Распределение признаков биодеградации углеводородов и оценка технологически важных свойств нефтеокисляющих бактерий

Мельников, Дмитрий Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Распределение признаков биодеградации углеводородов и оценка технологически важных свойств нефтеокисляющих бактерий
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Распределение признаков биодеградации углеводородов и оценка технологически важных свойств нефтеокисляющих бактерий"

УДК-573.6:579.6 На правах рукописи

Мельников Дмитрий Александрович

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИЗНАКОВ БИОДЕГРАДАЦИИ УГЛЕВОДОРОДОВ И ОЦЕНКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫХ СВОЙСТВ НЕФТЕОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар, 2005

Работа выполнена на кафедре генетики и микробиологии Кубанского государственного университета

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Э.В. Карасева

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор

А.А. Петенко

кандидат биологических наук, доцент М.Д. Назарько

Ведущая организация: ФГУ "Краснодарский биоцентр"

Защита состоится «20» декабря 2005 г. в часов на заседании Диссертационного Совета Д 220.038.09 при КубГАУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кубанского государственного аграрного госуниверситета.

Автореферат разослан «» ноября 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат биологических наук

Н.В. Чернышева

¿4990

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

з зиъ&^з

Актуальность темы. На сегодняшний день все острее возникает проблема углеводородных загрязнений почвы и детоксикации нефтешламов. Для безопасного решения задачи детоксикации нефтезагрязненных субстратов используются следующие подходы: интродукция нефтеокисляющих микроорганизмов в загрязненный объект и оптимизация жизнедеятельности аборигенной углеводородокис-ляющей микрофлоры. При реализации этих подходов возникают определенные проблемы.

Нефтешламы с длительными сроками хранения отличаются от большинства углеводородных поллютантов несколькими особенностями: высоким содержанием неуглеводородных компонентов (смол и асфальтенов), низким содержанием легких углеводородов, это придает поллютанту высокую температуру плавления (3060 °С) и вязкость. Кроме того, соотношение различных компонентов в нефтешла-мах сильно варьирует, это затрудняет выбор и применение многих технологических приемов, используемых при их очистке.

В биотехнологии очистки объектов, загрязненных углеводородными поллю-тантами, применяются нефтеокисляющие бактерии разных систематических групп. Широко используются углеводородокисляющие актинобактерии. На данный момент недостаточно изучена способность актинобактерий разрушать тяжелые неуглеводородные компоненты нефтепродуктов, ничего неизвестно о распространенности данных признаков среди штаммов нефтеокисляющих актинобактерий и их взаимосвязи с признаками деградации углеводородов. Кроме того, из-за вязкого или твердого состояния смолисто-асфальтеновых фракций недостаточно разработаны методики конструирования и приготовления минимальных плотных и жидких сред с данными веществами в качестве источника углерода и энергии.

Для штаммов, деградирующих монокомпонентные загрязнения (фенол, пестициды и др.), существует универсальный критерий отбора - способность к полной минерализации поллютанта. Так как нефть содержит сотни веществ и их соотношение различается от образца к образцу, возникает вопрос, по каким критериям отбирать и сравнивать нефтеокисляющие штаммы? Для оценки и отбора

культур-интродуцентов необходимо учитыва со способно-

стью деградировать нефтепродукты, есть необходимость сравнивать потенциал штаммов, причем в контексте конкретного поллютанта и на ранних этапах отбора культур потенциальных интродуцентов. На данный момент неизвестны универсальные критерии отбора углеводородокисляющих микроорганизмов, активных по отношению к широкому кругу нефтяных поллютантов.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в исследовании характера распространения признаков биодеградации углеводородов среди выделяемой в чистой культуре аборигенной аэробной гетеротрофной микрофлоры чистой и загрязненной почвы, нефтешламов различных типов, выяснении закономерностей встречаемости признаков деградации углеводородов и неуглеводородных компонентов нефтепродуктов среди лабораторных штаммов актинобактерий. На основе полученных данных предполагалось отобрать культуры нефтеокис-ляющих актинобактерий - потенциальных интродуцентов, оценить некоторые технологически важные признаки у отобранных штаммов-интродуцентов. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи: 1) оценить разнообразие спектров потребления углеводородов у микрофлоры, выделяемой из местообитаний с разным характером нефтяных загрязнений; 2) среди штаммов нефтеокис-ляющих актинобактерий провести исследование чувствительности к тяжелым металлам; 3) отобрать штаммы, активные в отношении конкретных нефтепродуктов-поллютантов, а также их отдельных компонентов с учетом чувствительности к тяжелым металлам; 4) исследовать возможность и степень деградации компонентов мазута отобранными штаммами нефтеокисляющих актинобактерий; 5) исследовать влияние явления диссоциации на технологически важные признаки у потенциальных штаммов интродуцентов.

Научная новизна. На основе исследования микробных популяций проводится оценка и сопоставление способности к росту на различных углеводородах гетеротрофной микрофлоры чистого и загрязненного нефтью чернозема и нефтешламов с разным характером загрязнения. Предлагается оригинальная система сравнения и оценки штаммов нефтеокисляющих актинобактерий. Предлагается способ выделения диссоциатов актинобактерий по признаку антибиотикорезистентности В ходе исследований апробирован способ создания плотных и жидких питательных сред с твердыми нефтешламами, битумами и неуглеводородными компонентами

нефтепродуктов - смолами и асфальтенами.

Настоящее исследование выполнено в соответствии с Всероссийской программой фундаментальных исследований "Проблемы общей биологии и экологии; рациональное использование природных ресурсов (1998-2005 гг.) Направление 12: Экологические проблемы биоповреждений" (РАН Отдел биологических наук, Научный совет по биоповреждениям). Часть исследований проведено в рамках работы по гранту ЮТАБ 01-2151.

Практическая ценность работы. Результатом данной работы является разработка способа отбора лабораторных штаммов нефтеокисляющих актинобактерий, основанного на общих закономерностях распределения признаков деградации отдельных углеводородов у почвенной микрофлоры и микрофлоры нефтешламов. Проведен скрининг коллекции штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов по комплексу признаков деградации углеводородов, отдельных компонентов нефтепродуктов и нефтешламйв. Произведена количественная оценка параметров биодеградации модельного поллютанта у отобранных штаммов, которые рекомендованы к дальнейшему изучению и созданию на их основе бактерийных препаратов для детоксикации нефтешламов. Основные положения, выносимые на защиту.

I. Содержание бактерий, окисляющих отдельные углеводороды нефти выше, чем окисляющих сырую нефть, среди выделяемой гетеротрофной микрофлоры.

2 Характер распределения микроорганизмов с разными спектрами потребляемых углеводородов не отличается у чистых почв, загрязненного нефтью чернозема и нефтешлама, подвергнутого микробиологической очистке.

3 Обоснован способ прогнозирования роста штамма на нефтепродукте-поллютанте на основании спектра потребляемых им углеводородов.

4. Показана возможность отбора штаммов актинобактерий, устойчивых к солям тяжелых металлов и при этом способных расти на большом наборе углеводородов.

5. Предложен способ контроля процесса диссоциации штаммов нефтеокисляющих актинобактерий по технологически важным признакам.

Апробация работы и публикации. Результаты исследований, изложенные в данной работе, апробированы на следующих конференциях: "Экология 2000: Эстафета поколений. I международная межвузовская школа", "Актуальные вопросы эко-

логии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий, 2000", "Современные проблемы биологических повреждений материалов (Биопрвреждения - 2002)", "1th FEMS congress of European microbiologists, 2003". Всего опубликовано девять работ, одна в печати.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания постановки экспериментов и методов исследования, результатов и обсуждения собственных исследований, выводов и приложения. Работа содержит 28 таблиц и иллюстрирована 29 рисунками. Список использованной литературы включает 155 наименований, в том числе 55 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе исследованы лабораторные штаммы нефте-окисляющих актинобактерий (44 штамма) и микрофлора, выделенная сотрудниками кафедры генетики и микробиологии КубГУ из свежих образцов почв и неф-тешламов: 74 штамма из почвы загрязненной легкой тенгизской нефтью, 45 штаммов из почвы, загрязненной российской нефтью, 36 штаммов из чистой почвы, 108 штаммов из нефтешлама на завершающей стадии очистки, 106 штаммов из чистой почвы, две выборки по 20 штаммов из нефтешламов, не подвергавшихся микробиологической очистке.

Питательные среды, используемые для культивирования микроорганизмов

(Методы общей бактериологии, 1983). Для поддержания и выделения чистых культур гетеротрофных микроорганизмов использовали стандартные питательные среды: питательный агар, питательный бульон, среду Эшби; крахмало-аммиачный агар, среду для целлюлозоразлагающих аэробных бактерий, почвенный агар, питательный агар разведенный в сто раз. Для культивирования нефтеокисляющих микроорганизмов и определения их активности использовали жидкую минеральную среду следующего состава (г/л): KN03 - 4,Or, КН2Р04 - 0,6г, Na2HP04*12H20 - 1,4г, MgS04 - 0,8г, Н20 (водопр.) - 1л, агар - 20г. Источники углерода: углеводороды, нефть и нефтепродукты - 0,2% (0,2 г/100 мл среды). Определение способности микроорганизмов к окислению мазута в жидкой минеральной среде. Для оценки деградации мазута культивировали актинобакте-

рии в колбах на качалке при комнатной температуре в жидкой минеральной среде с мазутом в качестве единственного источника углерода и энергии и концентрации 0,5 об.%, в течение 14 дней. Далее экстрагировали остаточный мазут хлороформом, испаряли при комнатной температуре растворитель и взвешивали. Определение у микроорганизмов способности к росту на углеводородах. Для определения способности к росту йа углеводородах использовали плотную минеральную среду с углеводородами (0,2%) в качестве единственного источника углерода и энергии. Исследовали рост бактерий на следующих углеводородах: смесь н-алканов (Си-Сц), н-алканы ряда С6 - С18, бензол и его производные и полициклические ароматические углеводороды. Нафтид нефтешламов вносили в расплавленную минеральную среду перед автоклавированием в виде хлороформенного экстракта. Смолы и битум в виде бензольного раствора. Перед розливом расплавленную среду нагревали и выдерживали в течение одного часа на кипящей водяной бане в вытяжном шкафу для удаления растворителя и периодически встряхивали. Затем производили посевы микроорганизмов методом штриха. Результаты учитывали на седьмые сутки, по системе:«-» - роста нет,«+» - рост есть. Определение чувствительности штаммов актинобактерий к солям металлов (Методы общей бактериологии, 1983). Металлочувствительность штаммов актинобактерий определяли при помощи посева на питательный агар, содержащий соль металла. Исследовали чувствительность к следующим солям: Си804, гп80ь С(1(Ш,Ь К2[НеС14], N¡804, СоС12, Мп804) РеС13, Ыа2\У04, (ЫН4)2Мо04. Выделение диссоциатов актинобактерий по признаку антибиотикочувстви-тельности методом дисков. Исследование диссоциации и отбор штаммов-диссоциатов по признаку антибиотикоустойчивости вели по следующей схеме. 1) Готовили жидкие культуры, в жидкой среде следующего состава: глюкоза - 5,0 г, дрожжевой экстракт 5,0 г, пептон 10,0 г, соли как в вышеописанной минеральной среде, вода водопроводная до 1 л. Культивировали бактерии при 30°С в течение 5 суток. 2) Исследование акгибиотикочувствительности проводили методом дисков на агаризованной минеральной среде, с 1 % глюкозой в качестве источника углерода и энергии. На поверхность пластинки агара, инокулированной 0,1 мл жидкой культуры, наносили бумажные диски, пропитанные антибиотиками. Культивировали бактерии при 30°С в течение 5 суток. 3) Диссоциаты наблюдали в виде от-

дельных колоний, расположенных внутри зоны подавления роста вокруг диска с антибиотиком. Далее отбор диссоциатов и исследование их свойств проводили как описано у Милько Е.С. и Егорова Н.С. (1991).

