Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка метода получения рекомбинантного соматолиберина и его применение для доставки животным с помощью пробиотических бацилл

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Разработка метода получения рекомбинантного соматолиберина и его применение для доставки животным с помощью пробиотических бацилл"

На правах рукописи

БЕЛЯКОВА АЛЛА ВЛАДИМИРОВНА

Разработка метода получения рекомбинантного соматолиберина и его применение для доставки животным с помощью пробиотических бацилл

03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2013

3 О МАЙ 2013

005060680

Работа выполнена в отделе нанобиотехнологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» г. Казань.

ЕГОРОВА Татьяна Алексеевна, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Московский педагогический государственный университет», биолого-химический факультет, кафедра органической и биологической химии, профессор

кафедры

ПЕТРАКОВ Евгений Сергеевич, кандидат биологических наук, ФГБУ «Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных» лаборатория биотехнологии микроорганизмов пищеварительного тракта, заведующий лабораторией

Ведущая организация - Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН Российской академии наук

Защита состоится «26» июня 2013 года в Ц часов на заседании диссертационного совета Д 212.154.17 при ФГБОУ ВПО «Московский педагогический государственный университет» по адресу: 119021, г.Москва, ул. Кибальчича, д. 6, корп.5, ауд. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО Mill У по адресу: 119991, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1.

Научный руководитель

доктор биологических наук ШЕВЕЛЕВ Алексей Борисович

Официальные оппоненты:

¿ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Холмогорова Наталья Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Бактериальные препараты на основе рекомбинантных пробиотических штаммов, предназначенные для пероральной доставки пептидных стимуляторов роста в организм сельскохозяйственных животных, могут рассматриваться как эффективные и безопасные средства увеличения привесов. Одним из наиболее перспективных биоактивных пептидов для пероральной доставки является соматолиберин. Он обладает высокой устойчивостью к протеолизу и характеризуется низкими по сравнению с соматотропином (СТГ) и инсулиноподобным фактором роста (IGF) действующими концентрациями, что позволяет ожидать проявления его физиологического эффекта даже в условиях неэффективности проникновения из просвета кишечника в циркуляцию. Использование соматолиберина для решения практических задач в области зоотехнии в том числе, за счет синтезирующих его рекомбинантных штаммов, ограничивается фрагментарностью представлений о сигнальной роли этого пептидного гормона в регуляции роста и развитии организма, его фармакокинетике и клеточных мишенях. Есть данные о том, что в естественных условиях эффект соматолиберина дополняется действием его агониста РАСАР (аденилатциклаза-активирующий пептид). В отличие от других позвоночных - птиц, рептилий и рыб, у млекопитающих GHRH и РАСАР кодируются независимыми геномными генами (апоморфное состояние). В плезиоморфном варианте оба пептида транслируются в виде единого белка-предшественника с последующим процессингом, в результате которого в аппарате Гольджи клеток аденогипофиза образуются два отдельных физиологически активных пептида. Во всех опубликованных работах по исследованию биологического действия GHRH и РАСАР эти пептиды были получены путём химического синтеза. В результате задача изучения сочетанного физиологического действия GHRH и РАСАР не была поставлена и не решалась. Изучение естественной сигнальной функции соматолиберина осложняется тем, что его мРНК подвергается альтернативному сплайсингу. У птиц GHRH может являться продуктом одной из трех возможных сплайсоформ. В литературе полностью отсутствуют данные о возможности пероральной доставки производных соматолиберина, вызывающей, в частности, нарушение естественного распределения гормона в организме.

Практическое использование рекомбинантных штаммов бацилл, накапливающих в цитоплазме соматолиберин, в нестерильных условиях кишечника животных осложняется несовершенством экспрессионных систем поддержания чужеродных генов в этих микроорганизмах. Существующие плазмидные векторы не обладают достаточной репликативной и физиологической стабильностью. Кроме того, введение в организм

сельскохозяйственных животных внехромосомных генетических элементов нежелательно с точки зрения биобезопасности. Наконец, системы контроля секреции, созревания и деградации гетерологичных белков в культурах бацилл изучены недостаточно, что нередко приводит к денатурации и деградации синтезируемых продуктов. Этому способствует высокая собственная протеолитическая активность бацилл. Таким образом, разработка метода получения рекомбинантного соматолиберина с помощью пробиотических штаммов потребовала решения .целого ряда вопросов, связанных как с физиологической регуляцией действия соматолиберина, так и с разработкой систем экспрессии генов в клетках бацилл.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилось доказательство возможности пероральной доставки соматолиберина с помощью живых бактериальных препаратов на основе рекомбинантных штаммов бацилл, несущих оригинальную интегративную генную конструкцию.

В соответствии с этой целью решались следующие задачи:

- Оптимизировать структуру гена соматолиберина для экспрессии в бактериях. На модели Е. coli разработать систему измерения уровня накопления в бактериальных культурах и анаболического эффекта производных соматолиберина in vivo.

- Разработать интегративную генетическую систему, позволяющую экспрессировать производные соматолиберина свиньи в клетках пробиотического штамма Bacillus licheniformis В-4161.

- Получить опытный образец бактериального препарата на основе вегетативных клеток рекомбинантного штамма В. licheniformis В-4161, несущего ген соматолиберина и провести его биологические испытания на животных моделях мышей и поросят-отъёмышей.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые получен продуцент соматолиберина свиньи на основе пробиотического штамма В. licheniformis В-4161, сертифицированного для применения в животноводстве. При конструировании продуцента впервые показана высокая эффективность вновь сконструированной интегративной системы клонирования на основе промотора гена субтилизина клеточной стенки WprA и мини-гена устойчивости к эритромицину (E-пептид). На модели мышей и поросят впервые экспериментально показана возможность достижения анаболического эффекта при пероральном введении млекопитающим двух видов (мыши и поросята) бактериального препарата, содержащего зрелую форму производного соматолиберина свиньи -пептидного гормона GHRH.

Искусственная стимуляция привесов сельскохозяйственных животных превратилось в существенный фактор сокращения себестоимости производства, её конкурентоспособности. Однако, изготовление очищенных белковых ростовых факторов парентерального применения, остается дорогостоящим и требует длительных сроков на разработку. Именно поэтому использование опасных для потребителя синтетических стероидных гормонов (производных тестостерона) животноводческими хозяйствами приобрело массовый характер. Внедрение в практику бактериальных препаратов на основе рекомбинантных продуцентов факторов роста на основе безопасных микроорганизмов, в том числе, бацилл является экономически эффективной и безопасной альтернативой использованию стероидов. Результаты работы могут быть непосредственно положены в основу новой технологии производства и применения рекомбинантных пробиотиков, обладающих анаболическим эффектом наряду с естественным защитным и профилактическим действием на патогенную микрофлору кишечника. Настоящая работа выполнена в рамках НИР по Государственным контрактам 16.512.11.2060, 14.740.11.1033, 14.740.11.0625, 16.740.11.0196, 14.740.11.0631 и 16.740.11.0027.

На защиту выносятся следующие основные положения

1. Предложена структура гена зрелого соматолиберина свиньи, пригодного для экспрессии в бактериях с образованием биологически активного пептидного гормона;

2. Показана принципиальная возможность пероральной доставки соматолиберина млекопитающим, разработана тест-система для биологического тестирования активности соматолиберина свиньи на мышатах-отъёмышах;

3. Разработана новая интегративная система на основе гена WprA, пригодная для высокоэффективной экспрессии гена соматолиберина в бациллах;

4. Показан анаболический эффект соматолиберина, доставляемого в составе пробиотического препарата на основе рекомбинантного штамма Bacillus licheniformis, на поросятах отъемышах при отсутствии у них системных дисфункций.

5. Впервые показана эффективность вегетативных клеток бацилл и Е. coli в качестве контейнера для переноса рекомбинантных пептидов через агрессивную среду желудка и двенадцатиперстной кишки, что позволяет разрабатывать технологии создания бациллярных пробиотиков не споровой формы.

Апробация работы и публикации

Результаты исследований были представлены на следующих научных конференциях: Всероссийская конференция молодых учёных и II школа им. Н.М. Эммануэля (Москва, 2006); IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); Конференция посвященная 90-летию Московской академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина (Москва 2009); Научная конференция Доминикана (13-22 апреля 2012 г): материалы конференции опубликованы в журналах РАЕ: «Международный журнал экспериментального образования» №4, 2012 и «Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований» №4,2012. Диссертационная работа была доложена на заседании отдела нанобиотехнологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» 7 марта 2013 г.

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 4 статьи

в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, включая 20 рисунков и 15 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 276 источника.

