Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Родококки в водных экосистемах

ВАК РФ 03.00.18, Гидробиология

Автореферат диссертации по теме "Родококки в водных экосистемах"

гс£? МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТЭ£ННЬ1Й УНИВЕРСИТЕТ

ИМ М- 8. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 579.87.017: 576.8

ПОРШНЕВА Ольга Вячеславовна

РОДОКОККИ В ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ

Специальность 03.00.18 - гидробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1998

Работа выполнена на кафедре гидробиологии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Т.В. КОРОНЕЛЛИ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.А. АБАКУМОВ кандидат биологических наук, ст. н. сотр. Е.С. МИЛЬКО

Ведущее учреждение:

Институт биологии внутренних вод РАН

Защита диссертации состоится 22 мая 1998 года в 15 часов 30 мин. на заседании Специализированного диссертационного совета Д.053.05.71 в Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория 557.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 20 апреля 1998 г.

Отзывы в двух экземплярах просьба направлять по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра гидробиологии.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

А. Г. Дмитриева

)БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Бактерии, способные окислять и усваивать такой бескислородный :убстрат, как углеводороды, всегда присутствуют в естественных место-питаниях, являясь потенциальным фактором самоочищения воды и поч-!Ы. Несмотря на то, что наличие в пресноводных экосистемах бактерий, пособных использовать н-алканы в качестве единственного источника гглерода и энергии, многократно отмечено разными авторами, динамика герестройки гетеротрофного бактериоценоза при попадании в экосистему тлеводородов нефти совершенно не изучена. Это связано, в первую оче->едь, с методическими трудностями, возникающими при изучении провеса in situ. Однократный отбор проб позволяет получить информацию о 1Идовом составе углеводородокисляющих бактерий и их доле в бактерио-tенозе только на данный момент и не дает представления о тенденциях i изменении структуры гетеротрофного бактериоценоза при переходе от 1втохтонной к аллохтонной гидрофобной органике.

Одними из наиболее распространенных углеводородокисляющих »актерий являются представители рода Rliodococcus. Эти бактерии встре-[аются как в составе наземных, так и в составе водных бактериоценозов, фичем в обоих случаях они играют одну из ведущих ролей в окислении углеводородов. Родококки легко приспосабливаются к экстремальным Условиям среды - повышенной и пониженной температурам, колебаниям :олености, пониженной влажности и т.д. Однако, механизмы устойчиво-:ти этих бактерий к таким факторам практически не изучены.

В связи с вышеизложенным особое значение приобретает ком-¡лексное изучение экологической роли родококков в углеводо-юдокисляющих сообществах и механизмов их устойчивости к экстремальным условиям окружающей среды.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось изучение сукцессионных изменений и формирования углеводородокисляющего бактериоценоза в |ресноводном водохранилище и выяснение механизмов устойчивости к [екоторым экстремальным факторам среды доминирующих форм.

В соответствии с этим были сформулированы следующие кон-;ретные задачи:

1. определить численность и родовой состав естественного угле-водородокисляющего бактериоценоза Можайского водохранилища в летний период, выявить доминирующие роды;

2. проследить перестройки естественного углеводородокисляюще-го бактериоценоза Можайского водохранилища, происходящие в модельной системе при внесении гидрофобного субстрата и выявить закономерности этого процесса;

3. изучить своеобразие липидного состава R- и S-вариантов Rhodococcus erythropolis, как представителя одного из доминирующих родов естественного углеводородокисляющего бактериоценоза, в связи со значительной ролью липидов в обеспечении пассивного поглощения клетками гидрофобного субстрата;

4. изучить физиолого-биохимические свойства родококков с целью выявления механизмов феноменальной устойчивости этих бактерий к воздействию некоторых экстремальных факторов среды;

5. провести лабораторные испытания нового нефтеокисляющего биопрепарата, состоящего из бактерий Rhodococcus erythropolis и гидрофобного сорбента, насыщенного соединениями азота и фосфора.

Научная новизна

Проведено исследование естественного углеводородокисляющего бактериоценоза Можайского водохранилища, в результате которого были выявлены доминирующие роды и зональность их распределения, изучены сукцессионные перестройки данного бактериоценоза в течение летнего периода. Углеводородокисляющий бактериоценоз Можайского водохранилища представлен бактериями четырех родов: Rhodococcus, Acinetobacter, Pseudomonas и Micrococcus, каждый из которых (кроме рода Micro-coccus) занимает в определенный период доминирующее положение.

Впервые прослежена динамика структурных перестроек пресноводного углеводородокисляющего бактериоценоза в естественных условиях, происходящих при попадании в экосистему углеводородов нефти. Отмечена активизация естественного нефтеокисляющего бактериоценоза при загрязнении водной экосистемы нефтепродуктами и изменение его таксономического состава. Выявлены наиболее активные деструкторы углеводородов - бактерии рода Rhodococcus.

Показано, что форма и структура колоний R. erythropolis связаны со структурой их клеточных стенок, важнейшим элементом которых яв-

ляются специфические липиды - эфиры миколовых кислот и дисахарида трегалозы.

Исследован механизм адаптации родококков к некоторым экстремальным факторам с[)еды, выявлена осмо- и термопротекторная роль дисахарида трегалозы.

Практическая значимость работы

Изучение перестроек углеводородокисляющего бактериоценоза под действием нефтяного загрязнения, проведенное на Можайском водохранилище, позволяет установить взаимосвязь между численностью и таксономическим составом естественного нефтеокислягощего бактериоценоза и интенсивностью процессов самоочищения в этом водоеме при внезапном нефтяном загрязнении. Бактерии рода Июйососсиб могут служить показателем загрязнения среды гидрофобной органикой.