Битумииологические анализ нефтепродуктов. Для разделения нефтепродуктов использовали метод экстракционной хроматографии. В основе метода лежит принцип избирательной растворимости компонентов нефтепродуктов в разных растворителях. (Успенский В.А. с соавт., 1975). Часть анализов проведена в Рос-НИПИтермнефть канд. геол.- минералог, наук Микериной Татьяной Борисовной. Хроматографические анализ масляных экстрактов нефтепродуктов и сырой нефти. Анализ качественного состава нефтепродуктов проводили газохромато-графически на хроматографе "Шимацу RTF4" в ГазНИПИПереработка и "Chrom 5" в центре "Аналит" КубГУ.

Параметры анализа. Хроматограф "Шимацу 4RTF": колонка адсорбционно-капиллярная - сорбент "Силоксан Е-30", использовали режим с программированием температуры 80 - 270 "С (2 °С мин), газ-носитель гелий, для анализа нефтей использовали режим программируемой чувствительности детектора.

Хроматограф "Хром 5": колонка газо-жидкостная 2,5 м, диаметр 3 мм, носитель "Хроматон MAW-HMDS" с 5% SE-30, использовали режим с программированием температуры 30 - 270 °С (10 "С мин), газ-носитель азот. Математическая обработка результатов. Для измерения различий распределения штаммов по количеству деградируемых углеводородов между группами изо-лятов, разделенными по показателю роста на нефтепродукте, использовали двух-выборочный критерий Колмогорова-Смирнова. Этот критерий использовали также для оценки отличий по количеству деградируемых углеводородов между группами штаммов, выделенными на разных средах. Для оценки взаимосвязи между количеством деградируемых углеводородов и способностью к росту на поллютан-те использовали критерий хи-квадрат и коэффициент неопределенности в качестве меры связи. Анализ проводили в программе SPSS 11.5 for Windows. Достаточным уровнем достоверности считали 5%.

Для группировки признаков деградации углеводородов в зависимости от качественных особенностей спектра потребляемых углеводородов использовали многомерное шкалирование, модуль (PROXSCAL, порядковая модель с разреше-

нием связанных наблюдений) программы SPSS 11.5 for Windows. В качестве дистанции между объектами использовали Евклидову меру для бинарных Данных (Компьютерная биометрика, 1990). В результате получали Двумерное пространство, где расстояние между объектами служило мерой сходства между ними.

Для измерения разнообразия выделенной микрофлоры с учетом степени сходства индивидуальных характеристик роста штаммов на различных углеводородах использовали коэффициент Евклидова разнообразия (EDC - Euclidean diversity coefficient), приведенный в работе (Stephane Champely and Daniel Chessel, 2002).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оценка способности к росту на углеводородах у микрофлоры, выделенной из местообитаний с разным составом углеводородного поллютанта

Для исследования состояния микрофлоры нефтезагрязненных экосистем использовали следующий Подход: выделение изолятов в чистой культуре с последующим исследованием их способности к росту на различных углеводородах. Эту схему реализовали двумя способами: 1) выделение на разных средах для гетеротрофных микроорганизмов максимально большого числа изолятов, отличающихся друг от друга по культурально-морфологическим признакам; 2) выделение всей культивируемой микрофлоры с учетом разведения, отражая количественное соотношение различных изолятов с различными спектрами потребляемых углеводородов в высеве.

1.1 Характеристика способности к росту на углеводородах у микрофлоры, выделенной из почвы, загрязненной нефтью

Для выделения максимального число штаммов, способных деградировать углеводороды, нужно сочетать оба способа - выделение микроорганизмов на минеральной среде с поллютантом и поиск признаков роста на углеводородах у микроорганизмов, выделенных на средах без углеводородов, где исключается их токсическое действие.

Нами была проверена способность к окислению углеводородов у 74 штаммов бактерий, выделенных из чернозема, загрязненной легкой сернистой тенгизской нефтью. Также было исследовано 45 штаммов бактерий, выделенных из чернозе-

ма, загрязненного российской нефтью и 36 штаммов выделенных из той же почвы, но чистого образца. Штаммы были выделены на средах для различных физиологических групп гетеротрофных микроорганизмов. Все выделенные изоляты были способны к росту на питательном агаре, давали различные типр колоний, отличались друг от друга по комплексу культурально-морфологических признаков. Основной характеристикой каждого изолята считали спектр потребляемых им углеводородов. В качестве субстратов использовали индивидуальные н-алканы ряда октан - октадекан, бензол, бутилбензол, толуол, псевдокумол, орто-ксилол, российскую и тенгизскую нефть. Количество углеводородокисляющих микроорганизмов с различными спектрами потребляемых углеводородов, выделенных на разных средах, приведено в таблице 1.

Таблица 1 - Количество изолятов углеводородокисляющих микроорганизмов,

выделенных на различных средах

Почва загрязненная тенгизскойлефтью Почва загрязненная российской нефтью Чистая почва

Среда выделения Коли- Количество изо- Коли- Количество изо- Коли- Количество изо-

чество лятов с различ- чество лятов с различ- чество лятов с различ-

изолятов ными спектрами потребляемых углеводородов изолятов ными спектрами потребляемых углеводородов изолятов ными спектрами потребляемых углеводородов

Суммарная выборка 74 29 45 15 36 12

Среда с нефтью 18 9 12 8 6

ПА 32 22 - - - -

Среда для целлюло- 10 6 10 4 9 5

литиков

КАА 9 4 - - - -

Эшби 5 3 15 5 0 0

Почвенный 3 2 6 1

агар

ПА: 100 - - 5 3 13 3

Примечание:

Прочерк обозначает, что на данной среде не проводили выделение микроорганизмов; ПА - питательный агар; КАА - крахмало-аммиачный агар, ПА-100 - питательный агар, разведенный в сто раз.

Каждая среда в отдельности позволила выделить меньше изолятов с уникальными спектрами деградации углеводородов, чем все среды вместе. Особенно важно, что использование нескольких сред для гетеротрофных микроорганизмов дало

возможность выделить в два раза больше изолятов бактерий с уникальными спектрами потребления углеводородов, чем только одна среда с нефтью. Очевидно, что выделение всего многообразия углеводородокисляющих микроорганизмов было бы неполным, если использовать только минеральную среду с нефтью.

Рост на нефти предполагает наличие соответствующих ферментных систем деградации углеводородов и механизмов подавления токсического действия нефти. Для эффективного окисления компонентов нефти, микроорганизм должен компенсировать ее токсическое действие и быть способным использовать хотя бы часть компонентов в качестве источника углерода и энергии.

Штаммы, которые росли на нефти, потребляли до 13 углеводородов, а не способные к росту на нефти, значительно меньше (рис. 1).

4 * и 30

ей 20

И 10

т 0

■Л

п-.гъ ■

. 11

3 4 5 6 7 8 9

Количество утилизируемых углеводородов

10 11

Отсутствие роста на ° нефти

Наличие роста на " нефти

Ь с « о. »

6 ё эо « =

г 4* г ю

—I

__.1

]

_ Отсутствие роста на нефти

Наличие роста на нефти

5 6 7 в 9 10 11 12 13 14 15 Ю 17

Количество потребляемыху! деводородов

6 е

8 5

г 4

е £ 20

? 10

П ~ -

Отсутствие роста на О нефти

Наличие роста на нефти

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 ц Количество потребляемых углеводородов

Рисунок 1 - Распределение частот встречаемости изолятов с различным спектром потребляемых углеводородов в зависимости от способности к росту на нефти Примечание:

А - образец загрязненный тенгизской нефтью, Б - российской нефтью, В - чистая почва

Очевидно наличие зависимости между способностью к росту на нефти и количеством окисляемых углеводородов. Для оценки такой зависимости использовали двухвыборочный критерий Колмогорова-Смирнова, критерий хи-квадрат и коэффициент неопределенности. Данные приведены в таблице 2. Таблица 2 - Статистические показатели, отражающие взаимосвязь количества потребляемых углеводородов и способность к росту на нефти

Выборка штаммов г-статистика двухвы-бороиного критерия Колмогорова-Смирнова Критерий хи-квадрат Коэффициент неопределенности

Почва загрязненная тенгизской нефтью 3,31 (р< 0,001). 49,25 (<!./. =10, /КО,001) 0,62 О<0,001)

Почва загрязненная российской нефтью 2,36, (р < 0,001) 40,77(<*/ =7,/КО,001) 0,89 (р<0,001)

Чистая почва 1,94 (р = 0,001) 35,00 («¿/ =7,/КО,001) 1,00 (р<0,001)

Наличие сильной положительной связи между количеством потребляемых штаммом углеводородов и способностью к росту на нефти подтверждено достаточно убедительно.

Дополнительно сравнивали распределение штаммов с различной шириной спектра потребляемых углеводородов в выборках штаммов, выделенных из чистой и загрязненной почвы. Получены следующие результаты: г-статистика двухвыбо-рочного критерия Колмогорова-Смирнова равна 0,47, р-уровень равен 0,979. Следует признать, что не обнаружено различий по распределению штаммов с разными спектрами потребляемых углеводородов между выборками штаммов выделенных из чистой и загрязненной почвы.

1.2 Выделение гетеротрофной и нефтеокисляющей микрофлоры из чистой почвы и нефтешламов и оценка ее способности к росту на углеводородах

Известно, что нефтешламы, как и почвы, характеризуются присутствием в них гетеротрофных микроорганизмов. В данном варианте мы стремились выделить как можно больше изолятов гетеротрофных бактерий с учетом концентрации бактерий в высеве и исследовать спектр потребляемых углеводородов у выделяемой микрофлоры. Чтобы выделить максимальное число штаммов, способных деградировать углеводороды, сочетали два способа: а именно, выделение микроор-

ганизмов на минеральной среде с нефтепродуктом-поллютантом и поиск признаков утилизации углеводородов у гетеротрофных микроорганизмов, выделенных на среде без углеводородов, где исключено токсическое действие нефтепродукта. Отбирали все видимые колонии для получения чистых культур.

