактор 11 «0210->А ЛЗ-Р-НТ лх-е-мт Р-Р ЗОЕ -ССАТАОСАСТСОСАССАГТСАССАТС ЗОЕ - ОС АПТТСАССССГЙААТАССАСТОООАОСАТГС АСОаТТ СТТССОССГСААОААОТОСАТАСАСАА 174 187 189

Фактору С!691->А (ЬеИео) .«-¿-мг ь-р ЗОЕ - ¿ДТСААСЮАСААААГАСС ТСТАТТССДС ЗОЕ - ОТСГОТСТОТСТСТГСААСО АСААААТАСС ТСТАТТСССГГ СССАСОААСААСАССАТСАТСАО 233 245 239

АСТ С1015-+Т (Т174М) АЫ74-МТ 174-Я ЗОЕ • СХООСССАОСТОСТССТОТСДАС ЗОЕ. рА^ГЛГгАТССТАСАГЛСССАйСТССТССТСТССАТ ААОТССАСАаАОСОТСОСАОСАС 123 137 131

ТИ98-+С (М235Т) Л3-13!- ИТ 231.Г ЗОЕ . ЕСТОСТаТССАСАСТООСГССАА ЗОЕ - АТСОСТСТААС АОТТССТОТССАСАСГООСГСССС СААТССТСООТОТГССТГООААО 174 187 180

0(-6Ь*А А5-6М'ИТ4 ЛЗ-СбА-МТ) СЬЛРЗ ЗОЕ - АСГГАСССАОААС ААССОСАССТТСПССМС ЗОЕ - СТД<5ТАТАСС Ав АСССАСААСА АСОССАГгСТГСТТСС ДСТ СТСТОТТСАССАСГгеАААСТСТССАТСО 236 245 239 95'С -12 мин, 30 циклов: 94*С-40сек, 58*С - 30 се*, (45'С - 30 кк, • случае мутации С2046Т), 72*С-30се*; 72*С - 5 мни

Ей Т93!->С (ЛиЩ ЛЯ-Ргя-Ш АХ-Р>*-МТ Ли-Р ЗОЕ - ¿САСГГССАААГСГСССАОДТ ЗОЕ - атптсстатаатсасттссааатотсссаоос тптссаооаататасааттат 125 137 131

А984-« №1) л&хы-ю лз-хш-мт ХЫ-Р ЗОЕ - ЩСААТОСТСАТСССААСТДТ ЗОЕ - АААТТСАСАОАТАСС ААТОСТСАТСССААСГОС АСТСАТАТССАООСПТАТСТОО 174 186 180

СОЬ1А1 01(м6-»т АЗ-СОЬ-ЦГ ЛЬ-СОЬ-МТ СОЫi ЗОЕ -ШАССССАССТССССАСССААПС ЗОЕ - ТААТМСААТГГГСлаХСАССТССССАОСС ААТСТ ОАААГААА^АССАСАСОСТСАСАСЮОСО 173 185 180

Примни ае:'' ~ деа верхви* праЯыерз - «ичякпеплфичюсне, лкжний - общий праймер;" - верхи« значение - раамер ПЦР-проЛуста, обрмуюпкго« в резултаи реахпии с цроЯмерами 45-(Л9-ВТ(гле М- утткалмое дла каждой мутации обозвпеиие) в общего, среднее эваченне - в реакции с граймерама АБ-(Я)-МТ в общего, нижяее значение - раамер соответствующего маркера длины. Жирным шрифтом в последовательности гтраймеров обюкачены куклеотнды. соответствующие «нормальному» или «иутаотжмгуя иуклеошду ДНК-чатрнцм, подчеркиванием выделены нуклеогнды, некомплемснтарные ДИК-м»трице.

Генетический анализатор «Мультигек» осиоваи иа оригинальной оптической схеме, защищен патентом на изобретение (Шилов НА. и др., 2000), и рекомендован для применения в медицинской практике Комитетом по новой медицинской технике МЗ РФ. Поскольку прибор «Мультиген» позволяет осуществлять флуоресцентную детекцию фрагментов ДНК в диапазоне от 550 до 615 им, для анализа продуктов АС-ПЦР была использована «двухцветная» детекция на основе коммерчески доступных красителей JOE (для мечения продуктов ПЦР, Табл. 2) и ROX (для мечення маркеров длины).

Рис. 5. Электрофоре граммы разделения продуктов АС-1ЩР, полученных ори анализе полиморфизма TI198C а гене АОТ, с помощью КЭ. Каналы регистрации ПЦР-продукгов и маркеров длины (обозначены стрелками) представлены отдельно. На верхних электро-фореграмиая представлены пики, образуемые маркерами длины, размер которых составляет 131 п.и., 180 л.и. и 239 п.н. На нижних - пики, соответствующие анализируемым продуктам АС-ПЦР. А. Разделение продуктов, полученных при анализе ДНК гомозиготной по адлелю И9&Т гена AGT (длина продукта -174 п.н,), Б. Анализ ДНК гомозиготной по аллелю 119SC (длина продукта - 187 п.н.). В. Анализ ДНК. гетерозиготной по полиморфизму Т1198С (дойна продуктов - 174 п.н. и 187 им.).

На рис. 5 представлена электрофореграмма разделения продуктов АС-ПЦР, полученных при анализе полиморфизма Т119S—»C в гене AGT с помощью КЭ.

В случае ДНК гомозиготной по аллелю 1198T наблюдается один пик, соответствующий ПЦР-продукту длиной 174 п.н., расположенный слева от маркера длины размером 180 п.н. (рис, 5, А), В случае ДНК гомозиготной по аллелю П98С пик соответствующего ПЦР-вродукта (IК7 п.н.) наблюдается справа от маркера длины (рис. 5, Б). Пики обоих ПЦР-продуктоэ (174 п.н. и 187 п.н.) наблюдаются по обе стороны от маркера длины в случае ДНК гетерозиготной по данному аллелю (рис. 5, В).

При разработке систем для детекции мутаций в генах МТГФР, факторов II и V свертываемости крови человека в рамках данной работы также была предпринята попытка создания диагности кума на основе мультиплексной ПЦР, предполагающего одновременный анализ нескольких полиморфизмов. Для всех трех полиморфных маркеров были подобраны праймеры, имеющие одинаковую температуру отжига (Табл. 2).

( I 4

* « »

LLL !.M.J_.J 1 П i k\

! | i M JiLL S .

» Л ü ¿4 Ä ¿1 .4» iJ Mi «tM 4 1 t

_iil>—М j.............JL_Li-1

jLl.CEIJOLI

M 41 |j; U jli

Время titigjtii'iu, мин

L i. ^L .....1 1 1 i ! А:

ttltlHU lítx MVM

Рис. 6. Эиеетрофореграмми одновременного разделения продуктов двух и трех различных АС-ПЦР в одном капилляре. Каналы регистрации ПЦР-продуктов и маркеров длины (обозначены етрел-камм) представлены отдельно. На верхнгсс электрофоре* граммах представлены пики. образуемые маркерами длины, размер которых соответствует 131 п.н., 18« п.н, и 239 п.н. На нижних - пики, соответствующие анализируемым продуктам АС-ПЦР, А. Разделение ПЦР-продуктов, полученных при анализе ДНК гетерозиготной па мутации С677Т гена МТГФР (длина продуктов - {25 пн. и 138 п.н.), гомозиготной по

2021 ОС адлелю гена фактора II (длина продукта- 174 п.н.) и гетерозиготной по мутации Leiden гена фактора V свертываемости крови (длина продуктов- 233 п.н. л 245 п.И.), Б. Анализ гетерозиготы по полиморфизму G450S2A геиа VDR (длина продуктов - 125 п.н, и 137 п.н,) и гомозиготы по аллето 204ЙТ гена COLIA1 (длина продукта - 185 п.н.). В. Анализ гомозиготы по аллелга 93ЯС гена ER (длина продукта - 137 п.н.) я гетерозиготы по полиморфизму A9R4G гена ER (длина продуктов - 174 П.н. и 18й п.н.).

Тем не менее, оказалось, что проведение в одной пробирке шести разных реакций не приводит к получению достоверно воспроизводимых результатов. Поэтому более надежной является такая стратегия детекции нескольких мутаций, при которой АС-ПЦР для каждой мутации проводится отдельно, а уже анализ продуктов нескольких АС-ПЦР может проводиться в одном капилляре.

На рис. 6 приведены данные электрофореза при анализе в одном капилляре продуктов, полученных в результате двух или трех различных АС-ПЦР и смешанных перед нанесением на гель. На рис. 6, А представлена электрофореграмма. полученная при анализе ДНК, гетерозиготной по мутации С677Т гена МТГФР, гомозиготной по 20210G аллелю гена фактора It и гетерозиготной по мутации Leiden гена фактора V свертываемости крови. В этом случае наблюдаются два пика (125 п.н. н 138 п.н.), расположенные по обе стороны от маркера длины, размером 131 п.н.; один пик, соответствующий продукту реакции длиной 174 п.н. и расположенный слева от маркера длины размером 180 пн., а также два лика (233 п.н. и 245 п.н.), расположенных по обе стороны от маркера, длиной 239 п.н., соответственно. Электре фореграммы разделения в одном капилляре продуктов ПЦР, полученных при анализе по одному полиморфизму в генах COLI AI и VDR, а также двух полиморфизмов в гене ER представлены на рис. 6. Б и В. соответственно.

Результаты анализа нуклеотидных замен с помощью разработанных систем были выборочно подтверждены методом прямого секвеинрования предварительно амплифицированных фрагментов ДНК, содержащих области с предполагаемы ми мутациями, что свидетельствует о надежности разработанных систем.

2.2.3. Концепция создания наборов реагентов для детекции точечных мутаций.

Конечным продуктом разрабатываемой технологий, который будет использоваться в клинической практике, является набор реагентов для детекции конкретной мутации. Такой набор должен включать в свой состав все реагенты, необходимые для проведения анализа по единой технологической схеме, начиная от реагентов для выделения ДНК, заканчивая реагентами для детекции (в данном случае, специальными маркерами длины) и подробную инструкцию по эксплуатация набора реагентов.

Используемая в ПЦР ДНК-матрица не должна содержать примесей (белков, полисахаридов и низкомолекуяярных веществ), способных ннгибировать действие ДНК-полнмеразы, поскольку их наличие может приводить к неоднозначным и трудно интерпретируемым результатам. В случае АС-ПЦР, где праймеры содержат некомплементарные матрице нуклеотиды. требования к качеству препарата амплифкцируемой ДНК возрастают. Поэтому, в настоящей работе было уделено отдельное внимание выбору оптимального способа выделения ДНК.

Для методов, основанных на ПЦР, особое значение имеет качество фермента -термостабильной ДНК-полимераэы, качество других реагентов для амплификации ДНК и хорошая «подобранность» всех компонентов набора. В процессе выполнения работы для каждой системы потребовался индивидуальный дизайн аллель-специфических праймеров, подбор оптимального фермента, условий амплификации и т.п. Кроме того, для удобства использования наборов в клинической практике реакции по разным системам оптимизировали так, чтобы было возможно проводить анализ нескольких мутаций одновременно, используя единую программу амплификации (Табл. 2).

В случае диагностических систем также очень важно иметь внутренний контроль, чтобы исключить ложноотрнцательные результаты. Например, можно в одной пробирке с аллель-специфической ПЦР проводить амплификацию какого-либо фрагмента другого гена (Ра<гизЬе\ Ь.1. а1., 1998). Этот дополнительный амплификат и является внутренним контролем. Его отсутствие свидетельствует о том, что условия реакции не являются подходящими для проведения АС-ПЦР, Недостаток такого внутреннего контроля может заключаться в том, что его синтез иногда может мешать протеканию АС-ПЦР. Преимуществом проведения реакции с тремя праймерами (рис. 4) является то, что при этом

использования такого специального внутреннего контроля ие требуется. В качестве внутренних контролсЯ будут выступать сами аллель-специфические продукты: образование одного из них обязательно произойдет, если условия реакции соблюдаются.

Таким образом, результатом этого этапа исследований явилось создание надежной технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР с применением автомагических анализаторов ДНК, адаптированной для использования в клинической практике.

К преимуществам разработанной технологии можно отнести:

• гелотипирование в одну стадию, исключающее пост-реакционную обработку ПЦР-продуктов;

• возможность детекции всех типов нуклеотндных замен н получение информации не только об их наличии в ДНК, но также и об их гомо- или гетероэиготности;

• высокую производительность и быстроту выполнения анализа за счет использования автоматических анализаторов ДНК;

• надежность и наличие внутреннего положительного контроля за счет того, что во время АС-ПЦР в одной пробирке протекают сразу две реакции, при этом одна из них должна пройти обязательно;

• однозначность интерпретации результатов анализа за счет использования маркера длины, расположенного между двумя возможными продуктами амплификации.

На основе разработанной технологии было создано три набора реагентов: для выявления мутации Gl 691Л (Leiden) в гене фактора V системы свертываемости крови методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции для определения генотипа пациентов по Ф5 (АСП-Ф5Л), для выявления мутации G20210 в гене протромбина человека методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции для определения генотипа пациентов по протромбину (АСП-ПР), а также для выявления мутации С677Т в гене метилентетрагидрофалатредуктазы человека методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции для определения генотипа пациентов по МТГФР (АСП-МТГФР). К настоящему времени завершены государственные медицинские испытания данных наборов. Инструкции по применению наборов утверждены Федеральной службой по налзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ.

2.3. Концепция стандартизации технологии молекулярно-генетпческой идентификации

личности.

Анализ индивидуальных генетических отличий людей представляет собой самый совершенный и точный способ идентификации личности на сегодняшний день. Для

проведения такого рода анализа достаточно следовых количеств любого биологического материала - крови, слюны, фрагмента ткани, волос. В процессе анализа исследуют специальные изменчивые участки ДНК (мини- и мнкросателлитные локусы, содержащие различное количество повторяющихся нуклеотидных последовательностей), определенная комбинация которых, своего рода «генетический паспорт», является уникальной характеристикой каждого человека.

Традиционный способ анализа ДНК при выполнении генетической экспертизы включает несколько последовательных стадий:

• выделение ДНК из исследуемого биологического материала;

■ проведение амплификации специфических участков генома, содержащих различное число тандем я ых повторов;

• разделение ^модифицированных фрагментов ДНК с помощью электрофореза в полиакрил амидном геле;

• окрашивание геля с целью визуализации фрагментов ДНК;

• интерпретацию результатов путем сопоставления ПЦР-фрагментов с соответствующим стандартом длины (аллельной лестницей).

Качество выполнения каждой стадии работы определяет конечный результат анализа. Особое внимание следует обратить на то, что достоверность анализа во многом определяется качеством стандарта длины, применяемого для идентификации аллелей.

Большую опасность в плане ложного генотипировання представляет использование в качестве маркеров для идентификации аллелей так называемых гетсрологичных полинуклеотидов - фрагментов ДНК, соответствующих по длине, но не соответствующих по нуклеотидной последовательности истинным аллелям данного локуса. Дело в том, что при определенных условиях фрагменты ДНК одинаковой длины, но с различной нуклеотидной последовательностью имеют разную конформацню и, соответственно, с разной скоростью движутся в геле под действием электрического поля. Даже при использовании «гомологичных» аллельных лестниц в некоторых случаях незначительные различия, выражающиеся в наличии точечных мутаций или полиморфизмов о анализируемых фрагментах ДНК, могут оказывать влияние на подвижность в теле. На рис. 7, А приведен результат разделения в 6 '/¿-ном неденатурирующем ПААГ смеси фрагментов ДНК, соответствующих аллелям локуса Р13А01. Фрагменты, соответствующие аллелям 5, 9 и 13, имеющие однонукпеотидные замены в области тетрануклеотидных повторов, как было показано при секвенировании этих фрагментов (рис. 7, В), характеризуются аномальной подвижностью при электрофорезе. Это выражается в неравномерности аллельной лестницы

и в смещении «мутантного» фрагмента ДНК аллельной лестницы, соответствующего аллелю 5. относительно «нормального» фрагмента ДНК, соответствующего аллелю 5 анализируемого образца.

Рис. 7. Примеры аномальной подвижности гомологичных фрагментов ДНК при различных условиях электрофореза. А. Электрофоретаческое разделение амплнфицировалных фрагментов ДНК (дорожка I) н гомологичного аллельного маркера (лорожка 2) локуса Р13Д01 в <> ТЬ-ном ПААГ в неденатурирующкх условиях (окраска бромистым дащвем). В дорожке I стрелкой обозначен фрагмент ДНК длиной 127 п и., соответствующий аллелю 5. В дорожке 2 стрелками отмечены фрагменты ДНК с аномальной подвижностью из-за имеющихся в их составе нуклеотидвы* замен. Этн фрагменты соответствуют аллелям 5 (127 п.н.). 9 <143 п.н.) н 13 (159 п.н.). К. Электрофоретнческое разделение амплифщщрованных фрагментов ДНК (дорожка I) и гомологичного аллельного маркера (дорожка 2) локуеаПЗЛО! в денатурирутоших условиям (окраска серебром), В. Результаты секвенирояания областей тетрануклеотидных повторов аллеля 5 (с аномальной подвижностью) из аллельной лестницы (дорожка 2) и нормального аллеля 5 (дорожка I). Однонукяеозидвая замена Т—«С отмечена стрелкой.

Однако эти различия в подвижности практически нивелируются при проведении электрофореза в денатурирующих условиях (рис. 7, Б), Следует отметить, что при этом также существенно снижается время, затрачиваемое на проведение электрофореза и. соответственно, общее время на проведение экспертизы.

Поэтому основным принципом стандартизации технологии молекулярно-генетнческого анализа для идентификации личности является необходимость проведения анализа по единой технологической схеме, основанной на использовании сертифицированных реагентов для всех стадий от одного производителя на рекомендуемом им оборудовании и в рекомендуемых им условиях.

Создание наборов реагентов для молекулярно-генетической идентификации личности - сложный технологический процесс, при котором следует учитывать целый ряд условий, невыполнение которых может привести к получению инструмента, не способного обеспечить получение правильного результата. Поэтому разработка и производство наборов реагентов, соответствующих необходимым требованиям, могут быть осуществлены только в

специализированных лабораториях, имеющих необходимый опыт работы и подходящую производственную баау.

Наборы реагентов для проведения молекул ярно-генетичесхих экспертных исследований с использованием технологии анализа ПДАО (Иванов ПЛ., 1999), должны удовлетворять следующим требованиям:

■ включать в свой состав все реагенты, необходимые для проведения анализа по единой технологической схеме, начиная от реагентов для выделения ДНК и заканчивая реагентами для выявления фрагментов ДНК в геле;

• обеспечивать высокую чувствительность и специфичность;

• быть удобными в использовании.

Ках уже отмечалось ранее, особое значение имеет взаимная «подгонка» всех компонентов набора. Все компоненты должны быть соответствующим образом протестированы как по отдельности, так и в составе набора, с тем, чтобы обеспечивать необходимый уровень чувствительности и специфичности в течение всего срока годности набора реагентов. Для повышения удобства работы с наборами могут быть использованы особые технические приемы, например, разработка аллельных маркеров со специфическим набором фрагментов. Для таких аллельных лестниц характерно отсутствие одного или нескольких фрагментов ДНК, соответствующих определенным аллелям. Наличие такого нгэпа» облегчает интерпретацию результатов и позволяет избежать возможных ошибок при идентификации аллелей в исследуемых образцах. Необходимо, чтобы используемый аллеяьный маркер был гомологичен анализируемой ДНК, т.е. чтобы маркерные фрагменты ДНК аллельной лестницы точно соответствовали аллелям анализируемого локуса не только го длине, но и по нуклеотидной последовательности. Только при этом условии можно добиться однозначного соответствия подвижности фрагментов, получаемых при амплификации анализируемой матричной ДНК и фрагментов аллельной лестницы.

При анализе следовых количеств биологического материала, что является стандартной практикой при производстве судебно-медицинских молекул ярно-генетичесхих экспертиз, особенно важна высокая чувствительность. Применение специальных термостабильных ДНК-полимераз со встроенным «горячим стартом» для ПЦР и тщательный подбор условий реакции позволяют повысить чувствительность, а также избежать появления дополнительных артефактных полос на геле при амплификации «проблемных» локусов.

