Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПЕРСПЕКТИВЫ СОЗДАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ БАЦИЛЛ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ НОВЫХ БИОПРЕПАРАТОВ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ПЕРСПЕКТИВЫ СОЗДАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ БАЦИЛЛ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ НОВЫХ БИОПРЕПАРАТОВ"

А-з ош

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ -им. Д.К. ЗАБ0Л0ТН0Г0

На правах рукописи

Для служебного пользования Экз. №ооз

БЕЛЯВСКАЯ ВАЛЕНТИНА АЛЕКСАНДРОВНА

УДК 579.852.11 ; #15.281+577.21

V

ПЕРСПЕКТИВЫ СОЗДАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ БАЦИЛЛ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ НОВЫХ БИОПРЕПАРАТОВ

03.00.07 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Киев -1992

Работа выполнена в отделе антибиотиков Ордена Трудового Красного Знамени Института микробиологии и вирусология им. Д. К Заболотного АН Украины и в отделе■Сиоинженерии Научно-исследовательского конструкторско-технологического института биологически активных веществ /НПСГВектор"/

академик АН Украины В. В. Смирнов . чл. -корр. АН, Украины,' доктор биологических наук, профессор ■' . ' Б. И Мацелюх ' ■

кандидат биологических наук доцент

И. А. Василевская | Ведущая организация ; Институт эпидемиологии и

янфекционннх болезней . - - им. Л.В.Х^омашевского

■ АМЗ Украины,'г.Киев/ Защита состоится " {£ " 1992 г/ в/£час

на заседании специализированной совета Д 016.06.CH" по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук при Институте микробиологии й вирусологии им. Д. К. Заболотного АН Украины по адресу: \ ;

252627,ГСП,Киев-143,ул. Заболотного,26 ' •

Автореферат разослан " М> " г."

/

Учёный секретарь 1

специализированного совета " . *, кандидата биологических наук -Э. А. Коваленко

Научный руководитель Официальные' оппоненты

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Аэробные спорообразущие бактерии рола

Basilius привлекают всё большее внимание.исследователей различных направлений .Высокая антагонистическая активность » отношена патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, Фер- : ыентативные свойства. синтез аминокислот, витаминов, продукта других физиологически активных. веществ, спределящих полеэ- . ные свойства для макроорганигма,наряду о полной безвредностью, обуславливает перспективность использования этих'бактерий в качестве основы лечебно-профилактических препаратов;/ Pusey et, al. ,1984;b020v1c et. al .1986; Смирнов В, В. и др.,1963; Резник С. Р. и др. .1988:Никятенко и др. 1991/.

Способность к экспрессии и секреции значительных количеств гетерологичных,белков наряду с разработанными технологическими процессами крупномасштабного культивирования представляет интерес для использования бактерий рода Bacillus в качестве перспективной системы клонирования чужеродных про-и зукариотических генов /Vorig S.L. .1989; Schumann V. .1987/.

Методами генетической инженерш на основе бацилл созданы ■ суперпродуценты таких важных белков .как интерферон человека/Ра! va et. ak,1983/,гормон роста / Honjo М. et. al ..1987/, белок А стафилококка /Yasantha et.al; ,1936/ и многие другие. ' Данные ,свидетельствующие о том,что метода»« генетической инженерии'можно получать штаммы бацилл с заданными свойствами. приобретают особое значение при конструировании новых штаммов.перспективных в качестве основы биопрепаратов. .

Существующие в настоящее время пробиотики характеризуются высокой эффективностью при заболеваниях бактериальной этио- . логии,однако среди них нет препаратов с выраженной антивирусной активность». В то, же время известно, .что в структуре заболеваний человека и животных заболевания вирусной или сметной этиологии встречаются широко. Так.среди всех госпитализирован- . них детей с острой диареей.более БО% составляют больные рота-вирусным гастроэнтеритом/Гизатуллина С.С, и др. .1992/.

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧНАЯ Б,(5ЛИ0ТЕКА K-íoc:t. сс/!ь:::;0-;ол ачадоули

Поэтому представляется важным создание новых рекомбинаят-ных штаммов бацилл ,характеризующихся как высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов »так и антивирусной за счет введенной генетической информации, кодирушей .например.интерферон. Это от- \ крывает возможности конструирования высокоэффективных и необходимых для медицины и народного хозяйства препаратов.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы яви- '

лось создание рекомбинантного штамма В. subti Us,характеризующегося высотой исходной биологической активностью /ферментативной. антагонистической /.а тага» антивирусной активностью/ за счет введенных генетических детерминант;' создание на основе этого штамма принципиально нового биопрепарата и разработка технологического процесса для его получения." .

В связи с этим задачи исследования состояли в следующем:

1. Шказать принципиальную возможность создания рекомби-нантных штаммов с задавшими свойствами на основе штаммов,входящих в состав биопрепаратов .при сохранении исходной высокой биологической активности.

2. Изучить стабильность .введённой генетической информации ;' при различных способах культивирования штаммов . а .тага© при ; ■ -длительном пассировании их in vitro и in vivo.

3. Провести сравнительное изучение созданных рекбмбииант-- . ншс штаммов по способности к стабильной экспрессии интерферона_ при пассировании штаммов in vivo и in vitro ,и предложить штамм наиболее перспективный для конструирования биопрепаратов нового, типа. ; .: ' . ■ . ^ ■,

4. Изучить специфическое воздействие рекомбинантного штамма на иакрооргаяизм. . -■).■*..•', ■ . ■

5. Изучить токсичность,токснгенность и вирулентность соз- -данного штамма. -

6. Создать на основе сконструированного штамма новый пробио-тнческий препарат .кластеризующийся как антибактериальной ;так и антивирусной активностью.