В результате проведенных лабораторных испытаний биопрепарата «Родококк» для разрушения нефтяных пленок в водных экосистемах найден способ его использования в водной среде.

Апробация работы

Основные положения работы были доложены и обсуждены на конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы», Пермь, октябрь 1996 г.; на семинаре кафедры гидробиологии Биологического факультета МГУ, 1998 г.

Результаты работы представлены в 7 публикациях.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, 8 глав, общего заключения, выводов и списка литературы; изложена на ИХ страницах, включая 7 таблиц и 3 рисунков. Главы 1-3 представляют собой обзор литературы по проблеме диссертации; в 4 главе дана характеристика Можайского водохранилища, описание объектов и применявшихся методов; результаты работы изложены в главах 5 - 8, каждая из которых (кроме 8 главы) завершается обсуждением полученных результатов. Список литературы содержит 442 названий, в том числе 6Ь работ зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ__

Обзор литературы (главы 1-3)

В обзоре рассмотрены количественные характеристики углеводо-родокисляющих бактериоценозов, сформировавшихся в различных пре-

сноводных бассейнах под влиянием хронического нефтяного загрязнения Приведены данные по таксономическому положению микроорганизмов способных к окислению гидрофобной органики в щ>есноводных и мор ских экосистемах.

Активно окисляют парафиновые углеводороды те обитатели вод ных экосистем, которые обладают липофильной клеточной стенкой i способностью поглощать гидрофобный субстрат пассивным путем. К таким организмам относятся сапротрофные микобактерии (Rliodococcus) Corynebacterium, Nocardia, Brevibacterium, Flavobacterium и Arthrobacter Наиболее активные деструкторы нефти относятся к роду Rliodococcus который является широко распространенным и стабильным компонентом углеводородокисляющих бактериоценозов различных водных экосистем -пресных и соленых, полярных и тропических. В главе 3 приведена подробная характеристика культуральных и морфологических свойств родо-кокков, а также рассмот{>ены возможные механизмы изменчивости этих бактерий. Особое внимание уделено рассмотрению липидного состава клеток и роли специфических липидов входящих в состав клеточных стенок, в усвоении гидрофобного субстрата.

глава 4. Материалы и методы

Натурные эксперименты проводили на Можайском водохранилище в районе биостанции «Ильинское», сроки проведения - нюнь - август 1995 года.

Для изучения формирования углеводородокисляющего бактерио-ценоза при длительном воздействии дизельного топлива непос|>едственно в водоеме использовали модифицированную установку американских исследователей |Walker, Colwell, 1976], закрепленную на плаву на расстоянии 10 м от берега. Источник углеводородов - дизельное топливо -вносили в трубки установки в начале периода наблюдения по 2 мл и далее каждые 2 - 3 недели в каждую трубку повторно добавляли по 0,5 мл. Пробы воды отбирали 6 раз в течение летнего сезона из трубок, а также из приб|)ежной (вблизи трубок) и центральной зон водоема.

Численность углеводородокисляющих микроорганизмов оп)>еде-ляли методом предельных разведений [Полякова, 19691, подсчет проводили по статистическим таблицам Мак-Креди [Walker, Colwell, 1977].

Идентификацию бактерий проводили по культуральным, морфологическим и биохимическим признакам. Для уточнения систематической принадлежности отдельных штаммов ощюделяли содержание нук-

леотидных оснований (молекулярный %Г+Ц). Этот анализ был проведен сотрудником института микробиологии РАН Лысенко А.М.

В работе были использованы бактерии родов Acinetobader, Rhodococcus, Arthrobacter, Pseudomonas и Micrococcus, выделенные из разных мест обитания, а также штамм Rhodococcus erythropolis Е-15, хранящийся в коллекции кафедры гидробиологии МГУ им. М.В.Ломоносова на синтетической среде с н-гексадеканом (R-вариант), и формирующий гладкие колонии S-вариант R. erythropolis, поддерживаемый на мясо-пептонном агаре (МПА).

Экстракцию липидов проводили из сухой биомассы смесью хлороформ:метанол (3:1). Анализ неполярных липидов осуществляли методом тонкослойной хроматографии. Хроматограммы проявляли 5% спиртовым раствором фосфорно-молибденовой кислоты. Обнаружение гликолипидов проводили с помощью антронового реагента. Препаративное разделение липидов проводили методами тонкослойной и колоночной хроматографии [Коронелли и др., 1988J.

Жирные кислоты анализировали методом газожидкостной хроматографии по стандартам насыщенных жирных кислот С9 - См [Коронелли и др., 1993].

Качественный анализ углеводов проводили методом восходящей бумажной хроматографии [Плешков, 1976], хроматограммы проявляли перманганатным реактивом {Gordon е.а., 1956].

Количественное содержание трегалозы рассчитывали по концентрации глюкозы в образце после кислотного гидролиза. Содержание глюкозы определяли фенол-серным методом [Плешков, 1976].

Моделирование стрессовых воздействий. Контрольные условия культивирования бактерий - среда Чапека с н-гексадеканом, 24°С. R- и S-варианты выращивали до стационарной фазы роста, затем подвергали их кратковременному действию стрессовых агентов. Высокотемпературный шок - 1 час при температуре +39°С, холодовой шок - 1 час при +4°С. Кратковременный осмотический шок создавали, выдерживая биомассу в течение 2 часов в среде с 5% NaCl. Культивирование до стационарной фазы роста при повышенном осмотическом давлении («запланированный стресс«") проводили в среде Чапека с н-гексадеканом и 5% NaCl.

Проведение лабораторных испытаний биопрепарата. Испытания бактериального биопрепарата для борьбы с нефтяными за-

грязнениями, созданного на кафедре гидробиологии в лаборатории проф. Т. В. Коронелли на основе бактерий Rhodococcus erythropolis штамм Е-15, проводили в лабораторных условиях в стеклянных вегетационных сосудах объемом 2,3 - 5,2 литра с площадью поверхности от 154 до 238 см2, в среде со стандартным раствором микроэлементов (по Пауэллу и Эррингтону). Внесение углеводородов и азотно-осфорных удобрений производили в соотношении C:N:P = 100:10:1 из расчета 500 г. гексадекана на 1 м2 поверхности. В ходе испытаний использовали гидрофобный сорбент, содержащий в виде липофильных форм 15% по весу N и 1,5% по весу Р. Через три недели культивирования биомассу отделяли от культуральной жидкости, высушивали и взвешивали. Экстракцию неиспользованных углеводородов из среды осуществляли ССЦ.

В таблицах и на графиках приведены результаты типичных экспериментов, полученные в трех-чегырех повторностях. Статистическую обработку результатов проводили по стандартным статистическим методам (Бронштейн, 1986).

Глава 5. Численность и таксономический состав углеводород-

окисляющих бактериоценозов можайского водохранилища и их изменение под влиянием нефтяных углеводородов

Численность углеводородокисляющих бактерий в приб{)ежной зоне водохранилища в течение всего периода наблюдений варьировала в пределах одного порядка - от 2,5x10' до 2,5х102 кл/мл (рис. 1), в центральной зоне составляла 0,6 - 4,5x10' кл/мл.

В прибрежных водах максимальное разнообразие углеводородокисляющих бактерий было обнаружено в первой декаде июня (рис. 2), они были представлены тремя родами: Acinetobacter, Micrococcus и Pseudomonas; в июле ведущую роль играли бактерии рода Rhodococcus. В течение практически всего периода наблюдений доминирующее положение занимал только какой-либо один род. В открытых водах углеводоро-докисляющий бактериоценоз состоял из представителей четы|)ех ]юдов: Acinetobacter, Micrococcus, Pseudomonas и Rhodococcus (рис. 2). С июля и до конца периода наблюдений углеводородокисляющий бактериоценоз был представлен только каким-либо одним родом.

В контрольных трубках (без нефтепродуктов) через 12 суток после их установи! было отмечено увеличение численности углеводородокисляющих бактерий по сравнению с их количеством в пробах воды, отобранных вне трубок (рис. 1), эта закономерность сохранялась в течение

□ Центральная зона □ Прибрежная зона

□ Контрольные трубки ■ Трубки с дизтопливом

Рис. 1. Динамика численности (Ы) углеводородокисляю-щих бактерий в прибрежной и центральной зонах Можайского водохранилища и в трубках экспериментальной установки в летний период.

Прибрежная зона Можайского водохранилища

8 июня

20 июня

4 июля

Р аегвд1поаа, 26%

Ш)о<1ососси8 8р„ 100%

Ас1пе1;оЬас1ег яр., 60%

19 июня

РвеисЯотопав вр., 100%

18 августа

28 августа

Шювососсив яр., 100%

АспкЧоЬясиг яр., 100%

Ас1ЛеЪоЬас1ег вр., 100%

Центральная зона Можайского водохранилища

8 июня

20 июня

4 июля

М1сгососсив ер., 48%

Рвеидотопав вр., 2%

Рвеи<]отопав вр.. 32%

Асте1оЬас1ег вр., 50%

НИовососсив вр., 68%

Аздпесооас вр., 100%

19 ИЮЛЯ

18 августа

28 августа

Рвеийотопав вр., 100%

Аса пр 1.оЬ)и: 1ГТ вр., 100%

Ас1пеЬоЬасЪег вр., 100%

Рис, 2. Динамика изменения таксономического состава естественного углеводородокисляющего бактериоценоза Можайского водохранилища в летний период.

практически всего периода наблюдений. В трубках с дизельным топливом численность углеводородокнсляющих бактерий (рис. 1) превышала таковую в контрольных трубках на 1-2 порядка, а в прибрежной зоне -на 1-3 порядка. Максимальное значение - 9,5хЮ4 кл/мл - наблюдали в последней пробе из трубок с дизельным топливом.

В контрольных трубках углеводородокисляющее сообщество было представлено бактериями трех родов: Acinetobacter, Rhodococcus и Pseudomonas (рис. 3). В пробах воды из трубок с дизельным топливом присутствовали те же роды, но отмечено преобладание родококков.

Внесение нефтяных углеводородов приводит к перестройке угле-водородокисляющего бактериоценоза пресноводного водохранилища, что выражается в возрастании численности углеводородокнсляющих бактерий и в изменении таксономического состава бактериоценоза. Обнаруженная зональность в распределении углеводородокнсляющих бактерий в Можайском водохранилище согласуется с данными для Кольского залива [Пономаренко, Килиженко. 1979]. Более высокая плотность бактерий в прибрежной зоне водохранилища по сравнению с его центральной частью связана, прежде всего, с влиянием берегового стока, с которым в воду поступают минеральные и органические вещества, а также почвенные бактерии (что влияет на таксономический состав бактериоценоза).

Выявлена различная роль родов углеводородокнсляющих бактерий в процессах окисления нефтепродуктов в водоеме: ведущее положение в бактериоценозе, сформировавшемся под влиянием нефтяного загрязнения, занимали родококки. Это вполне объяснимо и закономерно: анализ собственных и данных литературы [Нестеренко, 1982; Нестеренко и др., 1976] показывает, что бактерии этого рода характеризуются эври-термностью, способностью развиваться в очень широком диапазоне концентраций органических веществ и выживать в неблагоприятных условиях среды; из углеводородов нефти лучше всего родококки усваивают н-алканы С13-С,9, которые преобладают в составе дизельного топлива.

Среди видов этого рода наиболее часто встречается R. erythropolis - относительная частота встречаемости штаммов этого вида по отношению к другим видам составляет 56% [Нестеренко и др., 1985].

Глава 6. Роль липидов в изменчивости родококков

Склонность родококков к изменчивости была отмечена Н.А.Кра-сильниковым и Т. A.Tay сон еще в 1938 году [Красильников, Tay сон, 1938]. Внешне это проявляется в том, что один и тот же вид образует на

Контрольные трубки (без нефтяных углеводородов)

8 июня

20 июня

4 июля

Устаповлены трубки l'scudom.

sp., 20%

19 июня

О

Acinetobacter sp., 74%

18 ату ста

Rhodococcus sp., 41%

Pseudomonas sp., 59%

28 августп

Rhodococcus ар., 3%

Acinetobacter sp., 34%

Acinetobacter sp., 20%

Pseudomonas sp., 97%

Pseudomonas sp., 00%

Rhodococcus sp., 80%

Трубки с дизельным топливом

8 июня

Установлены трубки, впесепо дизельпоо топлиио

20 июня

4 июля

Pseudomonas sp., 8%

Acinetobacter »р., 92%

Rhodococcus sp., 100%

19 июня

R. erythropolis, 10%

Рвецйотопаз 8%

18 августа

R. erythropolis, 18%

28 августа

Acinetobacter 8P>, 20%

Rhodococcus sp., 70%

Pseudomonas sp., 82%

Rhodococcus sp., 80%

Рис. 3. Динамика изменения таксономического состава естественного углеводородокисляющего бактериоценоза Можайского водохранилища в трубках экспериментальной установки под влияние нефтяных углеводородов в летний период.

плотных средах колонии двух типов - с гладкой поверхностью (Б-вариант) и с морщинистой (И-вариант). Свежевыделенные из природных местообитаний штаммы имеют, как правило, Б-форму и плохо растут на углеводородах, а хранящиеся в лаборатории приобретают И-форму и характеризуются активным усвоением углеводородов. Различие культу-ральных признаков и отношения к углеводородам создавало трудности при идентификации новых штаммов родококков. Известны случаи, когда Б- и И-варианты одного вида были описаны как разные виды. В ряде работ [Егоров, 1986; Милько, Егоров, 1991; 1993] возникновение вариантов с разными культуральными и физиолого-биохимическими признаками объясняется как результат диссоциации культуры. Тип колоний определяется в первую очередь структурой внешних слоев клеток. У родококков ведущую роль в построении клеточных стенок играют специфические липиды и гликолипиды. Роль этих соединений в изменчивости культу-ральных признаков оставалась практически неизученной.

Таблица 1.

Содержание свободных липидов и состав свободных жирных кислот в клетках И- и свежевыделенного Б - вариантов ШюЛососсив егуШгороИ? (среда Чапека с н-гексадеканом, 24°С, стационарная фаза)

Штамм Я. егуШгороИБ Е-15 ({^-вариант) егуШгороНБ В-2 (Б-вариант)

Сухая биомасса, г/л 4,0 2,4

Содержание свободных липидов, % от биомассы 24,5 16,2

Содержание свободных жирных кислот, % от суммы

С 10:0 3,2 1,8

С 12:0 2,6 4,8

С 14:0 8,2 11,3

С 16:0 47,6 47,8

С 16:1 5,8 4,6

С 17:0 28,6 28,7

С 18:0 3,9 0,8

Качественный анализ малополярных липидов свежевыделенного Б-варианта и лабораторного И-варианта показал, что у обоих штаммов присутствуют типичные для родококков миколовые кислоты, а также обычные жирные кислоты, триглицериды и в незначительных количествах воска. Анализ полярных липидов показал отсутствие димиколата

трегалозы (трегалозо-димиколат - ТДМ) в клетках Б-варианта. По составу свободных жирных кислот оба варианта оказались сходными (табл. 1).

После двухлетнего хранения Б-варианта в лабораторных условиях его клетки стали более активно использовать гидрофобный субстрат (табл. 2), а культуральные признаки претерпели заметные изменения: колонии, хотя и не приобрели складчатой структуры, но стали более сухими по консистенции. Лабораторный Б-вариант в отличие от свежевы-деленного обнаружил хороший рост на среде с гексадеканом - 2,9 г/л, и более слабый на мясо-пептонном бульоне (МПБ) -1,9 г/л (табл. 2). Сравнительный анализ содержания специфических стеночных липидов показал, что моно- и димиколаты трегалозы присутствуют в клетках обоих вариантов. В клетках, выросших на гексадекане, содержание мономи-колата трегалозы (трегалозо-мономиколат - ТММ) у обоих вариантов существенно выше, чем в «МПБ»-клетках, а содержание ТДМ на разных средах различно только у И-варианта - на среде с гидрофобным субстратом происходит увеличение количества ТДМ в клетках. Б-вариант образует равное количество ТДМ при росте на обеих средах (табл.2).

Таблица 2.

Содержание моно-(ТММ) и ди-(ТДМ) миколатов трегалозы в клетках И- и лабораторного Б-вариантов И. егу^гороНБ, выращенных на среде Чапека с гексадеканом и в мясо-пептонном бульоне (МПБ) (24°С, стационарная фаза)

Среда Биомасса, г/л Суммарные липиды, % к биомассе ТДМ, % от биомассы ТММ, % от биомассы

И Б Я Б И Б И Б

Чапек, с16н34 3,0 2,9 23,3 15,6 2,3 1,5 1,2 1,0

МПБ 2,0 1,9 4,3 4,1 1,8 1.6 0,6 0,4

Исследование содержания липидов в клетках лабораторных И- и Б-вариантов в динамике роста на среде с н-гексадеканом (рис. 4) показало, что образование миколатов в клетках И- и Б-вариантов идет параллельно с накоплением биомассы и прекращается при достижении стационарной фазы роста. В клетках обоих вариантов в течение всего периода роста содержание ТДМ превышало содержание ТММ.

Таким образом, основное различие в липидном составе свежевы-деленного из природного местообитания гладкого варианта и хранящегося в лаборатории морщинистого варианта И. егу^гороНэ заключается в полном отсутствии димиколата трегалозы в клетках Б-варианта.

% от биомассы

Время, сутки

- * - Содержание ТДМ, % от биомассы (Э)

- • - Содержание ТММ, % от биомассы (Б) —*—Содержание ТДМ, % от биомассы (К)

* Содержание ТММ, % от биомассы (И)

- ■ - Сухая биомасса, г/л (в) —■—Сухая биомасса, г/л (И)

Рис. 4. Рост и образование ТММ и ТДМ клетками Б-и И-вариантов Е. егуМгороИэ (данные по содержанию ТДМ и ТММ приведены в процентах от веса сухой биомассы); среда Чапека с н-гексадеканом.

Еще H.A. Красильников [1949], описывая «гладкие» и «бугристые» (морщинистые) расы Mycobacterium mucosum (позже определенного как R. erythropolis), отмечал, что «гладкие» расы не способны к росту на парафинах или растут очень плохо, а «бугристые» хорошо растут и активно усваивают различные углеводороды. Однако причины подобных различий до сих пор не были установлены. Из полученных нами данных следует, что именно ТДМ играет ключевую роль в обеспечении способности клеток к активному росту на гидрофобных субстратах. Отсутствие ТДМ у свежевыделенного S-варианта сопровождается низким по сравнению с R-вариантом содержанием других свободных липидов, в частности, миколовых кислот. Следствием этого является пониженная гидрофобность клеточных стенок S-формы, что затрудняет пассивное поступление липофильного субстрата в клетку и, соответственно, влияет на качество роста этих бактерий на средах с углеводородами. При повторном исследовании липидного состава S-варианта после поддержания его в течение двух лет в лабораторных условиях ТДМ был обнаружен в его клетках. Также было отмечено, что колонии S-варианга стали более сухими по консистенции по сравнению со свежевыделенным штаммом, а накопление биомассы на среде с гексадеканом приблизилось к таковому у R-варианта.

Очевидно, именно появление в составе клеток S-варианта ТДМ, этого наиболее гидрофобного из всех специфических «стеночных» липидов, привело к перестройке клеточной стенки исходного штамма и приближению его по культуральным признакам и способности к усвоению углеводородов к R-форме. Снижение содержания липидов в целом, ди- и, особенно, мономиколатов в клетках обоих вариантов при пересеве на МПБ можно интерпретировать, с одной стороны, как приближение R-варианта к S-форме, а с другой стороны, как восстановление характерных культуральных и физиологических признаков S-варианта. Очевидно, изменение структуры клеточной стенки и степени ее гидрофобности путем регуляции биосинтеза миколовых кислот и их эфиров с трегалозой позволяет клеткам легко приспосабливаться к различным типам органического субстрата.

Глава 7. Устойчивость родококков к некоторым экстремальным

факторам среды (соленость, высокие и низкие температуры)

Бактерии рода Rhodococcus являются постоянными компонентами нефтеокисляющих биоценозов [Коронелли и др., 1994], они встречаются практически повсеместно: в почве, в пресных и морских водах, в тропи-

ках и Сибири. Все эти биотопы различны по основным физико-химическим характеристикам, таким как температура, влажность, рН, соленость, концентрация органических веществ, а также степень загрязнения углеводородами. Значительные отклонения какого-либо фактора от ростового оптимума воспринимаются организмом как стрессовые воздействия. Распространение бактерий одного и того же вида в биотопах, существенно различающихся по физико-химическим показателям, предполагает существование биохимических и иных механизмов, обеспечивающих высокую толерантность бактерий к стрессовым факторам среды.

В процессе ответа на стрессовые условия микроорганизмы вырабатывают различные механизмы защиты, одним из которых является усиленный синтез низкомолекулярных органических соединений, в частности, трегалозы [Волков, 1994; Кашнер, 1981; Феофилова, 1992J. В клетках родококков трегалоза является обязательным продуктом клеточного синтеза, поскольку входит в состав специфических липидов клеточных стенок этих бактерий - мономиколатов и димиколатов трегалозы [Коронелли, 1984; Koronelli, 1988]. Исходя из предположения, что защитные функции при стрессовых воздействиях на клетки родококков выполняет именно этот дисахарид, был изучен биосинтез трегалозы при действии на клетки вариантов R erythropolis высокой и низкой температур и повышенного осмотического давления.

На повышение осмотического давления, как внезапное, так и «запланированное», клетки R- и S-вариантов R. erythropolis отвечают усилением биосинтеза трегалозы (табл. 3). При этом вся синтезированная трегалоза сохраняется внутри клеток. Защитная роль трегалозы при осмотическом стрессе заключается в выравнивании осмотического давления внутри и вне клеток и поддержании тургора цитоплазмы. Накопление трегалозы не приводит к увеличению ионной силы цитоплазмы [David е.а., 1991] и, следовательно, не ведет к дестабилизации мембран и ферментных комплексов. Именно высокий уровень свободной трегалозы в клетках S-варианта обеспечивает ему лучший рост при повышенной концентрации NaCl.

В условиях "запланированного" осмотического стресса происходит значительное увеличение содержания трегалозы в клетках обоих вариантов, отмечено более чем двукратное превышение коли-

Таблица 3.

Образование трегалозы клетками R- и S-вариантов R. erythropolis в зависимости

от источника углерода (гексадекан, мясо-пептонный бульон- МПБ) и условий культивирования.

Источник углерода "Условия культивирования Биомасса, г/л Количество трегалозы

в культуральной жидкости, мг/г сухой биомассы в клетках, мг/г сухой биомассы суммарное, мг/г сухой биомассы суммарное, в % от контроля

R S R S R S R S К S

Н-С1вН.,4 контрольные: среда 2, 24°С 4,3 2,8 0 0 1,0 3,1 1,0 3,1 100% 100%

H-Cl бН.Ч4 контроль + 1 час при +39°С 4,3 2.8 2,0 5,8 2,2 6,4 4,2 12,2 420% 394%

H-CieH34 контроль + 1 час при +4°С 4,3 2,8 5,2 15,2 2,7 10,3 7,9 25,5 790% 823%

н-С,6Нз4 контроль + 2 часа в среде с 5% МаС1 4,3 2,8 0 0 1,8 7,0 1,8 7,0 180% 226%

H-Ci«H34 контроль • 5% МяС1 1,5 2,0 0 0 1,8 3,9 1,8 3,9 180% 126%

МПБ среда МПБ, 24°С 1,0 0,2 не определяли не определяли 8,5 22,8 не определяли не определяли не рассчитывали не рассчитывали

чества трегалозы в клетках слизистого варианта по сравнению с морщинистым и отсутствие трегалозы в среде.

В клетках исследованных R- и S-вариантов R. erythropolis содержание трегалозы при тепловом шоке возрастает вдвое, а при холодовом - в три раза. Одновременно происходит выброс этого диса-харида в среду, отсутствующий при нормальных условиях роста (табл. 3). Предполагается, что быстрая и значительная потеря трегалозы при внезапном резком изменении температуры была вызвана нарушениями в структуре мембран неадаптированных клеток. При низкотемпературном воздействии повреждения оказались более существенными. Для компенсации потери трегалозы клетки интенсифицируют ее биосинтез.

Выход трегалозы в среду наблюдается только при температурном стрессе, причем в клетках S-варианта он заметно выше. При воздействии низкой температуры происходит значительно большая потеря трегалозы клетками обоих вариантов.

Защитная роль трегалозы при воздействии экстремальных температур выражается в ее взаимодействии с клеточными полимерами и, вследствие этого, предотвращении обезвоживания цитоплазмы при высоких температурах и стабилизации структуры мембран при высыхании и замерзании [Феофилова, 1992; Сох, 1993; Hottiger е.а., 19876; Iwahashi е.а., 1995;J. Образуя близкие по своей пространственной ориентации к связям в водных кластерах водородные связи с фосфолипидами мембраны и другими клеточными полимерами, тре-галоза подменяет собой молекулы воды и предохраняет структуру мембран от повреждений, вызванных уходом (неважно, при испарении или кристаллизации) подвижной воды (Волков и др., 1992; Феофилова, 1992; Crowe е.а., 1987].

В предыдущей главе нами было показано, что S-вариант R. erythropolis содержит значительно меньше миколовых кислот и мико-латов трегалозы, что обусловливает меньшую по сравнению с R-формой гидрофобность клеточных стенок, отсутствие складчатой структуры колоний и слабый рост в среде с гексадеканом. Высокое, в отличие от R-варианта, содержание трегалозы также может быть связано с образованием избытка этого дисахарида из-за недостаточного биосинтеза миколовых кислот.

В клетках родококков трегалоза принимает участие в создании структуры клеточных стенок посредством образования специфических липидов и насыщения стенок миколовыми кислотами. Как было установлено ITakayama, Armstrong, 1977], перенос миколовых кислот от места их биосинтеза в клеточную стенку осуществляется через образование их моно- и диэфиров с трегалозой (миколатов трега-лозы). При изучении динамики биохимических изменений клеток R. erythropolis в зависимости от ростового субстрата (МПБ, глюкоза, гексадекан) была выдвинута гипотеза о том. что в клетках родококков имеется эффективная система регуляции синтеза биополимеров клеточной стенки [Гусев и др., 1980]. Сигналом к перестройке служит природа ростового субстрата, а процесс регуляции осуществляется прежде всего на уровне синтеза липидных компонентов клеточной стенки - миколовых кислот.

При росте клеток R. erythropolis в среде МПБ количество образующихся липидов и, в частности, миколовых кислот, крайне мало [Коронелли и др., 1979; наши данные]. Полученные данные о высоком содержании грегалозы в клетках, выращенных в МПБ, могут быть интерпретированы в свете этой гипотезы как нерегулируемый синтез трегалозы и ее невостребованность в связи с отсутствием миколовых кислот.

Обсуждая роль трегалозы в клетках родококков при стрессовых воздействиях факторов среды, следует отметить, что реакция R- и S-вариантов на перепады температуры и на осмотический шок является однотипной и выражается в резком увеличении биосинтеза трегалозы. При этом в клетках S-варианта (преобладающей формы в природных условиях) остается стабильным значительное превышение уровня трегалозы при всех воздействиях.

Обнаруженный защитный механизм ответа на различные стрессовые воздействия среды обеспечивает родококкам доминирующее положение в углеводородокисляющих биоценозах вод и почв различных климатических зон.

Глава 8. Лабораторные испытания бактериального биопрепарата для борьбы с нефтяным загрязнением

Нефтеокисляющая микрофлора является нормальным компонентом незагрязненных экосистем, но для интенсификации процессов самоочищения в некоторых ситуациях необходимо дополнительное внесение бактериальных препаратов. Это относится, прежде всего, к

северным районам, где за короткий теплый период года численность естественного бактериоценоза не успевает достигнуть значений, достаточных для полной утилизации присутствующих нефтепродуктов. Также не обойтись без использования бактериальных препаратов при залповых разливах нефтепродуктов в олиготрофных зонах мирового океана, где численность естественных углеводородокисляющих бакте-риоценозов крайне низка ¡Коронелли и др., 1997}.

Биопрепарат на основе R. erytliropolis был ранее использован для очистки от нефтяного загрязнения тундровой почвы (Коронелли, 1996]. Для применения данного препарата в водных системах необходимо было решить две проблемы: найти удобную форму внесенй* дополнительных удобрений (в олигогрофные водоемы) и способ to>c удержания на поверхности [Коронелли, 1996]. Проблема удержаний самих бактерий на поверхности в данном случае не стоит, так ка}( клетки родококков в силу гидрофобности клеточной поверхности обладают положительной плавучестью и хорошо прилипают к нефтяной пленке. Одним из возможных вариантов является использование гидрофобного сорбента с положительной плавучестью, содержащего ли-пофильные формы азота и фосфора, который был синтезирован на химическом факультете МГУ в группе профессора Г.В.Лисичкина и предоставлен автору для лабораторных испытаний.

Таблица 4.

Результаты лабораторных испытаний биопрепарата для борьбы

с нефтяными загрязнениями

Вариант опыта Внесение Использовано углеводородов, %*

биопрепарата сорбента удобрений сорбента, связанного с удобрениями

1 — — — — 10

2 — + + — 14

3 + — — — 24

4 + — + — 58

5 + + + — 60

6 + — — + 87

* - данные по количеству утилизированного углеводорода приведены в процентах от внесенного (500 г/м2) углеводорода с учетом потерь при экстракции

При внесении в сосуды, содержащие гексадекан (500 г./м2),

одного биопрепарата количество углеводородов в них уменьшилось на 24%. Отсутствие источников азота и фосфора лимитировало процесс биодеградации (табл. 4, вар. 3). Внесение азотно-фосфорных удобрений стимулирует активность биопрепарата - при этих условиях было утилизировано 58% гексадекана. Добавление того же сорбента, не содержащего удобрений, не влияло на эффективность препарата.

Максимальная степень утилизации гексадекана - 87% -была достигнута при совместном внесении биопрепарата и сорбента с закрепленными на нем соединениями азота и фосфора (табл. 4).

В ходе лабораторных испытаний бактериальный биопрепарат, предъявляющий собой сочетание лиофильно высушенных клеток И. егуШгороНв и гидрофобного сорбента, содержащего липофильные формы азота и фосфора, показал высокую углеводородокисляющую активность при утилизации нефтепродуктов с водной поверхности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ _ . _.

В водах Можайского водохранилища бактерии, способные к усвоению гидрофобной органики (в первую очередь, углеводородов), составляют часть естественно гетеротрофного бактериоценоза. Их количество невелико (десятки и сотни клеток в одном мл), но довольно стабильно: в течение всего периода наблюдений их численность варьирует в пределах одного порядка. Сукцессионные перестройки, происходящие при попадании в водоем углеводородов, заключаются в возрастании количества углеводородокисляющих бактерий (на 1-2 порядка) и изменении их таксономического состава.

В незагрязненных водах родовой состав определяется, в основном, сезонностью, поступлением береговых и паводковых вод. Родококки - одни, из самых активных деструкторов углеводородов - встречаются в прибрежной зоне водохранилища чаще и в большем количестве, чем в центральной. К концу лета в обеих частях водохранилища в углеводоро-докисляющем бактериоценозе преобладали ацинетобактерии. При загрязнении среды состав углеводородокисляющего сообщества зависит не только от количества углеводородов, но и от их типа: при преобладании н-алканов (дизельное топливо) большую часть составляли родококки. По мере исчерпания углеводородного субстрата состав углеводородокисляющего бактериоценоза снова приближается к таковому в незагрязненных водах.

Благодаря своему лидирующему положению в окислении углеводородов родококки могут служить индикатором загрязнения с[>еды гидрофобной органикой. Однако идентификация этих бактерий затруднена из-за их склонности к изменению культуральных признаков, которое наступает в результате смены условий культивирования или даже просто при хранении в лабораторных условиях.

В настоящей работе установлено, что форма и консистенция колоний родококков связаны со структурой их клеточных стенок, в частности, с содержанием в них специфических липидов и гликолипидов. Так, клетки, образующие сухие складчатые колонии (Г£-вариант) отличаются от клеток, формирующих гладкие колонии (Б-вариант), высоким содержанием димиколата трегалозы и миколовых кислот. Эти соединения придают клеткам И-варианта родококков высокую гидрофобность, что обеспечивает способность к пассивному поглощению углеводородов и, в конечном счете, их активное усвоение. Поэтому для интенсификации биодеградации углеводородного загрязнения в окружающей среде следует использовать клетки 11-варианга.