Этой же цели - получению надежных и достоверных результатов - служит проведение электрофореза в полиакрил амидном геле в денатурирующих условиях, поскольку при этом нивелируется влияние на зяектрофоретическую подвижность в геле различий во вторичной

структуре анализируемых пол и ну оеотидов, возможных мутаций и полиморфизмов (рис. 7). Предпочтительно также комплектовать наборы реагентами, которые обеспечивают выявление фрагментов ДНК после проведения электрофореза путем прокраски геля серебром. Этот способ визуализации фрагментов ДНК существенно повышает чувствительность анализа по сравнению с прокраской бромистым этидием.

Существенно облегчить интерпретацию результатов и, в целом, повысить эффективность и надежность судебно-экспертного типировання ДНК, можно за счет уменьшения длины анализируемых фрагментов. !>го достигается путем разработки новых праймерных пар для анализируемых локусоа. Дело в том, что в случае относительно длинных полинуклеотидов - длиной более 250 п.н., для хорошего разделения фрагментов ДНК и, соответственно, получения достоверных результатов генотипирования, необходимо значительно увеличивать время электрофореза. Это увеличивает общее время анализа и не всегда хорошо сказывается на качестве получаемой картины разделения фрагментов ДНК. Кроме того, уменьшение размера амплифнцнруемых фрагментов важно с точки зрения получения хороших результатов при анализе образцов, содержащих деградированную ДНК. Оптимальным представляется диапазон размеров анализируемых фрагментов ДНК от 100 до 250 п.н.

Следует отметить, что к настоящему времени для экспертных целей разработано несколько десятков молекулярно-генетнческих индивидуализирующих систем на основе мнкросателлитных локусов. Во многих странах мира разработаны стандартные наборы локусов, которые должны подвергаться анализу при производстве молекулярно-гентическнх экспертиз. В США это система CODIS (Combined |>NA Indexing System), в которую включено 13 мнкросателлитных локусов, в Европе рабочей группой ENFSI (jaropean Network of forensic Science Inslitutes) отобрано 7 мнкросателлитных локусов, в Латинской Америке CITAD (£шро Iberoamericano de Trabajo en Análisis de £NA) выбрано 6 мнкросателлитных локусов, а Интерпол установил набор из четырех мнкросателлитных локусов в качестве пан-Европейского стандарта (Табл. 3).

Выбор именно таких локусов обусловлен тем, что они находятся на разных хромосомах (Табл. 3), наследуются независимо и, кроме того, благодаря популяцнонным исследованиям, проводимым в различных странах на протяжении последних лет, охарактеризовано аллельное разнообразие данных локусов.

Учитывая важность этой группы локусов для судебно-медицинских экспертных исследований, на основе разработанных выше требований в рамках данной работы были созданы наборы реагентов для идентификации личности CTWA (на основе анализа локусов

Табл. 3. Микроеателтггные лакусы, использующиеся при производстве молекулярно-генетичсских экспертиз в различных странах мира, а также выпускаемые фирмой Рготе^а (США).

Рготпсца (США) ЕГЧП»1 1мегро1 отло Хромосомная локализация

С5Р1РО С'5НР(> сын го 5ц33.3-34

РОЛ ЮЛ К!А КОЛ Г1Ш1 4Ч28

ТН01 ТМ01 ТНШ Т1101 11р15-15,5

ТРОХ тюх ТРОХ 2р23-2рГег

\ЛУА 12р12-г(ег

0351358 0351358 0351358 Зр21

055Ш »53818 5ч21 <1.)|

075Ш ГШХ20 075820 74

0851179 0851179 0851179 0135317 8

I) (353! 7 01383(7 13ч22-ч31

[Э165539 0165539 0165539 16422-24

1>)КЭ51 018551 1)1 «851 1Яд21.3

021Э Н 021811 1)21511 021511 2ЦИ-<|21

Р13Л01 6^24-25

8р22

РКЭРРЗ 15ч25чцег

изв 1с|11ю32.1

протоонкогена рецептора (С8Р1Р0), интрона 10 гена тироид пероксидазы (ТРОХ),

факторе VIII коагуляции (у\УА) и амелогснина (Ате!) геномной ДНК человека) и Г т. (па основе анализа локусов протоонкогена с-РЕ5-ТРЗ <РЕ5РР5), гена р-субъедшшцы фактора XIII коагуляция (Р13В), нитрона ) гена тирозингндроксилазы (ТИ01) и нитрона 6 гена липолротеинлнпазы (1.Р1,) геномной ДНК человека). В настоящее время эти наборы реагентов зарегистрированы Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации и внесены в государственный реестр изделий медицинского назначения и медицинской техники.

2.4, Разработка н стандартизация технологий генотипа рования растений.

В настоящее время все большее применение получают методы анализа генетического полиморфизма растений. Применение ДНК-технологий открывает новые возможности для эффективного решения различных задач современной селекции, таких как поддержание генетических коллекций, подбор родительских пар при скрещивании, составление родословных, контроль интрогрессии генетического материала, паспортизация и сертификация сортов, зашита интеллектуальной собственности, картирование и клонирование генов хозяйственно ценных признаков, а также в исследовании организации и эволюции геномов.

Наиболее перспективным методом различения и идентификации генотипов является анализ полиморфизма микросателлитов, или простых повторяющихся последовательностей

(SSR - simple sequence repeats), позволяющий получать воспроизводимые информативные профили известных фрагментов генома. В основе этого метода анализа лежит полиморфизм длин микросатеялитных локусов, выявляемый посредством ПЦР с использованием пар праймеров, фланкирующих области коротких тавдемных повторов. Следует отметить, что в отличие от генома человека геномы растений являются гораздо менее изученными. И, если микросателлнтные локусы, по которым проводится молекулярно-генетнческий анализ идентификации личности, на сегодняшний день, в основном, определены (Табл. 3), то соответствующие технологии различения и идентификации растений требуют отдельной разработки для каждой группы объектов.

2.4.1. Исследование межвидовой и внутривидовой вариабельности растений рода Solanum методой мнкросателлитного анализа.

При выборе праймеров для исследования полиморфизма микросатеялитных локусов растений Solanum учитывались следующие критерии. Во-первых, диапазон длин амшшфицнруемых фрагментов генома исследуемого объекта, содержащего микросателянтные последовательности, должен составлять от 100 до 300 п.н. Поскольку различие длин аллелей мнкросателянтного локуса определяется числом повторяющихся единиц, представляющих собой ди-, три-, тетра-, пента- и гексануклеотиды, то с помощью высокоразрешающего электрофореза ПЦР-фрагменты, отличающиеся всего на несколько нуклеотидов, разделяются надежнее, если они имеют не очень большую длину. Во-вторых, при выборе праймеров большое значение представляют сведения о количестве аллелей и Природе повторяющихся единиц, содержащихся внутри того или иного микросателлнтного локуса.

На основании литературных данных (Milbourne D. et al. 1998; Ashkenazi V. et al. 2001; McGregor C.E, et al. 2000) было проанализировано около 200 пар праймеров к мнкросателлктным локусам, после чего для генотнпирования представителей рода Solanum было выбрано 30 пар праймеров.

С помощью метода микросателдитного анализа в работе было проанализировано б клубненосных видов Solanum (S, kurtzianam, 5. stolonifemm, S. chacoeme, S. bulbocasltinum, S. Jemissum и S. tuberosum) я один бесклубневый вил IS. tycopersicoiiJes), На рис. 8 представлены электрофоре граммы разделения продуктов ПЦР в 8 %-ном полиакриламидном геле, полученных с четырех пар праймеров (POT47-4S, STIIKA, STS 1-2 и STM0031), выявляющих в сумме от б до 12 аллельных вариантов для исследуемых микросателлитных локусов картофеля.

Рис. 8. Электрофореграммы разделения продуктов Г1ЦР в Я % -ном полиахриламидиом геле, полученных с праймеров РОТ 47-4Й (А). ЭТИКА (Б>. ЗТЗ 1-2 <В> и БТМ 0031 (Г). В качестве матриц для ПЦР

использовали образцы ДНК растений £ ¡у прсг^ноьАч

(2). 5. кштапит р1 472923

(3). Ж г/тчи-л» Р1 133713 (4), 5. аюит^тт 255532 (5). 5". ^тктт Р1 498012 (6), $. ЬиНчн-ахМнпт 5Ьк (7), 5. шЫ-тхит 7Я5ЛЗ-76 (8). (Соответствующие дорожки электрофореграммы указаны в скобках). Дорожка 1 • маркер молекулярной массы.

Анализ представленных на рис. 8 данных показывает, что с помощью ряда праймеров к мнкросатеялитным локусам картофеля можно получать уникальные адя каждого образца ДНК-профили. В целом, совокупный генетический профиль, полученный в результате анализа нескольких локусов, позволяет надежно различать клубненосные и неклубненосные формы Solanum.

Следующим этапом работы было исследование уровня генетического полиморфизма внутри видов Solamim. Для проведения анализа использовали два североамериканских вида: S. stolonlfertmt, Л demissum, и один южноамериканский вид S. chm nense. На рис. 9 представлены генетические профили 5-6 представителей каждого вида, полученные с пар лраймеров РОТ 81-82 н STM 0019. Как видно из представленных на рис. 9 электрофоре грамм, внутри каждого локуса все три вида Solanum имеют свои уникальные микросателлитные профили, однако, отдельные растения каждого вида обладают низким уровнем полиморфизма, что может свидетельствовать о том, что внутри того или иного локуса разные виды Solanum проявляют различный уровень генетического разнообразия. Так, например, внутри локуса РОТ 81-82 (рис. 9, А) все 6 растений S. staUmifcmm имеют идентичный микросателлнтный профиль; среди 3 растений S. demh.ium только S, Jemisxum CGN 17805 (рис, 9, А, дорожка 17) имеет отличный от остальных растений ДНК-профиль; наибольший полиморфизм проявляют растения южноамериканского вида

5. сЬасосгке, среди которых 5 из 6 анализируемых генотипов имеют уникальные ДНК-профили; неразличимы только генотипы сНасоепзе Р1 1И9219 и сЬасоете Р1 133713 (рис.9. А, дорожки 8 и 9), Внутри локуса БТМ0019 (рис,9, Б) формы 5- иокнй/егшп проявляют больший (по сравнению с локусом РОТ 81-82) полиморфизм.

