Биодеградация нефтяных углеводородов иммобилизованными родококками в колоночном биореакторе

Серебренникова, Марина Константиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биодеградация нефтяных углеводородов иммобилизованными родококками в колоночном биореакторе
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биодеградация нефтяных углеводородов иммобилизованными родококками в колоночном биореакторе"

На правах рукопщ

Ы/. (Фт

СЕРЕБРЕННИКОВА Марина Константиновна

БИОДЕГРАДАЦИЯ НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ РОДОКОККАМИ В КОЛОНОЧНОМ БИОРЕАКТОРЕ

03.02.03 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О 3 АПР 2014

Пермь-2014

005546713

Работа выполнена в лаборатории алканотрофных микроорганизмов ФГБУН Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научный руководитель:

доктор биологических наук Куюкина Мария Станиславовна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии химико-биологического факультета ФГБОУ ВПО «Оренбургского государственного университета» Дерябин Дмитрий Геннадьевич

кандидат биологических наук, научный сотрудник отдела инновационной деятельности Филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» Петровских Валентина Петровна

Ведущая организация:

Казанский (Приволжский) федеральный университет (420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18).

Защита диссертации состоится «,/£>» апреля 2014 г. в /О часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс:(342)2809211.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭГМ УрО РАН и на сайте ИЭГМ УрО РАН (http://www.iegm.ru).

Автореферат разослан «_//_» ом^^и^-тЯ.—2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Развитие нефтяной промышленности приводит к загрязнению окружающей среды нефтепродуктами, а также увеличению объема нефтесодержащих сточных вод. В связи с этим, важным направлением экологической биотехнологии является разработка эффективных и безопасных способов очистки нефтезагрязненных сред. Наиболее перспективными и экологически безопасными являются микробиологические методы, основанные на использовании углеводородокис-ляющих микроорганизмов, как правило, иммобилизованных на твердых носителях. Данный подход предусматривает (1) сорбцию нефтяных углеводородов материалом носителя и (2) их эффективное окисление иммобилизованными микробными клетками (Жукова, Морозов, 2010; Рымовская, Ручай, 2008; Junter et al., 2002; Martins et al., 2012). Поскольку при иммобилизации решается проблема отделения биомассы от жидкой фазы, это позволяет перейти от периодических схем очистки воды к более производительным непрерывным технологиям, предусматривающим использование проточных биореакторов (Сироткин и др., 2007; Doaa, Wafaa, 2009).

Сегодня широкое применение в очистке загрязненных сточных вод получили колоночные биореакторы с псевдоожиженным слоем (fluidized-bed), заполненные дисперсным носителем с иммобилизованной микрофлорой, через который циркулирует восходящий поток жидкости (Vahlberg et al., 2002; Mccarty, Meyer, 2005). Использование реакторов такого типа позволяет (1) осуществлять процессы в небольших по размеру конструкциях; (2) обеспечивать равномерное распределение загрязненной жидкости между поддерживаемыми во взвешенном состоянии частицами носителя, что повышает биодоступность углеводородов для закрепленных клеток; (3) создавать оптимальные условия для адаптации микроорганизмов к органическим загрязнителям и другим факторам (Касаткин, 1973; Махлин, 2009; Shieh, Keenan, 1986; Soko'í, Korpal, 2006).

Биотехнологически перспективной группой микроорганизмов, используемой для очистки нефтезагрязненных сред, являются актинобактерии рода Rhodococcus. Обладая широким спектром метаболических возможностей и уникальными ферментными комплексами, родококки являются активными биодеструкторами токсичных и труднодоступных для многих микроорганизмов углеводородов (алифатических, ароматических, поли- и гетероциклических) и их производных (гербицидов, полихлорированных бифенилов, фармполлютантов, фенолов, эстрогенов) (Bell et al., 1998; Yoshimoto et al., 2004; Martínková et al., 2009; Ivshina et al., 2012). Биотехнологические преимущества родококков обусловлены такими их биологическими особенностями как типично бактериальный рост и сложный морфогенетический цикл развития, способность ассимилировать гидрофобные субстраты и синтезировать поверхностно-активные вещества (биосурфактанты), а также устойчивая активность в экстремальных условиях среды (Ившина и др., 2007; Prieto et al., 2002; Kuyukina, Ivshina, 2010). В последнее время для расширения спектра окисляемых в процессах биоремедиации нефтяных углеводородов все чаще используются природные или искусственные ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов, отличающихся по спектру потребляемых субстратов (Жуков и др., 2007; Prieto et al., 2002; Ghazali et al., 2004; Mikesková et al., 2012). При подборе бактериальных ассоциаций необходимо учитывать антагонистическую активность штаммов, их устойчивость к солям тяжелых металлов и токсикантам, а также функциональную стабильность в экстремальных условиях среды. Возможность использования ассоциации на основе коиммобилизованных родококков для очистки нефтезагрязненных сточных вод в биореакторе до настоящего времени не исследовалась.

Цель настоящей работы - изучение процесса иммобилизации родококков на твердых носителях в колоночном биореакторе и оптимизация условий биодеградации нефтяных углеводородов.

Основные задачи исследования:

1. Подобрать оптимальные условия иммобилизации клеток родококков на органических носителях в колоночном биореакторе.

2. Изучить жизнеспособность и функциональную стабильность коиммобилизованных родококков в процессе очистки нефтезагрязненной воды.

3. Исследовать влияние процесса адаптации родококков к повышенным концентрациям углеводородов на физико-химические свойства клеток.

4. Оценить возможность многократного использования иммобилизованной ассоциации родококков для очистки промышленных сточных вод в биореакторе.

Научная новизна. Впервые для биодеградации нефтяных углеводородов в колоночном биореакторе с псевдоожиженным слоем использована ассоциация алканотрофных родококков R. ruber и R. opacus, закрепленных на гидрофобизованных хвойных опилках. Экспериментально определены гидродинамические условия (1,2 и 2,0 мл/мин) в биореакторе, при которых происходит псевдоожижение частиц носителя. На основе математического моделирования подобран оптимальный скоростной режим (2,0 мл/мин) иммобилизации родококков на опилках, при котором происходит прочное закрепление клеток и достигается высокая (1,7 х 107 клеток/г носителя) концентрация биомассы в реакторе. Установлено, что родококки, адаптированные к повышенным концентрациям нефтезагрязнителей, характеризуются гидрофобной клеточной стенкой, обусловленной высоким содержанием клеточных липидов, и повышенным синтезом биосурфактантов. Выявлена прямая зависимость (R = 0,98; р < 0,05) между показателем гидрофобности клеточной стенки родококков и их электрокинетическим потенциалом. Показано, что адаптация к углеводородам в биореакторе сопровождается увеличением антибиотикоустойчивости бактериальной популяции и изменением плазмидного профиля. Так, из клеток адаптированного R. ruber выделена плазмида размером около 15 т.п.н., не выявляемая с помощью экстракционного метода в исходном штамме.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представления о процессе биодеградации углеводородных загрязнителей иммобилизованными микроорганизмами в условиях биореактора. Показано, что коиммобилизованные клетки R. ruber и R. opacus могут быть использованы для очистки загрязненной нефтяными углеводородами воды в колоночном биореакторе с псевдоожиженным слоем. При этом оценена возможность оптимизации процесса деградации нефтяных углеводородов ассоциацией коиммобилизованных родококков путем подбора оптимальной скорости подачи загрязненной воды в биореактор и адаптации бактериальных культур к углеводородам. Установлено, что в процессе очистки формируется устойчивая к высоким концентрациям нефтепродуктов ассоциация иммобилизованных бактерий, способная сохранять метаболическую активность при попадании в биореактор высококонцентрированных промышленных стоков. Разработан комбинированный метод видовой дифференциации и количественной детекции жизнеспособных родококков, входящих в состав иммобилизованной ассоциации, который может применяться для мониторинга функциональной активности биокатализаторов. Показана возможность многократного использования иммобилизованных на модифицированных опилках родококков в биотехнологическом процессе очистки нефтезагрязненной воды.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Процесс иммобилизации родококков на твердых носителях целесообразно проводить в биореакторе с псевдоожиженным слоем при оптимальной скорости подачи клеточной суспензии.

2. Ассоциация коиммобилизованных R. ruber и R. opacits эффективно удаляет нефтяные углеводороды из загрязненной воды.

3. Адаптация родококков к повышенным концентрациям нефтяных углеводородов в биореакторе сопровождается изменением их физико-химических свойств и возрастанием антибиотикоустойчивости.

4. Применение иммобилизованных на опилках адаптированных родококков эффективно для очистки промышленных нефтесодержащих сточных вод в биореакторе.

Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований доложены и обсуждены на XVI и XVII Всероссийских школах-конференциях молодых ученых и студентов «Математическое моделирование в естественных науках», Пермь, 2007 и 2008; II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2009», Пермь, 2009; The XIII Annual Symposium for Biology Students of Europe, Kazan, 2009; III Всероссийском конгрессе с международным участием студентов и аспирантов биологов «Симбиоз-Россия 2010», Н.Новгород, 2010; 3-ем Байкальском Микробиологическом Симпозиуме с международным участием, Иркутск, 2011; I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии», Пермь, 2011; Environmental Microbiology & Biotechnology (ЕМВ2012), Болонья, Италия, 2012; VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», Саратов, 2012; 17-ой международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2013.

По теме диссертации опубликовано 21 печатная работа, из них 8 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура работы. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и 30 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 221 наименование, в том числе 87 на русском и 134 на английском языках.

Связь работы с крупными программами и собственный вклад автора. Работа выполнена в лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований по теме «Изучение и сохранение функционального и видового разнообразия алканотрофных родококков in/ex situ, полезного для экзоценозов и практической деятельности человека» (номер госрегистрации 01.9.70 005279), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (соглашение № 8793). Исследования поддержаны грантом Российского фонда фундаментальных исследований (11-04-96045-р_урал_а), Президента РФ «Ведущие научные школы» № НШ-5589.2012.4 и Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (12-П-4-1052).

Личный вклад автора состоял в планировании и проведении экспериментов, критическом анализе полученных результатов. Автор принимал участие в подготовке результатов работы к публикации и их представлении на научных конференциях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Рабочая коллекция, условия культивирования родококков. В работе использовали штаммы Rhodococcus opacus ИЭГМ 249 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 231, ИЭГМ 615 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекции культур 768; www.iegm.ru/iegmcol/strains). Бактериальные культуры выращивали в мясопептонном бульоне (МПБ) или жидкой минеральной среде RS (Catalogue of strains, 2008) с добавлением в качестве источника углерода и энергии н-гексадекана (3 об.%) либо модельной нефти (2 об.%) в условиях перемешивания на орбитальном шейкере (160 об/мин) или микропланшетном шейкере-инкубаторе Titramax 1000 (Heidolph-Instruments, Германия) при 28°С, 160 об/мин в течение 1-7 сут.

Исследование кинетики процесса иммобилизации родококков в биореакторе с перемешиванием и колоночного типа. В качестве носителя для иммобилизации родококков использовали гидрофобизованные хвойные опилки (Podorozhko el al., 2008) и макропористый криогель на основе поливинилового спирта (ПВС) производства ОАО «Невинномысский Азот» (Невинномысск). Адсорбцию бактерий на опилках проводили в 250-мл колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл бактериальной суспензии (2,0 х 107 кл/мл) и 2 г носителя, на орбитальной шейкере при 60; 110; 160 и 210 об./мин (модель биореактора с перемешиванием), а также в лабораторном колоночном биореакторе, заполненном 2 г модифицированных опилок, представляющем собой замкнутую циркулирующую систему. Суспензию родококков (2,0 х 107 кл/мл; 200 мл) подавали в колоночный реактор с помощью перистальтического насоса со скоростью 0,6; 1,2; 2,0 или 2,8 мл/мин в течение 7 сут. Процесс адсорбции контролировали по изменению показателя оптической плотности (ОГГбоонм) клеточной суспензии с помощью двулучевого спектрофотометра Lambda EZ201 (Perkin Elmer, США). Иммобилизацию родококков в криогеле ПВС проводили согласно методике, описанной Kuyukina с соавт. (2006). Число жизнеспособных иммобилизованных клеток родококков определяли модифицированным методом специфического окрашивания йодонитротеразолием хлоридом (ИНТ) как описано ниже. Математическое моделирование иммобилизационного процесса в зависимости от скорости подачи бактериальной суспензии в биореактор выполнено на базе кафедры теоретической механики Пермского национального исследовательского политехнического университета (зав. кафедрой, д.т.н., профессор Ю.И. Няшин).

Изучение способности бактериальных культур усваивать нефтяные углеводороды. Способность исследуемых штаммов R. ruber и R. opacus расти в присутствии различных концентраций углеводородов изучали в 96-луночных полистирольных микропланшетах методом микроразведений в минеральной среде RS. В качестве единственного источника углерода использовали индивидуальные н-алканы (декан, ундекан, додекан, тетрадекан, гексадекан), пристан, ароматические (фенол) и полиароматические (нафталин, фенантрен и антрацен) углеводороды, а также модельную нефть. Закрытые парафиновой пленкой планшеты инкубировали на микропланшетном шейкере-инкубаторе Titramax 1000 (Heidolph-lnstruments, Германия) при 28°С, 160 об./мин в течение 7 сут. После окончания инкубации в лунки добавляли 50 мкл 0,2% раствора ИНТ для определения числа жизнеспособных клеток (Wrenn, Venosa, 1996). При этом оптическую плотность окрашенных ИНТ культур определяли с помощью микропланшетного фотометра Multiskan Ascent (Thermo Electron

Corporation, Финляндия) при 630 нм с программным обеспечением Ascent Software v. 2,6. (Thermo Labsystems, Финляндия).

Очистка нефтезагрязненной воды коиммобилизованными родококками в биореакторе с псевдоожиженным слоем. Углеводородокисляющую активность родококков оценивали в экспериментах по очистке модельной и промышленной нефтезагрязненной воды. Модельную нефтезагрязненную воду готовили на основе среды RS с добавлением углеводородов: //-декан, //-ундекан, //-додекан, //-тетрадекан, н-гексадекан, м-гептадекан и н-нонадекан - 12 об.%, пристан - 10 об.%, нафталин, фенантрен и антрацен - 2 об.% (Kuyukina et al., 2009). Используемая в экспериментах промышленная сточная вода получена из Пермского филиала ООО «Буровая компания «Евразия». Образующаяся после завершения промывки бурового оборудования сточная вода, загрязненная углеводородами в концентрации 3,9 г/л, содержит нормальные (52%) и разветвленные алканы (36%), азотсодержащие соединения (9%) и фенол (3%), а также тяжелые металлы (Со, Cr, Mn, Zn, Mo и др.) в концентрации от 0,01 до 2,4 мг/л. Для формирования псевдоожиженного слоя нефтезагрязненную воду пропускали через биореактор, заполненный коиммобилизованными на древесных опилках клетками R. ruber и R. opacus (1:1), со скоростью 0,6; 1,2 и 2,0 мл/мин при 28°С в течение трех недель. Все эксперименты проводили параллельно в трех одинаковых колонках, в качестве контроля использовали неинокулированный носитель. Возможность многократного использования иммобилизованных на опилках родококков для очистки новой порции нефтезагрязненной воды изучали после промывания биокатализатора натрий-фосфатным буфером (2,0 мл/мин, 2 ч).

Содержание алифатических углеводородов в образцах из биореактора определяли после экстракции хлороформом с использованием газового хроматографа Agilent 6890N, снабженного масс-спектрометрическим детектором Agilent MSD 5973N (Agilent Technologies, США) и кварцевой колонкой НР-5 MS SN US 1518974-1. Полиароматические углеводороды анализировали с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа LC Prominence (Shimadzu, Япония), оборудованного колонкой с обращено-фазовым сорбентом Discovery С18® и ультрафиолетовым детектором RF-10A XL. Содержание тяжелых металлов определяли методом атомно-эмиссионной спектроскопии в аналитической лаборатории Центра SETN университета Статклайд (Великобритания) с использованием спектрометра с индуктивно-связанной плазмой (Thermo Scientific iCAP 6200 Duo View ICP Spectrometer, Thermo Fisher Scientific, Cambridge, UK).

Определение физико-химических свойств клеток родококков. Морфологию клеточной поверхности родококков изучали с помощью атомно-силового микроскопа (ACM) Asylum MFP-3D-BIO (Asylum Research, США) в полуконтактном режиме на воздухе с использованием кремниевого кантилевера AC240TS с резонансной частотой 50-90 кГц и константой жесткости 0,5-4,4 Н/м на базе Rhodococcus-центра Пермского государственного национального исследовательского университета. Обработку АСМ-изображения проводили с использованием программы Igor Pro 6.22А (WaveMetrics, США).

Гидрофобность клеточной стенки родококков определяли с помощью МАТН-теста (Microbial Adhesion to Hydrocarbons - Микробная адгезия к углеводородам) по модифицированной методике (Kuyukina et al., 2009). Адгезивную активность (%) в отношении модельной нефти рассчитывали по формуле: [1 - (Л/Ао)1х 100, где А - оптическая плотность суспензии клеток после смешивания с углеводородам, Ао- оптическая плотность исходной суспензии.

Электрокинетический потенциал клеток родококков регистрировали методом динамического светорассеяния с использованием анализатора ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments, Великобритания) с программным обеспечением Malvern Zetasizer v. 2.2 (Malvern Instruments, Великобритания). Для этого предварительно выращенные в МПБ до стационарной фазы роста исходные и адаптированные к углеводородам клетки отмывали и ресуспендировали в 0,1 М KNO3 (pH 7,0) до достижения ОПбоонм 0,15-0,2 (спектрофотометр Lambda EZ 201, Perkin Elmer, США).

Для определения эмульгирующей активности родококков в отношении н-гексадекана использовали модифицированный метод пробирочной микропробы (Коронелли, Юферова, 1990). Индекс эмульгирования (%) рассчитывали по формуле: Е= (Н/Но)х100, где Н - величина эмульсионного слоя, Но - общая высота столба жидкости в пробирке. Суммарные клеточные липиды определяли гравиметрически после хлороформ-метанольной экстракции по методике М. Кейтса (1975).

Изучение чувствительности исследуемых бактериальных культур к антибиотикам проводили диско-диффузионным методом на мясопептонном агаре (МПА) с использованием стандартных индикаторных дисков, пропитанных растворами антибиотических веществ. Степень чувствительности культур к антибиотикам определяли по диаметру зоны (в мм) отсутствия бактериального роста вокруг соответствующего диска с антибиотиком. При этом микроорганизмы, образующие при действии антибиотиков зоны задержки роста свыше 25 мм, относили к высокочувствительным, от 16 до 25 мм - к чувствительным, от 11 до 15 мм -к малочувствительным, если зона задержки роста была менее 10 мм или отсутствовала вообще - к устойчивым (Методические указания..., 1983). Коэффициент резистентности (К) рассчитывали как отношение числа антибиотиков, к которым исследуемый штамм устойчив, к общему числу исследуемых антибиотиков (Коронелли, Юферова, 1990).

Определение жизнеспособности и функциональной стабильности иммобилизованных клеток. Число жизнеспособных клеток родококков определяли модифицированным методом окрашивания ИНТ (Wrenn, Venosa, 1996). После появления специфического красно-фиолетового окрашивания формазана, образуемого в присутствии активно респирирующих бактерий, измеряли ОПбзонм культуры. Для определения жизнеспособности иммобилизованных клеток формазан экстрагировали из носителя 96%-ьтм этанолом и, после инкубации на шейкере (150 об./мин, 120 мин), измеряли ОШво™ экстракта. Число жизнеспособных родококков определяли с помощью калибровочного графика зависимости между показателем ОП480нм и числом жизнеспособных клеток в суспензии, определенным методом высева на МПА.

Функциональную стабильность используемых в ходе очистки нефтезагрязненной воды иммобилизованных родококков исследовали с использованием автоматизированного 6-канального респирометра замкнутого цикла Micro-Oxymax® (Columbus, США). При этом оценивали скорость дыхания (мкл/мин) и общее количество (мкл) потребленного кислорода и выделенного углекислого газа в присутствии модельной нефти. Измерения проводили при температуре 28±1°С каждые 42 минуты.

Генетический анализ бактериальных штаммов. Выделение ДНК из иммобилизованных клеток родококков проводили с помощью коммерческого набора Soil Microbe DNA Kit™ (Zymo Research, США) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенную ДНК использовали для проведения ПЦР с наборами видоспецифических праймеров для R. ruber и R. opacus в амплификаторе MyCycler (BioRad, США). При этом соблюдали условия постановки ПЦР для конкретного набора

праймеров (Bell et al., 1999). Плазмидную ДНК (пДНК) выделяли с использованием коммерческого набора Zyppy™ Plasmid Miniprep Kit (Zymo Research, США) согласно протоколу от производителя. Продукты ПЦР анализировали при помощи электрофореза в 0,8 и 1,5%-ном агарозном геле (ApplyChem, Германия) с последующим окрашиванием в растворе (0,5 мкг/мл) бромистого этидия (Sambrook et al., 1989). После появления соответствующих полосок в УФ-свете определяли видовое положение иммобилизованных бактерий или наличие пДНК.

Статистическая обработка результатов. Все эксперименты проводили в 3-6-кратной повторности. Обработку полученных данных осуществляли с использованием программы Excel 2007 (Microsoft Inc., 1999), рассчитывая среднее арифметическое, стандартное отклонение, доверительный интервал. Связь между переменными определяли с помощью коэффициента корреляции Пирсона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Подбор носителя для иммобилизации клеток родококков. Иммобилизацию ассоциации клеток R. ruber и R. opacus осуществляли (1) адсорбционным методом на поверхности модифицированных хвойных опилок и (2) путем включения в матрицу криогеля ПВС. Как видно из табл. 1, высокая удельная площадь поверхности опилок позволяет адсорбировать в 6 раз больше бактериальных клеток по сравнению с плотным криогелем ПВС. Однако, следует отметить, что в пересчете на объемные единицы носителя количество иммобилизованных клеток родококков сопоставимо для модифицированных опилок и криогеля ПВС (1,9 х 10б и 1,7 х 10® кл/см3 соответственно). При этом углеводородокисляющая активность адсорбированных на опилках родококков в отношении н-гексадекана и модельной нефти на 18-88% выше соответствующих показателей для криоиммобилизованных клеток.

Таблица 1.

Физико-химические и технологические свойства биокатализаторов на основе иммобилизованных родококков

Параметр Носитель для иммобилизации

модифицированные хвойные опилки криогель ПВС

Размер частиц, мм3 3-5 5

Плотность носителя, г/см3 0,11 0,9

Механическая прочность средняя высокая

Сорбция углеводородов, об.% 25,3 ± 2,0 5,0 ± 0,3

Количество клеток на г носителя 1,7 х 107 1,9 х 106

Каталитическая активность в отношении //-гексадекана, мг окисленного субстрата/(л ч) на 106 клеток 23,4 ± 1,9 19,3 ± 1,2

Каталитическая активность в отношении модельной нефти, мг окисленного субстрата/(л ч) на 10б клеток 7,2 ± 1,5 0,9 ± 0,03

Число рабочих циклов с сохранением функциональной эффективности 3-4 2-3

Об эффективном окислении нефтяных углеводородов родококками, закрепленными на целлюлозосодержащем носителе, свидетельствовали высокие показатели дыхательной активности бактерий в присутствии модельной нефти, которые в 2 раза превышали таковые для клеток, включенных в криоПВС (рис. I).

Рис. 1. Скорость дыхания иммобилизованных на хвойных опилках (1,4) и в гранулах криоПВС (2,3) родококков в присутствии модельной нефти.

Количество иммобилизованных клеток па опилках и в гранулах криоПВС одинаково.

Деструктирующий потенциал иммобилизованных на опилках родококков сохранялся в течение 3-4 операционных циклов, тогда как функциональная активность иммобилизованного биокатализатора на основе ПВС снижалась после 2-3-кратного использования (см. табл. 1). Немаловажным фактором, определяющим выбор хвойных опилок в качестве адсорбента для иммобилизации нефтеокисляющих бактерий, является относительная дешевизна и доступность данного материала на территории России. Следует отметить, что синтетический носитель на основе криогеля ПВС целесообразно использовать в биотехнологических процессах получения целевых соединений, тогда как природный древесный носитель - для очистки загрязненных сточных вод (Саз51ёу е? а/., 1996; Ьогшэку еГ а/., 2003)

Динамика процесса иммобилизации родококков в биореакторе с перемешиванием и колоночного типа. Как видно из рис. 2, динамика процесса иммобилизации родококков на опилках зависит от типа биореактора (колоночного или с перемешиванием) и гидродинамических условий. Так, закрепление клеток на органическом носителе в условиях колоночного биореактора наиболее интенсивно происходило в течение первых 48 ч, в результате чего адсорбировалось от 18 до 44% родококков (рис 2, А). Следует отметить, что с течением времени при скорости подачи суспензии 1,2 и 2,0 мл/мин наблюдалось постепенное снижение интенсивности адсорбции клеток на опилках и стабилизация показателя ОПбоопм на уровне 0,5-0,7. Вероятно, это обусловлено формированием псевдоожиженного слоя, обеспечивающего равномерную монослойную адсорбцию клеток родококков, а также насыщением центров связывания носителя с бактериальными клетками (Коваленко и др., 1999; Куюкина и др., 2007). При этом в биореакторе с перемешиванием процесс иммобилизации характеризовался сравнительно равномерным снижением показателя ОПбоонм в течение первых 48 ч, в ходе чего сорбировалось 22-35% родококков (рис 2, Б). После 72 ч процесс иммобилизации при скорости перемешивания 60 и 110 об./мин характеризовался постепенным снижением интенсивности, тогда как при более высоких (160 и 210 об./мин) скоростях максимальная (66 и 75% соответственно) сорбция клеток на носителе отмечалась после 7 сут эксперимента. Однако следует отметить, что проведение процесса иммобилизации при высокоскоростных режимах перемешивания приводит к значительными энергетическими затратами. Кроме того, при высокой скорости перемешивания (110-210 об./мин) и подачи суспензии (0,6 и 2,8 мл/мин) в био-

реактор зарегистрировано некоторое увеличение показателя ОПбоонм, которое вызвано (1) десорбцией иммобилизованных клеток, (2) механическим истиранием материала носителя, (3) биологическим процессом фрагментации клеточного мицелия родококков (Ившина и др., 2007).

