Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, ферментативные и антибиотические свойства природных микроорганизмов и оценка их биотехнологического потенциала

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Выделение, ферментативные и антибиотические свойства природных микроорганизмов и оценка их биотехнологического потенциала"

На правах рукдщси

Андреева Ирина Сергеевна

Выделение, ферментативные и антибиотические свойства природных микроорганизмов и оценка их биотехнологического потенциала

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2009

О 2 АПР 20С9

003466215

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Репин Владимир Евгеньевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Наплекова Надежда Николаевна доктор биологических наук, доцент Тикунова Нина Викторовна

Ведущая организация:

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Защита состоится 29 апреля 2009 года в/ часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, п. Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора по адресу: 630559, п. Кольцово Новосибирской области Автореферат разослан « 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Карпенко Л.И.

Актуальность исследования. Микроорганизмы и продукты их жизнедеятельности являются наиболее доступным и рентабельным источником ферментов и многих других биологически активных веществ, необходимых для промышленности и научных исследований. Особый интерес представляют микроорганизмы экстремальных условий обитания, обладающие ферментными системами, активными в более широком диапазоне температур и pH среды по сравнению с мезофильными прототипами (Бонч-Осмоловская, 2004; Бонч-Осмоловская, Мирошниченко и др., 2004; Гальченко, 2005). Экстремофилы являются также ценным источником генов, обеспечивающих возможность создания рекомбинантных суперпродуцентов с новыми расширенными возможностями (Pecigou et al., 2001; Bell et al., 2002; Robertson, Steer, 2004). Существует большая потребность в микроорганизмах, применяемых для биоремедиации окружающей среды от нефтяных и других загрязнителей (Стабникова и др., 1995; Коронелли, 1996; Барышникова и др., 2001; Киреева и др., 2004). Значительное число насекомых-вредителей сельского и лесного хозяйства не контролируются доступными инсектицидными препаратами, сохраняется актуальность обнаружения новых продуцентов энтомопатогенных токсинов (Шехурина, 1963; Grimont et al., 1998; Глупов, 2001; Rampersad, Ammons, 2005). В связи с нарастающим распространением возбудителей инфекционных заболеваний, обладающих множественной устойчивостью к антибиотикам, так же актуален поиск новых антагонистов патогенных микроорганизмов. Чрезвычайно важным является поддержание и сохранение коллекций микроорганизмов, их пополнение новыми перспективными штаммами для своевременного обеспечения потребностей промышленности и научных исследований (Ившина, 1994; Родичева и др., 1998; Синеокий, Агранович, 2001).

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в выделении и изучении микроорганизмов из различных природных источников, создании базовой коллекции микробных изолятов для выявления новых продуцентов БАВ, перспективных для разработок биотехнологических препаратов. Задачи исследования:

1. Выделить микробное разнообразие образцов почвы, воды и донных осадков водоемов различных природных территорий, включая экстремальные, создать коллекцию термофильных, мезофильных и психрофильных природных микробных изолятов.

2. Провести скрининг выделенных микроорганизмов на наличие ферментативной и антибиотической активностей.

3. Выявить активные продуценты БАВ, перспективные для биотехнологии, определить их таксономическую принадлежность.

4. Провести селекцию по выделению наиболее активных субкультур продуцентов, оптимизировать условия культивирования.

5. Составить коллекцию штаммов Bacillus thuringiensis, определить особенности их инсектицидной и антибиотической активностей.

Научная новизна работы. Из природных образцов, отобранных из различных экологических ниш, выделено 6938 новых микробных изолятов, представленных мезофиль-ными, термофильными и психрофильными бактериями. Обнаружены и идентифицированы новые виды микроорганизмов родов Paenibacillus, Brevibacillus, Roseomonas, не имеющие аналогов в доступных базах данных. В результате скрининга выделенных изолятов на наличие амилолитической, фосфатазной, эндонуклеазной и другой ферментативной активности, выявлены высоко продуктивные штаммы, сохраняющих способность к росту и продукции БАВ в широком диапазоне температур и pH среды. Среди бактерий родов Rhizobium, Bacillus, Klebsiella, Paenibacillus, Micrococcus и др. обнаружены новые продуценты эндонуклеаз рестрикции (ЭР), имеющие преимущества относительно ранее известных прототипов и их изошизомеров. Выделены новые штаммы, относящиеся к Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki, В. thuringiensis ssp. gallería, обладающие высокой активностью против ряда патогенных микроорганизмов и комаров Aedes aegypti. Обнаружены атипичные, неинсектицидные штаммы В. thuringiensis, проявляющие выраженный антагонизм по отношению к патогенным бактериям кишечной группы и Candida albicans, эффективно подавляющие размножение вируса A/(H5N1) на клетках MDCK. Выявленные признаки позволяют считать их подвидами Bt, ранее не представленными в базах данных.

Практическая значимость. Основная часть полученной коллекции представлена микроорганизмами экстремальных условий обитания, что позволяет прогнозировать выделение новых продуцентов БАВ, активных в широком диапазоне pH и температуры культивирования. Исследование и использование генов выделенных микроорганизмов-экстремофилов имеет значение для конструирования штаммов с более широкими возможностями применения в биотехнологии. Вновь выделенные изошизомеры ЭР, обладающие рядом преимуществ, в сравнении с ранее известными ферментами-прототипами и их изо-шизомерами, могут заменить эти ЭР в проводимых генно-инженерных работах. Выделенные из аэрозолей воздуха и осадков Байкала высоко инсектицидные штаммы В. thuringiensis ssp. kurstaki и В. thuringiensis ssp. gallería пригодны в качестве основы энтомопатоген-ных препаратов токсичных для комаров Aedes aegypti и для разработки антимикробных средств, направленных против ряда патогенных микроорганизмов кишечной группы. Атипичные штаммы В. thuringiensis Долины гейзеров интересны как для фундаментальных исследований в области систематики бацилл, так и для разработки эффективных антимикробных и противовирусных препаратов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены на 28 Всероссийских и Международных конференциях, в том числе: Fourth USA/CIS Joint Conference on Environmental Hydrology and Hydrogeology (San Francisco, California, 1999), 23d Biotechnological Symposium for Fuels and Chemicals (Breckenridge, 2001), 1-ом Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002),

International Conference «Microbial diversity: current situation, conservation strategy and bio-technological potentialities ICOMID-2005» (Perm-Kazan-Perm, 2005), 9th International Colloquium in Invertebrate Pathology and Microbial Control, 39th Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology and 8th International Conference on B. thuringiensis (China, 2006), II International conference «Biospheere Origin and Evolution» (Loutraki, 2007), Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирск, 2008), IV Международной научной конференции: «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008) и др.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 26 статей, получено 9 патентов РФ.

Вклад автора. Автору принадлежат постановка задач, выполнение работ по выделению и идентификации природных микроорганизмов, культивированию и селекции продуцентов, определению факторов патогенности штаммов, чувствительности к антибиотикам, антагонистической активности. Коллекция штаммов В. thuringiensis (Bt), продуцентов БАВ, штаммов, исследуемых в качестве новых видов, получена, охарактеризована и поддерживается автором лично. Инсектицидная активность штаммов Bt исследована на базе ИСиЭЖ СО РАН совместно с к.б.н. Бурцевой Л.И. и к.б.н. Калмыковой Г.В. RABD-анализ штаммов Bt выполнен совместно с сотрудниками ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнад-зора Мокеевой А.В. и к.б.н. Орешковой С.Ф. Анализ биохимической активности штаммов проведен автором совместно с сотрудником «Вектора» Печуркиной Н.И., скрининг штаммов на продукцию ферментов - совместно с к.б.н. Пучковой Л.И., к.б.н. Лебедевым Л.Р., Афиногеновой Г.Н. Электронная микроскопия ультратонких срезов клеток выполнена сотрудником «Вектора» д.б.н. Рябчиковой Е.И. Анализ нуклеотидных последовательностей 16S рРНК штаммов выполнен д.б.н. Морозовой О.В. и Пилипенко А.С. в Межинститутском Центре секвенирования ДНК СО РАН (г. Новосибирск). Исследование противовирусной активности препаратов проведены совместно с к.б.н. Мазурковой Н.А. на базе отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспот-ребнадзора.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах, содержит 38 таблиц и 44 рисунка, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», трех глав собственных исследований, заключения, выводов, двух приложений и списка использованной литературы, включающего 115 отечественных и 171 зарубежный источник.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Созданная коллекция в составе 6938 природных микробных изолятов, охарактеризованных по основным фенотипическим и ферментативным признакам, представляющих

собой научную и практическую ценность в качестве новых перспективных штаммов для биотехнологии.

2. Новые виды микроорганизмов, ранее не представленные в базах данных, относящиеся к родам Roseomonas, Brevibacillus и Paenibacillus, обнаруженные в образцах Долины гейзеров и осадков Байкала, представляющие интерес для прикладных и фундаментальных исследований.

3. Новые продуценты эндонуклеаз рестрикции, в том числе, более технологичные при использовании или превышающие по уровню биосинтеза ранее известные прототипы ЭР SacII, BstEII, BbvII, Bgll, Ppal, Hae III, Clal и их изошизомеры.

4. Штаммы В. thuringiensis ssp. kurstaki и В. thuringiensis ssp. gallería, выделенные из аэрозолей воздуха и осадков Байкала, обладающие высокой антибиотической и инсектицидной активностью, пригодные для разработки антимикробных средств и энтомопа-тогенных препаратов.

5. Образующие эндоспоры и параспоральные включения, неинсектицидные атипичные штаммы вида В. thuringiensis Долины гейзеров, перспективные для разработки антимикробных и противовирусных препаратов, представляющие интерес для таксономических исследований.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы -«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы», с частичной поддержкой Региональным грантом РФФИ 97-04-96171, грантами DOE-IPP CRDF 10618 и DOE-IPP ААХ-8-18652-01, субконтракт DE-AC36-83CY10093, грантами DOE-IPP № 6480540 и МНТЦ № 2490р, а также - междисциплинарным интеграционным грантом Президиума СО РАН № 24 «Роль микроорганизмов в функционировании живых систем: фундаментальные проблемы и биоинженерные приложения».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ Материалы и методы

Выделение, идентификацию микробных изолятов, определение их ферментативной и антибиотической активности выполняли, используя стандартные методы (Герхард и др., 1983, 1984; Маниатис et al., 1984, Holt et al., 1986). При необходимости проводили геномный анализ штаммов, включающий в себя скрининг микроорганизмов на наличие плаз-мидной ДНК (Маниатис et al., 1984), определение ГЦ-состава хромосомной ДНК (Marmur and Doty, 1962) и нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК (Chomczynski, Sacchi 1987). Филогенетический анализ выполняли с использованием программы MEGA версии 4 [Tamura et al., 2007] для нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, определённых в данной работе, и близкородственных видов из базы данных GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Ультраструктуру клеток микроорганизмов исследовали с помощью электронной микроскопии, анализ профиля жирных кислот (АЖК) штаммов выполняли согласно рекомендациям MIDI (Newark, США).

Исследование разнообразия и ферментативной активности микроорганизмов, выделенных из природных источников

В результате выделения микроорганизмов из 744-х природных образцов, создана базовая коллекция, насчитывающая около 7000 мезофильных, термофильных и психро-фильных микробных изолятов: 2200 изолятов выделены из образцов воды и осадков Байкала; 1480 - из почвы, воды и осадков источников Долины Гейзеров; 2360 изолятов - из аэрозолей воздуха, 83 - из льда Антарктиды, 815 изолятов выделены из образцов почвы и воды, отобранных на различных территориях Сибири и Алтая, включая нефтезагрязнен-ные. В целях выделения ферментов, активных в широком диапазоне температур и рН среды, основное внимание уделено микроорганизмам, выделенным из экстремальных условий обитания.

Разнообразие и Ферментативная активность изолятов Полины гейзеров. При исследовании свойств изолятов, выделенных из образцов Долины гейзеров, обнаружены микроорганизмы, принадлежащие к родам Streptomyces, Calorbacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Wantersia, Paenibacillus, Thermus, Geobacillus, Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus. В числе спорообразующих бактерий рода Bacillus выявлены относящиеся к видам В. stearothermophilus, В. cereus, В. coagulans, В. circulans, В. thuringiensis и ряду других.

