Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антибиотикочувствительность алкантрофных родококков и возможные пути формирования их неспецифической антибиотикорезистентности

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Антибиотикочувствительность алкантрофных родококков и возможные пути формирования их неспецифической антибиотикорезистентности"

Р Г Б ОД

2 2 СЕН ет

На правах рукописи

КУЮКИНА Мария Станиславовна

АНТИБИОТИКОЧУВСТБИТЕЛЬНОСТЬ АЛКАНОТРОФНЫХ РОДОКОККОВ И ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ ФОРМИРОВАНИЯ ИХ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь -1997

Работа выполнена в Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, г. Пермь

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник И. Б.Ившина

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

доцент В.Г.Ременников,

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник В.П.Коробов

Ведущая организация - Московский государственный

университет им. М.В.Ломоносова

Защита состоится "Лв « сентября 1997 г., в ^^^часов на заседании диссертационного совета К 200.4 6.01 Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.■

Автореферат разослан " ^^ " ЯЖ^ЪбиО— 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, л ^

старший научный сотрудник 'СЛ-'С*—^.-— - "Й. Б. Ившина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Повышенный интерес исследователей к представителям рода Rhodococcus (Zopf 1891) Goodfellow and Alderson 1977 обусловлен широкими метаболическими возможностями родококков, осуществляющих деградацию большого спектра органических загрязнителей и биосинтез практически ценных соединений.

Становление таксономической структуры данного рода еще не завершено, имеют место случаи переноса отдельных видов Rhodococcus в другие таксоны, а также описание новых штаммов и видов родококков (Briglia et al., 1994, 1996; Stoecker et al., 1994; Rayney et al., 1995). По-прежнему остро стоит проблема классификации новых видов в пределах изучаемого рода и объективной идентификации свежевыделенных изолятов. Предложенная классификация родококков на основе изучения генетических и хе-мотаксономических свойств трудоемка. В этой связи поиск новых надежных таксономических признаков сохраняет актуальность. Среди таксономических критериев, применяемых в видовой диагностике Rhodococcus spp., представляется перспективным использование анализа чувствительности бактериальных культур к антибиотическим веществам различной природы и спектра действия.

Основная биологическая особенность алканотрофных родококков - способность использовать в качестве единственного источника углеродного питания газообразные и жидкие я-алканы. Потребление родококками углеводородных субстратов во многом определяет своеобразие их структурной и метаболической организации, способствует появлению новых физиологических свойств (Ившина и др., 1987, 1996). В этой связи представляет интерес сравнительное изучение чувствительности родококков к антибиотическим веществам при культивировании в присутствии н-алканов и на средах без них.

Пропанокисляющие родококки относятся к трудноизолируемой группе организмов, получение которых в чистой культуре требует больших затрат труда и времени, поскольку в накопительной культуре они растут в виде микробных сообществ с быстрорастущими спутниковыми бактериями, не усваивающими газообразные н-алканы и тормозящими развитие родококков. Это обусловливает необходимость создания не только элективных, но и селективных условий при изоляции пропанокислякхцих родококков. Разработка метода селективного выделения газоокисляющих родококков представляется возможной после изучения антибиотикочувствительности природных ассоциаций, развивающихся в присутствии пропана (н-бутана) как единственных источников углерода.

Цель настоящей работы - изучение резистентности бактерий рода ВЪоёососсиз к антибиотическим веществам различной природы и механизма действия.

Конкретные задачи исследования:

1. Оценка возможности использования показателей антибио-тикочувствительности в качестве дополнительного критерия видовой дифференциации бактерий рода КЬос1ососсив, в частности разработка диагностических критериев для разделения труднодиффе-ренцируемых близкородственных видов родококков.

2. Изучение влияния состава среды и условий культивирования алканотрофных родококков на их чувствительность к антибиотическим веществам различного биологического происхождения и механизма действия.

3. Исследование механизмов антибиотикорезистентности родококков в условиях их роста на н-алканах.

4. Модификация метода выделения алканотрофных родококков из природных образцов путем разработки селективных питательных сред с добавлением антибиотических соединений.

Научная новизна работы. Исследована чувствительность значительного числа коллекционных и свежевьщеленных из контрастных экосистем штаммов родококков к большому набору антибиотических веществ различного механизма и спектра действия. Показано, что анализ антибиотикочувствительности может служить таксономическим критерием видовой диагностики КЬос1ососсиэ эрр.

Подтверждена зависимость чувствительности родококков к антибиотикам от используемого источника углеродного питания. Установлено повышение антибиотикорезистентности родококков, культивируемых на минеральных средах в присутствии газообразных и жидких н-алканов, по сравнению с организмами, растущими на богатых питательных средах. Выявлены механизмы резистентности, связанные с изменением липидной структуры бактериальной клеточной оболочки и повышением активности окислительных ферментных систем родококков, осуществляющих деструкцию и инактивирование антибиотиков.

Изучена антибиотикочувствительность естественных бактериальных ассоциаций, развивающихся в присутствии пропана. Установлено, что пропанокисляющие родококки обладают повышенной устойчивостью к ряду антибиотиков по сравнению со спутниковыми негазоокисляющими эубактериями. Данные антибиотические соединения использованы при создании селективных условий выделения родококков из природных сред.

Практическое значение. Определены таксономически значимые антибиотики, тесты на чувствительность к которым предложены в качестве новых дифференцирующих критериев для разделения близкородственных видов родококков: R."longus" и R.opacus; R.zhodochrous и R.ruber. Предложенные тесты, отличающиеся простотой постановки и высокой воспроизводимостью результатов, рекомендованы для включения в диагностические ключи определения данных видов Rhodococcus.

Разработаны селективные среды для эффективной изоляции пропанокислякацих родококков из природных популяций. Разработанные среды могут быть успешно использованы в экологических исследованиях данной группы бактерий, а также при культивировании смешанных культур родококков в нестерильных производственных условиях. Получено положительное решение ВНИИГПЭ от 10.07.97 на выдачу патента 96124751 «Способ селективной изоляции пропано-кисляющих родококков».

