Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Перенос гена рилизинг-фактора гормона роста человека кроликам, свиньям и овцам

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Перенос гена рилизинг-фактора гормона роста человека кроликам, свиньям и овцам"

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всесоюзного научно-исследовательского института разведения и генетики сельскохозяйственных животных ВАСХНИЛ.

Научные руководители — Лауреат премии Совета Министров СССР, доктор биологических наук, профессор А. Ф. Яковлев; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Л. В. Козикова.

Официальные оппоненты — доктор медицинских наук В. С. Баранов (НИИАГ РАМН); кандидат биологических наук А. Н. Ермилов (ЦИН РАН).

Ведущее учреждение — Всесоюзный научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных, РАСХН.

Защита состоится 30 июня 1992 в И часов на заседании Специализированного совета Д.020.07.01 по защите докторских диссертаций при Всесоюзном научно-исследовательском институте разведения и генетики сельскохозяйственных животных по адресу: 189620, С.-Петербург—Пушкин, ул. Московское шоссе, 55-А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного НИИ разведения и генетики сельскохозяйственных животных.

Автореферат разослан « г?» мая 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор сельскохозяйственных наук

Ж. Г. Логинов

ПУйШЛЗШЯ ■ По результатам исследований опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из раз дез лов : введение, обзор литературы, материал и методы . исследования, результаты исследования, обобщение и обсуждение результатов исследования, выводов, практических предложений и списка литературы, включающего 2^5 публикаций отечественных и зарубежных авторов. Объем диссертации составляет 18&f страницы машинописного текста. : В качестве иллюстраций представлено 18 таблиц и 32 рисунка.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Исследования проводили на кроликах (шиншила, белый великан, калифорнийская), свиньях.(крупная белая, ландрас, словацкая благородная) и овцах (эдельбаевская, казахская подугрубошерстная).

У доноров эмбрионов проводили гормональную стимуляцию полиовуляции согласно отработанных схем, либо использовали животных с естественной овуляцией. Реципиентов синхронизировали по половому циклу с донорами, либо, подбирали животных с естественным совпадением эстрального цикла.

Ранние эмбрионы на стадии зиготы извлекали из изолированных яйцеводов убитых животных либо от живых животных хирургическим путем; промывая яйцевода через прокол стенки со стороны рога матки по направлению к воронке яйцэвода.

После морфологической оценки качества зиготы микроинъециро-вали и трансплантировали самкам в просвет воронки яйцевода, а прадъимплантационныо эмбрионы (после in vitro культивирования) -в область верхушки рога матки (через прокол стенки), в 3-5. см от места его соединения с яйцэводом.

Использовали ген рилизинг-Факторз гормона роста человека (hgrf) с промотором гена'металлотионеина мыши (МТ-1). Генноинда-нерная конструкция hGRFvMT-l (Mayo et ai'. , 1S83) в составе бактериального вектора была предоставлена А.ф. Смирновым (лаборатория молекулярной организации генома эукариот, ВНИИРГЖ). Микро-' .инъецировали Есои-нтат-Фрагмент (2,5 т.п.н.) рекомбинантной ДНК, включающий структурную часть "минигена" hGRF с З'-нетранс-лируемой областью-и промотор гена- МТ-1 (770 п.н.), содержащий последовательности, инициации,. транскрипции и индукции тяжелыми 'металлами, с 5*-нетранслируемой областью (рис. 1).

а

о с

Ü CL

U> ¿T

a

e <

Ul M 14 •vJ -w ""J m M a» CO In со

ce

i 5 "и E ö

ti с

NX

Ii

£00 п. н. Iii Т т" ~Ч

I —d tí .

Рисунок 1. Рвстрикгная, Физическая карта ecori-hjndiii -Фрагмента рвкомбинантноа (ucrf-'MT-í) ДНК, использовавшегося для "микроиньекции. Томный участок - ген ьсйр : геномные клоны (ь экзон 2; с - интрон Б), кДНК (a - вкзоны 3-5), светлый участок (а) - S'-нетранслируемая область и промотор гена МГ-1 (экзон 1); тонкая линия (е) - 3'-нетранслируемая область гена msrf.