Показано, что 149 изолятов из 450 исследованных обладали протеазами, более сорока из которых были высоко активны при рН среды от 5,0 до 9,0. К этой группе относятся термофильные бактерии Anoxybacillus sp. Dg-326 и Gi-621, Aneurinibacillus sp. Dg-480t, Calorbacillus sp. Dg-382t и Dg-383t, Geobacillus sp. Dg-321t и Dg-491, а также ряд галото-лерантных штаммов, секретирующих протеазы с высокой активностью при повышенной засоленности среды. 114 изолятов содержали липазы, 35 из них были высокоактивными, в том числе - термофильные штаммы Geobacillus sp. Gi-385t и штамм Anoxybacillus sp. Km-999. Лецитиназной активностью обладали 72 изолята, амилолитические ферменты обнаружены у 151 микроорганизма. Наиболее активные ферменты секретировали актиномице-ты, термофильные и мезофильные бациллы. Для 47 изолятов было характерно наличие 4-х тестируемых ферментных активностей (амилазной, протеазной, липазной и лецитиназной), из них штаммы бактерий Dg-878, Dg-843, Dg-784 продуцировали ферменты, активные при повышенной засоленности среды и рН в диапазоне от 5,0 до 9,0. Количественное соотношение микроорганизмов, обладающих ферментативной активностью, представлено на рис. I.

Рис. 1. Продукция секретируе-мых ферментов микроорганизмами Долины гейзеров

С применением селективной среды, содержащей хромогенные AZCL-полисахариды, у 280 из 450 исследованных изолятов обнаружена способность к секреции полисахарид-деградирующих ферментов при pH среды 5,0, 7,0 или 9,0. Наиболее распространенными ферментами оказались: бета-глюканаза (190 изолятов), 1,4-бета-галактаназа (163 изолята), эндоцеллюлаза (145 изолятов). Менее представлены были микроорганизмы, содержащие пуллуланазу (96 изолятов) и эндоксиланазу (63 изолята). Максимальное количество гидролитических ферментов - до пяти, обнаружено у семи изолятов.

На наличие эндонуклеаз рестрикции (ЭР) изучено 844 изолята, на экзонуклеазную активность - 526, на продукцию щелочной фосфатазы - 429, на наличие плазмидных ДНК - 720. Изоляты, содержащие ЭР II типа, составили 4,5 % от общего числа исследованных микроорганизмов. Продуценты ЭР были представлены мезофильными и термофильными бактериями, содержащими изошизомеры ЭР SalGI, PspEI, Pstl, MspR9I, Bgll, Bsa29I, Hpa II, Hae III и др. Показано, что ферменты Hpa II и Нае III особенно широко распространены в микроорганизмах Камчатки. Около 48,0% от исследованных изолятов являлись продуцентами щелочной фосфатазы, из которых 2,4 % были высокоактивными, перспективными для биотехнологических разработок.

Психрофильные бактерии Антарктиды. Изо льда Антарктиды выделены и идентифицированы 83 культивируемых штамма психрофильных и психротолерантных бактерий родов Pseudomonas, Arthrobacter, Flavobacterium, Psychrobacter, Aquaspirillum, Polaromonas, семейств Comamonadacea, Actinobacteridae и др. (рис 2). Проведен скрининг всех полученных штаммов на наличие плазмидных ДНК и ферментативной активности при температуре 4-6°С. В отличие от изолятов Долины гейзеров у штаммов Антарктиды не обнаружены секретируемые амилазы и лишь небольшой процент из них секретировал протеазы. ЭР Ii-типа содержали 8,4% штаммов от общего количества. Неспецифические экзонуклеазы обнаружены у 16,4% штаммов. Липазной активностью, детектируемой с применением эфиров жирных кислот при температуре 4-6°С, обладали 28,9 % штаммов.

Рис. 2. Количественное соотношение микроорганизмов разной таксономической принадлежности среди выделенных из поверхностного льда Антарктиды

Липолитические ферменты штаммов Антарктиды различались по специфичности гидролиза используемых субстратов (твин-20, твин-40 или твин-80). Более чем для 42,2% изолятов отмечен высокий уровень продукции щелочной фосфатазы при температуре 4-6°С. Количественное соотношение микроорганизмов Антарктиды, секретирующих ферменты, показано на рис. 3.

Рис. 3. Относительное содержание штаммов, продуцирующих ферменты, адаптированные к пониженной температуре

о4

4&П •10 Г ■ С - ъа а • - ЭВ9

:<> г -

29 С №9

'ЬЧ ■

•ОС •

5 С п

Щелочные фосфатазы

Экзонук-леазы

Эндонук-

леазы

рестрикции

Штаммы, выделенные из образцов Антарктического льда, как правило, обладали множественной устойчивостью к антибиотикам (до 13 из 17 использованных в опыте). Взаимосвязи резистентности к антибиотикам и наличием в клетках штаммов плазмидных ДНК не обнаружено.

Психрофильные и психотолерантные штаммы Aquaspirillum arcticum А-12p, Pseudomonas aurantiaca A-23p, Arthrobacter sp. Lv-21, Flavobacterium frigidarium A-32p, Janthinobacterium lividum Lv-6, Polaromonas vacuolata Lv-9, Pseudomonas antarctica A-55, Psychrobacter species A-51, Pseudomonas sp. Lv-2, A-57, Duganella sp. A-26 и ряд других, проявляющих выраженную ферментативную активность при 4-6°С, пригодны для разработок в качестве продуцентов ферментов, активных при низких температурах. Плазмид-ные ДНК штаммов, обладающих устойчивостью к пониженным температурам, представляют интерес для генно-инженерного применения.

Разнообразие, ферментативная активность микробных аэуоизолятов. В образцах аэрозолей воздуха, отобранных на высотах от 500 до 7000 м, обнаружены микроорганизмы, относящиеся к широкому спектру родов, таких как Brevibacillus, Kocuria, Brevun-dimonas, Deinococcus, Micrococcus, Arthrobacter, Flavobacterium, Acetobacter, Bacillus, Pae-nibacillus, Acinetobacter, Staphylococcus, Streptococcus и др. Полученные штаммы исследованы на наличие ЭР, щелочной фосфатазы, факторов патогенности (гемолитической,

плазмокоагулазной, желатиназной и фибринолитической активностей) и устойчивости к антибиотикам. Показано, что ЭР обладают в разных образцах от 6 до 10% выделенных изолятов. Среди идентифицированных ЭР в наибольшем количестве обнаружены изоши-зомеры ферментов Clal и НаеШ. Выделены также штаммы-продуценты изошизомеров ЭР PstI, AsuII, Bgll, Bst2UI, Kzo9I и ряда других ферментов рестрикции. Около 50% исследуемых микроорганизмов продуцировали щелочную фосфатазу, из них 38% были высокоактивны. Всего на ферментативную активность изучено 1850 изолятов. Следует отметить, что микробные аэроизоляты интересны не только для биотехнологических разработок, но и в плане исследований состава биогенной компоненты аэрозолей атмосферы и ее влияния на здоровье людей, так как от 8 до 40% микроорганизмов, выделенных из разных образцов аэрозолей, обладали признаками патогенности.

Микроорганизмы древних осадков оз. Байкал. В образцах осадков, полученных при глубоком бурении дна озера Байкал, обнаружено значительное количество жизнеспособных микроорганизмов (до 103-106 КОЕ/г). Выявлены бактерии родов Micrococcus, Staphylococcus, Bacillus, Nocardia, Acinetobacter, Arthrobacter, Rhodococcus, Curtobacterium, Clavibacter и других, всего 17 родов. В пробах обнаружены дрожжи и плесневые грибы. Психрофильные и психротолерантные штаммы составляли около 11% от общего количества выделенных микроорганизмов. Согласно данным АЖК для более 40% полученных микробных изолятов не найдены аналоги в доступных базах данных.

Ферментативная активность выделенных штаммов. В результате скрининга микробных изолятов Байкала обнаружены штаммы, продуцирующие ЭР разной специфичности. Наиболее многочисленными оказались продуценты изошизомеров ЭР BstNI, AsuII, НаеШ, Hpall. Кроме того, выделены продуценты изошизомеров ЭР Bglll, Bell, Clal, Saul, Xhol, BamHI и ряд других. 455 из 1700 исследованных изолятов Байкала проявили амило-литическую активность при разных значениях рН реакционной среды: 11,8% штаммов бьии активны при рН 5,0, 54,5 % штаммов - при рН 7,0, и 33,7 % штаммов - при рН 9,0. Более подробно исследованы мезофильные бациллы, имеющие амилолитические ферменты. Штаммы отличались по способности утилизировать крахмал, наблюдалась зависимость проявления амилолитической активности штаммов, как от температуры, так и от рН среды. Самую высокую активность амилаз проявил штамм Bacillus sp. ChelOlO при температуре 55°С и диапазоне рН от 4,85 до 8,22. При этом пик активности обнаруживался при рН 7,5, при котором гидролизовалось 45,2% субстрата в течение 60 мин., в то время как среди исследованных термофильных штаммов Долины гейзеров наибольшую амило-литическую активность проявил штамм Bacillus sp. ТК 478: за то же время, но при более высокой температуре (70°С) и рН 4,85 было гидролизовано 41,2% субстрата. Штамм Bacillus sp. ChelOlO продуцировал также эндо-1,4-р-галактаназу, эндо-ксиланазу и Р-глюканазу

Из осадков Байкала выделено 19 штаммов спорообразующих бактерий, относящихся к группе видов Bacillus subtilis - Bacillus mesentericus, проявивших выраженное антибиотическое действие относительно патогенных микроорганизмов Candida albicans, Shigella sonnei и Staphylococcus aureus. Жизнеспособность и антагонистические способности, выявленные при температуре 30°С, штаммы бацилл сохраняли и при 42"С. Это свойство может быть полезно при рассмотрении их в качестве пробиотиков в ветеринарии, так как нормальная температура тела птиц и ряда животных приближается к этому значению.

Новые виды микроорганизмов, выделенные из природных образцов. В числе выделенных микроорганизмов обнаружены и идентифицированы уникальные бактерии, для которых не были найдены аналоги в доступных базах данных. Среди них - грамотрицатель-ные, спорообразующие бактерии Долины гейзеров, растущие в диапазоне рН среды от 5,0 до 12,0. Сочетание грамотрицательной окраски бактерий со способностью к образованию эндоспор является достаточно редким явлением, представляет интерес для таксономических исследований. Обнаруженные спорообразующие грамотрицательные бактерии Долины гейзеров определены в соответствии с полученными фенотипическими и геномными характеристиками как новые виды микроорганизмов Paenibacillus inaequabilis sp. nov. (штамм Dg-1009, номер доступа нуклеотидной последовательности 16S рРНК в базе данных GenBank EU497637) и Paenibacillus formosus sp. nov. (штаммы K-58 и К-59, номер доступа EU497638). Грамотрицательная, спорообразующая бактерия LB-56, обнаруженная в горячем источнике, отнесена к роду Brevibacillus и идентифицирована как новый вид В. barguzinii sp. nov. (номер доступа EF467658) (рис.4).

Рис. 4. Световая (А) и электронная (С, О) микроскопия клеток грамотрицательной, спорообра-зующей бактерии Вгеу1ЪасШи$ Ъаг^иг'шп Бр. поу. ЬВ-56 и грамотрицательной бактерии Яозеотопаз ЬшкаИса Бр. поу. СЬе-82 (В).

А- спорулирующие клетки штамма LB-56, окраска по Граму (*2500)

В- клетки штамма СЬе-82 в стадии деления. Ультратонкие срезы. Длина масштабной линии 1мкм.

С, Э - ультратонкие срезы клеток штамма ЬВ-56, тонкой стрелкой обозначены эндоспоры, толстой - нуклеоид, двойной - волнистая наружная мембрана/

Неспороносная, грамотрицательная, коккоподобная, подвижная бактерия С11е-82, выделена из образца древних осадочных пород Байкала, отобранного на глубине 146,7 м. Клетки штамма могут достигать более 2,5 мкм в диаметре, что, как правило, не характерно для клеток прокариот. В соответствии с полученными фенотипическими признаками и данными геномного анализа штамм СЪе-82 определен как новый вид Нозеотопаз ЬткаИса эр. поу. (номер доступа в базе данных ОепВапк 0(2508813) (рис.4). Следует отметить, что ранее известные виды рода Дсмео/иогак представлены, главным образом, клиническим изолятами. Новые виды микроорганизмов, обнаруженные при выполнении данной работы, интересны как для исследований в области систематики микроорганизмов, так и в качестве источника генов при конструировании рекомбинантных микроорганизмов с расширенными полезными свойствами.

Идентификация микроорганизмов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции, определение специфичности ферментов

Идентификация штаммов, обладающих ферментами рестрикции, перспективными для практического использования, проведена стандартными методами. Выделенные продуценты изошизомеров ЭР Bell, SacII, Clal, SalGI, BspRI, Ball, BstEII, Bgll, BbvII, ScrFI, BsiYI, Hae III, включенные в состав коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, частично приведены в табл. 1. В их числе находятся штаммы, имеющие ряд преимуществе сравнении со штаммами-прототипами и их ранее известными изо-шизомерами.

Так, ЭР ВтеЗбН штамма Bacillus meeaterium В-361 узнает и расщепляет на двунитевой ДНК последовательность нуклеотидов 5'-GGCC-3'. Штамм В. megaterium В-361 имел продуктивность в 5-10 раз более высокую по сравнению с продуцентами ЭР аналогичной специфичности, описанными в литературе (рис.5). В отличие от прототипа штамм В. megaterium В-361 не проявлял патогенных свойств, был не требователен к условиям роста. Штамм-продуцент ЭР ВтеЗбП депонирован в ВКПМ ГосНИИ генетика (колл. № В-4723).

