Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Использование ДНК-технологий для оценки и изменения генома сельскохозяйственных животных

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, доктора биологических наук, Калашникова, Любовь Александровна, Лесные Поляны, Московской обл.



;. ¡ вшш^щуш ш&ж i G »

7, piTriri^ttî ; :

f — Г . Г T" ^ ^

.• yit-ixyiU С. üil w£ib i V^'A a „

; у;травло:и: UAÍ< Po ;

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПЛЕМЕННОГО ДЕЛА (ВНИИплем)

На правах рукописи

КАЛАШНИКОВА ЛЮБОВЬ АЛЕКСАНДРОВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДНК-ТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ ОЦЕНКИ И ИЗМЕНЕНИЯ ГЕНОМА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Специальность 06.02.01. - Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени доктора биологических наук

Лесные Поляны Московской области 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ...............................6

Раздел I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................13

1.1. Структура и полиморфизм митохондриальной ДНК сельскохозяйственных животных.............13

1.2. Структура и полиморфизм повторяющейся фракции генома сельскохозяйственных животных.........29

1.3. Полиморфизм уникальных генов сельскохозяйственных животных..........................37

1.4. Интродукция генов в геном сельскохозяйственных животных..........................41

Раздел II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.............58

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ........58

Глава I. ГЕНОТИПИРОВАНИЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

ПО МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК . .............74

1.1. Объект, материал и методы исследований........75

1.2. Разработка метода рестрикционного анализа

мтДНК крупного рогатого скота..............82

1.3. Рестрикционный анализ мтДНК крупного рогатого скота. 88

1.4. Характеристика полиморфных вариантов мтДНК крупного рогатого скота.................104

1.5. Разработка метода амплификации участка Д-петли мтДНК крупного рогатого скота.............118

1.6. Рестрикционный анализ Д-петли мтДНК

крупного рогатого скота .................129

1.7. Расположение сайтов рестрикции в регуляторном регионе Д-петли мтДНК крупного рогатого скота .... 140

Глава 2. РЕСТРИКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК ОВЕЦ И КОЗ.....148

2.1. Объект, материал и метод исследования........149

2.2. Выбор рестриктаз, позволяющих выявлять паттерны повторяющейся ДНК овец и коз.............152

2.3. Рестрикционный анализ повторяющейся ДНК овец . . .156

2.3.1. Характеристика рестрикционных фрагментов повторяющейся фракции генома овец.....157

2.3.2. Доминантная повторяющаяся единица сателлитной ДНК овец..............183

2.3.3. Сравнительный рестрикционный анализ повторяющейся ДНК овец различных пород . . 188

2.4. Рестрикционный анализ повторяющейся ДНК коз . . . .194

2.5. Характеристика межвидовых маркеров геномов

овец и коз.........................200

2.6. Генотипирование химерного животного овце-козла . . .208 Глава 3. ГЕНОТИПИРОВАНИЕ СВИНЕЙ ПО RYR - ГЕНУ.....218

3.1. Объект исследования, материал и методы.......220

3.2. Определение оптимальных параметров ДНК-технологии выявления мутации в RYR - гене.............224

3.3. Диагностика мутации RYR - гена свиней.........229

3.4. Анализ популяции свиней скороспелой мясной породы на предрасположенность к злокачественной гипертермии .232

Глава 4. ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ

ЖИВОТНЫХ И ИХ ПОТОМКОВ..............237

4.1 Материалы и методы....................238

4.2 Получение трансгенных животных.............247

4.3 Генетический анализ трансгенных животных.......249

4.3.1. Анализ интеграции чужеродной ДНК в геноме животных, полученных из микроинъецированных зигот .........................249

4.3.2. Анализ наличия чужеродной ДНК в геноме потомков трансгенных животных................255

4.3.3 Цитогенетический анализ трансгенных животных и их потомков.......................259

4.4 Фенотипический анализ трансгенных животных и их потомков...........................265

4.4.1 Фенотипический анализ трансгенных кроликов . . 266

4.4.2. Фенотипический анализ животных, полученных из микроинъецированных зигот............275