Из данных литературы известно распространение родококков в наземных и водных экосистемах разных климатических зон, что свидетельствует об их высокой устойчивости к таким экстремальным факторам внешней среды, как высокие и низкие температуры, повышенная соленость, длительное голодание, солнечное излучение (ультрафиолет). Проведенное нами исследование устойчивости И. егуМгороПя к осмотическому и температурному стрессам показало, что ответной защитной реакцией клеток на эти воздействия является интенсификация биосинтеза диса-харида трегалозы. В случае осмотического шока увеличение внутриклеточного содержания трегалозы обеспечивает выравнивание внутреннего и внешнего осмотического давления, предотвращая гибель клеток. При температурном шоке повышенное содержание трегалозы предохраняет клетки от обезвоживания при высыхании (тепловой шок) или при кристаллизации (холодовой шок). Воздействие температур, граничащих с критическими ростовыми значениями родококков, приводит, по всей вероятности, к нарушению цитоплазматической мембраны и, как следствие, к утечке трегалозы в среду. Чтобы компенсировать эти потери, клетки вынуждены интенсифицировать биосинтез этого дисахарида.

Благодаря эффективному окислению углеводородов и высокой сопротивляемости экстремальным воздействиям родококки были исполь-

зованы для интенсификации разрушения нефтяных углеводородов в тундровой почве (Коронелли и др., 1997). Применение родококков в водной среде предпочтительно по сравнению с другими биопрепаратами, поскольку липофильная клеточная стенка родококков удерживает бактерии в нефтяной пленке на поверхности воды и делает излишним применение каких-либо приспособлений (сорбентов и т.п.) для предотвращения вымывания клеток за пределы загрязненного участка. Однако обычно низкая трофнссть загрязненных водоемов требует внесения минеральных удобрений вместе с бактериальным препаратом. На химическом факультете МГУ в группе профессора Г.В.Лисичкина было разработано удобрение, подставляющее собой липофильные формы азота и фосфора, закрепленные на плавающем гидрофобном сорбенте. Наши исследования, проведенные в лаборатории, показали, что такая форма удобрений используется родококками и утилизация углеводородов идет с высокой эффективностью. Эти исследования открывают перспективу создания нефтеокис-ляющих биопрепаратов нового типа, состоящих из активного углеводоро-докисляющего агента (родококки) и закрепленных на плавающем сорбенте соединений азота и фосфора.

ВЫВОДЫ_

1. Естественный углеводородокисляющий бактериоценоз Можайского водохранилища в летний период представлен, главным образом, бактериями трех родов: Acinetobacter, Pseudomonas и Rhodococcus. Численность углеводородокисляющих бактерий в летний сезон стабильна и находится на уровне, характерном для чистых и слабозагрязненных нефтепродуктами водоемов (101 - Юг кл/мл).

2. Загрязнение водоема нефтепродуктами вызывает перестройку естественного углеводородокисляющего бактериоценоза, которая выражается в увеличении численности бактерий (на 1-2 порядка) и в изменении его таксономического состава (преобладание бактерий рода Rhodococcus).

3. Установлена связь между типом колоний бактерий R erythro-polis и содержанием в клетках специфических липидов - миколатов тре-галозы; выявлена ведущая роль миколатов трегалозы в обеспечении способности родококков к росту на гидрофобном субстрате.

4. Феноменальная устойчивость родококков к экстремальным воздействиям среды, благодаря которой стало возможным их повсеместное распространение, обусловлена действием в клетках защитного меха-

низма ответа на стресс, который заключается в интенсификации биосинтеза трегалозы.

5. Для испытанного ранее на почве бактериального биопрепарата «Ро до кокк» найден способ его использования с максимальной эффективностью в водной среде, который заключается в одновременном внесении биопрепарата и минеральных удобрений, закрепленных на гидрофобном плавучем сорбенте.

ПУБЛИКАЦИИ _> •'•;• - - •-;, • ■ fjl

1. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Ильинский В.В., Комарова Т.И., Поршнева О.В./ Видовая структура углеводородокисляющих бац-териоценозов водных экосистем разных климатических зон// Микробиология. 1994. Т. 63. Вып. 5. С. 917-923.

2. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Поршнева О.В./ Липиды R- и S-вариантов Rhodococcus erythropolis// Микробиология. 1995. Т. 64. Вып. 6. С. 769-771.

3. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Поршнева О.В./ Биосинтез липи-дов трегалозы S- и R-вариантами Rhodococcus erythropolis// В кн.: Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы. Тез. докл. межд. конф. 8-11 окт. 1996. Пермь. С. 51.

4. Комарова Т.И., Поршнева О.В., Коронелли Т.В./Образование трегалозы клетками R- и S-вариантов Rhodococcus erythropolis в условиях стресса//Микробиология. 1998. Т.67. Вып.З. С. 443-446.

5. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Поршнева О.В., Дермичева С.Г./ Изменение липидного состава клеток R- и S-вариантов Rhodococcus erythropolis при длительном хранении на лабораторной среде// Микробиология. 1998 (в печати).

6. Ильинский В.В., Поршнева О.В., Комарова Т.И., Коронелли Т,В./ Углеводородокисляющие бактериоценозы незагрязненных водоемов и их изменения под влиянием нефтяных углеводородов (на примере юго-восточной части Можайского водохранилища) //Микробиология. 1998 (в печати).

7. Ильинский В.В., Поршнева О.В., Семененко М.Н./ Углеводородокисляющие микроорганизмы прибрежных и открытых вод Можайского водохранилища: сравнительная активность и вклад в процессы естественного очищения в летний период// Водные ресурсы. 1998 (в печати).