7. Разработать технологию получения биопрепарата о использование« метода глубинного культивирования'и получить опытно-экспериментальны^., партии.

8. Представить данные для документации.необходимой для

' утверждения и освоения производственного выпуска и внедрения в широкую практику лечебно-профилактического препарата.

Научная новизна. Впервые получен рекомбинантный штамм

В. subti lis 233S/105,характеризующийся антимикробными и антивирусными свойствами /коллекционный номер ВЕШИ Б-4759. положит, решение по заявке N-483655/13/063118 от 06.04.91/.

Показано.что,введенная генетическая информация стабильно сохраняется и наследуется при культивировании штамма как in vitro .так и при пассировании его через организм животных .

Впервые показано в опытах на животных .что пероральное ¿ведение штамма В. subti lis 2335/105 обеспечивает противовирусную защиту макроорганизма даже' при особоопасных инфекциях .

На основе рекомбинантного штамма В. subti И s 2335/105 разработав новый препарат.Субалин,обладавший антимикробной'и антивирусной активностью /положит, решение то заявке n-5œ5233 /13 /005316 от 06.07.92/.

разработаны условия глубинного культивирования' рекомби-нантного штамма:'Ба основе экспериментальных данных предложена технологическая схема получения препарата Субалин в виде по-' рошка и изготовленных на его основе таблеток.

Эффективность субадина подтверждена в опытах на с/х животных.

Практическая значимость работы . В результате проведенных

исследований разработан принципиально новый биопрепарат,характеризующийся как антимикробными свойствами в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных бактерий,так и антивирусными за счет синтеза интерферона

Материалы исследований включены в Регламент производства. Технические условия. Наставление по применению препарата Оу»

■ . - 4 -' .

5адин.Инструкцию по изготовлению и контролю. Материалы подготовлены для представления в Бетфармсовет и ГИСК им. Тара- . севича.

Апробация работы . Материалы диссертации -доложены на :

VII съезде Украинского микробиологического об-ва /Чгрнов-цы.1939/: VII Всесоюзном генетическом симпозиуме /Нссква. 1990 /; VI Международном симпозиуме по генетике промышленных микроорганизмов /Страсбург,199С/;Всесскенсй научной конференции "Бэеые направления сельскохозяйственной биотехнологии" /Алма-Ата. 1990/. . .. .

Основные результаты исследований были представлены на научном семинаре отдела антибиотиков НЫВ им. Л К. Заболстного -/КиеЕ.1992/. . ^

Публикация материалов исследований. По материалам исследований опубликовано 4 печатные*работы .получено z положительных решения по заявкам. '

Структура и объём работы. Диссертационная работа изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы в 3-х частях.4-к глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы.вклшагщего 224-работы.из.них 154 на иностранном языке. Работа иллюстрирована 28 таблицей и 4 рисунками.

: ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЕ . Во введении.показана необходимость и обоснованность соз-.

лания рекомбинантних иггаммов! бацилл, продуцирующих интерферон . и конструирования на их основе биопрепаратов нового поколения. В обзоре литературы приведены данные по практическому исполь-

зования живых культур бактерий рода Вас! И из /для сельского хозяйства и медицины /,их преимущества серед другими культурами; на примерах живьи вагаэюных препаратов рассмотрены принципы для конструирования рекомбинантных штаммов багщлл

о заданными свойствами б качестве основы новых Ьиопоепаратое; а также представлены данные о возможностях генеттеОКОЙ инженерии бацилл. " (.

Материалы и методы исследования. Основными оОъеетами ис-

следования являлись 3 штамма аэробных спорообраэутатсс бактерий: В. subti 11 s ШШ В-2335.БШ1М В-2895.ВКШ В-2896, " • входящих в состав биопрепаратов,как широко применяемых б сельском хозяйстве /Бактерия-СЛ/, так и перспективных .находящихся на стадии pasработки. Шгаюш были любезно предоставлены сотрудниками отдела антибиотиков ИМВ. Для постановки генно-инженерных экспериментов использовали лабораторные штаммы В- subtil i s BDI70 и BD224 из коллекции ЖГИ ЕАВ/Г. Вердска/. В качестве тест-культур использовали 26 патогенных в условно патогенных микроорганизмов различных таксономических групп /стафилококков, садьмоведл, жителя, клебсиедл. протеев, корине-бактерий и др./.

Опыты по исследованию противовирусной активности реком-бинантного штамма проводили на модели особоопаоной вирусной инфекции на морских свинках с использованием вируса энцефаломиелита лошадей /ВЗЛ/ с инфекционным титром 2,5х10?БОЕ/мл совместно с сотрудниками ВНКК ЫВ /ШЭ "Вектор"/.

■ йнтерферощщдуцируицую активность изучали на беспородных белых мышах массой 15-18 г.

Безвредность рекомбииантного штамма испытывали на мышах, кроликах,поросятах-сосунках,телятах совместно с сотрудниками отдела биологических испытаний НЖГИ ЕАВ /г. Вердск/ в стлелз антибиотиков ИМВ /АН Украины,г. Кие!Л

Эффективность препарата Субалин испытывали совместно с Институтом ветеринарии /ВАСХНИЛ/ на поросятах-сосунках 1-5-тк дневного возраста в: условиях опытно-промышленного комплекса в районе эпидемиологически.неблагоприятном по ротавируснкм инфекциям. . ■

Всего s работе мспольвовали 200 морских свинок, 8Ш мтпек, 50 кроликов , 200 телят и 1100 поросят.