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Антибиотикочувствительность бактерий рода Rhodococcus является объективным дополнительным критерием при определении видовой принадлежности родококков, подтвержденным результатами генетического анализа с использованием видоспецифической поли-меразной цепной реакции.

2. В условиях углеводородного питания происходит неспецифическое увеличение антибиотикоустойчивости родококков, коррелирующее с изменением липидной структуры их клеточной оболочки и обусловленное повышением активности бактериальных окислительных ферментных систем.

3. Для эффективного выделения алканотрофных родококков из природных образцов рекомендуются селективные питательные среды с добавлением оптимальных концентраций индивидуальных антибиотических веществ и комбинаций антибиотиков.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены на Международном симпозиуме «International Symposium on Subsurface Microbiology - ISSM'93», Бат, Великобритания, 1993; Конференции молодых ученых «Механизмы поддержания биологического разнообразия», Екатеринбург, 1995; Международной конференции «Microbial Diversity: current situation, conservation strategy, and ecological aspects -ICOMID'96», Пермь, 1996. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 таблицами и

16 рисунками; состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, обсуждения и выводов. Список литературы включает 245 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили 170 культур алканотрофных родококков из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ (Каталог штаммов..., 1994), принадлежащих к десяти ■ видам Rhodococcus (R.coprophilus, R.equi, R.erythropolis, R.fascians, R.globerulus, R."longus", R.opacus, R.rhodnii, R.rhodochrous и R.ruber), а также 29 природных изо-лятов, выделенных нами из почвенных и водных образцов районов нефтепромыслов Пермской области и отнесенных на основании фено-типических, иммунохимических и генетических признаков к R.ruber (9 штаммов), Kocuria rosea (6 штаммов), Micrococcus luteus {4 штамма), Micrococcus sp. (3 штамма) и Pseudomonas sp. (7 штаммов) . Кроме того, в работе использовали высокочувствительные к антибиотикам тест-культуры Bacillus subtilis АТСС 6633, Bacillus mycoides R-537, Micrococcus luteus ATCC 9341, полученные из Института по изысканию новых антибиотиков (Москва, Россия).

Получение накопительных и чистых культур бактерий, предварительную идентификацию выделенных изолятов, культивирование микроорганизмов, микробиологическое определение активного антибиотика в среде проводили в соответствии с известными методиками (Малашенко и др., 1973; Методы общей бактериологии, 1983; Барбан и др., 1988). Исследование антибиотикочувствительности бактерий проводили дискодиффузионным методом (Гивенталь и др., 1982; Gould, Bowie, 1952), используя набор 34 стандартных индикаторных дисков с антибиотиками.

Аналитические методы исследования включали полярографическое определение скорости потребления кислорода, тонкослойную, жидкостную и газовую хроматографию.

Для подтверждения видовой специфичности отдельных представителей Rhodococcus spp. впервые использован генетический анализ с применением видоспецифической полимеразной цепной реакции (Kwok, Higuchi, 1989; Atlas, Bej, 1996).

Математическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета компьютерных программ STATISTICA (версия 3.4 для Windows). Основной массив экспериментальных данных обрабатывали с помощью программ описательной статистики с вычислени-

ем среднего квадратического, стандартной ошибки, доверительного интервала. При оценке степени достоверности различий средних данных использовали t-критерий Стьюдента; степени гомогенности признаков внутри группы - критерий Шапиро-Уилка. Расчеты вели с учетом числа степеней свободы (Лакин, 1990). В более детальных исследованиях применяли программы корреляционного, кластерного и дискриминантного анализа (Девис, 1977).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ антибиотикочувствительности как дополнительный критерий видовой дифференциации Rhodococcus spp. Полученные результаты свидетельствуют, что исследуемые штаммы родококков при росте на мясопептонном агаре проявляют высокую чувствительность ко многим антибиотическим веществам различной химической структуры (аминогликозидам, пенициллинам, линкозами-дам, макролидам, тетрациклинам и др.) . Выявленная высокая анти-биотикочувствительность родококков согласуется с литературными данными и, по-видимому, является характерной особенностью рода Rhodococcus (Goodfellow, Orchard, 1974; Boiron, Provost, 1990).

Для выявления межвидовых различий в антибиотикочувствительности результаты антибиотикотипирования большого массива коллекционных штаммов родококков, представленные в виде величин диаметра зоны подавления бактериального роста (в мм) , были обработаны с помощью кластерного анализа. Дендрограмма сходства 10 видов родококков (рис. 1), построенная на основе сравнения

R.equi (5 штаммов) _;_:_¡_:_i_■

R.erythropolis (33 штамма) _

R.globerulus ИЭГМ AC 591т _i_Г~|

R.rhodochrous (13 штаммов) --i

R. ruber (70 штаммов) --~П

R.coprophilus ИЭГМ АС 600т -;-:--i- ¡ I

R.fascians (7 штаммов) -:-;---г~|

R. "longus " (6 штаммов) ■ | _J —;-;—

R.opacus (9 штаммов) R.rhodnii ИЭГМ AC 555T

80 120 160 200 240

Рис. 1. Дендрограмма сходства видов Rhodococcus, рассчитанного по усредненным для каждого вида значениям диаметра зоны ингибирования бактериального роста под действием антибиотика.

усредненных видовых характеристик антибиотикочувствительности, свидетельствует, что патогенные для животных и человека виды R.equi и R.rhodnii обособлены от других представителей данного рода. Среди Rhodococcus spp., представленных свободно живущими формами, выявляются пары сходных по признаку антибиотикочувствительности видов: R.erythropolis и R.globerulus, R.longus и R.opacus, и особенно близкие виды - R.rhodochrous и R.ruber. Построенная дендрограмма обнаруживает значительное совпадение при сравнении с дендрограммой филогенетического родства, основанной на степени гомологии олигонуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК (Briglia et al., 1996).

Особое внимание в работе уделено оценке возможности использования характеристик антибиотикочувствительности в исследовании таксономической структуры широко распространенных в природе и имеющих большое экологическое и биотехнологическое значение видов родококков, таких как R.erythropolis, R.fascians, R."longus", R.opacus, R.rhodochrous и R.ruber. Все они наиболее полно представлены в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ.