Содержание работы

Материалы и методы исследования В ходе создания экспрессионных конструкций, из генома курицы с помощью ПЦР было клонировано два экзона гена соматолиберина, которые затем были слиты и введены в состав вектора pQE30. В качестве источника гена была выбрана геномная ДНК курицы, выделенная из мышечной ткани методом фенольной экстракции.

taccqcaqcfc ggaggaggag gtatacgacg aggacgqgaa taccctacag gacttcgcac

l eee v y d edgn tlq dfa tacgagcagg agcccctggg ggtggcgggc egegccegcg ctggggcagg tgtacggcgc

l r a g apg g g g p r p r wgr ста tgtactaccc gccgggaaag agqtqacaqa ggggcgccgg atagggccgg ggggggaggg l y y p pgk r

ggggaatggg aaacctaagg gcccccgggg gaggccggga aatatcgtaa ttccgcccca cctgggctgc gcgagcgggg gaggggggtg gggagggagg gcgcctcggg gatgggcgct

Праймер SLN1 GGGGATCC cacgcogat gggatcttca gc gacgggccgt gccccggcag gcacgccqat gggatcttca gcaaagccta caggaaactc

HAD GIF SKAY RKL Праймер SLN2 ccctga tggcTaagcg ggtcggg ctgggccagc tgtccgcaag aaattacctg cactccctga tqqccaagcg ggtcgqgtaa

L G Q L S A RN Y L H S L M A К R V G gggctgcggc gggacgggag cgaacaaagc gcggcgcgcg gcggccgggg cggggcggcc cattctcccc gcggtgctct gccggaacga gagaggcggc cgcacccggg gctcggcgtc cctcccgcgg ggcagccccg ggtggtgcca tcggagcgaa ccccccccgg gaacgcgatg cataatgcat gggggggggg gggggagacg tctcgctccg gcccggcccc gccctttgtc tgccgggaga tgcggggccg gggcgggggt tagggccggg gttggggttg gggttgggtt agggccgggt tgggtcgggc ccgggagggc ccctcctgat ggttgtgtcc ttctcggtgc tgatggcTaagcgggtcggggg tgccagcagc ggcctgggg Праймер SLN3 tttgcagcgg tgccagcagc qqcctqqqqq acqaggcqqa accgctcaqc aagcgccaca

G ASS G L G D E A E P LS К RH tagacggcat cttcacggac aqctacagcc qctaccggaa acaaatqgct qtcaaqaaat 1 D G 1 F T 0 SYS R Y R К Q M A V К К acttaqcqqc cgtcctgggg aaaaggtata aacaaagagt taaaaacaaa qqacqccqaq

Y L A A v L G К R Y К Q R V К N К G R R

caaccgccgc tgccgtgcgt agtcGACCC Праймер SLN4 tagcgtattt gtaggatgag caaccgccgc tgccgtgcgt agtcctgaga gagagagaga

V A Y L стоп

Рисунок 1. Организация геномного гена соматолиберина курицы G. gallus и схема конструирования искусственных вариантов генов GHRH и РАСАР с помощью ПЦР. Подчеркнут экзон, соответствующие сплайсоформе I.

Основываясь на известной интрон-экзонной организации гена соматолиберина курицы (рис. 1), были сконструированы две пары праймеров SLN1-SLN2 и SLN3-SLN4. Праймеры позволяли получить ген соматолиберина, кодирующий полноразмерный зрелый гормон без пропептида и секреторного лидера, соответствующий сплайсоформе I первичного транскрипта («длинная» сплайсоформа, состоящая из 46 а.о.).

С помощью пары праймеров SLN1+SLN2 на матрице геномной ДНК курицы был получен продукт размером 103 п.н., соответствующий II экзону гена соматолиберина, а помощью пары праймеров SLN3+SLN4 - продукт размером 238 п.н., соответствующий III экзону того же гена. На 5'-конец праймера SLN3 была введена последовательность из 20 нуклеотидов, комплементарная праймеру SLN2, что позволяло продуктам ПЦР, полученных с использованием праймеров SLN2 и SLN3 взаимно отжигаться друг с другом. Кроме того, в составе праймеров SLN2 и SLN3 была введена транзиция С/Т, не вызывающая аминокислотных замен, но позволяющая нарушить сайт рестриктазы Ball (TGGCCA).

Продукты ПЦР были очищены элюцией из агарозного геля, объединены и использованы в качестве матрицы для проведения ПЦР с праймерами SLN1+SLN4. В результате был получен продукт размером 321 п.н. После

элюции из агарозного геля он был обработан рестриктазами ВатШ и Sali и клонирован в вектор pQE30 (Qiagen), предварительно расщепленный по сайтам ВатШ и Sali. В итоге была отобрана конструкция pQE-SLNl, содержащая ген полноразмерного зрелого соматолиберина.

EcoRI

|GAATTClATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCAC

MRGSHHHHHH

BamHI

¡ggätcc|cacgccgatgggatcttcagcaaagcctacaggaaa.ctcctgggccagctg

G_S H ADGI FSKAYRKLLGQL

gg|ggatcc]CACGCCGATGGGATCTTCAGC Праймер SLN1

tccgcaagaaattacctgcactccctgatggcca&gcgggtcgggggtgccagcagc

~S Ä R N Y L H S L M Ä К R V G G Ä S S~

Sall Pstl Hindlll

ggcctgggggacgaggcggaaccgctcagcta|gtcgäc|ctgcagccaagcttaat

glgdeaepls

CGAGGCGGAACCGCTCAGCTA|gtcgac]cc Праймер SLN102

Рисунок 2. Последовательность гена пептидного гормона соматолиберина курицы в составе конструкции pQE-SLN-Chl. показаны сайты клонирования ВатШ и Sali, подчеркнуты - нуклеотиды кДНК пептида GHRH, жирным-подчеркнутым шрифтом - стартовый и стоп-кодоны искусственного гена. В составе олигонуклеотидных праймеров ПРОПИСНЫМИ БУКВАМИ показаны нуклеотиды, соответствующие последовательности гена соматолиберина, строчными - дополнительные нуклеотиды, необходимые для введения сайтов клонирования.

Эта конструкция послужила в качестве исходной для получения искусственных генов, кодирующих производные предшественника соматолиберина - пептиды GHRH и РАСАР. С этой целью на матрице pQE-SLN1 был проведен ПЦР с парймерами SLN1/SLN102 (размер продукта 156 п.н.) и праймерами SLN101/SLN4 (размер продукта 179 п.н.). После элюции из агарозного геля эти продукты были обработаны рестриктазами ВатШ и Sali и клонированы в вектор pQE30 (Qiagen), предварительно расщепленный по сайтам ВатШ и Sali. В итоге были отобраны конструкции pQE-SLN-Chl, содержащая ген пептида GHRH (рис. 2), и pQE-SLN- РАСАР, содержащая ген пептида РАСАР (рис. 3).

EcoRI

|gaattc)attaaagaggagaaattaactatgagaggatcgcatcaccatcaccatcac

MRGSHHHHHH

BamHI

|ggatcc|cacatagacggcatcttcacggacagctacagccgctaccggaaacaaatg

GHRH Рамками

СЗН1ВС1РТОЗУЗКУКК0М дддда^сСАСАТАСАССССАТСТТСАСС Праймер ЗЬЫ101

бстстсаАваААтдсттлесеессбтсствебСАаалббТАТАдасддАбАбттАдд

hVKKYLAAVLGKKYKQRVK

АДСаАДбеЛС6ССбабТД6С6ТДТТТ5ТД66АТСабСДАССеССССТ0ССеТСС6ТА|СТС6АС|

ИКСЯКУАУЬ " -

Праймер БЬМ СААСССССССТССССТбСбТАСТСдассс Рисунок 3. Последовательность конструкции рРЕ-БЬИ-РАСАР, предназначенной для экспрессии искусственного гена, кодирующего гормон РАСАР курицы в изолированном состоянии. [Рамками| показаны сайты ВатШ и

Sali, использованные для клонирования, подчеркнут- клонированный фрагмент генома курицы (РАСАР), жирным-подчеркнутым шрифтом - элементы контроля трансляции искусственного гена. В последовательностях олигонуклеотидов ПРОПИСНЫМИ БУКВАМИ отмечены позиции, комплементарные мишени в геноме курицы, строчными - искусственно вводимые позиции, необходимые для обеспечения сборки и эксплуатации конструкции.

EcoRI

|gaattc|attaaagaggagaaattaactatgagaggatcgcatcaccatcaccatcah

mrgshhhhhh

BamHI

IggatccItatgcagatgccatcttcaccaacagctaccggaaggtgctgggccagctg

gsyadai ftnsyrkvlgql ggggatcctatgcagatgccatcttcac Праймер SLN-Hl

tccgcccgcaagctgctccaggacrtcatgrgcaggcagcagggata)GTCGACjCTGC

sarkllqdimsrqqg

Праймер SLN-H2 TCATGAGCAGGCAGCAGGGATA|gtcgic|cc Рисунок 4. Схема конструкции pQE-SLN-Lel, предназначенной для экспрессии в Е. coli и биосинтеза GHRH свиньи. |Рамками| показаны сайты ВатШ и Sali,

использованные для клонирования, подчеркнут - клонированный фрагмент генома курицы (РАСАР), жирным-подчеркнутым шрифтом - элементы контроля трансляции искусственного гена. В последовательностях олигонуклеотидов ПРОПИСНЫМИ БУКВАМИ отмечены позиции, комплементарные мишени в геноме курицы, строчными - искусственно вводимые позиции, необходимые для обеспечения сборки и эксплуатации конструкции.

Помимо генов ОШШ и РАСАР курицы для использования в экспериментах был получен продуцент ОШШ свиньи. Он был подвергнут биологическому тестированию параллельно с производными соматолиберина курицы, что

благодаря возможности парных и множественного сравнения результатов увеличило достоверность выводов относительно их биологического эффекта при пероральной доставке.