- 6 -'

Трансформацию природных и лабораторных штаммов банила проводили кееколькими методами: трансформацию компетентных клеток- по известному методу Contente et. al, /1979/;трансформацию протопластов -по методу Chans et. al,/1279/.

При создании рекомбинантных плазмид и их рестрикционном и гисридизационном анализе, использовали стандартнш методы генетической инженерии /Маниатис Т. и др., 1984/.

Образны для определения внутриклеточного и внеклеточного v интерферона готовили по схемам .разработанных нами с учетом известных.методик по изучению продукции интерферона бактериальными клетками 0аШ1ЛЛ/Ра1 va at. al. ,'lS83;5chei n С. ft. et. al. 1986/. Количество интерферона в стандартных образцах клеточных лизатсв и культуральной.жидкости определяли по биолсгичесой . цитопатической активности интерферона методом микрот'.гсрога-ния /Finter N. В.,1983/,с использованием вируса зкцефалсмио-кардита /ЕМС/и культуры клеток 58. Для определения эндогенного,индуцируемого в сызоротке крови мышей интерферона приме- . няли культуру мышк.чшс клеток L-929 и вирус везикулярного стоматита милей /ЕВС.итамм Индиана/.-

ПрямоЯ иммуноферментньй анализ для определения титра внеклеточного интерферона .продуцируемого рекомбинантными.штаммами, проводили по методу Lauzon et.al./1983/. с использованием политональных АТ_ к интерферону .меченых пирокеидазой.

Стабильность рекомбинантных плазмид в*трансформированных штаммах определяли при пассирований их in vitro при различных условиях культивирования/при поверхностном и глубинном / и на . разных питательных средах -/минимальной и осогашеннои среде Спецайзена /Zpizi J.,1973/.а такав при пассировании через организм животных. В каждом из опытов определяли процентное . содержание канзмивднустойчивых клонов и проводили рестрккци-онный и тбридизационный анализ регамбинантной ВНК .выделенной из пассированных клонов.Кроме того клоны анализировали, на способность продуцировать интерферон. Всего в опытах по изучению стабильности было.проанализировано 5 тыс. клоноа. При пассировании через организм ливотнщс было использовано 250

белых беспородных мышей.

■Изучение Оиологических свойств бацилл проводили"по .Смирнову В.В. с соавт./198бс/. ' .

. Токскгенные,токсические и.вирулентные свойства рекомби-' нантного штамма изучали по Биргер /1973 ,1982/, '

Антибактериальную антагонистическую активность изучали методом отстроченного антагонизма/Егоров* Н. С., 1986/.,

Условия глубинного культивирования отрабатывали при.Ъы-рашивании. рекомбинантного птамма в качалочньк колбах.в 10-ти и 50-ти литровых ферментерах /"Ul traferm''np-во Швеция и пр-во

осс?/. р ■

Изготовление препарата на основе рекомбивантного штамма В.subtiUs 2335/105 проводили двумя методами ; при поверхностном культивировании .разработанном ранее для' штамма Кsubti 1 is 2335 при получении препарата Бактерия-СЛ /Смирнов В. В. и др. .1985/ и при глубинном культивировании с последующей распылительной сушкой, разработанным нами. , ■ • ■'..*' РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

: Глава 3. Конструирование'рекомбинантных штаммов бацилл.

<Ва основе живых ссорообразуюших бактерий В. subtil i s в настоящее время создано несколько пробиотических препаратов ' для медицины и ветеринарии : Еиоспорин и Бактерии -СЛ /Смирнов ' ЕЕи др.1985 .Смирнов В.В. и др.";198б /.Слоробактерин /Ники. тенко ,1991/. Эти препараты являются высокоэффективными ' ' средствами профилактики и лечения Дисбактериоэов и острых. ' желудочно-кишечных заболеваний.вызываемых патогенными.и условно патогенными :микроорганизмйми. Однако,с нашей точки .зрения,имеются резервы для увеличения противовирусной активности данных препаратов. В этой связи представляется целесообразным конструирование методами генетической инженерии таких бактериальных штаммов ¿которые наряду с высокой антагонистической активностью в'отношении патогенных и условно патогенных микро- . организмов'обладали бы выраженной антивирусной активностью, sa Ç4ÔT гведеиов ЙШрфеЭШЭ.

- 8 - • .

При конструировании рекомбинантных штаммов бацилл ис-. пользовали,созданные нами'совместно с сотрудниками Института молекулярной биологии /НПО "Вектор "/ рексмбияантные" плазмида серии рВШ.кодирутеие вне-и внутриклеточный интерферон /Красных В. В. -л др. 19S6 ; Заявка N 483665 /. Схематическое. изображение плазмид представлено на рисунке 1. •

£col?I

/ , -Зо/С-Г ---

?у.с. 1. Структура плазмид рЕГ,Е1С4 и рЕЖЮс." .

Гек нтерферока з рекомбинактаых плазшдах представляет' собой химко-статетический аналог гена интерферона человека ~JL2 / Ко робко и др. .1984 /. Регуляторные элементы, обеспечиваюсь экспрессия гена в клетках, бацилл: промотор:, сайты инициации транскрипции и трансляции были выбраны на основе ли- . тературяых данных и получены хиыико-ферментативкым синтезом /Красных и др. 1986 /.Плазмида' рЕ№105 отличается От "рВМВ 104 . наличием в своей структуре.сигнального пептида, гомологичного сигнальному пептиду гена альфа-амилазы .способного обеспечивать секрецию гетерологичного белка во внеклеточное пространство. ...

Вэ первом этапе была поставлена задача по изучению эффективности трансформации .репликащгонной'и структурной ста-, бильности пласмия. по оценке уровня синтеза интерферона в трансформированных плазмидаки лабораторных штаммах В. subtt-Из F0170 и EDC24 с тем .чтобы на основании полученных.данных в'йрать ссшСслее перспективную из плазмид для конструирования реь"ксш:онтсз на основе природных сггилюз бацилл.

- 9 - ■ ; ■

Качественный элекгрофоретический анализ препаратов плаз-мид.выделенных из первичных трансформантов .выявил наличие ь препаратах как мономер^й /суперекрученной кольцевой/,так и Мультимерной•форм плазмиды .что позволило провести трансформацию двумя методами :с использованием компетентных клеток В^иОДИг Ю 170 и протопластов В0224.

Установлено, что эффективность трансформации компетентных клеток лабораторного, шташа В. Еиъи 11 э ВШ70 рекомбинаятйымв плазиидамн серии рВШ составляет 6-8x10 /таблица 1/ и соответствует эффективности трансформации плазмиды рРЬ608 /Цэтге^ е!.а1. .1979 /.не содержадей гена интерферона и используемой нами в качестве контроля. При проведении трансформации протопластов увеличение эффективности трансфомации не было достигнуто, и в дальнейших экспериментах применяли для трансформации метод с использованием компетентных клеток, как менее трудоёмкий и более доступный.

Таблица 1 _

. Эффективность трансформации лабораторных штаммов ; В. гиОД 11 з рекомЗинантными ллавмидами.

■ ! количество трансформаитов /х 10*/

Плазмиды I /на 1 мкг ДНК/

. . ■ ! а а. Ю170 I а 5.60224.

I /компетент. ю. / ! /протопласты/

! ■■ 1 _ . .

рВШ104 аб! 0.6 5.4 ± 0.2

рВШ105 - 6.7 £ 0.3 7.0 1 0.1'

ррь 608 4.з ± о. 4 -а б + 0.3

/контроль/ ■ •

- ' . ' . ■ - '

-. Трансформанты были проанализированы на наличие плаз-.мид й соответствие исходным плазмидам по картине рестриктного НзеШ//Взрг1/ -гидролиза. • /

Во всех проанализированных клонах /со 20 клонов каждого вариадта/ плазмиды по додекуляррому ресу и до распределении

(

- 10 - - _ фрагментов Нае111-гидролиза соответствовали исходным. Т, о. установлено .что рексмбинантные плазмиды серии рВШ способны эф^ктивно трансформировать лабораторные штаммы .не претерпевая при этом качественных изменений.

Способность плазмид направлять в трансформантах синтез . . интерферона оценивали по биологической активности интерферона . в клеточных лизатах /таблица 2/.

Таблица 2 -

Синтез внутриклеточного интерферона штаммами В-зиЬиИБ ВО 170.трансформированными _ . •

ре комбинат ними пдазмидами рВМВ. ' 1 .

( _ ■

Плазшла t Титр интерферона,ЫЕ/мл

'_j_: ■ • ■

P&MSÍ04 /6.3 + О. 5/ 2 10J

рБШ105 /5.6 i 0.4/ Х-10a '

pPL60S не определяется /контроль/

Установлено.что рекомбинантные плазмиды серии рБМВ способны обеспечивать в трансформированных штаммах синтез внутриклеточного интерферона, в то время как а контрольном штамме с плазмидоЯ pPL 608 интерферон не определяется.'

ЕЬкасав способность плазмкд обеспечивать в трансформантах -синтез интерферона.важно было выяснить,проникает ли интерферон во Енеклеточное пространства,И'какую роль при этом играет сигнальный пептид в составе плазмиды рВ1й5105. Внеклеточный интерферон определяли в образцах культуральной жидкости при культивировании .трансфоршнтов штамма ED170 Pro- ,с ослабленной экзопротеазкоЛ активностью , полученного методом селекции /табл.3/.

Таблица 3-Сиятез внеклеточного интерферона травоформантами аггамма В. S. ВШ70 Pro-.

Плазмиды !Титр интерферона/МЕ/мл/.определяемый -

! ——-------—-----------——

- ■ ( по антивирусной !, по. JfffiA : ч

I активности ! . .

РБШ105 /4.0 + 0.5/Х 10^ /1.1 ± 0.7/Х 10*

рВ№104 /1,2 ± О.б/х 10* не исследовали

Штамм без не определяется ' плазмиды

Как видно из таблицы, трансформанты штамма BD 170 Pro-, содержащие плазмиду рВМВ105. способны продуцировать интерферон в кудьтуралыгую жидкость,что подтверждается как по цитопатичее :кому действию на ЕМ?лак и имкуноферментным анализом . Безнал чительное количество-интерферона .определяемое у трансформантов {содержащих рекомбинантную плазмиду рБ№104. вероятно. можно объяснить автолизом части клеток в процессе роста. Разница в титрах интерферона при определении двум« различными методами мозкет быть обусловлена либо большей степенью деградации интерферона протеазами при приготовлении образцов культу-ральной жидкости для биологического тестирования, так как в этом случае' требуется длительный диализ.либо наличием в тестируемых образца^ определенной.доли интерферона .не обладающего цитопатической активностью, но способного связываться, со специфическими антителами.

Полученная разница в титрах внеклеточного интерферона может косвенно свидетельствовать о способности плазмиды pBMBlOS обеспечивать в.трансформаитах секрецию интерферона в культу-ральну» жидкость. Плазмида .обеспечивающая секрецию гетеродогич ного белка, более перспективна .по-ватему шению.для создания

- 13 - ' •

рекомбинантных штаммов -основы шкробиотиков,так как молет обеспечивать доставку заданного биологически активного вещест- ■ тва к местам воздействия и пролонгировать его воздействие на макроорганизм при введении препаратов per оз. ■

Для окончательного выбора плазмиды .необходимо было убедиться .что плазмида рВ№105 не отличается по стабильности от рВМВ104,т. к. стабильность плазмиды в рекомбинантном шгам- . ме является одним из важных критериев оценки возможности ее использования для.конструирования биопрепаратов.

Стабильность плазмид в клетках лабораторного штамма ED 170 изучали при многократного пассировайии /до 10 пассажей/, используя различные способы культивирования /поверхностное ,и -глубинное/ и разные среды. Наказана высокая стабильность плазмид серии рВШ. составляющая 92-99 Z .практически независимо от условий культивирования. Стабильность рекомбинантных плазмид после пассирования была исследована с помощью рестриктного анализа и методом гибридизации с EcoRt-Slal. фрагментом рВМВ105, содержащим фрагмент гена интерферона. Кроме того, трансформанты после пассирования были изучены на способность к синтезу интер- . ферона.По картине рестриктного гидролиза рекомбинантных пдазмкд и по уровню синтеза интерферона трансформанты после пассирования соответствовали исходным штаммам. Различий в стабильности меж- . ду рВШ104 и рВШ1С5 выявлено не было .'однако, способность _ обуславливать в трансформаятах синтез внеклеточного интерферона делает плазмиду рВШ105 более перспективной для' дальнейшего конструирования на основе природных штаммов бацилл.обла-даших биологической активностью ■ *

Трансформация этих штаммов плазмидой рВМВ105 проводили. с использованием компетентных: клеток. Эффективность трансфер- ' мании зависела от штамма и варьировала в значительных преде-' лах /от 4x10 - у штамма В.' subti I i s 2335 до 0.4- у R s. 2895^ трансформационных событий на 1 мкг пдазмидной ДНК /таблица 4/. Значительное уменьшение.трансформационной эффективности у -природных штаммов бацилл по сравнению с лабораторным штаммом. -вероятно.обусловлено высокой нуклеазной активностью природных

штаммов /Смирное В.&И др.1984/.что может существенно влиять на проникновение плазмядной ДНК в клетку при трансформации /ЮиЬпаи ,1. ,1983/.

Таблица 4

Эффективность трансформации различных - штаммов бацилл плаэмидой рВЬВ105

Штамм. 1 Эффективность трансформзшги/на 1мгДНК/

В. э. 2335_ /4.0 * 0.8/ ,х 10 * " ' ~~

В. э. 2895 /6.1 Т 0.5/ X 10* . . . "

В. 3.2856 /4.3 ± О, 4/ X 10"'

В. г. ЫЛ70 /б. О ± 0. б/ X 10*

' ' Подученные трансформанты Ез. 2335/105,2895/105,2896/105 были оценены по уровню синтеза интерферона,который определяли по количеству внутриклеточного интерферона. Данные, представлен ные в таблице 5'.свидетельствуют о способности рекомбинантных штаммов .созданных на основе природных штаммов .продуцировать интерферон, причем количество его незначительно уступает количеству интерферона",продуцируемого трансформантами лабораторного штамма В. э. В0170.адаптированного для экспрессии.г®тероло-гичной информации.

Таблица 5 Синтез внутриклеточного интерферона различными рекомбинанткыми биологически активными лггаммаш,Б. зиЬи Иг.

йгамм ! Титры интерферона, Ь£/мл .

" - ' ' I -■"'-'- - - -а зиьи 11 з ; - ■ : ■' ■ ' -, -

2335/105 4 ■ /1.8 + 0.5/х 10 В. 3.2895/105 /2.3 + ,0.4/х 10? . В,5.2896/105 ■ /1,5 + 0.6/х 10*. В. э. ВП170/105 /4.2 + аЗ/хЮ

- 14 -

Способность к стабильному поддержанию введенной генетической информации при пассировании in vivo является важным критерием опенки перспективности штамма длиГсовдания препарата., применяемого per os.

Данные по стабильности рекомбинантных плззмид в лабораторных штаммах бьии подтвериаены при изучении трансформэштов

природных штаммов бацилл. ......

Установлено ,что после 10-ти кратного пассирования игзм-мов через организм лабораторных животных введенная плазмида стабильно сохранялась /в 90S-для В. subtil is 2335/106 88Х -для Е subtl lis 2395/105/, 86% -для В. s. 2896/105. Трансформанты после пассирования анализировали на сохранность способности клеток продуцировать интерферон/таблица 6/.

- Таблица 6 . Синтез внутриклеточного интерферона рекомбинантнъш биологически активными . штаммами после пассирования in viva

¡йгамм • ! Титр интерферона, ЫЕ /х 10*/

« - ' " » ■ • -■ ■ -

В. s. 2335/105 В. s, 2895/105 В. s. 2896/105 В. s. BD170/105 /контроль/

Полученнные данные / табл.5 и 6/ свидетельствуют, что уровень синтеза интерферона рекомбинантными штаммами . В. зиЬШ 15.2335/105, В.-з. 2885/105 и а з. 2896/105 после пассирования практически остаётся неизменным .что свидё- ... . тельствует о высокой стабильности введённой генетической ■ информации в исследуемых штаммах. ■ .'. ■ ■ - "*

Получив данные по стабильной продукции интерферона в различных биологически активных штаммах .было решено для,даль--кейшего изучения ограничится исследованием штамма В. е. 2335/ ;

4.7 ± 0.8 2.0 + 0.5 0. 5 ± 0.6 0.1 + 0.02

. - 15 - .

/1С©, поскольку исходный штамм В. г. 2335 широко апробирован . показал высокую эффективность при лечении и профилактике желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных, получил признание и запатентован в"ряде стран.