а.» &.4U чи E.1U штамм выход фермента выход фермента на на 1 г биомассы 1 л КЖ

Рис. 5. Выход ферментов ВтеЗбП и ВзрШ (изошизо-мер прототипа НаеШ, продуцируемый штаммом В. ¡рУшепст В-13 8) в зависимости от состава среды ферментации (культивирование в течение 24 часов, при температуре 30°С).

Таблица 1. Перечень вновь выделенных штаммов-продуцентов ЭР с указанием сай-

та узнавания и прототипа

№ п/п Штамм Колл. № ЭР Сайт узнавания Прототип

1. Klebsiella pneumoniae 378-13, В-4894* B-378 Kpn378I CCGCAGG SacII

2. Rhizobium trifolii 20 B-480 Rtr20I GAAGAC BbvII

3. Rhizobium leguminozarum 69, B-195" B-320 Rial GGTCTC Ppal

4. Rhizobium meliloti 21 B-385 Rme21I ATCGAT Clal

5. Rhizobium trifolii 63, B-194" B-386 Rtrl GATCGAC SalGI

6. Slreplomyces species St-13 B-417 Spe-131 CTGCAG SalPl

7. Bacllus megaterium 361, B-4723* B-361 Bme3611 GGACC Haelll

8. Micrococcus species K-29 B-465 MspR91 CCNGG ScrFI

9. Bacillus species 07 B-479 Bsp07I GAAGAC BbvII

10. Bacillus sp. 54 B-499 Bsp54I GGNCC Sau96I

11. Bacillus sp. 122 B-500 Bspl22I CTGCAG PstI

12. Bacillus stearothermophilus T-9 B-605 BstT9I GGTNACC BstEII

13. Bacillus stearothermophilus T-5 B-607 BstT5I CYCGRG Aval

14. Streptomyces species St—12 B-679 Spel2I CTGCAG SalPI

15. Bacillus stearothermophilus T-7 B-683 BstT7I TGATCA Bell

16. Bacillus stearothermophilus T-10 B-684 BstTlOI GGTNACC BstEII

17. Bacillus stearothermophilus T-22 B-894 Bst22 I CCNSANNGG BsiYI

18. Paenibacillus sp. Dg-1009 B-1135 Psp10091 GCCN5GC Bgll

19. Acinetobacter sp. ОК-ЮЗр B-1145 Asp103I GGATCC BamHI

20. Bacillus sp. K-443t B-1182 BspK.4431 CTGCAG PstI

21. Bacillus sp. К-43П B-1183 BspK4311 GGCC Haelll

22. Bacillus sp. K-437t B-1184 BspK4371 GGCC Haelll

23. Bacillus sp. K-590t B-l 186 Bsp5901 GGCC BspRI

24. Bacillus sp. K-507t B-1187 Bsp507I CCGG Hpall

25. Bacillus sp. K-204t B-1188 Bsp204I CCGG Hpall

26. Bacillus sp. Az-575 B-1189 Bsp575I AGATCT Bglll

Обозначения: *, коллекционный номер ВКПМ ГосНИИ генетика; **, коллекционный номер

ВНИИСХМ.

Изолированный из клубеньков бобового растения штамм Rhizobium leeuminozarum R-69 продуцировал ЭР Rle69I (прототип Ppal, уровень продукции в литературе не приведен). При этом по продукции фермента штамм R-69 в 3,3 раза превышал штамм Escherichia coli RFL31- продуцент ЭР ЕсоЗП, являющейся ранее известным изошизомером ЭР Ppal.

Штамм Rhizobium trifolii R-63 продуцировал ЭР Rtrl (прототип SalGI), узнающую нуклеотидную последовательность 5'-GTCGAC-3'. Высокая продуктивность нового штамма-продуцента и наличие в нем единственной сайт-специфической эндонуклеазы обеспечивают преимущества последнего по сравнению с ранее известными штаммом-прототипом и другими штаммами, продуцирующими изошизомеры ЭР SalGI.

Из горячих источников Камчатки изолированы термофильные штаммы Bacillus stearothermophilus Т-10 и В. stearothermophilus Т-9 продуцирующие ЭР BstTlOI и BstT9I, узнающие и расщепляющие нуклеотидную последовательность 5'-GGTNACC-3' (прототип BstEII). В отличие от известных ферментов с аналогичной специфичностью штаммы В. stearothermophilus Т-10, В. stearothermophilus Т-9 растут на простых средах, имеют по одной ЭР и в 3-4 раза более высокий выход фермента.

Обнаружен термофильный штамм В. stearothermophilus 22. обладающий ЭР Bst22I с редко встречающейся специфичностью (сайт узнавания 5'-CCNNNNNANNGG-3', идентичный сайту узнавания ЭР Bsc4I), являющейся изошизомером ЭР BsiYI, значительно превышающей продуктивность прототипа. ЭР Bst22I термостабильна, ее активность сохраняется при температуре до 80°С.

Выделен высокопродуктивный штамм Klebsiella pneumoniae В-378 содержащий ЭР Крп3781, узнающую и гидролизующую последовательность нуклеотидов 5'-CCGCGG-3', являющуюся изошизомером ЭР SacII. Технологически важным являлось то, что в отличие от известных продуцентов SacII, штамм К. pneumoniae 378 продуцировал только одну ЭР. Штамм К. pneumoniae В-378 в экспериментах вызывал 100% гибель белых мышей. Проведена селекционная работа, позволившая выявить не вирулентную, не токсичную субкультуру штамма К. pneumoniae 378 №13. Внутрибрюшинное и пероральное введение суспензии клеток (дозы составляли 1х108, 5*108, 1x10' клеток) и фильтратов культуральной жидкости субкультуры К. pneumoniae 378 №13 не вызывало заболевания и гибели животных. Непатогенный вариант продуцента ЭР Крп3781 депонирован в ВКПМ ГосНИИ генетика (колл. № В-4894).

Из грамотрицательного. спорообразующего штамма Dgl009 рода Paenibacillus выделена высокоактивная ЭР, узнающая и расщепляющая последовательность нуклеотидов 5'-GCCNNNNNGGC-31, являющаяся изошизомером известного фермента Bgll (Pirrotta, 1976). Данные об обнаружении ЭР указанной специфичности в микроорганизмах рода Paenibacillus в базах данных отсутствуют. В отличие от ранее известных продуцентов изошизомеров ЭР Bgll (Bacillus species 6-3-1 и Thermus species 8E), содержащих по две эн-донуклеазы разной специфичности, штамм Dg 1009 содержит только один фермент, хорошо растет на простых питательных средах, является технологически более удобным.

Психрофильный штамм Acinetobacter ОК-ЮЗр. продуцент изошизомера ЭР BamHI, изолирован из образца льда, взятого из зоны мерзлоты. Продуцируемая штаммом ЭР имела максимум активности при температуре 6-10°С, что является достаточно редким свойством для ЭР данной специфичности.

Перечень патентов РФ, полученных на выделенные штаммы-продуценты ЭР, приведен в списке публикаций по материалам проведенных исследований.

Антимикробная и инсектицидная активность бактерий Bacillus thuringiensis (Bt), формирующих эндоспоры и параспоральные включения

В результате выполненной работы составлена коллекция, включающая в себя 36 кристаллосодержащих, спорообразующих штаммов, выделенных из разных природных источников и идентифицированных как В. thuringiensis. К инсектицидными подвидами отнесены 15 штаммов В. thuringiensis ssp. kurstaki, выделенные из аэрозолей воздуха, и 3 штамма В. thuringiensis ssp. gallería, выделенные из осадков Байкала (таблица 2).

Таблица 2. Энтомопатогенная активность штаммов Bt, выделенных из аэрозолей воздуха и из осадков Байкала

Штамм Н-антиген Гибель A. aegypti (%) / время экспозиции (час) Штамм Н-антиген Гибель A. aegypti (%) / время экспозиции (час)

24 48 24 48

Ar 100-04 3abc 80 100 Ar 18-15 ЗаЬс 84 96

Ar 78-04 -«- 76 100 Ar 63-04 -«- 80 100

Ar 31-04 -«- 48 100 Ar 5-18 -«- 60 96

Ar 5-15 -«- 68 88 Che-152 5 ab 16 80

Ar 2-18 80 100 Che-159 -«- 100

Ar 118-17 -«- 48 96 Che-157 -«- 92 100

Ar 32-04 76 100 K-l ЗаЬс 85 100

Ar 50-04 -«- 16 96 Контроль -«- 0 10

Обозначение: К-1, производственный штамм В. thuringiensis ssp. kurstaki K-l.

Штаммы Bt, изолированные из образцов Долины гейзеров (Dg-1011, Dg-1015, Dg-1018, Dg-1024, Dg-992, Dg-994, Gi-47, Gi-117, Gi-416, Gi-424, Gi-429, Gi-443, Gi-466, Gi-528, Gi-530, Gi-535, Gi-542, Gi-719), не проявили инсектицидную активность относительно тест-насекомых, представителей трех отрядов Hyponomeuta evonymellus (Lepidoptera), Aedes aegypti (Díptera), Leptinotarsa decemlineata (Colepotera), наиболее часто используемых для биотестирования штаммов Bt. В отличие от большинства типовых подвидов штаммы Bt Долины гейзеров формировали споры и включения, соединенные в пары после разрушения спорангия, имели капсулированные клетки (рис. 6), для многих были характерны ослизненные колонии.

Рис. 6. Споры и параспоральные кристаллы штаммов В1 язр.киШаИ Аг-100-04, (окраска 1% карболовым эозином), Л СЬе-!59 и атипичного штамма В1 С1-47 (фазовый контраст), капсулированные вегетативные клетки штамма В* Dg-992 (окраска по Гинсу, фазовый контраст); х2500.

Штаммы Bt Долины гейзеров систематизированы по форме и белковому составу пара-споральных включений. Изучено антагонистическое действие водорастворимых метаболитов культуральной жидкости (КЖ) и растворов белков параспоральных включений штаммов Bt Долины гейзеров относительно патогенных микроорганизмов Staphylococcus aureus, Salmonella thyphimurium, Shigella sonnei, Candida albicans и ряда других. Патогенные тест-культуры показали разную восприимчивость к действию метаболитов штаммов Bt.

При совместном культивировании на агаризованной среде наибольшую чувствительность к водорастворимым метаболитам всех штаммов Bt Долины гейзеров проявил возбудитель кандидозов С. albicans (табл. 3). Штамм S. aureus и бактерии кишечной группы были более устойчивы. Наиболее резистентным к метаболитам Bt Долины гейзеров оказался штамм S. sonnei. Тем не менее, два штамма Bt (Gi-528 и Gi-530) из 17 испытанных, эффективно подавляли рост этого микроорганизма. Штамм Bt Dg-1024 обладал высокой активностью против всех использованных патогенных тест-штаммов (табл. 3).

Таблица 3. Антимикробная активность водорастворимых метаболитов штаммов Bt

Долины гейзеров, определенная на агаризованной среде

Штамм Тест-штаммы / зоны лизиса или угнетения роста штаммов (мм)

С. albicans S. aureus S. thyphimurium S. sonnei Е. coli.

Dg-992 39 10 15 6 0

Dg-994 47 25 33 7 20

Dg-1011 30 И 0 0 31

Dg-1015 42 8 9 5 31

Dg-1018 50 6 10 10 17

Dg-1024 38 26 37 18 20

Gi-47 47 10 10 10 0

Gi-117 52 10 5 7 0

Gi-416 32 0 6 6 0

Gi-424 27 4 7 4 22

Gi-429 40 10 И 11 9

Gi-443 50 8 16 10 7

Gi-466 15 12 18 12 7

Gi-528 12 5 10 50 37

Gi-530 12 17 10 50 30

Gi-535 30 30 0 0 0

Gi-542 28 10 7 5 6

Инкубирование штамма С. albicans в среде LB с добавлением стерилизованных ультрафильтрацией образцов КЖ штаммов Bt, наработанных в течение суток в жидкой питательной среде, подтвердило полученные данные о его высокой чувствительности к антибиотическому действию метаболитов Bt : через 48 часов в большинстве вариантов опыта жизнеспособные клетки С. albicans отсутствовали (табл. 4).