-I

-Н t—

Рис. 9. Электрофореграммы разделения продуктов ПЦР ■¿.«j^ifww. в g % -нем подиакриламяд-

ном rent, полученных с Праймеров РОТ 81-82 (А) и STM00I9 (Б). В качестве MaipHK для ПЦР использовали образцы ДНК растений S, ilofonífi-rum PI 230490 (2), S. stoloHiferuin PI 255532 (J), S. sMtmi/erum CON 18348 (4), S. smfo/ii-ferum CGN 23072 (5), S. sSotomferit/» S13 (Í), 5. sloloniferwn 590 (7), S. íhíHuense PI 1Ш19 (8). S. с/ми««« PI 133713 (9), S, cAaeumve PI 472828 (10), SU'fw«ieni'e PI 472Й10 (H), chucoense CON 20ÍS3 (12), S.chmWHse 135 (12), S. ilemhtiim PI 161715 (14), К tkmasum Pi 20551A (15), S. Jumismun PI 498012 (16), S. üemissum CGN 17805(17), Jemhsum 253 (18). (Соответствующие дорожки электрофореграмыы указаны в скобках). Дорожка 1 - маркер молекулярной массы.

В результате проведенных экспериментальных исследований были отобраны 20 пар праймеров (Табл. 4), являющихся перспективными для идентификации растений рода Sotanum.

2.4.2. Исследование полиморфизма генома картофеля методом микросвтелянтного

анализа.

В данной работе для исследования полиморфизма иетранслируемых последовательностей генома картофеля были использованы сорта отечественной и зарубежной селекции. Технология анализа мнкросателлнтных последовательностей генома картофеля позволяет различать сорта по ряду мнкросателлнтных локусов, причем перечень этих локусов не универсален и варьирует в зависимости от характера н количества анализируемых генотипов. Внутри одного и того же локуса для определенной выборки

i i J J í * î « t i» il ч и m и м n i» it » ¡t a н к » » n » и

Рис. 10. Элекгрофореграммы разделения продуктов ПЦР в S % -ном полнакриламидиом геле, полученных с помощью праймеров STM 2005. В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений Скорошщдиый (2), Брянский рашшй (3), Эффект (4), Голубизна (5), Ресурс (6), Никулинский (7), Белоснежка (8), Жуковский ранний (9), Atlantic (10), Ильиискнй (И), Лугоаской (II), Удача (13), Сияецвет (14), Лукьянове кий (15), Петербургский (16), Невский (17), Kameraz (18), Смена-20 (19), Saturna (20), Desiree (21), Romano (22), Katahdin (23), Russet Burtank (24), Kennebec (25), Wauseon (26), Lady Rosetta (27), Maris Piper (28), Альтаир (29), Аксамит (30). В скобках указаны соответствующие дорожки электрофореграммы. Дорожка 1 * маркер молекулярной массы.

I J 1 4 *

1 t » MU HU M II К »It В 1» II П 13 И H

Pue, 11. Элекгрофореграммы разделения продуктов ПЦР в Î % -ном полиакриламиотом геле, полученных с помощью праймеров РОТ 47-4Я. В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений Olev (2), Агрономический (3), Aquila (4), Jubel (5), Приекульский ранний (б), Смена-20 (7), Kameraz (К), Голубизна (9), Осень (ЮХ 118-6(11), Эффект (12), Раченсшй (13), Скороплодный (14), Атюка (15), Удача (16), Брянский ранний (17), Березка (IS), Atlantic (19), Wauseon (20), Katahdin (21), Kennebec (22), Superior (23), Альтаир (24), Аксамит (25). В скобках указаны соответствующие дорожки элегтрофореграммы. Дорожка 1 - маркер молекулярной массы.

генотипов можно получить микросатедлитные профили, позволяющие различать либо всю панель исследуемых генотипов, либо часть представленных образцов растений.

Таким образом, можно говорить о том, что выбор информативного локуса для генотипироваиия образцов методом михросателлнтного анализа во многом зависит от характера и представительности выборки генотипов для проведения подобного эксперимента. На рис. 10 представлены микросателлитные профили сортов картофеля, обнаруженные для локуса STM 2005. Как видно, внутри локуса STM 2005 (рис. J0) можно наблюдать наличие 7 различных генетических профилей анализируемых сортов, среди которых 2 являются уникальными: сорт Никулинский и Kennebec (дорожки 7 и 25).

Специального внимания заслуживает задача генотипирования близкородственных сортов картофеля методом анализа микросателлитных последовательностей. В качестве примера на рис. 11 приведен анализ генетических профилей ряда близкородственных сортов по локусу РОТ47-48, Как видно из рис. 1), практически все представленные генетические профили имеют сложный и схожий набор аллелей. Среди анализируемых образцов ДНК имеются 2 пары генотипов: сорт Голубизна (Гатчинский [Л 28-6) и Осень (Granóla L128-6) (дорожки 9 н 10); сорт Скороплодный (128-6 О Anoka) и Удача (Vilnia С! Anoka) {дорожки 14 и 16), в селекции которых участвовали родительские формы, среди которых одна была общая (генотипы выделены жирным шрифтом). Как видно из электрофореграмм генотипы сортов можно различать между собой внутри каждой полусестрииской пары.

Еще более сложной, но крайне необходимой и важной задачей в селекции растений является различение и идентификация растений, полученных в результате скрещивания одних и тех же родительских форм, получивших статус сорта. В рамках данной работы был проведен анализ сортов белорусской селекции, являющихся сестринскими линиями: Аксамит (Добро II 77540-57) и Альтаир (Добро С 77540-57). Генотипы сортов Аксамит и Альтаир по ряду локусов имеют различный набор аллелей, что позволяет надежно различать два растения.

Таким образом, разработанная система генотипироваиия растений рода Solanum на основании использования 20 пар праимеров (Табл. 4), позволяет различать известные генотипы между собой (включая близкородственные сорта),

2.4.3. Мнкросателлнтный анализ ендов и разновидностей Brassica м родственных представителей семейства Brissltactie.

Семейство Brassicaceae (Капустные) насчитывает 350 родов и около 3500 видов. Экономическую ценность семейства главным образом определяет род Brassica (Капуста).

Табл. 4. Микросателлтные яокусы и соответствующие праймам дгм генопшироваши растений рода Sobmim.

St Пиши DpatMepa Поеаидоатгяъяоста правнгрм 5--н.Э' T 1 гтж. •с Дяапаюн длщ ПЦР-фрагментов, u.U. Morí в Кмтмтп ефваружснвнт ялликй

1 STUKA F-TrcGTTCCTT/VCOTBCTA В -CCCAAGATTACCACATTC 4} 10D-250 12

2 SÎS 1-2 f-tctcttgacacgîgtcactgamc F - T CA CCGAT T ACAGTAGGCAAG AGA. 3D 200-270 (uicv »

3 ТОМ F-SCATTGATTGAACT tcattctggt n-ATTTTTGTCCACACCMCTAACCG 56 [10-170 («К !

4 РОГ 474! F-facattacaftcacmtmca Я-АЯСТТАТСТСДАДСТСТСВТ 45 150-270 «

J РОГ (344 F-GGGACATCACAGTGT B-GGTOCTCCTATTGGTG 42 100-200 OgJL

i STIS-lí F-AATTCAKTTTOCGCIACGTC B-MGCACAABGATOTCAAÄATTCÄ 52 200-300 (aaek S

7 РОТ 53.54 ff-GCAAAATACAGGCTCCATAG R-ТТСТСЛАСААСТТСССЛТСС s; 150-250 4

t РОТ 17-« F-T1 GCGTGAAGCAGCCGTAAA R-GCCCAGTAAGTAAAACATTG 55 100-200 Ш 6

9 РОТ »1-й F-ATAAACCGGATCACAAGC R-ATGOGATAGATTTGTTAG 41 50-17» ШШ1, 1

10 STS-é f -cii5caacttgtta5iaccccc B-AAATCCTTTGTGACCTCCCC 55 100-200 («Mu). 4

11 STM0031 f-catäcgcjvcgcacgtacac s-ticaacctatcairrtgroactcg M ÎIWOO («V. .(ас W(tae).„(i£)y((«c¡(, î

12 S TM IMS f-stgcctcttacsaataacicgg b-cagctaacctggttgogg ss 1S0-2M CCA 3

п STM1016 F-TICTGATTTCATGCATGTTTCC r-atgcttcccatgtgatgtct SS 200-300 4

и SIM 1019 f - t agatt t t atta îtcccaacaagca R-CAACTACCTTCTCCCCACATAG и 200-2S« (яс). 4

11 SIM Ml» F-AATAGGTGTACTGACTCTCAATG Я - TT CAAG T AAAAG TCCT AGT ATG T G 4« 70-1И (MWgDJMWWícMíi). 9

1« STMJ0J7 f-ttatgïttcûgîtaaaatgta r-aaattaaatggaagacaacc 47 100-1 so (laak J

17 STMWÍ7 F-TCAITTAOTTGCTTGTTTG R-CCTTTCOATCCTAATACACC 47 100-200 fcettflL 4

II SIM 2905 F-TITAAGTTCTCAGTTCTGCAOÄJ R-GTWTÍACCTTTACCATTGCTGGG ÍJ 150-200 (ЯШ). 3

1» STM 2013 f- ttcggaattaccctctgcc r-aaaaaaagaacocscacg S3 IJ0-200 (Wa). 4

20 SIM 111» F- AAAÇCTGCTACAfATfAKC ft-cagaaataaítggartgagatg S3 70-1 SO 9

Естественный отбор в пределах рода Brassica привел к формированию большого морфологического разнообразия, на основе которого было создано многообразие выращиваемых по всему миру ценных масличных, овощных, пряных, кормовых и декоративных культур. Большинство культурных форм Brassica произошло от шести основных видов: В, napus (масличный рапс, брюква). В, rapa (восточноазиатские капусты, сурепица, репа н турнепс), В. oleráceo (кочанная, брюссельская и цветная капуста, брокколи, кольраби), В. juncea (горчица сарепгска») В. carinata (горчица эфиопская) и В. nigra (горчица черная). Филогенетические взаимосвязи между этими видами хорошо описаны моделью так называемого «U-треугольника» (U, 1935). Согласно этой модели в результате естественной гибридизации трех диплоидных видов В. rapa, В. nigra, В. olerácea, геномы которых условно обозначены как А, В, С возникли алдотетраплоидные формы В, juncea (ААВВ), В. napus (ААСС), В. carinata (ВВСС), Таким образом, род Brassica представляет собой одну из удачных систем для исследования возможности применения метода микросателдитного анализа для оценки генетического разнообразия, установления филогенетических взаимосвязей и исследования иктрогрессии генетического материала в результате межвидовой и межродовой гибридизации.

За последние годы число публично доступных праймеров к микросателлитным локусам Brassica значительно увеличилось, однако уступает другим важным культурным видам. В настоящий момент в международной базе данных Brassica MicrosaletHte Information Exchange представлено 628 лар праймеров к фланкирующим областям микросателлитных локусов В. napus, В. rapa, В. nigra и В. oleráceo. Следует отметить, что не все микросателлитные локусы эффективны для исследования межвидового н внутривидового генетического разнообразия, интрогрессии генов к филогенетических взаимосвязей. Некоторые из них являются мономорфными или выявляют незначительный полиморфизм.

В данной работе выбор праймеров для исследования полиморфизма микросателлитов растений Brassica определялся, как уже отмечалось выше, шиной амплифицируемых фрагментов ДНК и количеством выявляемых аллелей. Из 459 пар праймеров для исследования полиморфизма микросателлитных локусов Brassica первоначально были отобраны 40 пар праймеров. Эти праймеры предварительно тестировали на возможность образования ПЦР-продуктов с использованием как обоих, так и только одного (прямого или обратного) праймера, чтобы исключить из исследования инвертированные последовательности.

Следующим этапом данной работы являлось исследование возможности использования отобранных пар праймеров для анализа генетического разнообразия растений шести видов рода Brassica: В. oleráceo, £t. napus, В, rapa, В. juncea. В, nigra и В. carinóla, а

также родственник представителей семейства Tírassicaccae - Sinapis alba (горчица белая), Rapbanus satina (редька, редис). Cornelina saliva (рыжик посевной).

На рис. 12 в качестве примера представлены электрофоре граммы разделения ПЦР-фрагмеотов, полученных в результате амплификации с парами праймеров NM0-D09, Na ЛОЗ, 0112-Л04, демонстрирующие межвидовой и внутривидовой полиморфизм. По данным парам праймеров для каждого исследуемого вида выявлен определенный набор фрагментов, отличающий его от других видов. Пара праймеров Na 10-D09 (рис. 12, Л) позволяет различать все шесть видов Brassica, а также обнаруживает небольшой внутривидовой полиморфизм у видов В. nigra, В. carinóla и В olerácea. Данная пара праймеров позволяет выявить фрагменты, специфичные для геномов Л, В и С, Электрофореграмма разделения ПЦР-фрагментов, полученных с пары праймеров Nal2-A02 (рис. 12, Б) иллюстрирует яркий пример значительного внутривидового и межвидового полиморфизма, С помощью данной пары праймеров можно выявить четыре зоны фрагментов с различной злектрофорегической подвижностью, специфичные для генома А; четыре зоны, специфичные для генома В, и две зоны, специфичные для С-генома. Внутривидовой полиморфизм, выявленный в результате амплификации праймеров 0112-А04 (рис. 12, В) у видов В, napas, B.ra/ra, B.juncca и В. oleráceo, обусловлен полиморфизмом длин А- и С-геном-специфичных фрагментов.

В ходе данного исследования выяснилось, что полиморфизм диин мнкросателлитиого локуса не всегда позволяет различать виды и отдельные формы Brassica, поскольку выявляемые по некоторым парам праймеров аллели не являются видо- или геном-спецнфнчными и присутствуют у всех или нескольких видов Brassica. При анализе с некоторыми парами праймеров, ПЦР-фрагменты детектировались не во всех образцах. В этих случаях наличие/отсутствие продукта определялось видовой принадлежностью.

По результатам проведенного микросателлитного анализа растений рода Brassica было отобрано 13 пар праймеров (Табл.5), позволяющих выявлять межвидовой и внутривидовой полиморфизм. Данные пары праймеров позволяют выявлять фрагменты, специфичные для простых геномов А, В и С, которые кодоминантно сочетаются в тетраплондных формах, а также фрагменты, общие для всех или нескольких видов треугольника U, Каждая пара праймеров позволяет выявлять в сумме от 4 до 19 аллелей у видов рода Brassica. Диапазон длин получаемых фрагментов составляет от НО до 320 п.н.

Существенным моментом в изучении интрогрессни генетического материала в результате межвидовых скрещиваний является универсальность (transferability) -консервативность праймеров для всех или нескольких видов Brassica, образующих треугольник U. Среди выбранных 18 пар праймеров 15 оказались универсальными, т.е. позволяли различать все шесть видов Brassica, одна пара (BRMS-043) • специфичной для

ААСС АА ААВВ BR ВВСС СС

В. napas Д. rapa В, ¡uncía В. тцга В. carinara Я, ttíeruíeu

. I ¡') 4 5*7 ¿"о 10 II И 13 и7Г1б 17 1« 1<1 ti 21 12 13 24 ИЦ 17 2вИДв 31~1?33 34 3$ ЗЬ 373 «39 д i — л

Al" Cl"

.В

-с

100 я, н. 150 п. и.

и_М

200 л. н.

._АЗ

ГЦС2

150 п. н.

С1_

С1_с

А_

—_V3-

Шин. :_В

100 в. п.

Рис; 12, Межвидовой и вку1рш1ндовой полиморфизм растений рода Brassica. Пары праймеров А • NÍ10-D09, Б • Nat2-A02, В - 0112-А04.1,39 - маркер молекулярной массы. 2 - Sinapís alba 4232, В. парш: 3 - Bnal-02,4 - SnaVikros, 5 - BnaKbatma, ti - BtiaUral, 7 - Bna 10-02,8 -Bnal44J2, B, rapa: 9 - Btl 14, Ю-Вг107, И -Вг350, 12-Br548557, 13-Bi6832, 14 - Bi6S18. В, júncea: 15 - Bj4588, 16 - BJ4594, 17- Bj6ól5, 18 - Bj7l54,19 - Bjl3191.20 - Bj 15193, B. «fgra.-2l-Bnj6618,22-Bni6619,23-Bn¡6fi20,24-Bm6628,25-Bni6634,26-Bni6635, i. carinetó.- 27-Bc3946,28-Be3950,29-Bc3952,30-Bc3976,31 - Bc4025,32 - Bc4035, B. olerácea: в/в botrytís: 33 - Bob699, nte coslata: 34 - Boc2218, п/в gemmifera: 35 - Bog6998, п/в eapüata: 36 - В ocal92,37 - Boca2432, 38 - Boca7022. Фрагменты, специфичные для геномов А, В и С, обозначены разными стрелками.

Табл. 5. Мииросагюипгтые локусы я соответствующие дравмсры для генотипирокшия видов и разновидностей Вгамка.

л Иапши вр>1м«|м Пжл^штепынктл рраВмсрой Тог»» •с Диапик ялша 1ЩР-фр»ПКЛТЙ«| п. в. Мота* [>ном-(оешфнчм^ Колячмтв» офняружнаьн яллелей

1 N¡10-1)09 г-аасаасстсаасатсстстсс »-лссАссдссетдстлслосб 49 150-17» (оа АВС «

2 Г-А13ССТТСТТ(ЗСТТТТСААСО к-астсаатссатсатстсагс 53 (СГ), АЙС 16

з Nil2.F12 Р-ССТТСТСАССТССйАТААЕС й-тссеятстасаатсаосвес и 170-190 <ССО). ЛВС 8

4 №«02 Г-С5СТ0СААТТАТАССААА6С »-ССТСАТОСТСТССАААСАСС 49 10-110 (СОС\ АВС 14

I №2-С12 г-асаистт(катстт6аттсе л-ааасжтсаастссттссттсо 49 112-150 ЮА). АС 6

« N¡3^02 »-ТССААСЩАААААОйАТСАСС В-ТОСТААГГйАОСМТАСТМТТСС 4* 165-190 (С1\ ВС 1

7 №К»4В Г-атастссь катаете? кб Р-СДТС;т{ксаатсстасаггтас 70-140 (АО), ЛВС 15

1 ОП2-Ай4 р-ти;с;таастаастстоисес И-АОАеТТСООАТАСТСТООА«: м !!0-Ш (СГ>, ЛВС 1

9 1Ы-Е12 г-ТСТСАбТСТОТССАСТТСйС Л-ААбАСЛЛЛСССАДТАААСТАСЛАО: я 125-165 (ОА). ЛВС

10 ВВМЯЮб Ж-тобтсссисдеаттасттс Н*АСТТОАА(ЗССТААТ<ЗАААА<; и 140-175 (ОА*. лвс 5

П Р-ЙСТССАТТССТТТТТеСАТСТС »-САТСОСАДеаИТААСАААСАТ 55 125-165 (слиалк А 7

12 ВЯММ42 Р-СОАТС АСТТАГСХССАС САСАА в-ТСЕетЛТТ<ЮДТААаААТТСАД 48 <1-136 (ллтысщгыах АВС 8

13 ВНМ$-042-2 г-асстсссоасазсаасааааоа в-ттсесттссттгтстаяаато 35 205-235 (слисп, А !

14 г-оссатйттттттсттсабтстс в-ггаатссстасссасаатттсс *ь 280-320 штиоп, Л 4

ВЯМЗ-046 Г-ттеессттбстаттассасспз К-АТОСОСАААСССТААТТТТСАС 41 125-270 (САЫСАиОА). АВС 19

16 вям^о Г-ААСГТТйСТТССАСТбАТТТТТ Й- ТТ&СТ Т ДАССС? АААТ СС АТ АТ 41 162-171 (ААтутсыиа ЛВ 9

17 ВМ6А2 Г-СТТгетвТКАСТТТТАбААСТТТА »-СбСАОСТТТТОССССАССТС 5) №11 (ОАга АВС 6

К ВМ13В1 Г-йССТТТСТТСАСААС1йАТАОС1АА в-гсисстесстссгтсаеттс И 170-230 (САиААС), АВС 10

генома А, две (BRMS-006 и NÍ2-F02) - для геномов А и С, Двенадцать универсальных, пар праймеров одновременно выявляют фрагменты, специфичные для геномов А, В и С, у исследуемого спектра видов, что позволяет проследить распределение генетического материала у видов Brassica. Исследованные пары праймеров выявляют внутривидовой полиморфизм у большинства видов, образующих треугольник U. Три универсальные пары праймеров (Nal2-А02, NÍ2-F02 и BRMS-046) обнаруживают полиморфизм у всех шести видов Brassica, Для некоторых праймеров универсальность распространяется за пределы рода, что позволяет провести сравнительный анализ н оценить генетические расстояния между формами рода Brassica и такими отдаленными формами, как Sinapis, Raphamts и Camelina.

В данной работе в качестве моделей для исследования интрогрессии генетического материала также были использованы межродовой гибрид капусты (в. oleráceo) и редьки {R. sativas) - Raphanobrassica (RRCC) и межвидовой гибрид 3, Vcomposila (ААВВСС) (Монахос Г.Ф, и др., 2001), полученный в результате гибридизации В. carimiia (ВВСС) и В. ra¡xt (АА). В геноме аллогексаплоида В. Z Komposita по отобранным парам праймеров были выявлены фрагменты, специфичные для геномов А, В и С. В геноме аллотетраплонда Raphanobntsstca с помощью большинства исследованных пар праймеров были выявлены фрагменты, специфичные для генома С (В. oleráceo). Большинство отобранных праймеров оказались универсальными для рода Raphanus, что позволило идентифицировать в геноме Raphanobrassica характерные для этого рода фрагменты.

Таким образом, разработанная система генотипирования на основании использования I8 пар праймеров (Табл. 5) позволяет надежно различать подвиды и разновидности растений рода Brassica, а также позволяет исследовать генетическое разнообразие представителей семейства Brassicaeeae и устанавливать филогенетические взаимосвязи на родовом, видовом к внутривидовом уровне.

2,4.4. Практическое применение метода мы крася галл нтного анализа в селекции.

2.4.4,1. Различение близкородственны» сортов рапса (Я. парии).

Важное значение для селекции представляет различение близко родственных сортов растений. ВНИПТИ рапса (г. Липецк) были предоставлены образцы 12 высокопродуктивных сортов ярового рапса (В. napns), обладающих сходными морфологическими характеристиками, но различающихся по таким признакам как урожайность, содержание масла, эруковой кислоты и глюкозинолятов, устойчивость к фузариозу, полеганию и осыпанию. Поскольку проявление количественных признаков определяется сложным взаимодействием многих генов и в значительной степени зависит от условий выращивания

растений, различение и идентификация сортов по фенотипу представляются ненадежными, В связи с этим важное методологическое и практическое значение представляет исследование возможности применения технологии микросателлитного для различения близкородственных сортов на генетическом уровне,

I ! .11 * 4 7 ■ 9 |й И II 13 М и

Л мо п. н.

111 н.

_ lS0n.it.

_ 100 я, и.

-4 п. П.

Рис. 13. Эяеггрофореграммы разделения ■ 8 "о-вом полизкрилам идиом геле ПЦР-фрагментов, полученных в результате амплификации с ларами праймеров N312-А02 (А), О! 12-А04 (Б), №М8-0ЭА (В), ВЯМ8-043 (Г), ЫаЮ-ООФ (Д>. N¡2-Р02 (Е). В качестве матриц для ГЩР использовали образцы ДНК сортов рапса (11. >\<>ри'.\. Аргумент (2), Визит (31. Лира (4). Мадригал (5), Ратник (6), Ритм (Т), Рубеж (8), Форум (9\Фрегат (10), Эввин (II), Топаз (12), №1 (13). Ханна (М). В скобках указаны соответствующие дорожки электрофоре граммы. Дорожки I и 15 - маркер молекулярной массы.

Е —

В результате микросателлитного анализа по шести ларам праймеров были получены индивидуальные генетические профили (рис. 13). позволяющие надежно различать сорта рапса. в том числе близкородственные: Аргумент (Зг-150-871 Глобаль), Рубеж (Й. пи/имг: В. гщкг. Глобаль! "\VW1727), Визит (Глобаль! Монета) и Ратник [П (Глобаль! БЫ 50-87)1 Р1(5М10-87[ Глобаль)], в селекции которых в качестве одной из родительских форм использовали сорт Глобаль, Полученные генетические профили в перспективе могут быть использованы для идентификации, генетической паспортизации и сертификации сортов.

■I (Яв.».

2.4.4,1, Оценка эффектней ости передачи генетического материала при межвидовой гибридизации картофеля. В настоящее время одним из основных методов селекции картофеля является межвидовая гибридизация, в частности, гибридизация с дикими видами картофеля. Однако

передача полезных признаков от диких видов путем их непосредственного скрещивания с S. tuberusum осложняется по ряду причин, одной из которых является филогенетическая отдаленность видов. В целях преодоления межвидовой несовместимости, вызывающей отклонения от нормального процесса формирования гибридных семян, прибегают к использованию метода сомакпональной гибридизации. Для оценки эффективности передачи генетического материала при межвидовой гибридизации было проведено исследование растительного материала, любезно предоставленного Г.Л.Яковлевой (Институт картофелеводства НАН, Беларусь), представляющего собой соматические гибриды и их семенное поколение, подученные при скрещивании S. balboeastamtm и S. шЬеготт. Для установления природы иктрогрессируемых фрагментов ДНК от родительских форм в гибриды в работе использовали образцы ДНК растений £ butbocasianum, S. tuberosum (сорт Ласунак) и гибрида L 4-11 (рис. 14).

Для экспериментального подтверждения факта интрогрессии генетического материала соответствующие аллели родительских форм и гибрида L 4-11 размером 96, 104 и 114 п.н. (рис. 14, А), а также аллели размером 154 и 166 п.н. (рис, 14, Б) были клонированы и секвенированы.

» j i <

Рис. 14. Электрофореграммы разделения продуктов ПЦР в 8 % -ном полиакрнламкдкоы теле, полученных с праймеров STM 1105 (А) и STM 2005 (В). В качестве матриц дня ПЦР использовали образцы ДНК растений S. ЬШЫюшитшп (Sbk; дорожка 21, L 4-11 (Sbk С Ласунак; дорожка 3J, 5, itiburusum (сорт Ласунак; дорожка 4). (Соответствующие родительские пары и/или дорожки электрофоре грамм ы указаны в скобках). Дорожка 1 • маркер молекулярной массы. 96, 104, 114, 154, IAÓ - размер аллелей соответствующего локуса, п.н.

Проведенный анализ первичных структур аллелей локуса БТМ 1105 (рис. 15) позволяет говорить о полиморфизме микросателлитных последовательностей, основанном не только на различии в количестве тандемных повторов, но и на вариабельности областей, прилегающих к микросателлнтным повторам. Анализ первичных структур микросателлитных повторов локуса БТМ 2005 позволяет объяснять полиморфизм длин аллелей только лишь различием в количестве повторяющихся гексануклеотидных единиц (СТОТТО (рис. 16).

. 114 KAACCTOCTBCKAATJUlGOCACKiCACCTCCTC ATTCTTACACTCACTC АСТСАСТС АСТСАС ТС : 64

М-П.Ш *mCCTaCtA(a*BTim06CAGGCACCTeCTeATTCГТАСАСТСАСТСЛСГСАСТСАСTCACTC : «4

L4-11.104 AAACCTCCIACAAATAAGGCAGGCACCTCCrCATTCT--с--------АСТСАСТСАСТСАСТС 1 54

Ii». 104 AAACCTGCTUCAAAtAAGGCACGCACCТССТСАТТСТ--С--------АСТСАСТСАСТСАСТС ! 54

Sbk,Si AAACCTGCTACAAATXAG^C----АССТССТ^АТТСТ - - САС- - АСТС---------------- : 4tJ

L4-U.96 AAACCTGCTACAAATAAGOC----ACCTCCTCATfCT--САС--АСТС---------------- t 40

Las.114 ACACAGCTCftAC-------ААСТааТААСТТТТЛСТСЛТСТССТССКВГТАСТГСТв : 114

L4-U.1U ACACAGCTCAA.C-------ААОТОЗТААСТТТТАГТСАТСТССТССААТТЬТТТСТЕ ; U4

L4-11.104 ACACAGCTCAAL-------AAGTGGTAACTTTTAC7CATCTCCTCCAATT*TTTCTQ : 104

La* .104 ACACAGCTCAAC-------AAGTGGTAACTTTTACTCMCTCCTCCAXTTXTTTCTG : 104

Sbk.96 ACACAaCTCAACACTCAACAAGTGSTAACTTTTAC-CATCTOTTCCAATtilTTCTO : 96

L4-11.96 ACACAGCTCAALfiCTGAACAAGTGSTAACTTT TAC-САТСТССТССАЛТТ АГГТСТв ; 96

Рис. 15, Первичная структура аляелей яокуса STM 1105 интрогресснруемых из родительских форм $ Ьи1Ь<н:ахГ<1пит (Sbk) н Ь tul'cntM'in (сорт Ласунак, l.as) в соматический гибрид Sbk ! -Ласунак (L4-II). 96, 104, 114 - размер соотеетстиующего аллели, п и. Повторяющийся мотив (ЛСТСК, подчеркнут. Последовательности прайм еров отмечены жирным шрифтом.

Li*. 166 TTTAAGTTCTCAIJTTCTCCAOGOAAGTACTTCATATAACATATATTТСTGTSTAAACGACGAAATA : «6 L4-U.166 TTTAACTTCTCACTTCTGCAG<3QAAGTACTTCATATAACATATATTTCTGT'jTAAACGACGAAATA : 6 6 Sbk.lS4 TTTAAGTTCTCAGTTCTGCAGMAAGTACTTCATATAACTTATATTTCT^TGTAGACGACGAAATA: 66 L4-11.1S« TTTAAGTTCTavGTTCTSCAGOGAAGTACTTCATATAACTTATATTTCTGTGTACACGACGAAATA: 66

101

L»». 166 AACAATGtTGCTGTTGCTGTTGCTGGTGCTGTTGCTGGTGCTGCTAAGAGGGGACTATCGTGCCAA : 132

L4-11,166 AACAATCCTGCTSTTGCTGTTCCTyiTljCTGTTaCT^^T^CTSCTftAGAOmMACT^TCCTGCCAA: 132

Sbk,154 AACAATGCTGCTGTTGCTGTTGCTGGTG------------TTSCTAAGAGGGGACTATCGTGCCAA : 120

L4-11.1S4 AACAATGCTGCTCTTqCTGTTGCTOGTC------------TTGCTAAGAGCCGACTATCGTGCCAA : 120

L»«,M6 TCTA.OTGAACCCAGCAATOCTAJLlGCTTATaAC: 166

L4-11.1M ТСТАССССААСССХОСЫЯОПТЫШввТТИ^АСИбб

Sbk .154 TGTAGCCGAACCCAGCAATGGTAAAÜGTTJITGAC : 154 1.4-11.154 TGTAGCCGMCCCAGCAATCGTAAAGCTTATGAC .'151

Рис. 16. Первичная структура аллелей локуса STM 2005 ннтрогрессируемих из родительских форм £ btiJbocaxlanum (Sbk) н £ Uiberosum (сорт Ласунак. Las) в соматический гибрид Sbk J Ласунак (L4-11). 154, 166 - размер соответствующего аллеля, п.н. Повторяющийся мотив (CTGTTG\, подчеркнут. Последовательности праймеров и иуклеотнды в позициях 40, 107 отмечены жирным шрифтом.

Интересно отметить, что в этих двух микросаггеллитных лохусах обе родительские формы имеют уникальные первичные структуры: нуклеогидные последовательности AGCC...TA...T (5, tuberosum) и АСТСАЛС (5. ШЬосаыатт), образующие соответствующие инсериии/делецин в первичных структурах аллелей (рис. 15), или точечные нуклеотидные замены в позициях 40 и 107 (рис. 16). которые отчетливо наследуются гибридом L 4-11.

Таким образом, применение технологии микросателлнтного анализа позволяет эффективно осуществлять контроль и (Прогрессии генетического материала от родительских форм в гибриды.

выводы

1. Разработана общая технология детекции мутаций в геномной ДНК на основе аляель-специфической полимеразной цепной реакции (АС-ПЦР) с последующим анализом продуктов реакции с помощью автоматического анализатора ДНК на основе электрофореза высокого разрешения.

2. Разработана общая методология конструирования аллель-специфических праймеров для выявления мутаций в любых интересующих генах путем анализа продуктов АС-ПЦР на автоматическом анализаторе ДНК.

3. Разработаны тест-системы для выявления нуклеотидных замен в генах метнлентетрагидрофолатредуктазы (677С—»T), факторов II (2Q210G—*А) и V (169IG—«А) свертываемости крови, для анализа полиморфизмов М235Т, Т174М, G(-6)A в гене ангиотензиногена человека, а также нуклеотидных замен в генах al-коллагена типа I (2046G—fT), рецептора витамина D3 (45082G—эстрогенового рецептора а (93ST-+C и 984А—»G).

4. Созданы наборы реагентов АСП-МТГФР, АСП-ПР и АСП-Ф5Л для детекции мутаций в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—факторов II (202I0G—*А) и V (I691G—►А) свертываемости крови, соответственно. Завершены медицинские испытания наборов, инструкции по применению наборов утверждены Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

5. Разработаны основные принципы стандартизации технологии молекулярно-геиетн ческой идентификации личности, основанной на анализе количества тандемных повторов в микросЕГтеллитиых локусах геномной ДНК человека. На основании разработанных в данной работе технологических подходов созданы наборы реагентов для идентификации личности CTWA и FFTL. Наборы зарегистрированы Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации и внесены в государственный реестр изделий медицинского назначения и медицинской техники.

6. Разработана универсальная технология генотипирования растений рода Solanum на основе анализа 20 микросателлитных докусов. С помощью этой технологии проведено межвидовое и внутривидовое различение растений рода Solanum, а также ДНК-тнпированне 44 сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции. На примере сорта Голубизна проведено подтверждение сортовой подлинности экспертных образцов картофеля, полученных нз различных опытно-производственных хозяйств.

7. Разработана универсальная технология генотипирования культурных и дикорастущих растений рода Brassica на основе анализа 18 микросателлитных локусов. Показано, что разработанная технология позволяет различать и идентифицировать растения рода

Brassica, составляющие треугольник U, а также представителей других родов семейства Brassicaceae (Sinapis. Raphamts. Cametina) на родовом, видовом и внутривидовом уровне.

8. Показано, что разработанные технологии генотип и рования растений позволяют осуществлять контроль интрогресснн генетического материала родительских форм в гибриды/сорта при межродовых, межвидовых и внутривидовых скрещиваниях. На основе экспериментального анализа первичных структур ряда микросателлитных локусов показана возможность контроля интрогрессии генетического материала дикого вида £ bnlbocasianum и сорта Ласунак в гибрид L 4-11, а также интрогрессии генетического материала сортов Osaka Market и Sensudzi Kin Mizuna вида В. гара в их реципрокные гибриды.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Demchinskaya AV, Shilov 1A, Karyagina AS, Luntn VO, Sergienko OV, Voronina OL, Leiscr M, Plobner L. A new approach for point mutation detection based on a ligase chain reaction. // J. Biochem. Biophys. Methods. 2001, V. 50. No. 1. P, 79-89.

2.Ванюшева O.B., Шилов И.А., Карягина A.C.. Файзуллин Л.З.. Сухих Г.Т., Швец В.И. Разработка технологии идентификации аллелей однонуклеотидных полиморфных маркеров на основе аялель-спецнфической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК. // Биотехнология, 2005. № 4, С, 20-28.

3.Шилов И.А., Карягина А.С„ Сумерин В.В., Михайлов ДА., Шилов О.А, Многоканальный капиллярный генетический анализатор. И Патент Российской Федерации № 2145078 от 27 января 2000 г.

4.Badoeva F.S., Ahmedova Е.М., Zjdanov A.V.. Demchinskaya A.V., Shilov I.A.. Karyagina A.S., Murashko L.E., Sukhikh G.T, Higher rate of the thrombophylic mutations in women with complicated pregnancy.// Am. J, Reprod, Immunol. 2001. No. I. P. 46.

5.Vanyusheva O.V., Shilov I.A., Karyagina A.S. Elaboration and usage of AS-PCR method for detection the Spl polymorphysm in collagen type I al gene, BsmI polymorphism in vitamin D receptor gene, and Xbal and 1 polymorphisms in estrogen receptor« gene in women with postmenopausal osteoporosis.// Eur. J, Hum. Genet. V, 12, Suppl. I. 2004. P. 270.

6.Vanyusheva O.V., Shilov 1.А., Karyagina A.S. Elaboration and usage of point mutation detection technology based on AS-PCR using automated DNA analyzer, // Eur. J. Hum, Genet, V, 13, Suppl. 1,2005, P. 360.

7.Бирюкова B.A., Зайцев B.C., Хавкин Э.Е., Хромова JI.M., Шилов И.А. ДНК-маркеры в селекции картофеля. //Достижения науки и техники АПК, 2003, № 10, С. 38-41.

8. Бирюкова В.А., Велишаева Н.С., Зайцев B.C., Хавкин Э.Е., Хромова Л.М., Шилов И.А.

ДНК-дактилоскопия картофеля и его дикорастущих сородичей, // Вопросы картофелеводства. Материалы «Школы молодых ученых», г. Москва. 2004, С. 114-123.

9.Анискина Ю.В., Бирюкова В.А., Велишаева Н.С.. Панкин А.А., Прибылова Т.А., Хавкин Э.Е., Шилов И.А. ДНК-генотипирование растений родов Braxaica и Solaniim. Н Сельскохозяйственная биология, 2005, № I.C. 110-119.

10. Анискина Ю.В., Велишаева Н.С., Шилов И.А., Хавкин Э.Е. Генотнпирование пасленовых и крестоцветных растений методом микросателлитиого анализа. // Методические рекомендации. ВНИИСБ, г. Москва. 2005. 21 С.

11. Велишаева Н.С., Шилов И.А., Хавкин Э.Е. Использование технологии микросателлитиого анализа для различения сортов картофеля и его дикорастущих

сородичей, // Вопросы картофелеводства. Актуальные проблемы науки и техники, г. Москва, 2006, С. 228-235.

12. Аннскина Ю.В., Панкин A.A., Хавкин Э.Е., Шилов И.А. ДНК-маркер хромосомы III генома В Brassica. //Доклады РАСХН, 2006, №4, С. 15-16.

13. Велишаева Н.С., Шилов И.А., Хавкин Э.Е. Генотип и ровааие картофеля и его дикорастущих сородичей методом анализа полиморфизма микросателлитов. // Доклады РАСХН, 2006, Кг 5, С. 3-5.

14. Журавлева Ю.Н., Луговцев В.Ю., Воронина О.Л., Шилов И.А., Ванюшева О.В., Лунин

B.Г., Наумова М.А., Мамаева Т.А., Тихонова Н.Т. Генетический анализ диких штаммов вируса кори, изолированных в Европейской части РФ. // Вопросы вирусологии, 2003, Т. 48, №4, С. 29-35.

15. Дмитренко OA., Шагишш И А., Прохоров В.Я., Матвеев С.М., Аляпкина Ю.С., Ванюшева О.В., Шилов И.А , Лунин В.Г., Гннцбург АЛ. Исследование полиморфизма коагулазного гена методом секвенирования у метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus atireiu, выделенных в стационарах различных регионов России и Беларуси. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2005, № 3, С. 27-32.

16. Бирюкова ВА, Зайцев B.C., Панкин A.A., Хавкин Э.Е., Шипов И.А. Геиотипирование растений рода Solanum с помощью рассеянных повторяющихся последовательностей и микросателлитов. // Материалы II Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», г. Москва, 10-14 ноября 2003 г., Т. 1,С. 185.

