Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ РОДА RHODOCOCCUS, УСВАИВАЮЩИХ ПРОПАН И БУТАН

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "БИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ РОДА RHODOCOCCUS, УСВАИВАЮЩИХ ПРОПАН И БУТАН"

I -иш

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖИ НАРОДОВ АХАДЁИИ НАУК УКРАШШЗЙ ССР

одой трудового красного ацдам

ИНСТИТУТ МККРОШОЛОПШ И БИРУСОйОЛМ им.Д.К. ЭАКШШОГО

УДК 576.85 + 676.096 № правах рукописи

И В Ш И Н А Ирана Борасовш

БИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ РОДА ШЮООСОСС КЗ ■ УСВАИВАХиШ ПРОПАН И БУТАН

03.00.07 - ш(фоб«аяо«я

Автореферат д*ссвртацмя на с оа скакие ученой степей* кжнмдвта Омологмчвомис наук

Киев - 1982

Работе вноохшыа в Отделе вколотая и генетики инфооргшшэ-нов Институте зяахопш растений я животных Уральского научного центра АН СССР.

Научны« руководите*» : доктор медвцинскхх наук, щюфеосср

Р.А.Пшеничнов кандидат геолого-минерадогячесюис наук, старший научный сотрудник А.А,Оборин

Сфициллыше оппоаевтн 1 доктор биологические наук,профессор

Ы.Н.Ротшстров доктор технических наук, профессор Г. а. Никл тин

Ведущее учреидание: Московский государствешшй

унаверсатет им. М, В. Ломоносова

Эыщата диссертации состоится " 4.S " идя 1962 г.

в /(^9чаоов аа заседании свецкадязареванного совета Д. 016.06.01 при Институте микробиологи* ж вирус ологли им. Д.К.Зайалотного АН УССР ао адресу: 252627, ГСП, Киев-143, ул.акад. Эайадотного,26.

С диссертацией моаио ознакомиться в библиотеке Института м&кройиодогяш в вярусслогя« хм, Д.К.З&бсдотного АН УССР.

Автореферат ра»осдан

-ж*.

т'

Ученый св!фетарь специалиаированного совета кадшцат биологических наук

А.Г.Коваленко

ОВДШ ХАРАКТЕРИСТИК* РАКШ'

Актуальность проблемы. Актуальность изучения бактерий, важнейшей биологической особенность» которых является способность аосимидшровать в качестве единственных источников углеродного штевня газообразные углеводороды (пропая я Оутая), обусловлена перспективой их практического применения для повышения продуктивности процесса биосинтеза на природной газе, определения мест утечек горгчях газов, оценки их вклада в процессы биодеградадия нефтяных загрязнений и при поисковых работах на нефть и газ в качестве биологических индикаторов скопления углеводородных газов.

Бактерии, усваивающие пропан н бутан, наиболее часто встречаются в подземных вещах и породах нефтеносных структур и считаются основными показателями месторождений нефти и газа (Слаэника, 1961; Смирнова.. 1964; Квасников и др., 1974; Могядевский, 1973). Для усовершенствования метода микроба одогиче с кого ирогнозярова-ния лодаемных эалехей нефти и газа необходимо разработать методы точного и быотрого распознавания индикаторных микроорганизмов. Несмотря на то, что о момента возникновения геомикробиологичвоко-го метода поискав нефтяных и газовых месторождений прошло более -сорока лет (Могилевский,:1938,1939; теев»!*, 1941;' В1аи, 1942, 1943; Неев1ег, 1Э43), проблема его усовершенствования еще далека от окончательного решения ввиду недостаточной изученности экология, систематического положения и особенностей метаболизма бактерий, потребляющих газообразные гомологи мотана ЧС^-Сд).

£ связи о отмеченным изучение пропан- я бутанояисляюцих бактерий грунтовых вод нефтяных месторождений фиобретает существенный ;црактичевкнй интерес.

Цель и заца^я Целью настоящей работы являлось

изучение распространения, биологических свойств и систематического положения пропан- я бутанокнелямцих бактерий грунтовых вод

' Цзвтр. Кма. сгд. Г :: п с шд. кл.^.А. ?

нефтяных месторождения Пермского Предуралья.

Основные задачи исследования состояли в следующем: I) дать характеристику экологической нишя их обитания; 2) провести сравнительное изучение содержания пропан- и Оутаяокясдяющих Оактеря) в грунтовых водах нефтеносных в не нефтеносных районов Перископ Предуралья; 3) определить систематическое положение изолированных микроорганизмов; 4) изучить особенности их морфология и улы раструктуры в различных условиях культивирования, а также хемо-таксоисшпеские и физиологические свойства, в том числе усвоена• индивидуальных н-алканов и ни зкоыолекулярных сперто®; 5) аыясяи! влияние условий выращивания гааоокислявдих бактерий на синтез кг внеклеточных аминокислот; 6) исследовать иимуногевкость и антигенную специфичность выделенных штшаюв, выяснять влияние разли1 Ш1Х источников углеродного питания на их антигенную структуру; 7) оценить возможность применения серологических методов для ид< тификадая гаэоокисляэдих бактерий.

Вауддад. новизна. Изучены закономерности распространения бак-терна, ассимилируташх пропан, бутан в качестве единственных источников углерода и энергии, в подземных ведах нефтеносных и не нефтеносных районе» Пермского Предуралья. Показано, что газсюкж ляпцив бактерии приурочены к контуру нефтеносных структур я аре; ставлены в основном видом еьойососсив гьо^сьгоив, Выявлены ов> бвННОСТИ удьтраоТРУктуры Н.гЬэ<Юе11ГОиа в к.гиь«г, культявиру мых в срасутсгвли пропана. Установлена способность изолированны: гаеоокисляпцих бактерий накапливать экотрацеллодяриые вмонокисл' ты цря росте на пропане.

С аомоодл разработанного способа получения гипериммунных СИ' вороток исследована иммуногенность н антигенная специфичность г^ аоокасляшцих родококков. Установлена коррелятивная связь меяду антигенной структурой родококков, ассимилирующих высшие гаэообр*

вые гомолога метана, я источниками их питания. У а.гЬойооЬгоие выявлены функциональные антигены, укаэыванцие ив развитие бактериальных клеток 31 счет конкретного ростового субстрата - газообразных углеводородов (пропана или бутана).

Показана возможность применения серологических реакций> в частное» двойной икмунакиф&гзии в агаровой геле« непрямой илеу-нсфлюоресцеиции и микробной агглютинации для ускоренной идентификации видов рока ПЬододоссиа.

Практическая ценность. Проведенные исследования позволят рекомендовать оцределешшй вид родококков, а именно, Е.гЬойосйгоив, в качестве индикаторного на нефть цри нефтегазопоисковой съемке по водоисточникам. Выявленная способность газоокисляоцих родококков синтезировать на ореде в атмосфере пропана я выделять в куль-туральнув жидкость свободные аминокислоты может быть использована при отборе штаммов, представляющих интерес для микробиологической промышленности. Полученные в работе данные о способноститазоокао-дяющих родокоххов ассимилировать углеводороды широкого ооектра могут оказаться полезными при селекции микроорганизмов, перспективных для борьбы о загрязнениями окружающей среда нефтепродуктами.

Разработаны рациональные схемы получения высокоактивных иммунных сывороток против КЬойоеоссив ерр., оптимальный режим разрушения бактериальных клеток радококков, обеспечивающий максимальный выход антигенного материала кьойососсив ерр., и усовервйнотво-ванный способ получения высокодисперсной ультразвуковой эмульсии антигенов в адъюванте Фрейяда. Выявление в составе клеток ь.гьо-¿осЬгоиа, выращиваемых в присутствии пропана, спецамическ«1х дополнительных антигенов и отсутствие последних в клетках, культи-вчруеуих на мясо-пептонном агаре (ША), может оказаться полезный при уточнении природы утилизируемого родококками ростового субст-

рата, дополнительным признаком при решении вопросов видосяеци^яч нооти индикаторных на нефть и газ бактерий и является первым необходимый этапом разработка серологического метода, испсяъзуеыо-го при М01фобяологдческо2 разведка нефтяных месторождений. Лая акспресс-даагяостикя газоокислящих рцдококков наш рекомендована реакция имцуяоди^фуави в агаровом геле.

Применение оерологических методов представляется перспзктив-нш для решения вопросов экология бактерий, ассимилирухидих высшие газообразные гомологи метана ^Cg-C^) ; оно открывав? дополнительные возможности 7Соверахенствования микробиологического метода разведки нефтяных и газовых месторождений.

Апробашщ работы. Материалы диссертации доложены на заседали ях Пермского отделения Всесоюзного микробиологического общества в I976-1980 гг. (г.Пермь); на конференциях молодых ученых Института экология растений и «ивоtaux Уральского научного центра АН СССР в 1976-1979 гг, (г. Свердловск); на семинаре ВОДЯТ "Чего-дика и техника гаэобактериадьных поисков нефти и газа на оуше и на море" в 1976 г. (г.Москва): на Всесоюзном совещании по отраслевой проблеме "Усовершенствовать в внедрить в производство комплекс геохимических методов поисков нефти и газа применительно к районам Русской платформы" в 1978 г. (г. Саратов); на Всесоюзном совещании "Прямые геохимические методы поисков месторождений нефти и газа" в 1979 г. (г.Яркутск) ; на Первой Уральской школе молодых ученых и специалистов со проблемам экологии и охраны окружающей среды в 1980 г. (г.Свердловск); на 71 съезде Всесоюзного микробиологического общеотва "На главных путях научно-технического прогресса" в i960 г. (г.Рига).

ПуАяйяя^. По результатам исследований опубликовано 7 печатных работ.

Структура и обгек работы. Диссертация изложена на 215 страки-

пах машиопися, в том числе 117 страницах текста, включает 26 таблиц, 34 рисунка и состоят из введения» четырех глав, обсуждения результатов а выводов. Список литературы включает 265 работ, из них 157 отечественных к 128 зарубежных.

СОДЕКШШВ РАБОТЫ

Глава I. ШОЛОГШ БАКТЕРИЙ, ОКИСЛНЩИХ ШШЕ ГАЭООБРАЗИК

ШШ01И МЕТАНА Обзор литературы щ>едставлев четырьмя разделами, в которых освещены вопросы распространения в природе, систематического положения, практического использования продан- и бутанокисляющих бактерий, а также применения серологических методов для идентификации бактерий рода Шктоеоссив н родстве иных организмов.

Глава П. МАТЕРИАЛЫ И ЫЕТОДН ИССВДОЩНИЯ В данной главе описаны методы, используемые для изучения динамики содержания пропан- и бутанокисляшдас бактерий в грунтовых водах, введения, идентификация и исследования их морфолого-куль-туральных, физиологических и хемотавсоношческих признаков, Приведено подробное описание методов изучения нмцуяогенностж я антигенной специфичности бактерий, асскмшшрухщих пропав и бугая в качестве единственных источников углеродного питания.

Глава В. 32Ш0№1, ШШЮВДЕСШ СВОЙСТВА И СЛСТИШЖЕСЮК

ШЛ02ЕНИЕ БАКТЕРИЙ, УСВАИВАЩЛ2 ПРОПАН И БУТАН распространение в грунт овн^ водау. Исследования пропан- ж бу-танокисляхшщх бактерий нефтеносных районов Пермского Предуралья до сих пор не проводадиоь, межцу тем потенциальные ресурсы «того нефтегазоносного района обусловливают нэобходимость проведения на его территории поисково-разведочных работ, используя инкроодологический метод, ¿актериа, ассимилируюацие пропан и бутан, видв-лялг из грунтовых вод, стерильно отобранных в мае-ноябре Х37&-

1980 гг. на участках, расположенных в контуре одного яз нефтяных месторождений Пермского Предуралья, за его пределами и в районе Итимовской разбуренной непродуктивной структуры (контрольной).

Проведенные исследования показали, что пропа»- и бутанокисля-шие бактерии обнаруживается, как правило, в подземных водах над нефтяной завехю (рис. I). Так, в контуре нефтеносности проба води, в которых выявляется газоокисляюцие бактерии, составляют 81,от числа исследованных, а содержание пропан- и бутанокисля-ицих бактерий варьирует в пределам 103-104 кя/ш.

Контур Закон- Непрсщук-

яефтеноо- ' турная тивная

ности зона структура

Рио. I. Частота обнаружения бактерий, усваиваниях

пропан н бутан, в грунтовых вещах исследуемых ноточников;

(3 - общее число проанализированных проб воды;

0 - число водных проб, в которых обнаружены пропан- и бутанокисляюше бактерии

¡3 среднем, количество исследуемых бактерий в грунтовых водах контурной зоны нефтяного меетороадения в несколько раз превышает общее число гетеротрофных микроорганизмов, обнаруживаемых при высеве образцов на МПЖ/ХО (рис. 2), и в отдельных пробах их содержание иногда достигает 74* от общего количества бактерий.

Известие (Коптевский, 197Э), что бактерии, окисляющие пропан

- ? -

я бутан, обычно присутствуют в тех естественных субстратах, куда постоянно поступав* данные газы. По-вндимоцу, в связи с атим га-эоокисляюцие бактерии не выявлены в водоисточниках, питающихся ив района Ишимовской непродуктивной ("пустой") структуры. Установленная нами корреляция между содержанием пропан- а бутанокис-ляицих бактерий в природных водах и концентрацией находящихся там высших газообразных гомологов метана (рис. 3), систематическое обнаружение исследуемых на кр о органашов на протяжении всего периода наблюдения свидетельствуют о непосредственном участии их в окислении газообразных углеводородов. Численность пропан- и бутан-окисляшвх бактерий в пробах грунтовых вод ее подвержена резюш сеаоаяым колебаниям, и основными факторами, рагулмрупщшн жизнедеятельность их в изученной ехал отеческой нише, является углеводородные газы.

Я качестве питательных сред дли ввделения газоохислявдих бактерий использовали агаризовааные и жидкие среды: ионца, Бушнзлла-Хааса.'К" (Ыалашенко к др., 1975), а также предварительно обеспложенные с помощью мембранных фильтров природные грунтовые воды. Оказалось, что наиболее благоприятной средой для выделения бактерий, потребляпдих прспая и бутая, является минеральная среда "ЕС. Накопительные культуры газоокисляющих бактерий на поверхности инкубированных жидких сред через 5-8 суток имели вид тонкой йдедяо-оранжевоЙ ила розовой пленки, состоящей из интенсивно ветвяищхся клеток длиной 5-10, реже 30 мкм. Уже после первого высева накопительной культуры на минеральную агаризованнув среду "К", инкубированную в атмосфере пропана иди бутака, были получены однотипные колонии газоокисляющих бактерий, чистые культуры которых получали затем на ЫПА и сусло-агаре. £цделенне пропан- и бутакокясдающих бактерий в чистую культуру при использования пропана ила бутана в качестве источников углеродного питания не сопровожкается.

Кд/мх

Тыс/кя

1 &

н €>

(-4

200

100

1

I 2 3 4 Контур нефтеносности

5 6 7 8 9 Л вацо-

гьконтур-

ная вона

Рис. 2. Содержание гетеротрофных и пропаноки слягаих 0акте рей в грунтовых водах исследуемых источников: О — гетеротрофные бактерии,, учитываемые высевом на

ША, разведенном в 10 раз; 0 - пропанокисляжхцяе бактерии

Тыо/ш

Э * водоисточника

Рис. 3. Распределение пропан- и бутанокисляюащх бактерий в

грунтовых водах нефтяного месторождения в зависимости от содержания тяжелых газообразных углов одородс®: I - суммарная концентрация тяжелых газообразных углеводородов; г - количество цропанокислякщвх бактерий; Э - количество бутанокя сляпюх бактерий

таким образом, трудностями, выявляемыми при выделении облигатншс матилотрофов (Малашенко в др.» 1975).

Систематическое ролдмадя^ изолированна микроорганизмов. Иэ ИЗ обследованных водных образцов было изолировано 56 штаммов бактерий, окисляющих пропан я бутан. Большинство их (33 штамма) обнаружено при высеве проб веши на минеральную среду "К". Выделенные газоокисляшцие бактерии отнесены к роду Rhodococcus Zopf 1891 и характеризуются рядом общих свойств, Она аеробы, грашюло-жителыш, не кислотоустойчивы, неподвижны, образуют катал&зу, не формируют спор, имеют трехстадийный шл» развития (кокки-ветвящиеся нитевидные клетки-кокки), содержат липид lcn-a типа К.ruber лето 576- Изолированные родококки не разжижают желатина, не разлагают казеина, не вызывают гидролиза крахмала, ксантина, при росте на ШБ не выделяют аммиака, индола н сероводорода, растут при 28°С и 37 °С, в среде о liaci, чаще всего окисляют глюкозу (тест Хью и Лифсона), растут не только на различных источниках азота, но и на безаэоткой среде Эшби. Rhodocoecue epp. малочувствительны к тетрациклину и высокочувствительны к стрептомицину и эритромицину. Все газонепольэу юдае родококки не образуют кислоты из дульвдта, ксилозы, лактозы, раффинозы, х-метил-Д-глюкозида, но образуют из глюкозы, маннозы и фруктозы, усваивают натриевые соли лимонной, уксусной, янтарной, но не щавелевой кислоты. Остальные свойства изолятов я коллекционных культур приведены в таблице X. Подавляющее большинство штаммов (47) было идентифицировано как H.rhodochroue и лишь 9 штаммов, выделенных иэ некоторых водоисточников, как R.ruber.

Разностороннее исследование родококков грунтовых вод пало возможность выявить ряд особенностей, обеспечиваниях выживание их и сохранение максимального числа особей вида в экологической ниже. Среди указанных особенностей следует отметить способность

Табляиа!

Физиологические признаки бактерий рода вьоалсооои», выделенных я» подземных вод нефтеносных структур Пермского Предуралья *

Признака

¡Число штаммов, положи-:* в.гЬоЛо-! : тельных по данному [ признаку

В.гиЬ«х

И. гЬо <1о - ■ Е.гиЪ*г ;

оЬгои* | :

47,шуаммо?| ? вггаммов;

сЬхоив А ТОО

1зесе1*

М-1

1)

л.

Образование кислоты из: арабжнозы галактозы глицерина инозита мальтозы маннита рамаозы сахароз» сорбита сорбози Наличие ацетамядаоы Усвоение я» -солей органических кислот: У-амивомасляяой бензойной . винной

¡¿-кетогдутаровой молочной пировиноградной Разлсоеняв тирозина Образование уреазы Восстановление нитратов в нитрит V Изменение окраски среды Леввнягейка-Явнсела в 0,05% п-нятрофенола Рост на среде о ИЭА4' как источнике С и н

42

47

Л

46

!з)

47 ^

43 47

46

47

22+,11с; _3)

I

3

5

4

7 I

9 9 ' 4 9

9 9

.: э

7

2 7

2+ ,3с 9

+

+

+ , +

Таблица I (продолжение)

■ .1/, ■■' 2 3 . 4 5

Ростц^нп 28

42° 47 2 +

45° 1с5> + +

4в° - ■

Рос? после нагревания

при 60° в течение 4 часов 47 I

Рост е присутствия 1% мас1 42 5 +

: Дркшчшив! '"+• - признак положителен; - признак отрицателен! *о" - признак выражен слабо, "типовые втамш) ОЭШ I7PÏ, ОЗШ 16PI,

' „ / : 0ЩМ450, ОЗШ 776 слабо образуют кислоту M сахаро-эычерез28 дней кнкубааи*} 'btsoasî ОЗШ I7PI, 03П1 1аРЖ, оага 450, ОЭГЫ 775 повожвтелыш по даяво-* '-;- иу првэнакуг - U3A - мояозтаяожамкн} 'оставшиеся шта*лш «э чиолаизучеккых ее росли; незаполненные места означают, что цризнах не изучался, ОЗШ - Отдел »колоти л генетика микроорганизмов ' Института экологии растений я животных Уральского : ' научного центра АН СССР.

выдедеюшх родовоккоэ раоти пря низких температурах (5-10°С), ао: сяшлнровать углеводородные гавы я переключаться в использования ■высших газообразных гомологов метана на использование других о;р-гаяячеекях веществ(т,е,. проявлять днауксотрофаые свойства), оли-гокарбофалия а олягонитрофиляя.

■ . <Зо<убенности морфология в .ультсасург^тут)^.. Наш данные показывают, что культивирование родококков в присутствии пропана или бутана влияет, прежде всего, нц окраск? н форцу их колоний. Так, У н-rhô do с tiro не оагм 27-11, имеюшй обычно бледно-розовую окраску на НПА, на;минеральной среде в атмосфере,пропана образует ярко-розовый с желтоватым оттенком пигмент, а на среде в атмосфере

н-бу-гаяа приобретает красно-оранжевую окраску. Клетки нЬоЛэсос-сив эрр. на МИЛ через 12 часов выращивания длинные, ветвящиеся (8-30 мкм х 0,6-1,3 мкм). В течение последующих шести часов происходит активное деление их на более короткие палочковидные формы. Ужа к 24-40 часам большинство культур характеризуется главным образом сферическими кокковидными клетками. Культивирование ВЬойососсив ерр. на минеральной среде в атмосфере пропана или бутана оказывает существенное влияние на продолжительность жизненного цикла культур. Так, в мазках из колоний й.гЬэааоЬгоив ОЗШ 27-П, ОЭШ 76, ОЭГЫ 153, выросших в пропано~воэдутной атмосфере, через 16 часов заметно еще преобладание кокковидных кле-. ток. В 24-часовом возрасте культуры представлены длинным нате- ^ видными клетками до 20 мкм, толщина которых составляет 0,9-1,3 мкм. И только на 4-5-е сутки обнаруживается распад шцелия на кокковидные овально-сферические формы.

Потребление газообразных углеводородов и.гЬойоЫдоив а в. гиЪет сопровождается и определенными изменениями их внутриклеточной организации по сравнению с таковой организмов, культивируемых на АШ, Эти изменения выражается, в первую очередь, в формировании в клетках крупных электронио-плотных включений, окруженных злектронно-прозрачной зоной. Они несколько напоминают внутри^ клеточные структуры, описанные Аристарховой (1981) у ЕЬоАосоооиа •р. (к.оагаШш)) растущих на Декеле, и рассматриваемые автором как области окисления данного субстрата. Выявленные наш Включения близки питоолазматичеоким структурам, называемый о кси с омами, описанным Кордаеди и ВаДманоы (КогсекОу, маушап, 1974) а клетках АгШгоЪде^г и Оапи^в дешв, выращиваемых на средах с н-бутаном и 1-бутанолом. Авторы полагают, что оксисош являются местами окисления углеводородов. Наличие подобных включений показано и в клетках вгет1Ьш-1ег±ит и ЦвчоЬысг ог1иш, растущих на

сырой нефти Utlas, Hôinta, 1973). При изучения ультратонкого строения клеток гаэоокиоляицих R.ruber нами обнаружены ранее не описанные структуры типа вакуолей умеренной электронной плотности . заполненные бесструктурны» содержимым и окруженные осцио--фялыпш валиком.

Таким образом, электронно-плотные включения, сходные с окси-сомгш, л включения умеренной электронной плотности, имеющие вид вакуолей, возможно, представляв собой специфические участки,связанные с окислением газообразных углеводородов - пропана и бутана.

Характерной особенностью клеток Jtoodocoocue врр., культивируемых в присутствии пропана, является также увеличение числа гранул волютина и фрагментация цитоплазмы на отдельные участки о образованием между ними светлого пространства. Подобные особенности ультраструктуры отмечены у Мю do со cous ер. (H.rubre) при культивировании их на среде с фенолом (Аристархова, 1961),

Выращивание xhodococcue ipp. на среде с пропаном индуцирует изменение и их внутрацитоплазматичеокого мембранного аппарата, Так, клетки Rhodoeoccue ерр., выращенные на ША, обычно характеризуются наличием мелких ыезосомальных структур, относящихся главным образам к типу концентрически замкнутых мембран, расположенных беспорядочно в цитоплазме. У родококков, культивируемых в атмосфере пропана, выявляется хорошо развитая сиотема внутриклеточных мембранных структур, располагающихся чаще всего по периферии клеток; мембранные образования представлены крупнына трубчато-везякулярныыи структурами. Встречаются и довольно сложной конфигурации мезосомальные образования в виде плотно уложенных везикул, занимающих значительное пространство цитоплазмы вблизи клеточной стенки. Расположение выявленных мембранных структур преимущественно около клеточной стенки делает основание полагать, что они уве-

дияивают поверхность дйтоплаэштической мембраны к функционально могут быть связаны о метаболизмом газоохяоляпшх рсдококков. -

Синтез внеклеточных ажнокислот. ПскгреЛдение,гмообразннх углеводорода» родококкамн сопровождается не тошю ядонеоишк меточной структуры бактерий, но я существенной перестройкой многих процасоов их метабодиэда. Нами установлено, что вр* переходе ро-дококков о углеводного на углеводородное' питание изменяется качественный орота» экстрацелдюдярных аминокислот, Так, если аргинан выделялся в ереду о глюкозой тоико девятью штаммами кьойосоосин врр., то при роста на пропане его выделяют в кудьтуральную жидкость вое,26 исследованных штаммов,;Увеличивается и числа изаня- . тов, способных синтезировать зкстрацелдипярные валмн.лейцик, ли-аия, метионин, фенилаланин, Нашнеральной среде'о пропаном в качестве единственного источника углеродного питания обнаруживается также изменение количества внеклеточных аминокислот, что выражается в значительна увеличении (р < 0,05)"содержанияаргинина, .валяна, гн стали на, глутаминовой кислоты, иэолейцнна, ллзияа, ые-тяоняна, тирозина, фенилаланина по сравнению о количеством дая-ныхешвокиолот, ввдвдяемыхродококкамив сингетичес^ю средуе глюкозой, В присутствии протна родококки синтезирухч довольно много аргинина (до 0,6 валяна (до 1,2 тМ/д), лизина (до

1,1 дМ/л), гиотвдика (до Х,5 аИ/л). V'■";V\;V'^^^л■' /

/"^вреаи^ чртаидуальных я-алкановя яизкемалекулярных спиртов. Характерной особенностью изученных гаэоокмеляющих родококков является способность их ассимилировать в качестве, источников^углерода индивидуальные н-алканн от Сэ до С9, а также от С^ до С^. Нонан (Сд) и декан не ассимилируются. Длина углеродной цеш

в моле нуле н-алкана влияет на продолжительность даг-фазы, скорость роста рсдококков и количество синтезируемой бномаосы, Так, максимальный выход биомассы на среде с н-алканаш С11-С16 наблюдается

на 3-4 сутки, тогда как На среде о углеводородами с белее короткой углеродной цепью - S-7 сутки.

Все язояяты используют в конструктивном обмене в качестве единственных источников углеродного питания этанол, н-просаяоя я н-бутаяол. Способность растя на данных спиртах не -зависит от видовой принадлежности штаммов родококков. Интенсивное накопление биомассы происходит на втаноле и н-бутаяоле. На этих субстратах Rbodecoco«e epp. синтезируют от 1,1 до 3.8 г/л АСЭ в течение 46 суток роста. На среде о н-пропаяолом на 6-8 сутки ин^бадяи урожай оостаздяет 0,5-2,4 г сухой биомассы! на 1 л среды. Все родо-кокки значительно хуже используют в качестве ростовых субстратов метанол я иэоспярти. Цри этой они в течение 6-8 суток накапливают 0,6-0,9 г/л АС8.

Глава 1У. ИЗУЧЕНИЕ АЯТИШШОЙ СШОДЯШХЯК rhodococcus SPf.

Проведенные исследования показали, что, несмотря на принадлежность выделенных нами пропан- я бутанокисляющих бактерий к рааличным видам - a.rhodoohroue и : в.ruber,- они бдязкя пофе-нотяпкчесхиы свойствам, развиваются в одинаковых экологических условиях, характерных для изученных грунтовых в ад Пермского Цред-урадья. Дифференциация этих видов вызывает немало затруднений я требует дальнейшей разработки, В этой: связи каш в качестве одного из возможных подходов установления видоспегдафичнос ти родококков использовано выявление их антигенных различий в серологических реаюрях о диагностическими именными сыворотками.

Проведен,подбор оптимальных условий для получения еысокоак-тившх антисывороток против RhoUococou» spp. с учетом следугщпх .факторов, определяющих эффективность иммуннвацм: физико-химическая^ природа вводимого антигена {корпускулярный аш водорастворимый)! метод его введения; кратность и интервалы мезду имыунизаниями. разработан усовершенствованный способ получения высокодис-

персаой емульсии антигенов Kto dococcus ерр. в адьюваяте, который предусматривает дезинтеграцию ынедобных клеток н создание эмульсин в эдной пробе. С этой целью бактерии обрабатываются ультразвуком на дисвэргаторе типа УЗДН-1 при ультразвуковых колебаниях 45 кП* в течение IS мин, затем в пробу добавляется неполный адьювант Фрейнда (1:Х) и смесь дополнительно озвучивается Б шн. Избирательно используя разработанные оптимальные схемы получения гомогенатов де зинтегрирдванных бактериальных клеток и антисывороток к ним, бшш получены (.иммунные сыворотки против 10 штаммов Rhodococcua ерр., в том числе ряда типовых, с титром агглютининов 1:2046, преципятинов 1:1024, о достаточно высокой ви-доспедифичности которых свидетельствуют данные, цредотавленные в таблицах 2, 3.

Степень антигенного родства ыеаду Ktodococcus »pp. исследовали в опытах перекрестной постановки реакций агглютинации, непрямой имыунофлюоресцеяцнл и имцунодаффузии в агаровом геле (РИ). Результат серологической идентификаций свежевыделенных из грунтовых вод газоокяслящнх родококков (табл. 2) указывают, что подавляющее большинство штаммов, по фенотишческвм свойствам диагностируемых как R.rhodocliroua или Е. ruber, также идентифицируются и о помощью РИ. Следует отметить, что на основании ОД штаммы (ОЗГМ 17РЖ, СЭЛ! ISPX, ОЭГЫ 450, ОЗЛА 775), промежуточные ПО фенотипическим признакам между R.rhodochroua и н.ruber (табл. I), удалось о определенностью идентифицировать как R. г ¡10 doc Ii roue (табл. 2). Оки причисляются к атому виду и по результатам реакций агглютинации и непрямой иммунофлюоресцеиции. В ходе проведенных исследований с привлечением значительного набора штаммов родококков (в т.ч. типовых), принадлежащих х видам lutrythropoiis, R.rhodochrous, R. ruber, K.rubjrvjpertinctus, R. terrae, показала высокая специфичность серологических реакций, позволявдих вняв-

Таблица 2

".Распределение хзолираванша дз гигямвнх вод газоокясдящвх рсаошжмв в соответствии с числом выявленных в гомзлопптд сястешх антагеа-: анмтздо общих дгг преци цитация

1Коаж-: : ' , , , Днтисавооогки штаммам' _■

. ;4eC*rlB.rhodocbiwia • B.thoioehrous * Е.гиЪзг ; Н.гиЬег * E.rabropertlnc-£вд rj^jATCC 13808(3) i 0ЗД1 27-П (4) ! >W (3) i ОЗШ 14-П (Z) ; tue ИМВ 130(4)

:вов :ошix> 2 3 : oí i1J2 з 4: о ш i1* г з j о ш i" г • о ш 1Х) г з 4

........и,i .i „ « iiii' i *

■ B.riwdochroue 47 42 ) 43 ' 42) 43 39 8 34 13 41 6

R.ruber . .'■' 9 2 7 5 4 9 9 7 2

Примечание :0 - линия преципитация отсутствует; Ш- образование истинной„шпорыГ

^ Цяфрнвскобгах я 1-4 означаю количество общи вреодшмяогенов в гомологичной системе аятяген-аятитело;

. ' 2У оташы (ОЗГш I7PÍ, 03TJ 18РЖ, ОЗШ 450, О&Ы 775), Ероыеяуточнне ко феном-■ ввчесхяи свойствам меаду £.rhodocbroae и Е.гиЪег.

ИМВ - Институт шифойислогм и вирусологии АН УССР.

Таблица 3

Результаты перекрестных РИ тжяовых имиунныг сывороток с гоиогеяаташ бактериальных клеток хкдоных культур Июаосоееиз врр.

; Гомогенаты клеток типовых штаммов родокош®

Адтясыворотва :....... + .. ,-.-,------...-------- —-------

;Е.Сог9111- ;В.вгуй1хо-; В.тЬоДосЬ- * В.гиЪег ; В.гиЬгорег- ; ЕЛеггее

к штавдт : йог ; рош ; гоиз ; ; -шсгие : ______: АТСС 25593: АТСС 4377.; АТОС 13608; Ц.Х ; АТСС 14353 ; ЛТСС 25594

В.сотеШаш АТСС 25593 - ' - " ч . + +

Я.гтзгЬгсроШ АТСС 4277 - +++ \ . V ■ -

В,ГЬС4ОСЬгоо8 АТСС 13808 - - +++ ++ - ' -

Е.гиЪег Ц-1 ++ +++ - -

& .гиЪгорелию-Ъиз АТСС 14352 ■ ++ - л +++ \ +

&.£егтав АТСС 25534 V - + +1

Примечание: Число сдгсов отражает число полос прецдштащш;. - отсутствие общих антигенов; ■ Шд - длинная истинвая.апфа" (Лээеяв, Гарве!, 1976),

Рис. 5. Реалия ивдуаоддффузла б агаровом геле системы: шггиснворотка (АС) против 2,rtLodochrott3 ОЗШ 27-й, вультяви-- руемого яа пропане, - гсизгвяат бактериального иггамма E.rhodoehxous ОЗШ 27-Й, выращиваемого на просеке (Аг1)

Рис. 6. Реакция яшунода$фузил в агаровом rase сястеыы: антяскворотка (я;) против B.rhodochioue ОЯЯ 27*11, культивируемого на пропане, - гошгенат бактериального еташа Е.йкйосьгопе ОЗШ £7-П, выращиваемого на ША ÍÁrHJ

лять антигенное родство отдельных видов Bhodocoecue epp.i в частности, В*terree, R.rubropertínctue и R. coral llnuet R.rhodocb-roue и к.гиЪвг (табл. 3), а также целесообразность использо- . вания данных реакций (в качестве дополнительного критерия) дня идентификация Rbodococcue ерр., а именно: R-xhodochrouB, К.ти-

Ьвг я И.rubropertinotue.

Представляется важным факт выявления в клетках индикаторных на нефть и газ цроган- и бутанокислянцях бактерий функциональных антигенов (ряс. 5,6). Полный сдерур предапитацаоаной системы АС-АгП отличается от такового системы АС-Аг1 но отсутствию одной специфической линия преципитации А и резкоцу уменьшению концентрации антигена, обусловливающего возникновение преципитационной дуги В. (Истощение антисыворотка к jt.xhodookroue ОЗГЫ 27-П, Культивируемому на пропане, гомогенатом R.rhodúchroue ОЗГМ 27-11, выращенного на ША, подтвердило идентичность полос прецишпации С, Ь,В и В.) Направленный синтез больших количеств специфических дополнительных антигенов в клетках родококков, культивируемых в присутствии пропана (а не на ША), можно, по-ЕИдямоцу, объяснить' индукцией субстратом питания синтеза соответствующих аятягенспеци-фичеокнх энзимных систем его утилизации. Обнаружение функциональных антигенов, очевидно, подтверждает адаптивную природу ферментов окисления газообразных углеводородов, которые формируются только после появления данного субстрата в среде.

вывода

I. Микроорганизмы, облачающие способностью использовать в качестве единственных источников углерода высшие газообразные гомологи метана - пропан и бутан, обитают в фунтовых водах района нефтяных месторождений Пермского Предуралья, Количество их колеблется от сотен до десятков тысяч клеток в I ил води. Данных микроорганизмов в несколько раз больше в водоисточниках с высокой кок-

центрацией тяжелых газообразных углеводородов, чем с низкой.

2. Провая- н бутанокисляющиз бактерии не выделяются из водоисточников, питающихся из района разбуренной не продуктивной структуры, что позволяет считать данные организмы снецифичесиями для определенной экологической ниши, а именно - водоносных горизонтов над контуром нефтеносности.

3. И зонированные микроорганизмы являются представителями рода HbodococcuB Zopf 1691 и принадлежат к видам R.rboioclii-oua и Н.ruber. Поскольку К R.rhodoehroua относятся подавляющее большинство выделенных организмов, данный вид может быть рекомендован как индикаторный на нефть при нефтегаэопоисковой съемке со водоисточникам в условиях Пермского Предуралья.

4. Выделенные Rhodococcue spp. характеризуются радом особенностей - способностью расти при 5-Ю°С, активно ассимилировать углеводородные газы, олкгокарбофилией, ояигонктрофолпей. Они усваивают индивидуальные н-алканы от пент&на до гексадекана, за исключением нонана и декана. Наиболее активно н-алканы усваиваются штаммами R.rhodochroue. Длина углеродной цепи молекулы н-алкана влияет на продолжительность лаг-фазы, скорость роста и синтез биомассы Hhodoooccus epp.

5. Rhodocoocua ерр., растущие на минеральной среде в присутствии пропана, по сравнению с «удьтаэируешми на органических средах (например, мясо-педтоияом агаре), характеризуются наличием электронно-плотных включений, окруженных электронно-прозрачной зоной и включений умеренной электронной плотности, имеющих вид вакуолей; хорошо развитой внутризметочной мембранной системы, локализующейся вблизи клеточной стенки; повышенным содержанием гранул вошотина и фрагментацией цитоплазмы на отдельные участки.

6. Khodococcuc ерр. при выращивании их в атмосфере пропала накапливает внеклеточные аминокислоты (до 1,5™ М/л): аргинин, Bf>-

лян. гистядин, лигиа, глутаминовую кислоту, ä присутствия пропана родококки синтезируют более широкий спектр и большие количества аминокислот, чем при выращяваиаи их-на минеральной среде о глюкозой.

7. Дня получения антигенных комплексов родококков разработай оптимальный режим ультразвуковой обработки бактериальных клеток (45 кГц, 20 мин) н усовершенствованный способ получения внсоко-дисперсной ацульсии антигенов бактериальных клеток Rho лососе ив

ерр. в адьюванте с использованием ультразвукового дезинтегратора.

8. Выращивание газоокисляющих n.rhodochi-oue в атмосфере пропана определяет наличие у них функциональных антигенов (обнаруживаемых с помощью реакции двойной иммунсвдМузии в агаровом гаде), не выявляемых у данных микроорганизмов при культивировании их на ША. Указанные специфические антигены не найдены у к. rhodochroue, не способных усваивать пропан. Установленная закономерность может быть использована для направленного поиска (с помощью серологических методов) родококков, обладающих способностью ассимилировать газообразные углеводороды и обитающих в раз-, личных природных экосистемах.

9. Серологические методы (в частности, метод нимуяодиффузи-онного анализа, непрямой метод флюоресцирующих антител) рекомендуем использовать для ускоренной идентификации Rtiodocoscue ерр.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

X. Оборин A.A.. Ившина И.Б., Рубинштейн Ü.M.. ¿ёрдичевская U.B., Впадимирцев Г.И. Некоторые особенности экология углеводо-родокислящих бактерий грунтов а подземных вод нефтяных месторождений Пермского Предуралья. - 3 кн.: Рост микроорганизмов на Отсоединениях: Тезисы докладов II Международного симпозиума (12-

17 сентября 1977). Пущико, 1977, с.б,

2. Поносов В.Л., Хвдана 1.Б., Кеворков H.H., Спектор ГЛ. 1муногенн|сть f антигеана специф(ча(сть ряду сапрофИнях штам(в бактер1й, асин!люючих вутлеводя(. - Шкроб!ол.журн., 1377, т.39, вип.6, с.753-754.

3, Оборин A.A., И вши на 14.Б., БервдчеВская М.В.О природных экологических факторах, влияющих ва жизнедеятельность углеводо-родокислявдей микрофлоры. - В кн.: Геошчфобиодогия поиска а разработки нефтяных месторождений. Свердловск, 1979, с.30-38.

4» Ившина И.В., Влади мирцев Г.И. Сравнительная характеристика углеводородокисляющей микрофлоры грунтовых вод Пермского Цред-уралья я Ставрополья. - В кн.: Геомикробиология поиска и разработки нефтяных месторождений. Свердловск, 1979, с.51-52.

5, Ившина И.Б. Сравнительное изучение антигенной специфичности различных видов тзоиспользувщих бактерий. - В кн.: Геохимические методы поисков нефти и газа на Русской платформе. Иэд-во Саратовского ун-^га, 1990, с.41-42.

Б. Ившина H.Ii., Кеворков H.H., Оборин A.A. Серологическая идентификация углеводородомелдидих бактерий. - В кн.: На главных цутях научно-технического прогресса: Тезисы докладов У1 съезда Всесоюзного шяроби алогического общества (25-29 марта 1980). Рига, 1980, с.60.

7. Ившина И.Б., Оборин A.A., Нестереяяо O.A., Касумова С.А. Бактерии рода Rhodococcue грунтовых вод района нефтяных месторождений Дермского Предуралья. - Микробиология, 1981, т.50, вып. 4, с.709-7X7. ...

-

БФ 17744 Зам, Формат 60x90/16. Уч.-изд.л. 1,0 Подписано к печати £7.04.1982 г., Тирах 100, Бесплатно.

Офсетная лаборатория Института теоретической физики АН УССР