Как видно из дендрограммы на рис. 2, исследуемые культуры группируются на основании антибиотикочувствительности в кластеры, совпадающие с обозначенными видами родококков. Представители R.fascians четко дифференцируются по признаку антибиотикочувствительности, образуя компактную группу на дендрограмме. В отдельный кластер выделяются штаммы R.erythropolis, которые характеризуются довольно высокой степенью гетерогенности по изучаемому признаку. Представители R."longus" и R.opacus, хотя и располагаются на разных ветвях построенной дендрограммы, но очень близко друг к другу, что свидетельствует о затруднительности их дифференциации по совокупной антибиотикочувствительности. Культуры R.rhodochrous и R.ruber, также очень близки и даже частично смешиваются между собой.

В этой связи следующей задачей явился поиск дополнительных надежных таксономических критериев для разделения близкородственных видов родококков. С этой целью проведен статистический анализ с помощью t-критерия Стьюдента средних значений диаметра зоны подавления роста под действием антибиотиков для каждой пары трудноразделимых таксонов.

Результаты анализа, выполненного для представителей R."longus" и R.opacus, свидетельствуют, что значимыми для дифференциации исследуемых видов родококков являются антибиотики доксициклин, канамицин, полимиксин, фузидин и хлорамфеникол,

R. rhodochrous MBITM AC 62 R. rhodochrous M3rM AC 64 R.rhodochrous H3n-1 AC 66 R. rhodochrous H3I>1 AC 656 R.ruber M3n-1 AC 641 R. rhodochrous M3rM AC 67 R. ruber H3rM AC 4 37 R.ruber H3IM AC 572 R. ruber H3n-I AC 34 3 P.. ruber H3rM AC 382 R.ruber Msrt-I AC 4 46 R. ruber H3n-1 AC 578 R. ruber M3n-1 AC 482 R. ruber I13n-I AC 449 R.ruber MSn-I AC 475 R. ruber 113m AC 481 R.ruber H3H1 AC 471 R. ruber I13n-1 AC 472 R. ruber ll3n-1 AC 483 R. ruber M3H-1 AC 319 R. ruber iisn i AC 448 R. ruber M3m AC 70 R. ruber H3n-I AC 333 R. ruber H3n-I AC 71 R. ruber HOITI AC 230 P.. ruber llSHl AC 224 R. ruber I13n-1 AC 84 R. ruber H3n i AC 91 R. fascials 11311-1 AC 34 R. fascians H3rM AC 4 3T R. fascials I13ni AC 289 R. fascians M3n-I AC 35 R. fascians !13n-I AC 36 R. fascians H3n-I AC 170 R. fascians USUI AC 171 longus" Hsn-I AC 27 longus" longus" longus" longus" longus"

R

ИЭП-I AC 29 ИЭГМ AC 33 ИЗП-I AC 31 ИЭП-I AC 68 ИЭШ AC 32 R.cpacus ИЭП-I AC 56 R.cpacus ИЭП-I AC 58 R.opacus ИЭГМ AC 60 R.cpacus ИЭП-I AC 61 R.opacus ИЭГМ AC 4 58 R.opacus ИЭГМ AC 716T R.opacus ИЭП-I AC 717 R.erythropolis ИЭГМ AC 7T R.ervthropolis ИЭП4 AC 13 R.erythropolis ИЭГМ AC 18 R.erythropolis ИЭП-I AC 272 R.erythropolis ИЭП-I AC 208 R.erythropolis ИЭП-I AC 209 R.erythropolis ИЭП-I AC 252 R.erythropolis ИЭП-I AC 682 R.ervthropolis ИЭП-I AC 684 R.erythropolis ИЭП-I AC 686 R.erythropolis ИЭП4 AC 687 R.erythroDolis ИЭП-I AC 691 R.ervthropolis ИЭШ AC 683 R.erythropolis ИЭП-I AC 690

Рис. 2. Кластерный анализ результатов определения антибио-тикочувствительности исследуемых штаммов Кпоёососсив зрр.

поскольку разница величин диаметра стерильной зоны, образуемой под влиянием данных антибиотических веществ, статистически достоверна (Р < 0.05) и составляет 6.8, 15.7, 4,6, 20,1 и 5.4 мм, соответственно. Статистически достоверное разделение видов R.rhodochrous и R.ruber достигается с помощью показателей их чувствительности к ампициллину, олеандомицину, фузидину и эритромицину. При этом разница величин диаметра зоны подавления роста штаммов R.rhodochrous и R.ruber под действием перечисленных антибиотических соединений^достигает 6.7, 13.7, 24.9 и 13.0 мм, соответственно (Р < 0.05). Тесты на чувствительность к указанным антибиотикам рекомендуется включать в диагностические ключи для определения данных видов родококков и использовать при идентификации природных изолятов на конечных этапах видового определения. Следует отметить достоинство этих тестов, заключающееся в простоте постановки, экспрессности и хорошей воспроизводимости результатов.

На основании предложенных тестов удалось идентифицировать не определенные ранее до уровня вида штаммы родококков, полученные из Национальной коллекции промышленных и морских бактерий (NCIMB, Абердин, Великобритания). Так, по значению дис-криминантной функции чувствительности к таксономически значимым антибиотикам штамм Rhodococcus sp. ИЭГМ АС 718 (=NCIMB 11160) принадлежит к R.opacus; штаммы Rhodococcus sp. ИЭГМ АС 743 (=NCIMB 9741) и ИЭГМ АС 744 (=NCIMB 9784) идентифицируются как R.ruber. Кроме того, чувствительность к таксономически значимым антибиотикам может служить одним из оснований реклассификации культур, видовая принадлежность которых ранее определена неправильно. В частности, была переопределена видовая принадлежность 3 штаммов, полученных как R.erythropolis ИЭГМ АС 247 (=ИНМИБ ДСС-31), ИЭГМ АС 248 (=ИНМИБ 29Ф) , ИЭГМ АС 261 (=ИНМИБ 7Ф) из коллекции бактериальных культур Института микробиологии АН Беларуси, и 4 штаммов R.rhodochrous ИЭГМ АС 67 (=PNKbl), ИЭШ АС 656 (=NCIMB 11273), ИЭГМ АС 657 (=NCIMB 11277), ИЭГМ АС 759 (=NCIMB 13259), которые по результатам тестов на антибиотико-чувствительность принадлежат к R.opacus и R.ruber, соответственно. Выводы о видовой принадлежности всех перечисленных идентифицированных и реклассифицированных штаммов подтверждаются данными комплексного таксономического исследования, проведенного в коллекции ИЭГМ с использованием физиолого-биохимических, хемотаксономических и иммунохимических методов.

С целью проверки информативной значимости признака анти-биотикочувствительности для изучения систематической структуры КЬоёососсцб проведен генетический анализ 105 штаммов родо-кокков. В качестве арбитра видовой идентификации использовался метод видоспецифической амлификации 16Б рРНК гена с помощью полимеразной цепной реакции.

Таблица 1.

Результаты генетического анализа бактерий рода Мюйососсиз, проведенного с помощью полимеразной цепной реакции

Вид, штамм Результаты ПЦР, поставленной с праймерами для

R.erythropolis R.rhodochrous R.ruber

R.erythropolis ++

(30 штаммов) -

R.erythropolis

ИЭГМ АС 247 - -

АС 248 - -

АС 261 - -

R.rhodochrous ++

(9 штаммов)

R.rhodochrous

ИЭГМ АС 67 - - +?

АС 656 - - ++

АС 657 - - ++

АС 759 - - ++

R.ruber ++

(57 штаммов)

Rhodococcus sp.

ИЭГМ АС 743 - - ++

Rhodococcus sp.

ИЭГМ АС 744 - - ++

Примечание. В таблице приведены результаты ПЦР анализа, выполненного в двух повторностях. + - Положительный результат; - - отрицательный; ? - неопределенный, продукт реакции проявлялся на гелевой пластинке в виде слабой линии.

Результаты анализа (табл. 1) свидетельствуют, что характеризующиеся значительным разнообразием спектров антибиотико-чувствительности 30 представителей Д.егуЬЬгороИБ по результатам ПЦР с праймерами, выбранными для Я.егуЬИгороЛз, однозначно принадлежат данному виду родококков. По-видимому, выявленная гетерогенность бактериальных культур по признаку анти-биотикочувствительности определяется не их филогенетической разнородностью, а неодинаковым экологическим давлением на мик-

роорганизмы в естественных условиях и, скорее всего, обусловлена присутствием в клетках мобильных генетических элементов, несущих маркеры антибиотикоустойчивости. Следует особо подчеркнуть, что в результате ПЦР-анализа трех штаммов ИЭГМ АС 247, ИЭГМ АС 248 и ИЭГМ АС 261, поступивших из коллекции бактериальных культур ИНМИБ под видовым названием R.erythropolis, получен отрицательный ответ.

Девять исследуемых коллекционных культур R.rhodochrous дают положительный результат при постановке ПЦР с праймерами, сконструированными для данного вида. В то же время, результаты анализа других исследуемых штаммов Я.rhodochrous ИЭГМ АС 67, ИЭГМ АС 656, ИЭГМ АС 657 и ИЭГМ АС 759, тестируемых с этими праймерами, демонстрируют отрицательную реакцию, свидетельствуя о неправильном отнесении организмов к R.rhodochrous. Проведение для данных штаммов ПЦР с использованием праймеров, специфичных для R.ruber, привело к получению положительного результата, что позволяет установить принадлежность тестируемых культур к R.ruber.

Результаты ПЦР для 57 штаммов R.ruber, осуществляемой с использованием праймеров, видоспецифичных для R.ruber, подтверждают принадлежность всех исследуемых культур данному виду Rhodococcus. Неидентифицированные штаммы Rhodococcus sp. ИЭГМ АС 743 и Rhodococcus sp. ИЭГМ АС 744 из Национальной коллекции промышленных и морских бактерий (Абердин, Великобритания), по данным ПЦР классифицируются как R.ruber.

Таким образом, проведенный генетический анализ полностью подтверждает выводы о видовой принадлежности исследуемых культур, сделанные на основании данных антибиотикочувствительности. Следовательно, антибиотикочувствительность родококков имеет информативную ценность в таксономических исследованиях данной группы эубактерий и является надежным дополнительным критерием видовой дифференциации Rhodococcus spp.

Повышение антибиотикорезистентности родококков в условиях их роста на н-алканах. Возможные механизмы устойчивости.

Проведенные исследования показали, что степень антибиотикочувствительности родококков в большой мере зависит от используемого источника углеродного питания (рис. 3) . Так, при переходе клеток родококков с богатой питательной среды на использование жидких и газообразных н-алканов происходит резкое снижение их

чувствительности к аминогликозидным антибиотикам, линкозамидам, макролидам, оксациллину и хлорамфениколу. Интересно отметить, что снижение чувствительности наблюдается преимущественно к антибиотическим веществам актиномицетного происхождения и их производным. Это имеет, по-видимому, приспособительное значение, повышая конкурентоспособность родококков во взаимоотношениях с широко распространенными в природе актиномицетными микроорганизмами .

Диаметр зоны ингибирования роста, мм

Гента- Нео-мицин мицин

Линко- Окса- Хлорам- Олеандо- Эритромицин циллин феникол мицин мицин

Рис. 3. Изменение антибиотикочувствительности 17 штаммов родококков, культивируемых на разных питательных средах. 1 - мясопептонный агар; 2 - минеральная среда с н-гекса-деканом; 3 - минеральная среда с пропаном.

При изучении механизмов неспецифической антибиоти-корезистентности родококков в условиях их роста на н-ал-канах, обнаружена корреляция между повышением количества суммарных липидов клеток, выращенных на пропане и н-гекса-декане, и устойчивостью данных организмов к антибиотикам, проявляющим гидрофобные свойства, таким как линкомицин, хлорамфеникол и эритромицин (табл. 2).

Таблица 2.