Микроорганизмы выделяли из чистой почвы (чернозема), нефтешлама на завершающей стадии очистки (концентрация нефтепродуктов - 34,8 г/кг) и двух образцов нефтешламов (концентрация нефтепродуктов свыше 300 г/кг). Битумино-логическая характеристика нефтешламов и нафтида нефтешлама на завершающей стадии очистки приведена в таблице 3.

Таблица 3 - Битуминологическая характеристика нафтидов нефтешламов и

нефтешлама на завершающей стадии очистки

Компонент Нафтид нефтешлама с длительным сроком хранения Нафтид свежего нефтешлама Нафтид нефтешлама на завершающей стадии очистки

Асфапьтены 10,93 2,72 5,00

Смолы бензольные 8,15 14,32 15,83

Смолы спир-тобензольные 4,43 8,08 7,33

Масла ^75,76 74,41 70,47

Парафины 0,73 0,47 1,37

Выделение и количественный учет микроорганизмов проводили методом кратных разведений почвы (нефтешлама), суспендированной в физиологическом растворе. Четыре грамма почвы (нефтешлама) помещали в 40 мл физиологического раствора. После встряхивания, по стандартной методике делали десятикратные разведения. Начиная с четвертого разведения для нефтешламов и пятого для почвы делали двукратные разведения. Соответственно посевы производили из последнего десятикратного разведения и двух первых двукратных разведений на стандартный питательный агар для гетеротрофных микроорганизмов и на агаризо-ванную минеральную среду с сырой нефтью. Такой способ разведений позволил выделить в чистой культуре оптимальное количество изолятов.

Оценку способности к росту на различных углеводородах производили как

описано в разделе 1.1. В качестве источника углерода и энергии использовали те же углеводороды, что и ранее. Также производили посевы выделенной микрофлоры на минеральную среду с хлороформенным экстрактом соответствующего объекта (нефтешламы). Так как чистая почва не содержала нефтепродукты, микроорганизмы, выделенные из нее, культивировали на среде с российской нефтью, взятой в качестве модельного поллютанта.

В данном варианте проводили выделение всех видимых колоний, таким образом, соотношение изолятов с различными спектрами потребляемых углеводородов отражает долю (содержание) микроорганизмов с соответствующими спектрами потребляемых углеводородов среди выделяемой микрофлоры. Из 40 штаммов, выделенных из нефтешламов не подвергнутых микробиологической очистке, только один рос на нафтиде нефтешлама и был способен к утилизации углеводородов, остальные не росли ни на соответствующем нафтиде нефтешлама, ни на углеводородах. Данные по соотношению изолятов, отличающихся по способности к росту на углеводородах и поллютанте (нефть и нафтид нефтешлама), для микроорганизмов, выделенных из почвы и нефтешлама на завершающей стадии очистки, приведены в таблице 4.

Таблица 4 - Соотношение изолятов, различающихся по способности к росту на

углеводородах и поллютанте (нафтид нефтешлама и нефть для чистой почвы)

Объект Доля изолятов с различными трофическими возможностями, %

не растут ни на углеводородах, ни на поллютанте растут на углеводородах, но не на поллютанте растут на поллютанте, но не на углеводородах растут и на поллютанте и на углеводородах

Почва 38,7 0,0 17,0

Нефтешлам на завершающей стадии очистки 24,1 27,8 4,6 43,5

Из анализа данных следует, что среди выделенной микрофлоры изоляты, окисляющие отдельные углеводороды, встречаются чаще, чем способные к росту на нефти или нафтиде нефтешлама.

Как и в предыдущих разделах, для микрофлоры, выделенной из почвы и нефтешлама в процессе очистки, провели сопоставление количества потребляемых углеводородов в зависимости от способности к росту на поллютанте. Распре-

деление показателя роста на нефти (нафтиде нефтешлама на завершающей стадии очистки) среди изолятов с различным количеством потребляемых углеводородов представлено на рисунке 2.

£ 30

Ни

Ск, rm.ru.__■

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Количество потребляемых углеводородов

Отсутствие роста на нафтиде

'' Наличие роста на нафтиде

50 . 45 J 40 # 35

4 30 | 25

5 20

15 10 5 0

4 5 8 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Количество потребляемых углеводородов

Р Отсутствие роста на нефти

■ Наличие роста на нефти

Рисунок 2 - Частота встречаемости изолятов, выделенных из почвы и нефтешлама на завершающей стадии очистки, в зависимости от количества потребляемых углеводородов и способности к росту на нефти (нафтиде нефтшлама) Примечание:

А - группа штаммов выделенных из нефтешлама на завершающей стадии очистки; Б - труппа штаммов выделенных из чистой почвы.

В обоих случаях была выявлена та же закономерность, что и ранее, данные приведены в таблице 5.

Таблица 5 - Статистические показатели, отражающие взаимосвязь количества потребляемых углеводородов и способность к росту на нефти (нафтиде нефтешлама)

Выборка штаммов г-статистика двухвы-борочного критерия Колмогорова-Смирнова Критерий хи-квадрат Коэффициент неопределенности

Чистая почва 3,69 (р<0,001) 90,46 (с1 / =14, /?<0,001) 0,86 (р<0,001)

Нефтешлам на завершающей стадии очистки 2,41 (р<0,001) 31,98 ^df = 15,= 0,006) 0,25 (р<0.001)

Высокое значение коэффициента неопределенности для почвы отражает возможность предсказать рост штамма на данной нефти с высокой точностью, основываясь на знании спектра потребляемых углеводородов. В случае нефтешлама на завершающей стадии детоксикации получено меньшее значение коэффициента неопределенности, вероятно, что используемый набор углеводородов недостаточно отражает состав нафтида, выделенного из данного нефтешлама. Тем не менее, и здесь наличие связи подтверждено с высоким уровнем точности.

Для оценки и сравнения разнообразия спектров потребляемых углеводородов у микрофлоры, выделенной из разных источников, было бы логичным использовать какой-либо интегральный показатель. Мы остановили свой выбор на коэффициенте Евклидова разнообразия (ЕОС), так как этот коэффициент слабо зависит от объема исследуемой выборки и позволяет учесть степень различий между объектами, которые характеризуются по множеству показателей. Были получены следующие значения: для почвы ЕВС=0,14 и для нефтешлама после очистки ЕОС=0,19 (полученные значения составляют примерно треть от максимально возможных при таких объемах выборок штаммов). ЕБС для нефтешламов не подвергнутых биологической очистке, соответственно, равняется 0,00 и 0,02. Эти данные позволяют утверждать, что по характеристике разнообразия трофических возможностей по отношению к углеводородам у гетеротрофной микрофлоры грунт, полученный на завершающем этапе биоремедиации, не отличался от чистой почвы и значительно превосходил нефтешламы до очистки.

1.3 Особенности распределения признаков биодеградации углеводородов в исследованных группах штаммов

Для выделения минимальной группы углеводородов, ориентируясь на которые можно было бы оценивать углеводородокисляющую направленность штамма, использовали процедуру многомерного шкалирования. Распределение показателей роста на различных углеводородах, для штаммов, выделенных из нефтешлама в процессе очистки, приведено на рисунке 3.

Во всех случаях почти все признаки были распределены хаотично, только признаки роста на ароматических углеводородах образовали отдельные плотные

группы. Это означало, что большинство штаммов имели по данным группам углеводородов похожие ответы. Во всех исследованных выборках признаки деградации ароматических углеводородов встречались редко: у 0-10% штаммов. Почти во всех случаях признаки роста на н-алканах С13-С18 были близко расположены по отношению друг к другу. Признак роста на этой группе углеводородов был распространен у большинства штаммов, способных расти хотя бы на одном углеводороде Н-алканы данного ряда наименее летучие и нетоксичные среди всех использованных углеводородов. .8

.6 .4 .2

см

с. 0.0 о <0

I., а -.4

-.8 -.6 -.4 -.2 (ХО .2 .4 .6 .в 1.0

01твгвюп 1

Рисунок 3 - Распределение показателей роста на различных углеводородах, полученное методом многомерного шкалирования для штаммов, выделенных из нефтешлама в процессе очистки

Примечание: Нафтид - остаточный нафтид нефтешлама, Ар УВ - ароматические углеводороды, С6-С,8 - н-алканы с соответствующим числом атомов углерода

Мы попытались выяснить, можно ли использовать показатели роста на этих углеводородах для предсказания роста штаммов на других углеводородах. Для выяснения такой возможности использовали коэффициент корреляции рангов Спирмана (связь между количеством утилизируемых н-алканов ряда С13-С18 и количеством других потребляемых углеводородов). Для трех из четырех исследуемых выборок получены средние значения коэффициентов корреляции, с высоким уровнем значимости (Я более 0,40, р<0,001). Отсутствие роста на данных углеводородах позволяет исключить на ранних этапах отбора штаммы с заведомо малым спектром потребляемых углеводородов, а рост на н-алканах ряда тридекан - окта-декан ожидать наличие роста и на других углеводородах.

Нафтид

СЮ

С12

С7

се се се

со с

АрУВ \

2 Оценка потенциальных штаммов-иитроду центов по комплексу биотехйологически важных признаков

Из всех родов гетеротрофных микроорганизмов немногие сочетают редкую встречаемость патогенных видов и способность деградировать широкий спектр поллютантов. Нокардиоформные актинобактерии относятся именно к таким. Многие представители рода Ююс1ососст обладают деструктивной, эмульгирующей и сорбирующей активностью в отношении углеводородов, причем сочетаемой в одном штамме. Поэтому в дальнейших исследованиях мы остановились именно на группе нокардиоформных актинобактерий.

2.1 Исследование коллекции штаммов нефтеокисляющих актинобактерий по способности к росту на нефтепродуктах

В дальнейшей работе мы ориентировались на способность штамма использовать как можно больший круг углеводородов, неуглеводородных компонентов нефтепродуктов и нефтешламов в качестве единственного источника углерода и энергии. Объектом исследований послужила коллекция нефтеокисляющих бактерий кафедры генетики и микробиологии КубГУ. Были отобраны 44 штамма угле-водородокисляющих актинобактерий. Штаммы периодически пересевали на среде с нефтью не менее пяти лет, что отличает эти штаммы от свежевыделенных. Несколько штаммов депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ЯИоЛососсш егу&ороПз В2 - ВКМ Ас-2017, Сог<1ота ¿р. - ВКМ Ас-2271). Некоторые штаммы являются типовыми на кафедре генетики и микробиологии Куб-ГУ (штамм Шюс1ососсш егуй-ороШ В2 - ВКМ Ас-2017) и успешно применяются сотрудниками кафедры в работах по биоремедиации. Штаммы данной коллекции охарарктеризованы по способности к росту на сырой нефти, но спектр потребляемых углеводородов для них не был известен.

Изучали способность к росту на плотной минеральной среде с разными источниками углерода: н-алканы ряда С6 - С[8, твердый технический парафин, ароматические субстраты: бензол и его производные (толуол, о-, м-, п-ксилолы, этил-бензол, бутилбензол, псевдокумол, кумол, мезитилен). Также исследовали рост бактерий на нафталине, 1-метилнафталине, флюорене, фенантрене, антрацене и

бифениле. Кроме углеводородов, исследовали способность к росту на нафтидах нефтешламов (14 образцов), 7-ми образцах асфальтенов и 6-ти образцах смол.

Для сравнения распределения показателей роста на н-алканах и ароматических углеводородах приведен рисунок 4.

¡1ГГГ _ юг -1 т

п я

О 1 2 3 4 5 « 7 в 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1«

Кашркспо утмтплруеыш утдаяодородов

Рисунок 4 - Распределение частот встречаемости штаммов актинобактерий с различным спектром потребляемых углеводородов

Очевидно, что доля штаммов, способных к утилизации большей части исследуемых углеводородов, значительно выше, чем в выборках свежевыделенной микрофлоры, описанной ранее. Особенно важно, что в исследуемой выборке штаммов актинобактерий присутствуют изоляты с большим спектром потребляемых углеводородов, не обнаруженным среди свежевыделенной микрофлоры, а некоторые обладали довольно узким спектром потребляемых углеводородов. Полученные данные по способности к росту на всех исследованных субстратах использовали в дальнейшем для отбора штаммов, обладающих оптимальным набором трофических возможностей по отношению к углеводородам и нефтепродуктам.

2.3 Устойчивость актинобактерий к присутствию солей тяжелых металлов в питательной среде

Зачастую загрязнение углеводородами сопровождается соконтаминацией солями тяжелых металлов Поэтому необходим контроль чувствительности к данным металлам у предполагаемых штаммов-интродуцентов.

Для солей Мп, Мо все без исключения коллекционные штаммы показали рост при концентрации ионов соответствующего металла более 500 мг/л Наименьшая устойчивость выявлена для соли ртути (1-5 мг/л). Наибольший диапазон

устойчивости был отмечен Для соли N5 (от 100 до 1000 мг/л). По степени чувствительности к исследованным металлам составили ряд чувствительности: Н£>Си=2п>Со>Сй>№>Ре=Мп=)У=Мо.

Ориентируясь на полученный ряд, выбрали те металлы, к которым были наиболее чувствительны исследуемые штаммы, следовательно, концентрацию этих металлов необходимо контролировать в объекте, куда предполагается интродуци-ровать штамм. Такие металлы - Си, Тп, Со, С&

2.4 Отбор и оценка потенциальных штаммов-интродуцентов из коллекции нефтеокисляющих актинобактерий

На основе полученных данных была выделена группа из 17 штаммов, наиболее перспективных для дальнейших исследований и внедрения. Они характеризуются оптимальным сочетанием биотехнологически важных признаков: максимальными спектрами деградируемых углеводородов, способностью утилизировать нафтиды различных нефтешламов и их неуглеводородные компоненты. Обладают устойчивостью к солям тяжелых металлов. В дальнейших исследованиях мы остановились на штаммах К1юс1ососсж егуЪгороИь В2, Р1 и штаммах актинобактерий К2, ТА, Л0.

2.5 Оценка деградации мазута и его компонентов штаммами нефтеокисляющих актинобактерий В2, И, К2, ТА, Л0

Любая технология биоремедиации нефтезагрязненных почв и почвогрунтов должна выполнять условие полной деградации всех токсичных и потенциально токсичных компонентов нефтепродукта. Известно, что нефть и нефтепродукты состоят из большого количества веществ, значительно различающихся по своей физико-химической природе и соответственно токсичности. Неуглеводородные компоненты нефти содержатся в высоких концентрациях (десятки %) в нефтешламах, мазутах, гудронах, маслах и тяжелой нефти, добыча которой постоянно растет.

Мазут похож по битуминологическому составу на нефтешламы и характеризуется отсутствием легких фракций. Отобранные культуры испытали на способность к деградации всех компонентов мазута марки М-40. Мазут исследовали

двумя способами: битуминологический анализ для характеристики неуглеводородных компонентов, фракцию масел исследовали хроматографически. Параметры деградации мазута исследуемыми штаммами приведены в таблице 6. Таблица 6 — Показатели деградации мазута (массовые %) и его компонентов исследуемыми штаммами актинобактерий

Штамм Мазут М-40 Асфальтены Спиртобен-зольные смолы Бензольные смолы Фракция масел

В2 35,7 9,7 11,9 64,4 31,1

П 36,2 12,7 23,5 48,8 33,8

ЛО 28,1 15,3 22,9 40,3 24,6

К2 32,5 11,2 10,6 62,8 27,2

гл 25,7 11,1 17,3 53,1 19,4

Продукт деградации масляной фракции остаточного мазута анализировали хроматографически, для штамма ЮюАососсиъ егуПороИз В2 результат приведен на рисунке 5.

Рисунок 5 - Хроматограмма масляной фракции мазута до биодеградации штаммом ЮюсЬсоссш егу^ороШ В2 (А) и после (Б)

Из результатов хроматографического анализа следует, что остаточный мазут не содержит углеводородов исходного мазута. Для проверки биодеградабельности остаточной масляной фракции мазута провели эксперимент по культивированию пяти исследуемых штаммов на этой фракции. Активный рост показывает принципиальную возможность дальнейшей деградации данной фракции.

2.6 Контроль диссоциации штаммов актинобактерий по технологически важным признакам

Для определения маркерных признаков у штаммов исследуемой коллекции проводили исследование признака антибиотикочувствительности методом дисков (7 антибиотиков). В ходе исследования было обнаружено появление отдельных колоний в зоне подавления роста у 19 из 44 штаммов актинобактерий.

Для подробного изучения свойств диссоциатов взяли четыре культуры: штаммы ШюАососсш егуЛгороНз В2 и Ююс1ососсих егуЛгороШ Р1, штаммы актинобактерий Г2, К2 - диссоциаты по стрептомицину. Штаммы В2, ¥2, Р1 давали два типа колоний диссоциатов: крупные - 3 мм и мелкие - < 1 мм. При рассеве истощающим штрихом было обнаружено, что для всех трех штаммов варианты с крупными колониями сохранили исходный М-тип колоний. Диссоциаты с мелкими колониями обладали Л-типом колоний. В течение пяти пересевов Л-варианты штаммов В2 и сохранили Л-тип колонии. Я-диссоциат штамма Б2 ревертировал к исходному М-типу уже после второго пересева.

После получения чистых культур штаммов-диссоциатов провели исследование их свойств по сравнению со свойствами исходных культур. Изучали способность к росту на плотной минеральной среде с гексадеканом, углеводами, признак антибиотикочувствительности методом дисков и в жидкой минеральной среде исследовали способность к деградации мазута (табл. 7).

Таблица 7 - Свойства исходных штаммов и штаммов-диссоциатов

Штамм Зона задержки роста, мм (Б^) Мазут М40 Гекса-декан Цитрат Сорбит Маннит

В2 Исходный штамм М-тип 20 + + - + +

Диссоциат Бй-*, Я-тип 0 - - - + +

Диссоциат М-тип 0 + + - + +

Р1 Исходный штамм Эгг', М-тип 17 + + - + +

Диссоциат 8й-\ й-тип 0 + - - + +

Диссоциат 81г+, М-тип 0 + + - + +

К2 Исходный штамм вй-", Я-тип 23 + + - + +

Диссоциат 81г+, Б-тип 0 - - + - -

В данной работе не ставилась задача исследования механизмов влияния диссоциации на признаки биодеградации, тем не менее, очевидна необходимость контроля данного явления у промышленных штаммов нефтеокисляющих актинобактерий.

ВЫВОДЫ

1. На основании закономерностей распределения признаков биодеградации углеводородов среди 409 штаммов бактерий, выделенных из чистой и загрязненной нефтью почвы, а также бактерий, выделенных из нефтешламов с разным характером загрязнения, установлено, что содержание микроорганизмов, окисляющих отдельные углеводороды нефти выше, чем окисляющих сырую нефть.

2. Характер распределения микроорганизмов с разными спектрами потребляемых углеводородов не отличается у чистых почв, загрязненного чернозема при умеренной степени загрязнения и нефтешлама после биологической очистки.

3. Признаки деградации ароматических углеводородов среди гетеротрофной микрофлоры встречаются реже (0-10% штаммов), чем способность к росту на н-алканах и нефтепродуктах-поллютантах (10-40% штаммов).

4 Установлена применимость понятия количества потребляемых углеводородов для прогнозирования роста штамма на нефтепродукте-поллютанте. Н-алканы ряда Сп-С,8 предложены для оценки углеводородокисляющей направленности штамма в качестве минимальной набора, удобного для лабораторного использования.

5 Из 44 коллекционных штаммов нефтеокисляющих актинобактерий отобраны пять, перспективных для'промышленного применения Данные штаммы обладают широким спектром деградации углеводородов, способны к росту на неуглеводородных компонентах мазута, обладают устойчивостью к солям тяжелых металлов. 6. На средах с ингибиторами отмечена диссоциация трех из пяти отобранных к>льтур актинобактерий по технологически важным признаками Способ определения диссоциации может быть использован для контроля данного явления в случае промышленного применения штаммов Ккойососсш егу1горо1и В2 - ВКМ Ас-2017, Согйота ¡р Н - ВКМ Ас-2271, а также для определения условий культивирования, предотвращающих диссоциацию.

Список работ, опубликованных по теме диссертационной работы

1 Худокормов А.А Некоторые физиологические особенности углеводородокисляющих микроорганизмов / A.A. Худокормов, Д.А. Мельников // Экол. проблемы биодеградации промышленных строительных материалов и отходов производств: материалы III Всероссийской науч.-практ. конф. / Изд-во Приволжский Дом знаний. - Пенза, 2000. - С 37-39. 2. Гирич И.Е. Отбор штаммов микроорганизмов, способных к утилизации тяжелых фракций углеводородов / И.Е. Гирич, Т.Ю. Нечитайло, A.A. Худокормов, Д.А Мельников // Экология 2000 Эстафета поколений: тезисы докладов I международной межвузовской школы - семинара по экологии / Изд-во МГУЛ. - М., 2000. - С. 12-13.

3 Худокормов А А. Отбор штаммов микроорганизмов - деструкторов мазута / Худокормов А А , Гирич И Е , Мельников Д А. // Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий / материалы XIII межреспубликанской науч.-практ. конф. / КубГУ. - Краснодар, 2000. - С. 203-204.

4 Худокормов А А Способность актинобактерий к окислению различных углеводородов и их физиологические особенности /Худокормов А.А , Мельников Д.А. // Вестник студенческого научного общества КубГУ / КубГУ. - Краснодар, 2001. - С. 75-81.

5. Гирич И.Е Поиск штаммов микроорганизмов - активных деструкторов нефтепродуктов / Гирич И F,., Карасев С Г , Мельников Д А. // Современные проблемы биологических повреждений материалов (Биоповреждения - 2002). - Пенза, 2002 - С 3-5.

6 Карасёва Э В Экспериментально-практический опыт ликвидации нефтешламов и нефтяных загрязнений / Карасёва Э В., Гирич И.Е , Карасёв С Г., Мельников Д А, Худокормов А.А // Биотехнология состояние и перспективы развития- материалы II Московского международного конгресса / ЗАО "ПИК "Максима". - М., 2003. - С. 21.

7 Мельников Д A The correlation between oil degrading activity and colony morphotypes in some strains of nocardioform actinobacteria / Мельников Д.А., Махлаева О С , Карасева Э В // материалы Первого Европейского конгресса микробиологов / Из-во Elsever - Словения, 2003 - С. 340

8 Мельников Д.А Спектры потребляемых углеводородов у гетеротрофных бактерий, выделенных на различных средах из чернозема, загрязненного тенгизской нефтью [Электронный ресурс] / Мельников Д А., Гирич И.Е., Карасева Э В // Научный журнал КубГАУ. - Краснодар. Куб-ГАУ, 2005. - №02(10). - Режим доступа:Ь«р:/АИ.kubagro.ru/2005/02/02/n02 asp

9 Мельников Д А Распределение признаков деградации углеводородов среди гетеротрофной микрофлоры, выделенной из почвы и нефтешламов [Электронный ресурс] / Мельников Д А , Карасева Э.В // Науч. журн. КубГАУ. - Краснодар: КубГАУ, 2005. - №02(10). - Режим доступа http //ei.kubagro ru/2005/02/01/p01.asp

í I

I i

Отпечат. ООО "Фирма Тамзи" тираж 100 экз., заказ № 1179, ФА5 г. Краснодар, ул. Пашковская, 79 тел.: 255-73-16

I *

»23202

РНБ Русский фонд

2006-4 24990

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мельников, Дмитрий Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ. ф

ГЛАВА 1 ТИПЫ НЕФТЯНЫХ ПОЛЛЮТАНТОВ, БИОДЕГРАДАЦИЯ

НЕФТЕПРОДУКТОВ НЕФТЕОКИСЛЯЮЩИМИ БАКТЕРИЯМИ.

1.1 Типы углеводородных поллютантов.

1.2 Физико-химические свойства нефти и нефтепродуктов.

1.3 Биодеградация нефтепродуктов микроорганизмами.

1.4 Биотехно логически важные свойства нефтеокисляющих микроорганизмов.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Объекты исследования.

2.2 Питательные среды, используемые для культивирования микроорганизмов.

2.3 Определение способности микроорганизмов к окислению мазута в жидкой минеральной среде.

2.4 Определение способности микроорганизмов к росту на углеводородах.

2.5 Выделение бактерий методом кратных разведений.

2.6 Определение чувствительности штаммов актинобактерий к солям металлов.

Ф 2.7 Выделение диссоциатов актино б актерий по признаку Ф антибиотикочувствительности.

2.8 Определение количества нефтепродуктов в культуральной жидкости весовым методом.

2.9 Определение концентрации нефтепродуктов в почве и нефтешламах.

2.10 Битуминологический анализ нефтепродуктов.

2.11 Хроматографический анализ масляной фракции нефтепродуктов и сырой нефти.

2.12 Математическая обработка результатов.

ГЛАВА 3 ОЦЕНКА СПОСОБНОСТИ К РОСТУ НА УГЛЕВОДОРОДАХ У МИКРОФЛОРЫ, ВЫДЕЛЕННОЙ ИЗ МЕСТООБИТАНИЙ С РАЗНЫМ

СОСТАВОМ УГЛЕВОДОРОДНОГО ПОЛЛЮТАНТА.

3.1 Оценка способности к росту на углеводородах у микрофлоры, выделенной на различных средах из загрязненной и чистой почвы.

3.1 Л Способность к росту на углеводородах у микрофлоры, выделенной из почвы, загрязненной тенгизской нефтью.

3.1.2 Характеристика способности к росту на углеводородах у микрофлоры, выделенной из почв, загрязненной и не загрязненной российской нефтью.

3.2 Выделение гетеротрофной и нефтеокисляющей микрофлоры из нефтешламов и чистой почвы и исследование ее способности к росту на углеводородах.

3.3 Особенности распределения признаков биодеградации углеводородов в исследованных группах штаммов микроорганизмов.

ГЛАВА 4 ОЦЕНКА ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ШТАММОВ-ИНТРОДУЦЕНТОВ ПО ТЕХНОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ

4.1 Битуминологическая характеристика нефтепродуктов, исследуемых в работе.

4.2 Исследование коллекции штаммов нефтеокисляющих актинобактерий по способности к росту на нефтепродуктах.

4.3 Исследование влияния элементарной серы и сульфида на рост штаммов актинобактерий.

4.4 Оценка роста актинобактерий в присутствии солей тяжелых металлов в питательной среде.

4.5 Проявление R-, S-, М-типа колоний у штаммов исследуемой коллекции актинобактерий.

4.6 Оценка потенциальных штаммов-интродуцентов из коллекции нефтеокисляющих актинобактерий.

4.6.1 Деградация мазута и его компонентов штаммами нефтеокисляющих актинобактерий В2, Fl, К2, Z4, J10.

4.6.2 Контроль диссоциации штаммов нефтеокисляющих актинобактерий 94 ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Распределение признаков биодеградации углеводородов и оценка технологически важных свойств нефтеокисляющих бактерий"

На сегодняшний день все острее возникает проблема углеводородных загрязнений почвы и детоксшсации нефтешламов. Нафтид нефтепшамов длительных сроков хранения отличается от большинства углеводородных поллютантов несколькими особенностями: высоким содержанием неуглеводородных компонентов (смол и асфальтенов), низким содержанием легких углеводородов, это придает поллютанту высокую температуру плавления (30-60 °С) и вязкость (Требин Г.Ф. и др., 1980). Высшие компоненты фракции смол недостаточно исследованы на предмет токсичности. Содержание данных веществ в объектах окружающей среды практически никак не регламентируется. Поэтому деградация всех компонентов нефтешламов является особенно актуальной задачей, и позволит гарантированно детоксицировать объект очистки. Важным обстоятельством является высокое варьирование состава нафтида нефтешламов. Все это затрудняет выбор и применение практически всех известных технологических приемов, используемых в очистке нефтешламов.

Для безопасного решения задачи детоксикации нефтяных загрязнений используются следующие подходы: интродукция нефтеокисляющих микроорганизмов в загрязненный объект и оптимизация жизнедеятельности аборигенной углеводородокисляюгцей микрофлоры объекта очистки (Бельков В.В., 1995; Сидоров Д.Г. и др., 1997). При реализации этих подходов или их сочетании возникают определенные проблемы.

В биотехнологии очистки объектов, загрязненных углеводородными пол-лютантами, применяются нефтеокисляюгцие бактерии разных систематических групп. Широко используются углеводородокисляюгцие актинобактерии. Это объясняется рядом причин: данная систематическая группа бактерий способна к биодеградации широкого спектра углеводородов, обладает устойчивостью к засолению среды обитания, способна переносить действие света и высушивания, отличается высоким сродством к липофильным субстратам и почти отсутствием патогенных дня человека и животных видов, в отличие, от ряда грамот-рицательных родов микроорганизмов, грамположительных бацилл и грибов

Kulakova Arma N, и др., 1996; Whyte Lyle G. и др., 1998; Irvine Valerie А. и др., 2000). В то же время на данный момент недостаточно изучена способность ак-тинобактерий разрушать тяжелые неуглеводородные компоненты нефтепродуктов, ничего неизвестно о распространенности данных признаков среди штаммов нефтеокисляющих актинобактерий и их взаимосвязи с признаками деградации углеводородов. Кроме того, из-за высоковязкого или твердого состояния смолисто-асфальтеновых фракций недостаточно разработаны методики конструирования и приготовления минимальных плотных и жидких сред с данной группой веществ в качестве единственного источника углерода и энергии.

Для штаммов, деградирующих монокомпонентные загрязнения (фенол, пестициды, компоненты ракетного топлива и др.), существует универсальный критерий отбора - способность к полной минерализации поллютанта. Так как нефтепродукты содержат сотни веществ и их состав различается от образца к образцу, возникает вопрос, по каким критериям отбирать и сравнивать нефтео-кислягощие штаммы? Для оценки и отбора культур-интродуцентов необходимо учитывать признаки, связанные со способностью деградировать нефтепродукты, есть необходимость сравнивать потенциал штаммов, причем в контексте конкретного поллютанта и на ранних этапах отбора культур потенциальных ин-тр оду центов. На данный момент неизвестны универсальные критерии отбора углеводородокисляющих микроорганизмов, активных по отношению к широкому кругу нефтяных поллютантов.

1) оценить разнообразие спектров потребления углеводородов у микрофлоры, выделяемой из местообитаний с разным характером нефтяных загрязнений;

2) исследовать у нефтеокисляющих штаммов актинобактерий чувствительность к тяжелым металлам, элементарной сере и сульфиду;

3) отобрать штаммы компетентные в отношении конкретных нефтепродуктов, а также их отдельных компонентов с учетом чувствительности к тяжелым металлам;

4) исследовать возможность и степень деградации компонентов мазута отобранными штаммами нефтеокисляющих актинобактерий;

5) исследовать влияние явления диссоциации на технологически важные признаки у потенциальных штаммов интродуцентов.

Научная новизна. На основе исследования микробных популяций, впервые проводится оценка и сопоставление способности к росту на различных углеводородах гетеротрофной микрофлоры чистого и загрязненного нефтью чернозема и нефтешламов с разным характером загрязнения. Предлагается оригинальная система сравнения и оценки штаммов нефтеокисляющих актинобактерий. Предлагается способ выделения диссоциатов актинобактерий по признаку антибиотикорезистентности. В ходе исследований предложен и апробирован способ создания плотных и жидких питательных сред с твердыми нефтешла-мами, битумами и неуглеводородными компонентами нефтепродуктов - смолами и асфальтенами.

Практическая ценность работы. Большая часть современных методов выделения нефтеокисляющих микроорганизмов основывается на получении накопительных культур на различных углеводород окисляющих субстратах, таких как нефть, жидкие нефтешламы, дизельное топливо, индивидуальные углеводороды и их композиции. Результатом данной работы является разработка способа отбора лабораторных штаммов нефтеокисляющих актинобактерий, основанного на общих закономерностях распределения признаков деградации отдельных углеводородов у почвенной микрофлоры и микрофлоры нефтешламов. Проводится скрининг коллекции штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов по комплексу признаков деградации углеводородов, отдельных компонентов нефтепродуктов и нефтешламов. Произведена количественная оценка параметров биодеградации модельного поллютанта у отобранных штаммов, которые рекомендованы к дальнейшему изучению и созданию на их основе бактерийных препаратов для детоксикации нефтешламов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Содержание микроорганизмов, окисляющих отдельные углеводороды нефти выше, чем окисляющих сырую нефть, среди выделяемой гетеротрофной микрофлоры.

2. Характер распределения микроорганизмов с разными спектрами потребляемых углеводородов не отличается у чистых почв, загрязненного нефтью чернозема и нефтешлама, подвергнутого микробиологической очистке.

3. Обоснован способ прогнозирования роста штамма на нефтепродукте-поллютанте на основании спектра потребляемых им углеводородов

5. Для исследуемой коллекции штаммов нефтеокисляющих актинобакте-рий установлена повышенная чувствительность к элементарной сере (1 г/л гек-садекана) при росте на углеводородах.

6. Предложен способ контроля процесса диссоциации штаммов нефтеокисляющих актинобактерий по технологически важным признакам.

Апробация работы и публикации.

Результаты исследований, изложенные в данной работе, апробированы на следующих конференциях: "Экология 2000: Эстафета поколений. I международная межвузовская школа", "Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий, 2000", "Современные проблемы биологических повреждений материалов (Биоповреждения - 2002)", "1th FEMS congress of European microbiologists, 2003". Всего опубликовано девять работ, одна в печати.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Мельников, Дмитрий Александрович

выводы

2. Характер распределения микроорганизмов с разными спектрами потребляемых углеводородов не отличается у чистых почв, загрязненного чернозема при умеренной степени загрязнения, и нефтешлама после биологической очистки.

4. Установлена применимость понятия количества потребляемых углеводородов для прогнозирования роста штамма на нефтепродукте-поллютанте. Н-алканы ряда С13-С18 предложены для оценки углеводородокисляющей направленности штамма в качестве минимальной набора, удобного для лабораторного использования.

5. Из 44 коллекционных штаммов нефтеокисляющих актинобактерий отобраны пять, перспективных для промышленного применения. Данные штаммы обладают широким спектром деградации углеводородов, способны к росту на неуглеводородных компонентах мазута, обладают устойчивостью к солям тяжелых металлов.

6. Для исследуемой коллекции штаммов нефтеокисляющих актинобактерий установлена повышенная чувствительность к элементарной сере (1 г/л гексадека-на) при росте на углеводородах.

7. На средах с ингибиторами отмечена диссоциация трех из пяти отобранных культур актинобактерий по технологически важным признаками. Способ определения диссоциации может быть использован для контроля данного явления в случае промышленного применения штаммов Rhodococcus erytropolis В2

ВКМ Ас-2017, Gordonia sp. F1 - BKM Ac-2271, а таюке для определения условий культивирования, предотвращающих диссоциацию.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мельников, Дмитрий Александрович, Краснодар

1. Аристархова, В.И. Электронно-микроскопическое изучение Nocardia rubra, выращиваемой на среде с фенолом / В.И. Аристархова // Микробиология. -1976.- Т. XLV. №2. -С. 324-328.

2. Балашова, Н.В. Штамм BS3 701 деструктор фенантрена и нафталина / Н.В. Балашова, И.А. Кошелева, А.Е. Филонов и др.. // Микробиология. - 1997. -№4.-Т. 66.-С. 488-493.

3. Барышникова, Jl. М. Миксотрофный рост Rhodococcus minimus в периодической культуре / Л.М. Барышникова, Н.В. Ерошина, Я.М. Мясоедова и др.. // Микробиология. 1985. - том 54. - Вып. 2. - С. 284-289.

4. Беляев, С.С. Активация современной геохимической деятельности пластовой микрофлоры как основа биогеотехнологии повышения нефтеизвлечения / С.С. Беляев, И.А. Борзенков, И.Ф. Глумов и др.. // Микробиология. -1998.-том 67.-№ 6.-С. 851-858.

5. Бердичевская, М. В. Особенности физиологии родококков разрабатываемых нефтяных залежей / М.В. Бердичевская // Микробиология. 1989. - Т. 58. -Вып. 1.-С. 60-65.

6. Боровиков, В. STATISTICA: искусство анализа данных на компьютере. Для профессионалов. / В. Боровиков СПб.: Питер, 2001. - 656 с.

7. Бошвинко, Л. В. Синтез экзополисахаридов и протеолитических ферментов М-, S— и R-формами Mycobacterium lacticolum / Л. В. Бошвинко, И.С. Егоров, Н.С. Ландау и др..// Микробиология. 1979. - Т. XLVIII. - Вып. 8. - С. 439-442.

8. Велысов, В.В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы / В.В. Вельков // Биотехнология. 1995. - №3-4. - С. 20-27.

9. Глазачева, Л.Е. Клеточные приспособления Rhodococcus rodochrous и Rhodococcus ruber, усваивающих пропан и н-бутан / Л.Е. Глазачева, И.Б. Ившина, А.А. Оборин // Микробиология. 1990. - №2. - Т. 59. - С. 301-306.

10. Ю.Гоголева, Е.В. Внеклеточные полисахариды, синтезируемые Mycobacterium lacticolum на средах с н-додеканом, н-тетрадеканом и н-гексадеканом / Е.В.101

11. Гоголева, Н.И. Гречушкина, Я.С. Егоров // Микробиология. 1973. - Т. XLII. - Вып. 5. - С. 806-808.

12. П.Головлев, E.JI. Катаболизм ароматических соединений у родококков группы erythropolis / E.JI. Головлев, Н.В. Ерошина // Микробиология. 1982. - Т. 51. -Вып. З.-С. 407-412.

13. Головлева, JI.A. Микробная детоксикация сточных вод коксохимического производства / JI.A. Головлева, З.И. Финкельштейн, Б.П. Баскунов и др.. // Микробиология. 1995. - Т. 64. - №2. - С. 197-200.

14. Головченко, А. В. Влияние нефти на численность, биомассу и жизнеспособность грибов в верховых торфяниках / А.В. Головченко, JI.M. Полянская // Микробиология. 2001. - Т.70. - №1. - С. 111-117.

15. Готтшалк, Г. Метаболизм бактерий / Г. Готтшалк М.: 1982. - 310 с.

16. Гречушкина, Н.Н. Некоторые физиологические особенности Mycobacterium lacticolum 121 при росте в среде с н-додеканом / Н.Н. Гречушкина, С.В. Денисова // Микробиология. 1970. - Т. XXXIX. - №6. - С. 956-969.

17. Гузев, B.C. Влияние масляной кислоты на физиологическую активность уг-леводородокисляющих родококков / B.C. Гузев, М.И. Волде, И.С. Куличев-ская, Л.В. Лысак // Микробиология. 2001. - Т.70. - №3. - С. 313-320.

18. Гузев, B.C. Регуляторное действие глюкозы на активность углеводородокис-ляющих микроорганизмов в почве / B.C. Гузев, Э.М. Халимов, М.И. Волде, И.С. Куличевская // Микробиология. 1997. - Т. 66. - № 2. - С. 154-159.

19. Гузев, B.C. Роль почвенной микробиоты в рекультивации нефтезагрязнен-ных почв. Микробиология и охрана почв. / B.C. Гузев и др.. М.: - 1989. -С.129-149.

20. Дуган, И.Н. Индукция пирокатехин-диоксигеназ у Rhodococcus corallinus / И.Н. Дуган, Е.Л. Головлёв // Микробиология. 1983. - Т. 52. - В. 5. - С.729-734.

21. Дуган, И.Н. Ключевые ферменты катаболизма ароматических соединений Rhodococcus / И.Н. Дуган, Е.Л. Головлев // Микробиология. 1982. - Т. 51. -Вып. 2.-С. 181-186.

22. Дуган, И.Н. Пути катаболизма ароматических субстратов у родококков / И.Н. Дуган, E.JI. Головлев // Микробиология. 1985. - Т. 54. - Вып. 1. - С. 128-134.

23. Дуган, И.Н., Индукция диоксигеназ ароматических субстратов у родококков при лимите питательных веществ / И.Н. Дуган, Е.Л. Головлёв // Микробиология. 1983а. - Т. 52. - В. 6. - С. 951-955.

24. Егоров, Н. С. Сравнение липидного состава R- S- и М-вариантов Rhodococcus rubropertinctus / Н.С. Егоров, Т.В. Коронелли, Е.С. Милько и др.. // Микробиология. 1986. - Т. 55. - Вып. 2. - С. 227-230.

25. Елисеева, И.И., Юзбашев М.М. Общая теория статистики / И.И. Елисеева, М.М. Юзбашев М.: "Финансы и статистика", 2004. - 656 с.

26. Ермоленко, З.М. Биологическая характеристика штамма микобактерий, выделенного из нефти ухтинского месторождения / З.М. Ермоленко, В.П. Хо-лоденко, В.А. Чугунов и др.. // Микробиология. 1997. - Т. 66. - № 5. - С. 650-654.

27. Звягинцева, И.С. Влияние солености среды на деструкцию нефтяных масел нокардиоподобными бактериями / И.С. Звягинцева, М.Н. Поглазова, М.Т. Готоева, С.С. Беляев // Микробиология. 2001. - Т. 70. - №6. - С. 759-764.

28. Звягинцева, И.С. Деградация нефтяных масел нокардиоподобными бактериями / И.С. Звягинцева, Э.Г. Суровцева, М.Н. Поглазова и др.. // Микробиология.-2001.-Т. 70. -№3. С. 321-328.

29. Ившина, И.Б. Методы консервации культур Rhodococcus spp. и их применение в практике поддержания специализированного фонда алканотрофных родококков / И.Б. Ившина, Т.Н. Каменских, М.С. Куюкина и др.. // Микробиология. 1994. - Т.63. - №1. - С. 118-127.

30. Ившина, И.Б. Селективное выделение пропанокисляющих родококков с использованием антибиотических веществ / И.Б. Ившина, М.С. Куюкина // Микробиология. 1997. - Т. 66. - № 4. - С. 494-500.

31. Ившина, И.Б. Фенотипическая характеристика алканотрофных родококков из различных экосистем / И.Б. Ившина, М.В. Бердичевская, JI.B. Зверева и др.. // Микробиология. 1995. - Т.64. -№4. - С. 507-513.103

32. Комарова, Т. И. Роль низкомолекулярных азотистых соединений в осмото-лерантности бактерий родов Rhodococcus и Arthrobacter / Т.И. Комарова, Т.В. Коронелли, Е.А. Тимохина // Микробиология. 2002. - Т. 71. - № 2. -С.166-170.

33. Комарова, Т.И. Влияние серы на рост углеводородокисляющих бактерий разных родов / Т.И. Комарова,,Е-С. Милько, Т.В. Коронелли // Микробиология. 2003. - Т. 72. - № 2. - С. 275-276.

34. Комарова, Т.И. Образование трегалозы клетками R- и S- вариантов Rhodococcus erythropolis / Т.И. Комарова, О.В. Поршнева, Т.В. Коронелли // Микробиология. 1998. - №3. - Т.67. - С. 428-431.

35. Компьютерная биометрика / под ред. В.Н. Носова. М.: Изд-во МГУ, 1990. -232 с.

36. Коронелли, Т.В. Видовая структура углеводородокисляющих бактериоцено-зов водных экосистем разных климатических зон / Т.В. Коронелли, С.Г. Дермичева, В.В. Ильинский и др.. // Микробиология. 1994. - Т.63. - №5. -С. 917-923.

37. Коронелли, Т.В. Выживаемость углеводородокисляющих бактерий в условиях полного голодания / Т.В. Коронелли, С.Г. Дермичева, Е.В. Коротаева // Микробиология. 1988. -Т.57. -№2. - С. 298-304.

38. Коронелли, Т.В. Изменение липидного состава клеток R- и S-вариантов Rhodococcus erythropolis при длительном хранении на лабораторной среде / Т.В. Коронелли, Т.И. Комарова, О.В. Поршнева, С.Г. Дермичева // Микробиология 1998. Т. 67. - №5. - С. 718-720.

39. Коронелли, Т.В. Интродукция бактерий рода Rhodococcus в тундровую почву, загрязненную нефтью / Т.В. Коронелли, Т.И. Комарова, В.В. Ильинскийи др.. // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. - Т.ЗЗ. - №2. - С. 198-201.

40. Коронелли, Т.В. Липиды R- и S-вариантов Rhodococcus erythropolis / Т.В. Коронелли, Т.И. Комарова, О.В. Поршнева // Микробиология. 1995. - Т. 64.-№6.-С. 769-771.

41. Коронелли, Т.В. Полярные липиды углеводородокисляющих бактерий / Т.В. Коронелли, Т.И. Комарова, С.Г. Юферова и др.. // Микробиология. 1993.- Т.62. №2. - С. 231-237.

42. Коронелли, Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде (обзор) / Т.В. Коронелли // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. - Т.32. - №6. - С. 579-585.

43. Коронелли, Т.В. Родококки как природный сорбент углеводородов / Т.В. Коронелли, С.Г. Дермичева, М.Н. Семененко // Микробиология. 1986. -Т.55.-№4.-С. 683-685.

44. Коронелли, Т.В. Углеводородокисляющая микрофлора акваторий Балтийского моря и Куршского залива, загрязненных при разливе мазута / Т.В. Коронелли, В.В. Ильинский, В.А. Янушка, Т.И. Красникова // Микробиология.- 1987. Т.56. -№3. - С. 472-477.

45. Коронелли, Т.В. Экологическая стратегия бактерий, использующих гидрофобный субстрат / Т.В. Коронелли, Е.Д. Нестерова // Микробиология. -1990. Т.59. - №6. - С. 993-997.

46. Кулик, Е.С. Окисление гексадекана в пористой системе с образованием жирных кислот / Е.С. Кулик, Ю.П. Сомов, E.JI. Розанова // Микробиология. -1985. Т. 54. - Вып. 3. - С. 381-385.

47. Куликова, А.К. Микроорганизмы, ассимилирующие газообразные углеводороды (С2-С4) (Обзор) / А.К. Куликова // Прикладная биохимия и микробиология. 1995. -Т.31. -№2. - С. 155-167.

48. Куликова, А.К. Эпоксидирование этилена нативными и иммобилизованными клетками пропанассимилирующей культуры Rhodococcus erythropolis 3/89 / А.К. Куликова, А.М. Безбородов // Прикладная биохимия и микробиология.- 1999. Т.35. - №6. - С. 611-615.

49. Куличевская, И.С. Популяционная динамика углеводородокисляющих дрожжей, интродуцированных в нефтезагрязненную почву /И.С. Куличев-ская, B.C. Гузев, Н.С. Паников // Микробиология. 1995. Т. 64. - № 5, С. 668 -673.

50. Максимов, В.Н. Влияние углеродного, азотного и фосфорного питания на рост R-, S— и М-диссоциантов Pseudomonas aeruginosa в смешанных культурах / В.Н. Максимов, Е.С. Милько, И.А. Ильиных // Микробиология. -1999. Т. - 68. - № 4. - С. 485-490.

51. Матыс, В.Ю. Адаптации к стрессовым условиям у представителей родов Rhodococcus и Gordona / В.Ю. Матыс, JI.M. Барышникова, E.JI. Головлев // Микробиология. 1998. Т. 67. - № 6. - С. 743-747.

52. Методы общей бактериологии в 3 Ч. Ч. 1 / Под общ. ред. Ф. Герхардта. пер. с англ. М.: Мир. - 1983. - 536с.

53. Микроорганизмы и охрана почв / под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1989.-206 с.

54. Милехина, Е.И. Эколого-физиологические особенности аэробных эубакте-рий из нефтяных месторождений Татарстана / Е.И. Милехина, И.А. Борзенков, И.С. Звягинцева и др.. // Микробиология. 1998. - Т.67. - №2. - С. 208-214.

55. Милько, Е.С. Влияние пониженных концентраций углерода, азота и фосфора в среде на динамику роста трёх диссоциантов Pseudomonas aeruginosa / Е.С. Милько, И.А. Ильиных // Микробиология. 2001. - Т.70. - №5. - С. 607-610.

56. Милько, Е.С. Образование биологически активных соединений S-, R- и М-формами Mycobacterium lacticolum на среде с н-гексадеканом / Е.С. Милько, Н.С. Егоров, Н.Н. Угарова и др.. // Микробиология. 1976. - Т. XLV. -Вып. 5-С. 808-810.

57. Миронова, Р.И. Биодеградация и биосорбция плавающей нефти природными микромицетами / Р.И. Миронова, В.П. Носкова, Г.Е. Расулова, В.П. Холо-денко // Биотехнология. 1996. - №7. - С. 44-48.

58. Муратова, А.Ю. Изучение микробного консорциума, осуществляющего деструкцию минерального масла / А.Ю. Муратова, О.В. Турковская // Прикладная биохимия и микробиология. 1994. - Т.30. - Вып.6. - С.623-627.

59. Назина, Т.Н. Физиологическое и филогенетическое разнообразие термофильных спорообразующих углеводородокисляющих бактерий из нефтяных пластов / Т.Н. Назина, Т.П. Турова, Т.П. Полтараус и др.. // Микробиология. 2000. - Т.69. - №1. - С. 113-119.

60. Нестеренко, О.А. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии / О.А. Нестеренко, Е.И. Квасников, Т.М. Ногина-Киев: "Наукова дкумка". 1985. - 336 с.

61. Никитина, Е.В. Особенности распределения и физиологического состояния микроорганизмов нефтешлама отхода нефтехимического производства / Е.В. Никитина, О.И. Якушева, С.А. Зарипов и др.. // Микробиология. -2003. - Т.72. -№5. - С. 699-706.

62. Обухова, Н.А. Некоторые физико-химические свойства ДНК умеренного фага и возможное влияние его на изменчивость Mycobacterium lacticolum / Н.А. Обухова, А.А. Колесников, Д.А. Маслов и др.. // Микробиология. -1985. Т. 54. - Вып. 4. - С. 641-645.

63. Определитель бактерий Берджи в 2 Ч. 1-2 Ч. / Под ред. Дж. Хоулта и др.. -9-е изд. М.: Мир, 1997. - 780, с.

64. Петрикевич, С.Б. Оценка углеводородокисляющей активности микроорганизмов / С.Б. Петрикевич, Е.Н. Кобзев, А.Н. Шкидченко // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т. 39. - № 1. - С. 25-30.

65. Плакунов В.К. Взаимосвязь кинетики роста и дыхания у родококков в присутствии высоких концентраций солей / Плакунов В.К., В.Г. Арзуманян, Н.А. Воронина, С.С. Беляев // Микробиология. 1999. - Т. 68. - № 1. - С. 40^44.

66. Плотникова, Е.Г. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов, выделенные из почв и донных отложений района солеразработок / Е.Г. Плотникова, О.В. Алтынцева, И.А. Кошелева и др.. // Микробиология,-2001. Т.70. -№1. - С. 61-69.

67. Позмогова, И.Н. Некоторые физиологические особенности термотолерантных и термофильных микроорганизмов, развивающихся на средах с ясидким парафином / И.Н. Позмогова, С.Д. Таптыкова, Г.Г. Сотников // Микробиология. 1972. - Т. XLI. - №2. - О. 299-305.

68. Полянская, J1.M. Микронавески ризосферной почвы и лабораторные артефакты / JI.M. Полянская, М.Х. Оразова, О.А. Бурканова, Д.Г. Звягинцев // Микробиология. 2000. - Т. 69. - № 4. - С. 581-585.

69. Пунтус, И.Ф. Выделение и характеристика микроорганизмов деструкторов полициклических ароматических углеводородов / И.Ф. Пунтус, А.Е. Филонов, И.А. Кошелева и др.. // Микробиология. 1997. - Т. 66. - №5. - С. 269-272.

70. Руководство по газовой хроматографии / К. Метунер, Х.Г. Штруппе, В. Лейпниц и др.. -М.: Мир. 1988. -480 с.

71. Рустемов, С.А. Новый путь окисления стирола культурой Pseudomonas putida / С.А. Рустемов, JT.A. Головлева, P.M. Алиева, Б.П. Баскунов // Микробиология. 1992. - Т. 61.-Вып. 1.-С. 5-10.

72. Сборник методик и инструктивных материалов по определению вредных веществ для контроля источников загрязнения окружающей среды. Ч. 5. -Краснодар. -1996.

73. Селифонов, С.А. Катаболизм аценафтена штаммами Alcaligenes eutrophus и Alcaligenesparadadoxus / С.А. Селифонов, А.В. Слепенькин, В.М. Аданин, и др.. // Микробиология. 1993. - Т. 62. - Вып. 1. - С. 120-128.

74. Селифонов, С.А. Окисление дибензофурана штаммами Pseudomonas несущими плазмиды биодеградации нафталина / С.А. Селифонов, А.В. Слепенькин, В.М. Аданин и др.. // Микробиология. 1991. - Т. 60. - Вып. 6. - С. 67-71.

75. Сергиенко, С.Р. Высокомолекулярные неуглеводородные соединения нефти. Смолы и асфальтены / С.Р. Сергиенко, Б.А. Таимова, Е.И. Талалаев М.: Наука,-1979.-270 с.

76. Стабникова, Е.В. Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородов для очистки нефтезагрязненных почв / Е.В. Стабникова, М.В. Селезнева, О.Н. Рева, В.Н. Иванов // Прикладная биохимия и микробиология. -1995. -Т.31. -№5. С. 534-539.

77. Старовойтов, И.И. Катаболизм бифенила штаммом Pseudomonas putida BS 893, содержащим плазмиду биодеградации pBS241 / И.И. Старовойтов, С.А. Селифонов, М.Ю. Нефедова, В.М. Аданин // Микробиология. 1985. - Т. 54. -Вып. 6.-С. 914-918.

78. Старостина, Н.Г. Характеристика гидрофобности клеточной поверхности метанотрофных бактерий по их способности к адгезии на углеводородах /

79. Н.Г. Старостина, А.Г. Кощаев, Е.Н. Ратнер, А.Б. Циоменко // Микробиология. 1997. - Т.66. -№2. - С. f 85-191.