Выдалениэ плазмвдноя ДНК, перевод ее Билинейную форму, разделений Фрагментов ДНК и элюцию.необходимого EcoRi-Hindiii-Фрагмента (2,5 т.п.н.) проводили согласно стандартных методик-(Маниатис и др., 1084). Перед микроиъекциоа маточный раствор ре-комбинантной ДНК разводили до концентрации ~2 мнг^мл буфером .ТЕ.

Микроинструменты готовили из стеклянных капилляров на ник-рокузницв (СКБ БП АН СССР). Непосредственно перед микрошъекодей истонченную часть микроиглы заполняли стерильным маслом "Fiiior-

inert f-40" ("Sigma"), á ОСТЗЛЬНУЮ ЧЭСТЬ МИКрОИГЛЫ И ВСЮ СИСТ6МУ

привода - вазелиновым маслом. .

Визуализацию ядерного материала и микроинъецированиэ акгот ПРОВОДИЛИ ПОД Контролем МИКрОСКОПа "Olympus" (Япония) с оптикой дифференциального.интерференционного контраста по Номарскому (18 х20), с помощью микроманимулятора КМ-2 (ОКБ БП АН СССР) и микро-иньектора конструкции ШГ АН СССР. Зиготы свиней предварительно цэнтрифугировали В градиенте даркрлла0<бО£) ("Pharmacia") для смещения цитоплазматических включений, маскирующих пронуклеусы. Микроинъецировали зиготы в чашка 1!втри (d 4U мм) в капле <~100 мкл) питательной среды под слоем стерильного парафинового . масла

("VEB JENAPHARM-LABORCHEVIE APOLDA"-, Г/Ц') .

Культивировали эмбрионы со стадии зиготы до стадии морулы в газовой среде (5'í сог. ог. 90% ыг) в синтетических питатель-

НЫХ сред ах фирмы "ШЬсо" : Brinster'4 (ВМОС-3) McCoy"s S-Л, MEM (EAGLE), Mutei f?nt MLtture F-10 (НАМ), Medium 199, а Т8КЖ0 В

среда Виттенэ (vhitien, 197e), приготовленной на реактивах Фирмы "sigma", с добавлением во все среды аНТИбИОТИКОВ.

Гибридизационный анализ геномной ДНК (southern, 1.97s), выделенной ИЗ крови И тканей (CI 111 1 a et al., 1988; Pal miter et ai. , 1982), проводили в изотопном варианте, на нейлоновых Фильтрах "Hybond™". В качество зонда использовали EcoRI-HlndlII-Фрагмент плазмидной ДНК (вставка hoRF/MT-i), меченной Ся-Р"з методом "Primer Change Reaction" (Felnberg. Vcgelstein, 1983) .С ПОМОЩЬЮ стандартных наборов реактивов "Random Labelling Kit" Фирмы "Amersham и. je. ". Образом суммарной ДНК, давшие ПОЛОЖИТЙЛЬ-ныя ответ при дот-гибридизации, расщепляли рестриктазами (НПО "Фермент", Вильнюс; "Aroersham U.K.") С П0СЛ8ДУЮЩИМ Э-ЛвКТрОФОрО-зом в 0,7:« агарозном геле, переносом на нейлоновые -Фильтры и блот-габридизацией. Для радиоавтографии использовали рептгенов-скую пленку "НуретШт MP" ФИрМЫ "Amersham U. К. ".

Для определения частоты встречаемости клеток с измененным карнотитом _ использовали метод микроядерного. тестирования (МГ)

(MacGregor et al.. 1 SB7 ) В ПОПУЛЯЦИЯХ ' ЭрИТрОЦИТОВ ШрИФврИЧвСКОЙ

крови 1фоликов и свиней, полученных после микроинъекции рекомби-нантпои ДНК hGRF/MT-i в зиготы. Мазки крови Фиксировали этанолом и окрашивали по Гимза. Частоту клеток с'микроядрэми определяли в 100 полях зрения (-20000 эритроцитов) каидого препарата.

Статистическую обработку проводили по Стьюденту и'Фишеру (Лакин, 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Исследования по переносу гена hGRF в ранние эмбрионы кроликов, свиней и овоц включали 6 экспериментов, в том число, 2 на кроликах, 2 на свиньях и'1 на овцах. В каждом эксперименте .были получены трансговнью особи : б трансгонных кроликов, 4 трансгенных свиньи и 1 трансгенная овца (табл. 1). . ' Разработка технологии переноса гена ьше щшжш. Через 17-19 ч после спаривания от крольчих-доноров получали ранние 'эмбрионы' на стадии зиготы. Выход эмбрионов от числа овуляций в яичниках доноров составил в эксперименте н 1 95,3% (532/558), в эксперименте ч 2 - 88,4% (397/449). Из общего количества эмбрионов полноценными, были 93,835 (499/532) (эксп. n 1) и

- 8 - , 94,4« (363^397) <зксп.. м 2) (табл. 1).

Таблица 1

Результаты исследовании по переносу гена ьа^ в зиготы кроликов, свиней и овец

' ' ~ КРОЛИКИ' ! свиньи . | овш

н= эксперимента - 1 ' 2 ' 1 ' 2 ■ ' 1 Кол-во эмбрионов :

получено - 532 397 115 249 80

в т.ч.

полноценных . - 449 363 . 109 204 76

транспл. после

микроинъекции - 369 356 92 196 61

•Родилось животных - 54 32 5 24 10

в т.ч.

трансгенных - 1(1,9Ж) 4(12,5«) 1(20«) 3(12,5«) 1(10«)

Исключали из экспериментов неошгодотворенные яйцеклетки и неполноценные эмбрионы, в частности, полиплоидные эмбрионы, составившие в эксперименте n 1 2,3« и в эксперименте n 2 1,8«.

' Рекомбйнантную ДНК hGRF^MT-i микроинъецировали, как гранило, в мужской пронуклеус зигот, более крупный, лежащий на стороне, противоположной направительным тельцам. Эффективность микро-иньекции оценивали по увеличению в объеме пронуклеуса. (в -1,5 раза). После микроинъвцирования целостность была сохранена у 97,4« эмбрионов (486^49?) в эксперименте м 1 и у 98,0« (35&<363) эмбрионов в эксперименте n 2. Травмируемость эмбрионов определялась качеством используемых микроигл. Микроинъекции более тонкими микроиглами, с диаметром 'колющей части не более 1 мкм (в сравнении - более 1-1,5 мкм), обеспечивали достоверно (Р<0,05) меньший уровень визульно определяемого травмирования эмбрионов и,- соответственно,, меньшую их бракуемость.

Способность эмбрионов, сохранивших, целостность после микро-., инъецирования,, к дальнейшему развитию Выла изучена нами при их культивировании in vi tro со стадии зиготы до стадии морулы (аксп н 1). Из 173 культивированных поело микрокнмкции' эмбрионов, стадии морулы достигли 58 (32,4%)'. В средах НАМ - f-10 и -Виггена из числа мшрошъециропанных зигот было подучено, соответственно, на 12,2S .и на 27,8¿C меньше (Р<0,0В) морул, чем из числа интакт-. ных зигот в контрольном варианте. 28,7% микроинъвщашванных зи-

гот в среде НАМ f-10 и 42% - в среде Виттена даже не вступали в Фазу первого деления дробления, вероятно, по причине значительного травмирования. Сравнительно больший отсев эмбрионов в опытном и контрольном вариантах происходил на стадиях 4-8 оластоме-ров, вероятно, в связис основными качественными изменениями в синтезе белков (табл. 2).

Таблица 2

Развитие in vitro эмбрионов кроликов после микроиньецирования

р пя Кол-во иРеда опытов Кол-во зигот Число' эмбрионов, развившихся до :

2-х клет. стадии 3-4-х клет. стадии 8-ми клет. стадии стадии морулы

НАМ F-10 7 '75 55(73,358)* 55(73,3%)* 45(60%) 40(53,3%)

К 4 29 28(96,6%) 28(96,6%) 20(69%). 19(65,5%)

Виггена 4 36 21(58%) 18(50%) 9(25%)*. 8(22,2%)*

К. 3 16 12(75%) 9(56,3%) 8(50%) 8(50%)

К - контроль, неиньецированные эмбрионы. * - (Р<0,05)

В эксперименте n 1 из общего числа микроинъевдрованных эмбрионов трансплантировали реципиентам 74% (369^499) (в т.ч. после культивирования in vitro), в эксперименте n 2- 98% (356/383). Как правило, в один яйцевод реципиента пересаживали не менее 7-8 эмбрионов. Более высокие требования, предъявляемые к полноценности трансплантируемых эмбрионов в эксперименте n 1, способствовали сравнительно более высокой рождаемости потомства (14,6%) в сравнении с экспериментом n 2 (9%). Наши данные соответствовали таковым (-12%) в ряде подобных работ (Strojek, 1986; Ross et ai. , 1988). При проведении серии контрольных трансплантаций интактных зигот' (эксп. n 1) рождаемость потомства, 56,2%, была, на 41,6% выше (Р<0,001) в сравнении с опытной группой (14,6%). Кроме того, было отмечено удлинение срока беременности на 1-2 суток у реципиентов, которым пересаживали микроинъецированные эмбрионы (30-31- сутки) в отличив от реципиентов, которым пересаживали интактные эмбрионы (28-30 суток). Причём, беременность, , установленная у 60% реципиентов из общего числа использованных в опытной груше, завершилась рождением потомства лишь у 42,5%. В . ряде случаев регистрировалась внутриутробная гибель и рассасывание, либо абортирование плодов, повидимо.му, в зависимости от ' уровня дезинтеграции зародышевого генома...

Частота встречаемости эритроцитов с микроядрами' (Фрагменты

- 10 - -хромосом, цалыв хромосомы) у кроликов, полученных после микроинъекции рекомбинантаой ДНК ьскг->мт-1 в ранние эмбрионы, более чем в 2 раза превышала (Р<0,001) таковую у интактных животных (рис. 2 А, В), что свидетельствовало в пользу достоверного повышения нестабильности кариотипа соматических клеток кроликов, развившихся из микроин'ъецировоТшых зигот.

40-)

ЗО. 20. 10. о.

Ип

х;х

О . 1

х ю

X

за. 20-| ю-

ш

о .1 г зав е х ю

.Рисунок 2. распредоленш 26 интактных (А) и 30 полученных посла микроинъекции гена г.окр в зиготы- (Б) кроликов по частотам эритроцитов с микроядрами.По оси абсцисс - частота эритроцитов с микроядрами (на Ю тыс клеток), по оси ординат - % животных.

Молвкулярно-генетический анализ геномной ДНК кроликов в эксперименте н 1, проведенный методами" дот-, блот-гибридизации, позволил идентифицировать трансгеноз у одного животного (н 17) из 54-х протестированных. Как показано.на рисунке 3, в обработанной ферментом шпагп. ДНК трансгешгого кролика N 17 выявлено 2 гибридазующиесн с ДНК,зонда Фракции : основная - 4,9 т.п.н. и дополнительная - 10 т.п.'н., -превышающие размер есом-Шпагт!-Фрагмонта (2,5 т.п.н.), что свидетельствует в пользу интеграцию рокомбинаитной ДНИ геномом увцишоита.-Но интенсивности основна-

■ - 11 -

го гибридизационного сигнала, в сравнении с-положительным контролем, можно судить об интеграции рвцмпиентным геномом 3-5 копни рекомбинантной ДНК ьекк/ит-1.

Т- п. и.

-12,0

1__В, О

4,0

9— 2, а

1 23456 7 в

Рисунок 3.' Блот-гибридизация геномной ДНК (рестрицирована чврментом Шпсяи ) кроликов (эксп. м 1) с меченым срагз ЕсоК1-Н1 пси 11 -фрагментом плазмвды (вставка ¡¡аир/кг-г) : 1, 2, 3, 4, & - ДНК нетрансгеиных кроликов; 6 - ДНК трансгенного кролика'и 1?; 7 - отрицательный контроль (ДНК интакгного•кролику); 8 - положительный ' контроль - вставка ьбкг,'МТ-1 (~ 5 копий на гоном).

Отличительным было значительное угнетение роста и развитии трансгенного кролика N 17. В возрасте 22 недели его вес был в 1,7 раза меньше среднего веса сверстников. Подобный Фе-нотипичес -кий эФФекг мог явиться следствием дезинтеграции зародышевого, ю-нома при микроинъецировании либо инсерционного мутагенеза, 5 из 10 (50Ж) потомков г», трапсгешюго кролика-самца, оказавшись трансгенными, также унаследовали замедленный рост.

В эксперименте м 2 гибридизационные сигналы■позволили предположить . возможность интеграции последовательностей донорской • ДНК-геномом 4-х'кроликов : N 334, м 335. н 337. н 338. Трапсгеи-йыа кролики отличались ускоренным, ростом. В возрасте 4 надели их вес в среднем , в 1,97- раза был больше среднего веса интактных сверстников, что свидетельствовало об эффективной экспрессии интегрированного геномом животных роотстимулирующэго тона ьзкг.

• Таким образом, выход траисгенпых кроликов в эксперимента* н 1 и N 2 составил, соответственно, 1,1« (1 54) и 12.5Ж (4-32). ЕаадеЙойа технологии ш{виноа шш Ь&ЕЕ'ШИШИ.

Ранние эмбрионы на сгга.нии зиготы (¡одумали через 24-2(5 ч .после осеменения шпоров. В эксперименте н 1 от 10 доноров со ' спонтанной охотой получили 115 <8Ь,й%) имбриолов. В акешримоате

ы 2 от 10 доноров после гормональной стимуляции полиовуляции получили 204 (92,6%) эмбриона.. Неполноценных эмбрионов (признаки дегенерации, геномные аберрации) и неоплодотворённых яйцеклеток было достоверно (Р<0,01) больше в эксперименте N 2 (18,1%), где все доноры проходили гормональную обработку, в сравнении с экс-шриментом N 1 (5,2%).

При центрифугировании эмбрионов в 4-х различных режимах наибольшая эффективность смещения цитоплазматических включений, маскирующих пронуклеусы, была достигнута при 13000 д - 6 минут (~80% эмбрионов). В более жестких режимах увеличивалось число поврежденных эмбрионов, более мягкие режимы были неэффективны.

После трансплантации 84,4% (дксп. н 1) и 96,1% (эксп.2) микроинъецированных в сочетании л центрифугированием' эмбрионов (в один яйцевод реципиента не менее 8-10 эмбрионов)' родилось, соответственно, 5,4% (5^94> и 12,3% (24^196) поросят из числа трансплантированных эмбрионов..Меньшая травмируемость эмбрионов при манипуляциях в эксперименте м 2 способствовала более высокой (Р<0,05) рождаемости потомства, в отличие от эксперимента N 1, где, в основном, отрабатывались манипуляции с эмбрионами.свиней.

Частота встречаемости эритроцитов с микроядрами у свиней, полученных после микроинъекции рекомбинантной ДНК ьвк;р/мт-1, в 9,6 раза превосходила (Р<0,001) данный показатель у интактных животных (рис, 4). Следует отметить, что максимальные значения МТ : 19 х Ю-* и 12 х 10"* были зарегистрированы в популяциях ■

Рисунок 4. Распределение интактных (А) и полученных после микроинъекции гена ьекг в зиготы (Б) свиней по частоте встречаемости эритроцитов с микроядрами.

эритроцитов опытных свиней, давших отрицательный результат при тестировании на трансгенез.

■ __ При дот-, блот-ш5ридиэационвом анализе геномной ДНК интеграция гена ьсжр была установлена у 1 свиньи в эксперименте н 1 (рис. -5 А) и у 3 - в эксперименте н 2 (рис. 5 В).

•..... f .

*

14,О _ Ï 12,0 — j çy»

5, О — ; 4, в —J

2,3 —

3 4

А

т. п. н.

12,0 _ ------------

10,0- | — <»•»

■•..'■ . .' i ' 'iv.

■ ( •

' i ■ 2,s — 'Г, '.

2,2 — jLfa, ¿Ш t

Ш- ЛЯтВ- mm i,—.. — .ия .

I 2 3 4 В 6 7 8 9 10

; . . В

Рисунок 5. Блот-гибридизация геномной ДНК- (рестрицирована Ферментом nindiii) свиней с меченым tp3Zi ecoRI-Hindi и -Фрагментом плазмиды (вставка hGRF/Mr-i). а (зксп. м 1 ) : 1 - ДНК трансгенной свиньи N1; 2, 3,4, 5- ДНК нятрансгенных свиней; в -отрицательный контроль (ДНК интактной.свиньи); 1 - положительный контроль - вставка hgrf/mt-i (~ю копия на геном). В (зксп. N 2) : 2, 3, 4 ,- ДНК трансгенных свиней м 56в'1, N 56ft'2, .N f56(V3; 1, 5 - 9 - ДНК нетраисгешшх евшей; 10 - положительный контроль - вставка Iigrf^mt-i (~Е> копии па юном).

Гяномпая ДНК ipaiKToiuiux свиней была обработана Формонтой

нхпсии, не имеющим внутреннего сайта рестрикции в есои-нхпсцц -Фрагменте1 плазмиды, использовавшемся для. микроинъекции. Таким образом, в ЛЖ трансгенной свиньи N 1 <зксп. N 1) ззгибридизова-лись 2 Фракции : 12 т.п.н. и 4,6 т.п.н. В ДНК трансгенных свиной н 5бв-1, n ь6(>-"2, N 566/3 (зксп. N 2) было выявлено по одной гиОридгоугабояея Фракции,. 10'т.п.н., а в ДНК свиней, ы 566/2, и 5сс>-.'3, крош того, по одной'дополнительной Фракции, 2,2 т.п.н. Нзличио высокомолекулярных Фракций (4 - 12 т.ц.н.) в ДНК всех 1ранск>(.-!ировашшх животных свидетельствовало об интеграции ре-кокбидантноа ДНК редапиентным геномом. Дополнительные Фракции (2,2 т.п.н,), выявленные в ДНК 2-х трансгенных свиней, характеризовали возможную перестройку микроиньвцированной рекомбинант-ной ДНК ьврр.-мт-1 (2,5 т.п.н.).. Интенсивность гийридазационных сиг налов соответствовала : интеграции геномом трансгенной свиньи » 1 (зксп. н 1) 10-15 кога|и гена ьскг, геномом хряков м 566/1, н 566/2, н 566/3 (зксп. н 2) - , 10, 3 кого®, соответственно.

Трансгенные хряки в эксперименте н 2, практически, не отличались га интенсивности роста от шггактных сверстников. В эксперименте N 1 все 5 родившихся свиней (трансгенная и нетрансгэн-ныо) значительно отставали в росте и развш и в возрасте 12 месяцев по размерам и весу соответствовали 6 месячным интактным животным. Причины угнетения роста свиней, полученных после микроинъекции рекомбинантной ДНК ьскг/мт-1 в ранние эмбрионы, возможно, те же, что и в экспериментах на кроликах.