В современной литературе нет данных последовательности гена GHRH/PACAP свиньи. Однако, на основании опубликованных данных определения последовательности деградацией по Эдману ранее была установлена аминокислотная последовательность GHRH свиньи Сопоставление данных аминокислотного секвенирования с последовательностью геномного гена соматолиберина человека позволило установить полную идентичность их белковых продуктов. Таким образом, экспрессия ген человеческого происхождения обеспечивала возможность синтеза GHRH свиньи.

С этой целью на матрице геномной ДНК человека была проведена ПЦР с парймерами SLN-H1 и SLN-H2, в результате чего образовался продукт размером 112 п.н. После элюции из агарозного геля продукт ПЦР был обработан рестриктазами ВатШ и Sali и клонирован в вектор pQE30 (Qiagen), предварительно расщепленный по сайтам ВатШ и Sali. В итоге была получена конструкция pQE-SLN-Lel, содержащая ген пептида GHRH свиньи (рис. 4).

Полученные конструкции pQE-SLN-Chl, pQE-SLN-PACAP и pQE-SLN-Lel были использованы для экспрессии в лабораторных условиях с целью препаративной наработки соматолиберина в виде биомассы Е. coli.

Рекомбинантные штаммы получали путем трансформации плазмидной ДНК, проверяли выделением и рестрикционным картированием плазмидной ДНК и в дальнейшем поддерживали на чашках Петри с агаризованной средой или в жидкой среде LB (10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl), содержащей 100 мкг/мл ампициллина, при 37°С. При поддержании на плотной среде пересев проводится не реже 1 раза в неделю. Для получения биомассы штаммы культивировали в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих по 50 мл среды, в течение 14-16 часов при интенсивной аэрации (250 об/мин). Полученную таким образом биомассу собирали низкоскоростным центрифугированием, промывали физиологическим раствором (150 мМ NaCl) и суспендировали в минимальном объеме физиологического раствора с целью создания концентрации бактериальных клеток не ниже Ю10 кое/мл.

Оптимизация структуры гена соматолиберина для экспрессии в бактериях. Разработка системы измерения уровня накопления в бактериальных культурах и анаболического эффекта производных соматолиберина in vivo

Первой задачей настоящей работы являлось создание производных генов соматолиберина свиньи и курицы, кодирующих зрелую последовательность GHRH («длинная» сплайсоформа, состоящая из 46 а.о.) и РАСАР, на основе которых были созданы конструкции, обеспечивающие экспрессию в клетках

E. coli. Биомасса этих штаммов порознь и в смеси друг с другом исследовалась на способность ускорять рост модельных животных. Было получено и испытано восемь рекомбинантных штаммов Е. coli. Штаммы получены путем введения четырех экспрессионных конструкций, включая интактный вектор pQE30, (табл. 1) в два различных базовых штамма Е. coli - C41(DE3) и TG1.

Таблица 1. Экспрессионные конструкции, предназначенные для продукции

№ Описание рекомбинантного продукта Название конструкции

1. Соматолиберин свиньи j>QE-SLN-Lel

2. Соматолиберин курицы pQE-SLN-Chl

3. Аденилат-циклаза-активирующий пептид курицы pQE-SLN-PACAP

4. Интактный вектор PQE30

Качественное подтверждение факта экспрессии введенных генов в рекомбинантных штаммах проводили с помощью электрофоретического анализа. Из состава биомассы из грубого клеточного экстракта каждой культуры отбирали по 100 мкл и осаждали клетки центрифугированием при 14000 g в течение 1 мин. Осадок клеток солюбилизировали, добавляя к нему по 30 мкл буфера Лэммли (без добавления мочевины), и прогревая при 99°С в течение 5 мин. Затем анализировали состав солюбилизированных белков биомассы с помощью денатурирующего БОБ-электрофореза в 15% ПААГ (рис.

5).__________1

ЩИНий

mw, коа

-116.0

I- ; ,4 ■■....'

-—-68.2

«ма — 45 0

. лк^йвї — gg 0

г., - і —- 25.0

. i|KfiMj|ji|< ... 4

і

12% ins-glyane SOS-PAGE

GHRH (7 )кДа

Рисунок 5. Анализ продуктов экспрессии конструкции pQE-SLN-Lel в клетках Е. coli C41(DE3) и TG1 методом электрофореза в денатурирующих условиях в 12,5% ПААГ с последующей окраской Кумасси R-250. В качестве отрицательного контроля использован нерекомбинантный вектор pQE30. На дорожки геля нанесена солюбилизированная суммарная биомасса штаммов (1) C41(DE3, pQE30), (2) TGl(pQE30), (3) C41(DE3, pQE-SLN-Lel), (4) TGl(pQE-SLN-Lel).

Биологические испытания на модели мышей опытного образца бактериального препарата на основе рекомбинантных штаммов Е. coli TGI и Е. coli C41(DE3), несущего ген соматолиберина

Для проведения предварительных токсикологических испытаний каждого штамма выделялась выборка из 40 мышат-отъемышей возрастом 4 недели, которая разбивалась на две подвыборки. Подвыборка 1 получала пробиотический препарат в дозировке 107 кое в сутки. В качестве контрольной группы выступала выборка из 10 мышей, не получающая пробиотика. Общая длительность эксперимента составила 20 дней.

Полученные результаты свидетельствовали о негативном влиянии реципиентного штамма TG1 на выживаемость и скорость привеса экспериментальных животных. Этот эффект наблюдается и в случае контрольного штамма, несущего нерекомбинантный вектор pQE30. Таким образом, результаты биотестов, полученные на модели штамма TG1, не отражают физиологического эффекта соматолиберина, находящегося внутри клеток рекомбинантного продуцента.

Напротив, штамм Е. coli C41(DE3) сам по себе не оказывал существенного влияния на скорость роста мышей в пределах использованных концентраций клеток модельного пробиотика (10б-10 кое в сутки). С учетом этого в дальнейших испытания использовали только рекомбинантные производные штамма Е. coli C41(DE3).

Биологические испытания анаболического эффекта бактериальных препаратов проводились на 80 белых беспородных мышах возрастом 3-4 недели. Мыши содержались на полноценном белково-витаминном корме в стандартных условиях. Были сформированы 4 группы по 10 мышей в каждой. Каждое животное в течение всего эксперимента один раз в сутки в составе корма получало бактериальный препарат в дозировке 106 или 107 кое, содержащий следующие белковые продукты: 1) GHRH_le (GHRH свиньи), 2) GHRH_ch(GHRH курицы), 3) Е. coli C41(DE3, pQE30), не содержащие рекомбинантного продукта, 4) контрольная группа, не получавшая препарата. Взвешивание каждой выборки животных проводилось ежедневно в одно и то же время.

Наиболее выраженная динамика изменения массы мышат в течение периода эксперимента установлена в группе GHRHle, в которой мыши с кормом получали рекомбинантный штамм Е. coli, продуцирую щийСТГОН свиньи. При этом на 10 и 20 сутки эксперимента отмечается значимое увеличение массы мышей в данной группе по сравнению со значениями в группах GHRH_ch (GHRH куриный), pQE (вектор pQE 30 без вставки) и контрольной. На (рис. 6) показана динамика изменения массы тела мышат при

получении бактериальных препаратов на основе рекомбинантных производных Е. coli C41(DE3).

12

О

2 и

pQE30

Hj—без Нробиотика

5

ю сутки 15

20

Рисунок 6. Динамика изменения массы тела мышат, получающих с кормом бактериальные препараты на основе рекомбинантных Е. coli, несущих конструкции pQE-SLN_Le, pQE30, и контрольная группа, не получавшая препарата.

Бактериальные препараты, содержащие GHRH курицы, а также не содержащие рекомбинантных продуктов, значимо не отличались по влиянию на динамику массы мышей от показателей контрольной группы, где мыши не получали при кормлении бактериального препарата. Полученные результаты свидетельствуют о возможности достижения анаболического эффекта при пероральном введении мышам гормона GHRH свиньи в составе бактериального препарата. При этом отмечается выраженная положительная динамика массы модельных животных при использовании рекомбинантных штаммов. Это позволило предполагать, что проведение дальнейших исследований по конструированию бациллярных продуцентов соматолиберина и пероральной доставке его свиньям в составе бактериальных препаратов является целесообразным. Предложенная в настоящей работе мышиная модель в дальнейшем была использована для оптимизации дозы бактериальной биомассы, перорально доставляемой поросятам.

Разработка интегративной генетической системы для экспрессии производных гена соматолиберина свиньи в клетках пробиотического штамма В. licheniformis В-4161

В литературе описаны способы создания рекомбинантных продуцентов на базе бацилл, например, интерферона а человека. При этом использовались автономно реплицирующиеся плазмидные векторы, несущие целевой ген и ген антибиотикорезистентности. Такая конструкция обеспечивает возможность продукции целевого белка при поддержании бациллярной культуры в стерильных условиях в присутствии антибиотической селекции. Однако за счет низкой репликативной стабильности плазмида быстро утрачивается при культивировании штамма в отсутствии селекции антибиотиком. Плазмидный вектор способен легко переноситься в клетки широкого круга грам-положительных микроорганизмов, в том числе, представителей резидентной микрофлоры кишечника человека и животных. Таким образом, в виду низкой стабильности и биологической опасности штамм оказывается не пригоден для производства пробиотических препаратов зооветеринарного назначения.

Xhol

CTCGAG1CTTGGATACGACATGTCCGATGGGGCCCGTGCTTGTACATAAATCATCTATTCAGGAGCCAGAGCGCCTCAAGGTTGAAACAAGAGTC ACGGCGAGCTGCGCCAATCCGGTTCGGCAAGCGATATGATCTTTTCCATTCCGGAATTAATTGAAACCCTCTCAAAGGGGATGACGCTTGAAGC GGCGACATTATTGCCACCGGTACGCCGTCTGGTGTCGGCAAGGGGTTTACGCCTCCAAAATTCTTGCGGTCAGGTGACAAAATTGATATTACAA TTGATCCGATCGGAACGCTGTCAAACCAAATTGGCTGAATAAAACTGGAGGGCGGACCCGGACCCGCCCGTTTTTTCTGATAATCATCTTTGTG ACAGAGGACAAGTTCATGGTACTATAAGTGGGGTAATTTATCTGATAGGGGGAACATATATGACACACCTACATATTACGACATGGGTGGTAGC GCTGATTCTGCTTTTCGTCAGCTACTCGCTGTATTCGTCAGGAAGTGCAAAGGGCGCAAAAATCACTCATATGATTCTGCGGTTATTCTATATC CTTATTATTTTGACAGGAGCTGAGCTGTTTGTCCGTTTCGCCAACTGGAACGGAGAATACGCCGGCAAAATGATTCTGGGCATTATCACCATCG GCCTGATGGAAATGCTCCTCATCCGCAAGAAAAAAGAAAAATCAACAGGAGGCCTGTGGGTCGGCTTCGTCATTGTCCTTTTGCTGACAGTGCT GCTCGGrCTGCATrTGCCAATTGGTTTTCAATTGTTTTAATAGAAAAACCTATGAACCCGGCTCTTTGATAGAGCTGGTTTTTTTTATATTTAT

Xbal

CCCCTCATATTCCAAATCATTTAAAATAACCTTAAAATTCCCTGTAAGCGGTATCTCGTCCTATGAAATTATGATACCT^CTAGAlAATAATTTT

SD Ndel E-peptide ECORI

GTTTAACTTTAAGAAGCASATATaIcÄT ATG ISTT TTG TTT GTT TAA CTAGCljGÄÄT TCftTTAAAgAGCAgAAATTAACT ATg AGA И V W F V Stop M R

GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC |GGA TCC [TAT GCA GAT GCC АТС TTC ACC AAC AGC TAC CGG AAG GTG GSHHHHHHGSYADAI FTNSYRKV

Sail PstI

CTG GGC CAG CTG TCC GCC CGC AAG CTG CTC CAG GAC АТС ATG AGC AGG CAG CAG GGA TA|g TCGAC|CTGCAG LGQLSARKLLQDIMSRQQG stop

Рисунок 7. Плазмидная конструкция pWpr-le для экспрессии в бациллах: последовательность экспрессионной кассеты. Условные обозначения: подчеркнут промотор гена WprA; |рамками| выделены последовательности ключевых рестриктных сайтов, использованных при конструировании; жирным подчеркнутым шрифтом выделены элементы контроля трансляции: последовательности Шайн-Дельгарно (SD), стартовые и стоп-кодоны. Указана трансляция мини-гена устойчивости к эритромицину (E-пептид) и гормона GHRH свиньи с искусственно добавленными на N-конце 11 а.о.

В рамках нашей работы была создана принципиально новая векторная система для экспрессии гена релизинг фактора гормона роста человека/свиньи в бактериях, обладающей высокой стабильностью при получении бактериального препарата пробиотического назначения в промышленных условиях и его пероральной доставки животным. Вектор для введения в хромосому бацилл состоял из следующих компонентов (рис. 7):

1. Промотор гена WprA (1000 п.н.). Ген wprA кодирует субтилизиноподобную протеиназу, прочно связанную с клеточной стенкой (CWBP). Использование нуклеотидной последовательности, соответствующей последовательности промотора данного гена предполагает интеграцию целевой конструкции (pWpr-le) в бациллярный геном. При этом, выключение гена WprA, происходящее в результате рекомбинации, не приводит к нарушению жизнедеятельности клетки, а активность промотора гена wprA обеспечивает синтез целевого белка (GHRH_le) в цитоплазму.

2. Мини ген пентапептида (Е-пептид) устойчивости к эритромицину (15 п.н.). Использование мини гена Е-пептида позволяет отбирать клоны трансформантов при введении конструкций в клетки. Кроме того, в качестве транскрипционного репортера он позволяет существенно облегчить поиск наиболее продуктивных клонов путем выращивания культур на постепенно повышающихся концентрациях эритромицина и отбора наиболее устойчивых к антибиотику.

3. Последовательность, кодирующая гормон роста релизинг гормон человека (GHRHJe) (100 п.н).

4. Терминатор фага Т5 (изначально находился в составе вектора pQE30).

В ходе эксперимента была получена плазмидная конструкция pWpr-le,

несущая гены Т-пептида и GHRH под контролем промотора WprA. Методом химической трансформации по Спицайзену конструкция вводилась клетки В. licheniformis В-4161, и пользуемого для получения пробиотического препарата Субтилис (ЗАО «Провими», Москва), где интегрировалась в геном.

Схема получения конструкции pWpr-le

1. ПЦР-клонирование кодирующей области зрелой формы соматолиберина свиньи/человека с использованием праймеров ПЦР проводили с использованием праймеров к гену рилизинг фактора гормона роста человека/свиньи:

SLN_H1: GGGGATCCTATGCAGATGCCATCTTCAC

SLN_H2: GGGTCGACTATCCCTGCTGCCTGCTCATGA

Размер ПЦР — продукта - 105 п.н. В качестве матрицы использовалась геномная ДНК человека (ЗАО «Синтол»).

2. Обработка продукта ПЦР 1 эндонуклеазами рестрикции ВатШ и Бай, клонирование в вектор рОЕЗО (С>1а§еп), расщепленный по сайтам ВатШ и Бай.

3. Получение ДНК-дуплекса искусственного мини-гена устойчивости к эритромицину путем взаимного комплементарного отжига синетических праймеров Еш2 и Ет1.1 в эквимолярном соотношении с последующей достройкой полимеразой РЙ1 или обратной транскриптазой Ми-МЬУ (Рготе§а).

4. Обработка ДНК-дуплекса эндонуклеазой рестрикции Ше1 с последующим клонированием в вектор рЕТ23а, рЕТ23Ь или рЕТ23с, обработанный эндонуклеазами рестрикции Ше1 и Ecll36.II.

5. ПЦР-амплификация на матрице геномной ДНК В. йпЫИи А173 фрагмента, содержащего промотор гена \vprA с праймерами Wpr41 и Wpг42 (размер продукта 935 п.н.).

6. Обработка продукта ПЦР 3 эндонуклеазами рестрикции BgПI и ХЬа\, лигирование с плазмидной ДНК конструкции 2 на базе вектора рЕТ23, несущей мини-ген устойчивости к эритромицину.

7. Перенос фрагмента ДНК, содержащего промотор гена \vprA и мини-ген устойчивости к эритромицину, из конструкции 6 в конструкцию 2. Для этого проводилась обработка ДНК обеих конструкций эндонуклеазами рестрикции Хко\ и ЕсоШ, препаративная очистка фрагмента конструкции 6 длиной 999 п.н. элюцией из агарозного геля, лигирование очищенного фрагмента с расщепленной и очищенной фенольной экстракцией плазмидной ДНК конструкции 2.

Введение конструкции pWpr-le в геном В. \icheniformis В-4161 проводилось методом химической трансформации по Спицайзену с отбором рекомбинантов на среде Леннокса с добавление эритромицина в концентрации 10 мкг/мл. Для детекции трансгена в геноме трансформантов с помощью ПЦР были использованы следующие пары праймеров. Для получения ПЦР-продукта, включающего последовательность ДНК, соответствующую гену рилизинг фактора гормона роста человека (ОШШ) - БЬМ_Н1 - 81ЛЯ_Н2: БЬЫШ: ОСЮОАТССТАТОСАОАТСКЗСАТСТТСАС БЬЫШ: СООТСОАСТАТСССТССТСССТССТСАТСА, При этом в геноме трансформантов, но не в контрольном реципиентном штамме В. \icheniformis В-4161 был выявлен ПЦР-продукт ожидаемого размера 105 п.н. Необходимо отметить, что в составе конструкции р>^рг-1е целевой ген ОНШ находится в составе искусственного оперона вместе с геном Е-пептида под контролем промотора WprA. Таким образом, наличие у рекомбинантного штамма устойчивости к эритромицину, при выявленной неспособности штамма В. Искет^гт15 В-4161 вырабатывать спонтанную устойчивость к выбранной

концентрации антибиотика, является доказательством факта транскрипции гена СТСШ в клетках бацилл.

Получение опытного образца бактериального препарата рекомбинантного штамма В. ПсИет/огт1$ В-4161, несущего ген соматолиберина

Для получения опытного образца бактериального препарата, предназначенного для биологических испытаний, культивирование В. ИсИет/огт1з проводилось при +37°С на среде Леннокса в колбах Эрленмейера объемом 750 мл в объеме среды 50 мл на колбу. Полученная биомасса была суспендирована в минимальном объеме консервирующего буфера и лиофильно высушена. Для этого к биомассе бацилл, осажденной центрифугированием из 450 мл культуры с содержанием бактерий 109 в мл, добавляли 100 мл физиологического раствора (№С1 9 г/л), 100 мл водного раствора сухого молока (70 г/л). После тщательного суспендирования препарат был расфасован в пенициллиновые флаконы по 5 мл, заморожен при температуре жидкого азота и подвергнут лиофилизации в асептических условиях. В результате в каждом флаконе (разовая доза на 1 голову) находилось 1.5 г пробиотического препарата, содержащего Ю|0коеВ. НсИет/огтхз.

Биологические испытания на модели мышей опытного образца бактериального препарата рекомбинантного штамма В. \icheniformis В-4161, несущего ген соматолиберина

Оценка эффективности полученного препарата проводилась с использованием животной модели мышей-отьемышей (белые беспородные мыши возрастом 4 недели, весом 6-8 г, питавшиеся моченым хлебом, запаренным пшеничным зерном, сухим комбикормом). Ежедневно один раз в сутки в течение 22 дней в утреннее время каждому животному с помощью автоматической пипетки рег <« вводили дозу пробиотика в дозировке 106кое. Взвешивание мышей каждой группы проводили до кормления на 1,2,4, 5, 6, 8, 11, 14, 18 и 22 сутки эксперимента. Результаты эксперимента показали значимое превышение скорости роста животных, получавших пробиотик на основе рекомбинантного штамма, по сравнению с пробиотиком на основе природного штамма В. \icheniformis (Рис. 8).

масса, г.

25

20 15 10 5 0

1 2 4 5 6 8 11 14 18 22 сут.

Рисунок 8. Динамика изменения массы тела мышей, получавших пробиотические бактериальные препараты на основе штаммов В. НсИеі/огтіз

Биологические испытания на модели поросятах-отъемышах опытного образца бактериального препарата рекомбинантного штамма В. ІісИепі/огтіз В-4161, несущего ген соматолиберина

Для проведения испытаний на поросятах-отъемышах использовались клинически здоровые животные породы ландрас двух-месячного возраста, полученные от ОАО «Племзавод им. В.Н. Цветкова». После уравнительного периода по принципу аналогов с учетом живой массы, пола и интенсивности роста были сформированы три группы свиней по 6 голов в каждой с начальной живой массой 18,3-18,5 кг. Кормление свиней проводили 2 раза в сутки (900 и 1600), вволю на протяжении всего опыта согласно нормам кормления (2003). Проводился учёт не съеденных остатков. Животные содержались в клетках группами по три головы, поение проводилось с помощью автопоилок. Поросята ежедневно осматривались ветеринарным врачом, проводились плановые ветеринарные мероприятия (вакцинация против классической чумы свиней, антигельминтная обработка). Опыт продолжался на протяжении двух месяцев до достижения живой массы свиней 54-60 кг и соответствовал периоду доращивания.

Животные получали сбалансированный по составу и питательности комбикорм производства Малоярославецкого комбината хлебопродуктов:

• на протяжении первого месяца опыта - по рецепту №СКК-51-98;

• на протяжении второго месяца по рецепту №СКК-52-126.

1) Первая группа - «контроль», получала основной рацион (ОР).

2) Вторая группа - «исходный штамм», дважды в неделю получала в дополнение к ОР добавку из лиофильно высушенного

—*— Реципиентный штамм Штамм с конструкцией

рЧУрг-1е

Ж—А—А—

пробиотического препарата на основе нерекомбинантного штамма В. licheniformis ВКПМ В 4161 в дозировке 1010 кое/на голову.

3) Третья группа — «рекомбинантный штамм», дважды в неделю получала в дополнение к ОР добавку из лиофильно пробиотического препарата на основе рекомбинантного штамма В. licheniformis ВКПМ В-4161, несущего конструкцию pWpr-le, в дозировке Ю10кое/на голову.

Для равномерного распределения пробиотических препаратов в массе корма их предварительно дробно перемешивали в малых количествах кормосмеси, а затем добавляли полученный порошок к основному рациону. В течение опыта проводили учет потребления комбикормов, его химический состав и расход на единицу прироста. В целях характеристики интенсивности роста и развития подопытных животных провели взвешивание поросят в начале и в конце опыта.

Были изучены основные показатели крови подопытных животных: количество эритроцитов, лейкоцитов, лейкоцитарная формула (5), содержание гемоглобина гемиглобинцианиндым колориметрическим способом (7). Наряду с форменными элементами было изучено: содержание общего кальция, необходимого животным для регулирования реакции крови и тканевой жидкости, возбудимости мышечной и нервной ткани, свертывания крови; содержание неорганического фосфора, который участвует во всех процессах обмена; содержание альбумина, так как эта фракция белков сыворотки крови является наиболее массовой. Важным представлялось оценить влияние вводимых культур на общий иммунный статус животных, для этого были определены показатели неспецифической резистентности: фагоцитарная активность по методу Блинова и бактерицидная активности по Смирновой и Кузьминой, содержание лизоцима по Емельяненко. Изучен уровень мочевины, интегрально отражающий соотношение скоростей биосинтеза и деградации белков, и содержание неэтерифицированных жирных кислот в крови, как показатель характеризующий соотношение процессов липолиза и липогенеза. Все биохимические показатели определялись на биохимическом анализаторе Screen Master LIHD113 (Hospitex Diagnostics, USA) при помощи наборов реагентов: альбумин, кальций, фосфор, железо и хлориды набор производства ЗАО «Диакон-ДС» (Россия), мочевина набор производства ЗАО «А/О Юнимед» (Россия). НЭЖК при помощи набора FA-115, производства Randox (UK).

В конце опыта был произведен контрольный забой животных, по три головы из каждой группы, с последующей обвалкой туш для определения убойных качеств и взятием образцов органов и тканей для физиолого-биохимических исследований. Анализ крови подопытных животных проводился дважды, через месяц после начала опыта и в конце эксперимента,

т.е. через два месяца после начала введения препарата. Результаты исследований крови обобщены в таблицах с 2-й по 5-ю.

Таблица 2. Гематологические показатели поросят на 30-й день опыта Г-критерий в сравнении с контрольной группой - р<0,05

Показатели Группа животных

1 (контроль) 2 (опытная) 3 (опытная)

Гемоглобин, г/л 76,00±0,98 93,86±0,47 85,93±1,50

Количество лейкоцитов, тыс/мкл П,05±0,13 15,2*1,03 15,96±0,06

Количество эритроцитов, млн/мкл 5,75±0,24 5,87±0,16 б,33±0,13

Лейкоцитарная формула, %

Базофилы 2,7 2,5 2,3

Эозинофилы 2,5 3,5 3,0

Нейтрофилы:

Юные - - -

Палочкоядерные 2,7 2,5 2,0

Сегментоядерные 33,2 34,8 32,5

Лимфоциты 55,7 53,7 58,2

Моноциты 3,2 3 2,0

Таблица 3. Гематологические показатели поросят на 60-й день опыта

Показатели Группа животных

1 (контроль) 2 (опытная) 3 (опытная)

Гемоглобин, г/л 133,89±0,15 132,96±0,47 109,99±1,23

Количество лейкоцитов, тыс/мкл 11,05±0,13 9,17±0,42 10,45±0,17

Количество эритроцитов, млн/мкл 6,24±0,47 6,70±0,22 6,60±0Д0

Лейкоцитарная формула, %

Базофилы 1,6 1,5 1,6

Эозинофилы 4 3,4 2,5

Нейтрофилы:

Юные - - -

Палочкоядерные 0,6 0,7 0,7

Сегментоядерные 35,1 35,5 35,6

Лимфоциты 55,6 56,4 57,5

Моноциты 3,1 2,5 2,1

Как видно из таблиц 2 и 3 общие гематологические показатели у животных находились в пределах физиологической нормы для поросят этого возраста как в контрольной, так и в опытных группах. Через месяц после начала использования пробиотических препаратов в крови поросят опытных групп уровень гемоглобина был выше, чем у контрольных животных, но со временем эта разница нивелировалась, и в конце опыта содержание гемоглобина у всех животных было примерно на одном уровне. Так же, на 30-й день эксперимента у животных опытных групп было зафиксировано достоверное повышение количества лимфоцитов, в сравнении с животными контрольной группы. Но к 60-му дню количество лейкоцитов в крови животных опытных групп стало ниже, чем у контрольных животных. Вероятно, первоначальное повышение количества лейкоцитов вызвано неспецифической иммунной реакцией организма на компоненты пробиотического препарата, что описано в литературе применительно к другим пробиотикам на основе бацилл и лактобацилл. Со временем произошла адаптация, и этот показатель пришел в норму. О том, что вводимые пробиотические препараты (как на базе исходного, так и рекомбинантного штаммов) оказали влияние на иммунный статус поросят, говорят и показатели неспецифической резистентности (табл. 4).

Таблица 4. Показатели факторов неспецифической резистентности крови ____поросят_

Показатель На 30-й день опыта На 60-й день опыта

1 группа 2 группа 3 группа 1 группа 2 группа 3 группа

Фагоцитарная активность, % 44,7±1,4 45,5±1,9 40,8±0,8 45,7±1,15 46,1±1,5 47,8±2,2

Фагоцитарный индекс 4,38±0,09 5,50±0,20 5,41 ±0,22 6,40±0,13 5,87±0,36 5,7б±0,14

Бактерицидная активность сыворотки крови,% 43,3±2,6 73,3±1,2 73,3±1,8 36,7±3,2 73,3±1,6 76,6±4,2

Содержание лизоцима в сыворотке крови, мкг/мкл 42,6±1,8 69,9±3,1 73,2±2,1 48,0±2,4 67,6±3,8 71,2±1,41

Как видно из таблицы, в сыворотке крови животных опытных групп значительно возросло содержание лизоцима и общая бактерицидная

активность, в то время как показатели фагоцитоза во всех группах находились примерно на одном уровне.

Таблица 5. Биохимические показатели крови у поросят

Показатель Через 30 дн. Через 60 дн

1 группа 2 группа 3 группа 1 группа 2 группа 3 группа

Альбумин, г/л 37,8±3,8 46,8±4,6 45,4±2,0 44,7±1,7 50,3±1,6 52,9±1,8

Глюкоза, ммоль/л 7,1 ±0,1 7,9±1,1 7,3±0,3 7,1 ±0,3 6,1±0Д 9,7±1,6

Железо, мкмоль/л 27,5±7,1 19,9±3,6 25,4±6,2 18,4±1,4 20,4±1,2 17,3±2,8

Кальций, ммоль/л 3,2±0,2 2,9±0,4 3,2±0,6 3,2±0,2 зд±о,з 3,9±0,3

Фосфор, ммоль/л 0,97±0,2 0,97±0,03 1,1±0,1 1,2±0,4 1,1 ±0,2 1,4±0,8

Хлорццы, ммоль/л 94,3±3,9 97,9±2,1 94,4±5,5 83,6±14,1 59,6±2,3 81,5±5,3

Мочевина, ммоль/л 6,37 8,33±0,49 7,19±0,43 6,24±0,23 9,15±0,7 9Д5±0,5

НЭЖК, ммоль/л - - - 0,54±0,05 0,72±0,11 0,81±0,13

Как видно из таблицы 5, на 30-й день опыта содержание глюкозы в образцах от животных получавших микробную добавку было несколько выше, чем у контрольной группы. Вероятно, это может быть объяснено более высокой интенсивностью метаболизма у поросят под действием пробиотических препаратов и мобилизацией гликогена печени. Образцы крови для исследований в конце опыта были получены при забое поросят. Испуг животных и последующий гормональный всплеск, с закономерным повышением уровня глюкозы в крови, привели к существенному разбросу по этому показателю и, что снижает достоверность соответствующих результатов.

По содержанию в сыворотке крови микроэлементов, таких как железо, фосфор, кальций, являющихся важной составляющей большинства обменных процессов, существенных и достоверных различий выявлено не было, все показатели укладываются в рамки физиологических норм.

Основной интерес представляют содержание мочевины и неэтерифицированных жирных кислот. У поросят получавших микробную добавку содержание мочевины было значительно выше, чем у контрольных

животных. Это говорит о высокой интенсивности метаболизма азотистых соединений, в том числе белков, под влиянием пробиотических бацилл. Повышение содержания НЭЖК в крови животных опытных групп, особенно в третьей, в сравнении с контролем, говорит о мобилизации липидов из депо и использовании их в энергетическом обмене, что является одним из метаболических эффектов СТГ.

Все описанные выше изменения в физиологическом состоянии поросят в совокупности привели к более высокой интенсивности роста животных, получавших микробную добавку. Зоотехнические показатели приведены в таблицах 7 и 6.

Таблица 6. Живая масса, среднесуточные приросты и показатели кормовой __эффективности поросят__

Показатели 1 группа 2 группа 3 группа

Живая масса в начале опыта, кг 18,6±1,6 18,5±1,6 18,7±1,8

Живая масса в конце опыта, кг 58,3 ±5,7 60,2±5,4 62,7±7,5

Прирост живой массы, кг 39,7 41,7 44,0

Среднесуточный прирост, г 558±51 605±49 638±65

В % к контролю 100 108 114

Потреблено корма на 1 гол., кг 149,1 155,6 166,9

Затрачено на 1 кг прироста: корма, кг 3,76 3,73 3,79

Биоконверсия корма в продукцию, г 266 268 263

Как видно из таблицы, наибольшую продуктивность показали животные, получавшие рекомбинантный штамм В. НсИепі/огтІБ, их среднесуточные приросты были на 14% выше, чем у поросят контрольной группы. Так же следует отметить, что затраты корма на 1 кг прироста у всех животных был примерно на одном уровне. Таким образом, можно отметить, что пероральная доставка соматолиберина в составе пробиотического препарата стимулирует потребление корма животными, что вызывает пропорциональное ускорение их роста.

Исследование состава туши свиней при убое их в конце опыта показало (табл. 7), что значительных различий в морфологическом составе туш между подопытными группами не установлено. Убойный выход туш у животных подопытных групп находились в пределах 58,95 - 60,06 %. У свиней опытных групп несколько было выше выход сала.

Таблица 7. Зоотехнические результаты убоя подопытных животных в конце __эксперимента__

Показатели 1 группа 2 группа 3 группа

Живая масса, кг 56,66±7,33 63,00±5,51 63,66±7,81

Масса туши, кг 33,41±4,63 37,77±3,65 38,23±4,46

Убойный выход,% 58,96±0,77 59,95±0,46 60,06±0,21

Вес полутуши, кг 17,24±1,51 19,19±2,00 19,07±1,84

Мяса, кг 10,03±1,35 10,93±1,12 10,77±0,78

% 58,18±0,83 56,96±1,14 56,47±1,74

Сало, кг 4,87±0,88 5,68±0,60 5,73±0,81

% 28,24±1,24 29,00±0,21 30,05±2,01

Кости, кг 2,34±0,27 2,58±0,28 2,57±0,26

% 13,58±0,45 13,44±0,31 13,48±0,07

Мякоть/жир 2,06 1,92 1,88

Мякоть/кости 4,28 4,24 4,19

Как показали результаты проведенного опыта использование рекомбинантных пробиотических штаммов, продуцирующих соматолиберин свиньи, способно повышать продуктивность животных, превосходя по эффективности парентерально доставляемый СТГ. Соматолиберин, являясь пептидным гормоном, эффективен в малых дозах и не накапливается в органах и тканях животного, а так же во внешней среде и, следовательно, является экологически безвредным. Наличие специфического эффекта соматолиберина доказывается тем, что группа животных, получавших пробиотический препарат на основе рекомбинантного штамма В. licheniformis ВКПМ В-4161, несущих конструкцию pWpr-le превосходила по скорости роста не только группу, не получавшую пробиотика, но и группу, получавшую пробиотик на основе нерекомбинантного штамма В. licheniformis ВКПМ В-4161. Среднесуточные привесы поросят получавших добавку из рекомбинантных бацилл оказались на 5% выше, чем в группе с исходным штаммом. Исходя из одинаковых условий содержания и кормления животных, данная разница может быть объяснена только влиянием экспрессии соматолиберина.

Таким образом, впервые удалось показать возможность достижения анаболического эффекта за счет перорального введения рекомбинантного штамма, экспрессирующего ген зрелого соматолиберина (GHRH).

Выводы

1. Созданы генетические конструкции для биосинтеза производных соматолиберина курицы (GHRH и РАСАР) и свиньи (GHRH) в клетках Е. coli. Методом электрофореза белков показана их высокоэффективная экспрессия.

2. С использованием рекомбинантных штаммов Е. coli, экспрессирующих производные соматолиберина, показана возможность достижения анаболического эффекта GHRH свиньи при пероральной доставке мышам-отьёмышам при условии выбора реципиентного штамма, не проявляющего токсигенности.

3. Получен рекомбинантный пробиотический штамм В. licheniformis, несущий интегрированную в геном конструкцию с геном GHRH свиньи. Экспрессия искусственного оперона «ген Е-пептида - ген GHRH» доказана путем обнаружения у рекомбинантного штамма устойчивости к эритромицину.

4. Показан анаболический эффект пробиотического препарата на основе рекомбинантного штамма В. licheniformis ВКПМ B-4161(pWpr-le) в отношении поросят-отьёмышей.