17. Аннскина Ю.В., Бирюкова В.А., Велишаева Н.С., Мартынов В.В., Панкин A.A.. Прибылова Т.А., Хавкин Э.Е., Шилов И.А. ДНК геиотипирование растений Brassica и Solanum. II Сб. трудов 111 Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии«, г. Москва, 19 октября 2004 г., С. 119120,

18. Велишаева Н.С., Бирюкова В.А., Шилов И.А., Хавкин Э.Е. Использование технологии микросагелдктного анализа для генотииирования картофеля и его дикорастущих сородичей. // Материалы научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», г. Казань, 17-18 июня 2004 г. С. 8-9.

19. Shilov t.A, Genolyping of Solanaceen and Brassicaceae using microsatellite polymorphism. // Materials of Bulgarian-Russian Seminar "The application of molecular diagnostic in breeding, variety testing and analysis of transgenic plants", Vama, Bulgaria, July 3-7, 2004, P. 25,

20. Шилов И.А., Велишаева H.С., Аннскина Ю.В. Генотипирование пасленовых и крестоцветных на основе полиморфизма микросателлитов. // Материалы Российско-Болгарского симпозиума "Актуальные проблемы сельскохозяйственной биотехнологии", г, Москва, 16 декабря 2005 г., С. 26-27.

21. Аннскина Ю.В., Мартынов В.В., Панкин A.A., Хавкин Э.Е., Шилов ИА. Три метода ДНК генотипирования культурных форм Brassica. И Материалы III Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», г. Москва. 14-18 марта 2005 г.. Т. 1,С. 221.

22. Бекетова М.П., Бирюкова В.А., Велишаева Н.С., Дробязина П.Е., Зайцев B.C., Хавкин Э.Е., Шилов И.А., Яковлева ГА. ДНК маркеры интрогрессни устойчивости к фитофторозу картофеля. // Материалы 111 Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», г. Москва. 14-18 марта 2005 г., Т. 1,

C, 227.

23. Аннскина Ю.В., Шилов И.А., Хавкин Э.Е. Использование метода анализа полиморфизма микросателлитов для оценки генетического разнообразия форм Brassica. И Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье», г, Суздаль, 19-22 мая 2005 г., С 319-321.

24. Faisulin L.S., Badocva F.S., Ahmedova E.M., Zjdanov A.V.. Demchinskaya A.V„ Shilov 1.Л., Karyagina A.S., Murashko LE., Sukhikh G.T. Higher rate of die thrombophylic mutations in women with complicated pregnancy. // VIII International Congress of Reproductive Immunology, Opatija, Croatia, July 2-6,2001. Program and Abstracts. P. 97.

25. Сухих Г.Т., Мурашко Л.Е., Файзуллин Л.З.. Бадоева Ф.С„ Ахмедова Е.М., Мурашко А.В., Демчннская А.В.. Шилов И.А., Карягина А.С. Тромбофилнческне мутации и гипергомоцистеинемня у женщин с гестозом, // Материалы Ш Российского форума «Мать и дитя», г. Москва, 22-26 октября 2001 г., С. 212-213.

2fi. Mourachko L.E., Faisulin L.S., Ahmedova Е,М„ Mourachko A.V„ Badoeva F,S„ Sukhih G.T., Vanjusheva O.V., Cvctkova T.N., Demchinskaya A.V., Karyagina A.S., Shilov 1Л. C677T MTIIFR mutation influence on homocysteine serum level and haemostasis tn patients with physiological and gestosis pregnancy. // J. Hungarian Family - friendly Society and Society of Pathophysiology of Pregnancy. 2002. Special cd, P. 33.

27. Mourachko A.V., Faisulin L.S., Ahmedova E.M., Shilov 1.Л.. Karyagina A.S., Vanjusheva O.V. Methyltctrahydrofolate reductase C677T mutation rate in pregnant with varicose veins. // J. Hungarian Family - friendly Society and Society of Pathophysiology of Pregnancy, 2002. Special ed. P. 34.

28. Мураш ко A.B.. Файзуллин Л.З., Сухих Г.Т., Ванюшева О.В., Демчннская А.В., Карягина

A.С., Шилов И.А. Частота мутации С677Т метилентеграгилрофолатредуктазы у беременных, страдающих варикозным расширением вен, // Материалы IV Российского форума «Мать и дитя», г. Москва, 21 -25 октября 2002 г., Т. 1, С, 416.

29. Сухих Г.Т., Файзуллин Л.З., Ахмедова Е.М., Бадоева Ф.С„ Казарян Л.М„ Мурашко Л.Е., Ванюшева О.В., Цветкова Т.Н., Демчннская А.В., Карягина А.С., Шилов И.А. Роль мутаций в генах, контролирующих различные функции системы кровообращения, в развитии гестоза. // Материалы IV Российского форума «Мать и дитя», г. Москва. 21-25 октября 2002 г., Т, 1, С. 589-590.

30. Сухих Г.Т., Файзуллин Л.З.. Ахмедова Е.М., Бадоева Ф.С., Мурашко Л.Е., Ванюшева О.В., Цветкова Т.Н., Карягина Л.С.. Шилов И.А. Генетический полиморфизм метялентетрагидрофолатредуктазы и уровни сывороточного гомоцистенна и эритроцитарных витаминов группы В у женщин с нормальным течением беременности и гестозом. // Материалы IV Российского форума «Мать и дитя», г. Москва. 21-25 октября 2002 г., Т. 1, С. 591-594.

31. Мурашко Л.Е., Ахмедова Е.М., Бадоева Ф.С., Сухих Г.Т., Файзуллин Л.З., Ванюшева О.В., Карягина А.С„ Шилов ИЛ. Тромбофил ические мутации и гипергомоцистеинемня у женщин с гестозом, // Проблемы беременности, 2002, Jft 6, С. 44-48.

32. Шилов ИЛ., Карягина А.С., Ванюшева О.В., Цветкова Т.П., Файзуллин Л.З., Ахмедова Е.М., Бадоева Ф.С., Мурашко Л.Е., Сухих Г.Т. Исследование генетического полиморфизма метилентетрагидрофолатредуктазы у женщин с нормальным течением беременности и гестозом. // Сб. трудов научно-практического симпозиума 'Технология генодиагностики в практическом здравоохранении", г. Москва, 20-21 июня 2002 г., С. 3758.

33. Шилов И.А., Карягина А.С., Лунин В.Г. Новые технологии генодиагностики с применением автоматических анализаторов ДНК. //Сб. трудов IV Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний", г. Москва, 22-24 октября 2002 г., С. 188-190.

34. Журавлева Ю.Н., Луговцев В.Ю., Воронина О.Л., Шилов И.А., Ванюшева О.В., Лунин

B.Г., Наумова М.А.. Мамаева Т.А.. Тихонова Н.Т. Идентификация генома вируса кори методом полимеразной цепной реакции. // Сб. трудов IV Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний", г. Москва, 22-24 октября 2002 г.. С, 210-211.

35. Сухих Г.Т., Мурашко Л.Е., Менжинская И.В.. Файзуллин Л.З., Ахмедова Е.М., Бадоева

Ф.С., Очан Т.Б., Ванюшева O B., Цветкова Т.Н., Карягина A.C., Шилов H.A. Взаимосвязь между антифосфолипндными антителами, гипергомоцисгеннемией и мутацией С677Т в гене З.Ш-метилентетрагмдрофолатредуктазы при беременности, осложненной гестозом. // Материалы V Российского форума «Мать и дитя», г. Москва, 6-10 октября 2003 г., С. 227228.

36. Сухих Г.Т., Мурашко Л.Е., Ахмедова Е.М., Еадоева Ф.С., Файзуллин Л.З., Ванюшева О.В., Цветкова Т.Н., Карягина A.C., Шилов И.А. Влияние мутации С677Т в гене фермента 5,10-мети лентетраги дрофол атредуктазы на риск развития тяжелых форм гесгоза. // Материалы V Российского форума «Мать и дитя», г. Москва, 6-10 октября 2003 г., С. 228-229.

37. Кулаков В.И., Мурашко A.B., Файзуллин Л.З., Шилов H.A.. Цветкова Т.Н., Карягина

A.C., Разумихин М.В., Ванюшева О.В. Генетическая предрасположенность к варикозной болезни у беременных: возможное подтверждение? // Проблемы беременности, 2003, № 7, С. 31-35.

38. Дмитренко O.A., Шагинян НА., Ванюшева О.В., Шилов И.А., Прохоров В.Я., Лунин

B.Г., Гинцбург A.J1. Генотипирование метициллинрезисгентных штаммов Staphyiococcits aureus методами исследования полиморфизма коагулазного гена и типа тес ДНК. И Сб. трудов V Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний", г. Москва, 19-21 октября 2004 г., Т. 2, С. 20-23.

39. Коваленко Т.Ф., Патрушев Л.И., Ванюшева О.В., Шилов H.A., Сосин Д.В., Суховерхова A.C., Козлова Т.В., Бокарев И.Н., Сорокина A.B., Озолиня Л .А. Исследование промоторов генов KiTHFR при гипергомоцнетеинемни и РТЕМ при злокачественных и доброкачественных опухолях эндометрия и яичников. // Биоорганическая химия, 2006, Т. 32, №4, С. 373-381.

40. Ванюшева О.В., Шилов И.А., Карягина A.C. Технология детекции точечных нуклеотндных замен на основе аллель-специфической ПЦР с применением капиллярного электрофореза // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье», г. Суздаль, 19-22 мая 2005 г., С. 331-332.

41. Шилов H.A., Карягина A.C. Иванов П.Л. О возможных неблагоприятных последствиях использования in-house компонентов для судебно-экспертных модскулярно-гснетических технологий, // Судебно-медицинская экспертиза, 2005, №4, С, 20-23,

42. Иванов ПЛ., Шилов H.A., Карягина A.C. К вопросу о регламентировании в Российской Федерации разработки и производства компонентов для молекулярно-генетических технологий. // Материалы VI Всероссийского съезда судебных медиков «Перспективы развития и совершенствования судебно-медицинской науки и практики», г. Тюмень, 7-8 сентября 2005 г., С. 114-116.

43. Иванов ПЛ., Шилов ИЛ., Карягина A.C. О необходимости регулирования в Российской Федерации производства компонентов для судебно-медицинских молекулярно-генетических технологий и совершенствования нормативно-правовой базы судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертиз. Н Судебно-медицинская экспертиза, 2006, №3, С. 21-24.

Информация о работе

Шилов, Илья Александрович
доктора биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.23

Автореферат

Похожие работы