Суммарные клеточные липиды (в % от сухого веса клеток) штамма Д. гаЬег ИЭГМ АС 333, выращенного на разных средах в присутствии антибиотиков и без них

Вносимый антибиотик Мясопептонный буль он Минеральная среда в присутствии

пропана я-гексадекана

Контроль 14.6 ± 9. 4 11.8 ± 5. 6 22.3 ± 8.2

(без антибиотика)

Гентамицин 15.3 ± 5. 7 11.9 ± 0. 6 23.1 ± 0.4

(Р>0.1) (Р>0.1) (Р>0.1)

Канамицин 15.0 + 3. 8 11.3 ± 9. 5 25.4 ± 2.5

(Р>0.1) (Р>0.1) (Р>0.1)

Линкомицин 14.9 + 8. 2 14.2 ± 7. 8 27.6 + 3.8

(Р>0.1) (Р<0.1) (Р<0.05)

Оксациллин 15.1 + 9. 0 10.4 ± 3. 2 22.9 + 1.3

(Р>0.1) (Р>0.1) (Р>0.1)

Хлорамфеникол 13.5 ± 4. 4 17.9 ± 6. 3 26.2 ± 8.2

(Р>0.1) (Р<0.05) (Р<0.1)

Эритромицин 16.3 ± 9. 8 18.3 ± 8. 2 26.1 ± 5.7

(Р>0.1) (Р<0.05) (Р<0.1)

Примечание. Приведены средние данные трех параллельных определений. В скобках указана достоверность различий между контрольным и опытным вариантами при уровнях значимости Р<0.1 и Р<0.05.

Клетки родококков при культивировании на углеводородсо-держащих средах содержат больше различных фосфолипидов по сравнению с таковыми, выращенными в мясопептонном бульоне. Особенно характерно присутствие в них нейтрального фосфоли-пида кардиолипина и его предшественника фосфатидилглицерина. Возможно, данные компоненты клеточной мембраны приводят к снижению проницаемости оболочки бактериальных клеток . для молекул антибиотиков, способствуя развитию антибиотикорези-стентности. Данный вывод подтверждается литературными сведениями о том, что кардиолипин вызывает повышение ригидности клеточной оболочки Pseudomonas aeruginosa, тем самым снижая чувствительность данных микроорганизмов к действию полимик-сина (Gilleland et al., 1984).

Известно, что жирные кислоты, присутствующие в свободном состоянии и входящие в состав различных липидных компонентов бактериальной клеточной оболочки (фосфо- и гликолипидов, три-глидеридов, липополисахаридов и т.д.), являются ее наиболее лабильным элементом и принимают активное участие в адаптационных изменениях, происходящих в клетках при воздействии негативных физических и химических факторов внешней среды (Смирнов и др., 1987). Литературные сведения об изменении состава клеточных жирных кислот при развитии у микроорганизмов устойчивости к антибиотикам многочисленны, но довольно противоречивы (Dunnick, O'Leary, 1970; Anderes et ai., 1971; Cheema et al., 1986; Rhahmati-Bahram et ai., 1990).

Таблица 3.

Жирно-кислотный состав клеточных липидов R.ruber ИЭГМ АС 333, выращенного на разных средах в присутствии антибиотиков

Жирные кислоты Конт- Гента- Кана- Линко- Окса- Олеан- Хлррам- Эритро~

(в % от суммы) роль мицин мицин мицин циллин домицин феникол МИНИН

Мясопептонный бульон

Предельные 47.8 48.1 50.2 н.о. 52.2 47 . 6 43 7 47.3

Непредельные и разветвленные 52.7 52.1 49.8 н.о. 46.1 53.3 56 8 52.6

С10-С15 18 .8 9.6 16.4 н.о. 22. 5 14.2 10 3 7.3

81.7 90. 6 83. 6 н.о. 75.8 82.6 90 2 92. 6

Мине ральная среда с пропаном

Предельные 60.7 н.о. 73.0 71. 7 77.0 73.9 63 4 н.о.

Непредельные и разветвленные 40 .1 н.о. 26. 9 28.3 23.0 25.1 37 5 н.о.

С10-С15 24.8 н. о. 14.7 11.2 22 Л 19.8 18 0 н.о.

Сгь-Сг, 76.0 н.о. 85.2 88.8 77.1 79.2 82 9 н.о.

Ми игральная среда с -гексадеканом

Предельные 67.5 52.6 65.1 н.о. 64 .4 н.о. 67 8 68.3

Непредельные и разветвленные 32.4 46.3 34.9 н.о. 35.2 н.о. 31 4 31.8

Сю-Си 6.3 11.5 11.3 н.о. 10.7 н.о. 21 8 4.4

С16-С21 93.6 87.4 88.7 и.о. 88.9 н.о. 77 4 95.7

Полученные нами результаты (табл. 3) свидетельствуют, что отличительной особенностью жирно-кислотного спектра родококков, культивируемых на углеводородных субстратах, является повышенное содержание насыщенных прямоцепочечных жирных кислот, в частности, пальмитиновой кислоты (Cie:о), и пониженное количество непредельных кислот - гексадеценовой (Ci6:i) и гептадеценовой (Ci7:i), по сравнению с культурой, выращенной в богатой органической питательной среде. Суммарная доля разветвленных жирных кислот также ниже в бактериальных клетках, культивируемых на углеводородных средах, и составляет 5.1 и 3.7 %, соответственно, от- суммы жирных кислот у R.ruber, растущего на пропане и н-гексадекане, и 10.0 % - у данного штамма в мясопептонном бульоне. Выявленные особенности, наряду с отмеченным для потребляющей н-гексадекан культуры удлинением ..углеродной цепочки жирно-кислотных молекул, по-видимому, обусловливают снижение проницаемости клеточной оболочки, препятствуя поступлению антибиотических веществ к чувствительным к ним мишеням действия, и тем самым повышают антибиотикорезистентность клеток родококков, растущих на углеводородных средах.