80. Сузина, Н.Е. Изменения в ультраструктурной организации клеток Pseudo-monas aeruginosa под действием додецилсульфата натрия / Н.Е. Сузина, С.С. Ставская, Б.А. Фихте // Микробиология. 1988. - Т.57. - №2. - С. 255-257.

81. Суржко, Л.Ф. Утилизация нефти в почве и воде микробными клетками / Л.Ф. Суржко, З.И. Финкельштейн, Б.П. Баскунов и др.. // Микробиология. -1995. Т. 64. - № 3. - С. 393 - 398.

82. Суровцева, Э.Г. Разрушение ароматической фракции нефти ассоциацией грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов / Э.Г. Суровцева, B.C. Ивойлов, С.С. Беляев // Микробиология. 1997. - Т. 66. - №1. - С. 78-83.

83. Суровцева, Э.Г. Физиолого-биохимические свойства штамма Beijerinckia mobilis 1 ф phn+ деструктора полициклических ароматических углеводородов / Э.Г. Суровцева, B.C. Ивойлов, С.С. Беляев // Микробиология. - 1999. -Т. 68. - № 6. - С. 845-850.

84. Тарасов, АЛ. Динамика микробных процессов в пластовых водах Ромаш-кинского нефтяного месторождения / А.Л. Тарасов, И.А. Борзенков, Е.И. Милехина и др.. // Микробиология. 2002. - Т.71. - №6. - С. 849-857.

85. Требин, Г.Ф. Нефти месторождений Советского Союза / Г.Ф. Требин, Н.В. Чарыгин, Т.М. Обухова М.: Недра, 1980. - 583 с.

86. Успенский В.А. Методы битуминологических исследований. Задачи исследований и пути их разработки / В.А. Успенский, О.А. Радченко, А.И. Горская, А.П. Шишкова Л.: Недра, 1975. - 319 с.

87. Уткин, И.Б. Деградация бензола, толуола и о-ксилола культурой Pseudomo-nas sp. Y13 / И.Б. Уткин, М.М. Якимов, Л.Н. Матвеева и др.. // Микробиология. 1992. - Т. 28. - Вып. 3. - С. 367-370.

88. Уткин, И.Б. Деградация полициклических ароматических углеводородов штаммом Pseudomonas fluorescens 16N2 / И.Б. Уткин, М.М. Якимов, Л.Н. Матвеева и др.. // Микробиология. 1991. - Т. 27. - Вып. 1. - С. 76-81.

89. Финкельнштейн, З.И. Превращение дибензотиофена и диметилдибензоти-фена микроорганизмами / З.И. Финкельнштейн, Б.П. Баскунов, JI.H. Вавилова, Л.А. Головлева// Микробиология. 1997. - Т. 66. №4. С. 481-487.

90. Финкельштейн, З.И. Десульфуризация 4,6-диметилдибензотиофена и дибензотиофена культурой Gordona, aichiensis 51 / З.И. Финкелыдтейн, Б.П. Баскунов, Е.Л. Головлев, Л.А. Головлева // Микробиология. 1999. - Т. 68. - № 2.-С. 187-190.

91. Химическая энциклопедия: в 5 т. // Редкол.: Зефиров Н. С. (гл. ред.) и др.. -М.: Большая российская энцикл. 1998.

92. Ягафарова, Г.Г. Новый нефтеокисляющий штамм бактерий Rhodococcus erythropolis / Г.Г. Ягафарова, И.Н. Скворцова // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. - Т.32. - №2. - С.224-227.

93. Яковлева, Л.М. Некоторые характеристики диссоциантов Pseudomonas sy-ringae pv. maculicola / Л.М. Яковлева, Г.М. Здоровенно, Р.И. Гвоздяк // Микробиология 2002. Т. 71. - №2. - С. 240-246.

94. Bruheim, Per Effects of surfactant mixtures, including Corexit 9527, on bacterial oxidation of acetate and alkanes in crude oil / Bruheim Per, Bredholt Harald, Eimhjellen Kjell // Applied and Environmental Microbiology. Apr. 1999. - P. 1658-1661.

95. Burd, Genrich Bacterial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons on agar plates: the role of biosurfactants / Burd Genrich, Owen P. Ward // Biotechnology Techniques. May 1996.-Vol. I0.-No.5.-P. 371-374.

96. Cal-Prieto, M. J. Antimony as a tracer of the anthropogenic influence on soils and estuarine sediments / Cal-Prieto M. J., Carlosena A., Andrade J. M., et al.. // Water, Air, and Soil Pollution. 2001. - Vol. 129. - P. 333-348.112

97. Chang, Je Hwan Desulphurization of model and diesel oils resting cells of Gor-dona sp. / Chang Je Hwan, Chang Yong Keun, Cho Kyung-Suk, Chang Ho Nam // Biotechnology Letters. 2000. - Vol. 22. - P. 193-196.

98. Charrie-Duhaut, A. Abiotic oxidation of petroleum bitumens under natural conditions / Charrie-Duhaut A., Lemoine S., Adam P., Connan J., Albrecht P. // Organic Geochemistry. 2000. - Vol. 31. - P. 977-1003.

99. Cheung, Pui-Yi Mycobacterium diversity and pyrene Mineralization in petroleum-contaminated soils / Cheung Pui-Yi, Kinkle Brian K. // Applied and Environmental Microbiology. May 2001. - Vol. 67. - No. 5. - P. 2222-2229.

100. Dean-Ross, Deborah Metabolism of anthracene by a Rhodococcus species / Dean-Ross Deborah, Moody Joanna D., Freeman James P., et al.. // FEMS Microbiology Letters. 2001. - Vol. 204. - P. 205-211.

101. Eckford, Ruth Free-living heterotrophic nitrogen-fixing bacteria isolated from fuel-contaminated antarctic soils / Eckford Ruth, Cook Fred D., Saul David et al.. // Applied and environmental microbiology. Oct. 2002. - Vol. 68. - No. 10.-P. 5181-5185.

102. Giilensoy, Nahide Diversity and correlation of specific aromatic hydrocarbon biodegradation capabilities / Giilensoy Nahide, Alvarez Pedro J.J. // Biodegrada-tion- 1999.-Vol. 10.-P. 331-340.

103. Gramss, Gerhard Degradation of poly cyclic aromatic hydrocarbons with three to seven aromatic rings by higher fungi in sterile and unsterile soils / Gramss Gerhard, Voigt Klaus-Dieter, Kirsche Brigitta // Biodegradation. 1999. - V. 10.-P. 51-62.

104. Groudeva, V.I. Bioremediation of waters contaminated with crude oil and toxic heavy metals / V.I. Groudeva, S.N. Groudev, A.S. Doycheva // Int. J. Miner. Process. 2001. - Vol. 62. - P. 293-299.

105. Iwabuchi, N. Relationships between colony morphotypes and oil tolerance in Rhodococcus rhodochrous / Iwabuchi N., Sunairi M., Anazai H. et al.. // Applied and Environmental microbiology. 2000. - Vol. 66. - No. 11. - P. 50735077.

106. Kulakova, Anna N Isolation of Rhodococcus rhodochrous NCIMB13064 derivatives with new biodegradative abilities / Kulakova Anna N, Reid Karen A., Larkin Michael J. et al. // FEMS Microbiology Letters. 1996. - Vol. 145. - P. 227-231.

107. Lang, S. Surface-active lipids in rhodococci / Lang S., Philp J. C. // Antonie van Leeuwenhoek. 1998. - Vol. 74. - P. 59-70.

108. Morton, Anna C. Diversity of isolates of Rhodococcus equi from Australian thoroughbred hors farms / Morton Anna C., Baseggio Nina, Peters Michelle A., Browning Glenn F. // Antonie van Leeuwenhoek. 1998. - Vol. 74. P. 21-25.

109. Nicodem, David E. Photochemical processes and environmental impact of petroleum spills / Nicodem David E., Conceicao M., Fernandes Z. et al. // Biogeo-chemistry. 1997. - Vol. 39. - P. 121-138.

110. Piehler, M.F. Stimulation of diesel fuel biodegradation by indigenous nitrogen fixing bacterial consortia / Piehler M.F., Swistak J.G., Pinckney J.L., Paerl H.W. // Microb. Ecol. 1999. - Vol. 38. - P. 69-78.

111. Pineda, Flores Petroleum asphaltenes: generated problematic and possible biodegradation mechanisms / Pineda Flores et al. // Rev. Latinoam. Microbiol. -2001.-Vol. 43.-№3.-P. 143-150.

112. Riis, V. Influence of special surfactants on the microbial degradation of mineral oils / Riis V., Brandt M., Miethe D., Babel W. // Chemosphere. 2000. Vol. 41. -P. 1001-1006.

113. Sharma, S. L. Biodegradation and conversion of alkanes and crude oil by a marine Rhodococcus sp. / Sharma S. L., Pant A. // Biodegradation. 2000. - Vol. 11.- P. 289-294.

114. Sikkema, Jan Mechanisms of Membrane Toxicity of Hydrocarbons / Sikkema Jan, De Bont Jan A. M., Poolman Bert / Microbiological Reviews. June 1995.- Vol.59. No.2. - P.201-222.

115. Stephane, Champely Measuring biological diversity using Euclidean metrics / Stephane Champely, Daniel Chessel // Environmental and Ecological Statistics.- 2002. Vol. 9. - P. 167-177.

116. Tiehm, Andreas Degradation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in the Presence of Synthetic Surfactants / Tiehm Andreas // Applied and Environmental Microbiology. Jan. 1994. - Vol. 60. - No. 1 - P. 258-263.

117. Torben, Madsen Effects of bacterial inoculation and nonionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil / Torben Madsen, Preben Kristensen // Environmental Toxicology and Chemistry. 1997. - Vol. 16. - № 4.-P. 631-637.

118. Wang, J., Characterization of polycyclic aromatic hydrocarbons created in lubricating oils / Wang J., Jia C. R., Wong С. K., Wong P. K. // Water, Air, And Soil Pollution. 2000. - V. 120. - P. 381-396.

119. Wong, P.K. The accumulation of polycyclic aromatic hydrocarbons in lubricating oil over time a comparison of supercritical fluid and liquid-liquid extraction methods / Wong P.K., Wang J. // Environmental Pollution. - 2001. Vol. 112.-P. 407-415.

120. Zhang, Yimin Effect of a Pseudomonas rhamnolipid biosurfactant on cell hy~ drophobisity and biodegradatin of octadecane / Zhang Yimin, Miller Raina M. // Applied and Environmental Microbiology. 1994. - Vol. 60. - No. 7. - P. 2101

Информация о работе

Мельников, Дмитрий Александрович
кандидата биологических наук
Краснодар, 2005
ВАК 03.00.23

Диссертация

Распределение признаков биодеградации углеводородов и оценка технологически важных свойств нефтеокисляющих бактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы