Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Селекция и конструирование штаммов молочнокислых бактерий, перспективных для использования в пробиотиках

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карпушина, Светлана Григорьевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава i. ЖТЕРАТУРНУЙ ОБЗОР 1.1, Пообиотики.

X , j. , я

Л, Роль кишечной микрофлоры в функционировании организма животных ,,,,,,,,.

1.2. Общая характеристика и свойства пробиотиков.

1,1.3. Получение пробиотиков на основе микроорганизмов - симбионтов пищеварительного тракта.

1.2. Бифидобактерии как важнейшие обитатели желудочно-кишечного тракта и важнейший компонент пробиотиков,.

1.3. Лактобациллы.

1.3.1. Таксономия лактобацилл и их биологические свойства.,

1.3.2. Антагонистическая -активность лактобацилл и других молочнокислых бактерий.

1.3.3. Антибиотикорезистентность лактобацилл,.

1.3.4. Лактобациллы как объект генетических манипуляций.,.,,,,,.

1.3.4.1, Плазмиды лактобацилл.,,.

1.3.4.2, Репликация плазмид лактобацилл,.,«.,,,.,.

1.3.4.3, Векторы для лактобацилл.

1.4. Конъюгация у бактерий.,.,,.37s

1.4.1. Механизмы конъюгации у грамотрицательных бактерий.

1.4.2. Конъюгативный перенос плазмид в клетки грамположителъных бактерий.

1.4.3. Конъюгативная мобилизация, аяЦЮ 41 "w ¿"1 j?'J. k^f зл£ааазааааа**лаз**е*жа*а*а*ла£лааа*Алаааааал**аг*лааяаз /

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Бактериальные штаммы, плазмиды.

2.2. Среды и антибиотики.

3. Выделение и щентификация молочнокислых бактерий.

2.4. Определение численности молочнокислых бактерий в пробиоти-ческом препарате.

2.5. Определение антагонистической активности молочнокислых бактерий.

2.8. Определение титруемой кислотности молочнокислых бактерий.

2.7. Определение устойчивости молочнокислых бактерий к поваренной соли и желчи.

2.8. Определение устойчивости молочнокислых бактерий к фенолу.

2.9. Исследование биохимической активности молочнокислых бактерий

2.10. Определение спектра кислых метаболитов, образуемых бифидо-бактериями ив глюкозы.

11. Выделение плазмидной ДНК из Е. coli.

12. Выделение плазмидной ЛНК из лактобаиилл и энтерококков.

2.13. Трансформация Е. ооП плазмидной ДНК.

2.14. Манипуляции с ДНК.

2.15. Процедура скрещивания.

2.16. Определение порога, устойчивости к действию антибиотиков

2.17. Определение сегрегационной стабильности плазмид.

2.18. /Индукция мутаций под действием нитрозогуанидина.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ й ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Выделение, идентификация и изучение некоторых биологических свойств лактобаиилл из кишечника•пушных зверей.

3.1.1. Выделение штаммов молочнокислых бактерий из' содержимого желудочно-кишечного тракта пушных зверей.

3.1.2. Исследование биологических признаков выделенных штаммов лактобацилл. 3.1,2,1. Исследование клеточной морфологии, окраски по Граму, формы колоний и определение наличия каталазы.

3.1.2.2. Определение способности к росту при различных температурах

3.1.2.3. Определение видовой принадлежности исследуемых штаммов лактобацилл на основании их способности образовывать кислоты из различных углеводов.

3.1.3. Исследование физиологических и культуральных признаков выделенных штаммов лактобацилл.

3.1.3.1. Определение титруемой кислотности.

3.1.3.2. Определение чувствительности (устойчивости) к различным концентрациям фенола.поваренной соли и желчи.

3.1.3.3. Определение антагонистической активности исследуемых штаммов лактобацилл.-.,.

3.1.3.4. Определение чувствительности (устойчивости) к антибиотикам исследуемых штаммов лактобацилл.

3.1.3.5. Изучение роста исследуемых штаммов лактобацилл при культивировании их в ферментере.

3.1.3.6. Определение ксероустойчивости.

3.1.4. Характеристика штамма Lactobacillus acidophilus ЗП7.

3.2, Разработка, производство и испытания нового пробиотического препарата, на основе штамма Lactobacillus acidophilus ЗП7 (ВКШ Б-6535).'.,.,.

3.2.1, Обоснование потребности разработки нового пробиотического. ■поелаюата.

3.2.2. Описание технологического процесса производства и харак-•

- о териотика Энтерацида П.

3.2.3. Испытание опытной партии Энтерацида П.

3.3. Выделение, идентификация и изучение некоторых биологических свойств бифидобактерий из кишечника человека.■ 84.

3.3.1. Разработка новых сред для выделения и культивирования бифидобактерий.

3.3.2. Определение видовой принадлежности изолятов бифидобакте-. рии на основании их способности образовывать кислоты из различных углеводов.

3.3.3. Чувствительность изолятов бифидобактерии к антибиотикам.

3.3.4. Образование изолятами бифидобактерий муравьиной и уксусной кислоты из глюкозы.

3.3.5. Антагонистическая активность супернатантов культуральных жидкостей бифидобактерий.

3.4. Получение штаммов молочнокислых бактерий, устойчивых к антибиотикам.

3.4.1, Безопасность мобилизуемых векторов семейства pi.Fl 311.

3.4.2. Оптимизация процесса конъюгативной мобилизации в клетки молочнокислых бактерий.

3.4.ЕЛ. Определение эффективности "двойных" и "тройных" конъюгационных скрещиваний.

3.4.2.2. Увеличение эффективности переноса плазмид в клетки молочнокислых бактерий за счет использования мембранных фильт-оов,.;.,,.,.

3.4.2.3. Подбор оптимальной неселективной питательной среды, для совместного выращивания донорных и реципиентных клеток.

3.4.2.4/ Варьирование соотношения донор-реципиент.

3,4.2.5. Оптимизация времени совместного инкубирования донорных

- б реципиентных клеток.

3.4.3. Конъюгативная мобилизация плазмиды PLF21 в клетки молочнокислых бактерий. 10S

3.4.3.1, Изучение структурной стабильности плазмиды pLF£l в клетках молочнокислых бактерий,. 104.

3.4.3.2, Изучение сегрегационной стабильности плазмиды pLF21 в клетках молочнокислых бактерий, . i.

3.4.3.3, Определение порога устойчивости молочнокислых бактерий, несущих плазмиду pLF21. к хлорамшениколу.

3.4.4. Конъюгационная мобилизация плазмид. несущих ген Ь-лакта-мазы в клетки молочнокислых бактерий,.

3.4.4.1. Конъюгативная мобилизация плазмиды pLFAl в клетки молочнокислых бактерий.,,,,.,.

3.4.4.2. Конструирование плазмидного вектора pLFAo.

3.4.4.3. Конъюгативная мобилизация плазмиды pLFA5 в клетки молочнокислых бактерий.

3,5, Клонирование гена соматолиберина в молочнокислых бактери-. ях .не

3.5.1, Клонирование гена соматолиберина. в клетках Е, coli.

3.5.2. Клонирование гена соматолиберина в молочнокислых бактериях и экспрессия пептида, в системе грамположительных бак-теоий.,.,,.,.,.,,.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Селекция и конструирование штаммов молочнокислых бактерий, перспективных для использования в пробиотиках"

Актуальность темы. В последние годы в медицине и ветеринарии все шире применяются пробнотики, которые представляют собой препараты, содержащие живые клетки микроорганизмов-симбионтов. Пробиоти-ки используют для лечения и профилактики дисбактериоза и кишечных инфекций, а также для стимуляции роста и развития сельскохозяйственных животных и птицы. По эффективности действия пробиотики не уступают некоторым антибиотикам и химиотерапевтическим средствам, но они не оказывают побочного действия на микрофлору пищеварительного тракта, не загрязняют продукты животноводства и окружающую среду, то есть являются экологически чистыми.

В настоящее время в нашей стране и за рубежом производят различные пробиотические препараты медицинского и ветеринарного назначения. В их составе входят е основном штаммы бактерий кишечного происхождения. Препараты пробиотиков могут содержать один или несколько различных штаммов микроорганизмов. Предпочтение отдается мульти-штаммовым препаратам, т. к. они активны в более широком диапазоне условий и видов животных.

Почти все пробиотики, используемые в настоящее время, содержат бифидобактерии, лактобациллы, а также энтерококки. В связи с этим актуальной является задача поиска, генетического конструирования и исследования новых штаммов этих микроорганизмов, которые можно было бы включать в состав пробиотиков.

Известно, что в настоящее время для лечения различны}-: заболеваний, вызванных патогенными микроорганизмами, широко применяют антибиотики-, Побочным результатом их использования является - нарушение качественного и количественного состава нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и животных. т, е, дисбакт-ериоз. Поэтому актуальна задача создания пробиотических препаратов., которые можно было бы использовать в комплексном лечении инфекций одновременно с антибиотиками для восстановления микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Для решения этой задачи необходимо получить антиби-отикорезистентные штаммы молочнокислых бактерий - компонентов йро-биотиков.

Значительный интерес может иметь использование в пробиотиках и заквасках штаммов молочнокислых бактерий, являющихся продуцентами биологически активных веществ: аминокислот, витаминов., гормонов и др. Поэтому получение таких штаммов с помощью современны:-: генетических и генно-инженерных методов представляется также весьма актуальным.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы было выделение., идентификация и изучение природных штаммов молочнокислых бактерий., перспективных для включения в состав лробиотинов, создание нового пробиотического препарата на основе одного из вновь выделенных штаммов, а также конструирование с помощью генно-инженерных методов новых штаммов молочнокислых бактерий., перспективных для включения в состав пробиотиков,

В соответствий с этой целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

-,выделить и идентифицировать молочнокичслые бактерии из желудочно-кишечного тракта пушных зверей, изучить их физиологе-биохимические, антагонистические и культуральные свойства; отобрать культуру пробиотического штамма лактобацилл, в наибольшей степени удовлетворяющую требованиям, предъявляемым к пробиотичеоким:штаммам, и испытать ее в производственных условиях;

- у

- разработать и испытать новый комплексный микробный препарат, предназначенный для пушных зверей, собак, а также сельскохозяйственных животных и птицы;

- разработать питательные среды для выделения, идентификации и накопления биомассы бифидобактерий; выделить и идентифицировать би-фидобактерии из желудочно-кишечного тракта здоровых детей, изучить их основные физиолога-биохимические свойства; отобрать штаммы, наиболее перспективные для включёния в состав пробиотиков;

- на основе штаммов Lactobacillus fermentum 30Тс4 и Lactob&ci1-lus plantarum 8РА-3, используемых для производства пробиотического препарата "Лактобактерин", а. также штамма Enterococcus faecium М-74, используемого для производства пробиотического препарата !,3н-•терацид", получить штаммы этих бактерий, устойчивые к антибиотику хлорамфениколу, а также к бета-лактамным антибиотикам;

- на основе штаммов молочнокислых бактерий - компонентов пробиотиков (Lactobacillus fermentum 90Тс4, Lactobacillus plantarum 8РА-3, Lactobacillus acidophilus КЗ и Enterococcus faecium M-74) получить рекомбинантные штаммы этих бактерий, несущие ген ооматоли-берина (рилизинг-фактора гормона роста),

Новизна результатов и научно-практическое значение работы. Выделены и идентифицированы новые штаммы лактобацилл и Оифидобактерий из желудочно-кишечного тракта человека- и животных, изучены их основные физиолого-биохимические, антагонистические и культуральные свойства. Разработаны питательные среды для выделения и культивирования бифидобактерий. Отобрано 10 штаммов бифидобактерий, которые могут быть рекомендованы для использования в пробиотиках. Разрабо-нан новый комплексный микробный препарат "Знтерацид П" (патент РФ N 95111097 от £8.06,95} на основе нового штамма Lactobacillus acidophilus ЗП7, ОпТйМИЗКрОЕЗНЫ условия ириБбДвКИЯ КОНЪЮГаТИБНОИ.МибйЛИ

•i .—1

- ли зации между кишечной палочкой и лактобациллами. Сконструирован вектор рЬРА5 с широким кругом хозяев, несущий ген в-лактамазы из грасположите ль ных бактерий. С помощью генно-инженерных методов получены штаммы молочнокислых бактерий - компонентов пробиотиков, устойчивые к хлорамфениколу и бета-лактамным антибиотикам, а также штаммы, несущие ген соматолиберина.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Карпушина, Светлана Григорьевна

ВЫВОДЫ

1) Новый штамм Lactobacillus acidophilus ЗП7(В- 6535), отобранный среди изученных штаммов лактобацилл, выделенных из желудочно-кишечного тракта пушных зверей, отличается высокой кислотообразующей активностью. хорошими органо-лептическими. культуральными и физиологическими свойствами, высокой скоростью роста и антагонистической активностью в отношении Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Esherichia coli, Enterococcus faecal is. Streptococcus sanguis, Lactobacillus plantarum и Pseudomonas aeruginosa, а также высокой ксероустойчивостью; он может быть рекомендован для включения в состав пробиотического препарата.

2) Разработанный нами новый комплексный микробный препара "Знтера-цид ГГ. содержащий живые клетки штаммов Lactobacillus acidophilus 31Г/ (В-6535) - 150 млн/г и Enterococcus faecium В-2990 - 200 млн/г. является новым эффективным пробиотиком, предназначенным для норок, собак и птицы, что было подтверждено результатами испытаний.

3) 10 штаммов бифидобактерий, выделенных из желудочно-кишечного тракта здоровых детей и отличающихся хорошими физиолого-биохимическими свойствами, а также высокой антагонистической активностью по отношению к --условно-патогенным и гнилостным микроорганизмам, могут быть рекомендованы для включения в состав пробиотиков.

4) Получены штаммы молочнокислых бактерий, устойчивые к хлорамфени-колу, на основе пробиотических штаммов Lactobacillus fermentum t

90ТС4, Lactobacillus plantarum 8PA3 и Eriterococcus faecium M-74 посредством кокъюгативной мобилизации плазмиды pLF21, несущей ген хлорамфениколщетилтрансферазы.

5) Получены штаммы Lactobacillus fermentum 90ТС4, Eriterococcus faecium M-74 и Eriterococcus faecalis 0G1, устойчивые к терапевтическим дозам ампициллина, с помощью конъюгативной мобилизации сконструированной нами плазмиды pLFAS, представляющей собой вектор широкого круга хозяев, несущий ген бета-лактамазы из грамположи-тельных бактерий.

6) Получены рекомбинантные штаммы четырех видов молочнокислых бактерий: Lactobacillus acidophilus КЗ, L.fermentum 90То4, L. plantarum 8РА-3 и Enterococcus faecium jW4, несущие плазмиду pLF-SL2 с геном ооматолиберина. Репликация в них плазмиды свидетельствует о сквозной транскрипции герА - соматолиберин - герВ с репликатйвного промотора вектора.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молочнокислые бактерии - лактобациллы, бифидобактерии и энтерококки - имеют большое практическое значение для пищевой промышленности, сельского хозяйства и медицины. Кроме того, эти бактерии являются симбионтами человека и животных, играя важную роль' в их жизнедеятельности. Различные виды молочнокислых бактерий используют для получения пробиотиков. Пробиотики представляют собой препараты, которые содержат живые микроорганизмы, способные развиваться в желудочно-кишечном тракте животных в качестве компонента нормальной микрофлоры. Применение пробиотиков позволяет ускорить рост молодняка и уменьшить его отход, способствует лечению и профилактике бактериальных заболеваний. По эффективности действия пробиотики не уступают некоторым антибиотикам и химиотерапевтическим средствам, но они не оказывают побочного действия на микрофлору пищеварительного тракта, не загрязняют продукты животноводства и окружающую среду, то есть являются экологически чистыми.

Использование в пробиотиках или заквасках штаммов - продуцентов полезных веществ (аминокислот, витаминов, гормонов) могло бы иметь немалое экономическое значение. Точно так для выделения некоторых веществ микробного синтеза, используемых в медицине, также предпочтительнее использовать молочнокислые бактерии вместо кишечных палочек; хотя затраты на ферментацию в этом случае могут обходиться дороже, безвредность молочнокислых бактерий делает их как продуценты предпочтительнее.,.

Широкомасштабное применение антибиотиков для 'лечения различных заболеваний приводит к нарушению качественного и количественного состава-нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и животных, В результате развиваются дисбактериозы. Поэтому в-настоящее время актуальной является задача создания пробиотических препаратов, которые можно было бы использовать в комплексном лечении кишечных инфекций одновременно с антибиотиками для восстановления микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

Мы предприняли поиск новых штаммов лактобацилл, которые можнс было бы использовать в качестве компонентов пробиотиков. предназначенных для пушных зверей и собак. Для этого мы выделили ö штаммоь лактобацилл из содержимого желудочно-кишечного тракта пушных зверей, т, к. лактобациллы обладают видоспецифичностью. Мы идентифицировали эти штаммы, а также изучили их физиолого-биохимические, антагонистические и культуральные свойства. Все штаммы обладали достаточно высокой антагонистической активностью по отношению к те& условно-патогенным микроорганизмам, которые могут присутствовать г желудочно-кишечном тракте животных. Кроме того штаммы характеризовались хорошими культуральными свойствами, быстро набирали биомассу, эффективно выдерживали сушку и их сухие препараты обладали высокой ксероустойчивостью.

По результатам сравнения всех исследованных штаммов лактобацилл был отобран штамм Laciohaci1lus■acidophilus ЗП7. обладающий наилучшими характеристиками, наиболее важными для пробиотического штамма. Штамм l, acidophilus ЗП7 (В- 6535) отличался высокой кислотообразующей активностью, хорошими органо-лептическими свойствами, высокой скоростью роста, антагонистической активностью в отношении Micrococcus luteus, ßacillus-subtilis. Esherichia coli. Enterococcus fa-ecalis. Streptococcus sanguis, Lactobacillus p'lantarum и Pseudomonas aeruginosa, а также наиболее высокой ксероустойчивостью.

Затем на основе нового штамма лактобацилл мы разработали новый комплексный микробный препарат Энтерацид П, тлеющий следующую характеристику: мелкий сухой порошок от кремового до светло коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом, нерастворимый в воде, содержащий живые клетки штаммов Lactobacillus acidophilus В-6535 -150 млн/г и Enterococcus faecium В-2990 - 200 млн/г. Испытания Зн-терацида IL проведенные на различных животных, показали его эффективность при использовании для'норок, собак и птицы.

Очень эффективными как для человека, так и для животных считаются пробиотические препараты и нормофлоры, в состав которых включены бифидобактерии, которые являются основными обитателями желудочно-кишечного тракта человека, а также в больших количествах присутствуют у животных. В силу природной полиауксотрофности. потребности для роста в строгом анаэробиозе, высокой обсемененности другими микроорганизмами биологического материала, содержащего бифидобактерии. выделение их весьма затруднено. Поэтому набор доступных для исследований штаммов бифидобактерий скуден ЕЮ].

В связи с вышеизложенным мы разработали питательную среду УТР, позволяющую с высокой эффективностью выделять бифидобактерии непосредственно из природного материала, а также питательную среду SB, которая является наилучшей из всех опробованных нами сред для культивирования бифидобактерий.

Используя разработанную нами среду УТР, мы выделили 53 штамма бифидобактерий-- из желудочно-кишечного тракта здоровых детей. Затем мы определили их видовую принадлежность на основаниии спектра сбраживаемых Сахаров, изучили основные физиологе-биохимические, и антагонистические свойства. На основании проведенных исследований мы отобрали. 10 штаммов- наиболее перспективных для включения- в состав пробиотиков, " " '

Б настоящее время является актуальной задача создания пробиоти-чес-ких препаратов, которые можно было бы использовать в комплексном лечении кишечных инфекций одновременно с антибиотиками. Использование таких штаммов в составе пробиотиков для комплексной терапии различных заболеваний совместно с антибиотиками позволило бы предотвратить развитие дисбактериозов. возникающих после лечения антибактериальными препаратами, сократить сроки лечения.

Часто при лечении желудочно-кишечных заболеваний применяют хло-рамфеникол (левомицетин), а b-лактамные антибиотики широко используются при лечении самых различных заболеваний. Поэтому мы поставили перед собой задачу получить штаммы молочнокислых бактерий - компоненты пробиотических препаратов, устойчивые к этим антибиотикам. К сожалению, мутантные штаммы молочнокислых бактерий, устойчивые к хлорамфениколу, характеризуются замедленной скоростью роста и пониженной жизнеспособность, что"является крайне нежелательным для пробиотических штаммов. Штаммы же молочнокислых бактерий, устойчивых даже к минимальным концентрациям b-лактамных антибиотиков, с помощью мутагенеза вообще не удается получить. Б связи с этим мы признали целесообразным подход, предполагающий введение в штаммы молочнокислых бактерий неконъюгативных плазмид, несущих детерминанты устойчивости к этим антибиотикам,

Лактобациллы относятся к числу бактерий, для которых не разработано эффективных методик трансформации и транодукции, Поэтому для введения ДНК в. их метки мы применили метод конъюгативной мобилизации.

Для достижения наибольшей частоты конъюгативной мобилизации при межродовом скрещивании между Е, coli и молочнокислыми бактериями:мы оптимизированы условия ее проведения, мы определили,, что мафримально эффективно конъюгативная мобилизация между кишечной лапочкой и лактобациллами проходит при "тройном" скрещивании, т. е. когда в качестве доноров используются одновременно два штамма: один - с мобилизуемой плазмидой. другой - с плазмидой-помощником. Кроме того, скрещивание должно проводиться на мембранных нитроцеллюлозных фильтрах. времы совместного инкубирования должно составлять 24 часа, соотношение донор - реципиент должно составлять 3:1.

Для получения штаммов молочнокислых бактерий, устойчивых к хло-рамфениколу, мы ввели с помощью конъюгативной мобилизации плазмиду PLF21, несущую ген хлорамфениколацетилтрансферазы. в пробиотические штаммы Lactobacillus fermentum 90ТС4. Lactobacillus plantarum ЗРАЗ и Enterococcus faecium М-74. Плазмида pLF21 была структурно стабильна в полученных штамма: трансконъюгантов. что мы подтвердили с помощью рестрикции и анализа плазмиды при электрофоркзе в агарозном геле. Сегрегационная стабильность плазмиды также поддерживалась на достаточно высоком уровне и составляла для штамма Lactobacillus fermentum 90ТС4 - 54%. для штамма Lactobacillus plantarum ЗРАЗ -87% и для штамма Enterococcus faecium М-74 - 92%.

Для получения штаммов молочнокислых бактерий, устойчивых к в-лактамным антибиотикам, мы сделали попытку ввести с помощью конъюгативной мобилизации плазмиду pLFA'i. несущую ген в-лактамазы из грамотрицательных бактерий, в пробиотические штаммы Lactobacillus fermentum 90TG4. L. plantarum ВРАЗ, L, acidophilus КЗ и Enterococcus faecium М-74. Трансконъюганты штаммов L. plantarum 8PA3 и L. acidophilus КЗ получить не удалось. Полученные же-штаммы трансконъюгантов L. fermentum 90Тс4 и Е, faecium М74 оказались чувствительны к в-лактамным антибиотикам. Вероятно, отсутствие экспрессии гена о-лактамазы было связано с тем. что у молочнокислых бактерии -отсутствует система, транспорта Ь-лактамавы грамотрицательных бактерий из клетки в окружающую среду.

В связи с тем, что попытка получить штаммы молочнокислых бактерий устойчивых к в-лактамным антибиотикам с помощью введения плазмиды. несущей ген в-лактамазы из грамотрицательных бактерий, оказалась неудачной, мы сконструировали плазмиду р1.РА5, несущую .ген в-лактамазы из грамположительных бактерий, и ввели ее с помощью конъюгативной мобилизации в пробиотические штаммы I. т'егтепЬит 901 с4 и £. /'зес2ит М74, шазмида рУРАо в полученных штаммах транс-конъюгантов обладала структурной стабильностью, что мы подтвердили с помощью рестрикционного анализа вектора, штамм лактобащлл был устойчив к ампициллину в концентрации 20 мкг/'мл. а штамм энтерококка - к ампициллину в концентрации 50 мкг/'мл. Сегрегационная стабильность штаммов составляла 50%.

К настоящему времени не реализованы возможности, состоящие в получении пробиотичеоких штаммов, продуцирующих биологически активные вещества, в частности, гормоны. Наибольший интерес представляют пептидные гормоны, эффективные в малых дозах и не накапливающиеся в органах и тканях животного, а также во внешней среде, следовательно, экологически безвредные, Б связи с этим мы провели работу по конструированию штаммов молочнокислых бактерий, продуцирующих один из таких гормонов. Для этого мы клонировали ген соматолиберина в штаммах лактобацилл и энтерококка, применяемых в пробиотичеоких препаратах,

Для введения плазмиды.рЬР-5Ь2, несущей ген соматолиберина в пробиотические штаммы молочнокислых бактерий мы испбльзовали как и в предыдущих случаях метод конъюгативной мобилизации. Мы получили ре* > ■ комбинантные штаммы четырех видов молочнокислых бактерий: . Ьас£дЬа

- 131 cillus acidophilus КЗ, L.fermentum 90Tc4, L. plantarum. 8PA-3 и En-terococcus faecium M74, несущие плазмиду pLF-SL£ с геном соматоли-берина, Репликация в них плазмиды свидетельствовала о сквозной транскрипции соматолиберин + герВ мРНК с репликативного промотора вектора, Плазмиды pLF-SL2 в полученных штаммах трансконъюгантов обладала структурной стабильностью, а также высокой сегрегационной стабильностью, которая составляла от 50 до 100%, после 72 генераций.

Конечно, физиологический эффект от рекомбинантных бактерий, населяющих кишечный тракт, будет зависеть от множества факторов., влияние которых в системе пробиотический штамм - микроорганизм мы в настоящее время не можем точно оценить, так как конечная эффективность экспрессии соматолиберина, в бактериальных клетках пока не измерена. Б последующем предполагается исследовать влияние клонированного гена на показатели роста и развития лабораторных и сельскохозяйственных животных. После проведения необходимых испытаний штаммы могут быть рекомендованы для использования в пробиотических поепаоатах,

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карпушина, Светлана Григорьевна, Москва

1. Антибиотики и антибиоз в сельском хозяйстве./ Пер. с англ. 3. Ф. Богаутдинова, под ред. Полина А. Н. М,: Колос. 1981, с. 360,

2. Антипов А. В., Мартынов Г. Н, Отечественные пробиотики для животноводства.// Биологические исновы высокой продуктивности сельскохозяйственных животных./' Тезисы докладов международной конференции. Боровск. '1990. ч,2. с. 109 110.

3. Антипов В, А,, Субботин В. М, Эффективность и перспективы применения пробиотиков,// Ветеринария, 1980, N0 12. с, 55 57,- 136

4. ATOO каталог бактерий и бактериофагов. 17th Ed, 1989.

5. Биотехнология лекарственных средств. Под ред. Быкова В.А. и Далина M.B. М., 1991.

6. Бокер Р., Флаховский Г., Ярайс Г., Хенниг А. и др. Зрготро-пики регуляторы обмена веществ и использования кормов сельскохозяйственными животными. М.: Агропрмиздат. 1986, с. 97 - 102.

7. Григорьева В. М,, Астанина Л. Н., Лесняк С. В,, Евтухова Л, Н, Чувствительность к антибиотикам бифидобактерий и лактобактерий., используемых для приготовления бифидум- и лактобактерина. /7 Антибиотики. 1983. N 6. с. 418 421.

8. Грязнова И.О., Субботина. H.A., Белявская И.В, и др.// Антибиотики и химиотерапия.1990. Т. 35. No 5. С.15 -19.

9. Дебабрв В,Г., Лившиц В.А. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов, М., "Высшая школа", 1988. 4С. Квасников Е.И., Нестеренко O.A. Молочнокислые бактерии и пути их иопользования. M., "Наука", 1975,

10. Девримов Д. А,, Воронин Е. С. Профилактика диаррей телят лактобактерином. // Инфекционные болезни телят, Кишинев, 1988, с, 79,

11. Достижения и проблемы регуляции микробиологических процессов в экосистеме рубца жвачных. // Известия АН СССР.' 1987. No 6. с. 881 -894.

12. Духин И. П., Пивняк И. Г. Обменные и микробиологические процессы в желудочно-кишечном тракте жвачных животных при различных условиях кормления. // В сб. науч. тр. ВИЖа / Проблемы интенсификации животноводства. Вып. 52. с. 118 1.22.

13. Иванов А. А., Шпигун 0. Н.? Золотое Ю. А. Ионная хроматография органических карбоновых кислот. Определение карбоновых и окси-кислот. // Журнал аналитической химии. 1986. N 1. с. 133 140.

14. Красильников Н. А, Определитель, бактерий и актиномицетов. М. Л,, Изд-во АН СССР, 1949.

15. Ленцнер A.A., Ленцнер X. П., Микельсаар М. 3., Тюри М, 3., Бриленс Т. А,, Врилес В. И., Левков Л. А. Лактофлора и колонизационная резистентность. // Антибиотики и медицинская биотехнология.• 1987, N 3, с. 173 179,

16. Леонов В. Предисловие к книге Мюллера 3., Ружечки В. "Химические и биологические препараты в кормлении животных". М, 1955.

17. Лившиц В,А,, Семенова Е,В,, Макарян К.В, Конъюгационный перенос плазмиды из Escherichia coli в клетки молочнокислых бактерий. Биолог, журн. Армении, .9 (43),1990,

18. Маниатис Т., Фрич 3,, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М., "Мир", 1984,

19. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. Под ред. Борисова Л,В., Смирновой А,М, М., "Медицина", 1994.

20. Ольшевская О. Д. Рациональное питание. Киев.1988, с, 55рт Df .

21. Петровская В. Г., Марко 0. П. Микрофлора, человека в норме и патологии. М.: Медицина. 1976. с. 34 36.

22. Петрухин В, В. Корма и кормовые добавки. М. 1989. с. 58.

23. Пробиотики дают пользу. // ВИНТИ ТАСС, 1987. No 9 с, 7,45, Пробиотики на основе экстракта из рубца. // ВИНТИ ТАСС. 1988, No 44, с, 7 8,

24. Семенихина В, Ф. Труды ВНИИ молочной промышленности, 1968, вып. 7, с. 69.53, Семенова Е.В. Мобилизуемые вектора для лактобацилл и других грамположительных бактерий. Дисс. . , к,б.н, М,, 1994,

25. Соколов В. Д, Фармакологическая корреляция продуктивности животных. /У Фармакология и токсикология новых лекарственных средств и кормовых добавок, в ветеринарии./ Сб. науч. тр., Л. 1989.

26. Тараканов Б, В, Использование микробных препаратов и продуктов микробиологического синтеза в животноводстве. Обзорная инфррмация. Москва. 1987.

27. Ташенов К. Т. Влияние препаратов из пропионовокислых и цел-люлозолитических бактерий на пищеварительные функции жвачных животных. // Вести с.-х. науки Казахстана. 1990. No 5. с, 73-77.

28. Тимошко М. А,, Холмецкая В, Г.Бурсук И. Ф. Бактериоценоз пищеварительного тракта поросят. Кишинев "Штинца". 1983. о. 56.

29. Тимошко М, А.Холмецкая В, Г. Микробиологический и иммунологический статус поросят-сосунов в условиях концентрации./ Тезисы докладов 2-го съезда физиологов Молдавии. Кишинев. "Штинца". 1980. с. 144.

30. Ткачев Е. 3. Физиология питания свиней. М.: Колос. 1981. с.

31. Тюрин M.В. Антибиотикорезистентность и антагонистическая активность лактобацилл, Дис,.,.канд.мед,наук,M.: Всесоюзный НИИ антибиотиков. 1990, 149 с,

32. Тюрин, М.В.Лившиц В,А,//Биол.мембр.1995.Т.12,Мо 1. О. 5868.

33. Barefoot S. F., Klaenharnrner T. R. Detection and activity of Lactacin B, a bacteriocin prodused by Lactobacillus acidophilus. // Applied and Environmental Microbiology. 1983, v. 45, N 6, p. 1808 -1815.

34. Barefoot S. F., Klaenharnrner T. R. Purification arid characterization of the Lactobacillus acidophilus bacteriocin Lactacin B, // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1984, v. 26, N 3, p. 328 334,

35. Barness E, rn., Irnpey C. S., Cooper D. M. Manipulation of the crop and intestinal flora of the newly hatced chick. /7 The American Journal of Chemical Nutrition^ 1980, v. 33, N 4176, p. 2426 2433. ,

36. Bates E.E., Gilbert H. Characterization of a cryptic plasrnid from Lactobacillus plantarum. Gene, 1989, 253-258.

37. Batt. C. A. Genetic engineering of Lactobacilli, /7 Food Technology. 1986, v. 40, N 10, p. 95 112.

38. Biavati B,,Mat-tare! 1 i P,/7Ibidurn, 1991, V,41, P. 163 168.79.' Bieleska M. Antagonistyczne wtaoiwosci kuetur Lactobacillus i ich wykerzysianie w produkcli jogurtu. /7 Acta Acad. Agr. ac techn olsten. Technol. aliment.7 1985, N 2, suppl. B, p. 3 54.

39. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasrnid DNA. Nucleic Acid Res.,

40. Bhattacharjee M., Rao X-M., Meyer R. Role of the origin of transfer in termination of strand transfer during: bacterial ooni ligation. J. Bacterid., 1992, 174, 6659-6565.

41. Blachet M. Levures et. probiotiques deux biotechnologiest au servaice de 1 'alimentation anirnale. // Biotechnol. et. alirri anim.

42. Ann, ooloq., Paris, 10 -11 juin. 1987. s. 31 44.

43. Bouia A. et. al. Structural organization of pLPl, a cryptic Plasmid from Laotobaoillus plantarum CCM1904. Plasmid, 1989, 22, 185-192.

44. Boyd A.C., Archer J.A., Sherrett D.J. Characterization of the ColEl mobilization region and its protein products. Mol. Gen. Genet., 1989, 217, 488-498,

45. Brant1 S., Behnke D., Alonso J.S. Molecular analysis of the replication region of the conjugative Streptococcus agalactia Plasmid pIP501 in Bacillus subtilis. Comparison with plasrnids pAMbl and pSM'19035. Nucl. Acid. Res., 1990, '18, 4783-4790.

46. Brenig, B., Muller, M. and Brem, 8, Gene transfer in pig, p. 41-48,

47. Chessy B. M. Prospects for improving economicalli significant Lactobacillus strains by "genetic technology". // Trends in Biotechnology. 1985, v. 3, N 11, p. 273 275.

48. Chassy B.M. Prospects for the genetic manipulation of lactobaciHi. FEMS Microbiol, Reviews, 1987, 46, 297-312.89.-,.Chassy B.M., Gibson E., Giuffrida A. Evidence for'extrachromosomal elements in Lactobacillus. J. Bacteriol., 1976, 127, 1576-1578. , .

49. Damian! G. et al. Sequence and functional analysis of a divergent promoter from a cryptic plasmid of Lactobacillus acidop- 144

50. Danek P., Novak J. Ovlimneni strevni microflory eselat. aplikaci Lactobacillus casei COM 4150. /7 Zivoc. Vuroba. No 2. s. 155 163.

51. DaoM.L., Ferretti. Streptococcus-Escherichia coll shuttle vector p5A3 and its use in the cloning- of streptococcal genes. AppL Environ. Microbiol., 1985, 49, 115-119.

52. Dellaglio F., Bottazzi V., Trovatelli L. D. Deoxyribonucleic Acid homology and base composition in some thermophilic Lactobacilli, /7" Journal of General Microbiology. 1973, v. 74, p. 289 297.

53. Dellaglio F., Bottazzi V,, Vescovo M, Deoxyribonucleic Acid homology among1 Lactobasillus species of the subgenus Streptobacteriurn Orla-Jensen. // International Journal of Systematic Bacteriology. 1975, v, 25, N 2, p. 160 172.

54. Dellaglio F,, Vescovo M., Prerni L. "Free" Diaminopimelic Acid and Deoxyribonucleic Asid homologu of Lactobacillus helveticus. /7 International Journal of Systematic Bacteriologu, 1974, v, 24, N 2, p, 235 237.

55. Dellaglio F., Torriani S. DNA-DNA-homology, physiological characteristics and distribution of lactic asid bacteria isolated from maize silage,// Journal of Applied Bacteriology? 1986, v. 60, N 2, p, 83 92,

56. De Klerk H. C., Coetzee J. N. Antibiotics among: Lactobacilli, /7 Nature. 1961, v. 192, N 4800, p. 340 341.luO. de Vos W.M. Gene cloning' in lactic streptococci. Neth. Milk Dairy J., 1986, 40, 141-154. '

57. Dut.ta S. N., Devriese L. A. Sensitivity and resistance to growth promoting- agents in animal Lactobas.1 Hi, // Journal oe Applied Bacteriology. 19816 v. 51, N 2, p. 283 288.

58. Dutta G, N., Devriese L. A. Degradation of Macrolide-Lincosamide-Streptogramin »antibiotics by Lactobasiilus strains from animals. /7 Annales de Microbiologic. 1981, v. 132A, d . 5"1 57,

59. Evans R.P. Macrina F.L. Streptococcal R plasmid pIP501; endonuclease site map, resistance determinant location, and construction of novel derivatives. J. Bacterid., 1983, 154, 1347-1355,

60. Everett R,, Willets. Characterization of an in vivo system for nicking at the origin of conjugal DNA transfer of the sex factor F. J, Mol. Biol., 1980, 136, 129-150.

61. Exteraote F. A. Otten B, J,, Wassenberg H, W,, Veerk- amp J. H. J, Bacterial, 1971, v, 106, p. 824,

62. Fereira C. L,, Gilliiand S, E, Bacteriooin involved in premature death of Lactobacillus acidophilus N0FM during growth at pH 6, // Journal of Dairu Science, 1988, v. 71, N 2, p, 306 315,

63. Fernandes. C.F., ••• Shahani K.M. and Arner M.A, Therapeutic role of dietary iactobacilii and lactobacillic fermented dairy products. FEMS Microbiol. Reviews. 1987, 46, 343-356,

64. Finnegan J,, Sherratt D, Plasmid GolEl conjugal mobility:- 146 the nature of born: a region required in cis for transfer. Mol. Gen. Genet., 1982, 185, 344-351.

65. Fujisawa Т.// Bifidobacteria Microflora. 1990. V. 9. P. 43-50.

66. Fuller R. Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteri-ol., 1989, 66, 365-378.ill. Fuller R, Basis and afficacy of probiotics. // J. Woid's poultry Sc. 1988. Vol. 44, No 1. p. 45 50.

67. Gangyli N, 0, Probiotics: A future food additive for li-vest.oc. // Ind. Dairyman. 1988, Vol. 40. No 9. p. 505 510.

68. Garvie E. I,, Zezula V., Hill V. A. Guanine plus cytosine content, oe the DNA of the Leuconostoc and some heteroferrnentative Lactobacilli, // International Journal of Systematic Bacterialogii. 1974. v. 24, N 2, p. 248 252.

69. Gedek B. Probiotics in animal feeding1 effects on performance and animal health. // "Feed Mad. Inf.". 1987. N NOV. p. 21

70. Gedek В. Probiotika in der Tierernahryng Wirkurider aufLei stung ;<und Tiergsundheit. // Kraftfutter, 1986. s. 80 84.

71. Gibson. T. The structural organization of Epstein-Barr virus, Ph. D. Thesis.Carnbrige, 1984.

72. Gilliland S. E., Nelson C. R,, Maxwell*C. Assimilation of cholisterol by Lactobasillus asidophilus,,. /7 Applied and Environmental Microbiology, 1985, v. 49, N 2, p, 377•-- 381, ,- 147

73. Guiney D.G., Lanka E. Con.iugative transfer of InoP plas-mids, p. £7-58. In Thomas C.M. (ed.), Promiscuous pi asm ids of gramnegative bacteria. Academic Press Ltd., 1989., London. %

74. Guiney D.G.Yakobson E. Location and nucleotide sequence of" the transfer origin of the broad host range plasrnid RK2. Proc. Natl. Acad. 3ci. USA., 1983, 80., 3595-3598.

75. Haddad P.R., Jackson P.E, Ion Chromatography, Principles and Application. Amsterdam: Elsevier. 1990. 771 PP.

76. Hayes F,, Daly C., Fitzgerald G, High-frequency, site-specific recombination between lactococcal and pAMbl plasrnid DNAs. J. Bacterid,, 1990, 172, 3485-3489.

77. Hayward A, C., Hale C. M. F., Bisset K. A. // Gen, Microbiol, 1955, v. 13, p. 292,

78. Hin-Chung W.; Chen Y.-L. Effect of lactic acid bacteria and organic acids on growth and fermentation of Bacillus cereus, /7 Applied and Environmentai Microbiology. 1988. v. 54, N 9, p. 21791. O-l Q A S--J.1>*2 ,

79. Ishlwa H,, Iwata S. Drug: resistance plasmids in-Lactobacillus fermentum. J. Sen. Appl. Microbiol., 1980, 26, 71-74.

80. Iwata M. Characterization of a pAMbl deletion derivative isolated from Lactobacillus casei after conjugation. Biochimie,,1988, 70, 553-558,

81. Joerger M. C., Klaerihammer T. R. Characterization and purification of Heivetioin J, and evidence for a chromosomally determined bacteriocin prodused by Lactobacillus helvetious. // Journal of Bacteriologu, 1986. v. 167, N 2, p. 439 446.

82. Jonson K. et al. Characterization of a gram-positive broad host range plasmid isolated from Lactobacillus hilgardii. Plasmid,1989, 11, 9-20,

83. Kand-ler 0. Int. J. Syst. Bacteriol, 1970. v. 121, p, 311.

84. Kennedy N. et al, Conjugation proteins encoded by the F sex factor. Mature, 1977, 270, 580-585.

85. Kok J., Vossen J,, Venerna G. Construction of plasmid cloning vectors for lactic streptococci which also replicate in Bacillus subtilis^-and- Escherichia coli. Appl. Environ, Microbiol,, 1984,40 "7ncr(Q.jiI, • { l OS .

86. Lauer E./VInt. J. Syst. Bacteriol. 1990. V. 40. P.100 -102.

87. Lazrad R., Clavel-Seres S., David H.L. and Roulland-Dus-soix D. Coniugative transfer of a shuttle plasmid for Escherichia ooli to Mycobacterium smegmatis. FEMS Microbiol. Lett. 1990 j 69, 135-138.

88. LeBianc D.L., Lee L.N. Physical and genetic analysis of streptococcal plasmid pAMbl and clonihg of its replication region. J, Bacteriol., 1984, 157, 445-453.

89. Lee B. H., Sirnard R. E. Evaluation of methods for detecting the production of Hps,, volatile sulfides and greening by Lactobacilli, // Journal of Food Science. 1984, v, 49, N 4, p. 981 983,

90. Leer R.J., Luirik N. Posno M., Pouwels P.H. Structural and functional analysis of two cryptic plasmids from Lactobacillus pentosus MD353 and Lactobacillus plantarum ATCC8014. Mol. Qen. Genetic,, 1992, 234, 265-274.

91. Mori shit a. T., Deguchi Y., YajimaM,, Sakurai T., Yura T. Multiple nutritinal requirements of Lactobacilli: genetic lesions affecting amino acid biosinthesis pathways. // Journal of Bacteriology. 1981. v. 148, N 1, p. 64 71.

92. Murphy M. G., Condon S. Correlation of oxygen utilisation and hidrogen peroxyde accumulation with oxygen induced enzymes in Lactobacillus plantarum. /7 Archives of" Microbiology, 1984. v. .138, N 1, p. 44 48.

93. Murphy C. 6., Malarny M.H. Characterization of a "mobilization cassette" in transposon Tn 4399 from Bacteroides fragilis. 1993, 175, 5814-5823.

94. Murphy M. 0., O'Connor L., Walsh D., CondonS. Oxygen dependent lactate utilization by Lactobacillus plantarum culture. // Archives of Microbiology. 1985. v. 141, N 1, p. 75 79.

95. Morris R. F., Flanders T., Tomarelli R. M., Gyorgy P. J, Bacteriology, 1967, v. 60, p, 681,

96. Orla-Jensen S./7 Lait. 1924. V. 4. P. 468 474.

97. Orla-Jensen S. The lactic asid bacteria. 2-d ed., Koben-havn, I Komiiiission hos E.jnar Munksgaard,, 1942,

98. O'Sallivan D, J,, Klaenharnmer T.R, Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DMA from Lactococcus and Lactobar.illus spp. Appl, Environ. Microbiol., 1993, 2730-2733.

99. Pansegrau W. In vitro assembly of relaxosomes at the transfer origin of plasmid RP4, Proo, Natl. Acad. Sci USA, 1990, 87, 6555-6559,

100. Plotho 0,„ von. ; Zbl. Bakt., I. Abt,, Orig,, 1947, v, 90, p. 152.

101. Podrowka W,, Podrowka Z, Probiotiki f irmy Pioneer w zy-wieniu cielat, prosiat, .iagniat i zrebiat, /7 Pr. Wydz,. nauk. '1.990,1. Mo 38. c. 11 22.

102. Polmann D. S., Danielson D. M., Peo E. R. Effect of Lactobacillus acidophilus on starter pigs feed a diet supplemented with lactose. // J. Anirn. Sc. 1980. No 3. p. 638 644.

103. Posno M- et al. Incompatibility of Lactobacillus vectors with replicons derived from small cryptic Lactobacillus plasmids and segregation instability of the introduced vectors. Appl, Environ. Microbiol., 1991, 5?, 1822-1828.

104. Pradhan A., Maiumdar M. K. Metabolism of some drags by intestinal Lactobacilli and their toxicological considerations.// Acta Pharmacologica et Toxicologica. 1986, v. 58, p. 11 15.

105. Priebe S.D., Lacks S.A. Region of the streptococcal plas-rnid pMV'158 required for con.iugative mobilisation, J. Bacteriol., 1989, 171, 4778-4784,

106. Salrninen S., Deighton M, Lactic acid bacteria in the gut in normal and disordered states. Dig, Dis., 1992, 10, 227-238.

107. Salminen S., Isolauri E., Salrninen E. Probiotics and stabilization, of the gut mucosal barrier. Asia Pacific J. Clin. Nutr., 1996, 5, 53-56. •

108. Sandine W.E. Roles of Lactobacillus in the intestinal tract. J. Food protection., 1979, 42, 259-262-,

109. Sarra. P. G., Magri M., Bottazzi V., Deliaglio'F, Genetic- 153 heterogenity among Lactobacillus asidophiiius strains. // Antonie van Leeuwenhoek& 1980. v. 46., N 2, p. 169 176.

110. Savage D. 0. Mechanisms by which indegenous microorganisms colonize gastrointestinal epithelial surfaces. // Prog. Fd. Nutr. Sc. V. 7. 1983. p. 65 74.

111. Scardovi V. P.1418-1435//Bergey's Manual of Systemic Bacteriology. V.2/Eds. Sneath P.H.A.,et al. Baltimore; Williams & Wil-kins. 1986.

112. Schafer A,, Kalinowski J., Simon R. Seep-Feldbaus A.H. and Puler A. High-frequency conjugal piasmid transfer from gram-negative Escherichia coli to various gram-positive corvneform bacteria, J, Bacteriol., 1990, 172, 1663-1666,

113. Sharpe M. E. The genus Lactobacillus. /7 Procariotes. -Berlin e. a. 1981. v. 2, p. 1653 "1677.

114. Shaw B, 6., PucKey D, J., MaoFie H, J., Bolt S. J, Classification of some lactic acid •■ bacteria from vacuum-packed meats by direct probe mass spectrometry.// Journal of Applied Bacteriology., 1985. v7 59, N 2, p. 157 165.

115. Scheirlink T. et al. Integration and expression of a-amylase and endoglucanase genes in the Lactobacillus plantarum chromosome. Appl. Environ. Microbiol,., 1989, 55, 2130-2137,

116. Shimizu-Kadota M, Properties of lactose plasmid pLYlOl in Lactobacillus casei, Appl, Environ, Microbiol., 1987, 53, 2987-2991. "

117. Shimamura S,/7 Agric. Biol. Chem, 1990. V. 54. P. 2869oor'.-i ¿Gil,

118. Simon R. High frequency mobilization of gram-negative bacterial replicons by the in vitro constructed Tn5-rnob transposon. Moi, Gen, Genet., 1984, 196, 413-420. •- 154

119. Sorokin A.V., Khazak V.E. Structure of pSM19035 replication region and MLS-resistance gene. In Butler L.O.} Harwood'C.R., Moseley B.E. (eds.), Genetic transformation and expression, 1989, £69-281.

120. Soska J, Growth of Lactobacillus acidophilus in the absence of folic acid, /7 Journal of Bacteriology. 1966. v. 91, N 5, p. 1840 1847.

121. Takiguchi, HashibaH., Aoyama K., Ishii S. Complete nucleotide sequence and characterization of a cryptic piasmid from Lactobaci11us he1vet i cus subsp. jugurt1, App1. Environ. Mi crobiol., 1989, 55, 1653-1655.

122. Tannock G.W. Conjugal transfer of pi asm id pAMb'l in Lactobacillus reuteri and Lactobacilli and Enterococcus faecalis, Appl. Environ. Microbiol,, 1987, 53, £693-2695,

123. Tannock G, W. The normal microflora new concept in he- alth promotion. /7 Microbiological Sc. Vol. 5 No 1. 1988. p. 4-8.

124. Thompson T.L., Centola M.B., Deonier R,C. Location of the nick at oriT of the F plasrnid. J. Mol. Biol,, 1989, 207, 505-512.

125. Thornhill P. J., Cogan T. M. Use of gas liquid chromatography to determine the end products of growth of lactic acid bacteria. /7 Applied and Environmental Microbiologu. 1984. v. 47, n 6, p, 1250 1254,

126. Tibbets G. W., Seerly R, W., McCampbell H. 0. Poultry offal ensiled with Lactobacillus acidophilus for growing and finis-- hing- 155 svine diets. // J. Anim. Sc. 1987. p. 182 190.

127. Tibor Nemeskerv Probiotics for young: animals. . // Feed International, p. 45 477

128. Tissier H. Recherches sur la flore intestinale narrnale et pathologique du nourisson. These de Paris. 1900. 253 PP.