Создаваемый бактериальной клеточной оболочкой барьер проницаемости - существенный, но недостаточный фактор развития антибиотикоустойчивости (Arthur et а_1., 1987; Jalier, Nikaido, 1994; George, 1996). В подавляющем большинстве случаев адаптивная резистентность микроорганизмов к антибиотикам является результатом синергического действия нескольких механизмов, работающих на вне- и внутриклеточном уровне. Среди последних наиболее широко распространены и изучены процессы, связанные с инак-тивированием поступивших в клетку антибиотических соединений путем ферментативной трансформации молекул (Dabbs, 1987; Tanaka et al., 1996).

Известно, что родококки принадлежат группе эубактерий с ярко выраженным окислительным типом метаболизма, осуществляющих окисление широкого спектра органических веществ, включая газообразные и жидкие н-алканы, ароматические, галогензамещенные и полициклические углеводородные соединения, в том числе ксенобиотики (Finnerty, 1992). Окислительные ферменты родококков отличаются большим разнообразием и широко представлены системами многоцелевых оксигеназ или оксидаз смешанных функций, способных атаковать не только "свой" специфический субстрат, но и его структурные аналоги, и осуществляющих первичную

трансформацию чужеродных соединений (Скрябин, Головлева, 1976). И.Б.Ившиной с соавт.(1990) высказано предположение, что резистентность родококков в присутствии газообразных н-алканов к антибиотическим веществам является результатом неспецифических ферментных реакций, инактивирующих тот или иной воздействующий антибиотик. Для проверки этого предположения в условиях потребления родококками газообразных и жидких углеводородов исследовалась активность окислительных ферментных систем бактериальных клеток по отношению к различным антибиотикам.

В табл. 4 приведены результаты измерения скорости потребления кислорода бесклеточным ферментным экстрактом штамма R.ruber ИЭГМ АС 333, выращенного на пропане, при внесении в полярографическую ячейку различных источников углерода и антибиотических веществ.

Таблица 4.

Потребление кислорода бесклеточным экстрактом иэ R.ruber ИЭГМ АС 333 в присутствии различных источников углерода

Источник углерода Испытуемая концентрация (мкг/мл) Скорость поглощения Ог (нмоль/ч-мг белка)

я-Гексан 0 3. 0 X ю2

50 3. 7 X 103

Смесь жидких 0 2. б X 10г

н-алканов (С12-С17) 50 1. 4 X 103

Этанол 0 2. 5 X 102

50 8. 8 X ю2

Канамицин 0 2. 7 X 10г

40 9. 9 X ю2

Линкомицин 0 2. 7 X ю2

100 9. 7 X ю2

Оксациллин 0 2. 1 X ю2

40 1. 1 X 103

0л е а нд омицин 0 2. 5 X ю2

10 7. 3 X ю2

Хлорамфеникол 0 2. 5 X ю2

100 3. 5 X ю2

Эритромицин 0 2. 8 X ю2

8 б. 9 X ю2

Из таблицы видно, что углеводороды и спирты индуцируют окислительные ферментные реакции, о чем свидетельствует 4-12-кратное увеличение поглощения кислорода, наблюдаемое в их присутствии. Антибиотические вещества (канамицин, линкомицин, ок-сациллин, олеандомицин и эритромицин) также служат субстратом для окислительных ферментов родококков, вызывая повышение скорости потребления кислорода в 2.5-5.0 раз.

Таким образом, опыты с неочищенными энзиматическими препаратами наглядно демонстрируют способность окислительных ферментных систем родококков осуществлять неспецифическую атаку на молекулы различных антибиотиков. Степень инактивирования антибиотиков линкомицина, оксациллина и олеандомицина, дополнительно проверенная с помощью микробиологического метода, составляет 40-47 % после семидневного инкубирования клеток родококков в присутствии пропана. Несколько меньшая степень инактивирования выявляется для эритромицина, снижение действующей концентрации которого в культуральной среде составляет около 30 %. Объяснение выявленной разницы в степени инактивирования родококками двух антибиотических соединений - олеандомицина и эритромицина, принадлежащих одному химическому классу макролидов, по-видимому можно найти при рассмотрении гидрофильно-липофильных свойств их молекул. Так, молекулы эритромицина характеризуются более выраженной гидрофобностью по сравнению с таковыми олеандомицина, что, очевидно, обусловливает их затруднительное поступление в клетки родококков к местам локализации инактивирующих ферментов. Данное предположение подтверждается тем, что бесклеточный экстракт R.ruber окисляет оба антибиотика с одинаковой скоростью (см. табл. 4). Как показали исследования, хлорамфеникол практически не инактивируется клетками R.ruber при росте на пропане. Это согласуется с результатами опытов с бесклеточными ферментными экстрактами, свидетельствующими о довольно слабой способности окислительных систем родококков осуществлять атаку на данный антибиотик.

С целью изучения динамики процесса трансформации антибиотических веществ в условиях потребления родококками жидких н-алканов проводились эксперименты по периодическому культивированию R.ruber ИЭГМ АС 333 в минеральной среде, содержащей в качестве источника углерода н-гексадекан, с добавлением различных антибиотиков. Из рис. 4. видно, что линкомицин в концентрации 60 мкг/мл ингибирует рост родококков, поскольку скорость потребления углеводородного субстрата в течение первых трех

дней инкубирования в 3.7 раза ниже соответствующего значения для культуры, растущей в среде без внесения антибиотика. После окончания периода адаптации микроорганизмов к воздействию антибиотика наступает фаза экспоненциального роста, во время которой интенсивность потребления н-гексадекана клетками R. ruber, растущими в присутствии антибиотика и без него, одинакова и достигает максимального значения 0.1 rrfV'1. Потребление углеводородного субстрата родококками в присутствии линкомицина полностью останавливается на 10 сут культивирования, тогда как в не ингибируемой антибиотиком культуре • этот процесс завершается уже на 5-е сут. В конце инкубирования в культуральной среде присутствует остаточный н-гексадекан в количестве 2-3 г/л.

Рис. 4. Процесс микробной трансформации линкомицина штаммом R. ruber ИЭГМ АС 333 при_культивировании в минеральной среде в присутствии н-гексадекана. 1 - концентрация линкомицина в неинокулированной минеральной среде; 2 - то же в среде культивирования исследуемого штамма родококка; 3 - концентрация н-гексадекана в среде культивирования исследуемого штамма в присутствии линкомицина; 4 - то же в культуральной среде без внесения антибиотика.

::20 §

7 ю 14 Время, сут

Уменьшение количества линкомицина в среде становится заметным примерно на 5-е сут инкубации. В целом за весь инкубационный период происходит снижение концентрации антибиотика на 87 %, в то время как в неинокулированной среде этот показатель составляет всего 13 %. Следует отметить, что родококки в условиях потребления жидких я-алканов, очевидно, осуществляют полную химическую деструкцию молекул линкомицина, о чем свидетельствует отсутствие в культуральной среде детектируемых с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии продуктов частичной трансформации антибиотика.

Исследование процесса трансформации олеандомицина клетками R.ruber ИЭГМ АС 333, растущими на н-гексадекане, показало, что олеандомицин в концентрации 5 мкг/мл не оказывает подавляющего действия на развитие родококков (рис.5). Так, потребление углеводорода бактериальными клетками в присутствии антибиотика и без него происходит практически одинаково и достигает максимальной интенсивности (0.27-0.3 гл^ч"1) на 2-3 сут. В дальнейшем процесс замедляется и останавливается после 6-8 сут. Исходная концентрация олеандомицина начинает снижаться на 2-ой день инкубирования и в последующие 5 сут трансформируется практически весь присутствующий в среде антибиотик.

- 4,5 4

3,5 -- 3

2,5 + 2

1,5 + 1

0,5 £

10

Время, сут

Рис. 5. Процесс микробной трансформации олеандомицина штаммом R. ruber ИЭГМ АС 333 при культивировании в минеральной среде в присутствии н-гексадекана. 1 - концентрация олеандомицина в неинокулированной минеральной среде; 2 - то же в среде культивирования исследуемого штамма родо-кокка; 3 - количество н-гексадекана в среде культивирования исследуемого штамма в присутствии олеандомицина; 4 - то же в культуральной среде без внесения антибиотика.

О

В отличие от эксперимента по трансформации линкомицина, в данном случае нельзя утверждать, что в процессе культивирования R.ruber происходит полная деградация олеандомицина, поскольку с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии обнаруживается параллельно с уменьшением концентрации исходного антибиотика, появление двух дополнительных хроматографических пиков, которые, возможно, соответствуют частично окисленным неактивным формам антибиотика (рис. 6).

Таким образом, устойчивость алканотрофных родококков к антибиотикам, обусловленная углеводородным типом питания, как правило, является результатом синергического действия нескольких адаптационных механизмов. Один из таких механизмов, дейст-

А

19

Б

/

Рис. 6. Хроматографи-ческое определение

олеандомицина в среде

культивирования

R.ruber ИЭГМ АС 333 при росте на н-гекса-декане. Определение олеандомицина проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. А - в начале культивирования; Б - в конце культивирования. 1 - оле-андомицин; 2, 3 - неи-дентифицированные пики.

У

вующий на уровне клеточной оболочки, заключается в изменении ее липидной структуры, а именно: - повышении количества суммарных липидов клеточной стенки; - присутствии в составе фосфолипидов нейтрального кардиолипина и его предшественника фосфатидилгли-церина; - изменении жирно-кислотного состава клеточных липидов в сторону увеличения доли предельных длинноцепочечных жирных кислот и соответственном уменьшении количества ненасыщенных и разветвленных компонентов. Данные приспособления результируются в снижении проницаемости клеточной оболочки для молекул антибиотиков и, как следствие, препятствии накоплению высоких концентраций антибиотических соединений в клетках родококков. Другой выявленный механизм резистентности связан с внутриклеточным инактивированием антибиотиков в результате неспецифической ферментной атаки со стороны окислительных систем родококков, приводящей либо к полной деградации антибиотических соединений (линкомицина), либо трансформации их (олеандомицина) в неактивную форму.

Использование антибиотических веществ в качестве селективных агентов для выделения газоокисляющих родококков.

На основании выявленной закономерности повышения антибиоти-корезистентности родококков при росте на н-алканах удалось усовершенствовать метод выделения газоокисляющих организмов из природных образцов с использованием антибиотических сред.

В серии предварительных экспериментов по выявлению оптимальных концентраций антибиотиков с использованием искусственных и природных бактериальных ассоциаций, включающих наряду с пропанокисляющими родококками также представителей спутниковых микроорганизмов, установлено, что для подавления роста грампо-ложительных бактерий (косурий и микрококков) более успешным является использование линкомицина в концентрации 90 мкг/мл, ок-сациллина - 50-75 мкг/мл и эритромицина - 1.0-2.5 мкг/мл; для ингибирования развития грамотрицательных микроорганизмов (псевдомонад) - 75-100 Ед/мл полимиксина и 20 мкг/мл налидиксовой кислоты. Хлорамфеникол в концентрации 20 мкг/мл проявляет комплексное воздействие, угнетая рост обеих групп эубактерий. Подобранные концентрации антибиотических агентов не оказывают отрицательного влияния на жизнедеятельность газоокисляющих родо-кокков.

Разработаны конкретные варианты селективных сред с добавками одного антибиотика (хлорамфеникола), либо комбинации двух антибиотиков (линкомицина и полимиксина или эритромицина и налидиксовой кислоты)(рис. 7).

Рис. 7. Селективные питательные среды для выделения пропан-окисляххцюс родококков. Контроль- минеральная среда без антибиотиков; N1- минеральная среда с хлорамфениколом (20 мкг/мл); N2- минеральная среда с линкомицином (90 мкг/мл) и полимик-сином (100 Ед/мл) ; N3- минеральная среда с эритромицином (2.5 мкг/мл) и налидиксовой кислотой (20 мкг/мл).

Контроль

N1

N2

N3

Предложенные варианты селективных сред, характеризуются высокими значениями селективного индекса (85-98%), отражающего способность среды подавлять развитие нежелательной сопутствующей микрофлоры. При этом, количество изолированных родококков остается высоким, а в случае хлорамфеникола превышает контрольные показатели в 1.5-2 раза. Разработанные селективные среды могут быть использованы в экологических исследованиях пропанокисляющих родококков и при культивировании их смешанных популяций в нестерильных полупромышленных условиях.

