Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Консервация и гарантированное сохранение родококков EX SITV

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Консервация и гарантированное сохранение родококков EX SITV"

На правах рукописи

Каменских Татьяна Ннкодимовна

КОНСЕРВАЦИЯ И ГАРАНТИРОВАННОЕ СОХРАНЕНИЕ РОДОКОККОВ EX SITU

03.00.07 - микробиология'

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь - 1998

Работа выполнена в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь

Научный руководитель:

доктор биологических наук И.Б. Ившина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.И. Саралов, кандидат биологических наук В.П. Петровских

Ведущая организация - НИИ микробиологии МО РФ, г. Киров

Защита состоится 30 октября 1998 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета К 200.46.01 Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан "¿О" сг-нызфс, 1998 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук ■— И.Б. Ившина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В условиях прогрессирующего процесса разрушения биологического разнообразия одним из наиболее эффективных способов охраны микробиолопиеских ресурсов является их поддержание в современных коллекциях. Созданная в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН коллекция бактерий рода Rhodococcus специализируется на изучении и сохранении чистых культур, обладающих свойствами прикладного назначения.

Перспектива практического использования алканотрофных родокок-ков в различных областях биотехнологии и охраны окружающей среды - от биоиндикации углеводородных залежей до интенсификации процессов биодеградащш нефтяных загрязнений, синтеза кормового белка на природном газе до биокатализа в тонком органическом синтезе - требует надежных методов гарантированного хранения культур без потери их исходных свойств.

В литературе описаны различные способы консервации большого разнообразия физиологических групп микроорганизмов (Сидякина, 1990; Heckly, 1978; Kirsop, 1991). В последнее время предлагается много новых методов (Доронина и др., 1992; Фельдман, Маханева, 1994; Henry, Kirsop. 1989; Malik, 1990, 1996; Gherna, 1994), однако ни один из них не является универсальным. Наиболее оправдано, по-видимому, применение глубокого замораживания и высушивания. Помимо оптимального режима самого процесса консервации необходим ряд дополнительных условий, как то: наличие протектора, оптимальная концентрация исходной суспензии, соответствующий регидратант, благоприятная среда восстановления. Следует учитывать и то, что разные виды и даже штаммы обладают специфическими реакциями на высушивание - регидратацию. Все это диктует необходимость индивидуального подбора наиболее эффективных условий хранения для каждой конкретной систематической группы организмов.

Следует отметить, что на хранение, как правило, закладываю юя микроорганизмы, предварительно выращенные на богатых питательных средах. Использование таких сред для родококков, осуществляющих синтез на основе углеводородных субстратов, представляется не совсем корректным. Так, известно, что культивирование на сложных питательных средах приводит к снижению содержания клеточных липидных компонентов, облегчающих потребление гидрофобного углеводородного субстрата (Мпль-ко, Егоров, 1991; Коронелли и др., 1993, 1994), повышению антибиотшсо-чувствительности (Ившина и др., 1990), а, следовательно, к снижению конкурентноспособности, уменьшению биохимической активности организмов в отношении ряда ксенобиотиков (Ротмистров и др., 1990).

Цель настоящей работы - разработка оптимальных методов сохранения жизнеспособности и стабилизации потенциально биотехнологически ценных свойств Rhodococcus spp. с учетом биологических особенностей пх

клеток. Формирование дублирующей коллекции культур родококков и автоматизированной базы данных по методам их хранения.

Конкретные задачи исследования:

1. Испытание традиционных методов консервации микроорганизмов с целью подбора эффективных способов сохранения чистых культур Л/ш-йососсиь Брр.

2. Изучение влияния условий предварительного культивирования клеток родококков на их жизнеспособность и биохимическую активность при хранении различными способами.

3. Разработка новых методов и рекомендаций по консервации и последующему хранению коллекционных культур родококков с учетом их структурных и физиолого-биохимпческих особенностей.

4. Оценка рациональной продолжительности хранения КЬойосоесил-

эрр.

5. Формирование автоматизированной базы данных по методам консервации и условиям хранения штаммов, поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алкапотрофных микроорганизмов ИЭГМ.

Научная новизна работы. Апробирован широкий спектр методов для сохранения чистых культур КИойососсш Брр. Показано, что наиболее оптимальный и надежный метод долгосрочной консервации родококков -лиофилизация.

Впервые исследована зависимость жизнеспособности сохраняемых клеток родококков от источника углеродного питания в среде их предварительного культивирования. Установлено, что клетки с углеводородным питанием более устойчивы к действию неблагоприятных внешних факторов - замораживанию и высушиванию. Показано влияние уровня десагура-ции клеточных жирных кислот на жизнеспособность и длительность хранения лиофилизированных клеток алкапотрофных родококков.

Практическое значение. Подобраны оптимальные методы консервации культур Икос1ососсш эрр., гарантирующие сохранение их жизнеспособности и исходных свойств. Предложен новый способ высушивания клеток на мембранных фильтрах. К практическому использованию для длительного хранения родококков рекомендован метод лиофилизации. Создана дублирующая коллекция сублимированных чистых культур Я/юс/ососст г>рр., Согс!ола Брр., Д/е/ггд эрр. Рекомендовано поддержание штаммов-деструкторов и продуцентов практически ценных веществ по оптимизированным схемам хранения. На основе пакета жрограммы СУБД Рагас1о.\ (версия 4.5.) сформирована компьютеризированная база данных по методам консервации и хранения штаммов родококков в Региональной профилированной коллекции алкапотрофных микроорганизмов ИЭГМ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Гарантированное сохранение чистых культур бактерий рода Юю-йососсиз можно осуществлять в лабораторных условиях с использованием широкого спектра краткосрочных и долгосрочных методов.

2. Клетки родококков с предварительно индуцированным алкано-трофным метаболизмом более устойчивы к действию неблагоприятных внешних факторов - замораживанию и высушиванию.

3. Наиболее надежный способ сохранения исходных свойств Rhodo-coccus spp. - криоконсервация и лиофилизация клеток родококков, предварительно выращенных на н-алканах.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Международной научной конференции "Environmental Pollution (ICEP'95)", Санкт-Петербург, 1995; Международной конференции "Перспективы развития естественных наук на Западном Урале", Пермь, 1996; Международной конферешщи "Microbial Diversity: current situation, conservation strategy, and ecological aspects (ICOMID'96)", Пермь, 1996. По,теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 таблицей и 14 рисунками; состоит из введения, обзора литературы, трех глав экспериментальной части, обсуждения и выводов. Список литературы включает 228 наименований работ, в том числе 137 отечественных и 91 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили 85 чистых культур алканотрофных бактерий, принадлежащих к восьми видам Rhodococciis (R. "aquosus", R. equi, R. erythropolis, R. fascians, R. "longns", R. opacus, R. rhodochrous и R. ruber), а так же трем видам родов Dietzia (D. maris) и Gor dona (G. rubroper-tinctus, G. terrae), ранее считавшимся родококками (Rainey et al., 1995; Stackebrandt et al., 1988). Рабочая коллекция включала как типовые культуры, так и выделенные в 1986-1992 гг. из разных регионов бывшего Советского Союза и сохраняемые в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ' УрО РАН (Каталог штаммов .... 1994).

Культуры параллельно выращивали на мясопептонном агаре, минеральной среде Rhodococciis с пропаном' (и-бутаном) в газовоздушной атмосфере (1:5),* минеральной среде Rhodococcus с н-гексадеканом (1,0 об. %) с добавлением раствора микроэлементов и тиамина (4 мкг/л). В работе использовали исходные взвеси бактериальных клеток различной плотности (105 - 1012 клеток/мл), отобранных в стационарной фазе роста культуры.

Среди методов краткосрочного хранения испытывали: субкультивирование (на мясопептонном агаре и'минеральной среде с углеводородами), хранение на "голодном" агаре, мясопептонном агаре под слоем вазелинового масла, в дистиллированной воде, 0,5%-ном растворе NaCl, на твердых носителях (в кварцевом песке, на дисках фильтровальной бумаги и мем-

бранных фильтрах), криоконсервацшо при -20°С. Для длительного хранения апробировали высушивание клеток в вакууме из замороженного состояния - метод лиофилизации.

Количество жизнеспособных клеток до и после консервации через определенные сроки хранения определяли по числу колониеобразующих единиц при высеве на агаризованные питательные среды. Эффективность используемых методов хранения оценивали по показателю выживаемости поддерживаемых культур в процентах по отношению к контролю (после лиофилизации — относительно исходного количества клеток, а при последующем хранении - относительно числа клеток, оставшихся жизнеспособными после сублимации). Константы скорости отмирания лиофилыю высушенных культур родококков и рациональную, длительность хранения их в лиофилизированном состоянии рассчитывали по известным формулам (Нестеров и др., 1986; Mikata, Banno, 1989).

Контроль чистоты исследуемых культур проводили методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием, набора специфических моновалентных поликлональных иммунных сывороток против типовых штаммов Rhodococcus spp., Gordona spp. и Dietzia spp. (Барбан и др., 1988).

Все исследования сопровождались контрольной постановкой отличительных тестов: усвоение натриевых солей органических кислот, образование кислоты из углеводов, рост на моноэтаноламине, наличие ацетами-дазной, пропанокисляющей и деструктивной активностей, устойчивость к действию экстремальных факторов внешней среды и антимикробных агентов, а также изучением морфологических и культуральных характеристик сохраняемых культур (Методы общей бактериологии, 1983; Gould, Bowie, 1952; Gordon, Smith, 1953; Gordon, Mihm, 1957; Tsukamura, 1967, 1969).

Анализ метиловых эфиров клеточных жирных кислот осуществляли методом газовой хроматографии по известным методикам (Методы общей бактериологии, 1983). Наличие взаимосвязи между выживаемостью бактериальных клеток Rhodococcus spp. и интенсивностью эндогенного дыхания изучали с помощью полярографического метода (Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом, 1973).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета компьютерных программ Statistica (версия 3.4 для Windows). При оценке степени достоверности средних данных использовали t-критерий Стьюдента (Лакин, 1990). Для решения отдельных задач применяли программы корреляционного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительное исследование методов хранения, обеспечивающих выживаемость и стабильность исходных свойств Rhodococcus spp. Сравнительное изучение традиционных методов хранения показало, что наиболее приемлемы способы поддержания живых культур родококков на "голодном" агаре и в 0,5%-ном растворе хлорида натрия (табл. 1). Высокий про-

цент их выживаемости (до 83%) и сохранение биологической активности в течение одного года обусловлены, по-видимому, известной реакцией 11Ьос1ососсш- зрр. на истощение питательной среды - образованием переживающих форм в результате дробления исходных клеток (Коронелли и др.. 1988; Соо(Ш1о\у, 1983).

Таблица 1. Жизнеспособность исследуемых культур родококков при хранении в 0,5%-ном растворе хлорида натрия

Виды, штаммы Число жизнеспособных клеток х Ю10/ мл (выживаемость, %)

до хранения через 6 месяцев через 12 месяцев

R. rhodochrous

ИЭГМ 62 т 21,0 18,7 (89,0) 16,0 (76,2)

R. ruber

ИЭГМ 70 т 23,3 13,0 (55,8) 11,5 (49,4)

ИЭГМ 71 52,0 48,0 (92,3) 43,0 (82,7)

ИЭГМ 83 25,0 16,0 (64,0) 15,3(61,2)

ИЭГМ 84 189,0 96,4(51,0) 88,9 (47,0)

ИЭГМ 87 97,0 66,3 (68,4) 62,0 (63,9)

ИЭГМ 333 84,0 77,3 (92,0) 70,0 (83.3)

ИЭГМ 375 104,5 45,0 (43,1) 42,0 (40.2)

ИЭГМ 443 35,0 30,0 (85,7) 27,3 (78.0)

ИЭГМ-518 79,0 71,0 (89,9) 57,0(72.1)

Примечание.1 Здесь и в табл. 3,4,5- типовой штамм.

Как показали исследования, использование способа консервации родококков под вазелиновым маслом не эффективно. Это обусловлено тем, что представители изучаемой группы микроорганизмов являются хорошими деструкторами минерального масла, основные компоненты которого -углеводородные составляющие, а также успешно развиваются в условиях ограниченного доступа кислорода.

Используя способность исследуемых организмов к адгезии, мицели-альному росту и высокую их устойчивость к высушиванию, в качестве полезного приема предложен метод хранения родококков "на мембранных фильтрах. Данный метод предполагает наложение фильтров на поверхность питательных сред с последующим снятием мембран с выросшими клетками и хранением в закрытых флаконах при 4°С. Длительность сохранения жизнеспособности иммобилизованных клеток без изменения ими исходных свойств, по нашим данным, составляет не менее 5 лет. Данный метод может быть использован в практике лабораторий, где отсутствует дорогостоящее оборудование для лиофилизации и криоконсервации.

Для поддержания коллекционных штаммов испытан метод криоконсервации бактериальной суспензии при температуре -20°С в условиях морозильной камеры. Установлено, что родококки переносят процедуру замораживания с незначительными потерями численности. Как видно из

табл. 2, процент их выживаемости при хранении постепенно снижается - о г 83% после первых суток консервации до 50%-ного уровня - в течение двух лет. Следует отметить, что применение криопротектора, в частности 10%-ного глицерина, способствует сохранению большего числа жизнеспособных клеток одних штаммов (в частности, R. ruber ИЭГМ 333), в то время как криоконсервация других штаммов (R. ruber ИЭГМ 83) более эффективна без применения протектора.

Таблица 2. Влияние криопротектора на выживаемость родококков после криоконсерващш при -20°С и последующего сохранения в течение двух лет числа жизнеспособных клеток/мл)

Срок хранения Я ruber ИЭГМ 333 Я ruber ИЭГМ 83

Контроль (без протектора) Глицерин (10%) Контроль (без протектора) Глицерин (10 °/о)

0 7,23 (100,0) 6,92 (100,0) 7,30(100,0) 7,08(100.0)

1 суг 7,15 (83,48) 6,91 (99,11) 7,21 (83,16) 7,04 (94.03)

1 мес 7,08 (70,58) 6,85 (84,52) 7,22 (85,00) 7,01 (83,33)

2 мес 7,06 (67,64) 6,89(92,85) 7,20 (80,00) 6,99 (82,50)

3 мес 7,04(64,70) 6,82 (78,57) 7,19(78,61) 6,89 (65,00)

4 мес 6,98 (57,05) 6,71(60,71) 7,15(70,00) 6.93 (71,66)

5 мес 6,97 (54,70) 6,83 (79,76) 7,11 (65,00) 6,96(75.83)

6 мес 6,99 (57,64) 6,78(72,61) 7,20 (80,00) 6,89 (64,16)

24 мес 6,87 (43,52) 6,67 (55,95) 7,04 (55,00) 6,71 (42,50)

Примечание. В скобках приведен % от исходного числа клеток родококков.

Серией опытов по многократному замораживанию-оттаиванию бактериальной суспензии установлено, что исследуемые родококки высоко устойчивы к действию повторного низкотемпературного стресса, так как даже в результате десяти циклов криоконсервации - размораживания (с интервалом хранения 20 дней) количество жизнеспособных клеток снижается лишь на один-два порядка. Применение глицерина в качестве криопротектора способствует повышению выживаемости родококков по сравнению с контрольным вариантом более чем в 2 раза.

Среди способов длительного хранения родококков наиболее эффективным является метод лиофилизации. Как видно из табл. 3, все культуры выдерживают лиофилизацию, но не все одинаково успешно - в зависимости от условий опыта и особенностей штамма. Выявленный процент гибели клеток родококков довольно высок по сравнению с таковым других таксономических групп. Нельзя говорить о повышенной чувствительности к

процессу лиофилизации конкретного вида КЪос1ососси^, так как даже в пределах одного таксона наблюдается различный уровень жизнеспособности культур. Максимальная выживаемость родококков достигается при использовании в качестве защитной среды сахарозо-желатинового агара Файбича и регидратации 0,5%-ным раствором хлорида натрия.

Таблица 3. Выживаемость Шюйососсиь врр. в зависимости от условий лиофилизации п регидратации бактериальных клеток (% от исходного числа клеток)

Виды, штаммы Крио-ттро-тектор Регидратант

дистиллированная вода водопроводная вода 0,5%-ный раствор NaCl минеральная среда

R. "longus"

ИЭГМ27 СЖА 0,6 0,7 1,2 -

ИЭГМ 68 СЖА 1,1 3,1 3,2 -

ИЭГМ 69 СЖА 0,9 1,5 2,0 -

R. fascians

ИЭГМ 34 СЖА 0,0 30,0 32,2 -

ИЭГМ 170 СЖА 7,0 11,1 18,5 -

R. opacus

ИЭГМ 56 СЖА 1,9 2,2 0,9 -

ИЭГМ 57 СЖА 1,4 2,9 3,0 -

ИЭГМ 58 СЖА 0,3 0,9 1,9 -

R. rhodochrous

ИЭГМ 62т СЖА 39,1 18,8 39,1 -

ИЭГМ 63 СЖА 1,8 21,4 22,6 -

ИЭГМ 64 СЖА 18,5 15,4 25,0 -

R. ruber

ИЭГМ 70т СЖА 10,0 25,3 27,3 -

ИЭГМ 71 СЖА 0,4 0,4 2,4 0.5

К - 19,6 20,0 6.8

ИЭГМ 76 СЖА 10,7 13,3 6,3

К 0,9 0,4 1,3 0,6

ИЭГМ 84 СЖА 2,3 2,4 4,6 3,1

К 0,2 1,8 1,0 1,3

ИЭГМ 86 СЖА 6,5 11,8 28,8 4,1

К 5,9 11,2 24,1 2,9

ИЭГМ 87 СЖА 8,3 8,5 8,6 3,9

К 2,5 4,2 1,7 0,6

ИЭГМ 333 СЖА 14,6 34,1 39,0 13,4

К 45,1 29,3 39,0 13,4

Примечание. СЖА - сахарозо-желатиновый агар Файбича; К - минеральная основа среды Ююс1ососсиз в качестве контроля. «-» Нет данных.

В экспериментах испытывались исходные взвеси различной плотности, от 108 до 1012 клеток/мл. Использование концентрации порядка 108-10 ' клеток/мл позволяет сохранить в жизнеспособном состоянии достаточно большое число клеток Rhodococcus spp., поэтому применение более высоких исходных титров не целесообразно.

Анализ жизнеспособности родококков в течение первого года хранения показал, что высокий процент гибели клеток в процессе сублимации не влечет за собой последующего быстрого вырождения бактериальной суспензии (табл. 4). Скорость гибели клеток при хранении значительно замедляется по сравнению с таковой за время лиофилизации. Наиболее интенсивное отмирание клеток происходит в течение первого месяца хранения культур, при этом процент выживаемости уменьшается в среднем в 10,8 раз. Полугодовое хранение приводит к последующему постепенному падению титра, однако к исходу первого года в консервированных суспензиях остается еще до 44,8 % живых клеток.

Длительный период эксперимента позволил оценить эффективность долгосрочного хранения лиофилизированных коллекционных культур (табл. 5). По нашим данным, большинство штаммов, испытанных на выживаемость в течение 8 лет консервации, успешно восстанавливается с высокой степенью жизнеспособности, что позволяет сделать положительный прогноз их долгосрочного хранения без промежуточных пересевов на свежую питательную среду. На основании экспериментальных данных рассчитаны скорости гибели клеток и рациональные сроки хранения сублимированных препаратов коллекционных штаммов. Так, для штаммов R. ruber, предварительно культивируемых на мясопеитонном агаре, константа скорости отмирания лиофилизированных клеток равняется в среднем 0,24, а рациональная длигельность их хранения определяется в границах от 22,6 до 43,9 лет (см. табл. 5).

Следует отметить, что наиболее высокая степень жизнеспособности отмечена у штаммов родококков, имеющих красно-оранжевый пигмент. Это представители видов R. ruber и R. rhodochrous. В тоже время среди утраченных в процессе хранения и имеющих критический уровень жизнеспособности - неокрашенные штаммы, принадлежащие к видам R. "longus" и R. opacus. Очевидно, между наличием красно-оранжевых пигментов и резистентностью клеток к лиофилизации существует прямая зависимость. Высказанное предположение согласуется с литературными данными о биологической функции каротиноидов, как природных антиокси-дантов, предотвращающих клеточные липиды от перекисного окисления (Владимиров, 1979), и подверженности компонентов клеток в лиофильно высушенном состоянии окислительным процессам (Ураков, 1988).

Как показали наши исследования, отмирание клеточной популяции родококков, переживших лиофилгаацшо, происходит в два этапа: 1-й этап, включающий быструю гибель не приспособлешшх к замораживанию -высушиванию клеток, и П-й этап - медленное отмирание адаптированных клеток. Ориентировочная длительность сохранения жизнеспособности

штаммами Ююйососст эрр. в лиофилизированном состоянии составляет от 6 до 44 лет.

Контрольное определение ключевых признаков исследуемых штаммов после хранения в лиофилизированном состоянии выявило сохранение основных морфологических характеристик, всех особенностей окисления субстратов и деструктивных способностей, присущих интактным клеткам Ккосососсия эрр.

Таблица 4. Жизнеспособность лиофилнзированных культур Ы1ойососси% врр. при хранении в течение одного года

числа живых клеток / мл (показатель выживаемости, %)

Виды, штаммы сразу после через 1 мес через 6 мес хра- через 12 мес

лиофилизации хранения нения хранения

R. erythropolis

ИЭГМ 7Т 11,72(0,6) 8,43 (0,05) 8,00 (0,02) -

ИЭГМ 200 8,60 (0,00003) 7,14 (3,5) 6,92 (2,0) -

R. fascians

ИЭГМ 34 6,74 (0,0004) 6,51 (58,2) 6,46 (52,7) 5,59(7.1)

ИЭГМ 170 11,08 (0,2) 10,67 (39,2) 9,59(3,0) -

R. "longus"

ИЭГМ 27 8,04(1,2) 6,81 (5,9) 6,34 (2,0) 6,04(1,0)

ИЭГМ 68 9,48 (0,04) 8,54 (11,7) 8,28 (6,3) -

ИЭГМ 69 6,15 (0,0002) 6,04 (78,6) 5,86(51,4) 4,85 (5,1)

R. opacus

ИЭГМ 56 6,81 (0,9) 6,57 (56,9) 6,20 (24,6) 6,04 (16,9)

R. rhodochrous

ИЭГМ 62т 8,32 (0,009) 8,43 (123,6)* 8,11 (61,9) 7,97 (44,8)

R. ruber

ИЭГМ 70т 8,95 (0,01) 8,61 (45,6) 8,28(21,1) 8,15(15,6)

ИЭГМ 74 9,65 (0,0002) 8,15 (3,1) 9,20 (35,6)* 8,20 (4,2)

ИЭГМ 83 8,84 (0,004) 7,54 (5,4) 8,62 (60,7)* 7,76 (8,4)

ИЭГМ 84 8,71 (0,004) 7,96 (17,8) 8,30 (39,2)* 7,88(15,1)

ИЭГМ 87 8,76 (0,001) 7,88(13,3) 8,08(21,1)* 7,63 (7,5)

ИЭГМ 333 ' 9,79 (0,07) 9,20 (27,4) 8,76 (9,4) 8,54 (5.6)

Примечание. * Здесь и в табл. 5 - неизбежные отклонения экспериментальных данных от теоретически рассчитанной кривой гибели клеток при увеличении сроков хранения. Многие авторы (Ротмистров и др., 1990; Куплетская, Аркадьева, 1997; ГуЦкага, Ваппо, 1989) также регистрируют увеличение числа жизнеспособных клеток при долгосрочном хранении. Чаще всего причины этого явления не обсуждаются. Они могут бьггь разными: от механических при отсутствии автоматической системы разлива бактериальной взвеси по ампулам до чисто биологических. Мы полагаем, что частично решить этот вопрос можно методически: при проверке жизнеспособности клеток необходимо вскрывать из каждой серии одновременно закладываемых ампул не менее трех, готовить усредненную пробу и в ней через ряд последующих разведений с высевом на агаризованную питательную среду определять титр клеток, переживших лиофилизацию.

Таблица 5. Изменение жизнеспособности лнофнлнзироваиных бактерий коллекционного фонда н перспективы их длительного хранения

^ числа жизнеспособных клеток / мл

Виды, штаммы через через через через К, год' РДХ, годы

2 года 4 года б лет 8 лет

О. гиЬгореПтсш

ИЭГМ 95 т 7,60 - 7,81* -

ИЭГМ 111 8,26 - 7,46 - 0,20 29.8

ИЭГМ 112 . 7,69 - 7,00 - 0,17 31.4

С. 1еггае

ИЭГМ 143 т 7,34 - 7,43* -

ИЭГМ 157 8,04 - - 7,28 0,13 43,1

ИЭГМ 160 - 7,57 - 7,65*

ИЭГМ 163 - 8,20 - 7,23 0,24 26.9

Д тага

ИЭГМ 49 - 5,70 - 0,00 6,1

ИЭГМ 55 Т - 8,75 - 9,20*

ИЭГМ 310 - 7,08 - 5,67 0,35 16.5

Я. егуЛгороНя

ИЭГМ 7 т 7,26 6,81 - - 0,23 21,8

ИЭГМ 8 - 7,15 6,15 - 0,50 12,9

ИЭГМ 14 6,49 - 4,30 - 0,55 8,9

ИЭГМ 23 8,32 7,68 - - 0,32 19.6

Я. /азегат

ИЭГМ 37 7,86 7,40 - - 0.23 24,4

ИЭГМ 39 8,40 7,54 - - 0,43 15,3

ИЭГМ 43 - 7,63 - 5,15 0,62 . 12,0

ИЭГМ 171 7,63 - 7,88* -

Я. «\ongus»

ИЭГМ 28 - 7,49 - 7,61*

ИЭГМ 30 - 4,90 - 5,34* -

ИЭГМ 69 5,23 - 0,00 0,00 5,9

Я. орасш

ИЭГМ 56 - 6,85 - 2,30 1,14 7.6

ИЭГМ 59 - 6,72 - 2,56 1,04 7,9

ИЭГМ 61 - 1,60 - 0,00

ИЭГМ 458 - 6,72 . - 5,60 0,28 18,4

Я. гИоЛосИгоих

ИЭГМ 62т 8,54* 7,23 - - 0,25 22,1

Я. гиЬег

ИЭГМ 70т - 7,56 - - 0,20 28,3

ИЭГМ 83 - - 7,83 - 0,14 43,9

ИЭГМ 89 8,71 8,23 - - 0,24 27.1

ИЭГМ 92 9,08 - - 7,24 0,31 22,6

ИЭГМ 371 - 7,93 7,53 - 0,20 30.2

Поиск эффективных условий консервации алканотрофных родокок-ков. Изложешше выше данные касалось вариантов опыта, когда исследуемые культуры предварительно выращивали на мясопептонном агаре. Однако оказалось, что предварительное культивирование клеток на углеводородных субстратах способствует повышению их устойчивости при замораживании и высушивании. Так, наиболее высокий уровень жизнеспособных клеток спустя 1 мес после сублимации отмечается для R. ruber, культивируемых на минеральной среде с пропаном (рис. 1). Подтверждение этих результатов получено в экспериментах по сравнительному исследованию измерению эндогенного дыхания 23 интактных и сублимированных культур R. ruber, предварительно выращенных на разных средах (рис. 2). Установлено, что родококки с углеводородным обменом более устойчивы к условиям лиофилизации и поддерживают клеточное дыхание на уровне, в 2 раза превышающем таковой R. ruber, выращенных на мясопептонном агаре.

ИЭГМ 87 ИЭГМ 74 ИЭГМ 84 ИЭГМ 333 ИЭГМ 71 ИЭГМ 443 ИЭГМ 83

□ 1: ЕЭ2

80 100 Выживаемость, %

Рис. 1. Влияние среды культивирования на выживаемость лиофшшзировапиых штаммов Rhodococcus ruber после одномесячного хранения. Среда культивирования: 1- мясо-пептонный агар; 2 - минеральная среда Rhodococcus с пропаном.

8

Ш1 □ 2

£

7

6

5

4

3

2

О

А

Б

Рис. 2. Сравнительное исследование активности эндогенного дыхания интактных (А) и лиофилизированных (Б) клеток Rhodococcus ruber, предварительно выращенных на разных средах. Среда культивирования: 1 - мясопептон-ный агар; 2 - минеральная среда Rhodococcus с пропаном.

По-видимому, высокий уровень их выживаемости является, прежде всего, отражением выявленной структурно-физиологической перестройки в условиях перехода клеток на углеводородное питание, а именно: повышенным содержанием липидных компонентов (Коронелли, 1980; Vestal, Репу, 1971), накоплением резервных питательных веществ, в частности, поли-ß-оксибутирата (Ившина и др., 1987; Глазачева и др., 1990), сверхсинтезом аминокислот (Ившина, 1982), обладающих, как известно (Волков, 1994), защитным действием, а также выявленным нами изменением жирно-кислотного состава клеток.

Как видно из табл. 6, родококки, использующие в качестве единственного источника углерода пропан, характеризуются повышенным уровнем непредельных жирных кислот по сравнению с таковым клеток, выращенных на мясопептонном агаре или н-гексадекане. Известно (MacLeod, Calcott, 1976; Russell, 1984), что увеличение ненасыщенности жирно-кислотных цепей является одним из факторов устойчивости бактериальных клеток к низкотемпературным воздействиям за счет увеличения текучести и повышения эластичности клеточных стенок и мембран.

Таблица 6. Влияние среды культивирования на жирно-кислотный состав клеток Rhodococciis ruber (% к общему количеству жирных кислот)

Жирные кислоты ИЭГМ 334 ИЭГМ 328

1 2 3 1 2 3

Сд 0 0,3 0,0 0,0 0,0 1,8 0.0

с 10:0 0,4 0,2 0,8 0,2 0,2 0,4

Cl 10 1,0 0,5 0,9 0,2 0,6 0.5

С] 2:0 0,3 0,3 2,3 0,5 0,7 0,6

Cl2:l 0,0 0,5 0,0 0,0 0,3 0,2

Cl3:0 0,0 0,6 0,0 0,2 0,3 . 0.2

C]3:l 0,0 0,0 0,0 0,2 1,2 0,7

рСм-о 0,0 0,0 0,4 0,0 0,0 0.0

Сн.О 3,8 2,6 15,0 1,2 3,8 2.3

Cl4:l 0,0 1,2 0,4 0,0 1,6 0.2

PCI5:0 0,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Cl5:0 0,0 0,6 0,0 4,1 1,7 0,8

Cl5:l 0,0 0,0 0,9 0,3 0,8 0.2

pCi6:0 0,0 3,5 0,8 0,0 0,0 1,9

Cl6:0 59,0 27,6 54,3 50,5 36,6 61.2

Cl6:l 3,4 8,9 16,1 9,0 16,5 6.6

с 17:0 0,0 0,0 0,0 0,6 1,5 0,2

Cl7.1 0,7 10,8 0,8 3,5 4,8 1.9

С-18:0 0,7 1,0 0,7 0,5 1,4 0.0

Cl8:l 29,1 8,6 3,1 27,6 26,2 7.3

Cl8:2 0,0 9,6 0,0 0,0 0,0 3.3

pC|90 0,4 0,0 0,0 0,0 0,0 0.0

Cl9-o 0,0 11,0 0,0 0,0 0,9 0,8

0,0 0,0 o;o- 0,0 0,0 1,6

Сг0:0 0,0 4,1 0,0 0,0 0,0 0.0

Qo:l 0,0 0,9 0,0 0,0 0,0 0.2

Ql.O 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 4.3

C21:l 0,0 0,8 0,0 0,0 0,0 0,0

n:0 66,6 52,0 75,2 58,0 49,5 73,2

n:l . 33,2 41,3 21,3 40,6 51,4 22,2

Примечание. 1 - мясопептонный агар; 2 - минеральная среда Rhodococcш с пропаном; 3 - минеральная среда Rhodococcus с н-гексадеканом. С9 0- число атомов углерода и двойных связей; п:0 - сумма насыщенных жирных кислот; п: 1 - сумма ненасыщенных жирных кислот.

Следует отметить, что наличие ненасыщенных жирных кислот в составе клеток пропанокисляющих родококков существенно ограничивает использование метода лиофилизации для культур, предварительно выращенных на пропане, так как в процессе хранения ненасыщенные жирные кислоты подвержены окислению. Согласно литературшлм данным (Кузнецов и др., 1975; Сох, Неск1у, 1973), даже кратковременный контакт с возду-

хом лиофилизированных клеток (в частности, при фасовке препаратов) может привести к запуску цепных реакций перекисного окисления липи-дов, способствуя изменению проницаемости мембраны за счет образования гидрофильных пор, что ухудшает выживаемость клеток после регидрата-ции. Как свидетельствуют результаты опыта (рис. 3), добавление 1 мМ а-токоферол-ацетата в состав защитной среды способствует увеличению числа жизнеспособных клеток, осуществляющих окисление пропана. Полученные данные согласуются с фактами повышенной устойчивости более насыщенных к окислению липидов спор мицелиальных грибов по сравнению с липидами активно растущего мицелия (Феофилова, 1987), а также обнаруженной П.Б.Зикманисом (1987) обратной зависимости между выживаемостью обезвоженных клеток дрожжей и степенью ненасыщенности их жирных кислот.

□ 1 □ 2 □ 3 Э4 В 5

R. ruber ИЭГМ 83 R. ruber ИЗ I'M 333

Рис. 3. Влияние добавок аптиоксиданта (а-токоферол-ацетата) на выживаемость лиофилизированных культур газоокнеляющих Rhodococcus ruber после хранения в течение 5 месяцев. 1 - контроль без добавления аптиоксиданта; 5 - контроль с растворителем антиоксиданта (этанолом). Концентрация а-токоферол-ацетата: 2 -1,0 мМ; 3 - 0,1 мМ; 4 - 0,01мМ.

Следует отметить, что для обеспечения высокой выживаемости ро-дококков целесообразно предварительное выращивание их и на жидких //-алканах. Выявленная ранее способность некоторых видов Rhodococcus при использовании жидких м-алканов синтезировать биосурфактанты гликоли-пидной природы (Коронелли и др., 1994; Ivshina, et а!., 1996, 1998) позволила использовать этот адаптационный механизм для разработки модификации метода низкотемпературного хранения. Его особенность заключаем -

ся в применении минеральной среды с н-гексадеканом для предварительного культивирования родококков с последующим замораживанием клеток непосредственно в среде выращивания. По результатам криоконсервации родококков с предварительным культивированием на разных средах (рис. 4) установлено, что самый высокий процент жизнеспособных клеток отмечается в варианте опыта по восстановлению культур, выращенных на среде с н-гексадеканом. При этом выживаемость клеток к концу срока наблюдения (2 года) регистрируется на уровне 95,7 %.

100

80 -

60 -

40

20

1 сут

1 мес

6 мес

24 мес

Рис. 4. Влияние среды культивирования на выживаемость клеток Rhodococcus ruber ИЭГМ 333 после криоконсервации. Среда культивирования: 1 - мясопептонный агар; 2 - минеральная среда Rhodococcus с пропаном; 3 - минеральная среда Rhodococcus с н-гексадеканом

Высушивание родококков непосредственно в ростовой среде при комнатной температуре (табл. 7) показало, что предварительное культивирование клеток на богатой питательной среде приводит к существенному снижению выживаемости культур до 0,002-0,003 % от первоначального уровня, тогда как показатель жизнеспособности клеток, использующих и-гексадекан, в сотни раз превосходит таковой для родококков с углеводным обменом.

Анализ механизмов устойчивости алканотрофных родококков, предварительно культивируемых на минеральной среде с м-гексадеканом, к естественному высушиванию (см. табл. 7) и замораживанию (см. рис. 4) свидетельствует не только о лучшей выживаемости клеток, но и позволяет высказать предположение о возможной защитной функции при стрессовых воздействиях на клетки родококков биосурфактантов гликолипидной природы, синтезируемых при росте на жидких н-алканах. Наше предположение обосновано тем, что в состав локализованных в клеточной стенке гли-

колипвдов родококков, как известно, входят ацетилпроизводные трегалозы (Коронелли и др., 1994; Kim et al, 1990; Singer et ai, 1990). Благодаря своим гидрофильным свойствам, низкомолекулярный дисахаридный компонент трегалоза обладает эффективным защитным действием, вступая во взаимодействие с биополимерами клеток путем образования водородных связей и препятствуя сближению и деформации клеточггых оболочек в ходе замораживания - оттаивания и высушивания - регидратации (Волков и др.. 1992; Волков, 1994). Хотя корреляция между увеличением содержания трегалозы и повышением устойчивости мембран к высушиванию установлена, в основном, для эукариотных организмов (Рапопорт, Вентыня, 1987; Фео-филова, 1987), подобный механизм защиты прокариотных клеток в условиях алканотрофного питания, по-видимому, также возможен. Сделанное предположение согласуется с недавно опубликованными данными (Комарова и др., 1998) об увеличении синтеза трегалозы клетками Rhodococam erythropolis в результате высокотемпературного и холодового шока.

Таблица 7. Влияние среды культивирования на жизнеспособность клеток Rhodococcus ruber при высушивании бактериальной суспензии при комнатной температуре

Штаммы Среда культивирования Число жизнеспособных клеток / мл через 2,5 мес хранения Выживаемость, % Число жизнеспособных клеток / мл через 4 мес хранения Выживаемость. %

ИЭГМ 351 1 (43,3±3,20)х103 0,005 (18,4±3.53)х103 0,002

2 (44,0±5,28)х105 0,92 (30,9±5,20)х105 0,64

ИЭГМ 333 1 (74,0±18,76)х102 0,0015 (16.2+2,97)х103 0.003

2 (77,4±18,35)х105 2,20 (93,2+12,85)х105 2.66

Примечание. 1- мясопегтгонный бульон; 2 - минеральная среда Rhodococcus с н-гексадеканом.

Таким образом, в результате проведенных исследований испытан широкий спектр методов консервации чистых культур бактерий рода К1ю-dococcus и впервые показана возможность повышения их эффективности путем использования клеток родококков с предварительно индуцированным алканотрофным метаболизмом.

Результаты работы по усовершенствованию известных и разработке новых методов долгосрочного хранения культур, поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ, обобщены и представлены в виде практических рекомендаций в печатных и электронных информационных материалах, как то: (1) изданный на русском и английском языках Каталог штаммов Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (Каталог

штаммов ..., 1994), включающий разделы "Хранение и консервация штаммов" и "Рецепты питательных сред". Массив каталожной информации используется в каналах Всемирной сети Internet (http://www.ecology.psu.ru/iegmcol); (2) поисковый каталог (на русском и английском языках) в виде компьютеризированной базы данных, включающий рекомендации по методам культивирования и хранения, а также рецепты питательных сред.

ВЫВОДЫ

1. Апробирован широкий спектр традиционных методов консервации и последующего хранения чистых культур бактерий рода Rhodococcus, как то: субкультивирование, хранение в дистиллированной воде, 0,5%-ном растворе хлорида натрия, под вазелиновым маслом, на твердых носителях, криоконсервация, лиофилизация.

2. Среди испытанных традиционных методов краткосрочного хранения родококков наиболее приемлемы способы их поддержания на "голодном" агаре и в 0,5%-ном растворе хлорида натрия, обеспечивающие сохранение жизнеспособности у 40-83% популяции клеток в течение одного года.

3. Для более продолжительного хранения родококков рекомендуется метод поддержания на мйллипоровых мембранных фильтрах. Гарантированная длительность сохранения жизнеспособности иммобилизированных неразмножающихся клеток родококков достигает пяти лет.

4. Наиболее надежный способ долгосрочного хранения Rhodococcus spp. - лиофилизация с исходным титром клеточной популяции порядка 108-109 клеток/мл в присутствии сахарозо-желатинового агара и ее регидра-тация 0,5%-ным раствором хлорида натрия. Прогнозируемая длительность сохранения жизнеспособности родококков в лиофилизированном состоянии составляет 5,9-43,9 лет. :,

5. Клетки родококков с предварительно, индуцируемым алканотроф-ным метаболизмом более устойчивы к процессам криоконсервации и лио-филизации. Для обеспечения высокого уровня выживаемости и стабильности биологических характеристик клеток целесообразно предварительное выращивание Rhodococcus spp. на жидких н-алканах. Сублимацию га-зоокисляющих родококков рекомендуется проводить в защитной среде с использованием 1 мМ а-токоферол-ацетата в качестве антиоксиданта.

6. Повышенная устойчивость клеток родококков с алканотрофным обменом к замораживанию и обезвоживанию - регидратации коррелирует с наличием в них каротиноидных пигментов, а также относительным содержанием ненасыщенных клеточных жирных кислот.

Создана дублирующая коллекция лиофилизированных культур Rhodococcus spp. с учетом подобранных условий сублимации - регидратации. Сформирована автоматизированная база данных по методам консервации и условиям гарантированного хранен™ чистых идентифицированных культур, поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ившина И.Б., Каменских Т.Н., Козырева Г.И. Антибиотикочувствитель-ность родококков, культивируемых на разных средах // Факторы и механизмы регуляции развития бактериальных популяций. - Свердловск: УрО АН СССР, 1990. - С. 92-98.

2. Ившина И.Б., Каменских Т.Н., Куюкина М.С., Рычкова М.И., Шадрин O.A., Рыбалка JI.B., Зверева JI.B., Чумаков О.Б. Методы консервации культур Rhodococcus spp. и их применение в практике поддержания специализированного фонда алканотрофных родококков // Микробиолог«. - 1994. - Т. 63, вып. 1. - С. 118-128.

3. Каталог штаммов Региональной профилированной коллекции алканотрофных Микроорганизмов. Составители: Ившина И.Б., Каменских Т.Н., Ляпунов Я.Э. / Под ред. И.Б.Ившиной. Ин-т экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. - М.: Наука, 1994. - 163 с.

4. Kamenskihk Т., Ivshinb I. Conservation and safely storage of rhodococci utilizing propane and n-butswe as the sole carbon source // Inter. Conference on Environmental Pollution (ICEP' 95), 17-24 July 1995. - St. Petersburg. Russia, 1995. - P. 22.

5. Ившина И.Б., Каменских Т.Н., Куюкина М.С., Еловикова Е.А., Ляпунов Я.Э. Региональная профилированная коллекция алканотрофных микроорганизмов как хранилище специализированного генофонда и источник штаммов, перспективных для биотехнологии и защиты окружающей среды // Перспективы развития естественных наук на Западном Урале: Труды Между нар. науч. конф. - Пермь: Изд-во Пермского ун-та. 1996. -Т.Н. Экология.-С. 152-154.

6. Ившина И.Б., Каменских Т.Н., Куюкина М.С., Ляпунов Я.Э. Региональная профилированная коллекция алканотрофных микроорганизмов // Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы: Тез. докл. Междунар. конф., Пермь, 8-11 октября 1996. -Пермь, 1996. - С. 38.

7. Каменских Т.Н., Ившина И.Б. Консервация и гарантированное сохранение коллекционных культур рода Rhodococccus II Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы: Тез. докл. Междунар. конф., Пермь, 8-11 октября 1996. - Пермь, 1996. - С. 42-43.

8. Kamenskihk T.N., Ivshina I.B. Conservation and safe storage of propane-oxidising rhodococci // Environmental Pollution: Assessment and Treatment / Editors P.Read and J.Kinross. - Edinburgh: Napier University Press, 1997. -P. 85-91.

Издательская лицензия ЛП № 020930 от 26.10.94

Подписано в печать 24.09.98. Формат 60x84'/,6. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Заказ 46.

Техническая редакция "Пермского медицинского журнала" 614000, Пермь, ул. Большевистская, 85

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каменских, Татьяна Никодимовна, Пермь

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

Каменских Татьяна Никодимовна

КОНСЕРВАЦИЯ И ГАРАНТИРОВАННОЕ СОХРАНЕНИЕ

РОДОКОККОВ ЕХ яп и

03.00.07 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный сотрудник

у

И.Б. Ившина

Пермь -1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................... 4

Обзор литературы

Глава 1. ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ РОДА RHODOCOCCUS..................................................... 11

1.1. Распространение в природе........................................... 11

1.2. Приуроченность отдельных видов родококков к определенным условиям существования и пищевым субстратам.................................................................... 13

Глава 2. АДАПТИВНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЗАЩИТЫ КАК СПОСОБ ВЫЖИВАНИЯ РОДОКОККОВ IN SITU............................................. 17

2.1. Механизмы адаптации родококков к различным экологическим условиям..................................„............... 17

2.1.1. Клеточная стенка............................................................................................................17

2.1.2. Синтез протекторных и запасных соединений........................21

2.1.3. Плеоморфизм. Цикл развития................................................26

2.1.4. Олиго- и диауксотрофность.............................................................27

2.1.5. Естественная колониально-морфологическая изменчивость...............................................................................................................29

2.1.6. Адгезия и колонизация поверхности..................................................31

2.2. Экологическая стратегия...............................................................32

Глава 3. КОНСЕРВАЦИЯ И ДЛИТЕЛЬНОЕ ХРАНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР EX SITU...................................... 36

3.1. Современные представления об анабиозе микроорганизмов 36

3.2. Общая характеристика и особенности приемов хранения коллекционных культур......................................................... 40

3.3. Практический опыт хранения родококков в мировых и отечественных коллекциях чистых культур.......................... 49

Экспериментальная часть

Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................54

4.1. Рабочая коллекция...................................................................................54

4.2. Условия культивирования........................................................................................54

4.3. Консервация чистых культур..................................................................................57

4.4. Контроль чистоты и жизнеспособности............................61

4.5. Проверка сохранения исходных физиолого-биохимических

свойств....................................................................................................................63

4.6. Определение клеточного жирно-кислотного профиля.........64

4.7. Исследование интенсивности эндогенного дыхания......................65

4.8. Статистическая обработка экспериментальных данных............66

Глава 5. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДОВ ХРАНЕНИЯ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ ВЫЖИВАЕМОСТЬ И СТАБИЛЬНОСТЬ ИСХОДНЫХ СВОЙСТВ RHODOCOCCUS SPP. ... 67

5.1. Испытание традиционных методов краткосрочного

хранения бактериальных культур........................................ 67

5.1.1. Высушивание с иммобилизацией на твердых

носителях .............................................................................67

5.1.2. Применение "голодных" сред...........................................................75

5.1.3. Хранение под вазелиновым маслом..................................................80

5.2. Низкотемпературное замораживание........................................................................84

5.3. Лиофилизация как основной метод длительного поддержания коллекционного фонда чистых культур..............................89

5.3.1. Влияние условий лиофилизации и последующего хранения на жизнеспособность. Перспективы долгосрочной консервации.................................................................... 89

5.3.2. Изучение стабильности исходных свойств лиофилизированных культур......................................... 97

Глава 6. ПОИСК СПЕЦИФИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ КОНСЕРВАЦИИ АЛКАНОТРОФНЫХ РОДОКОККОВ.................................................. юз

6.1. Влияние среды предварительного культивирования на устойчивость родококков к естественному высушиванию .......... ЮЗ

6.2. Криоконсервация алканотрофных родококков.................. 105

6.3. Сравнительное изучение выживаемости лиофилизированных родококков в зависимости от условий предварительного выращивания......................................... 110

6.4. Обобщение информации о методах консервации и

хранения коллекционных культур.................................................. 124

ОБСУЖДЕНИЕ.................................................................................127

ВЫВОДЫ.........................................................................................138

ЛИТЕРАТУРА..............................................................................140

ПРИЛОЖЕНИЕ.................................................................................................................................155

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В преддверие XXI столетия, когда экологические проблемы приобретают все более угрожающий характер, в центре внимания мировой науки и национальных правительственных органов становится разработка Всемирной стратегии защиты и сохранения разнообразия жизни на Земле на уровне генов, видов, экосистем (Ившина, 1992). Как обозначено в Международной программе "Diversitas", особое внимание должно быть уделено «группам микроорганизмов, имеющим функциональное значение для биосферы и экосистем», а также «созданию специализированных региональных центров и информационных сетевых сообщений» (Haksworth, Aguirre-Hudson, 1994). Поэтому не случайно, все больший удельный вес приобретают коллекции живых культур, как «механизм, гарантирующий сохранение микробного разнообразия ex situ и делающий микроорганизмы доступными для использования и изучения человеком» (Microbial Diversity..., 1991).

В результате многолетней исследовательской работы в Институте

экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН (ИЭГМ

/

УрО РАН) создана первая на Урале профилированная коллекция микробных ресурсов, специализирующаяся на поддержании и изучении практически ценных для биотехнологии и охраны окружающей среды культур (Ившина, 1992; Ivshina, 1996, 1997). Большую часть коллекции составляют нокардио-формные эубактерии, объединенные в род Rhodococcus (Zopf 1891) Good-fellow and Alderson 1977 сем. Nocardiaceae Castellani and Chalmers 1919 nop. Actinomycetales Buchanan 1917, выделенные из контрастных эколого-географических зон, характеризующиеся высокой устойчивостью к экстремальным условиям и обладающие значительным биохимическим потенциа-

/

лом. Основная биологическая функция родококков - окисление природных и антропогенных газообразных (С3-С4), жидких w-алканов и ароматических

углеводородов. Они - постоянные и доминирующие компоненты естественного биоценоза нефтяных загрязнений (Ившина и др., 1981, 1987) и сапрофитного бактериального комплекса городских почв (Лысак, Сидоренко, 1997). Экологическая значимость родококков обусловлена широким диапазоном их толерантности к экстремальным абиотическим факторам, таким как температура, влажность, рН среды; способностью к олиготрофному и алканотрофному образу жизни; высокой сопротивляемостью конкурентам; диауксотрофными свойствами; реализацией адаптивных механизмов в условиях действия экологических стрессоров. В настоящее время в центре внимания многих исследователей находятся вопросы изучения биологии алка-нотрофных родококков и их адаптации к изменяющимся условиям внешней среды (Коронелли и др., 1990, 1994, 1997). Несомненный интерес представляет выяснение биохимических адаптационных механизмов при переключении с одного источника углеродного питания на другой.

Многие представители родококков имеют важное значение как продуценты ценных веществ: аминокислот, витаминов, ферментов, биополимеров, антибиотиков, биоПАВ (Нестеренко, 1985; Ившина и др., 1987; Ivshina et al., 1996, 1998; Finnerty, 1992). Синтезируемая ими ферментная система обладает широкой специфичностью и катализирует реакции биотрансформации практически всех классов органических соединений-загрязнителей (анилина, фенолов, эфиров фталевых кислот, стероидов и т.д.). Перспектива использования алканотрофных родококков в различных областях защиты окружающей среды и биотехнологии - от биоиндикации углеводородных залежей до интенсификации процессов биодеградации нефтяных загрязнений, от синтеза микробного белка на природном газе и до биокатализа в тонком органическом синтезе - требует надежных методов долгосрочного хранения производственно-ценных культур без потери их исходных свойств. Природная изменчивость родококков, обеспечивающая приспособляемость к неблагоприятным условиям in situ, одновременно создает проблему их

хранения ex situ, так как использование микроорганизмов в биотехнологии основано на стандартизации и исключении появления нежелательных вариантов. Поэтому выяснение условий поддержания культур без утраты или снижения их практически важных свойств особенно актуально.

В литературе описаны различные способы консервации большого разнообразия физиологических групп микроорганизмов (Сидякина, 1990; Lel-liott, 1965; Lapage, Redway, 1973; Heckly, 1978; Kirsop, 1991). В последнее время предлагается много новых и эффективных методов длительного сохранения коллекционных и производственных культур (Ротмистров и др., 1990; Доронина и др., 1992; Фельдман, Маханева, 1994; Henry, Kirsop, 1989; Malik, 1990, 1996; Gherna, 1994), однако большинство работ проведено с патогенными бактериями, а в отношении алканотрофных родококков подобные сведения весьма немногочисленны (Ившина и др., 1994; Wellington, Williams, 1978).

Традиционно в микробиологии испытывали и применяли для хранения организмы, предварительно выращенные на богатых органических средах. Однако использование богатой питательной среды для родококков, активно осуществляющих синтез на основе углеводородных субстратов трудноусвояемых для других микроорганизмов, представляется не совсем корректным. Так, культивирование на мясопептонном агаре приводит к повышению антибиотикочувствительности, а, следовательно, к снижению конкурентноспособности (Ившина и др., 1990), снижению содержания липидных компонентов клеточных оболочек, облегчающих потребление гидрофобного углеводородного субстрата (Милько, Егоров, 1991; Коронелли и др., 1993, 1994), уменьшению биохимической активности в отношении ряда ксенобиотиков (Ротмистров и др., 1990). В связи с этим актуален поиск способов хранения родококков, реализующих биохимические возможности при росте их на углеводородном субстрате, с учетом активного функционирования окси-геназного ферментного комплекса.

Обычно подбор методов хранения микроорганизмов идет в направлении изучения влияния внешних факторов (состава защитных сред, глубины замораживания, режима высушивания и т.п.) на выживаемость клеток после консервации. Это важно и актуально по сей день, однако специальная подготовка бактериальной биомассы с осознанием биохимических процессов, происходящих в клетке при изменении условий существования, реализация «самоконсервации» на основе механизмов адаптации микроорганизмов к неблагоприятным условиям среды может позволить добиться максимального результата в получении жизнеспособной культуры.

у

По свидетельству некоторых научных публикаций (Endangered ..., 1992) в настоящее время реально существует опасность потери отдельных ценных микробных коллекций из-за ряда внешних (ассигнования, штаты, оборудование) и внутренних (научные стандарты работы персонала) факторов. Как показывает практика (Сидякина, 1990), одновременное использование нескольких методов хранения для поддержания микроорганизмов конкретной таксономической группы позволяет избежать возможной потери коллекционных фондов под влиянием вероятности заражения культуры посторонней микрофлорой или потери исходной биохимической активности

у

при хранении. В связи с этим очевидна необходимость создания дублирующей коллекции сохраняемого генофонда.

В соответствии с современными требованиями решение проблем получения и обмена научной информацией осуществляется путем развития глобально разветвленных компьютеризированных баз данных (БД) о микроорганизмах и их характеристиках (Kalakoutskii, Mazanov, 1997), в том числе и специализированных компьютерных БД по методам хранения микроорганизмов (Melkozernov et al., 1993). Создание поискового каталога коллекции алканотрофных микроорганизмов в виде компьютеризированной БД, используемой в каналах Всемирной системы Internet, представляет возможность расширить поиск, сравнение и анализ информации о средах культиви-

рования и рекомендуемых методах консервации родококков для широкого круга исследователей.

В этой связи, цель настоящего исследования - разработка оптимальных методов сохранения жизнеспособности и стабилизации потенциально биотехнологически ценных свойств Шгойососсиз Брр. с учетом биологических особенностей их клеток. Формирование дублирующей коллекции культур родококков и автоматизированной базы данных по методам их хранения.

Конкретные задачи:

1. Испытание традиционных методов консервации микроорганизмов с целью подбора эффективных способов сохранения чистых культур Вкойосос-шэ рр.

у

2. Изучение влияния условий предварительного культивирования клеток родококков на их жизнеспособность и биохимическую активность при хранении различными способами.

3. Разработка новых методов и рекомендаций по консервации и последующему хранению коллекционных культур родококков с учетом их структурных и физиолого-биохимических особенностей.

4. Оценка рациональной продолжительности хранения Шойососст эрр.

5. Формирование автоматизированной базы данных по методам консервации и условиям хранения штаммов, поддерживаемых в Региональной

У

профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ.

Научная новизна работы. Апробирован широкий спектр методов для сохранения чистых культур Шюйососсш ърр. Показано, что наиболее оптимальный и надежный метод долгосрочной консервации родококков -высушивание их под вакуумом из замороженного состояния (лиофилиза-ция).

Впервые исследована зависимость жизнеспособности сохраняемых клеток от источника углеродного питания в среде предварительного культивирования родококков. Установлено, что клетки с углеводородным питанием, обладающие определенными структурными и физиолого-биохимическими особенностями, более устойчивы к действию неблагоприятных внешних факторов - замораживанию и высушиванию. Показано влияние уровня десатурации клеточных жирных кислот -йа жизнеспособность и длительность хранения лиофилизированных клеток алканотрофных родококков.

Практическое значение. Подобраны оптимальные методы консервации культур Rhodococcus spp., гарантирующие сохранение их жизнеспособности и исходных свойств. Предложен новый способ высушивания клеток на мембранных фильтрах. К практическому использованию для длительного хранения родококков рекомендован метод лиофилизации. Создана дублирующая коллекция сублимирован-ных чистых культур Rhodococcus spp.,

/

Gor dona spp., Dietzia spp. Рекомендовано поддержание штаммов-деструкторов и продуцентов практически ценных веществ по оптимизированным схемам хранения. На основе пакета программы СУБД Paradox (версия 4.5.) сформирована компьютеризированная база данных по методам консервации и хранения штаммов родококков в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Международной научной конференции "Environmental Pollution (ICEP'95)", Санкт-Петербург, 1995; Международной конференции "Перспективы развития естественных наук на Западном Урале", Пермь, 1996; Международной конференции "Microbial Diversity: current situation, conservation strategy, and ecological aspects (ICOMTO'96)", Пермь, 1996.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 таблицей и 14 рисунками; состоит из введения, обзора литературы, трех глав экспериментальной части, обсуждения и выводов. Список литературы включает 228 наименований работ, в том числе 137 отечественных и 91 зарубежных авторов.

Диссертационная работа выполнена на базе лаборатории алканотроф-ных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН и является частью исследований, проводимых в ней, по биологии и систематике бактерий рода Rhodococcus.

у

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

/

Глава 1. ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ РОДА RHODOCOCCUS

1.1. Распространение в природе

Еще до недавнего времени сапрофитным бактериям рода Rhodococcus не уделялось достаточно большого внимания. Между тем они имеют чрезвычайно широкий ареал распространения и встречаются практически во всех типах почв различных почвенно-климатических зон, а также в разнообразных водных экосистемах - пресных и морских, полярных и тропических, т.е. являются космополитами (Нестеренко и др., 1985; Ившина и др., 1987; Аристархова, 1989; Коронелли и др., 1994; Goodfellow, 1983, 1989). Широкие экологические возможности родококков обусловлены их высокой устойчивостью к эктремальными условиями существования.

Значительный температурный диапазон роста многих родококков позволяет им размножаться в снегу (Могилевский и др., 1979) и водах Антарктики (Коронелли и др., 1994), в почвах пустынь и сухих тропиков, испытывая не