4.4.3. Схема размножения трансгенного кролика .... 277

4.4.4. Фенотипический анализ потомков трансгенного кролика первого поколения.............277

4.4.5. Фенотипический анализ инбредных потомков трансгенного кролика второго поколения......283

4.4.6. Фенотипический анализ аутбредных потомков трансгенного кролика второго и третьего поколения.285

4.4.7. Связь между динамикой изменчивости живой массы и смертностью потомков трансгенного кролика . . . 287

4.4.8. Увеличение изменчивости живой массы экспериментальных животных...........292

4.4.9. Динамика смертности потомков трансгенного кролика....................... 295

4.4.10. Фенотипический анализ потомков трансгенного кролика с повышенной скоростью роста......298

4.4.11. Фенотипический анализ трансгенного хряка и его потомков ....................... 301

Раздел III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ . . .306

ВЫВОДЫ...............................337

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ................342

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...........345

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Решение селекционных проблем требует оценки генома сельскохозяйственных животных как на уровне хромосом, так и непосредственно на молекулярном уровне. Современные ДНК - технологии позволяют разработать способы точной идентификации генотипов и на их основе вести широкомасштабную селекцию по хозяйственно-полезным признакам. Молекулярно-генетические методы анализа всё шире используются в исследовании гетерогенности генома и решения проблем маркирования генетических ресурсов. К ним прежде всего следует отнести методы полиморфизма длин рестриктных фрагментов, молекулярной гибридизации и секвенирования последовательностей ДНК.

Эффективность оценки генотипов с помощью иммуногенетиче-ских маркеров и полиморфных белков ограничивается анализом экс-прессирующихся генов, например, молочных белков у лактирующих коров, и невозможностью оценки различий в некодирующих, в том числе и в регуляторных областях генома. Новые ДНК-технологии позволили поставить вопрос о возможности выявления особенностей геномов отдельных особей и родственных групп сельскохозяйственных животных непосредственно по полиморфизму последовательности ДНК. При этом рестрикционный анализ ДНК по точности намного превосходит использовавшиеся ранее подходы к оценке генетического полиморфизма и обладает широкими потенциальными возможностями в плане поиска новых систем генетического маркирования.

Поиск маркеров на уровне ДНК получил дальнейшее развитие с появлением метода амплификации фрагментов ДНК с помощью по-лимеразной цепной реакции (ПЦР). Использование ПЦР даёт воз-

можность детекции различий в последовательности ДНК небольших, наиболее вариабельных и интересующих исследователя участков генома при использовании для анализа микроколичеств биологического материала.

Перспективным источником генетических маркеров являются вариабельные участки ДНК, присутствующие как в ядерном, так и в цитоплазматическом геноме. Полиморфные нуклеотидные последовательности уже нашли своё применение при идентификации индивидуумов, в определении родословных и в анализе популяций человека (А.^еАтеуБ е1а1., 1985, 1987,1991).

Особое значение приобретают ДНК - технологии при получении сельскохозяйственных животных новых генотипов путём микроинъекции чужеродных генов в зиготы. Перспективы методов трансгенеза заключаются в создании животных с желательными наследственными признаками. Однако, частые проявления негативных эффектов переноса чужеродной ДНК затрудняют распространение трансгенной технологии в сельскохозяйственное производство. Является очевидной необходимость обширных исследований животных, полученных в результате генно-инженерных манипуляций, перед тем, как они будут использованы в практическом животноводстве.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований является разработка ДНК - технологий на основе современных достижений молекулярной генетики и изучение возможностей их использования для оценки и изменения генотипа сельскохозяйственных животных.

Были поставлены следующие задачи: 1. Оценить возможности использования рестрикционного полиморфизма митохондриального генома для генотипирования сельскохозяйственных животных на примере крупного рогатого скота.

2. Определить возможности генетического маркирования сельскохозяйственных животных по полиморфизму повторяющихся последовательностей ДНК на примере овец и коз.

3. Изучить возможности идентификации аллелей структурных генов с помощью метода ПЦР-ПДРФ на примере 1ЧУР-гена свиней.

4. Осуществить комплексный генетический и фенотипический анализ трансгенных животных и их потомков в; ряду поколений.

На основе научных исследований предусмотрено:

- разработать новые и адаптировать существующие ДНК - технологии для массового анализа сельскохозяйственных животных и рекомендовать усовершенствованные методы для генотипирования сельскохозяйственных животных;

- дать оценку современных молекулярно-генетических и биотехнологических методов в плане возможности их использования для оценки и изменения геномов сельскохозяйственных животных;

- предложить новые генетические маркеры на основе полиморфных вариантов ядерной и цитоплазматической ДНК;

- дать предложения по использованию новых категорий генетических маркеров для оценки генофонда сельскохозяйственных животных;

- выявить генетические и фенотипические последствия генно-инженерных манипуляций по переносу чужеродных генов в геном сельскохозяйственных животных и на этой основе оценить возможность использования генетически модифицированных животных и их потомков в практическом животноводстве.

Исследования выпб^ены в 1986 - 1998 гг. в соответствии с планами научно-исследовательских работ в лаборатории биохимической генетики Всероссийского НИИ племенного дела, в Международной лаборатории по биотехнологии (г.Нитра, Словакия) и в Институ-

те генетики и разведения животных Польской Академии Наук (Ястр-жембец-Мроков, Польша).

Научная новизна. Изучен полиморфизм митохондриального генома крупного рогатого скота в целом и гипервариабельного региона Д-петли мтДНК. Впервые проведён анализ полиморфных вариантов мтДНК отечественных пород и популяций крупного рогатого скота, а также помесных животных. Найдены генетические маркеры цитоплазматического генома. Предложен метод массового анализа полиморфных вариантов мтДНК на основе ПЦР-ПДРФ.

Впервые с помощью широкого набора рестриктаз исследована повторяющаяся фракция генома овец и коз. Получены новые данные о структуре и полиморфизме часто повторяющихся последовательностей ДНК. Показан видоспецифический характер полиморфизма повторяющейся фракции ядерного генома и возможность использования полиморфных вариантов частых повторов ДНК в качестве маркеров видовой принадлежности. Приведены характеристики новых генетических маркеров овец и коз. Впервые разработан метод оценки генома химерных животных. Проведено генотипирование тканей химерного животного овце-козла.

Предложены оптимальные параметры метода идентификации аллельных вариантов РУР - гена свиней. Определена частота встречаемости мутации гена, ответственной за предрасположенность к злокачественной гипертермии, у животных скороспелой мясной породы.

На обширном материале проведён комплексный генетический и фенотипический анализ животных, полученных генно-инженерными методами, и их потомков *в ряду поколений в различных вариантах спаривания. У экспериментальных животных выявлены обширные генетические и фенотипические изменения - отклонения ростовых

параметров и резкое снижение жизнеспособности. Показано, что фенотипические отклонения у потомков более выражены при ин-бредном спаривании.

Практическая значимость. По материалам исследования разработаны методические рекомендации по использованию ДНК - технологий для оценки геномов сельскохозяйственных животных. Методы определения рестрикционного полиморфизма митохондриально-го генома, повторяющейся фракции ядерной ДНК и аллельных вариантов РУ1Ч-гена рекомендованы для выявления генетических особенностей животных в программах по оценке мирового и отечественного генофонда, при создании животных новых генотипов и генетическом мониторинге в популяциях. Полученные схемы рестрикции и характеристики полиморфных генетических маркеров являются основой для генетической паспортизации сельскохозяйственных животных.

Полиморфные варианты мтДНК крупного рогатого скота могут быть использованы для маркирования генетических особенностей материнских семейств и определения роли цитоплазматического фактора в формировании продуктивных признаков, в частности жирномолочности коров. Рестрикционный полиморфизм частых повторов ядерной ДНК рекомендуется к использованию в качестве видос-пецифичных генетических маркеров, решения вопросов таксономии сельскохозяйственных животных, генотипирования гибридов и химерных животных. Генная диагностика аллельных вариантов РУР-гена может быть положена в основу селекционных программ по выведению стрессустойчивых пород свиней мясного направления.