: Таким образом, выход трансгенных свиней в экспериментах н 1 и м 2 составил, соответственно, 20% (1/5) и 12,5$ (3/24).

Разработка технологии переноса гена ьйее овцам.

От 16 овцэматок-доноров, подвергнутых гормональной стимуляции полиовуляции, через 28-32 ч -после осеменения получили 80' (75Ж) ранних эмбрионов, в основном, на стадии зиготы. В число выбракованных, 5% (4/80), вошли 3 неошгодотворенные'яйцеклетки и '» 1 (1,3%) тришгойдаыи эмбрион. 'Использование дифференциального: интерференционного контраста по Номарскому при микроскопировании позволило визуализировать ядерный материал у большинства эмбрионов, без предварительного их цэнтриФугирования..

После пересадки реципиентам 80,3% (61/76) микроинъецирован-ных эмбрионов (но более 2 одному реципиенту) родилось 10 (16,4%) ягнят. Ягнята рождались Фенотипически нормальными, практически, не отличаясь по интенсивности роста от шггактных сверстников.

При блот-гибридизациониом анализе в расщегменной сгерментами Есои и шпаги геномной ДНК овцы N 2 были выявлены 3 гибридазу-кедеся Фракции : 4 т.п.н., 3 т.п.н,. 2,7 т.п.н., размеры которых свидетельствовали об интеграции перенесенного гсша ьскг реципи-ентным геномом (рис. 6). Интенсивность гибридизационных сигналов соответствовала 8-10 копиям гена ьоггр в геноме животного.

4, В

2, О

.г, б 2, 3

<Ф

.1, , . !»' '.' 13 3 4В

Рисунок й. Влот-гибридиэавдя геномной ДНК. (рестрицнрована Ферментами ЕсоМ. шплп) овец с меченым срзгз . Есоы.-нтснп-Фрагментом плазмиды (вставка ьекр/мт-1) : 1 - отрицательный контроль (ДНК интактнои овцы); 2 - ДНК трансгенной овцы н 2; 3, 4 - ДНК нетрансгенных овец; 5 - положительный контроль - вставка ьв^/мт-г (-5 копия на геном).

Эффективность переноса гена ьскр овцам составила 10% (1/10).

ВЫВОДЫ

■ 1. В результате проведенные экспериментов отработана в условиях животноводческих хозяйств технология переноса гена рилизинг-Фактора гормона роста человека сельскохозяйственным животным. Подтверкдена интеграция перенесённого гена геномом 5 кроликов, 4 свиней и 1 овцы.

2. Установлены оптимальные сроки извлечения ранних эмбрионов на стадии зиготы, составившие для кроликов 17-19 ч, .для сви-. ней 24-26 ч и для овец 28-32 ч после' спаривания донора с самцом либо искусственного , осеменения.

3.. Поело гормональной стимуляции полиовуляции у доноров достоверно (р<0,001) увеличивался выход нооплодотворенных яйцеклеток и. неполноценных эмбрионов, в том числе полиплоидных эмбрионов кроликов (1,8-2,3%), свиней (1,6-2,6%) и овец (1,3%).

4. Наиболее оптимальным для визуализации ядерного материала в эмбрионах свиной является предваритёлыюе их 'центрифугирование в режиме. 1.3СЮ0 а в течение В-ти минут.

5. Показано, что.достоверна (Р<0,05) меньшая травмируе-

мость эмбрионов при микроиньецировании обеспечивается с использованием мюфоигл с удлиненной колющей частью и диаметром кончика не более 1 мкм.

в. Установлено, что микроинъекции ДНК'значительно снижают жизнеспособность эмбрионов. При культивировании in vitro основная часть травмированных эмбрионов с низкой жизнеспособностью останавливается в развитии на одноклеточной стадии либо на стадиях 4-8-ми Оластомеров, Трансплантация микроинъецированных эмбрионов приводит к удлинению срока беременности реципиентов на 1-2 суток. ■ ■

7. Микроинъекции чужеродной ДНК в зиготы обуславливают значительную дестабилизацию генома потомства', как трансгенного, так и нетрансгенного. Показано достоверное (р<0,001) повышение . частоты встречаемости микроядер эритроцитов периферической крови кроликов в 2 раза, свиней -¡в 9,6 раза.

. 8. Подтверждённая методом ,!ДК-ДНК-гибридизации интеграция гена рилизинг-Фактора гормона роста человека . реципиентным геномом индуцировала у одних животных эффокт ускоренного роста, у других - его ингибированиэ. Перенесенный ген наследовался в f* в 50% случаев. , " .

ИР АКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для повышения эффективности переноса генов животным микроинъекции ДНК проводить в ранние пронуклеусы зигот с помощью микроигл с удлинённой колющей частью и диаметром кончика не более • 1 мкм.

2. Иикроинъенированпые эмбрионы, перед пересадкой их реципиентам, целесообразно подвергать in vitro культивированию, в

. процессе которого отсевается значительное количество нежизнеспо- , собных эмбрионов.

3. Ввиду значительной дестабилизации генома нетрансгенных ; . животных, полученных из зигот, ■ в которые вводили экзогенную ДНК,.

предлагается не допускать попадания таких животных в. племенное поголовье.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Козикова Л.В., Андреева Л.Б., 'Рамша ТО.К., Медведев С.Ю. Спонтанная полиплоидия зигот кроликов .-v Материалы 2-й Всесоюзной конференции по цитогенетике сельскохозяйственных животных "Цитоганэтика я биотехнология". - Л. - 1989. - С. 103-105.

• - 17 -

2. Кравцов В.Ю., Козикова Л.В., Медведев С.Ю., Яковлев А.Ф. Повышенная частота клеток с микроядрами у кроликов, полученных из зигот после инъекции гена рилизинг-Фактора гормона роста человека Бюл. научн. работ ВНИИРГЖ. - Л. - 1089. - Вып. - 112.- - С. 24-28.

3. Козикова Л.В., Медведев С.Ю. Культивирование ранних зародышей кроликов .-v Бюл. научп. работ ВНШРГЖ. - Л. - 1989. -Вып. - 112. - С. 33-36. ,»

4. Козикова Л.В., Медведев С.Ю., Яковлев А.Ф., Рамша Ю.К. Влияние микроинъекции генов на трансплантацию зигот кроликов ^ 1езисы докладов Всесоюзного совещания."Трансплантация &мбрионов сельскохозяйственных животных". - Алма-Ата. - 1989. - С. 23-25.

5. Медведев С.К)., Козикова Л.В., Бавин В.Г., Ефимов A.M., Смирнов А.ф., Яковлев А.Ф. Перенос генов.в зиготы и эмбрионы животных /V Методические рекомендации по использованию приёмов генетической инженерии для оценки и изменения генома сельскохозяйственных животных. - Л. - 1990. - С..11-22.

6. Kozikova L.V. , Kravtsov V. Yu. , Medvedev., S. Yu. , 1'akov-lev A. F. Micronuclei test /МТ/ on rabbits obtained after micro injection with human growth hormone releasing factor gen«? 'hHT-GRF/ to.zygotes // 4™ Franco-Czechoslovak meeting "Through the oocyte to the embryo". .— Prague. Czechoslovakia. - 1990. - P. SI

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИ И ИНСТИТУТ РАЗВЕДЕНИЯ И ГЕНЕТИКИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

На правах рукописи УДК 575:576:385.5:610

МЕДВЕДЕВ Сергей Юрьевич

ПЕРЕНОС ГЕНА РИЛИЗИНГ-ФАКТОРА ГОРМОНА РОСТА ЧЕЛОВЕКА КРОЛИКАМ, СВИНЬЯМ И ОВЦАМ

03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

/

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ-ПУШКИН 1992