фи создании.препарата на основе ревомбинантного штамма, продуцирующего интерферон, для разработки схемы применения препарата необходимо.по возможности .более точно определить уровень продукции не только внутриклеточного ,но и внеклеточного интерферона.Получив предварительные данные о высокой деградирующей экэоаротеазной активности культуральнсй жидкости в опытах.с использованием меченых моноАТ к интерферону,мы посчитали целесообразным для более ерчной оценки уровня синтеза секреторного интерферона использовать трансформанты .дефицитного по зкзооротеазам аналога штамма В. г.2335/Рго-/,полученного методом селекции.Сравнительные.данные по синтезу внеклеточного интерферона штампамиэиьииз 2335/105 и В.э. 2335 Рго-/105 представлены в таблице 7. :

<; Таблица 7

. Синтез внеклеточного интерферона рекоыбинантным игаммом В . зиЬЪШз 2335/105 й его дефицитным по экзопротеазам' аналогом.

Штамм • !Тятр интерферона/МЕ/мл/,определяемый

!...........................-—---

I ■ по шгаопатич. t по ифа ! . действию ! ' ■ *

_!__-■ , I ■ '

В. s. £335/105 /4. 5±0.5/х10Л /6. 4 ИХ 6/XlO ? B.S.2335/105 /3»7+0.4/xiO^" Л.СкО.4/xlO7 . Pro- ■ _

ks. 2335 не определяется не определяется ■/контроль/

Установлено,что рекомбинантный штамм В. subti 11 s 2335/Ш5 способен продуцировать внеклеточный интерферон.тестируемое

' количество которого .подобно в опытах со штаммом Ш170/105 , зависит от'метода определения :по ИФА определяется количество интерферона на порядок превышающее количество,тестируемое по биологической цитопатической активности. • ■ Уровень синтеза секреторного интерферона /с р*ётом деградирующего действия экзопротеаз/ составляет 3,7x10 НЕ/мл /по цито-патическому действия/ или 1x10. МЕ/мл /по ИФА/,

Дополнительно» „ данные .свидетельствующие о способности -рекомбинантного штамма В- е. 2335/105 продуцировать* внеклеточный интерферон были получены с помощью белкового.электрофореза при сравнении кулътуральной жидкости рекокйинантного< И исходного штаммов о использованием в качестве контроля реаферова /рекомбинаятного «ттерфероза, рис. 3/,

.Полученные'данные свидетельствуют о принципиальной воз- ■

1 2-3 4 5 б

1КР

Рис. 3. Электрофореграмма белков кудьтуральной

жидкости 1-2 -В.а2335Рго-/105.-3-4 -а £. 2335/исходн. штамм/ 5-6 -реаферон /2мкг,10мкг /

' " • - 17 -

мошости создания рекомбинантных штаммов .способных стабильно сохранять и экспрессировать введённую генетическую информацию на основе природных штаммов бацилл. ДДя определения возможности конструирования на основе штамма В. з. 2335/1С5 нового биопрепарата .необходимо было изучить специфическое.антивирусное воздействие штамма на макроорганизм него безвредность,

Глава 4. Экспериментальное изучение специфической активности и безвредности рекомбинантного штамма

В. s. 23^/105. . . '

Специфическую. <ттротивовирусную активность рекомбинантного штамма изучали на модельной особоопасной инфекции .вызываемой вирусом энцефаломиелита лошадей./БЭЛ/ при заражении чувствительных к ВЗЛ животных /морских свинок/. Эта вирусная инфекция традиционно используется при определении уровня противовирусного защитного-действия интерферонов. Защитный- профилактический эффект оценивали по количеству выживших животных .

Ожазало,что рекомбияантный агамм в отличие от исходного, обладает способностью' защищать жиботньк от заражения ЮЛ /таблица 9/. Показатели защиты при особоопасной вирусной иафек-'. шш .составляивде 30%.характеризуют умеренную степень зашиты, наблюдаеьюй при парентеральном введении реаФерона /Шеничисв и др. ,1988/. Следует отметить,что пе'роральное введение препаратов интерферона не оказывает профилактического действия из-за деградации его ферментами желудочно-кишечного тракта.

' Таблица 9 „: Залетное действие рекомбинантко^о штамма: при особоопасной вирусной, инфекции. -

Вариант : ! Лоза ■ i ЧИСЛО Число . ! Зашта/Х/

! вируса I животных 1 павших !

( ! ( t

Рекомб. штамм LD/0 10 2 30

R s. 2335/105 ■ 10 б '20

LD«e . 10 . 10 0

. U) s* ■ 10. .. 5 о "

Исход, штамм '. LD« .'10 9 0

as. 2335 LD^ 10 10 * ■ о

1ДЙ> 10 5

Контроль LDjc .10 . 8

вируса . W-fce .10 10

Для выяснения механизма .антивирусного действия реком-бинантного штамма проводили титрование эндогенного интерфе- ' рона /<а и' $ / в сыворотках крови мдпей .которым per os вво-. дшш суспензию.бактериальных клеток. Установлено /таблица 10 /, что пероральвое введение живых бактерий штамма В. s. 2335/105 обладает интерферониндуцирующёй активностью.в несколько раз ■ превышающей гащуиирушую активность исходного штамма. Количест- ' во эндогенного интерферона,индуцируемого рекомбинантным штам^ мом в 6.5 раза превосходит количество .необходимое, согласно литературным данным / Пшеничнов и др. .1988/,для обеспечения ' противоврусной защиты макрооргавизма.

Полученные нами результаты по индукции -интерферона .подтвер-ляакггся литературными данными .свидетельствующими о возможное-, ти индуцирования ¿-интерферона при введении <к- интерФерона/Ве-дади и др. .1983/.

- 19 -Таблица 10

Продукция эндогенного интерферона у мышей после перорального введения штаммов В. subtil is

Штамм

Кратность (Кол-во клеток! Максимальн.! Титр введения ! при. одном (титры сумм. ( ^интерфе-! введении на ! '/«i- + £ / ! рона,

Реком. штамм

В. s. 2305/105

мышь

5x10 9 5х10э 5x10s

(интерферона! МЕ/мл

! МЕ/мл ! ; __

SO ± 8.7 -40 + 5.9 160 + 11.5 80 + 6.4 640 i 10. 2 320 + 15.1

Исходи. 1 5x104 « <20 -

штамм 2 5x103 80 ± 8.5 40 +14.5

В. s. 2335/105 3 ■ 5x10Э <20

Для окончательного решения о принципиальной возможности создания на основе рекомбинанткого штамма нового биопрепарата неойходмо было'всесторонне изучить безвредность сконструированного нами штамма.

При определении безвредности изучали токскгенность .вирулентность и токсичность 3. subti11s 2335/105 при различных условиях культивирования и после йассирования in vitro й ir. vt vo. Eto результатам испьггачий не выявлено отличий мутаду ре-комбинаятным и исходным штаммами. В. s. 2335/105 характеризовался полной безвредность» для теплокровных.что позволило считать его перспективным для создания пробиотических препаратов нового поколения.

Глава 5. Сравнительное изучение биологических

свойств исходного и' рекомбинактного штаммов.

При изучении биологических свойств рекомбинакткого штамма В. subti Ils 2335/105 особое внимание уделяли'$изиолого-био-химическим признакам.характерна для этого вида бактерий »а также те« свойствам,которые обусловливав антибактериальную активность. •

Установлено.что подобно исходной культуре ,рекомбняант-ный;штамм характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных ыикроорга-HMSMOV таблица 11/. ~

- Таблица 11

Сравнительное изучеяие антагонистической . активности штаммов В. subti lis.

Тест-культуры ! Зоны торможения роста тест-культур, мм

C !_________ ., , _.

! B.S, £335 ! 3. s. 2335/105

__!__t

Salmonella wesl aco247/49 26-28 28-30

S. derby 1519 15-17 ■ 15-17

Eigelia sonnei 659' 18-23 ' 16-23 *'

Z. fl «xneri 35/59 2&-34 28-54

Kl ebsi el 1 a pneumoni ae 5055 14-17 , 10-14

staphylococcus aureus 1479 28-30 28-30 ,

S. aureus 1623 24-26' 24-26 .

. Proteus.vulgaris 72 16-18 15-18,

P, vulgaris 171 24-27 '24-27

Pseudomonas aerogin. 4141 12-13 • 1E-13

P. aerogi n 4157 10-11 10-11

Candida tropica) 517 20-30 27-29

C. albicans 1106 31-33 29-31

Изучение основных культурально-морфологических /морфологии колоний.окраска по Граму и 2р. / и Физиолога-биохимических свойств /редукция нитратов,образование кислот из различных Сахаров .ферментативная: мелатиназная.амилазная. целлшаэная .лизоцимная активности и др. / рекомбинантногс и исходного штаммов не выявило каких-либо отличий между ни-ми.Т.о. рекомбакантныЯ штамм В.зиЬШ1з 2335/1С5 .полученный методами генетической инженерш .сохранил основные физиодо-го-биохикические свойства и антогснистичесвую активность исходной культуры. Учитывая эти данные ,а также противовирусную активность полученного штамма и его безвредность для животных, мы посчитали перспективным использовать штамм а г. 2335/105 в качестве оснсвы нового пробиотического препарата Субалин."-

Глава б.Создание препарата Субалин.

В процессе конструирования препарата нами было предложено создание Субалина в двух видах Субалина-П. основу производства которого составляет поверхностное культивирование штамма и последуйте лиофидьное высушивание в ампулах ;и Субалина-О , полученного при суспензионном культивировании и высушивании на распылительной сушке с последующей расфасовкой псрсшка э полиэтиленовые пакеты и изготовлением на его основе тзблетск.

В основу разработки производства Суоахша-П были положены условия получения препарата Бактерия-СЯ На основе, экспериментальных данных разработана Инструкция по изготовлению и контроля Субадина-П.

Для разработки условий получения Субалина-С,основанного на глубинном культивировании.необходимо было провести дополнительные исследования.

. йа первом этапе была подобрана среда культигирсводкя ' штамма. При выборе среды учитывалось несколько параметров: выход биомассы .время'культивирования для получения максимального титра живых клеток .время .необходимое для спекуляции не мен-г-*

50Х клеток. При подборе сред немаловажным было учитывать доступность составляющих ингредиентов среды.. t

Изучены среды различного состава: среди.Спецайзена, обогащенная гидролизатом казеина' и дрожжевым экстрактом /N1 /, среда с пептоном и дрожжевым экстрактом /N 2/, среда Спечайзе-на минимальная с глккозой /N3/. \ ,' „ ' .

результаты исследований /твбл! 12/ свидетельствуют, что наиболее оптимальной по совокупности оцениваемых параметров является среда.Н1. Установлено,что при вырадавании культуры на этой среде в более ранние сроки наблюдали наибольшее накопление биомассы и 50S споруляцию у изучаемого штамма.

- Таблица 12

Параметры роста и физиологического состояния рекомбинантного штамма В. subti lis при культивировании на разных средах.

■! ! !Еремя культиврования /ч/ при

N п/п I Выход t Максим. -! . котором достигается

среды! б/массы I титр t--------------------т——.----——-

0 ( /г/л/ 1 клеток t макс, титр клеток t 50Т споруляция . _I I_i . t

1 10.'6 1-3x10* ' ■ .0-9 ..' ■ ; 52-54'

2 9.7" ; 1-2Х105 * 9-11 - 60-61 - '

■ ■ t» <

3 8.0 . 0.7-1x10* 8-9 . .58-59

Полученные результаты позволили ~ иас штабировать'процесс культивирования с использованием 50-ти литрового ферментёра и среды N1. Закономерности культивирования рекомбинантного штамма, установленные в опытах на качалках .были подтверждены также при выращивании в ферментёрах. В результате проведенных исследований получены 5 партий Субалина -С. Полученные партии были охарактеризованы по количеству живых микробных

клеток в 1 г препарата.по содержанию спор.по процентному со^ держанию остаточной влаги .экспериментальные данные были положены в основу требований к готовому препарату, стандартный препарат Субзлин-С должен содержать не.менее 1x10 клеток в 1 г ' порошка .количество споргне.менее 502 и остаточная влажность -должна составлять не более 62.

Ш основании экспериментальных данных была ргюраЗотана технологическая схема получения препарата Субалш-С.*« состав. лена документация для представления в ВетфарысоБет и в ГИСК им. Тарасевича . ; \

В процессе последующей апробации Субалша большее внимание уделяли изучению его влияния ад макроорганизм. В' опытах на сельскохозяйственных животных .проведенных нами с участием Всесоюзного института ветеринарии /АН Украины/ на телятах установлено,что препарат безвреден .не вызывает осложнений ,не имеет противопоказаний.безопасен в применении.

В опытах на поросятах-сосунках.проведенных нами с участием Института ветеринарии 00 АН России, в условиях промышленного комплекса в районе неблагоприятном по энтеровирусным /парво- и ротавирусныы/ заболеваниям было установлено .что Субалии оказывает профилактическое действие по эффективности превышайте антибиотики. - ^

' Таким образом результатом всего комплекса проведенных вше исследований явилось создание препарата Субалдо .обеспечение его производственного выпуска и.внедрение в народное хозяйство. *.*■ ■

; . ЙЛБОДЫ. ■'

„1. Показана принципиальная возможность создания рекомбинантных штаммов бацилл. .прояушрутаих заданные .биологически активные вещества и сохраняло« при этом высокую исходную биологическую активность. ,

2.Евведенная генетическая информация стабильно сохраняется в культурах и наследуется при различных способах культи-

- 24 - - ■ . ;

виров&ния ,а также при длительном пассировании штаммов .

3. Отсбран штамм B.subtilis 2335/105 -наиболее перспективный для создания биопрепарата нового типа .Штамм характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенньи багаерий ,а такаю слосоОностью продуцировать интерферон типа альфа 2.

4. В опытах на тавотных в экспериментальной модели особо опасной вирусной инфекции ^-энцефаломиелита лошадей -показана антивирусная активность рекомбинантного штамма .Уровень ваш-ты животных при пероральном Еведении В. subti î i s.2335/105 соответствовал показателям .полученным при инъегашонном введении " реаферона. ' . ' • ■

5. Установлено, что уровень интерферон-индушруодей ак-. "■ гизности штамма В.subtjlis £335/105 обеспечивает антивирусную зациту макроорганизма. .

5. При изучения вирулентности .токсичности и токсигеннос-ти штамма В. subtí 1 i s 2335/105 подтверждена его полная безвредность для макроорганизма. ■.

7.На основе рекомбинантного штамма сконструирован новый, биопрепарат Субалин .характеризующийся как антибактериальной, так и антивирусной активность» sa счёт продукции интерферона, разработана технология его производства. .

. СПИСОК РАБОТ .ОПУБЛИКОВАННЫХ ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЯ.

1.Белявская В. А. .Ильичёв A.A. .Красных Ей.'. Стабильность рекомбинантных плазмил в различных штаммах бацилл. //Tes. докл. VII Всессш. симпозиума "Шлекулярн. механизмы генетических процессов".-Ы. .1990.-с.197. . .

2.Siramov V.V. .Belyavskaya V. A. .Sorokulóya I.B.et.al. perspectives for use of Baci 11 us subtilis reconbiriant straíns in bi opreparati oris //6-th intern. sympos. "Genet) cs of í ndust-riai шcroontanisns"-Strasburg.1990 V

а Смирнов В. В. .Резник С. Р. „Сорокулова И. Е ; Белявская В. А. и др. Перспективы использования генно-инженерная культур в

. _ - 25 -

конструировании микробиотиков для животноводства //Тез. докл. ' Бсесоюзн. нучн. конфер. "Новые направления сельскохозяйствен.биотехнолог. -А-Ата.1990,

4.Белявская В. А. .Ильичёв А. А. Конструирование рекомбинант-. ного штамма B.subtilis .продуцирующего интерферон альфа 2 .

чэловека//Тез. докл. VI I съезда микробиол. об-ва . -Киев-Черновцы: Наукова думка .-1989. -ч. 2-е. 15.

5.Смирнов В. В. .Белявская В. А. .Ильичёв А. А. и др: Ilirai-iM ' Bacillus subttlis - антимикробный и антивирусный агент.Положит, решение по заявке H 483655/13/063118 or Об. 04.9

6. Смирнов В. В. .Резник С. Р. .Сорокулова И. Б, .Сандахчиев ' JLС. .Петренко RA. .Ильичёв A.A. .Белявская В.А.И др. -Профилактический биопрепарат Субалин. Положительное "решение по заявке H 5025233/13/005316 от 06.07,92. : '<■•".'

fit"