ВЫВОДЫ

1. Исследована чувствительность 170 штаммов родококков из Региональной профилированной „коллекции алканотрофных микроорганизмов и 29 природных изолятов из нефтепромысловых районов Пермской области к 34 антибиотическим веществам различной природы и механизма действия.

2. Показана возможность использования анализа антибиоти-кочувствительности бактерий рода Rhodococcus в качестве дополнительного критерия при определении видовой принадлежности родококков. Информативная ценность данных антибиотикотипирования подтверждена результатами генетического анализа 105 штаммов родококков с использованием видаспецифической полимеразной цепной реакции.

3. С помощью кластерного анализа подтверждено близкое родство R."longus" и R.opacus, R.rhodochrous и R.ruber, обособленность R.rhodnii и R.equi от других видов родококков и гетерогенность исследуемых штаммов R.erythropolis.

4. Предложены дополнительные диагностические критерии для дифференциации близкородственных видов: R.rhodochrous и R.ruber - тест на чувствительность к ампициллину, олеандомици-ну, фузидину, эритромицину; R."longus" и R.opacus - тест на чувствительность к доксициклину, канамицину, полимиксину, фузидину , хлорамфениколу.

5. Выявлена высокая резистентность родококков в условиях углеводородного питания к олеандомицину, линкомицину, оксацил-лину и резкое снижение чувствительности к гентамицину, неомици-ну, эритромицину, хлорамфениколу.

6. Установлено, что антибиотикоустойчивость родококков, культивируемых на н-алканах, коррелирует с повышенным содержанием (до 14-28 %) суммарных клеточных липидов, насыщенных прямоцепочечных жирных кислот (С^о, Ci8:o, С21:о) и присутствием в составе фосфолипидов кардиолипина и фосфатидилглицерина.

7. Показано, что внутриклеточный механизм антибиотикоре-зистентности алканотрофных родококков связан с 3-5 кратным увеличением окислительной активности неспецифических ферментных систем. В экспериментах с я-гексадеканом в условиях соокисления выявлена интенсивная деструкция линкомицина и частичная трансформация и инактивация олеандомицина.

8. Для эффективного выделения алканотрофных родококков из природных образцов разработаны селективные питательные среды. с добавлением одного или двух антибиотиков: хлорамфеникола - 20 мкг/мл; линкомицина - 90 мкг/мл и полимиксина - 100 Ед/мл; эритромицина - 2.5 мкг/мл и налидиксовой кислоты - 20 мкг/мл, подавляющих развитие сопутствующих микроорганизмов. Данные среды характеризуются высокими значениями селективного индекса (85-98 %) и рекомендуются к использованию в экологических исследованиях газоокисляющих родококков и при культивировании их в нестерильных производственных условиях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ившина И.Б., Каменских Т.Н., Куюкина И.С., Рычкова М.И., Шадрин O.A., Рыбалка Л.В., Зверева Л.В., Чумаков О.Б. Методы консервации культур Rhodococcus spp. и их применение в практике поддержания специализированного фонда алканотрофных родококков/ /Микробиология. - 1994 - Т. 63. - Вып. 1. - С. 118-128.

2. Куюкина М.С. Своеобразие физиологических свойств бактерий рода Rhodococcus, ассимилирующих газообразные и жидкие н-алка-ны//Механизмы поддержания биологического разнообразия: Матер, конф. Екатеринбург: Изд-во Екатеринбург, 1995. - С. 86-87.

3. Kuyukina M.S. Selective isolation of subsurface alkanotro-phic Rhodococcus species using antibiotics//Inter. Symposium on Subsurface Microbiology. - ISSM'93: Abstr. Bath, UK, 1993. - H-26.

4. Ившина И.Б., Каменских Т.Н., Куюкина М.С., Еловикова Е.А., Ляпунов Я.Э. Региональная профилированная коллекция алканотрофных микроорганизмов как хранилище специализированного генофонда и источник штаммов, перспективных для биотехнологии и защиты

окружающей среды//Перспективы развития естественных наук на Западном Урале: Матер. Междунар. науч. конф., Пермь: Изд-во Пермского университета, 1996. - Т. 2. - С. 152-154.

5. Ившина И.Б., Каменских Т.Н., Куюкина М.С., Ляпунов Я.Э. Региональная профилированная коллекция алканотрофных микроорганизмов //Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы: Тез. докл. Мездун. конф., Пермь, 8-11 октября 1996. - Пермь, 1996. - С. 38.

6. Куюкина М.С. Антибиотикорезистентность бактерий рода Rhodococcus в условиях алканотрофии//Актуальные проблемы биологии: Тез. докл. IV Молодежной науч. конф, Сыктывкар, 11-12 апреля 1996. - Сыктывкар, 1996. - С. 70-71.

7. Куюкина М.С., Ившина И.Б., Ляпунов Н.Э., Белл К.С., Филп Д.К., Кристофи Н. Показатель антибиотикочувствительности как дополнительный критерий видовой дифференциации алканотрофных микроорганизмов//Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы: Тез. докл. Междун. конф., Пермь, 8-11 октября 1996. - Пермь, 1996. - С. 57.

8. Bell, K.S. Kuyukina, M.S., Christof!, N., Ivshina, I.B., Philp, J.C., and Aw, D.W.J. Identification of bacteria of the genus Rhodococcus by speciefic DNA amplification//Microbial diversity: current situation, conservation strategy, and ecological aspects (ICOMID'96): Intern. Conf, Perm, Russia, 8-11 October, 1996. Abst. - Perm, 1996. - P.151-152.

9. Ившина И.Б., Куюкина М.С. Селективное выделение пропанокис-ляюших родококков с использованием антибиотических веществ// Микробиология. - 1997 - Т. 67, № 4. - z,.

10. Ившина И.Б., Куюкина М.С. Способ селективной изоляции про-панокисляющих родококков. Заявка на патент 96124751 от 30.12.1996. Получено положительное ВНИИГПЭ от 10.07.97 на выдачу патента.