Список публикаций с основными результатами работы:

1. Белякова A.B., Гра O.A., Зылькова М.В., Эпова Е.Ю., Плаксина А.Г., Зарипова P.C., Хасанова А.Р., Филимонова H.A., Елагина Е.М., Смирнова A.B., Казеева Т.Н., Шевелев А.Б, Алешин В.В. Рекомбинантный продуцент соматолиберина курицы на основе бацилл. // Фундаментальные исследования - 2012. том №5 (2). - с. 401406. (доля личного участия - 80%)

2. Белякова A.B., Зылькова М.В., Гусева М.А., Гра O.A., Осипенкова О.В., Филимонова H.A., Елагина Е.М., Кузьмин П.А., Зарипова P.C., Шевелев А.Б., Рекомбинантный продуцент соматолиберина свиньи на основе дрожжей Yarrowia lipolytica. // Проблемы биологии продуктивных животных — 2012. - том №2. - с. 5-12. (доля личного участия - 60%)

3. Белякова A.B., Плаксина А.Г., Леонович O.A., Тремасов М.Я., Маракасова Е.С., Осипенкова О.В., Алёшин В.В., Папуниди К.Х., Барышникова A.C., Терехина A.C., Шевелев А.Б. Анаболический эффект соматолиберина при пероральной доставке в составе бактериальной биомассы. // Ветеринарный врач - 2011. том №6. - с. 32-34. (доля личного участия - 80%)

4. Белякова A.B., Некипелова Т.Д., Лыго О.Н., Ходот E.H., Кузьмин В.А., Шахматов В.В., Варгин В.В., Зылькова М.В. Спектрально-кинетические характеристики триплетного состояния 7,7,9-триметил-6,7-дигидрофуро[3,2- f] хинолина. // Химия высоких энергий - 2012. -том 46, №3. - с. 211-215. (доля личного участия - 40%)

5. Belyakova A., Epova Е., Guseva M., Kovalyov L., Isakova E., Deryabina Y.,

Zylkova M., Shevelev A. Identification of proteins involved in pH adaptation in extremophile yeast Yarrowia lipolytics // "Proteomics applications in biology. Eds. Heazlewood J.L.& Petzold C.J. Intech, Rijeka, Jan. - 2012. Pt 4, Capt. 10, P. 209-225. (доля личного участия - 20%) 6. Belyakova A.V., Poltronieri P., D'Urso O.F., Shevelev A.B. Book "Lactobacillus: classification, uses and health implications". Eds. A.I. Perez-Campos & A. Leon-Mena, www.novapublishers.com, // Nova Science Publishers, Hauppauge NY, USA, ISSNB 978-1-62081-151-1, Chpt. X, p 241256. (доля личного участия - 40%)

Подписано к печати 17.05.2013 Объем 1,5 пл. Заказ ЛЬ 15 Тираж 100 экз.

ГУТ.МПГУ

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белякова, Алла Владимировна, Казань

Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»

0420135922?

На правах ршшіиси

Белякова Алла Владимировна

Разработка метода получения рекомбинантного соматолиберина и его применение для доставки животным с помощью пробиотических бацилл

03.01.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, Шевелев Алексей Борисович

Казань-2013

Содержание

1. Введение 6

2. Обзор литературы 10 2.1 Соматолиберин и его гомологи в системе пептидных факторов 10 регуляции роста

2.1.1 Эволюция первичной структуры соматолиберина (ОНБШ) 14

2.1.2 Открытие гипофизарного аденилатциклаза-активирующего 14 полипептида (РАСАР)

2.1.3 Вторичная структура гипофизарного аденилатдиклаза- 16 активирующего полипептида (РАСАР)

2.1.4 Протеолитическая активация гипофизарного аденилатциклаза- 16 активирующего полипептида (РАСАР)

2.1.5 Геномная организация гена РАСАР 20

2.1.6 Филогенетические аспекты эволюции гипофизарного 22 аденилатциклаза-активирующего полипептида (РАСАР)

2.1.7 Биологическое и фармакологическое действие гипофизарного 24 аденилатциклаза-активирующего полипептида (РАСАР)

2.1.8 Эволюция структуры предшественников ОШШ и РАСАР 27

2.1.9 Эволюционные аспекты распределения нейронов, 31 продуцирующих ОНЕШ и РАСАР, в головном мозге

2.1.10 ОШ1Н и РАСАР как факторы регуляции секреции 33 соматотропина

2.1.11 Заключение по литературному обзору 35

3. Материалы и методы

3.1 Материалы 37

3.1.1. Стандартные растворы 37

3.1.2. Ферменты обмена ДНК 37

3.1.3. Среды для выращивания бактерий 3 7

3.1.4. Штаммы и векторы 3 8 3.2. Методы 38

3.2.1. Очистка плазмидной ДНК методом щелочного лизиса 3 8

3.2.2. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) 39

3.2.3. Очистка ДНК методом препаративного электрофореза с 40 последующей элюцией из агарозного геля

3.2.4 Денатурирующий электрофорез по Лэммли 41

3.2.5. Выявление соматолиберина с помощью иммуноблоттинга 41

3.2.6. Трансформация клеток Е. соИ 42

3.2.7. Получение бактериальных препаратов рекомбинантных 43 штаммов Е. соН

3.2.8. Химическая трансформация бацилл 43 3.2.9 Ферментация рекомбинантных штаммов, производных 44 В. Искет/огт18 В-4161 - продуцентов производных сотматолиберина

3.2.10 Выделение геномной ДНК из клеток В. licheniformis 45

3.2.11 Генно-инженерное конструирование 45

3.2.12 Организация эксперимента по биологическому тестированию 50 рекомбинантных пробиотических препаратов на мышах

3.2.13 Организация эксперимента по биологическому тестированию 51 рекомбинантных пробиотических препаратов на поросятах-отъёмышах

4 Результаты исследований 52

4.1 Оптимизация структуры гена соматолиберина для экспрессии 52 в бактериях. Разработка системы измерения уровня накопления в бактериальных культурах и анаболического эффекта производных соматолиберина in vivo

4.1.1 Биологические испытания на модели мышей опытного образца 54 бактериального препарата рекомбинантного штамма Е. coli TG1 и

Е. coli C41(DE3), несущего ген соматолиберина

4.1.2 Разработка интегративной генетической системы для экспрессии 58 производных гена соматолиберина свиньи в клетках пробиотического штамма В. licheniformis В-4161

4.1.3 Мини-ген Е-пептида - новая генетическая детерминанта 60 устойчивости к эритромицину, не кодирующая фермента

4.1.4 Получение опытного образца бактериального препарата 64 рекомбинантного штамма Я licheniformis В-4161, несущего ген соматолиберина

4.1.5 Биологические испытания на модели мышей опытного образца 64 бактериального препарата рекомбинантного штамма В. licheniformis В-4161, несущего ген соматолиберина

4.1.6 Биологические испытания на модели поросят-отъемышей 65 опытного образца бактериального препарата рекомбинантного

штамма В. licheniformis В-4161, несущего ген соматолиберина 5. Обсуждение результатов. Перспективы 73

использования пробиотических препаратов на основе спорообразующих бактерий.

5.1 Понятие пробиотиков и виды бактерий, лежащие в их основе 74

5.2 Таксономия спорообразующих бактерий, используемых для 75 получения пробиотиков

5.3 Морфологические и биохимические особенности спор 78

5.4 Герминация и образование спор в кишечнике 81

5.5 Выживание и герминация спор в условиях фагоцитоза 83

5.6 Взаимодействие Bacillus subtilis с клетками кишечника и 85 иммунной системы

5.7 Коммерческие пробиотические препараты на основе 89 спорообразующих бактерий

5.8 Бактерицидные факторы бацилл 91

5.9 Исследования эффективности бациллярных пробиотиков на 93 животных

5.10 Влияние бациллярных пробиотиков на иммунитет реципиента 95

5.11 Использование пробиотиков для лечения и профилактики 96 заболеваний человека

5.12 Механизмы действия пробиотиков 96

5.13 Проблемы биологической безопасности пробиотиков на основе 99 спорообразующих бактерий

5.13.1 Риски пищевых отравлений, связанные с бациллами 99

5.13.2 Риски развития инфекций от применения бацилл 101

5.13.3 Устойчивость к антибиотикам и генетическая модификация 101 штаммов

5.13.4 Неточное указание состава препарата 102

5.14 Регламентация безопасного использования спорообразующих 102 бактерий при изготовлении пробиотических препаратов

5.15 Пробиотические препараты на основе спорообразующих 107 бактерий в качестве вектора для доставки рекомбинантных белковых продуктов в организм животных

5.16 Специфический иммунный ответ на споры 108

5.17 Иммунный ответ на рекомбинантные штаммы В. subtilis 109

5.18 Преспективы практического применения 112 рекомбинантныхпробиотических штаммов В. subtilis, продуцирующих соматолиберин свиньи

6. Выводы 114

7. Литература

а.о. Аминокислотный остаток

АКТГ Адренокортикотропный гормон

ВКПМ Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов

(ГосНИИгенетика, г. Москва) ЖКТ Желудочно-кишечный тракт

кДНК ДНК-копия РНК (получена в результате обратной транскрипции)

ОКИ острая кишечная инфекция

ПЦР Полимеразная цепная реакция

СТГ Стоматотропный гормон

цАМФ Циклический аденозинмонофосфат

ЦМВЭИ Центр медико-ветеринарных экологических исследований

ЦНС Центральная нервная система

CSF фактор компетентности и спорообразования

GALT клетки лимфатической ткани кишечника

GHF Элемент ДНК, ответственный за связывание трансактивирующего

фактора 1 - элемент передачи сигнала от связывания соматотропного гормона с рецептором GHRH Релизинг-фактор гормона роста (соматолиберин)

GIP желудочный ингибиторный пептид

GLP глюкагон-подобный пептид

IGF Инсулиноподобный фактор роста

РАСАР Аденилат-циклаза активирующий пептид

РАМ пептидилглицин-амидирующая монооксигеназа

PC Прогормонконвертаза

PRP Пептид семейства секретина с неизвестной функцией,

синтезирующийся в составе общего предшественника с GHRH млекопитающих

QSM Механизм физиологической реакции бактерий на плотность

собственной популяции (Quorum sensing) SCAN Научный комитет по питанию животных (Scientific Committee on

Animal Nutrition) SP секреторный лидер

TS старт транскрипции

VIP Вазоинтестинальный пептид

WprA Иммобилизованная субтилизиноподобная протеаза клеточной стенки

бацилл

1. Введение

Актуальность проблемы

Бактериальные препараты на основе рекомбинантных пробиотических штаммов, предназначенные для пероральной доставки пептидных стимуляторов роста в организм сельскохозяйственных животных, могут рассматриваться как эффективные и безопасные средства увеличения привесов. Одним из наиболее перспективных биоактивных пептидов для пероральной доставки является соматолиберин (GHRH). Он обладает высокой устойчивостью к протеолизу и характеризуется низкими по сравнению с соматотропином (СТГ) и инсулиноподобным фактором роста (IGF) действующими концентрациями, что позволяет ожидать проявления его физиологического эффекта при пероральном введении, хотя при этом проникновение пептида через энтеральный барьер в такневую жидкость происходит с незначительной эффективностью. Использование соматолиберина для решения практических задач в области зоотехнии в том числе, за счет синтезирующих его рекомбинантных штаммов, ограничивается фрагментарностью представлений о сигнальной роли этого пептидного гормона в регуляции роста и развитии организма, его фармакокинетике и клеточных мишенях. Есть данные о том, что в естественных условиях эффект соматолиберина дополняется действием его агониста РАСАР (аденилатциклаза-активирующий пептид). В отличие от других позвоночных - птиц, рептилий и рыб, у млекопитающих GHRH и РАСАР кодируются независимыми геномными генами (апоморфное состояние). В плезиоморфном варианте оба пептида транслируются в виде единого белка-предшественника с последующим процессингом, в результате которого в аппарате Гольджи клеток аденогипофиза образуются два отдельных физиологически активных пептида. Во всех опубликованных работах по исследованию биологического действия GHRH и РАСАР эти пептиды были получены путём химического синтеза. В результате задача изучения сочетанного физиологического действия GHRH и РАСАР не была поставлена и не решалась. Изучение естественной сигнальной функции соматолиберина осложняется тем, что его мРНК подвергается альтернативному сплайсингу. У птиц GHRH может являться продуктом одной из трех возможных сплайсоформ.

Таким образом, разработка методов применения соматолиберина в комплексе с РАСАР или отдельно от него, в том числе, в варианте пероральной доставки представляется актуальной задачей. Однако, в литературе полностью отсутствуют данные о фармакокинетике производных соматолиберина в случае его энтерального введения, ни

с точки зрения возможности достижения анаболического эффекта, ни с точки зрения нежелательных побочных эффектов.

Практическое использование рекомбинантных штаммов бацилл, накапливающих в цитоплазме соматолиберин, в нестерильных условиях кишечника животных осложняется несовершенством экспрессионных систем поддержания чужеродных генов в этих микроорганизмах. Наиболее популярные автономно реплицирующиеся векторы характеризуются структурной нестабильностью, легко утрачиваются при репликации in vivo, вызывая тем самым неустойчивость уровня синтеза целевого продукта в различных условиях внешней среды. Кроме того, автономные генетические элементы, способные к горизонтальному переносу в клетки эндогенной микрофлоры животных, влючая патогенную, снижает уровень биологической безопасности штаммов in vivo. Наконец, системы контроля секреции, созревания и деградации гетерологичных белков в культурах бацилл изучены недостаточно, что нередко приводит к денатурации и деградации синтезируемых продуктов. Этому способствует высокая собственная протеолитическая активность бацилл. Таким образом, создание генетической конструкции для пероральной доставки соматолиберина с помощью пробиотических штаммов потребовало решения целого ряда вопросов, связанных как с физиологической регуляцией действия соматолиберина, так и с разработкой систем экспрессии генов в клетках бацилл.

Цель.

Целью настоящего исследования явилось доказательство возможности пероральной доставки соматолиберина с помощью живых бактериальных препаратов на основе рекомбинантных штаммов бацилл, несущих оригинальную интегративную генную конструкцию.

Задачи исследования.

В соответствии с этой целью решались следующие задачи:

1. Оптимизировать структуру гена соматолиберина для экспрессии в бактериях. На модели Е. coli разработать систему измерения уровня накопления в бактериальных культурах и анаболического эффекта производных соматолиберина in vivo.

2. Разработать интегративную генетическую систему, позволяющую экспрессировать производные соматолиберина свиньи в клетках пробиотического штамма Bacillus licheniformis В-4161.

3. Получить опытный образец бактерального препарата на основе вегетативных клеток рекомбинантного штамма В. licheniformis В-4161, несущего ген соматолиберина, и провести его биологические испытания на животных моделях мышей и поросят-отъёмышей.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Предложена структура гена зрелого соматолиберина свиньи, пригодного для экспрессии в бактериях с образованием биологически активного пептидного гормона;

2. Показана принципиальная возможность пероральной доставки соматолиберина млекопитающим, разработана тест-система для биологического тестирования активности соматолиберина свиньи на мышах-отъёмышах;

3. Разработана новая интегративная система на основе гена WprA, пригодная для высокоэффективной экспрессии гена соматолиберина в бациллах;

4. Показан анаболический эффект соматолиберина, доставляемого в составе пробиотического препарата на основе рекомбинантного штамма Bacillus licheniformis В-4161 , на поросятах отъёмышах при отсутствии у них системных дисфункций.

5. Впервые показана эффективность вегетативных клеток бацилл и Е. coli в качестве контейнера для переноса рекомбинантных пептидов через агрессивную среду желудка и двенадцатиперстной кишки, что позволяет разрабатывать технологии создания бациллярных пробиотиков неспоровой формы.

Научная новизна работы. Впервые получен продуцент соматолиберина свиньи на основе пробиотического штамма В. licheniformis В-4161, сертифицированного для применения в животноводстве. На модели этого продуцента впервые показана высокая эффективность вновь сконструированной интегративной системы клонирования, включающая промотор гена субтилизина клеточной стенки WprA и мини-ген устойчивости к эртиромицину (Е-пептид). На модели мышей и поросят впервые экспериментально показана возможность достижения анаболического эффекта при пероральном введении млекопитающим двух видов (мыши и поросята) бактериального препарата, содержащего зрелую форму производного соматолиберина свиньи -пептидного гормона GHRH без использования РАС АР.

Теоретическая и практическая ценность работы. В настоящее время применение стимуляторов роста на животноводческих предприятиях приобрело массовый характер и является важнейшим фактором снижения себестоимости продукции, обеспечения ее конкурентоспособности в условиях быстрого роста производства. В то же время, получение очищенных ростовых факторов и вакцинных субстанций, пригодных для парентерального применения, требует крупных затрат и длительных сроков на разработку. В результате животноводческим хозяйствам приходится прибегать к массовому применению потенциально опасных для потребителя химических средств стимуляции роста животных: синтетическим стероидным гормонам. Экономически эффективной и безопасной для человека альтернативой этому укоренившемуся на практике подходу является разработка живых продуцентов белковых ростовых факторов на базе полностью безопасных микроорганизмов, в частности, мезофильных бацилл. Результаты работы могут быть непосредственно положены в основу новой технологии производства и применения рекомбинантных пробиотиков, обладающих анаболическим эффектом наряду с естественным защитным и профилактическим действием на патогенную микрофлору кишечника.

2. Обзор литературы

2.1 Соматолиберин и его гомологи в системе пептидных факторов регуляции роста

Соматолиберин (GHRH, рилизинг-гормон соматотропина или рилизинг-фактор соматотропина) является одним из представителей класса рилизинг-гормонов гипоталамуса (Montero et al., 2000).

Рилизинг-гормоны, называемые также рилизинг-факторами или либеринами - класс пептидных гормонов гипоталамуса, общим свойством которых является способность индуцировать выброс в кровь различных тропных гормонов передней доли гипофиза. В свою очередь, к подклассу тропных гормонов (тропинов) относят гормоны передней доли гипофиза, проникающие в кровь и воздействующие на периферические эндокринные железы или непосредственно на определенные ткани и органы (На et al., 2000). Тропными гормонами регулируется активность эндокринных клеток пучковой и клубочковой зон коры надпочечников, фолликулов щитовидной железы и целый ряд других эндокринных тканей. Соматолиберин вызывает усиление секреции тропных гормонов передней доли гипофиза: соматотропина (СТГ) и пролактина (Kim et al., 2002). Как и все рилизинг-гормоны гипоталамуса, соматолиберин по химическому строению является полипептидом. Соматолиберин синтезируется в дугообразном и вентромедиальном ядрах гипоталамуса (Hashimoto et al., 2000). Аксоны нейронов указанных ядер оканчиваются в области срединного возвышения. Секреция GHRH стимулируется серотонином и норадреналином. Синтез соматолиберина усиливается при стрессовых воздействиях, физических нагрузках, а также во сне. Связывание соматолиберина с рецепторами на соматотропных клетках аденогипофиза приводит к усилению секреции СТГ. Биосинтез соматоиберина в организме человека и животных осуществляется, главным образом, в нейросекреторных клетках гипоталамуса (Chi-Wei et al., 2007;). Оттуда через портальную кровеносную систе