Таблица 4. Антимикробная активность стерилизованной ультрафильтрацией ЮК штаммов Bt Долины гейзеров относительно патогенного тест-штамма С. albicans при

совместном инкубировании в жидкой среде LB

КЖ штаммов Bt Титр С. albicans (кл/мл) / время инкубирования (час)

0 24 48

Dg-994 5,6.0x10" 2.0x103 0

Dg-1015 6,0x10" З.ОхЮ3 0

Dg-1024 5,9x10" 3.9x10" 0

Gi-535 6.2x10" 6.0x10J 3.0*10J

Gi-542 5,8.0x10" 1.2x10s 0

Gi-719 6,0x10" 3.0xl0J 0

Контроль (б/д) 6,0x10" 3.9x10" 5.5x10s

Растворы 5-эндотоксинов штаммов Bt Долины проявили антагонистические свойства относительно грамположительных штаммов рода Micrococcus, грамотрицательных фито-патогенов Pseudomonas fluorescens, Enterobacter sp., Xanthomonas malvacearum и были нетоксичны для С. albicans и патогенных бактерий кишечной группы (данные не приведены).

При тестировании на противовирусную активность препаратов приготовленных на основе водорастворимых метаболитов культуральной жидкости и клеточных лизатов штаммов Bt Долины гейзеров показано, что препараты были нетоксичны для клеток MDCK и в разной степени подавляли вирус гриппа птиц A/H5N1. При высокой инфекционное™ вируса на клетках MDCK (титр в ^ТЦД50/мл составил 8,5) его нейтрализация под влиянием исследованных препаратов составляла от 2 lg до 7 lg, а в ряде вариантов - до 8 lg, что является показателем высокой противовирусной активности исследованных препаратов (табл. 5).

Таблица. 5. Противовирусная активность КЖ и лизатов клеток штаммов Bt Долины

гейзеров относительно вируса гриппа птиц A/H5N1

Штамм Режим УЗ (сек.) % разрушенных клеток в лизате Индекс нейтрализации (lg ТЦД50)

КЖ Лизат КЖ Лизат

Dg-1015 нет 10x30" 90 5 7

Gi-528 -«- 5x30" 90 7 7

Gi-530 -«- 15x30" 75 7 7

Gi-416 -«- 15x30" 100 7 7

Gi-47 -«- 10x30" 90 7 7

Gi-535 -«- 10x30" 90 7 7

Dg-1024 -«- 15x30" 80 8 7

Gi-443 -«- 15x30" 90 7 7

Dg-992 10x30" 50 8 7

При молекулярном типировании штаммов с использованием КАРО-диагностики показано, что на филогенетическом дереве штаммы В1 Долины гейзеров формируют отдель-

ную ветвь, далеко отстоящую от типовых штаммов. Полученные факты указывают на существование в экологических нишах Долины гейзеров подвидов Вг, ранее не охарактеризованных. В последние годы описан ряд неинсектицидных штаммов Вг, которые продуцируют параспорины, негемолитические белки параспоральных включений, избирательно убивающие раковые клетки (Копёо, е1 а1., 2004). Штаммы Вг Долины гейзеров также могут быть перспективны для исследований в этом направлении.

Следует отметить, что большая часть коллекции, созданной в процессе выполнения настоящей работы, представлена разнообразием микроорганизмов, выделенных из уникальных мест обитания и обладающих уникальными генетическими ресурсами. Полученная базовая коллекция природных микробных изолятов является ценным генофондом для выполнения фундаментальных и прикладных исследований, потенциальные возможности которой лишь в малой мере представлены в настоящей работе.

Выводы

1. При исследовании 744 образцов, собранных в различных экологических нишах, выделено 6938 термофильных, мезофильных и психрофильных микроорганизмов. Получены первичные данные по основным морфологическим и биохимическим признакам изолятов, имеющим значение для их идентификации и дифференцированного подхода к использованию.

2. Обнаружены и идентифицированы новые виды бактерий: ВгечхЪасШих Ьаг^ти ер. поу., РаетЪасШт таедиаЫШ ер. поу., РаетЪасШт/огтозыя ер. поу., Всиео/иоисм Ьт-каИса ер. поу. (номера доступа нуклеотидных последовательностей 168 рРНК в базе данных ОепВапк ЕР467658, Е114975637, ЕШ97638 и 00508813, соответственно).

3. Выявлены высокоактивные штаммы, обладающие жизнеспособностью и ферментативной активностью в широком диапазоне температурных условий и рН среды, перспективные для биотехнологического применения, в том числе:

• 36 термофильных штаммов спорообразующих бактерий Долины гейзеров родов АпохуЪасШш, АпеиптЬасШю, Са1огЬасШш, ОеоЬасШш и др., продуцирующих про-теазы, высоко активные при диапазоне рН среды от 5,0 до 9,0, включая галотоле-рантные бактерии, проявившие высокую активность протеаз при повышенной засоленности среды;

• 35 термофильных штаммов Долины гейзеров, продуцирующих липазы, отличающиеся специфичностью действия по отношению к используемым субстратам, высокоактивные при температуре 60°С, и более 20 психрофильных штаммов Антарктиды с высокой активностью липаз при 4-6°С;

• 47 термофильных и мезофильных бактерий Долины гейзеров, обладающих комплексом тестируемых ферментных активностей (амилазной, протеазной, липазной и ле-цитиназной);

• 280 термофильных и мезофильных штаммов, секретирующих полисахарид-деградирующие ферменты: бета-глюканазу, 1,4-бета-галактаназу, эндоцеллюлазу, пуллулаиазу и эндоксиланазу в разных сочетаниях, что может позволить использовать их избирательно по отношению к полисахаридсодержащим субстратам;

• 24 психрофильных штамма Антарктиды, отнесенные к родам Pseudomonas, Duganella, Flavobacterium, Janthinobacterium, показавшие высокий уровень продукции щелочной фосфатазы при температуре 4-6°С, а также - ряд термофильных бацилл Долины гейзеров, секретирующих щелочные фосфатазы, высокоактивные при 60°С;

• 36 новых продуцентов изошизомеров ЭР: Bell, Pstl, MSpR9I, SacII, Clal, SalGI, BspRI, Ball, BstEII, Bgll, BbvII, ScrFI, BsiYI, Hae III, в том числе штаммы-продуценты ЭР, имеющие ряд преимуществ, заключающихся в более высокой продуктивности, иных температурных условиях роста или, в отличие от прототипа, наличием в штамме одной ЭР;

4. Путем направленной селекции выявлены более активные и технологичные субкультуры, подобраны условия культивирования для штаммов-продуцентов ЭР: Rhizobium leguminozarum R-69, продуцента изошизомера ЭР Eco 311; iî. trifotíi R-63, продуцента изо-шизомера ЭР Sali, В. megaterium В-361, продуцента изошизомера ЭР НаеШ, К. pneumoniae В-378, продуцирующего изошизомер ЭР SacII.

5. Из аэрозолей воздуха и осадков Байкала выделены и охарактеризованы 15 штаммов Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki и 3 штамма В. thuringiensis ssp. galleriae, высокотоксичные к комарам Aedes aegypti и обладающие выраженной антибиотической активностью к ряду патогенных микроорганизмов кишечной группы и Candida albicans.

6. Обнаружены 18 атипичных штаммов Bt Долины гейзеров, не проявляющих инсектицидную активность по отношению к использованным в опытах представителям отрядов Lepidoptera, Coleóptera и Díptera, обладающих высокой антимикробной активностью против патогенных микроорганизмов S. thyphimurium, S. aureus, S. sonnei и С. albicans, эффективно подавляющих размножение вируса гриппа птиц A/(H5N1) на клетках MDCK, пригодных для разработки как антимикробных, так и противовирусных препаратов.

Основные работы, опубликованные по теме диссертации

Статьи:

1. Андреева И.С.. Лебедев JI.P., Афиногенова Г.Н., Пустошилова Н.М., Поздняков С.Г., Чижиков В.Е. Установление субстратной сайтспецифичности эндонуклеазы рестрикции Rtrl // Биоорган. химия.-1991.- Т. 17, № 2,- С. 277-279.

2. Repln V.E., Lebedev L.R., Puchkova L.I, Serov G.D., Tereschenko T.A, Chizikov V.E., Andreeva I.S. New restriction endonucleases from soil thermophilic bacteria // Gene.-1995.-Vol.157, No 1-2,-P.321-322.

3. Репин В.Е., Лебедев Л.Р., Андреева И.С.. Пучкова Л.И., Зернов Ю.П., Серов Г.Д., Терещенко Т.А., Афиногенова Г.Н., Пустошилова Н.М. Продуценты эндонуклеаз рестрикции среди природных микробных изолятов и разработка на их основе технологий получения ферментных препаратов // Биотехнология,- 1998.- N 2. - С.18-27.

4. Andreeva I.S.. Ankilov A.N., Baklanov A.M., et al. Seasonal variations in the microorganisms concentration in the biogenic component of atmospheric aerosol in the South of Western Siberia // J. Aerosol Sci.-2001.-Vol.33, Suppl. l.-P. S369-S370.

5. Андреева И.С.. Рябчикова Е.И., Печуркина Н.И., Зайцев Б.Н., Гелетий В.Ф., Коробушкина Е.Д., Виноградова Т.П., Торок Т., Хантер-Цевера Дж., Кузьмин М.И., Репин В.Е. Морфологический анализ аэробных микроорганизмов в керне глубокого бурения озера Байкала // Геология и геофизика.-2001 .-Т.42, № 1-2.-С.220-230.

6. Пучкова Л.И., Михайлова В.К., Ушакова Т.А., Андреева И.С.. Печуркина Н.И., Радионенко Ю.В., Репин В.Е. Продуценты эндонуклеаз рестрикции термальных источников п-ва Камчатки и озера Байкал // Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе.- Иркутск, 2002.-С.223-225.

7. Андреева И.С., Орешкова С.Ф., Рябчикова Е.И., Пучкова Л.И., Блинова H.H., Репина М.В., Печуркина Н.И., Торок Т., Репин В.Е. Геномный и фенотипический анализ микроорганизмов, выделенных из седиментов озера Байкал // Микробиология.- 2005.- Т. 74, № 5.- С. 816-822.

8. Safatov A.S., Andreeva I.S.. Buryak G.A. et al. The result of 7-year monitoring of the biogenic components of atmospheric aerosol in Southwestern Siberia // Chem. Engin. Transact. - 2006.- Vol.10.-P. 401-406.

9. Андреева И.С- Печуркина Н.И., Рябчикова Е.И., Беликов С.И., Деникина Н.И., Пучкова Л.И., Торок Т., Репин В.Е. Roseomonas baikalica sp. nov - новый вид микроорганизма, выделенного из проб керна глубокого бурения дна озера Байкала // Микробиология.-2007.-Т. 76, № 4. - С. 552-559.

10. Андреева И.С.. Печуркина Н.И., Бурцева Л.И., Калмыкова Г.В., Пучкова Л.И., Саранина И.В., Репин В.Е. Атипичные штаммы Bacillus thuringiensis, выделенные из почвы и воды горячих источников Долины гейзеров (Камчатка) // Биотехнология.-2008.- №6.- С. 41-50.

11. Андреева И. С.. Мазуркова Н. А., Печуркина Н. И, Булычев Л. Е., Шишкина Л. Н., Сергеев А. Н. Нейтрализация инфекционносги вируса ipmma A/chicken/Kurgan /05/2005 (H5N1) водорастворимыми метаболитами атипичных штаммов Bacillus thuringiensis И Достижения современной биотехнологии: Сб. науч. тр./ Под ред. проф. И. Г. Дроздова.- Новосибирск, 2008.- С. 119-126.

12. Печуркина Н.И., Андреева И.С.. Закабунин А.И., Маркович H.A., Емельянова Е.К., Репин В.Е. Бациллы горячих источников Камчатки - продуценты ферментов, гидролизующих полисахариды // Достижения современной биотехнологии: Сб. науч. тр. / Под ред. проф. И. Г. Дроздова,- Новосибирск, 2008.-С. 317-328.

13. Пучкова Л. П., Андреева И.С.. Печуркина Н. И., Пилипенко A.C., Репин В.Е., Молодин В.И. Штамм Acinetobacter sp. 103p - продуцент эндонуклеазы рестрикции Aspl03I, узнающей нук-леотидную последовательность 5'-GGATCC-3' // Достижения современной биотехнологии: Сб. науч. тр./ Под ред. проф. И. Г. Дроздова,- Новосибирск, 2008.-С. 300-306.

Патенты, авторские свидетельства:

14. Лебедев J1.P., Андреева И.С.. Серов Г.Д., Денисова Л.Я., Пустошилова Н.М. Штамм Bacillus megateríum 361 - продуцент рестриктазы Bme 361 I//A.c. №4672312.1990.

15. Андреева И.С.. Афиногенова Г.Н., Зернов Ю.П., Лебедев Л.Р., Пустошилова Н.М. Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae - продуцент рестриктазы Крп 378 I. //A.c. №1659480. 1991.

16. Андреева И.С.. Афиногенова Г. Н., Лебедев Л. Р., Пустошилова Н. М., Гордиенко Н.Я., Майст-ренко Г.Г. Способ получения рестриктазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GTCGAC //А. с. №1752769. 1992.

17. Лебедев Л.Р., Андреева И.С.. Гордиенко Н.Я., Майстренко Г.Г., Репин В.Е., Пустошилова Н.М. Штамм бактерии Rhizobium leguminosarum -продуцент рестриктазы Rle69I// Патент RU №2001952. 1993.

18. Андреева И.С.. Пучкова Л.И., Саранина И.В., Лохова И.А., Репин В.Е. Штамм бактерий Bacillus stearothermophilus -продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-GGTNACC-3'//Патент RU № 2115728. 1998.

19. Пучкова Л.И., Ушакова Т.А., Радионенко Ю.В., Андреева И.С.. Репин В.Е. Штамм бактерии -Bacillus stearothermophilus-22 продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'- CCNNNNNANNGG-3', и обладающий ростостимули-рующей активностью в отношении семян культурных растений // Патент RU № 2238972.2004.

20. Андреева И.С.. Емельянова Е. К., Олькин С. Е., Резникова И. К., Загребельный С. Н., Репин В. Е. Штаммы микроорганизмов-деструкторов Saccharomyces sp. и Pseudomonas sp., используемые для биоремедиации нефтезагрязненных объектов окружающей среды, ассоциация на их основе // Патент RU № 2272071.2006.

21. Андреева И.С.. Емельянова Е. К., Репин В. Е. Штамм Alcaligenes sp. El 135 для биоремедиации нефтезагрязненных объектов окружающей среды // Патент RU № 2271390. 2006.

22. Пучкова Л.И.. Андреева И.С.. Саранина И.В., Печуркина Н.И., Афонина B.C., Репин В.Е. Штамм бактерии Paenibacillus sp. Dgl009 - продуцент эндонуклеазы рестрикции Pspl0091, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'- GCCNNNNNGGC -3' // Патент RU № 2340663. 2008.

Материалы в сборниках конференций:

23. Repin V., Andreeva I.S.. Degtyarev S., Guskov A., Abdurashidov M., Puchkova L., Oreshkova S., Repina M., Blinova N., Torok Т., Hunter-Cevera J.C., Geletij V.F., Vinogradova T. Microbiological and biotechnological investigation of deep sub-bottom sediment, Lake Baikal water, and hot spring samples/ Fourth USA/CIS Joint Conference on Environmental Hydrology and Hydrogeology. San Francisco, California, 1999.-P.21 -22.

24. Adney W.S., Andreeva I.. Pechurkina N., Karpov G., Frangui-Espiet D., Himmel M.E., Repin V. Discovery of industrial enzymes from thermophilic bacteria of the Kamchatka peninsula // 23d Biotechnological Symposium for Fuels and Chemicals.-Breckenridge.-2001 .-P.62-67.

25. Андреева И.С.. Морозова O.B., Печуркина Н.И., Пучкова Л.И., Саранина И.В., Емельянова Е.К., Власов В.В., Репин В.Е. Ферменты и плазмиды психрофильных эубакгерий Антарктиды // Сб. мат. 3-й Межд. конф. «Наука и бизнес». Пущино, 19-21 июня 2006.- Пущино.- 2006.- С. 94-96.

26. Andreeva I.S.. Pechurkina N.I., Ryabchikova E.I., Belikov S.I., Denikina N.I., Puchkova L.I., Emely-anova E.K., Torok Т., Repin V.E. A new species of cultivable microorganism "Roseomonas baika-lica-vector sp. nov." found in ancient sedimentary rocks of lake Baikal // Abstracts International Conference «Microbial diversity: current situation, conservation strategy and biotechnological potentialities ICOMID 2005». 20-25 September 2005, - Perm-Kazan-Perm, - Russia.-2005.- P. 128-129.

27. Андреева И.С.. Морозова O.B., Емельянова E.K., Печуркина Н.И., Рябчикова Е.И., Пучкова Л.И., Репин В.Е. Грамотрицательная эубактерия Brevibacillus barguzinii sp. nov., образующая эндоспоры, выделенная из термального источника // Сб. мат. IV Международной научной конференции: «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» в 2-х томах. Минск, 2-6 июня 2008 г.- Минск.- 2008,- Т.1.- С. 116-118.

28. Андреева И.С.. Мокеева А.В., Орешкова С.Ф., Бурцева Л.И., Калмыкова Г.В., Пучкова Л.И., Ломзов А.А., Репин В.Е. RAPD-анализ атипичных штаммов Bacillus thuringiensis, выделенных из почвы и источников Долины гейзеров (Камчатка) // Сб. мат. IV Межд. науч. конф. «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» в 2-х томах, Минск, 2-6 июня 2008 г.- Минск.- 2008.-Т.1.- С. 124-126.

Благодарности

Автор выражает искреннюю признательность руководителю работы к.б.н. В.Е. Репину, всем коллегам, способствующим выполнению данной работы, соавторам, участвовавшим в проведении исследований. Особую благодарность автор приносит рецензентам д.б.н., Н.Н. Наплековой и д.б.н. Н.В. Тикуновой, а также - д.б.н., С.Н. Загребельному, д.б.н. Е.И. Рябчиковой и д.б.н. Т.В. Тепляковой - за внимательное прочтение и обсуждение материалов диссертации, ценные замечания и рекомендации.

Андреева Ирина Сергеевна

Выделение, ферментативные и антибиотические свойства природных микроорганизмов и оценка их биотехнологического

потенциала

Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук Подписано в печать 17.03.2009. Заказ № 18. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Андреева, Ирина Сергеевна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИИ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

БИОРАЗНООБРАЗИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ - ИСТОЧНИК ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ (БАВ)

1.1. Основные направления в использовании микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности в науке и народном хозяйстве

1.2. Особенности и преимущества микроорганизмов экстремальных условий обитания в качестве продуцентов биологически активных веществ

1.3. Сайт-специфические эпдонуклеазы рестрикции (ЭР) - этимологический инструментарий молекулярной биологии

1.4. Микроорганизмы в процессах деградации и трансформации веществ

1.5. Антагонистическая активность микроорганизмов

1.6. Инсектицидная активность микроорганизмов

1.7. Антимикробная активность штаммов Bacillus thuringiensis

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Источники отбора образцов для выделения микроорганизмов

2. Методы выделения и идентификации микроорганизмов

3. Условия культивирования штаммов-продуцентов БАВ

4. Определение наличия и специфичности ЭР в штаммах микроорганизмов

5. Скрининг микроорганизмов па продукцию полисахаридгидролаз

6. Геномный анализ штаммов микроорганизмов

7. Анализ профиля жирных кислот

8. Идентификация, определение инсектицидной и антимикробной активностей штаммов Bacillus thuringiensis (Bt)

2.8.1. Определение инсектицидной активности штаммов В

2.8.2. Определение антимикробных свойств водорастворимых метаболитов штаммов Bl

2.8.3. Определение антимикробной активности растворенных дельта-эпдотоксипов

2.8.4. Определение противовирусной активности штаммов Bt

2.8.5. Определение состава белков параспоральных включений штаммов Bt

2.9. Определение патогеппости штаммов микроорганизмов

2.10. Храпение и поддержание штаммов

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА. 3. РАЗНООБРАЗИЕ И ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПРИРОДНЫХ ИСТОЧНИКОВ

3.1. Разнообразие, ферментативная активность микроорганизмов, выделенных из образцов почвы, воды и осадков Долины гейзеров (Камчатка)

3.2. Разнообразие, ферментативная и антибиотичекая активность микроорганизмов аэрозолей воздуха

3.3. Психрофильные бактерии льда Антарктиды, выделение, идентификация, ферментативная активность

3.4. Разнообразие и ферментативная активность микроорганизмов, выделенных из образцов осадков глубокого бурения дна оз. Байкал

3.5. Новые виды микроорганизмов, выделенные из природных образцов

3.5.1. Грамотрицательные, образующие эндоспоры, бактерии рода Paenibacillus, выделенные из почвы и источников Долины гейзеров

3.5.2. Образующая эндоспоры грамотрицательная эубактерия Brevibacillus barguzinii sp. nov., выделенная из термального источника

3.5.3. Roseomonas baikalica sp. nov. - новый вид микроорганизма, выделенного из образца керпа глубокого бурения дна озера Байкал

ГЛАВА 4. ВЫДЕЛЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ЭН

ДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ (ЭР)

4.1. Штамм Paenibacillus sp. Dg-1009 - продуцент изошизомера ЭР Psp 10091, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-GCCNNNNNGGC -3'

4.2. Азотофиксирующие микроорганизмы рода Rhizobium, продуценты ЭР

4.2.1. Идентификация штаммов, скрининг на наличие ЭР

4.2.2. Штамм R.leguminozarum R-69, продуцент ЭР Rle

4.2.3. Штамм R. trifolii R-63, продуцент ЭР Rtrl

4.2.4. Штамм R. meliloti 21, продуцент ЭР Rme21I

4.2.5. Штамм R. trifolii 20, продуцент ЭР Rtr20I

4.3. ВтеЗбП — новая сайт-специфическая ЭР II типа из штамма Bacillus megaterium

4.4. Психрофильный штамм Acinetobacter sp. ОК-ЮЗр - продуцент ЭР

Asp 1031, узнающей нуклеотидную последовательность 5'- GGATCC-3'

4.5. Штамм Klebsiellae pneumoniae 378- продуцент ЭР Крп

4.5.1. Идентификация штамма К. pneumoniae 378, определение специфичности

4.5.2. Селекция штамма К. pneumoniae 378 по технологически важным признакам

4.6. Штаммы термофильных бактерий вида Bacillus stearothermophilus - продуценты изошизомеров ЭР BstEII и BsiYI

4.6.1. Штаммы В. stearothermophilus Т-10 и Т-9 - продуценты изошизомера ЭР BstEII

4.6.2. Штамм В. stearothermophilus Т-22 - продуцент изошизомера ЭР BsiYI.

ГЛАВА 5. АНТИМИКРОБНАЯ И ИНСЕКТИЦИДНАЯ АКТИВНОСТИ СПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ ВИДА BACILLUS THURINGIENSIS

5.1. Идентификация и биотестирование штаммов В(, выделенных из аэрозолей воздуха и осадков Байкала

5.2. Атипичные штаммы Bt, выделенные из почвы, воды и осадков горячих источников Долины Гейзеров

5.2.1. Идентификация штаммов

5.2.2. Антимикробная активность штаммов

5.2.3. Противовирусная активность штаммов.

5.2.4. Гспотипирование штаммов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение, ферментативные и антибиотические свойства природных микроорганизмов и оценка их биотехнологического потенциала"

Актуальность исследования. Микроорганизмы и продуты их жизнедеятельности являю 1ся наиболее доступными и рентабельными источниками ферментов и многих других биологически активных веществ (БАВ), необходимых для промышленности и научных исследований. Продуцируемые микробными клетками ферменты, такие как липазы, протеазы, амилазы, эидопуклеазы рестрикции, экзонуклеазы, фосфатазы и др., находят широкое применение в биотехнологии. Экстремофильпые микроорганизмы обладают ферментными системами, продуцирующими биологически активные вещества, проявляющие активность в более широком диапазоне температур 11 рП среды по сравнению с мезофильными прототипами, благодаря чему имеют особое значение для биотехнологии (Бонч-Осмоловская, 2004; Бопч-Осмоловская, Мирошниченко и др., 2004; Гальченко, 2005). Экетремофилы являются также цепным источником генов, обеспечивающих возможность создания рекомбинантных супсрпродуцентов с расширенными возможностями (Pecigou et al., 2001: Bell et al., 2002; Robertson, Steer, 2004).

Успешное развитие молекулярной биологии, генной инженерии и их прикладных направлений невозможно без наличия ондопуклеаз рестрикции (ЭР) - энзимологического инструментария, способного специфически фрагментировать и модифицировать нуклеиновые кислоты (Roberts et al., 2002). Большое внимание уделяется поиску новых продуцентов сайт-специфических ЭР, легко культивируемых, высокопродуктивных штаммов, продуцирующих ферменты с новой специфичностью, или же более технологичных продуцентов ЭР известной специфичности.

Микроорганизмы применяются для защиты и очистки окружающей среды от нефтяных и других загрязнителей с использованием аборигенных или привнесенных микроорганизмов-деструкторов (Стабпикова и др., 1995; Коропелли, 1996; Барышникова и др., 2001; Киреева н др., 2004), а также для борьбы с насекомыми-вредителями сельского и лесного хозяйства. Более всего, как основа биопрепаратов инсектицидного назначения, используются штаммы Bacillus thuringiensis (Bt) (Шехурина, 1963; Grimont et al., 1998; Глупов, 2001; Rampersad, Amnions, 2005). Энтомопатогепная активность, а также действующее начало биоипсектицидов на основе Bt обусловлены, преимущественно, присутствием параспоральных включений, состоящих из белков, известных как инсектицидные Cry-белки или дельта-опдотоксины. Эндотоксины отличаются между собой по спектру инсектицидной активности. Различные подвиды Bt обладают избирательным действием не чолько в отношении насекомых, по и микроорганизмов.

Несмотря на известное разнообразие Cry-белков обнаружение новых продуцентов эптомопатогенных токсинов актуально, так как значительное число вредителей не контролируются доступными Cry-белками (Глупов, 2001; Rampersad, Amnions , 2005).

Для обеспечения прикладных и фундаментальных исследований чрезвычайно важным является своевременное сохранение полученных продуцентов и пополнение генофонда коллекций культур новыми охарактеризованными штаммами микроорганизмов, депонирование и гарантированное хранение производственно важных штаммов. По данным 5-го издания Всемирного справочника коллекций культур микроорганизмов (Sugawara et al., 1999) в мире уже насчитывалось около 500 зарегистрированных коллекций различного профиля и содержания. Коллекции являются центрами сохранения и изучения микробного разнообразия, депонирования штаммов, имеющих значение для производства медицинских и ветеринарных препаратов, разработки штаммов, перспективных для биотехнологического применения (Ившнпа, 1994; Родичева и др., 1998; Синеокий, Агранович, 2001).

Из выше сказанного следует, что создание базовой коллекции природных микроорганизмов в качестве основы для разработки новых препаратов БАВ является своевременной и актуальной задачей.

Цель и задачи исслсдопании. Цель настоящей работы состояла в выделении и изучении микроорганизмов из различных природных источников, создании базовой коллекции микробных изолятов для выявления новых продуцентов БАВ, перспективных для разработок биотехнологических препаратов. Задачи исследования:

1. Выделить микробное разнообразие образцов почвы, воды и донных осадков водоемов различных природных территорий, включая экстремальные, создать коллекцию термофильных, мезофильных и психрофильных природных микробных изолятов.

2. Провести скрининг выделенных микроорганизмов на наличие ферментативной и антибиотической активностей.

3. Выявить активные продуценты БАВ, перспективные для биотехнологии, определить их таксономическую принадлежность.

4. Провести селекцию по выделению наиболее активных субкультур продуцентов, оптимизировать условия культивирования.

5. Составить коллекцию штаммов Bacillus thuringiensis, провести оценку их инсектицидной и антибиотической активностей.

Научная новизна работы. Из природных образцов, отобранных из различных экологических ниш, выделено 6938 новых микробных изолятов, представленных мезофильпыми, термофильными и психрофильными бактериями. Обнаружены и идентифицированы новые виды микроорганизмов родов Paenibacillus, Brevibacillus, Roseomonas, не имеющие аналогов в доступных базах данных. В результате скрининга выделенных изолятов на наличие амилолитической, фосфатазпой, эндопуклеазпой и другой ферментативной активности, выявлены высоко продуктивные штаммы, сохраняющих способность к росту и продукции БАВ в широком диапазоне температур и рН среды. Среди бактерий родов Rhizobium, Bacillus, Klebsiella, Paenibacillus, Micrococcus и др. обнаружены новые продуценты эндонуклеаз рестрикции (ЭР), имеющие преимущества относительно ранее известных прототипов и их изошизомеров. Выделены новые штаммы, относящиеся к Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki, В. thwingiensis ssp. galleria, обладающие высокой активностью относительно ряда патогенных микроорганизмов и комаров Aedes aegypti. Обнаружены атипичные, пеипсектицидные штаммы В. thuringiensis, проявляющие выраженный антагонизм по отношению к патогенным бактериям кишечной группы и Candida albicans, эффективно подавляющие размножение вируса A/(H5N1) на клетках MDCK. Выявленные признаки позволяют считать их подвидами Bl, ранее не представленными в базах данных.

Практическая значимость. Основная часть полученной коллекции представлена микроорганизмами экстремальных условий обитания, что позволяет прогнозировать выделение новых продуцентов БАВ, активных в широком диапазоне рН и температуры культивирования. Исследование и использование генов выделенных микрооргапнзмов-экстремофилов имеет значение для конструирования штаммов с более широкими возможностями применения в биотехнологии. Вновь выделенные изошизомеры ЭР, обладающие рядом преимуществ, в сравнении с ранее известными ферментами-прототипами и их изошизомерами, могут заменить эти ЭР в проводимых генно-инженерных работах. Выделенные из аэрозолей воздуха и осадков Байкала высоко инсектицидные штаммы В. thuringiensis ssp. kurstaki и В. thuringiensis ssp. galleria пригодны в качестве основы энтомопатогенных препаратов токсичных для комаров Aedes aegypti и для разработки антимикробных средств, направленных против ряда патогенных микроорганизмов. Атипичные штаммы В. thuringiensis Долины гейзеров интересны как для фундаментальных исследований в области систематики бацилл, так и для разработки эффективных антимикробных и противовирусных препаратов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены па 28 Всероссийских и Международных конференциях, в том числе: Fourth USA/CIS Joint

Confcrcnce on Environmental Hydrology and Hydrogeology (San Francisco, California, 1999), 23d Biotechnological Symposium for Fuels and Chemicals (Breckenridge, 2001), 1-ом Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), International Conference «Microbial diversity: current situation, conservation strategy and biotechnological potentialities ICOMID-2005» (Perm-Kazan-Perm, 2005), 9lh International Colloquium in Invertebrate Pathology and Microbial Control, 391'1 Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology and 811' International Conference on Bacillus thuringiensis (China, 2006), II International conference «Biospheere Origin and Evolution» (Loutraki, 2007), Международной научпо-практичсской конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирск, 2008), IV Международной научной конференции: «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008) и др.

Публикации- По материалам диссертации опубликованы 26 статей, получено 9 патентов РФ.

Вклад автора. Автору принадлежат постановка задач, выполнение работ по выделению и идентификации природных микроорганизмов, культивированию и селекции продуцентов, определению факторов пагогсппости штаммов, чувствительности к антибиотикам, антагонистической активности. Коллекция штаммов В. thuringiensis (Bt), продуцентов БАВ, штаммов, исследуемых в качестве новых видов, создана, охарактеризована и поддерживается автором лично. Инсектицидная активность штаммов Bt исследована на базе ИСиЭЖ СО РАН совместно с к.б.и. Бурцевой Л.И. и к.б.п. Калмыковой Г.В. Молекулярное типирование (RABD-апализ) штаммов Bt Долины гейзеров выполнен совместно с сотрудниками ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребпадзора Мокеевой А.В. и к.б.н. Орешковой С.Ф. Анализ биохимической активности штаммов проведен автором совместно с научным сотрудником «Вектора» Печуркиной II.И., скрининг штаммов на продукцию ферментов - совместно с к.б.н. Пучковой Л.И., к.б.п. Лебедевым Л.Р., Афиногеновой Г.Н. Электронная микроскопия ультратопкнх срезов клеток выполнена сотрудником «Вектора» д.б.н. Рябчиковой Е.И. Анализ пуклеотидных последовательностей 16S рРНК штаммов выполнен д.б.н. Морозовой О.В. и Пилипепко А.С. в Межинститутском Центре секвенировапия ДНК СО РАН (г. Новосибирск). Исследование противовирусной активности препаратов проведены совместно с к.б.н. Мазурковой И.А. на базе отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребпадзора.

Структура н объем диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах, содержит 38 таблиц и 44 рисунка, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», трех глав собственных исследований, заключения, выводов, двух приложений и списка использованной литературы, включающего 115 отечественных и 171 зарубежный источник.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Андреева, Ирина Сергеевна

Выводы

1. При исследовании 744 образцов, собранных в различных экологических нишах, выделено 6938 термофильных, мезофильпых и психрофильных микроорганизмов. Получены первичные данные по основным морфологическим и биохимическим признакам изолятов, имеющим значение для их идентификации и дифференцированного подхода к использованию.

2. Обнаружены и идентифицированы новые виды уникальных бактерий: Brevibacillus barguzinii sp. nov., Paenibacillus inaequabilis sp. nov., Paenibacillus formosus sp. nov., Roseomonas baikalica sp. nov. (номера доступа пуклеотидпых последовательностей 16S рРНК в базе данных GenBank EF467658, EU4975637, EU497638 и DQ508813, соответственно).

3. Выявлены высокоактивные штаммы, обладающие жизнеспособностью и ферментативной активностью в широком диапазоне температурных условий и рП среды, перспективные для биотехнологического применения, в том числе:

• 36 термофильных штаммов спорообразующих бактерий Долины гейзеров родов Anoxybacillus, Aneurinibacillus, Calorbacillus, Geobacillus и др., продуцирующих протеазы, высоко активные при диапазоне рН среды от 5,0 до 9,0, включая галотолераптпые бактерии, проявившие высокую активность протеаз при повышенной засоленности срсды;

• 35 термофильных штаммов Долины гейзеров, продуцирующих липазы, отличающихся специфичностью действия по отношению к используемым субстратам, высокоактивные при температуре 60°С, и более 20 психрофильных штаммов Антарктиды с высокой активностью липаз при 4-6°С;

• 47 термофильных и мезофильных бактерий Долины гейзеров, обладающих комплексом тестируемых ферментных активностей (амилазиой, протеазной, липазпой и лецитиназной);

• 280 термофильных и мезофильных штаммов, секрегирующих полисахарид-деградирующие ферменты: бета-глюканазу, 1,4-бета-галактапазу, эпдоцеллюлазу, пуллулапазу и эндоксиланазу в разных сочетаниях, что может позволить использовать их избирательно по отношению к полисахаридсодержащим субстратам;

• 24 психрофильных штамма Антарктиды, отнесенные к родам Pseudomonas, Duganella, Flavobacterium, Janthinobacteriwn, показавшие высокий уровень продукции щелочной фосфатазы при температуре 4-6°С, а также - ряд термофильных бацилл Долины гейзеров, секретирующих щелочные фосфатазы, высокоактивные при 60°С;

• 36 новых продуцентов изошизомеров ЭР: Bell, PstI, MSpR9I, SacII, Clal, SalGI, BspRI, Ball, BstEII, Bgll, BbvII, ScrFI, BsiYI, Hae III, в том числе штаммы-продуценты ЭР, имеющие ряд преимуществ, заключающихся в основном в более высокой продуктивности, иных температурных условиях роста или, в отличие от прототипа, наличием в штамме одной ЭР;

4. Путем направленной селекции выявлены более активные и технологичные субкультуры, подобраны условия культивирования для штаммов-продуцентов ЭР: Rhizobium leguminozarum R-69, продуцента изошизомера ЭР Есо 311; R. trifolii R-63, продуцента изошизомера ЭР SalGI, В. megaterium В-361, продуцента изошизомера ЭР НасШ, К. pneumoniae В-378, продуцирующего изошизомер ЭР SacII и ряда других.

5. Из аэрозолей воздуха и осадков Байкала выделены и охарактеризованы 15 штаммов Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki и 3 штамма В. thuringiensis ssp. galleriae, высокотоксичныс к комарам Aedes aegypti и обладающие выраженной антибиотической активностью к ряду патогенных микроорганизмов кишечной группы и Candida albicans, перспективные для использования в качестве основы инсектицидных и противомикробных препаратов.

6. Обнаружены 18 атипичных штаммов Bt Долины гейзеров, не проявляющих энтомопаго генную активность по отношению к представителям отрядов Lepidoptera, Coleoptera и Diptera, обладающих высокой антимикробной активностью против патогенных микроорганизмов S. thyphimurium, S. aureus, S. sonnei и С. albicans, эффективно подавляющих размножение вируса гриппа птиц A/(H5N1) на клетках MDCK, пригодных для разработки как антимикробных, так и противовирусных препаратов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При микробиологическом исследовании 744-х образцов, отобранных из различных природных источников, создана базовая коллекция микроорганизмов, насчитывающая около 7000 мезофильпых, термофильных и пепхрофильных микробных изолятов: 2200 изолятов выделены из образцов воды и осадков Байкала; 1480 - из почвы, воды и осадков источников Долины Гейзеров; 2360 изолятов - из аэрозолей воздуха, 83 - изо льда Антарктиды, 815 изолятов - из проб почвы и образцов воды, взятых на различных территориях Сибири и Алтая, включая нефтезагрязненные. В настоящей работе изложены результаты трех основных направлений исследования: первое - выделение, первичная идентификация и скрининг микроорганизмов на наличие продукции биологически активных веществ (глава 3); второе - идентификация перспективных продуцентов эндонуклеаз рестрикции, определение специфичности ферментов (глава 4); третье -выделение, идентификация, тестирование на антибиотическую и инсектицидную активность штаммов Bacillus thuringiensis (глава 5).

При исследовании свойств изолятов, выделенных из образцов Долины гейзеров, обнаружены микроорганизмы, принадлежащих к родам Streptomyces, Calorbacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Wantersia, Paenibacillus, Thermits, Geobacillus, Bacillus, Pseuclomonas, Micrococcus. В числе спорообразующих бактерий рода Bacillus выявлены относящиеся к видам В. stearothermophilus, В. cereus, В. coagulans, В. circulans, В. thuringiensis. При тестировании микробных изолятов на наличие ферментативной активности у 149 изолятов из 450 исследованных обнаружена протеолитическая активность. Высоко активные протеазы продуцировали в основном бактерии рода Bacillus, около сорока из которых проявили активность протеаз при всех трех использованных значениях рН среды (5,0, 7,0, 9,0). К этой же группе относятся термофильные бактерии родов Anoxybacillus sp. Dg-326 и Gi-621, Aneurinibacillus sp. Dg-4801, Calorbacillus sp. Dg-382t и Dg-383t, Geobacillus sp. Dg-321l и Dg-491 и др. Обнаружены также галотолсрантные штаммы Dg-397, Dg-784, Dg- 637, Dg-324, Dg-542 и ряд др., секретирующне высокоактивные протеазы при повышенной засоленности среды.

Выяснено, что 114 изолятов (Dg-365, Dg-653, Dg-574 и др.) содержали липазы, 35 из них были перспективны в качестве продуцентов, в том числе — термофильный штамм Geobacillus sp. Gi-385t и штамм Anoxybacillus sp. Кш-999. Выявлено 72 бактерии обладающих лецитиназной активностью (Dg-700, Dg-367, Dg-404, Dg-630 и др.). Амилолитические ферменты обнаружены у 151 изолята, наиболее активными были -актииомицеты и бациллы, как термофильные (Dg-6111, Dg-324t и др), так и мезофильиые штаммы (Dg-719, Dg-869, Dg-718 и др). При этом 47 микроорганизмов содержали 4 из тестируемых ферментных активностей (амилазную, протеазную, липазную и лецитиназную). Среди них: изоляты Dg-815 и Dg-404, характеризующиеся обильным ростом и ферментативной активностью при рН среды 5,0, изоляты Dg-630 и Dg-367 - при рП 9,0, изоляты Dg-878, Dg-843, Dg-784 — при повышенной засоленности среды и рН среды от 5,0 до 9,0.

С применением селективной среды, содержащей AZCL-полисахариды, у 280 из 450 исследованных изолятов Долины гейзеров обнаружена способность к секреции полисахарид-деградирующих ферментов. Из них 50 микроорганизмов были активны при рН среды 5,0; 136 - при рН 7,0 и 94 изолята - при рП 9,0. Микроорганизмы отличались по составу и числу выявляемых ферментов. Максимальное количество гидролитических ферментов, выявленное на средах с хромогенпыми полисахаридами — до пяти, обнаружено у 2,5% изолятов от числа исследованных. Наиболее представительной оказалась группа бактерий, продуцирующих три фермента в разных сочетаниях (40,3%). Изоляты, продуцирующие два фермента из тестируемых, составили 17,1%, один фермент - 29,6%, четыре фермента - 10,3%. Показано, что наиболее распространенными ферментами полисахарид-деградирующих микроорганизмов оказались: бета-глюканаза (190 изолятов). 1,4-бета-галактапаза (163 изолята), эндоцеллюлаза (145 изолятов), в меньшем количестве обнаружены штаммы, содержащие нуллуланазу (96 изолятов) и эпдоксилапазу (63 изолята).

Проведен скрининг микроорганизмов коллекции на содержание ферментов обмена нуклеиновых кислот. На наличие ЭР изучено 844 изолята, на экзопуклеазпую активность — 526, на продукцию щелочной фосфатазы — 429. 720 изолятов анализированы па наличие плазмидпых ДНК. Число микроорганизмов, содержащих ЭР П типа составил 4,5 % от числа исследованных. Обнаруженные ЭР являлись изошизомерами SalGI (изоляты Dg-757, Dg-724, Dg-757 и др.), PspEI (изолят Gi-402), PstI (изоляты Gi-988t, К-4371 и др.), MspR9I (изоляты Gi-344, Gi-1080 и др.), Bgll (штамм Paenibacillus sp. Dg-1009), Bsa29I (изоляты Dg-607l и Dg-608t), Ilpall (изоляты Gi-320t, Gi-321t и др.), НаеШ (изоляты К-43It, K-437t и др.). Последние два фермента (Ilpall и НаеШ) широко распространены в микроорганизмах Камчатки.

Выяснено, что около 48,0% от исследованных изолятов Долины гейзеров являются продуцентами щелочной фосфатазы, из которых 2,4 % - высокоактивны, перспективны для биотехнологичсских разработок.

Выделены и идентифицированы 83 микробных психрофильпых и мезофильпых изолята из снега и льда Антарктиды. Доминирующими видами среди культивируемых штаммов оказались грамотрицательные Pseudomonas spp. (35 штаммов) и грамположительные Arthrobacter spp. (14 штаммов). Кроме того, обнаружены эубактерии родов Flavobacterium, Psychrobacter, Aquaspirillum, Polaromonas, семейства Comamonadcicea, Actinobacteridae и др. Проведен скрининг штаммов на ферментативную активность при температуре 4-б°С и наличие плазмидных ДНК. Показано, что все штаммы не имели амилазы, небольшой процент из них обладал протеолитической активностью, у большинства из них обнаружена оксидазная, пероксидазная и каталазиая активности. 8,2% от общего количества штаммов содержали эндонуклеазы рестрикции II-типа. Неспецифичсские экзонуклеазы обнаружены у 16,4% штаммов.

Липазиая активность, детектируемая с применением эфиров жирных кислот при температуре 4-6°С, обнаружена у 31,6 % штаммов, выделенных из образцов льда Антарктиды. Липолитические ферменты штаммов А-45р, А-50р А-52р, А-53р, A-55p, Lv-6, Lv-14, гидролизовали эфиры всех трех жирных кислот (лауриповой, пальмитиновой и олеиновой, соответственно - твип-20, твин-40 или твин-80). По два субстрата утилизировали штаммы А-7р, А-23р, А-32р, А-ЗЗр, А-41 Lv-17 (твин-20 и твип-40); штаммы Lv-9 и Lv-13 (твин-20 и твин-80) и штамм А-5р (твин-40 и твии-80). Только один субстрат гидролизовали липазы штаммов А-1р, А-4р, А-46р, А-56р, А-57р и Lv-5p (твин-80), а также А-12р и А-34р (твин-20). Наиболее выраженной липазной активностью при температуре 4-6°С обладали штаммы Aqiiaspirillum arcticum А-12р, Pseudomonas aurantiaca А-23р, Arthrobacter sp. Lv-21, Flavobacterium frigidarium A-32p, Janthinobacteriwn lividum Lv-6 и Polaromonas vacuolatci Lv-9.

Высокий уровень продукции щелочной фосфатазы при температуре 4-6°С отмечен более, чем для 40% изолятов из Антарктиды. Наибольшую активность фермента проявили мезофнльпые штаммы А-1, А-2 и А-3, отнесенные к Pseudomonas sp., пенхрофпльиые штаммы А-14р и А-26р, определенные как Duganella sp., штамм А-32р (.Flavobacterium frigidarium), штамм А-41р (Janthinobacteriwn sp.), психрофильные псевдомонады А-55р, А-56р, А-57р и ряд других.

Полученные психрофильные штаммы, продуцирующие ЭР, фосфатазы и липолитические ферменты при 4-6°С, а также имеющие плазмидиые ДНК, обеспечивающие устойчивость штаммов к пониженным температурам, могут представлять интерес для биотехнологичеекого применения.

В исследованных образцах аэрозолей воздуха, взятых на разных высотах (от 500 до 7000 м) обнаружены микроорганизмы, относящиеся к широкому спектру родов и видов, таких как Brevibacillus, Kocuria, Brevimdimonas, Deinococcus, Micrococcus, Arthrobacter, Flavobacterium, Acetobacter, Bacillus, Paenibacillus, Acinetobacter, Staphylococcus,

Streptococcus, Saccharomyces, Candida, Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Alternaria, Fusarhun, Cryptococcus, Rhodotorulla и др.

Показано, что в разных пробах от б до 10% бактериальных изолятов, из числа выделенных из аэрозолей, обладают ферментами рестрикции. Среди идентифицированных ЭР в наибольшем количестве выделены продуценты изошизомеров Clal (изоляты Ах-78, Az-252, Az-592, Az-806, Az-956 и др) и Ilaelll (изоляты Ах-158, Ах-161, Az-582 и др.). Выделены также продуценты изошизомеров ЭР PstI (изолят Az-20), Asull (изолят Az-504), Bgll (изолят Az-575), Bst2UI (изолят Ax-252), Kzo91 (изолят Ax-279) и ряд других. Около 50% изолятов от исследованных продуцировали щелочную фосфатазу, 38% из них были высокоактивны. Из числа микробных аэроизолягов, образующих эндоспоры, выявлены спорообразующие бактерии Bacillus thuringiensis, формирующих при споруляции параспоральпые включения.

Микроорганизмы, выделяющиеся из аэрозолей воздуха, заслуживают самого пристального внимания не только для бнотехнологических разработок, но и в плане изучения влияния биогенной компоненты аэрозолей атмосферы на здоровье людей изучаемого региона, гак как от 8 и до 40% микроорганизмов, выделенных из разных проб аэрозолей, обладали признаками патогениостн.

В составе полученной коллекции микробных изолятов обнаружен ряд уникальных микроорганизмов, для которых не найдены аналоги в доступных базах данных. Полученные фепотипические и геномные характеристики ряда ппаммов позволили идентифицировать их как новые виды, ранее пе известные: Paenibacillus inaequabilis sp. nov. (штамм Dg-1009, номер доступа нуклеотидной последовательности 16S рРНК в базе данных GenBank EU497637), Paenibacillus formosus sp. nov. (штаммы К-58 и К-59, помер доступа EU497638), Roseomonas baikalica sp. now. (штамм Che-82, номер доступа DQ508813), Brevibacillus barguzinii sp. now. (штамм LB-56, номер доступа EF467658).

Из числа микроорганизмов созданной коллекции выделены новые штаммы-продуценты ЭР, в том числе, имеющие ряд преимуществ, в сравнении с ранее известными штаммами-прототипами, мезофильные и термофильные продуценты изошизомеров таких ЭР как Bell, SacII, Clal, SalGl, BspRI, Ball, BstEII, Bgll, Bbvll, ScrFI, BsiYI, Пае III. Так, штамм R. leguminozarum 69 продуцирует ЭР, имеющую сайт узнавания идентичный сайту узнавания ЭР ЕсоЗП (Bso31I, Ppal). Для ЭР Ppal и Bso311 данные по продуктивности пе указаны. Согласно полученным результатам штамм R. leguminozarum 69 имеет выход фермента в 3,3 раза больше, чем прототип, штамм Escherichia coli RFL31- продуцент изошизомера ЕсоЗП, что является его преимуществом перед ранее известными продуцентами ЭР данной специфичности.

Штамм R. trifolii R-63 (прототип SalGI) продуцировал ЭР Rtrl, узнающую иуклсотидную последовательность 5Л-СТССАС-3\ Высокая продуктивность нового штамма-продуцента и наличие в нем единственной сайт-специфической эпдонуклеазы обеспечивают преимущества последнего по сравнению с рапсе известными штаммом-прототипом и другими штаммами, продуцирующими изошизомеры ЭР SalGI.

Штамм В. megaterium В-361, продуцирующий ЭР Вте 3611, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5Л-СССС-3\ имеет продуктивность в 510 раз более высокую по сравнению с продуцентами, описанными в литературе. Штамм не патогенен, не требователен к условиям роста.

В результате селекционной работы выделена не вирулентная, не токсичная высокопродуктивная субкультура штамма Klebsiella pneumoniae В-378,, содержащая ЭР Крп 378 I, узнающую и гидролизующую последовательность нуклеотидов S'-CCGCGG^', являющуюся изошизомером ЭР SacII. Технологически важным является то, что в отличие от известных продуцентов SacII, штамм К. pneumoniae 378 содержит только одну ЭР.

Штаммы В. stearothermophilus Т-10, В. stearothermophilus Т-9, выделенные из горячих источников Камчатки, продуцируют ЭР BslTlOl и BstT91, узнающие и расщепляющие нуклеотидную последовательность 5'-GGTNACC-3\ В отличие от известных прототипов штаммы В. stearothermophilus Т-10, В. stearothermophilus Т-9 растут на простых средах, имеют по одной ЭР и в 3-4 раза выше показатели по выходу фермента.

Выделен штамм-продуцеит В. stearothermophilus 22, обладающий термостабильпой ЭР Bst22I, сохраняющей активность при температуре среды до 80°С, с редко встречающейся специфичностью (сайт узнавания 5'-CCNNNNNANNGG-3\ идентичный сайту узнавания ЭР Bsc41, являющейся изошизомером ЭР BsiYI), значительно превышающей продуктивность прототипа.

Из грамотрицательиого, спорообразующего штамма Dg-1009 рода Paenibacillus (в последующих исследованиях определен как новый вид P. inaequabilis sp. nov.) впервые выделена высокоактивная ЭР, узнающая и расщепляющая последовательность нуклеотидов 5'-GCCNNNNNGGC-3\ являющаяся изошизомером фермента Bgll, выделеного из штамма Bacillus globigii. В отличие от ранее известных продуцентов изошизомсров ЭР Bgll {Bacillus species 6-3-1 и Thermus species 8E), содержащих по две эпдонуклеазы разной специфичности, штамм Paenibacillus sp. Dg-1009 содержит только один фермент, хорошо растет на простых питательных средах и не относится к патогенам, является технологически более удобным.

Из образца льда, взятого из зоны мерзлоты выделен психрофильпый штамм Acinetobacter ОК-ЮЗр, продуцент изошизомера ЭР ВашШ, с максимум активности при температуре 6-10°С. В литературных источниках не приводятся данные по продукции ЭР Baml-II при температуре ниже 20°С.

Составлена коллекция из 36 вновь выделенных кристаллосодержащих, спорообразующих штаммов вида Bacillus thuringiensis, обнаруженных в нескольких природных источниках: в аэрозолях воздуха, осадках Байкала, почве и источниках Долины гейзеров (Камчатка). Штаммы отличаются друг от друга по антимикробной и энтомопатогеииой активностям. Инсектицидными подвидами представлены 15 штаммов В. thuringiensis ssp. kurstaki, выделенные из аэрозолей воздуха, и 3 штамма В. thuringiensis ssp. galleria, выдслсные из осадков Байкала. Показано, что штаммы Аг 100-04, Аг 78-04, Аг 78-04, Аг 63-04, Che-159 и ряд других обладают высокой инсектицидной активностью против комаров Aedes aegypti и могут быть рекомендованы для разработки соответствующих эптомопатогепных биопрепаратов. Выраженная антимикробная активность штаммов проявляется, прежде всего, относительно против S. thyphimurium (Аг 2-18, Аг 63-04, Аг 118-17, Аг 5-18) и С. albicans (Аг 63-04, Аг 63-04, Аг 18-15, Аг 0901-40, Ar 100-04 и ряд др.).

Из образцов Долины гейзеров также выделена группа штаммов В. thuringiensis (Dg-1011, Dg-1015, Dg-1018, Dg-1024, Dg-992, Dg-994, Gi-47, Gi-117, Gi-416, Gi-424, Gi-429, Gi-443, Gi-466, Gi-528, Gi-530, Gi-535, Gi-542, Gi-719), образующих крупные параспоральные включения. Штаммы Долины гейзеров систематизировны по белковому составу включений, изучены морфо-физиологические и биохимические свойства штаммов, проведена оценка инсектицидной и антибактериальной активностей.

Выяснено, что штаммы Bt Долины гейзеров, имеют существенные отлнчпя по ряду признаков от ранее известных типовых подвидов Bt. Для штаммов Bt Долины гейзеров характерна низкая или отсутствующая инсектицидная активность относительно тест-насекомых Hyponomeuta evonymellus (Lepidoptera), Aedes aegypti (Diptera), Leptinotarsa decemlineata (Colepotera), капсулироваппые клетки, ослизненные колонии, споры и кристаллы, соединенные в пары после разрушения спорангия. Шесть штаммов, из 18 исследованных, показали отрицательный результат элекгрофоретического анализа па наличие белков в имеющихся крупных параспоральиых включениях. Все это признаки, не свойственные подавляющему большинству ранее известных типичных штаммов Bt.

Водорастворимые метаболиты культуральиой жидкости и растворы белков параспоральиых включений штаммов Bt Долины гейзеров обладали антибиотическим действием относительно патогенных микроорганизмов S. aureus, S. thyphimurium, S. sonnei, С. albicans и ряда других. Тест-штаммы проявили разную восприимчивость к действию метаболитов штаммов Bt. Наибольшую чувствительность к действию водорастворимых метаболитов КЖ штаммов Bt проявил тест-штамм С. albicans. Полученные растворы 5-эндотоксинов штаммов Bt Долины гейзеров не угнетали рост Е. coli, S. aureus, S. thyphimurium, S. sonnei и С. albicans, в то же время в разной степени и в разных сочетаниях проявили антагонистические свойства относительно грамположительных штаммов рода Micrococcus и грамотрицательных фитопатогепов Р. jluorescens, Entcrobacter sp. и X. malvacearum. Штаммы Bt Долины гейзеров перспективны для исследования и применения в качестве антимикробных агентов разной направленности, прежде всего - с целыо подавления возбудителей капдидозов и сальмонеллезов. Два штамма Bt Gi-528 и Gi-530 эффективно подавляли патогенную тест-культуру S. sonnei.

При тестировании на противовирусную активность препаратов на основе водорастворимых метаболитов культуралыюй жидкости и клеточных лизатов штаммов Bt Долины гейзеров выяснено, что все исследуемые препараты были нетоксичны для клеток MDCK н в разной степени подавляли размножение вируса гриппа птиц A/chickeri/Kurgari/05/2005 (A/H5N1) на клетках MDCK. При высокой инфекционпости вируса на клетках (титр в ^ТЦД50/мл составил 8,5) его нейтрализация под влиянием исследованных препаратов составляла от 2 lg до 7 lg, а в ряде вариантов - до 8 lg, что является показателем высокой противовирусной активности исследованных препаратов.

При филогенетическом анализе штаммов с использованием RAPD-днагпостики показано, что на филогенетическом дереве штаммы Долины гейзеров формируют отдельную ветвь, далеко отстоящую от типовых штаммов. Полученные факты показывают существование в экологических нишах Долины гейзеров подвидов 5/, ранее пе охарактеризованных.

Следует отметить, что большая часть коллекции, созданной в процессе выполнения настоящей работы, представлена разнообразием микроорганизмов, выделенных из уникальных мест обитания и обладающих уникальными генетическими ресурсами. Полученная базовая коллекция природных микробных изолятов является цепным генофондом для выполнения фундаментальных и прикладных исследований, потенциальные возможности которой лишь в малой мере представлены в настоящей работе.

Перечень выделенных продуцентов БАВ представлен в Приложении 1. По материалам исследований новых штаммов-продуцентов оформлены статьи, авторские заявки и патенты (Приложение 2).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Андреева, Ирина Сергеевна, Кольцово

1. Абызов С.С. Микрофлора ледникового щита Центральной Антарктиды// Автореф. дис. докт. биол. наук.-М., 2001.

2. Абызов С.С. Микробиологические исследования в Антарктиде// Антарктика,- 1989. № 28. -С. 214-216.

3. Абызов С.С., Белякова JI.A. Мицелиальные грибы из толщи ледника центральной Антарктиды// Изв. АН СССР. Сер. биол. 1982. - № 3. - С. 432-435.

4. Абызов С.С., Кузнецов В.Д., Филиппова С.Н. Nocardiopsis antarcdcus новый вид актиномицета из толщи ледника центральной Антарктики// Изв. АН СССР. Сер. биол. -1983,-№4,-С. 559-569.

5. Абызов С.С., Мицкевич И. 11., Поглазова М.Н., Иванов М.В. Микробиологические исследования ледниковой толщи Антарктиды// Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградекого РАН. Юбилейный сборник к 70-летию Института М.: Наука, 2004-Вып. XII,- С. 5-28.

6. Азизбекян P.P., Белых Р.А., Нетыкса Е.М., Погосбекова М.Р. Сравнительная характеристика спорообразующих и аспорогенных штаммов Bacillus thuringiensis II Генетика.- 1978,-Т. 14, № 3.-С. 510-518.

7. Арчегова И. Б. Восстановление земель на Крайнем Севере.-Сыктывкар, 2000,- 152 е.

8. Белавин П.А., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Метод определения эндонуклеаз рестрикции в колониях бактерий // Прикл. биохим. микробиол,-1988.-Т. 23, № 1.- С. 121-124.

9. Белоусова Н.И., Шкидченко А.Н. Деструкция нефтепродуктов различной степени конденсации микроорганизмами при пониженных температурах// Прикл. биохим. микробиол.- 2004.- Т.40,- С. 312-3 16

10. Белявская В.А., Ромашева II.Г., Сорокулова И.Б., Ильичева А.А., Нестеров A.M., Колосов А.В., Подкуйко В.В., Михайлов В.В. Разработка технологии получения таблеточной формы препарата субалин // Биотехнология.- 2001.- №2,- С. 64-69.

11. Бопч-Осмоловская Е.А. Изучение термофильных микроорганизмов в Институте микробиологии РАН // Микробиология. 2004. -Т.73, №5. - С. 644-658.

12. Бонч-Осмоловская Е.А., Мирошниченко М.Л., Соколова Т.Г., Слободкип А.И. Термофильные микробные сообщества: новые физиологические группы, новые местообитания //Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградекого PAIL- М.: Наука, 2004. -Вып. XII.-423 с.

13. Боропип A.M., Сахаровский В.Г., Ермакова И.Т., Гречкина Г.М., Старовойтов И.И. Утилизация продуктов детоксикации ипритно-люизитной смеси// Прикл. биохим. микробиол. 1999. - Т. 35, №. 6. - С. 671-678.18.21,22,23,24,25,2627,2829,3031,32,33,34,35.36,37.

14. Волова Т.Г. Биотехнология. Новосибирск: Изд-во Сиб. отд. Российской Академии наук, 1999.-252 с.

15. Вятчина О.Ф. Штаммы Bacillus thuringiensis, выделенные при эпизоотии лиственничной мухи (Hylemyia laricicola) в Камчатской области // Сиб. экол. журн,- 2004. № 4. — С. 501 -506.

16. Вятчина О.Ф., Завезенова Т.В. Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе// Мат. рос. науч.-практ. конф., поевящ. 100-летию со дня рождения проф. Е.В. Талалаева, г.Иркугск, I 1-13 марта 2002 г. С. 13-18.

17. Гальчснко В.Ф. Антарктида: микробиология озер / В.Ф. Гальченко; отв. ред. М.В. Иванов. -М.: Наука, 2005.-25 л.

18. Гальченко В.Ф. Сульфатредукция, метанобразоваиие и метанокислспие в различных водоемах Оазиса Бангер Хиллс, Антарктида // Микробиология.-1994.-Т.63 С. 683-698.

19. Гальченко В.Ф., Болыниянов Д.Ю., Черных 11.А. Андерсен В. Бактериальные процессы фотосинтеза и темповой ассимиляции углекислоты в озерах Оазиса Бангер Хиллс, Восточная Антарктида // Микробиология. 1995 - Т.64. - С. 833-844.

20. Гейл Э., Кандлифф Э., Реннодолдс П., Ричмонд М., Уоринг М. Молекулярные основы действия антибиотиков.- М.: Мир, 1975. 485 С.

21. Герхард Ф. и др. /Под ред./ Методы общей бактериологии.- М.: Мир, 1984.-Т.З.- 264 С.

22. Гсрхард Ф. и др. /Под ред./ Методы общей бактериологии М.: Мир3-1983.-Т.1.- 536 С.

23. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение /Пер. с англ. М.: Мир, 2002. - 589 с.

24. Глупов В.В. /Под ред./ Патогены насекомых: структурные и функциональные аспскты.-М.: Круглый год, 2001.-716 с.

25. Голубева И.В., Килессо В.А., Кисилева Б.С. // «Энтеробактерпи» /Под ред. В. И. Покровского.-М.: Медицина, 1985.- С. 321.

26. Горленко В.М., Намсараев Б.Б., Кулырова А.В., Заварзипа Д.Г., Жилина Т.Н. Активность еульфатредуцирующих бактерий в донных осадках содовых озер Юго-Восточного Забайкалья // Микробиология. 1999. - Т. 68. - С. 664-670.

27. Градова Н.Б., Горнова И.Б., Эддауди Р., Салина Р.11. Использование бактерий рода Azotobacter при биоремедиации иефтезагрязненных почв // Прикл. биохим. микробиол. 2003.-Т. 39, № 39. С. 318-321.

28. Давранов К.Д. Микробные липазы в биотехнологии // Прикл. биохим. микробиол. — 1994. -Т. 30.-С. 527-534.

29. Дедков В.С, Килева Е.В, Попичспко Д.В., Дегтярев С X. Эндонуклеаза рестрикции Fat I Flavobacterium aqiiatilr NL3 расщепляет ДНК по сайту 5'-j.CATG-37/ Биотехнология.-2002,-№ 5.-С. 3-7.

30. Дужак А.Б., Панфилова З.И., Васюнина Е.А. Выделение и свойства препаратов внеклеточных липаз природного и мутаптного штаммов Serratia inarcescens II Прикл. биохим. микробиол. 2000. - Т. 36. - С. 402-411.

31. Дятлова К.Д. Микробные препараты в растениеводстве// Соросовский образоват. Ж.-2001,-№5,- С. 17-22.39.