Наличие существенных изменений структуры и функционирования генома животных, полученных в результате микроинъекций

чужеродных генов, следует учитывать при решении вопроса о возможности их использования в практическом животноводстве.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Учёных советах ВНИИплем в ежегодных отчётах 1986-1998 гг., на Международных конференциях "15-е Генетические Дни" (Чешские Будеёвице, Чехия, 1991), "16-е Генетические Дни" (Чешские Будеё-вице, Чехия, 1992), "13-м Общесловацком семинаре по репродукции сельскохозяйственных животных" (Липтовский Ондрей, Словакия, 1992), на "1-й Генетической конференции Генетического общества Грегора Менделя" (Брно, Чехия, 1993), на Международной конференции "40 лет двойной спирали ДНК" (Брно, Чехия, 1993), "Дни генетики сельскохозяйственных животных" (Нитра, Словакия, 1993), на Международном симпозиуме "Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных" (Санкт-Петербург, Пушкин, 1994), на 1-й Международной конференции "Прогресс в эмбриотехнологии и генной инженерии крупного рогатого скота и овец" (Краков, Польша, 1994), на Международном симпозиуме "Способы сохранения редких пород сельскохозяйственных животных" (Балице под Краковым, Польша, 1994), На 2-й Международной конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" (Боровск, 1995), на 1-й и 2-й Международных конференциях по молекулярно-генетическим маркерам животных (Киев, 1994, 1996), на Международной конференции "Агробиотехнология растений и животных"( Киев, 1997), на Симпозиуме с международным участием "Бесплодие. Вспомогательные репродуктивные технологии" (Киев, 1997), на ХХУ-й Международной конференции по генетике животных Международного Общества Генетики Животных (Тур, Франция, 1996 ), на 46-м, 47-м и 48-м Ежегодных Симпозиумах Европейской Ассоциации Животноводства (Прага, 1995, Лиллехаммер,1996,

Вена, 1997), на Международной конференции "ДНК-технологии" (Киев, 1997), "18-е Генетические Дни" (Чешские Будеёвице, Чехия, 1998), экспонировались на ВДНХ СССР и ВВЦ.

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 30 работ в материалах Международных конференций, журналах "Доклады ВАСХНИЛ", "Вестник РАСХН", "Сельскохозяйственная биология" и, сборниках научных трудов ВНИИплем.

На защиту выносятся следующие положения:

-новый подход к оценке генетического сходства и различий сельскохозяйственных животных на основе ДНК-технологий;

- новые данные о структуре и полиморфизме ядерного и цито-плазматического генома сельскохозяйственных животных;

- методы оценки гетерогенности генома сельскохозяйственных животных на основе определения рестрикционного полиморфизма митохондриального генома, повторяющейся фракции ядерной ДНК и аллельных вариантов структурных генов, пригодные для массового анализа;

- новое поколение генетических маркеров на основе полиморфных вариантов нуклеотидных последовательностей ядерной и цитоплазматической ДНК;

- метод генотипирования химерных животных;

- предложения по многоуровневому генотипированию сельскохозяйственных животных на основе использования разных категорий генетических маркеров;

- новое представление о животных, полученных в результате микроинъекций в зиготу чужеродных генов, и их потомках как о генетически модифицированных организмах, несущих обширный комплекс генетических и фенотипических изменений.

Раздел I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. СТРУКТУРА И ПОЛИМОРФИЗМ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

В последние годы в генетических исследованиях в качестве маркера все шире стала использоваться митохондриальная ДНК (мтДНК) благодаря таким ее свойствам, как небольшой размер молекулы (16500 пар нуклеотидов - п.н.), большое количество копий мтДНК в клетках, отсутствие рекомбинаций и высокая степень изменчивости нуклеотидных последовательностей по сравнению с ядерными генами. Исследования мтДНК стали источником эволюционных оценок, которые отличаются от типичной традиционной Менделевской и популяционной генетики. Использование мтДНК в качестве маркера заставило пере