Мрсми. ■

() 20 22 24 4Н 12 % [24 144 11.К Время, ч

Рис. 2. Динамика процесса иммобилизации родококков на хвойных опилках в биореакторе колоночного типа (А) и с перемешиванием (Б) при различных гидродинамических условиях.

Показано, что повторное использование хвойных опилок для иммобилизации алканотрофных родококков в биореакторе приводит к сокращению продолжительности им мобилизационного процесса от 7 до 2 сут при увеличении степени иммобилизации родококков в 1,5 раза (рис. 3). Выявленное повышение адсорбционной емкости носителя, по-видимому, связано с «разрыхлением» поверхности опилок при длительном контакте с водой, приводящим к увеличению доступной для иммобилизации площади носителя.

Рис. 3. Динамика процесса иммобилизации родококков

в колоночном биореакторс на нативных ( ■) и повторно (□) исиолыуемых опилках. Скорость подачи клеточной суспензии в биореактор - 2 мл/мин.

В[)СМЯ, сут

В результате математического моделирования адсорбционного процесса получена теоретическая формула:

1 + /¡(V,)/

где Ил - изменение концентрации свободных клеток со временем (/); пх0 - концентрация свободных клеток в начальный момент времени; 7](у) среднее время иммобилизации клетки на частице носителя; Та (V) - среднее время десорбции клетки от частицы носителя; К(у) - кратность распада клеточного мицелия; V - скорость движения суспензии в биореакторе; 7/- характерное время распада мицелия.

С помощью построенной модели рассчитаны значения Т, и Т^ и определена величина р - вероятность иммобилизации клетки на носителе (табл. 2).

Таблица 2.

Математически рассчитанные параметры процесса иммобилизации родококков на хвойных опилках в биореакторах различного типа

Колоночный биореактор Биореактор с перемешиванием

V, мл/ мин Т:, ч Т„,ч К р с/,% м, об./ мин Та, ч К Р

0,6 49 40 1,0 1,8-10"4 49 60 130 350 1,6 2,1 10"7 61

1,2 210 140 1,0 2,1-Ю"5 35 110 280 ОО 1,0 2,8-10"8 55

2,0 73 73 1,0 3,5-10"5 55 160 150 4400 1,2 3,0 Ш"8 66

2,8 41 53 1,0 4,5-10"5 24 210 46 1000 3,6 6,8 10"8 75

Из рис. 4 видно, что теоретические рассчитанные зависимости показателя ОПйоонм от времени качественно совпадают с экспериментальными данными. Следовательно, разработанная модель адекватно описывает основные черты протекания иммобилизационного процесса в биореакторе и может быть использована при его масштабировании.

(1,9 -0.8

| о-7 Н

0.6 0.5 0.4

0,9 0,8 I 0.7 0.« -0,5 0.4

40 60 80 100 Время, ч

20 140 16(1

Рис. 4. Экспериментальные (точки) и теоретические (линии) зависимости процесса иммобилизации клеток родококков в колоночном биореакторе от скорости подачи суспензии: (о) - 0,6; (0) - 1,2; (+) - 2,0; (о) - 2,8 мл/мин.

Установлено, что гидродинамические условия оказывают влияние на степень иммобилизации клеток на носителе (сГ). Так в биореакторе с перемешиванием величина с1 достигала максимального (75%) значения при скорости 210 об./мин, тогда как в биореакторе колоночного типа соответствующий показатель (¿/=55%) регистрировался при скорости подачи суспензии 2,0 мл/мин. Следует отметить, что наиболее оптимальные условия иммобилизационного процесса (наименьшая Т,, соответствующая максимальной с/; динамическое равновесие между Г, и Т,1 при высокой р) создавались в колоночном биореакторе при скорости подачи клеточной суспензии, равной 2,0 мл/мин (см. табл. 2). Кроме того, использование реактора колоночного типа позволяет проводить процессы иммобилизации бактерий и очистки загрязненной воды в непрерывном режиме (Сироткин и др., 2007; Ооаа, \Vafaa, 2009).

Биодеградация нефтяных углеводородов ассоциацией коиммобилизованных родококков в колоночном биореакторе. Как видно из рис. 5, эффективность биологической очистки модельной нефтезагрязненной воды зависит от гидродинамического режима биореактора. Так, увеличение скорости подачи воды

от 0,6 до 2,0 мл/мин способствовало возрастанию степени биодеградации углеводородов от 72 до 86%. При этом максимальная интенсивность биодеградации н-алканов (90%) и пристана (67%) отмечалась при скорости 2,0 мл/мин, что на 7-16% выше соответствующих показателей для более низких скоростей (рис. 6). Выявленный факт объясняется тем, что при высокоскоростном (1,2-2,0 мл/мин) режиме работы биореактора формируется псевдоожиженный слой, который обеспечивает равномерное распределение загрязненной воды между взвешенными частицами носителя, повышая доступность углеводородов и растворенного кислорода для адсорбированных родококков (Sharma, Pant, 2001; Rajasimman, Karthikeyan, 2009). В то же время, степень деградации полиароматических углеводородов (ПАУ) при изменении скорости циркулирования воды через биореактор существенно не изменялась (рис. 6).

Пн-алканы □ разветвленные алканы И Г1ДУ

1.2

Скорость, мл/мин

4-1

ri- ll -г

Скорость, мл/мин

Рис. 5. Эффективность очистки модельной Рис. 6. Степень биодеградации нефтяных

нефтезагрязненной воды коиммобилизо- углеводородов в зависимости

ванными родококками в колоночном от скорости подачи нефтезагрязненной

биорсакторе. воды в биореактор.

Установлено, что повторное использование иммобилизованных на опилках R. ruber и R. opacus приводило к 22-26%-ному увеличению эффективности очистки модельной нефтезагрязненной воды в биореакторе (рис. 7). При этом наиболее интенсивно окислялись »-алканы (на 1-2% после каждого цикла) и пристан (на 16 и 5% после 2-го и 3-го цикла соответственно).

антрацен >; фенантрсн нафталин

пристан

Рис. 7. Сравнительное содержание остаточных углеводородов в воде после 1-го (I); 2-го (II) и 3-го (III) циклов обработки в биореакторе. Скорость подачи загрязненной воды в биореактор 2,0 мл/мин.

Время, недели

Повышенная эффективность очистки нефтезагрязненной воды, вероятно, обусловлена тем, что к концу первого цикла в биореакторе формировалась адаптированная к нефтяным углеводородам микробная популяция (Панов и др., 2004; Cuenca et al., 2006). Так, нами зарегистрировано почти двукратное сокращение продолжительности лаг-фазы роста адаптированных в реакторе клеток родококков в присутствии модельной нефти (рис. 8).

Рис. 8. Динамика роста ассоциации нативных (□) и адаптированных (■) в биореакторе клеток R. ruber и R. opticus в присутствии модельной нефти. Концентрация модельной нефти в воде - 3 об.%.

Время, ч

Следует отметить, что многократное использование иммобилизованных микроорганизмов для очистки промышленных сточных вод требует длительного поддержания их функциональной стабильности в условиях биореактора (Gomez, Lima, 2006). По данным респирометрии (рис. 9), иммобилизованные родококки поддерживали высокую скорость дыхания в присутствии модельной нефти на протяжении 3-х недель.

= 0,5 X

v'\

} -J.-- -" ... •* . - у •!

Рис. 9. Интенсивность дыхания иммобилизованных родококков в присутствии модельной нефти.

1 - скорость поглощения кислорода; 2 - скорость выделения углекислого газа.

0 I 2 Э 4 S 6 7 К 9 10 II 12 13 14 15 16 17 1В 19 20 Вркмо, сут

Более того, после очистки нефтезагрязненной воды в колоночном биореакторе суммарное потребление кислорода увеличивалось в 2,1, а выделение углекислого газа -в 2,3 раза (рис. 10). Очевидно, это обусловлено ростом бактерий в ходе потребления углеводородного субстрата в биореакторе и их последующей иммобилизацией на поверхности опилок.

Для оценки жизнеспособности и контроля функциональной стабильности иммобилизованных клеток R. ruber и R. opacus в биореакторе нами разработан комбинированный метод количественной детекции и видовой дифференциации родококков, входящих в состав бактериальной ассоциации. Суть метода в том, что первоначально путем окрашивания ИНТ и измерения оптической плотности экстракта формазана определяют число живых клеток родококков на носителе, а затем определяют видовую принадлежность бактерий путем постановки ПЦР с видоспецифи-

И Количество выделенного С02 И Количнство потребленного 02

■ Скорость выделения 002

■ Скорость потребления 02

ЮООО 2 «з

Рис. 10. Дыхательная активность иммобилизованных родококков после операционного цикла в биореакторе.

После цикла бподегралапни

ческими праймерами. Данный метод позволяет выделять ДНК из иммобилизованных на носителе бактериальных клеток, предварительно окрашенных ИНТ, даже после спиртовой экстракции образующегося формазана, и получении достоверных результатов видовой ПЦР-детекции. Из электрофореграммы на рис. 11 видно, что после трехнедельного цикла в биореакторе успешно детектировались оба штамма родококков, входящих в состав иммобилизованной ассоциации. Незначительное увеличение интенсивности окрашивания полос, характерных для R. ruber, по-видимому, обусловлено ростом данных бактерий в биореакторе (Рубцова, 2011; Ahn et ed., 2005), что согласуется с вышеприведенными результатами респирометрии (см. рис. 10).

1 2 3 4 5 6 7 М

500 п.н. 400 п.н. 300 п.н.

Рис. 11. Электрофоре! рамма в 1,5 % агарозном геле продуктов амплификации ДНК иммобилизованной ассоциации родококков с использованием видоспепифических праймеров. Обозначения: I - положительный контроль R. ruber ИЭГМ 70т; 2 - R. ruber нагивные; 3 - адаптированные клетки; 4 - положительный контроль R. opacus ИЭГМ 71 б1; 5 - R. opacus нативные; 6 - адаптированные клетки; 7 - отрицательный контроль; М — маркер молекулярного веса (AmpliSizeTM Molecular Ruler, Bio-Rad, США).

Из рис. 12 видно, что число жизнеспособных клеток R. ruber после контакта с нефтезагрязненной водой в биореакторе возрастало в 1,2 раза по сравнению с исходным показателем, тогда как количество иммобилизованных R. opacus существенно не изменялось. Таким образом, разработанный комбинированный метод пригоден для мониторинга функциональной активности штаммов микроорганизмов в составе иммобилизованного биокатализатора.

■ ■

m }

Рис. 12. Оценка жизнеспособности иммобилизованных родококков из биореактора методом

окрашивания ИНТ.

Обозначения: I - нативныс; II - адаптированные клетки.

R. opacus

Возможные механизмы адаптации родококков к углеводородным загрязнителям. Как видно из табл. 3 и 4, адаптация родококков в биореакторе способствовала 38-40%-ому повышению устойчивости исследуемых штаммов к нефтяным углеводородам. При этом оба адаптированных штамма интенсивнее росли в присутствии высоких (15-50 об.%) концентраций алифатических углеводородов (н-С11, «-С12, н-С14 и Н-С16), а также нафталина. После цикла в биореакторе клетки R. ruber и R. opacus демонстрировали более интенсивный рост в присутствии 15 об.% пристана, антрацена и фенантрена. Кроме того, адаптированный R. opacus интенсивнее накапливал биомассу в присутствии 3 об.% фенола, тогда как R. ruber был способен расти даже при 15-25 об.% фенола.

Из рис. 13 видно, что в процессе адаптации родококков к углеводородам архитектура клеточной поверхности изменяется в сторону увеличения степени ее шероховатости. Так, выявленное нами 26%-ное повышение шероховатости клеточной стенки, очевидно, приводит к возрастанию площади контакта с гидрофобным субстратом, что способствует его эффективному поглощению бактериальной клеткой (Norman et al., 2002; de Carvalho, 2010).

Рис. 13. АСМ-изображения (слева) и топография поверхности (справа) нативных (А) и адаптированных (Б) жизнеспособных клеток R. opacus ИЭГМ 249.

Таблица 3.

Интенсивность роста (АОПбзонм) нативных и адаптированных клеток R. ruber в присутствии нефтяных углеводородов

Углеводородный субстрат Концентрация углеводородов, об.%

3 6 15 25 50

к-СЮ 0,629 ± 0,07 0,285 ± 0,03 0,377 ± 0,04 0,445 ±0,1 0,462 ± 0,02 1,012 ±0,2 0,613 ±0,05 0,773 ± 0,1 1,149 ±0,06 1,479 ±0,1

н-С 11 0,370 ±0,05 0,225 ± 0,03 0,651 ±0,09 0,829 ±0,1 0,573 ± 0,06 0,804 ± 0,04 0,508 ± 0,04 0,574 ± 0,04 0,467 ± 0,05 0,520 ± 0,07

н-С 12 0,158 ±0,06 0,166 ±0,02 0,640 ± 0,09 0,776 ±0,12 0,663 ± 0,06 0,777 ± 0,04 0,665 ± 0,04 0,692 ± 0,04 0,608 ±0,07 0,675 ± 0,05

н-С 14 0,353 ±0,04 0,374 ± 0,02 0,380 ± 0,03 0,415 ±0,04 0,372 ± 0.04 0,755 ± 0,06 0,358 ± 0,03 0,585 ± 0,07 0,250 ± 0,02 0,425 ± 0,07

н-С 16 0,757 ±0,06 0,293 ± 0,04 0,511 ±0,05 0,804 ± 0,06 0,511 ±0,05 0,717 ±0,06 0,399 ± 0,03 0,815 ±0,05 0,363 ± 0,05 0,784 ± 0,05

пристан 0,411 ±0,03 0,512 ±0,04 0,707 ±0.09 0,810 ±0,03 0,247 ±0.12 0,318 ±0,03 0,460 ± 0,04 0,377 ± 0,03 0,616 ±0,1 0,554 ±0,08

фенол 0,623 ± 0,04 0,569 ±0,06 0,684 ± 0,05 0,581 ±0,03 0,84 ±0,1 0,987 ± 0,08 0,80 ± 0,03 0,894 ± 0,05 0,828 ±0,1 0,609 ± 0,05

фенангрен 0,437 ±0,1 0,601 ±0,06 0,303 ±0,1 0,521 ±0,07 0,286 ±0,1 0,391 ±0,1 0,288 ± 0,03 0,280 ± 0,03 0,396 ± 0,02 0,373 ± 0,03

антрацен 0,466 ±0,12 0,498 ±0,1 0,23 ±0,11 0,343 ± 0,09 0,410 ±0,07 0,572 ± 0,05 0,34 ± 0,07 0,34 ±0,1 0,453 ± 0,06 0,436 ±0,1

нафталин 0,487 ± 0,08 0,711 ±0,05 0,626 ± 0,07 0,789 ± 0,07 0,633 ±0,11 1,130 ± 0,13 0,639 ±0,09 0,912 ±0,1 0,781 ±0,04 0,854 ±0,05

Примечание. Здесь и в табл. 4 в числителе - нативные, в знаменателе - адаптированные клетки. н-СЮ; н-С11; н-С 12; н-С 14; н-С 16 - «-декан; я-ундекан; «-додекан; и-тетрадекан; и-гексадекан. ОПьзонм исходной суспензии составляла 0,5.

Таблица 4.

Интенсивность роста (АОПбзонм) нативных и адаптированных клеток Д. орасиэ в присутствии нефтяных углеводородов

Углеводородный субстрат Концентрация углеводородов, об.%

3 6 15 25 50

н-СЮ 0.287 ±0,1 0,186 ±0,06 0,233 ± 0,06 0,190 ±0,07 0.193 ±0,04 0,223 ± 0,07 0,513 ±0,07 0,377 ±0,1 0,397 ± 0,09 0,293 ± 0,04

Н-С11 0,131 ±0,02 0,224± 0,02 0,210 ±0,03 0,411 ±0,08 0,549 ± 0,09 0,600 ± 0,07 0,704 ±0,1 0,707 ± 0,07 0,681 ±0,1 0,832 ±0,1

н-СП 0,108 ±0,02 0,309 ± 0,09 0.187 ±0,03 0,430 ± 0,07 0,621 ±0,08 0,674 ±0,11 0,498 ± 0,09 0,547 ± 0,08 0,463 ± 0,04 0,488 ±0,14

н-С14 0,201 ±0,07 0,277±0,04 0,237±0,02 0,371±0,05 0,245 ± 0,03 0,405 ± 0,07 0,254 ± 0,03 0,426 ± 0,07 0,287 ± 0,03 0,36 ±0,12

И-С16 0,390 ± 0,02 0,516 ±0,03 0,519 ±0.04 0,558 ±0,03 0,432 ± 0,03 0,622 ± 0,04 0,470 ±0,05 0,595 ± 0,02 0,553 ± 0,05 0,613 ±0,03

пристан 0,419 ±0,02 0,542 ± 0,05 0,251 ± 0,04 0,303 ± 0,06 0,679 ± 0,07 0,710 ±0,06 0,704 ± 0,09 0,719 ±0,06 0,422 ± 0,06 0,424 ± 0,06

фенол 0,416 ±0,05 0,443 ± 0,04 0,392 ± 0,04 0,367 ± 0,04 0,443 ± 0,07 0,416 ±0,06 0,284 ± 0,02 0,257 ±0,04 0,115 ±0,02 0,109 ±0,03

фенантрен 0,221 ±0,06 0,382 ± 0,03 0,249 ± 0,08 0,370 ± 0,05 0,278 ± 0,03 0,359 ± 0,03 0,182 ±0,06 0,146 ±0,05 0,240 ± 0,08 0,259 ± 0,03

антрацен 0,465±0,12 0,623±0,07 0,367 ±0,07 0,569 ±0,09 0,362 ±0,1 0,563 ± 0,09 0,343 ± 0.1 0,325 ± 0,09 0,420 ± 0,05 0,420 ± 0,03

нафталин 0,552 ±0,03 1,171 ±0,02 0,671 ±0,04 1,143 ±0,06 0,687 ±0.07 1,418 ±0,09 1,073 ±0,09 1,442 ± 0,05 0,667 ± 0,09 1,396 ±0,02

Результаты МАТН-теста (табл. 5) показывают, что сродство клеток адаптированного R. ruber к углеводородному субстрату повышалось на 15% по сравнению с исходным штаммом. В то же время, гидрофобность десорбированных с поверхности носителя клеток R. opacus была на 32% ниже, чем у исходного штамма. Возрастание степени гидрофобности клеточной стенки адаптированного R. ruber коррелировало (R = 0,99, р < 0,01) с увеличением содержания суммарных лигшдов (табл. 5), тогда как снижение гидрофобности адаптированных клеток R. opacus компенсировалось повышением их эмульгирующей активности в 1,3-4 раза по сравнению с исходным штаммом (рис. 14).

Таблица 5.

Физико-химические свойства клеточной поверхности родококков

Штамм Степень гидрофобности, % Суммарные клеточные липиды, мг/г сухого веса Электрокинетический потенциал, мВ

R. ruber 35 ±0.05 50 ± 0,03 0,91 ±0,03 1,37 ±0,03 -28.9 ± 0.4 -21,1 ± 1,8

R. opacus 47±0,02 15±0,01 1.95 ±0,02 1,38 ±0,1 -7.9 ± 0.5 -24,5 ± 0,8

Примечание. В числителе - исходные, в знаменателе - адаптированные клетки.

Рис. 14. Изменение эмульгирующей активности клеток Я. орасия в процессе адаптации в биореакторе. I - нативные, II - адаптированные клетки.

0,1 I 24

Время, ч

Изменение сродства клеток к углеводородам в процессе адаптации сопровождалось изменением их электроповерхностных характеристик (см. табл. 5). Так электрокинетический потенциал более гидрофобных клеток адаптированного R. ruber возрастал от -28,9 мВ (значение для исходного штамма) до -21,1 мВ. В то же время, снижение степени гидрофобности адаптированных в реакторе клеток R. opacus коррелировало с уменьшением их электрокинетического потенциала на 16,6 мВ, что согласуется с опубликованными данными (Рубцова и др., 2012; de Carvalho et al., 2009).

Адаптация родококков к углеводородам в биореакторе сопровождалась 35%-ным повышением их антибиотикорезистентности (рис. 15). При этом рост устойчивости к антибиотикам был более выражен у адаптированного R. opacus (К = 0,23), который приобрел устойчивость к канамицину и налидиксовой кислоте, в то время как коэффициент резистентности R. ruber после операционного цикла в биореакторе существенно не изменялся (К = 0,08).

S 20

Рис. 15. Чувствительность исходных (I) и адаптированных (II) клеток R. ruber (А) и R. opticus (Б) к антибиотикам: 1 - гентамицину, 2 - канамицину, 3 - неомицину, 4 - стрептомицину, 5 - линкомицину, 6 - олеандомицину, 7 - эритромицину, 8 - ампициллину, 9 - карбеницеллину, 10 - оксациллину, 11 - тетрациклину, 12 - налидиксовой кислоте, 13 - фузидину.

Адаптация микроорганизмов к токсическому действию химических веществ часто обусловлена наличием плазмид, несущих гены устойчивости к углеводородам, антибиотикам и ионам тяжелых металлов (Larkin et al., 2010). Нами из клеток адаптированного R. ruber выделена плазмида размером около 15 т.п.н., не выявляемая с помощью экстракционного метода в исходном штамме (рис. 16). Известно, что копийность плазмид, несущих гены устойчивости бактерий к действию ксенобиотиков, увеличивается при длительном воздействии ингибирующего фактора, что определяет возможность адаптации микроорганизмов (McLeod et al., 2006).

12 345678 М

Ра (меры '>ис- Агарозный гель-электрофорез

о н. плазмидной ДНК.

Обозначения: 1 и 2 - исходные; 3 и 4 -

- 15000 D L с с. адаптированные клетки к. ruber; 5 и о -

- 10000 исходные; 7 и 8 - адаптированные клетки

- 5000 .. miv R. opacus; М - маркер молекулярного веса ДНК.

Очистка промышленной нефтезагрязненной сточной воды в лабораторном колоночном биореакторе с иммобилизованными родококками. Далее нами исследована возможность использования коиммобилизованных на хвойных опилках R. ruber и R. opacus для очистки промышленной нефтезагрязненной сточной воды в биореакторе. По нашим данным, применение иммобилизованной ассоциации родококков способствовало 67%-ному удалению нефтяных углеводородов из воды в течение двух недель, что в 2,5 раза эффективнее по сравнению с контролем (рис. 17). Полученные данные свидетельствуют о том, что основной механизм удаления углеводородов из загрязненной воды - их окислительная биодеградация иммобилизованными родококками (61%) (рис. 18), а также физико-химическая адсорбция носителем (26%). Из рис. 17 также видно, что хвойные опилки характеризовались высокой (50-90%) адсорбционной емкостью в отношении тяжелых металлов. При этом иммобилизация родококков на носителе способствовала повышению степени извлечения Мп, Zn и Мо на 3-10% по сравнению с неинокулированным носителем.

■■■■■НИН

» «а-

Рис. 17. Эффективность удаления

нефтяных углеводородов (НУ)и тяжелых металлов в процессе очистки промышленной сточной воды в биореакторе.

Обозначения: А - иммобилизованные клетки; Б - неинокулированный носитель.

НУ Cr Mn Fe Со Си

У.п Mo Hg

J«0 ООО

saootx? яаоооо

поооо

'JOOOO

Рис. 18. ГХ-МС хроматограммы углеводородной фракции промышленной сточной воды.

Варианты опыта: А - исходная нефтезагрязненная вода; Б - нефтезагрязненная вода после обработки в биореакторе.

Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют о возможности использования коиммобилизованных на хвойных опилках клеток R. ruber и R. opacus в процессе очистки промышленных сточных вод, загрязненных нефтепродуктами и тяжелыми металлами, в колоночном биореакторе с псевдоожиженным слоем.

Выводы

1. Показано, что эффективная иммобилизация (1,7 х Ю7 клеток/г носителя) родококков на гидрофобизованных хвойных опилках достигается в колоночном биореакторе при скорости подачи клеточной суспензии 2,0 мл/мин и повторном использовании органического носителя.

2. Установлено, что степень биодеградации модельной нефти иммобилизованной ассоциацией R. ruber и R. opacus составляет 86-89% после 1 -3 циклов обработки загрязненной воды в биореакторе.

3. Выявлено, что адаптация родококков к нефтяным углеводородам сопровождается повышением их антибиотикорезистентности, изменением поверхностных свойств (шероховатость клеточной поверхности, гидрофобность, электрокинетический потенциал), а также содержания клеточных липидов и биосурфактантов.

4. Разработан метод видовой ПЦР-дифференциации жизнеспособных клеток родококков, иммобилизованных на органическом носителе в условиях биореактора.

5. Эффективность очистки промышленной нефтезагрязненной воды в колоночном биореакторе с использованием адаптированных коиммобилизованных R. ruber и R. opacus составляет 67% в течение двух недель.

Список работ, опубликованных автором по теме диссертации

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

1. Кинетическая модель процесса иммобилизации бактериальных клеток на твердом носителе / М.С. Куюкина, И.Б. Ившина, М.А. Осипенко, Ю.И. Няшин, А.Н. Тюленева, М.К. Серебренникова, А.В. Криворучко // Российский журнал биомеханики. - 2007. - Т. 11, № 2. - С. 79-87.

2. Исследование адгезивных свойств актинобактерий рода Rhodococcus с помощью Тп5 мутагенеза / А.В. Криворучко, Е.В. Рубцова, М.К. Серебренникова, М.С. Куюкина, И.Б. Ившина // Ученые записки КГУ. Серия Естественные науки. -Казань, 2008. - Т. 150, №4.-С. 143-147.

3. Petroleum-contaminated water treatment in a fluidized-bed bioreactor with immobilized Rhodococcus cells / M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina, M.K. Serebrennikova, A.V. Krivoruchko, E.A. Podorozhko, R.V. Ivanov, V.I. Lozinsky // International Biodeterioration & Biodégradation. - 2009. - V. 63, N. 4. - P. 427-432.

4. Об учете свободной поверхности жидкости при моделировании процесса иммобилизации бактериальных клеток на твердом носителе / М.С. Куюкина, И.Б. Ившина, М.А. Осипенко, Ю.И. Няшин, А.Н. Тюленева, М.К. Серебренникова // Российский журнал биомеханики. -2009. - Т. 13, № 2. - С. 7-14.

5. Математическое моделирование процесса иммобилизации родококков в колоночном биореакторе / М.К. Серебренникова, М.С. Куюкина, И.Б. Ившина, А.Н. Шашерина, М.А. Осипенко // Вестник Уральской медицинской академической науки.-2011.-№4/1 (38).-С. 181-182.

6. Экспериментальное и теоретическое исследование процесса иммобилизации актинобактерий в колоночном биореакторе с псевдоожиженным слоем / М.С. Куюкина, И.Б. Ившина, М.К. Серебренникова, М.А. Осипенко, Ю.И. Няшин // Российский журнал биомеханики. - 2012. - Т. 16, № 4 (58). - С. 83-91.

7. Simultaneous species-specific PCR détection and viability testing of poly(vinyI alcohol) cryogel-entrapped Rhodococcus spp. after their exposure to petroleum hydrocarbons / M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina, M.K. Serebrennikova, E.V. Rubtsova, A.V. Krivoruchko // Journal of Microbiological Methods. - 2013. - V. 94, N 2. - P. 135-140.

8. Адаптация коиммобилизованных родококков к нефтяным углеводородам в колоночном биореакторе / М.К. Серебренникова, М.С. Куюкина, А.В. Криворучко, И.Б. Ившина // Прикладная биохимия и микробиология. - 2014. - Т. 50, № 3. - С.

9. Куюкина, М.С., Ившина, И.Б., Серебренникова, М.К., Рубцова, Е.В., Криворучко, А.В. Способ видовой дифференциации жизнеспособных родококков, иммобилизованных в гелевом носителе. Заявка на патент № 2013121968/10(032290) от 13.05.2013 г.

Публикации в других журналах и сборниках

1. Лабораторное исследование и математическое моделирование процесса иммобилизации клеток родококков на органическом носителе / М.К. Серебренникова, А.Н. Тюленева, М.С. Куюкина, М.А. Осипенко // Тез. XVI Всерос. школы-конф. молодых ученых и студентов «Математическое моделирование в естественных науках». - Пермь, 2007. - С. 89-90.

2. Серебренникова, М.К. Построение математической модели процесса иммобилизации клеток родококков на твердом носителе / М.К. Серебренникова, А.Н. Тюленева // Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии: Матер, регион, научн. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых 2006 и 2007 гг. Перм. ун-т. - Пермь, 2007. - С. 103-105.

3. Математическое моделирование процесса иммобилизации клеток родококков на опиле в движущейся жидкости / М.К. Серебренникова, А.Н. Тюленева, М.С. Куюкина, М.А. Осипенко // Тез. XVII Всерос. школы-конф. молодых ученых и студентов «Математическое моделирование в естественных науках». - Пермь, 2008. -С. 66-67.

4. Интенсификация процесса биодеградации нефтяных углеводородов в колоночном биореакторе с использованием иммобилизованных клеток родококков / М.К. Серебренникова, А.В. Криворучко, М.С. Куюкина, И.Б. Ившина // Матер. II Всерос. с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2009». - Пермь, 2009. - С. 69-73.

5. Enhanced biodégradation of petroleum hydrocarbons in a column bioreactor using immobilized Rhodococcus cells / M.K. Serebrennikova, A.V. Krivoruchko, M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina // Abstr. 13th annual Symposium for Biology Students of Europe «SymBioSE 2009». - Kazan, 2009. - P. 65-66.

6. Куюкина, М.С. Оптимизация процесса иммобилизации клеток алканотрофных родококков на хвойных опилках в условиях колоночного биореактора / М.С. Куюкина, И.Б. Ившина, М.К. Серебренникова // Вестник Пермского университета. Серия Биология. - 2010. - Вып. 1, № 1. - С. 69-72.

7. Серебренникова, М.К. Дыхательная активность как показатель функциональной стабильности иммобилизованных клеток алканотрофных родококков / М.К. Серебренникова, М.С. Куюкина, И.Б. Ившина // Матер. III Всерос. с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010». - Н. Новгород, 2010. - С. 71.

8. Серебренникова, М.К. Оптимизация процесса очистки нефтезагрязненной воды в биореакторе с использованием иммобилизованных клеток родококков / М.К. Серебренникова, М.С. Куюкина, И.Б. Ившина // Матер. 3-го Байкальского Микробиологического Симпозиума с международным участием. - Иркутск, 2011. -С. 119-121.

9. Серебренникова, М.К. Адаптация родококков к нефтяным углеводородам в колоночном биореакторе как фактор повышения биодеградационного потенциала М.К. Серебренникова, М.С. Куюкина, И.Б. Ившина // Матер. VI Всерос. конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» - Саратов, 2012. - С. 89.

10. Serebrennikova, М.К. Adaptation of immobilized Rhodococcus cells to increasing petroleum concentrations in a column bioreactor / M.K. Serebrennikova, M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina // Environmental Engineering and Management Journal. -2012. -V.l 1, N. 3S.-P. 127.

11. Серебренникова, M.K. Изменение физиологических свойств коиммобилизованных Rhodococcus ruber и Rhodococcus opacus после контакта с нефтяными углеводородами в колоночном биореакторе / М.К. Серебренникова, М.С. Куюкина, И.Б. Ившина // Матер. 17 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино, 2013. - С. 342.

12. Серебренникова, М.К. Очистка нефтезагрязненной воды иммобилизованными на хвойных опилках родококками в биореакторе с псевдоожиженным слоем / М.К. Серебренникова, М.С. Куюкина, И.Б. Ившина // Матер. VI Всерос. с международным участием конгресса молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2013». - Иркутск, 2013. - С. 112-114.

СЕРЕБРЕННИКОВА Марина Константиновна

БИОДЕГРАДАЦИЯ НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ РОДОКОККАМИ В КОЛОНОЧНОМ БИОРЕАКТОРЕ

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 120 экз. Заказ 03.03.2014 Набор компьютерный.

Отпечатано в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Серебренникова, Марина Константиновна, Пермь

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

04201456969

На правах рукописи СЕРЕБРЕННИКОВА Марина Константиновна

БИОДЕГРАДАЦИЯ НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ РОДОКОККАМИ В КОЛОНОЧНОМ БИОРЕАКТОРЕ

03.02.03 Микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Кунжина Мария Станиславовна

Пермь-2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение........................................................................................ 4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Биологические особенности алканотрофных родококков............. 10

1.1. Механизмы окисления алифатических углеводородов...................... 19

1.2. Механизмы расщепления ароматических углеводородов.................. 21

1.3. Механизмы расщепления полиароматических углеводородов............. 22

Глава 2. Иммобилизованные микроорганизмов в биотехнологических процессах..................................................................................... 27

2.1. Преимущества иммобилизованных микроорганизмов перед свободными 27

2.2. Методы оценки жизнеспособности иммобилизованных

микроорганизмов........................................................................... 35

Глава 3. Биореакторные технологии как способ оптимизации

биоремедиационных процессов ex situ............................................... 39

3.1. Адаптация как способ повышения углеводород окисляющей активности

микроорганизмов............................................................................. 51

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. Материалы и методы исследования....................................... 59

4.1. Бактериальные штаммы и условия их культивирования..................... 59

4.2. Исследование кинетики процесса иммобилизации родококков

в биореакторе с перемешиванием и колоночного типа.............................. 59

4.3. Изучение способности бактериальных культур усваивать нефтяные углеводороды................................................................................. 64

4.4. Определение солеустойчивости бактериальных культур.................... 65

4.5. Очистка нефтезагрязненной воды коиммобилизованными родококками в биореакторе с псевдоожиженным слоем............................ 66

4.6. Структурный анализ нефтезагрязненной воды................................. 69

4.7. Определение физико-химических свойств клеток родококков............. 71

4.7.1. Морфология клеточной поверхности.................................... 71

4.7.2. Гидрофобность клеточной стенки..................................................................................71

4.7.3. Определение электрокинетического потенциала............................................72

4.7.4. Эмульгирующая активность................................................................................................72

4.7.5. Определение суммарных клеточных липидов....................................................73

4.7.6. Определение антибиотикочуствительности бактерий................................73

4.8. Определение жизнеспособности и функциональной стабильности иммобилизованных клеток..................................................................................................................................75

4.9. Генетический анализ бактериальных штаммов................................................................75

4.10. Математическое моделирование процесса иммобилизации клеток родококков в колоночном биореакторе с псевдоожиженным слоем............................78

4.11. Статистическая обработка результатов....................................................................................80

Глава 5. Подбор носителя для иммобилизации клеток родококков....................81

Глава 6. Динамика процесса иммобилизация родококков в биореакторе

с перемешиванием и колоночного типа..........................................................................................88

Глава 7. Биодеградация нефтяных углеводородов ассоциацией

коиммобилизованных родококков в колоночном биореакторе..............................98

Глава 8. Возможные механизмы адаптации родококков

к углеводородным загрязнителям..........................................................................................................113

Глава 9. Очистка промышленной нефтезагрязненной сточной воды в лабораторном колоночном биореакторе с иммобилизованными

родококками..................................................................................................................................................................124

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................................................................................128

ВЫВОДЫ............................................................................................................................................................................132

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................................................133

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Развитие нефтяной промышленности приводит к загрязнению окружающей среды нефтепродуктами, а также увеличению объема нефтесодержащих сточных вод. В связи с этим, важным направлением экологической биотехнологии является разработка эффективных и безопасных способов очистки нефтезагрязненных сред. Наиболее перспективными и экологически безопасными являются микробиологические методы, основанные на использовании углеводородокисляющих микроорганизмов, как правило, иммобилизованных на твердых носителях. Данный подход предусматривает (1) сорбцию нефтяных углеводородов материалом носителя и (2) их эффективное окисление иммобилизованными микробными клетками (Жукова, Морозов, 2010; Рымовская, Ручай, 2008; Junter et al., 2002; Martins et al., 2012). Поскольку при иммобилизации решается проблема отделения биомассы от жидкой фазы, это позволяет перейти от периодических схем очистки воды к более производительным непрерывным технологиям, предусматривающим использование проточных биореакторов (Сироткин и др., 2007; Doaa, Wafaa, 2009).

Сегодня широкое применение в очистке загрязненных сточных вод получили колоночные биореакторы с псевдоожиженным слоем (ßuidized-bed), заполненные дисперсным носителем с иммобилизованной микрофлорой, через который циркулирует восходящий поток жидкости (Vainberg et al., 2002; McCarty, Meyer, 2005). Использование реакторов такого типа позволяет (1) осуществлять процессы в небольших по размеру конструкциях; (2) обеспечивать равномерное распределение загрязненной жидкости между поддерживаемыми во взвешенном состоянии частицами носителя, что повышает биодоступность углеводородов для закрепленных клеток; (3) создавать оптимальные условия для адаптации микроорганизмов к органическим загрязнителям и другим факторам (Касаткин, 1973; Махлин, 2009; Shieh, Keenan, 1986; Soko'l, Korpal, 2006; Werther, 2007).

уникальными ферментными комплексами, родококки являются активными биодеструкторами токсичных и труднодоступных для многих микроорганизмов углеводородов (алифатических, ароматических, поли- и гетероциклических) и их производных (гербицидов, полихлорированных бифенилов, фармполлютантов, фенолов, эстрогенов) (Ившина и др., 2006; Bell et al., 1998; Yoshimoto et al., 2004; Martínková et al., 2009; Ivshina et al., 2012). Биотехнологические преимущества родококков обусловлены такими их биологическими особенностями как типично бактериальный рост и сложный морфогенетический цикл развития, способность ассимилировать гидрофобные субстраты и синтезировать поверхностно-активные вещества (биосурфактанты), а также устойчивая активность в экстремальных условиях среды (Ившина и др., 2007; Prieto et al., 20026; Kuyukina, Ivshina, 2010). В последнее время для расширения спектра окисляемых в процессах биоремедиации нефтяных углеводородов все чаще используются природные или искусственные ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов, отличающихся по спектру потребляемых субстратов (Жуков и др., 2007; Prieto et al., 20026; Ghazali et al., 2004; Mikesková et al., 2012). При подборе бактериальных ассоциаций необходимо учитывать антагонистическую активность штаммов, их устойчивость к солям тяжелых металлов и токсикантам и функциональную стабильность в экстремальных условиях среды. Возможность использования ассоциации на основе коиммобилизованных родококков для очистки нефтезагрязненных сточных вод в биореакторе до настоящего времени не исследовалась.

Основные задачи исследования:

4. Оценить возможность использования иммобилизованной ассоциации родококков для очистки промышленных сточных вод в биореакторе.

Научная новизна. Впервые для биодеградации нефтяных углеводородов в колоночном биореакторе с псевдоожиженным слоем использована ассоциация алканотрофных родококков R. ruber и R. opacus, закрепленных на гидрофобизованных хвойных опилках. Экспериментально определены гидродинамические условия (1,2-2,0 мл/мин) в биореакторе, при которых происходит псевдоожижение частиц носителя. На основе математического моделирования подобран оптимальный скоростной режим (2,0 мл/мин) иммобилизации родококков на опилках, при котором происходит прочное закрепление клеток и достигается высокая (1,7 х 10 клеток/г носителя) концентрация биомассы в реакторе. Установлено, что родококки, адаптированные к повышенным концентрациям нефтезагрязнителей, характеризуются гидрофобной клеточной стенкой, обусловленной высоким содержанием клеточных липидов, и повышенным синтезом биосурфактантов. Выявлена прямая зависимость (R = 0,98; р < 0,05) между показателем гидрофобности клеточной стенки родококков и их электрокинетическим потенциалом. Показано, что адаптация к углеводородам в биореакторе сопровождается увеличением антибиотикоустойчивости бактериальной популяции и изменением плазмидного профиля. Так, из клеток адаптированного R. ruber выделена плазмида размером около 15 т.п.н., не выявляемая с помощью экстракционного метода в исходном штамме.

возможность оптимизации процесса деградации нефтяных углеводородов ассоциацией коиммобилизованных родококков путем подбора оптимальной скорости подачи загрязненной воды в биореактор и адаптации бактериальных культур к углеводородам. Установлено, что в процессе очистки формируется устойчивая к высоким концентрациям нефтепродуктов ассоциация иммобилизованных бактерий, способная сохранять метаболическую активность при попадании в биореактор высококонцентрированных промышленных стоков. Разработан комбинированный метод видовой дифференциации и количественной детекции жизнеспособных родококков, входящих в состав иммобилизованной ассоциации, который может применяться для мониторинга функциональной активности биокатализаторов. Показана возможность многократного использования иммобилизованных на модифицированных опилках родококков в биотехнологическом процессе очистки нефтезагрязненной воды.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Ассоциация коиммобилизованных R. ruber и R. opacus эффективно удаляет нефтяные углеводороды из загрязненной воды.

4. Применение иммобилизованных на опилках адаптированных родококков эффективно для очистки нефтесодержащих сточных вод в биореакторе.

2009; The XIII Annual Symposium for Biology Students of Europe, Kazan, 2009; III Всероссийском конгрессе с международным участием студентов и аспирантов биологов «Симбиоз-Россия 2010», Н. Новгород, 2010; 3-ем Байкальском Микробиологическом Симпозиуме с международным участием, Иркутск, 2011; I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии», Пермь, 2011; Environmental Microbiology & Biotechnology (ЕМВ2012), Болонья, Италия, 2012; VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», Саратов, 2012; 17-ой международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2013.

По теме диссертации опубликована 21 печатная работа, из них 8 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Благодарности. Автор выражает самую глубокую и искреннюю благодарность своему научному руководителю д.б.н. М.С. Куюкиной за постоянное внимание и неоценимую помощь в работе, а также чл.-корр. РАН И.Б. Ившиной и всему коллективу лаборатории алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН за помощь и поддержку на всех этапах диссертационной работы.

Глава 1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АЛКАНОТРОФНЫХ

РОДОКОККОВ

Актинобактерии рода Rhodococcus широко распространены в природе и выделяются из водных (грунтовых, поверхностных, сточных) и почвенных биотопов, связанных, в частности, с месторождением нефти и газа (Нестеренко и др., 1985; Ившина и др., 1987; Жуков и др., 2006; Martinkovä et al, 2009). Обладая уникальными биологическими свойствами и характеризуясь широкими катаболическими возможностями и уникальными ферментными системами, родококки могут деградировать разнообразные по химической структуре ксенобиотики (Bell et al. 1998; Larkin et al., 2005; Martinkovä et al., 2009). Эти особенности в сочетании со способностью выживать в неблагоприятных условиях среды делает представителей рода Rhodococcus перспективным при разработке биокатализаторов и биопрепаратов для биологических способов ремедиации загрязненных углеводородами объектов окружающей среды.

Род Rhodococcus включает аэробные, грамположительные, неподвижные, некислотоустойчивые, неспорообразующие актинобактерии, характеризующиеся морфологическим разнообразием (Ившина и др., 1987, Finnerty, 1992; Bell et al., 1998). Характерной особенностью представителей данного рода является сложный морфогенетический цикл развития: короткие палочковидные, нитевидные или ветвящиеся клетки - рудиментарный или хорошо развитый первичный мицелий - палочковидные и кокковидные клетки (Ившина, 1997). Фрагментация клеточного мицелия способствует увеличению отношения клеточной поверхности к общему объему клетки, что, в свою очередь, повышает способность родококков поглощать трудноусваиваемый гидрофобный субстрат (Ившина и др., 2007).

Трехстадийный цикл развития родококков является причиной появления разнообразных способов клеточной кооперации, выражающейся в слипании пептидогликановых слоев клеточной стенки, формировании пилевидных тяжей или шишковидных выростов на ее наружной поверхности. Это, в сво

Информация о работе

Серебренникова, Марина Константиновна
кандидата биологических наук
Пермь, 2014
ВАК 03.02.03

Диссертация

Биодеградация нефтяных углеводородов иммобилизованными родококками в колоночном биореакторе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы