Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка нового препарата-пробиотика "Витаспорин" и изучение его биологических свойств

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка нового препарата-пробиотика "Витаспорин" и изучение его биологических свойств"

На правах рукописи

Байгузина Светлана Назибовна

РАЗРАБОТКА НОВОГО ПРЕПАРАТА - ПРОБИОТИКА «ВИТАСПОРИН» И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Уфа-2004

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Башкирского государственного медицинского университета и на базе ГУДП «Биофаг» ГУП «Иммунопрепарат».

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РБ, доктор медицинских наук, профессор Габидуллин Зайнулла Гайнулинович.

Официальные оппоненты:

1. Доктор биологических наук, профессор Карташова Ольга Львовна.

2. Доктор медицинских наук, профессор Каган Юда Давидович.

Ведущая организация: Челябинская государственная медицинская академия.

Защита состоится С--2004 г. в «_» часов на заседании дис-

-?-' -

сертационного совета Д7208.066.03 при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6, чал заседаний диссертационного совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Оренбургской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Н.В. Немцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В условиях обострившейся экологической обстановки, широкого применения высокоактивных химиотерапевтических препаратов наблюдается тенденция к увеличению патологий, связанных с изменением нормальной микрофлоры человека. Наряду с этим расширяется спектр потенциальных возбудителей микотических поражений. Клинические проявления инфекций, обусловленных грибами, широко варьирует от поверхностных поражений слизистых оболочек и кожи до угрожающей жизни инвазивных микозов, при которых могут поражаться любые органы (О.К. Хмельницкий и др., 2000)

Применение антимикотиков и антибиотиков во многом решало проблему инфекционных осложнений, вызванных условно-патогенными, патогенными бактериями и грибами Однако в последние годы эффективность антибиотиков и антимикотиков существенно снизилась за счет возникновения широкой резистентности патогенных микроорганизмов и грибов ко многим группам антибиотиков. Кроме того, возросла прослойка людей среди населения, страдающими аллергическими реакциями на применение антибиотиков, вплоть до их полной непереносимости.

В этой связи большой интерес представляют препараты-пробиотики из спорообразующих бактерий рода Bacillus, обладающих широким спектром антагонистической активности в отношении патогенных и условно-патогенных, патогенных бактерий и грибов и способных оказать комплексное лечебно-оздоровительное действие на весь организм.

Применение препаратов-пробиотиков из бацилл обусловлено их преимуществами перед антибиотиками: широкий диапазон лечебно-профилактического действия, безвредность для организма, экологическая безопасность, относительная дешевизна (И.М.Нахабин, В.В.Перелыгин, 1996).

В настоящее время в отечественной практике выпускается и успешно применяется для профилактики и лечения дисбактериозов, кишечных инфекций, гнойно-воспалительных заболеваний единственный препарат-пробиотик на основе Bacillus subtilis 534 - «Споробактерин жидкий» (М В. Никитенко и др., 2004).

Вышеизложенное определило актуальность в расширении списка отечественных биопрепаратов на основе штаммов Bacillus subtilis, способных оказать антагонистическое воздействие на возбудителей заболеваний бактериальной и

грибной патологии.

НАЦИОНАЛЬНАЯ{

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования является выделение природного штамма Bacillus subtilis и разработка на его основе нового медицинского препарата-пробиотика.

Задачи исследования:

1. Выделить из природного материала наиболее активный штамм бактерий рода Bacillus, обладающий широким спектром антагонистической активности в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий и грибов.

2. Изучить биологические свойства нового штамма Bacillus subtilis и возможность его использования как основа нового биопрепарата.

3. Разработать научные основы технологического процесса культивирования нового штамма Bacillus subtilis, позволяющий получить биомассу популяции с максимальным количеством жизнеспособных клеток в споровой форме.

4. Создать новый препарат-пробиотик на основе выделенного штамма Bacillus subtilis, изучить его специфическую активность и стабильность свойств при хранении.

5. Изучить эффективность препарата «Витаспорин» при лечении зооноз-ной трихофитии в опытах на экспериментальных животных.

Научная новизна.

Выделен и идентифицирован штамм Bacillus subtilis 11В, обладающий широким спектром антагонистической активности как в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий и грибов, вызывающих заболевания человека. Штамм депонирован под номером ВКМ 2218Д во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина и защищен патентом РФ №2182172 от 10.05.2002 «Штамм бактерий рода Bacillus, обладающий широким спектром антагонистической активности».

Разработаны научные основы периодического гомогенного глубинного культивирования штамма Bacillus subtilis 11В с целью получения максимального выхода биомассы жизнеспособных бактерий и спорообразования в зависимости от: состава питательной среды, оптимальной дозы посевного материала, физико-химических параметров

РАН. Создан новый препарат - пробиотик «Витаспорин», сухой, показана его эффективность в комплексном лечении зоонозной трихофитии в опытах на экспериментальных животных и запатентован: патент РФ № 2181596 от 27.04.2002 «Лекарственный препарат из бактерий рода Bacillus».

Научно-практическая значимость.

Получен новый производственный штамм бактерий Bacillus subtilis 11В и показана возможность его использования в качестве основы нового препарата.

Разработаны научные основы промышленного технологического процесса культивирования штамма Bacillus subtilis 11В. патент РФ № 2182172 от 10.05.2002 «Штамм бактерий рода Bacillus, обладающий широким спектром антагонистической активности».

Создан новый медицинский препарат-пробиотик «Витаспорин», сухой. Получено 15 экспериментально-производственных серий препарата - пробио-тика «Витаспорин»

Составлена нормативно-техническая документация на препарат «Витаспо-рин», сухой (ФСП, ЭПР, Инструкция по применению) и передана на экспертизу в raCK им. Л.А.Тарасевича.

Показана эффективность препарата при лечении зоонозной трихофитии в опытах на экспериментальных животных.

Составлена и утверждена программа клинических испытаний для оценки лечебного действия препарата - пробиотика «Витаспорин», сухой в Государственном институте сертификации качества им. Л.А.Тарасевича; в комитете по медицинской этике при Национальном органе контроля медицинских иммунобиологических препаратов МЗ РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выделен из природной среды штамм Bacillus subtilis 11B, обладающий широким спектром антагонистической активности в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и грибов.

2. Разработан оптимизированный процесс периодического гомогенного глубинного культивирования штамма Bacillus subtilis 11В на сбалансированной питательной среде, позволяющий получить максимальный выход биомассы жизнеспособных клеток в споровой форме.

3. Создан новый препарат-пробиотик «Витаспорин», сухой, показана его эффективность в комплексном лечении зоонозной трихофитии в опытах на экспериментальных животных.

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на ряде научных форумов: Всероссийской научно конференции молодых ученых филиала ФГУП «НПО» Мик-

роген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» - «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004).

Апробация диссертации проведена на совместном межкафедральном совещании Башкирского государственного медицинского университета. ФГУП «НПО Микроген МЗ РФ филиал «Иммунопрепарат»» и Башкирского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (протокол № ] от 5 ноября 2004 г.)

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных научных работ и получено 2 патента Российской Федерации на изобретение.

Объем и структура диссертационной работы.

Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из оглавления, введения, обзора литературы, 4 глав собгтвенных исследований, заключения и выводов. Библиографический список литературы содержит 166 источника (130 отечественных и 36 зарубежных). Работа содержит 34 таблицы и 6 рисунков.

Содержание работы Глава 3. Материалы и методы исследований

В работе использовали коллекцию культур, выделенных из природного материала - здоровых частей яровой пшеницы. Основным объектом изучения являлся - штамм бактерий Bacillus subtilis 11B, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина под номером ВКМ В - 2218Д.

15 экспериментально-производственных серий препарата «Витаспо-рин», сухой, полученные на базе цеха производства препаратов на основе спо-рообразующих бактерий ГУДП «Биофаг».

Для изучения спектра антагонистической активности штамма и препарата были использованы 380 тест-штаммов патогенных и условно патогенных бактерий (по 20 штаммов каждого вида), полученные из Всесоюзного музея живых культур ГИСК им Л А Тарасевича; музея штаммов ГУДП «Биофаг» и 48 штаммов патогенных грибов (по 2 штамма), полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К.Скрябина

В работе использованы: белые, беспородные мыши массой 14-16 г и морские свинки массой 220-250 г, кролики породы Шиншилла массой 2,0-2,5 кг -из питомника лабораторных животных филиала ФГУП «НПО Микроген» МЗ

РФ «Имчунопрепарат». Белые беспородные крысы-самцы массой 200-220 г - из Рапполовского питомника лабораторных животных (г. Санкт-Петербург). Белые мыши линии BALB/C массой 14-16 г- из ОАО «Биомед» (Московская область). Все работы с животными проводились в соогветствии с правилами и методиками, изложенными в приказе Минздрава СССР № 0775 от 12.08.1977 г.

Методы исследования:

Выделение бактерий рода Bacillus из изолированных участков растений проводили по методу IJ.Misaghi, C.R.Doundelinger (1990).

Питательные среды: мясо-пептонный бульон и плотная (1,5%; 2,2%) ка основе мясо-пептонного бульона; картофельно-глюкозная плотная среда (1,5%); Среда Гаузе № 2; синтетическая питательная среда Егорова.

Морфологию клеток и спорообразование изучали на мазках, окрашенных по Граму при помощи светового микроскопа биологического «МБИ-6» под иммерсией при увеличении 90x15.

Подвижность штамма Bacillus subtilis I IB определяли при посеве культуры на полужидкий мясо-пептонный агар (0,45 % агара) уколом (В.В.Смирнов и др., 1983).

Биохимические свойства штамма Bacillus subtilis 11В изучали на способность продуцировать протеазу, желатиназу, амилазу, липазу, каталазу, лецити-назу, ферментировать глюкозу, сахарозу, маннит, мальтозу, гидролизовать крахмал, мочевину, расщеплять тирозин и утилизировать цитрат, образовывать аммиак, индол и сероводород (В.В. Смирнов и др., 1983).

Гемолитическую активность штамма Bacillus subtilis I IB определяли путем рассева на кровяной агар. О наличии гемолитической активности штамма судили по образованию зоны просветления вокруг колонии культуры на агэре (В.В.Смирнов и др., 1982).

Фибринолитические свойства и эластазную активность определяли согласно методических рекомендаций (В.В.Смирнов и др., 1983).

Изучение особенностей клеточной структуры клеток штамма Bacillus subtilis 11 В проводили с помощью электронного микроскопа (JEM-100B) на базе лаборатории филиала ФГУП «НПО» Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепа-рат» под руководством научного консультанта к.б.н И.Б. Ишкильдина.

Чувствительность штамма Bacillus subtilis 11B к антибиотикам изучали по общепринятой методике с помощью стандартных дисков, пропитанных антибиотиками (Л.Е. Бриан, 1984).

Антагонистические свойства штамма Bacillus subtilis 11B к условно патогенным, патогенным бактериям устанавливали методом отсроченного антагонизма по отношению к вирулентным штаммам условно патогенных бактерий (Н.С. Егоров, 1986).

Для определения антагонистической активности штамма Bacillus subtilis 11B в отношении патогенных грибов, были использовали различные методы отсроченного антагонизма in vitro: метод колодцев, метод агаровых блоков, метод укола (В.И. Билай, 1982, Л.В. Калакуцкий, 1992).

Адгезивную активность штамма Bacillus subtilis 11B определяли в реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка (Габидуллин З.Г. и соавт. Авторское свидетельство № 1312098,1987).

Безвредность (вирулентность, токсичность, токсигенность штамма, влияние на нормальную микрофлору организма, способность к контаминации внутренних органов) штамма Bacillus subtilis 11B изучали по методике В.В.Смирнова и др.(1983).

Изучение аллергизирующих свойств штамма Bacillus subtilis 11В проводили в опытах на экспериментальных животных с использованием следующих методов: изучение анафилактогенной активности, реакция непрямой деграну-ляции тучных клеток крыс, метод активной кожной анафилаксии, реакция гиперчувствительности замедленного типа согласно методическим рекомендациям (Б.И.Любимов и др., 1999).

Безопасность препарата изучали на базе лаборатории токсикологии филиала ФГУП «НПО» Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» под руководством к.м.н. Н.В. Мельникова в соответствии с Методическими рекомендациями по изучению общетоксического действия фармакологических средств и Санитарными правилами СП 3.3.2-561-96 (Медицинские иммунобиологические препараты).

Идентификацию бактерий рода Bacillus проводили на основе изучения морфологических, культуральных и биохимических свойств штаммов по «Определителю бактерий Берджи» (1997).

Методы культивирования. В работе использовали 2 метода культивирования (И.А. Баснакьян, 1992). 1. Метод периодического статического культивирования использовали для получения посевного материала штамма Bacillus subtilis ИВ в пробирках с объемом среды 5 мл, флаконах с объемом среды 50 мл, матрасах с объемом среды 250 мл.

2.Метод гомогенного глубинного культивирования штамма Bacillus subtilis 11B проводили в ферментере БИОР - 01 (г. Кириши) в объеме 100 л (27 опытов).

Физиологическую активность бактериальной популяции в процессе культивирования рассчитывали по формулам (С.Д.Перт, 1978):

Количество микробных клеток в 1 мл маточной культуры, биомассы в процессе выращивания, препарата после сушки определяли с помощью ОСО 42-8586 (эквивалент дозы 1x109 микробных клеток в 1 мл) в оптических единицах (ОЕ) и фотоэлектроколориметра КФК-2МП при длине волны Х- 540 нм.

Определение количества жизнеспособных клеток бактериальной популяции проводили чашечным методом (Ф. Герхард, 1983).

Экспериментальную модель зоонозной трихофитии на мышах линии BALB/C использовали для определения эффективности препарата «Витаспорин» (Ю.А.Медведева, 1989).

Статистическую обработку результатов проводили на основе общепринятых статистических методов (И.П.Ашмарин, А.А.Воробъев, 1962). Результаты представлены в виде М±т, где М - средняя арифметическая, m - стандартная ошибка средней арифметической. Оценку значимости различий средних арифметических проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Различия исследуемых величин считали статистически значимыми при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 4. Выделение и характеристика биологических свойств штамма Bacillus subtilis 11B

Нами проведены исследования по подбору нового производственного штамма путем выделения его из природной среды и селекции по спектру антагонистической активности в отношении ряда патогенных и условно патогенных бактерий и грибов.

Поиск проводился среди 56 колоний, которые выявлялись на диагностических средах, рекомендованных для выделения бактерий рода Bacillus (В.В.Смирнов, 1982). В результате комплексного изучения физиологических и биохимических свойств полученной из колоний популяций, бактерии были отнесены к семейству ВасШасеае, к 1 морфологической группе рода Bacillus - Bacillus subtilis. Дальнейший подбор среди выделенных бактерий проводили пу-

тем скрининга бактерий-антагонистов 4 штаммов с порядковыми номерами 3, 11,12, 19. В результате наших исследований по изучению спектра антагонистической активности, был выбран штамм с порядковым номером 11, как наиболее перспективный для создания препарата-пробиотика, поскольку помимо антибактериальной активности, он обладал антагонистической активностью против грибных патогенов. Штамм был наименован - Bacillus subtilis 11B и использован как основа препарата «Антигрибок» для зашиты растений против бактериальных и грибковых заболеваний.

С целью возможности использования Bacillus subtilis 11В в качестве основы медицинского препарата, дальнейшее его изучение проводилось согласно требований, предъявляемых к производственным микроорганизмам.

Изучение культуральных свойств штамма показало: при посеве на плотные питательные среды (мясо-пептонном агаре, картофельно-глюкозном агаре) штамм образует колонии в виде единичных мелкоморщинистых колоний бежевого цвета различной интенсивности округлой формы с волнистыми краями, поднимающиеся над агаром, вязкой консистенции. На жидких питательных средах (мясо-пептонном бульоне) через 18 - 24 ч растет в виде беловатой пленки и придонного осадка, вызывая помутнение среды. На окрашенных по Граму препаратах бактериальные клетки представляют собой грамположи-тельные палочки. При посеве культуры на полужидкий мясо-пептонный агар (0,45 % агара) уколом было показан о, что бактериальная клетка подвижна.

Штамм Bacillus subtilis 11B является строгим аэробом, имеющим оптимальные условия роста при температуре 37 °С и рН 6,0-7,5.

При просвечивающей электронной микроскопии бактериальные клетки представляли собой клетки палочковидной формы, величина которых составляет от 1,5 до 2,8 мкм в длину и от 0,6 до 0,9 мкм в толщину, располагающиеся одиночно попарно или цепочкой. Вокруг клетки виден слизистые выделения или слизистый слой, служащий дополнительной защитой клетки и для формирования колоний из отдельных клеток.

Изучение биохимических свойств показало, что штамм Bacillus subtilis 11В продуцирует ферменты: протеазу, амилазу, желатиназу, каталазу. Штамм овладеет так же фибринолитической и тромболитической активностью. Штамм гидролизуют в процессе ферментации казеин, желатину, крахмал. Не гидролизует мочевину, не об-

разует аммиак, индол и сероводород. При посеве на среды Гисса исследуемый штамм с образованием кислоты расщепляет без газа глюкозу, сахарозу, мальтозу; не ферментирует лактозу, маннит. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра.

Определение факторов патогенности в опытах in vitro показало, что новый штамм Bacillus subtilis ИВ не продуцирует лецитиназу, уреазу, липазу, гиалоуро-нидазу; отсутствие зоны просветления при рассеве бактериальной культуры на кровяной агар показало, что штамм не обладает гемолитической активностью.

Изучение адгезивной активности Bacillus subtilis 11В показало низкую активность штамма в реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка.

Как показали результаты исследования, культура штамма Bacillus subtilis ИВ обладает широким: спектром антагонистической активности по отношению ряда условно-патогенных патогенных бактерий и грибов (таблица 1).

Полученные данные позволяют сделать вывод о широком диапазоне и высокой степени антагонистической активности штамма по отношению: Candida albicans., Shigella sonne, Shigella flexneri IY, Shigella flexneri III, Shigella flex-neri I, Salmonella typhirnurium, Salmonella typhi, Salmonella С infantis, Salmonella D enteriditis, Salmonella paratyphi B, Salmonella paratyphi A, Yersenia Enterocoli-tica, Streptococcus D, Streptococcus pyogenes. Наименьшая литическая активность отмечена к самым устойчивым бактериям Pseudomonas aeruginosa.

Для проверки спектра антимикотической активности штамма были выбраны 17 штаммов мицелиальных грибов, выделенных из разных мест. Отобранные штаммы относились к патогенным грибам, вызывающие наиболее распространенные заболевания человека (таблица 2).

Все выбранные культуры хорошо растут на обычных питательных средах, но для эксперимента была выбрана картофельно-декстрозная среда, так как на ней хорошо растут не только все отобранные грибы, но и культура бактерии Bacillus sub-tilis 11В, составляющая основу препарата «Витаспорин». Оценку влияния препарата проводили с использованием трех методов в зависимости от состава клеточной стенки, типа мицелия, способу спорообразования и другим параметрам, различающие широкий спектр грибов (рисунок 1, рисунок 2, рисунок 3).

Таблица 1

Спектр антагонистической активности штамма Bacillus subtilis 11В в отношении тест-штаммов бактерий

Тест-штаммы Кол-во тест- Кол-во чувст- % чувстви-

штаммов вительных штаммов тельных штаммов

Escherihia coli 30 19 63,3

Staphylococcus aureus (Филиппов) 35 29 82,9

Staphylococcus aureus (Никифоров) 31 29 93,5

Pseudomonas aeruginosa 10 4 45,6

Proteus mirabilis 30 22 73,3

Proteus vulgaris 38 26 68,4

Streptococcus pyogenes 20 20 • 100

Streptococcus D 17 17 100

Yersenia Enterocolitica 22 22 100

Salmonella paratyphi A 10 10 100

Salmonella paratyphi В 10 10 100

Salmonella С infantis 10 10 100

Salmonella D enteriditis 10 10 100

Salmonella typhimurium 6 6 100

Salmonella typhi 4 4 100

Shigella fexneri I 10 10 100

Shigella fexneri III 10 10 100

Shigella fexneri IY 10 10 100

Shigella sonne 12 12 100

Candida albicans 15 15 100

Таблица 2

Тест штаммы патогенных грибов, использованные при изучении антагонисти-

ческой активности штамма Bacillus subtilis 11 В

Название гриба Группа пато-генности* Характер заболеваний Номер ВКМ

Alternaria alternate Keissler BSL-1 Кожные инфекции, эндоф-тальмиты, онихомикозы. F-1120

Aspergillusflavus BSL-2 Аллергические бронхиальные и легочные аспергиллезы F-1024

Aspergillus nidulans BSL-1 Легочные инфекции, синуситы, остеомиелиты и др. F-1567

Aspergillus niger BSL-1 Отомикозы, легочная аспер-гиллема F-1119

Bipolaris australien-sis BSL-1 Синуситы, кожные инфекции F-3040

Chysosporium keratinophilum BSL-1 Онихомикозы F- 2875

Cladosporium herbarum BSL-1 Кожные инфекции, кератиты F-1685

Exophialajeansel-mei BSL-2 Феогифомикозы, хромобла-стомикозы и др. F-421

Exophialasalmonis BSL-1 Феогифомикозы рыб F- 3000

Paecilomyces vari-otii BSL-2 Пневмония, синуситы, эндоф-тальмиты и др. F-378

Phialophora verru-cosa BSL-2 Хромибластомикозы F-1990

Piedraia hortai BSL-1 Заболевание волос (черная пи-едра) F-392

Pseudallescheria boydii BSL-2 Белая мицетома, артриты, отиты и др. F-1474

Absidia corymbifera BSL-2,3 группа СП Кожные микозы, глубокие микозы у людей с ослабленной иммунной системой F-648

Mucormucedo 3 группа СП Мукоромикозы F-1356

Rhizopus micro-sporus BSL-2 Кожные и гастроэнтеральные формы микозов F-3688

RRhizopus oryzae BSL-1 Разные типы мукоромикозов F-620

Рис. 1. Влияние штамма Bacillus subtilis 11B на рост культур грибов (Метод агаровых блоков, 6-е сутки роста)

Рис. 2. Влияние штамма Bacillus subtilis 11В на рост культур грибов (Метод укола)

Как видно из диаграмм, из всех изученных грибов полное подавление роста наблюдалось культуры гриба Paecilomyces vanotii в течение всего времени эксперимента (7 суток). Наименьшему воздействию штамма подвержены Aspergillus niger, Aspergillus flavus, при подавлении их на 3 сутки, на 7 сутки наблюдалось уси-

ленный рост грибов. Результаты наших исследований показали высокую степень до 96,7 % антимикотической активности нового штамма Bacillus subtilis 11В к грибам Alternaria alternata, Aspergillus nidulans, Bipolaris australiensis, Cladosporium heibarum, Bipolaris australiensis, Chrysosporium keratinophilum, Chrysospoiiiim keratinophilum, Cladosporium herbarum, Exophiala salmonis, Paecilomyces variotii, Phialophora verrucosa, Piedraia hortai, Pseudalleschena boydii, Absidia corymbifera, Mucor mucedo, Rhizopus microsporus, Rhizopus oryzae,

AbsidiacorymbtffTa Rhizopus mcrospTrus Rhizopus oryzae varrhzopo&fonm

Рис. 3. Влияние штамма Bacillus subtilis 11B на рост культур грибов (3-й сутки роста)

Изучение чувствительности штамма к 22 антибиотикам показало, что штамм В. subtilis 11В устойчив к действию антибиотиков: бензилпенициллину, ампициллину, азлоциллину, полимиксину, (зона задержки роста менее 10 мм), малочувствителен к линкомицину, ванкомицину, тетрациклину (зона задержки роста менее 15 мм); чувствителен к цефаперазону, офлаксацину, доксициклину, оксацилину, олеандомицину, эритромицину, нетилмицину, сизомицину, амика-цину, тобрамицину, канамицину, гентамицину, левомицетину, рифамицину.

Из результатов исследования безопасности штамма на лабораторных животных установлено, что введение культуры в виде живых клеток, инактивированных прогреванием в различных дозах, а так же продуктов их метаболизма, не вызывало у животных каких-либо признаков патологических изменений регистрируемых клинически и при макроскопическом, микроскопическом изучении внутренних ор-

ганов. В результате изучения аллергизирующих свойств штамма В. subtilis 11B выявлено отсутствие аллергенных свойств в реакциях гиперчувствительности замедленного типа и методом активной кожной анафилаксии.

Полученные экспериментальные данные по изучению безопасности штамма для организма теплокровных животных свидетельствовали о том, что штамм невирулентен, нетоксичен, нетоксигенен, не влияет на нормальную микрофлору кишечника, не вызывает диссеминации внутренних органов, не вызывает аллергических реакций. По совокупности исследованных признаков штамм Bacillus subtilis 11B относится к IV классу опасности.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что штамм В. subtilis 11В отвечает основным критериям, предъявляемым к штаммам для применения его в качестве основы лечебно-профилактического препарата-пробиотика.

Глава 5. Оптимизация процесса периодического гомогенного глубинного культивирования штамма Bacillus subtilis 11B

Для получения биомассы аэробных спорообразующих бактерий рода Bacillus оптимальным способом является периодический гомогенный глубинный метод культивирования (A.M. Мишульский, 1997; А.И.Осадчая и др., 1997; В.В.Смирнов и др., 1993; А.А. Глухова и др. 1993).

Учитывая, что задачей наших исследований является получение максимального выхода биомассы с сохранением жизнеспособности бактериальных клеток, нами проведено изучение закономерностей роста и развития штамма в условиях ферментера методом периодического гомогенного глубинного культивирования.

В процессе исследований была испытана синтетическая питательная среда Егорова, известная для получения споровых форм бактерий рода Bacillus. Изучение состава среды проводили путем исключения каждого минерального компонента в среде.

В результате был подобран необходимый состав минеральных солей, включающий: сульфат, кальция хлорид, калий фосфорнокислый (одно- и дву-замещенный), натрия хлорид, марганец сернокислый, медь сернокислая, железо сернокислое, цинк сернокислый.

В качестве предложенных авторами (Смирнов В.В. и др., 1982) источников азота в питательной среде были испытаны: 20% картофельно-глицериноеый гидро-лизат, 1% пептон, 1% триптон, 20% мясной пептон, 20% казеиновый гидролизат.

Результаты наших исследований показали, что выход биомассы, концентрация жизнеспособных клеток и количество спор было максимальным и составляла 48,7±0,5 хЮ9 кл/мл, 24,6±1,4х108 кл/мл, 73±2,6 %, в питательной среде, содержащей 1% пептона (различия статистически не значимы Р< 0,01).

Изучение источников углевода (сахароза 1 %, глюкоза 0,5 % крахмал 1 %, мальтоза 0,5 %), внесенных в синтетическую питательную среду показало, что содержание 0,5 % глюкозы оказало наибольшее статистически значимое влияние на количество получаемой биомассы, количество жизнеспособных клеток, содержание спор, а также на продолжительность процесса культивирования и составляла 22,2 xl О9 кл/мл, 11,4 х 108 кл/мл, 76 %, 15,6 часов (Р<0,01).

В результате исследований подобран оптимальный состав полусинтетической питательной среды, содержащий сульфат, кальция хлорид, калий фосфорнокислый (одно- и дву-замещенный), натрия хлорид, марганец сернокислый, медь сернокислая, железо сернокислое:, цинк сернокислый, пептон, глюкозу.

Следующим этапом оптимизации периодического культивирования был выбор фазы роста посевной культуры и дозы посевного материала.

Авторами (И.А. Баснакьян, 1985,1989, 1992) установлено, что посевной ма-териап в фазе экспоненциального роста обеспечивает исключение периода адаптации культуры к питательной среде, то есть полное отсутствие лаг-фазы в цикле развития популяции. Маточную культуру штамма в экспоненциальной фазе роста получали путем подращивания суточной культуры условиях ферментера в течение 4 часов на оптимизированной полусинтетической питательной среде при температуре 37 °С.

Для выбора оптимальной дозы посевного материала прозодили с использованием экспоненциальной маточной культуры в различных концентрациях на оптимизированной полусинтетической питательной среде в условиях аэрации и перемешивания в ферментере

Результаты исследований по изучению влияние посевной дозы на качественные параметры штамма В. subtilis 11В, представлены в таблице 3.

Таблица 3

Влияние величины посевной дозы на качественные характеристики получаемой биомассы штамма Bacillus subtilis 11B

Доза посевной культуры, хЮ кл/мл Продолжительность процесса,ч Выход биомассы, xl О9 кл/мл (ОЕ) Содержание спор, % Количество жизнеспособных клеток xl О8 кл/мл (КОЕ)

1 0,5-1,0 22,0±0,7 14,5±0,3 50,0±5,0 5,90±0,45

2 1,1-2,0 13,1±0,3 15,7±0,7 75,0±5,0 6,71 ±0,67

3 2,1-3,0 12,4±0,2 29,7±0,8 80,0±10,0 7,31±0,35

4 3,1-4,0 12,3±0,3 36,8±0,9 80,0±10,0 27,08±0,56

5 4,1-5,0 11,0±0,3 16,8±0,2 70,0±20,0 6,90±0,61

6 >5,0 8,0±0,4 15,0±0,4 30,0±10,0 3,14±0,37

Значи мость различий Р,.2> 0,01 Р,.з<0,01 Рм<0,01 Pl-5<0,01 Pw<0,01 Р2.з<0,01 Р2-4<0,01 Р2-5<0,01 Р2-б>0,01 Р3ц<0,01 Рз-5<0,01 Рз_б< 0,01 Р4-5<0,01 Р4-6<0,01 Р5-б>0,01 Pi.2<0,01 Pi-3,<0,01 Рм<0,01 Р.-5<0,01 Pi-6<0,01 Р2-3 >0,01 Р2Ц<0,01 Рг-5 >0,01 Р2-6<0,01 Рз-4 > 0,01 Рз-5<0,01 Рз-б<0,01 Р4-5>0,01 р«<0,01 Р5-б<0,01 Pl-2,< 0,01 Pi-3,<0,01 Рм<0,01 Pi-s<0,01 Pw>0,01 Р2-3<0,01 Р2-4<0,01 Р2.5<0,01 Р2-б>0,01 Р3-4<0,01 Рз-5< 0,01 Рз-б>0,01 Р4-5<0,01 Р4-б>0,01 Р5.6>0,01

Как видно из данных таблицы 3, при периодическом гомогенном культивировании штамма Bacillus subtilis 11B в течение 12,3±0,3 часов оптимальной дозой посевной культуры являлась доза от 3,1х109 до 4,0х109 кл/мл. Такая посевная доза обеспечивала выход максимальной биомассы (36,8±0,9) х109 кл/мл с содержанием количества (27,08±0,56)х108 кл/мл жизнеспособных клеток, при этом популяция клеток состояла на 80,0±10,0 % в споровой форме. В то же время как уменьшение посевной дозы до 1,0х10) кл/мл так и увеличение посевной дозы выше 5,1х109 кл/мл приводило к снижению показателей по выходу биомассы, содержанию жизнеспособных клеток и уровня спорообразования. При этом бактериальная популяция не зависимо от посевной дозы была представлена до 100 % в R-форме.

Одним из главных факторов оптимизации процесса культивирования является выбор физико-химических параметров культивирования, среди которых одним из важнейших для аэробных культур является режим аэрации.

Степень насыщения среды кислородом изменялась в зависимости от количества подаваемого в ферментер воздуха и скорости перемешивания культу-ральной жидкости.

Изучение влияния объема подаваемого воздуха на рост биомассы показало, что оптимальное количество должно составлять 70-80% от полного насыщения среды. Уменьшение показателя до 50% приводило к достоверному снижению количества биомассы. Увеличение степени насыщения среды воздухом более 90% способствовало незначительному увеличению биомассы, но было сопряжено с потерями продукта из-за сильного пенообразования.

Установлено, что при насыщении среды воздухом в объеме 70-80 %, скорость перемешивания должна быть в пределах (250-300) об/мин. Уменьшение скорости перемешивания мешалки ниже 250 об/мин, или увеличение скорости перемешивания более 350 об/мин, снижали количество жизнеспособных клеток популяции.

Таким образом, проведенные исследования позволили оптимизировать периодический гомогенный глубинный процесс культивирования для штамма В. subtilis 11В на полусинтетической питательной среде, содержащей 1 % пептона и 0,5 % глюкозы с использованием от 3,1x109 до 4,0x109 кл/мл посевной культуры в экспоненциальной фазе с содержанием в среде растворенного кислорода (70-80)% при перемешивании со скоростью вращения мешалки 250-300 об/мин, при температуре 37 °С и рН среды. Результаты оптимизированного процесса культивирования штамма В. subtilis 11В отражены в рисунке 4.

Рис. 4. Оптимизированный периодический процесс культивирования

Bacillus subtilis 11В Как видно из рисунка 4, лаг-фаза отсутствует. Экспоненциальная фаза имеет продолжительность 2 часа. Основное накопление биомассы происходит в течении 12,7±03 часов на стадии замедления роста с удельной скоростью 0,21 ч-1. Выход биомассы, количеством сокращению длительности культивирования в 2,2 раза. Выход биомассы жизнеспособных клеток и содержание спор составляет соответственно (49,5±0,6)х 109кл/мл, (27,5±0,2) х 108 кл/мл, 71,9±1,4 %. С 16 часов начинается стационарная фаза роста и рН среды повышается от 6,8-8,8 и с этого момента основные показатели качества биомассы существенно не изменяются. Поэтому после 16 часов роста целесообразно производить слив культу-ральной жидкости.

Таким образом, оптимизация периодического культивирования по фазе и дозе посевного материала и подбор состава питательной среды позволила устранить лаг-фазу в процессе культивирования и увеличить продуктивность процесса культивирования по накоплению биомассы с сохранением жизнеспособности бактериальных клеток в споровой форме. Оптимальные условия подачи

воздуха и скорости перемешивания среды сократили продолжительность процесса культивирования до (16,0±0,3) часов.

Глава 6. Создание и экспериментальное изучение препарата «Витаспорин», сухой

Следующей нашей задачей являлась создание препарата на основе полученной культуральной жидкости Bacillus subtilis 11B с сохранением жизнеспособности бактериальных клеток и высокой антагонистической активности в течение гарантийного срока хранения (2 года)

Для получения препарата 16-ти часовую культуральную жидкость в стационарной фазе роста помещают в сахарозо-желатиновую среду в соотношении 1:7 и разливают во флаконы по 1-2 мл. Затем препарат подвергают замораживанию и под вакуумом лиофильно высушивают в течение 24 часов

Сахарозо-желатиновая среда (сахароза -7,5 %, желатина -1,5 %) в качестве криопротектора обуславливает защитное действие для бактериальных клеток культуральной жидкости.

С использованием штамма Bacillus subtilis 11В в условиях оптимизированного периодического гомогенного глубинного ьультивирования и лиофильного высушивания были получены 15 экспериментально-производственных серий препа-рата-пробиотика «Витаспорин», сухой.

Препарат-пробиотик «Витаспорин», сухой предназначен для перорального применения. Биомасса бацилл в препарате не защищена капсулой, поэтому после попадания в желудочно-кишечный тракт бациллы подвергаются воздействию таких секреторных жидкостей, как желчь и желудочный сок различных значений рН Поэгому проведено изучение влияния перечисленных факторов на специфическую активность бацилл, входящих в состав препарата «Витаспорин».

Исследовали интенсивность роста бацилл и уровень их антагонистической активносги при инкубировании на мясо-пептонном бульоне (МПБ) с различными значениями рН (1,5 - 7,4).

Изучение антагонистической активности бацилл при разных значениях рН показало, что биомасса, выращенная на средах с рН - от 1,5 до 4,0 имеют более низкий уровень антагонистической активности в сравнении с биомассой, выращенной на средах с рН от 5,0 и выше.

Как следует из полученных результатов, желчь в концентрациях от 1 % до 30 % способна стимулировать размножение бацилл в первые 24 часов роста. Антагонистическая активность бацилл не изменяется существенным образом в присутствии желчи, а в отношении Proteus vulgaris даже возрастает с повышением концентрации желчи.

Из полученных результатов можно заключить, что 1 % концентрация желудочного сока способна стимулировать размножение бацилл в первые 24 часов роста, в последующие часы скорость размножения бацилл снижается по сравнению с контролем. Концентрации желудочного сока с 5 % до 30 % приводят к снижению скорости роста бацилл, однако не ингибирует способность бацилл к размножению и только 100 % желудочный сок практически полностью лизирует бациллы.

Таким образом, анализируя полученные результаты о влиянии различных рН, концентраций желчи и желудочного сока в питательной среде на биологическую активность биомассы исследуемого препарата представляется целесообразным назначать препарат «Витаспорин», сухой между приемами пищи, когда отмечается наименьшая активность секреторных желез и рН среды не опускается ниже 5,0.

Экспериментальное доклиническое изучение общетоксического действия (острая и хроническая токсичность) препарата «Витаспорин», сухой показало, что его воздействие на организм подопытных животных в терапевтических дозах, длительном введении не вызывает существенных изменений в функционировании органов и систем. Исследуемый препарат в реакции гиперчувствительности замедленного типа аллергенных свойств не проявлял, так как индекс реакции на введение препарата не превышал 5 % Препарат не обладает местно-раздражающим, кожно-резорбтивным действием. По результатам исследований

показано, что препарат «Витаспорин», сухой безопасен и можно отнести к IV классу токсичности - «Относительно безвредные вещества».

Спектр и степень специфической активности 15 экспериментально-производственных серий препарата «Витаспорин», сухой характеризуются высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов, и стабильно сохранились в процессе хранения при температуре (6±2) °С в течение 2-х лет и прошли контроль в ГИСК им. Л.А.Тарасевича (таблица 4).

В доказательство антимикотического эффекта препарата «Витаспорин», сухой in vitro было проведено исследование возможностей его использования при лечении зоонозной трихофитии на экспериментальных животных.

Экспериментальная зоонозная трихофития моделировалась на 20 мышах линии BALB/C, генетически высокочувствительных к возбудителю Trichofhy-ton mentagrophytes var. granulosum (R.A.Calderon, RJ.Hay, 1984) и были рандо-мизированы на 4 группы: 1 группа - контрольная (0,5 мл 0,9 % физиологический раствор, прием ежедневно); 2 группа - опытная (0,5 мл препарат «Витаспорин» в 1,0 мл 0,9% физиологического раствора, прием ежедневно в суточной дозе 1 х 108 кл/мл); 3 группа - опытная (0,2 мл гризеофульвин 1 раз в день через сутки с подсолнечным маслом из расчета 40 мг на 4 мл); 4 группа - опытная (0,2 мл гризеофульвин 1 раз в день через сутки и препарат «Витаспорин» в 0,5 мл 0,9% физиологического раствора, прием ежедневно в суточной дозе 1 х 108 кл/мл.

Клиническая степень поражения кожи в динамике заболевания оценивали в баллах по формуле: диаметр поражения х гиперемия х отек х суппурация.

При оценке характера действия препарата «Витаспорин» как средства сопроводительной терапии трихофитии был проведен анализ влияния препарата на выраженность инфекционного процесса.

Таблица 4

Стабильность свойств препарата «Витаспорин», сухого во флаконах при хранении 2-х лет

Описание Подлин- Раство- рн Массо- Контамина- Специфическая активность Безвредность

ность римость, вая доля ция посто- Количество жизне- Антагонистическая активность (зона

мин влаги, % ронними бактериями способных клегок, в одной дозе, кл/мл задержки роста тестовых штаммов, мм)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Staphylococcus aureus 20-25, Безвреден

Пористая Грам по- 1-1,5 7,0- 1,07-2,5 посторонняя (3,1-3,7)хЮ9 Escherihia coli 157 21-23,

масса бе- ложи- 7,2 микрофлора Proteus mirabilis 237 19-21

жевого тельные отсутствует Streptococcus pyogenes 324 15-18

цвета спорооб- ра- Candida albicans 885-653 25-28 Shigella sonnei 318 20- 23

зующие палочки Salmanella enteriditis 25-20 Epidermophyton floccosum 22-24

Trichophyton rubrum 23-24 Trichophyton mentagrophytes var. granu-losum 26-29 Trichophyton violacium 19-22 Microsporum canis 24-25 Penicillium notatum 16-18

Как следует из таблицы 5, индивидуальное введение препарата «Витас-пории», начиная уже с 14 дня после заражения (11 день лечения) (2,34+0,62) приводит к снижению выраженности воспалительного процесса в очагах трихофитии к концу срока наблюдения (1,14+0,62), по сравнению с контрольной группой животных (3,84+0,64). Различия статистически значимы, Р< 0,05. При использовании препарата «Витаспорин» при лечении трихофитии в комплексе с гризеофульвином к 21 дню заболевания отмечается полное исчезновение очага заражения. Различия статистически значимы по сравнению с группой, принимавших гризеофульвин (1,20+0,32), Р < 0,05.

Таблица 5

Лечебная эффективность препарата «Витгспорин» в очагах зоонозной трихофитии

Дни наблюдений после заражения Группы животных

1 группа контроль 2 группа препарат «Витас-порин» 3 группа Гризеофульвин 4 группа Гризеофульвин и «Витаспорин»

3 1,12+0,36 0,82+0,38 0,95+0,42 1,22+0,46

7 3,33±0,43 2,72+0,36 2,94+0,44 3,12+0,15

14 4,38+0,44 2,34+0,62 1,92+0,25*** 0 82+0 34*** ***

21 3,67+0,82 1,48+0,52* 1,20+0,32*** 0

30 3,84+0,64 1,14+0,62 0 0

Примечание: различие статистически значимо при р<0,05 с группами: контроль (*), лечение Витаспорином (**), лечение гризеофульвином (***).

Таким образом, в результате наших исследований разработан новый препарат-пробиотик «Витаспорин», сухой на основе нового выделенного из природного материала штамм Bacillus subtilis 11B, антагонистически активного в отношении широкого спектра условно-патогенных, патогенных бактерий и грибов. Показана его эффективность в комплексном применении с антифунгальным антибиотиком - гризеофуль-фином при лечении зоонозной трихофитии на экспериментальных животных.

Выводы

1. Выделен из природного материала, идентифицирован штамм Bacillus subtilis 11В, подавляющий широкий спектр условно-патогенных и патогенных бактерий и грибов. Штамм депонирован под номером ВКМ 2218Д во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН и запатентован (патент РФ № 2182172 от 10.05.2002).

2. В результате изучения биологических свойств установлено, что штамм Bacillus subtilis 11В продуцирует протеазу, амилазу, желатиназу, каталазу и не продуцирует лецитиназу, уреазу, липазу, гиалоуронидазу; не обладает гемолитической и адгезивной активностями. Штамм невирулентен, нетоксичен, не-токсигенен, не вызывает диссеминации внутренних органов, не влияет на нормальную микрофлору кишечника, не вызывает аллергических реакций и пере-спективен в качестве основы биопрепарата.

3. Разработаны оптимального режима периодического гомогенного глубинного культивирования штамма Bacillus subtilis 11 В на полусинтетической питательной среде, содержащей 1 % пептона и 0,5 % глюкозы с использованием от 3,1х109 до 4,0х109 кл/мл посевной культуры в экспоненциальной фазе, с содержанием в среде растворенного кислорода (70-80)% при перемешивании со скоростью вращения мешалки 250-300 об/мин, и при температуре 37 °С, рН среды 7,9, позволяющий получить максимальный выход биомассы жизнеспособных клеток в споровой форме.

4. На основе нового выделенного штамма Bacillus subtilis 11В с использованием разработанной технологии создан препарат-пробиотик «Витаспорин», сухой, который обладает специфической активностью в отношении широкого спектра условно-патогенных, патогенных бактерий и грибов и стабильностью свойств в процессе хранения.

5. Показана эффективность препарата «Витаспорин» в комплексном применении с антибиотиком - гризеофульвин при зоонозной трихофитии в опытах на экспериментальных животных.

Практические рекомендации

1. Создан новый медицинский препарат-пробиотик «Витаспорин», сухой, обладающий высокой антагонистической активностью в отношении патогенных бактерий и грибов.

2. Составлена нормативно-техническая документация на препарат «Витаспорин», сухой (ФСП, ЭПР, Инструкция по применению) и передана на экспертизу в ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

3. Утверждена программа клинических испытаний для оценки лечебного действия препарата - пробиотика «Витаспорин», сухой в Государственном институте сертификации качества им. Л.А.Тарасевича; в комитете по медицинской этике при Национальном органе контроля медицинских иммунобиологических препаратов МЗ РФ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Байгузина С.Н. Переспективы применения биопрепаратов на основе спо-рообразующих бактерий в медицине // В кн.: Сборник статей Всероссийской научно-практической конференции стоматологов.- Уфа, 2002 г. -С. 231-233.

2. Байгузина С.Н., Кузнецова Т.Н., Байгузина ФА Переспектива использования препарата «Витаспорин» как антагониста патогенных грибов // В кн.: Сборник тезисов IV Российского съезда врачей-инфекционистов. - СПб., 2003. - С. 36.

3. Байгузина С.Н., Кызина Н.В., Кузнецова Т.Н. Изучение влияния препарата-пробиотика «Витаспорин» на показатели иммунитета // В кн.: Материалы конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии»- Уфа, 2004. - С.133-135.

4. Байгузина С.Н., Кузнецова Т.Н., Байгузина ФА. Новый препарат-пробиотик на основе спорообразующих бактерий - Витаспорин // В кн.: Материалы конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии». -Уфа, 2004 г. - С.135-136.

5. Байгузина С.Н., Кузнецова Т.Н., Байгузина Ф.А., Кызина Н.В. Изучение влияния пробиотика из спорообразующих бактерий Витаспорин на клеточное звено иммунитета // В кн.:Тезисы докладов IV Всемирного конгресса по астме, IX Международный конгресс по клинической патологии. - Тай-ланд, 2004 г. - С. 134.

6. Байгузина С.Н., Кузнецова Т.Н., Байгузина Ф.А., Кызина Н.В. Изучение влияния пробиотика Витаспорин на гуморальное звено иммунитета //

В кн.: Тезисы докладов IV Всемирного конгресса по астме, IX Международный конгресс по клинической патологии. - Таиланд, 2004 г.- С. 135.

7. Байгузина С.Н., Байгузина ФА, Кузнецова Т.Н. Штамм бактерий рода Bacillus subtilis, обладающий широким спектром антагонистической активности // В кн.: Тезисы докладов XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2004 г. - С.76.

8. Байгузина С.Н. Изучение антимикотической активности нового препарата-пробиотика «Витаспорин» // В кн.: Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 100-летию со дня основания Томского НПО «Вирион», «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических препаратов». - Томск.,2004 г. С. 112-115.

Патенты на изобретения

1. Байгузина ФА., Кузнецова Т. Н., Байгузина С.Н. «Штамм бактерий рода Bacillus, обладающий широким спектром антагонистической активности». Патент РФ № 2182172 от 10.05.2002 г. (приоритет от 05.04.2001 г.). Бюллетень №13.-2002 г.

2. Байгузина Ф.А., Алсынбаев М.М., Штроман Г.А., Кулагин В.Ф., Осипова И.Г., Байгузина С.Н. «Лекарственный препарат из бактерий рода Bacillus». Патент РФ № 2181596 от 27.04.2002 г. (приоритет от 05.04.2001 г.). Бюллетень №12. -2002 г.

Байгузина Светлана Назибовна

РАЗРАБОТКА НОВОГО ПРЕПАРАТА-ПРОБИОТИКА «ВИТАСПОРИН» И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 19.11.04. Формат 60х84 1/16. Бумага мелованная. Гарнитура «Times». Печать на ризографе. Тираж 100 экз. Заказ № 408-И. ООО «Типография «Информреклама», 450077, г. Уфа, ул. Ветошникова, 97. Тел. (3472) 533-777. E-mail: infomreldama@ufanet.ru. От. в ООО «Типография «Информреклама».

р 2 6 5 3 6

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Байгузина, Светлана Назибовна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Препараты-пробиотики на основе бактерий рода

Bacillus и их лечебно-профилактическое действие.

1.2 Технологические основы культивирования бацилл.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

Собственные исследования.

Глава 3. Выделение нового штамма Bacillus subtilis 11В и характеристика его биологических свойств.

Глава 4. Оптимизация процесса периодического гомогенного глубинного культивирования штамма Bacillus subtilis 11В.

4.1 Оптимизация состава питательной среды.

4.2 Выбор фазы и дозы посевного материала.

4.3 Влияние условий аэрации и перемешивания.

4.4 Изучение криорезистентности культуры штамма.

Глава 5. Создание препарата-пробиотика «Витаспорин» и изучение его эффективности.

5.1 Влияние рН среды, желудочного сока и желчи на специфическую активность бацилл, входящих в состав препарата «Витаспорин».

5.2 Изучение иммуномодулирующего действия препарата «Витаспорин».

5.3 Изучение лечебной эффективности препарата «Витаспорин».

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка нового препарата-пробиотика "Витаспорин" и изучение его биологических свойств"

Актуальность темы. В условиях обострившейся экологической обстановки, широкого применения высокоактивных химиотерапевтических препаратов наблюдается тенденция к увеличению патологий, связанных с изменением нормальной микрофлоры человека. Наряду с этим расширяется спектр потенциальных возбудителей микотических поражений. Клинические проявления инфекций, обусловленных грибами, широко варьирует от поверхностных поражений слизистых оболочек и кожи до угрожающих жизни инвазивных микозов, при которых могут поражаться любые органы (O.K. Хмельницкий и др., 2000).

Применение антимикотиков и антибиотиков во многом решало проблему инфекционных осложнений, вызванных условно-патогенными, патогенными бактериями и грибами. Однако в последние годы их эффективность существенно снизилась за счет возникновения к ним широкой резистентности патогенных бактерий и грибов. Кроме того, возросла прослойка населения, страдающих аллергическими реакциями на применение антибиотиков, вплоть до их полной непереносимости.

В этой связи большой интерес представляют препараты-пробиотики из спорообразующих бактерий рода Bacillus, обладающих широким спектром антагонистической активности в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий и грибов и способных оказать комплексное лечебно-оздоровительное действие на весь организм (S.Yamada et al., 1990).

Применение препаратов-пробиотиков из бацилл обусловлено их преимуществами перед антибиотиками: широкий диапазон лечебно-профилактического действия, безвредность для организма, экологическая безопасность, относительная дешевизна (И.М.Нахабин, В.В.Перелыгин, 1996).

В настоящее время в отечественной практике выпускается и успешно применяется для профилактики и лечения дисбактериозов, кишечных инфекций, гнойно-воспалительных заболеваний единственный препарат-пробиотик на основе Bacillus subtilis 534 - «Споробактерин жидкий» (М.В. Никитенко и др., 2004).

Вышеизложенное определило актуальность разработки и расширения списка отечественных биопрепаратов на основе штаммов Bacillus subtilis, способных оказать антагонистическое воздействие на возбудителей заболеваний бактериальной и грибковой этиологии.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является выделение природного штамма Bacillus subtilis и разработка на его основе нового медицинского препарата-пробиотика.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить из природного материала наиболее активный штамм бактерий Bacillus subtilis, обладающий широким спектром антагонистической активности в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий и грибов.

2. Изучить биологические свойства нового штамма Bacillus subtilis и возможность его использования как основу нового биопрепарата.

3. Разработать оптимальный режим технологического процесса культивирования нового штамма Bacillus subtilis, позволяющий получить биомассу популяции с максимальным количеством жизнеспособных клеток в споровой форме.

4. Создать новый препарат-пробиотик на основе выделенного штамма Bacillus subtilis, изучить его специфическую активность и стабильность свойств при хранении.

5. Изучить эффективность препарата при лечении зоонозной трихофитии в опытах на экспериментальных животных.

Научная новизна

Выделен и идентифицирован штамм Bacillus subtilis 11В, обладающий широким спектром антагонистической активности в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий и грибов, вызывающих заболевания человека. Штамм депонирован под номером ВКМ 2218Д во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина и защищен патентом РФ № 2182172 от 10.05.2002 «Штамм бактерий рода Bacillus, обладающий широким спектром антагонистической активности».

Разработаны научные основы периодического гомогенного глубинного культивирования штамма Bacillus subtilis 11В с целью получения максимального выхода биомассы жизнеспособных бактерий и спорообразования в зависимости от состава питательной среды, оптимальной дозы посевного материала, физико-химических параметров.

Создан новый препарат - пробиотик «Витаспорин», сухой, показана его эффективность в комплексном лечении зоонозной трихофитии в опытах на экспериментальных животных, (патент РФ № 2181596 от 27.04.2002 «Лекарственный препарат из бактерий рода Bacillus»).

Научно-практическая значимость

Получен новый производственный штамм бактерий Bacillus subtilis 1 IB и показана возможность его использования в качестве основы нового препарата.

Разработаны научные основы промышленного технологического процесса культивирования штамма Bacillus subtilis 1 IB.

Создан новый медицинский препарат-пробиотик «Витаспорин», сухой. Получено 15 экспериментально-производственных серий препарата -пробиотика «Витаспорин»

Составлена нормативно-техническая документация на препарат «Витаспорин», сухой (ФСП, ЭПР, Инструкция по применению) и передана на экспертизу в ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

Показана эффективность препарата при лечении зоонозной трихофитии в опытах на экспериментальных животных.

Составлена и утверждена программа клинических испытаний для оценки лечебного действия препарата - пробиотика «Витаспорин», сухой в Государственном институте сертификации качества им. Л.А.Тарасевича; в комитете по медицинской этике при Национальном органе контроля медицинских иммунобиологических препаратов МЗ РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1.Выделен из природной среды штамм Bacillus subtilis 11В, обладающий широким спектром антагонистической активности в отношении широкого спектра условно-патогенных и патогенных бактерий и грибов.

2. Разработан оптимизированный процесс периодического гомогенного глубинного культивирования штамма Bacillus .subtilis 11В на сбалансированной питательной среде, позволяющий получить максимальный выход биомассы жизнеспособных клеток в споровой форме.

3.Создан новый препарат-пробиотик «Витаспорин», сухой, показана его эффективность в комплексном лечении зоонозной трихофитии в опытах на экспериментальных животных.

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации доложены и обсуждены во Всероссийской научной конференции молодых ученых филиала ФГУП «НПО» Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» - «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004).

Апробация диссертации проведена на совместном межкафедральном совещании Башкирского государственного медицинского университета, ФГУП «НПО Микроген МЗ РФ филиал «Иммунопрепарат»» и Башкирского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (протокол № 1 от 5 ноября 2004 г.).

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных научных работ и получено 2 патента Российской Федерации на изобретение.

Объем и структура диссертационной работы

Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения и выводов. Библиографический список литературы содержит 166 источников (130 отечественных и 36 зарубежных). Работа иллюстрирована 34 таблицами и 6 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Байгузина, Светлана Назибовна

128 Выводы

1.Выделен из природного материала, идентифицирован штамм Bacillus subtilis ИВ, подавляющий рост широкого спектра условно-патогенных и патогенных бактерий и грибов. Штамм депонирован под номером ВКМ 2218Д во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН и запатентован (патент РФ № 2182172 от 10.05.2002).

2. Установлено, что штамм Bacillus subtilis ИВ продуцирует протеазу, амилазу, желатиназу, каталазу и не продуцирует лецитиназу, уреазу, липазу, гиалоуронидазу; не обладает гемолитической активностью. Штамм невирулентен, нетоксичен, нетоксигенен, не вызывает диссеминации внутренних органов, не влияет на нормальную микрофлору кишечника, не вызывает аллергических реакций и переспективен в качестве основы биопрепарата.

3. Разработан оптимальный режим периодического гомогенного глубинного культивирования штамма Bacillus subtilis ИВ на полусинтетической питательной среде, содержащей 1 % пептона и 0,5 % глюкозы с использованием от 3,1x109 до 4,0x109 кл/мл посевной культуры в экспоненциальной фазе, с содержанием в среде растворенного кислорода (70-80)% при перемешивании со скоростью вращения мешалки 250-300 об/мин. и при температуре 37 °С, рН среды 7,9, позволяющий получить максимальный выход биомассы жизнеспособных клеток в споровой форме.

4. На основе нового штамма Bacillus subtilis ИВ с использованием разработанной технологии создан препарат-пробиотик «Витаспорин», сухой, который обладает специфической активностью в отношении широкого спектра условно-патогенных, патогенных бактерий и грибов и стабильностью свойств в процессе хранения.

5. Показана эффективность препарата «Витаспорин» в комплексном применении с антибиотиком - гризеофульвин при зоонозной трихофитии в опытах на экспериментальных животных.

129

Практические рекомендации

1. Создан новый медицинский препарат-пробиотик «Витаспорин», сухой, обладающий высокой антагонистической активностью в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий и грибов.

2. Составлена нормативно-техническая документация на препарат «Витаспорин», сухой (ФСП, ЭПР, Инструкция по применению) и передана на экспертизу в ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

3. Утверждена программа клинических испытаний для оценки лечебного действия препарата — пробиотика «Витаспорин», сухой в Государственном институте сертификации качества им. Л.А.Тарасевича; в комитете по медицинской этике при Национальном органе контроля медицинских иммунобиологических препаратов МЗ РФ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Байгузина, Светлана Назибовна, Оренбург

1. Акименко, В.К. Регуляция микробного метаболизма факторами внешней среды / В.К. Акименко // Тезисы докладов и сообщений. Пущино, 1983. — С.105-107.

2. Андреева, Н.Б. Кинетика потребления кислорода клетками Azotobacter vinelandi в периодической и проточной культуре / Н.Б. Андреева, И.А. Хмель // Микробиология. 1970. - Т. 39, № 2. - С. 280-287.

3. Антагонистическое действие культур Bacillus subtilis на бактерии рода Klebsiella / Н.В. Бойко, А.И. Туряница, Е.П. Попович, В.А. Вьюницкая // Микробиол. журн. 1989. - Т. 51, № 1. - С. 87-91.

4. Арзамазцев, Е.В. Изучение общетоксического действия: методические рекомендации / Е.В. Арзамасцев. М: МЗ РФ, 1997. - 160 с.

5. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологии / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. Л.: Медицина, 1962. - 111 с.

6. Ю.Бактиспорин в лечении дисбиоза толстого кишечника у детей /

7. B.И. Никитенко. Опубл. 19.10.1989.

8. Балансирование состава микробиологических питательных сред: метод, рекомендации / Л.Г. Иванова, Е.И. Шмелева, В.И. Трифонов и др.. М., 1987.-С. 3-20.

9. Баснакьян, И.А. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза / И.А. Баснакьян, В.В. Бирюков, В.М. Кантере. М.: Наука. - 1985. - 291 с.

10. Баснакьян, И.А. Оптимизация культивирования микроорганизмов в биотехнологии / И.А. Баснакьян // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1989. - №5. - С. 90-96.

11. Баснакьян, И.А. Управляющее действие кислорода на питательные потребности менингококка / И.А. Баснакьян // Журн. микробиол. 1990. -№ 2.- С. 3-7.

12. Баснакьян, И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. М., 1992. - 188 с.

13. Баснакьян, И.А. Патология и физиология микробов. Усовершенствование технологии культивирования / И.А. Баснакьян // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1982. —N12. - С. 28-33.

14. Белявская, В.А. Перспективы конструирования иммунопрепаратов на основе рекомбинантных бацилл / В.А. Белявская, И.Б. Сорокулова, А.А. Ильичев // Новые направления биотехнологий: тез. док. VI конф. РФ, 2426 мая, 1994. -Пущино, 1994. С. 68.

15. Белявская, В.А. Рекомбинантные пробиотики: проблемы и перспективы использования для медицины и ветеринарии / В.А. Белявская, И.Б. Сорокулова, В.А. Масычева // Дисбактериозы и эубиотики: тез. докл. Всерос. науч.-практич. конф. М., 1996. - С. 7.

16. Билай, В.И. Методы экспериментальной микологии. Киев: Наукова думка, 1982.-550 с.

17. Биопрепарат субтикол для профилактики и лечения инфекционных болезней: пат. 2129432 А 61 К 35/74 / В.В. Смирнов, И.Б. Сорокулова, И.Г. Осипова.; опубл. 27.04.99, Бюл. № 12.

18. Бриан, JI.E. Бактериальная резистентность и чувствительность к химиопрепаратам. М., 1984. - 270 с.

19. Вайтилавичус, А.И. Определение бактериальной желатиназы простым методом / А.И. Вайтилавичус // Лабораторное дело. 1977. - № 10. - С. 626-627.

20. Виестурс, У. Некоторые новые биотехнологии и аппаратура для их осуществления / У. Виестурс, М. Лейте // Прикладная биохимия и микробиология. 1977. - Т. 33. - С. 243-256.

21. Влияние условий аэрации на синтез и экскрецию полисахаридов бактериями рода Bacillus при их глубинном культивировании /

22. A.И. Осадчая, В.А. Кудрявцев, С.Р. Резник и др. // Биотехнология. 1993. -№ 3. - С. 12-14.

23. Влияние живых культур Bacillus subtilis на неспецифическую резистентность организма / В.А. Кудрявцев, Л.А. Сафронова, А.И. Осадчая и др. // Микробиол. журнал. 1996 - Т. 58, № 2. - С. 46-53.

24. Влияние качества посевного материала на биосинтез цефалоспорина /

25. B.А. Лосев, Б.А. Чагин, Т.Н. Вандышева, Л.В. Шурыгин // Антибиотики и химиотерапия. 1988. - Т. 33, № 7. - С. 493-496.

26. Влияние условий культивирования на некоторые свойства бацилл, составляющих основу пробиотиков / Т.М. Фурзикова, М.Г. Сергейчук, И.Б. Сорокулова, В.В. Смирнов // Мшробюл. журн. 1999 - Т.61, № 5.1. C. 19-23.

27. Воробьев, А.А. Дисбактериозы актуальная проблема медицины / А.А. Воробьев, Н.А. Абрамов, В.М. Бондаренко // Вестн. Российской АМН. - 1999. - № 3. - С. 4-7.

28. Вредная и полезная эндофитная микрофлора хлопчатника / М.Я. Минликеев, А.В. Хотянович, М.Х. Султанова и др. // Известия АН Тадж. ССР. 1987. - № 2. - С. 50-54.

29. Выбор оптимальных условий аэрирования для глубинного культивирования Bacillus thuringirnsis Ни 266/2-1 / А.И. Осадчая, С.Ф. Прокопченко, Н.Д. Костюченко и др. // Микробиол. журн. 1990. - Т. 52, № 6. - С. 34-38.

30. Габидуллин, З.Г. Биологическая характеристика штаммов Proteus, выделенных при инфекционных процессах различной локализации: автореф. дис. д-ра. мед. наук. Саратов, 1990.- 35 с.

31. Герхард, Ф. Методы общей бактериологии. М.: Мир, 1983. - Т. 1. — 35 с.

32. Глухова, М.Н. Спорообразование некоторых видов бактерий рода Bacillus на пептонном кукурузном агаре / М.Н. Глухова, Е.Б. Каневская, Г.М. Субботина // Физиология и биохимия микроорганизмов. Горький, 1974. — С. 53-54.

33. Дементьев, А.А. Новая внеклеточная рибонуклеаза штамма Bacillus sp.BCF 256. Препаративное выделение и характеристика индивидуального фермента / А.А. Дементьев, Н.Ф. Рябченко, И.И. Протасевич // Биотехнология. 1992. - № 5. - С. 84-89.

34. Дискуссионные вопросы создания и применения бактериальных препаратов для коррекции микрофлоры теплокровных / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.Б. Сорокулова, В.А Вьюницкая // Микробиол. журнал. -1992.-Т. 54, №6.-С. 82-92.

35. Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов. Основные положения: метод, рекомендации. РД-42-288-89. -М, 1989.

36. Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках. М.: Высшая школа, 1986.- 447 с.

37. Блинов, Н.ГТ. Основы биотехнологии. СПб.: Наука, 1995. - 560 с. 44.3аварзин, Г.А. Определитель бактерий Берджи. - М.: Мир, 1997. - 430 с.

38. Ивановский, А.А. Новый пробиотик бактоцеллолактин при различных патологиях у животных / А.А. Ивановский // Ветеринария. 1996 - № 11.-С. 34-35.

39. Изучение адгезивных свойств клеток Bacillus polymyxa и роль лектинов бацилл в адгезивном процессе / JI.B. Карпунина, У.Ю. Мельникова, Е.Ф. Соболева и др. // Микробиология. 1999. - Т. 68, № 4. - С. 445-448.

40. Изучение безопасности бактерий рода Bacillus, составляющих основу некоторых пробиотиков / И.Г. Осипова, И.Б. Сорокулова, Н.В. Терешкина, JI.B. Григорьева // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.- 1998.-№ 6.-С. 68-70.

41. Ильницкая, И.Ю. Совершенствование культивирования дифтерийных коринебактерий для получения токсина-анатоксина / И.Ю. Ильницкая, И.А. Баснакьян // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1986. - № 7. - С. 40-44.

42. Использование препарата-пробиотика бактиспорина для профилактики дисбактериоза и гнойно-септических осложнений в хирургии /

43. Т.В. Хасанова, Р.А. Хисамутдинов, P.M. Хасанов и др. // Клинические перспективы в инфектологии: тез. Всерос. науч. конф. СПб., 2001. - С. 205.

44. Кандыбин, Н.В. Итоги и перспективы применения бактокулицида / Н.В. Кандыбин, В.П. Ермолова, О.В. Смирнов // Современные достижения биотехнологии: матер. 1 Конф. Сев.- Кавказ, региона. Ставрополь, 1995. -С. 14-15.

45. Кашкин, Г.Н. Руководство по медицинской микологии / Г.Н. Кашкин, Н.Д.Шеклаков. М.: - Медицина, 1978. - 325 с.

46. Коваленко, Э.А. Внеклеточные лектины бактерий / Э.А. Коваленко // Микробиол. журнал. 1990. - Т. 52, № 3. - С. 92-99.

47. Коган, Н.И. Физиология человека и животных / Н.И. Коган . М.: Высшая школа , 1984. - Т.2 - 360 с.

48. Колпакова, С.Д. Исследование влияния количества посевного материала на жизнедеятельность бактериальной популяции / С.Д. Колпакова, А.И. Колпаков. Самара, 1994. - Деп. в ВИНИТИ 13.10.94. N 2359-В94.

49. Корвикова, Е.Р. Применение ударных доз бифидумбактерина-форте для лечения больных острых кишечными инфекциями / Е.Р. Корвикова // Журн. микробиология. — 2000. № 6. - С. 58-61.

50. Кулакова, С.М. Влияние кислорода и субстратов для роста на активность супероксидисмутазы и каталазы у микроорганизмов / С.М. Кулакова, И.Н. Гоготов // Микробиология. 1982. - Т. 51, № 1. - С. 21-25.

51. Лектиновая активность противоопухолевых веществ, синтезируемых Bacillus subtilis В-7025 / B.C. Подгорский, Э.А. Коваленко, Е.И. Гетьман и др. // МИсробюл. журнал. 2002. - Т 64, № 5. - С. 10-16.

52. Лечебно-оздоровительный эффект использования препарата-пробиотика-бактиспорин у женщин фертильного возраста / Р.Х. Гатауллина, Р.А.

53. Хисамутдинов, Т.Н. Кузнецова и др. // Клинические перспективы в инфектологии: тез. Всерос. научн. конф. СПб., 2001. - С. 205.

54. Любимов, Б.И. Оценка аллергизирующих свойств фармакологических средств / Методические рекомендации по оценке аллергенных свойств фармакологических средств / Б.И. Любимов, Л.П. Коваленко, В.Н.Федосеева и др.- 1988. С. 15-21

55. Медведев, Ю.А. Молекулярно-клеточные механизмы иммуногенеза при зоонозной трихофитии: автореф. дис. д-ра мед. наук. — М., 1988. 31 с.

56. Микробная биотехнология: метод, пособие к лабораторным работам / Е.П. Яковлева, О.А. Алексинцева, Н.В. Котова, В.А. Колодязная. СПб., 2000. -С. 21-24.

57. Молчанов O.JT. Применение биоспорина в комплексной терапии бактериального вагиноза / О.Л. Молчанов, А.Л. Позняк // Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней: тез. докл. -СПб., 1999.-С. 187.

58. Морфометрический анализ развития микроорганизмов / Л.А. Музыченко,

59. B.Н. Сенаторова, Л.Л. Альховская и др. // Биотехнология. 1990. - № 3.1. C.3-6.

60. Никитенко, В.И. Споробактерин новый препарат для лечения дисбактериозов и гнойно-воспалительных процессов / В.И. Никитенко, Н.Н. Горбунова, А.В. Жигайлов // Дисбактериозы и эубиотики: тез. докл. Всерос. науч.-практич. конф. М., 1996. - С. 26.

61. Никитенко М.В. Новая форма препарата «споробактерин жидкий» и изучение ее эффективности: автореф. дис.к-та мед. наук.- Оренбург, 2004.- 24 с.

62. B.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.Б. Сорокулова и др. // Микробиол. журнал. 1988. - Т. 50, № 6. - С. 56-59.

63. Оптимизация условий аэрации в процессе культивирования Bacillus thuringiensis ssp kurstaki шт. z-52 с использованием интегральной квазидинамической модели / В.В. Лаврикова, В.А. Ириков, Т.Г. Юдина и др. // Биотехнология. 1992. - № 2. - С. 61-66.

64. Патоморфологическая диагностика микозов, вызываемых условно-патогенными грибами: Пособие для врачей / Под ред. O.K. Хмельницкого, В.Л. Быкова, Н.М. Хмельницкой. С-Пб., 2000. — 36 с.

65. Пробиотики и функциональное питание / Б.А. Шендеров, М.А. Манвелова, Ю.Б. Степанчук, Н.Э. Скиба // Антибиотики и химиотерапия. 1997. - Т. 42, № 7. - С. 30-34.

66. Пестеров, П.Н. Трихофития зооантропонозная / П.Н. Пестеров. Томск: Из-во Томского ун-та, 1998. - 124 с.

67. Петров, JJ.H. Конструирование препаратов для лечения и профилактики дисбактериоза на основе представлений о эндоэкологии человека / JI.H. Петров, Н.Б. Вербицкая, Т.Я. Вахитов // Рус. журн. Вич/Спид и родст. пробл. 1997.-Т. 1, № 1.-С. 161-162.

68. Петров Р.В. Иммунофармакологическими требованиями к оценке модуляторов иммунной системы / Р.В. Петров, P.M. Хаитов, Е.В. Кожинова // Научно-методические аспекты биологических исследований новых лекарственных препаратов. Рига, 1987.

69. Перт, С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978.- 331 с.

70. Питательная среда для выращивания спорообразующих аэробных бактерий Bacillus subtilis и Вас. licheniformis: а. с. 1708832 / В.Я. Чаплинский. опубл. 01. 1992, Бюл. № 4.

71. Подберезный, В.В. Культивирование производственных штаммов Bacillus subtilis в подсырной сыворотке / В.В. Подберезный, Н.И. Полянцев, JI.B. Ропаева // Ветеринария. 1996. - № 1. - С. 21-29.

72. Подгорский, B.C. Систематическое положение, экологические аспекты и физиолого-биохимические особенности микроорганизмов, имеющих промышленное значение / B.C. Подгорский // М1кробюл. журнал. 1998. -Т 60, № 5. - С. 27-47.

73. Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека: а. с. 1722502 S.U. А 61 К 39/02 / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.Б. Сорокулова и др.. -опубл. 30.03.92.

74. Пробиотики на основе живых культур микроорганизмов /В.В. Смирнов, Н.К. Коваленко, B.C. Подгорский, И.Б. Сорокулова // Мпсробюл. журнал. 2002. - Т. 64, № 4. - С. 62-79.

75. Профилактический биопрепарат субалин: пат. 2035185 RU А 61 К 35/66 /

76. B.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.Б. Сорокулова и др.. опубл. 20.05.95, Бюл. № 14.

77. Процессы ассимиляции глюкозы и кислорода патогенными микроорганизмами / Л.Г. Жданова, Г.М. Машилова, И.М. Грубер и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1989. - № 9.1. C. 74-77.

78. Профилактический биопрепарат споролакт: пат. 2035186 RU А 61 К 35/66 / С.Р. Резник, И.Б. Сорокулова, В.А. Вьюницкая и др.. опубл. 20.05.95, Бюл. № 14.

79. Работнова, И.Л. Хемостатное и периодическое культивирование при изучении физиологии микроорганизмов / И.Л. Работнова, И.Н. Позмогова, И.А. Баснакьян // Итоги науки и техники. М.: ВИНИТИ, 1981. - Т.П. - С. 3-54. (Сер. Микробиология).

80. Резник, С.Р. Гематологические и цитохимические показатели телят при даче препарата Бактерии- SL / С.Р. Резник, И.И. Шуст // Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа: тез. докл. Всесоюз. симп. Киев, 1989. - С. 25.

81. Рост и спорообразование Bacillus subtilis в различных условиях аэрации /

82. B.В. Смирнов, А.И. Осадчая, В.А. Кудрявцев, JI.A. Сафронова // Микробиол. журнал. 1993. - Т. 55, № 3. - С. 38-44.

83. Слабоспицкая, А.Т. Ферментативная активность бацилл, перспективных для включения в состав биопрепаратов / А.Т. Слабоспицкая, С.С. Крымовская, С.Р. Резник // Микробиол. журнал. 1990. - № 2. - С. 9-14.

84. Смирнов, В.В. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.А. Василевская. Киев, 1982 — 280 с.

85. Смирнов, В.В. Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий рода Bacillus из организма человека и животных / В.В. Смирнов. Киев, 1983. - 49 с.

86. Смирнов, В.В. Спорообразующие аэробные бактерии итоги и перспективы исследований / В.В. Смирнов, С.Р. Резник // XI Украинский Республиканский съезд микробиологов, эпидемиологов и паразитологов: тез. докл. Киев, 1985. - Ч. 1. - С.15-16.

87. Смирнов, В.В. Адгезивные свойства бактерий рода Bacillus-компонентов пробиотика / В.В. Смирнов, И.В. Косюк // Мшробюл. журнал. 1997. - Т. 69, №6.-С. 36-43.

88. Смирнова, Г.В. Изменение количества SH-соединений в культурах Esherichia coli и Bacillus subtilis при переходе в стационарную фазу / Г.В. Смирнова, О.Н. Октябрьский // Микробиология. 1990. - Т. 59, № 3.1. C. 387-393.

89. Способ лечения гнойно-септических послеродовых заболеваний суспензией живых культур: а. с. 1398868 S.U. А 61 К 35/74 / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.Б. Сорокулова и др.. опубл. 30.05.88, Бюл. № 20.

90. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, В.А. Вьюницкая и др. // Микробиол. журнал. 1993. - Т. 55, № 4. -С. 92-112.

91. Сорокулова, И.Б. Перспективы применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых биопрепаратов / И.Б. Сорокулова // Антибиотики и химиотерапия. 1996. - Т. 41, № 10. - С. 13-15.

92. Сорокулова, И.Б. Сравнительное изучение биологических свойств биоспорина и других коммерческих препаратов на основе бацилл / И.Б. Сорокулова // Мшробюл. журнал. 1997. - Т. 69, № 6. - С. 43-49.

93. Сорокулова, И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов / И.Б. Сорокулова // Антибиотики и химиотерапия. 1998.-Т. 43, №2.-С. 20-23.

94. Способ получения бактериального препарата из бактерий рода Bacillus: пат. 2076902 С 12 N/20, А 61 К 35/74, С 12 R 1: 07 / A.M. Мишульский. -опубл. 10.04.97, Бюл. № 10.

95. Способ получения бактериального препарата на основе Bacillus subtilis: пат. 2105562 Рос. Федерации / А.И. Леляк, В.Г. Костровский, О.И. Рязанкина и др.. опубл. 27.02.98, Бюл. № 6.

96. Споровые пробиотики / И.Г. Осипова, Н.А. Михайлова, И.Б. Сорокулова и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2002. -№ 3. - С. 113-119.

97. Способ лечения и профилактики вирусных и бактериальных заболеваний животных: а.с. 1311243 SU/ С.Р. Резник. опубл. 1982.

98. Способ получения биомассы бацилл: пат. 2053293 Россия / А.А. Степин, В.М.'Самыгин, В.П. Кухтин и др.. -опубл. 27.01.96, Бюл. № 3.

99. Сторожук, П.Г. Патогенетическая направленность белкового питания и заместительной ферментотерапии при иммунодефицитных состоянияхорганизма / П.Г. Сторожук, И.М. Быков, А.П. Сторожук // Int. J. Immunorehabil. 1998. - № 10. - С. 110-115.

100. Топчий, М.П. Применение препаратов из живых культур сенной палочки при дисбактериозах у телят: автореф. дис. . канд. биол. наук. Минск, 1997.-21 с.

101. Фазылова, А.А. Клинико-иммунологическое обоснование применения споробактерина и бактиспорина при дисбиозе кишечника у детей раннего возраста: автореф. дис. . канд. мед. наук. Уфа, 1998. - 24 с.

102. Физиологические и биохимические характеристики роста клеток бактерий Bacillus mucilaginosis / А.А. Глухова, Е.В. Чекасина, Ю.В. Евтодиенко и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 1993. - Т. 29, №5.-С. 21-27.

103. Фримель, Г. Иммунологичнкие методы / Г. Фримель. М.: Медицина, 1987.-С. 213-218.

104. Харченко, Е.П. Малые пептиды с антибиотической активностью / Е.П. Харченко // Антибиотики и химиотерапия. 1994. - Т. 39, № 7. - С. 15-19.

105. Чернякова, В.И. Бактериологическая и иммунологическая эффективность препарата биоспорина при неспецифическом язвенном колите / В.И. Чернякова, Н.М. Береза, С.И. Селезнева // Микробиол. журнал. 1993. - Т. 55, №3.-С. 63-67.

106. Штамм бактерий Bacillus pumilus для получения препарата против фитопатогенных микроорганизмов: пат. 1817875 Россия F01N 63/00,

107. C12N 1/20 / И.А. Хмель, JI.C. Чернин, Н.Б. Леванова и др.. -опубл. 20.05.95, Бюл. № 14.

108. Штамм Bacillus subtilis МЖ-6 антагонист микобактерий туберкулеза: пат. 2120992 Рос. Федерация С 12N 1/20 / И.И. Марков, И.П. Жданов, А.И. Марков. - опубл. 27.10.98, Бюл. № 30.

109. Штамм бактерий Bacillus subtilis продуцент комплекса гидролитических ферментов, обогащенных b-глюканазой: пат. 2046141 Рос. Федерация, С12 N 9/42 / Н.Г. Бочкарева, Ю.А. Белогорцев, Э.В. Удалова и др.. - опубл. 20.10.95, Бюл. №29.

110. Штамм бактерии В. mucilaginosus в качестве продуцента биостимулятора неспецифического иммунитета у телят: а.с. 1210452 СССР 1/00 / Е.Я. Виноградов, В.П. Шичкина. опубл. 27.04.96, Бюл. № 12.

111. Штамм бактерий Bacillus SP. компонент лечебно-профилактического препарата против дисбактериозов и аллергии: а.с. 1710575, S.U. / Л.И. Никитенко, В.И. Никитенко. -опубл. 5. 1992.

112. Штамм бактерий Bacillus subtilis продуцент L-фенилаланина: а. с. 1693056, С 12 Р 13/22 / Т.А. Ямпольская, Г.А. Великжанина, Н.И. Жданова и др.. - опубл. 23.11.91, Бюл. № 43.

113. Эндофитные растения рода Bacillus перспективные культуры для создания биологических средств защиты растений от болезней / И.А. Козачко, В.А. Вьюницкая, Т.Г. Бережнизкая и др. // Мшробюл. журнал. - 1995. - Т. 57, № 5. - С. 69-78.

114. Эффективность нового бактерийного препарата биоспорина при лечении острых кишечных инфекций / Н.М. Грачева, А.Ф. Гаврилов, А.И. Соловьева и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1996. - № 1. - С. 75-77.

115. Blaznic, J. Sdravljenje kronicne granulomotozne bolezni z acidofilnem mlecom / J. Blaznic, I.M. Kumel, B. Salamum et al. // Zdrav.Vesth. 1976.- N 45. - P. 77-79.

116. Cromwick, A.M. Effects of pH and aeration on y-poly (glutamic acid) formation by bacillus licheniformis in controlled batch fermentor cultures / A.M. Cromwick, G.A. Birrer, R.A. Gross // Biotechnol. Bioeng. 1996. - Vol. 50, N 2. - P. 222-227.

117. Continuos production of the lipopeptide biosurfactant of Bacillus licheniformis JF-2 / S.C. Lin, K.S. Carswell, M.M. Sharma, G. Georgiou // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. - Vol. 41, N 3. - P. 281-285.

118. David, L. Enzyme producing of Вас. Bacteria: pat. 6177012 US С 00 F 3/34, C12N 1/14/ L. David, S.Steven, - заявка № 09291053; заявл. 14.04.1999; опубл. 23.01.2001.

119. Danchin, A. Bacillus subtilis devoile ses genes // Biofutur / Danchin A., Glasser P., KunstF. et al.- 1998. N 174. - P. 14-17.

120. Devin, K.M. The Bacillus subtilis genome project: Aims and progress // Trends Biotechnol. 1995. - V. 13, N 6. - P. 210-216.

121. Dercova K., Augustin I., Kraicova D. Cell growth and a-amylase production characteristics of Bacillus subtilis // Folia microbiol. CSSR. 1992. - V. 37, N l.-P. 17-23.

122. Donovan, W.P. Bacillus thuringiensis crytic, protein toxic to coleopteran isects // Патент N 5378625 США A61K 31/00 / W.P. Donovan, M.J. Rupar, A.C. Slanei Опубл. 03.01.95.

123. Gastro, G.R. Simul taneous production of alpha and beta amylases by Bacillus subtilis Mir-5 in batch and continuous culture / G.R. Gastro, M.A., Ferrero C.M. Abate et al // Biotechnol. Lett. 1992. - V. 14, N 1. - P. 49-54.

124. Guida, V. Importansia dos Bacillos esporulados aerobios em gastroenterologia e nutricao / V. Guida, R. Guida // Rev. Brasil. Med. 1978. - Vol. 35, N 12. - P. 702-707.

125. Haldenwang, L. Influence of phosphate concentration on the respiratory activity of Azotobacter vinelandii / L. Haldenwang, V. Behrens // Z. Allg. Microbiol. -1983. Vol. 23, N 8. - P. 491-494.

126. Harrison, D. Study Group on Continuous Culture of Microorganisms / D. Harrison // Proc. 5th Int. Symp. Oxford, 1971. - P. 29.

127. Humbert F. Les probiotigues: un sujet d'actualite / F. Humbert // Bull. Inf. Stat. Exp. Auicult. Ploufragan. 1988. - Vol. 28, N 3. - P. 128-130.

128. Immunomodulation by Bacillus subtilis spores / J. Benedettini et al. // Boll. 1st. Sierote Milan. 1983. - Vol. 62, N 6. - P. 509-516.

129. Kimura, H. Bile acid-converting microorganism Bacillus sp. and a method of use: pat. 5869319 US С 12 P 7/40, C12R 1/07 / H. Kimura, Ogata To-Oru, A. Okamura. опубл. 02.09.1999.

130. Kishko Y.G., Vasylenko M.I., Podgorsky V.S., Kovalenko E.A. Lectin of Bacillus subtilis sp. As overinducer of Y-interferonogenesis // Млкробюлопчний журнал. 1997. -N 6, Т. 59. - С. 20-26.

131. Kubo Kazuhiro. Pure culture of Bacillus subtilis FERM BP-3418//Пат. N 5364738. США. МКИ A01N 25//00 / Kubo Kazuhir.- опубл. 15.11.94.

132. Kudrya V.A., Simonenko L.A. Alkaline serine proteinase and lectine isolation from the culture fluid of Bacillus subtilis // Appl. Microbiol, and Biotechnol. -1994. v. 41,N5. -P. 505-509.

133. Leviveld H.L.M., Bachmayer H., Boon B. et al. Safe biotechnology. Part 6. Safety assessment, in respect of human health of microorganisms used in biotechnology // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1995. V. 43, N 3. - P. 389393.

134. Martins, M. Influence of the oxygen and growth rate on the metabolic activity of Bacillus stearothermophilus grown in glucose-limited cultures / M. Martins, L. Lelis // Rev. Microbiol. 1996. - Vol. 27, N. 3. - P. 166-170.

135. Martins, M. Effect of the dissolved oxygen level on the metabolic activity of Bacillus stearothermophilus when growing on glycerol in chemostat culture / M. Martins, L. Lelis // Rev. Microbiol. 1997. - Vol. 28, N 2. - P. 96-100.

136. Misaghi, I .J. Endophytic Bacteria in Symton tree Cotton Plants / I J. Misaghi, C.R. Doundelinger // Pyitopatology -1990 - V 80, № 9.- P. 808-811.

137. Moszer, I. A relational database for the Bacillus subtilis genome / Moszer I., Glaser P., Danchin A. SubtiList // Microbiology. 1995. - V. 141, N 2. - P. 261-268.

138. Payne Jewel M. Isolates of Bacillus thuringiensis Hist are active ayanist nematodes / Патент N51513 63,C12N 1/20, A 01 N 63/00, заявл. 27.07.90., опубл. 29.09.92.

139. Rodriewicz, A. Wykorzystanie bacterii z rodzaju Bacillus do produckcji pozakomoakowych proteinaz Cz.II / A. Rodriewicz // Zesz. nauk. AR Wroclawiu Technol. Zyw. 1989. - N 5. - P. 207-217.

140. Rychen, G. Effets des flores lactigues des produits laitiers fermentes: Une base scientifigue pour 1'etude des probiotigues microbiens dans l'espece porcine / G. Rychen, C. Simoes Nunes // Prod. Anim. 1995. - Vol. 8, N 2. - P. 97-104.

141. Selim, M.H. Proteases from thermophilic bacilli / M.H. Selim, G. El-Masry Hoda // Microbios. 1990. - Vol. 63, N 254. - P. 55-63.

142. Su Li, Wuhan daxue xuebao. Ziran kexue ban / Su Li, Zhang Zhihong, Xiao Xianzhi, Wang Xiaomin // J. Wuhan Univ. Natur. Sci. Ed. 1996. - V. 42, N 4. -C. 516-518.

143. Testolin, G. Batteri lattici e latti fermentati nella functionalita dell apparato gastro intestinale / G. Testolin, M. Gasiraghi // Ind. Latte. - 2000. - Vol. 36, N1-2.-P. 49-65.

144. Touati, D. Regulation and protective role of the microbial superoxide dismutases / D. Touati // Mol. Biol. Free Radic. Scaveng. Syst. Cold. Spring Harbor, 1992.-P. 231-261.

145. Tsuge Kenji Characterization of Bacillus subtilis YB8, coproducer of lipopeptides surfactin and plipastatin B1 / Tsuge Kenji, Ano Takashi, Shoda Macoto // J. Gen. Appl. Microbiol. 1995. - Vol. 41, N 6. - P. 541-545.

146. Yamada S. Biological activity of antifungal substances produced by Bacillus subtilis // S.Yamada,. Y.Takayama, M .Jamanaka.- Pestic. Sci. 1990. - V. 15, N 1. - P. 95-96.

147. Yoshimoto T. Nucleotide sequence of the neutral protease gene from Bacillus subtilis var. amylosacchariticus // T. Yoshimoto, H. Oyama, T. Takechita et aJ. -Ferment. andBioeng. 1990. -V. 70, N 6. P. 370-375.