Разработка основы биопрепарата для деградации нефти при загрязнении природных сред

Клюянова, Мария Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка основы биопрепарата для деградации нефти при загрязнении природных сред
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка основы биопрепарата для деградации нефти при загрязнении природных сред"

На правах рукописи

КЛЮЯНОВА МАРИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

РАЗРАБОТКА ОСНОВЫ БИОПРЕПАРАТА

ДЛЯ ДЕГРАДАЦИИ НЕФТИ ПРИ ЗАГРЯЗНЕНИИ ПРИРОДНЫХ СРЕД

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□3409226

Уфа-2009

003489226

Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории микробиологического мониторинга кафедры «Прикладная биология и микробиология» Астраханского государственного технического университета

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Сопрунова Ольга Борисовна

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Ибрагимов Ренат Исмагилович

доктор биологических наук, с.н.с. Силищев Николай Николаевич

Ведущая организация Учреждение Российской академии

наук Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь

Защита диссертации состоится «23» декабря 2009 г. в 12.00. часов на заседании Объединенного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций ДМ 002.136.01 при Институте биологии Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, Проспект Октября, 69, тел/факс: 8 (347) 235-62-47, е-таН: ib@arirb.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН и на официальном сайте АН РБ по адресу: http://www.anrb.ru/inbio/dissovet

Автореферат разослан «24» ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук, доцент ! \\ Р.В. Уразгильдин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Актуальной проблемой современной экологии является восстановление нефтезагрязненных почвенных и водных экосистем, так как зачастую нефтяное загрязнение приводит к необратимым изменениям биологического равновесия и разнообразия. В связи с этим, проблемы, связанные с разработкой способов и методов защиты окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, являются в настоящее время наиболее остро стоящими и актуальными.

Существующие биотехнологические методы защиты окружающей среды от техногенных загрязнений основаны на использовании микроорганизмов-деструкторов, имеющих в своем составе специфические ферментные системы, осуществляющие катаболизм нефтяных углеводородов (Логинов, 2000). Традиционно разрабатываемые и применяемые технологии, базируются на использовании моно- или поликультур микроорганизмов (Коронелли, 1996; Логинов, 2000; Ягафарова, 2001; Кураков и др., 2006).

Эффективность применения бактерий в качестве деструкторов нефтяных углеводородов может снижаться за счет появления в популяции неактивных форм микроорганизмов, то есть диссоциантов. Известно (Милько и др., 1991; Нетрусов, 2006), что диссоцианты могут синтезировать разное количество биологически активных веществ, спектр которых может различаться. Так, например, у М-клеток, как правило, образуется максимальное количество экзопродуктов, а R-варианты активнее разрушают ксенобиотики, так как они устойчивее к токсическим веществам. Основными факторами, влияющими на образование биосурфактантов способствующих активному разложению нефтяных углеводородов, относятся условия культивирования продуцента (природа и концентрация источников углерода и азота), рН, температуры, фазы роста культуры и концентрация микроорганизмов (Абрамзон и др., 1988; Desai et all., 1997; Картель, 2007; Гоготов и др., 2008).

В связи с этим, практический интерес представляет получение и использование устойчивых вариантов бактерий не только для стабилизации выхода синтезируемых клетками биологически активных веществ, но и процессов биотрансформации ксенобиотиков (Фурсова и др., 2005). ]

Таким образом, поиск устойчивых вариантов углеводородокисляющих бактерий, обладающих высокой биодеструкционной активностью в отношении нефтепродуктов, является весьма актуальным, так как на рынке Российской Федерации на данный момент существует лишь один патент на основе R-диссоциантов штаммов родококков - биопрепарат «Родер» (Патент РФ № 2174496).

Цель исследований. Выделение из нефтезагрязненных экосистем Прикаспийской Низменности штаммов микроорганизмов, обладающих углеводородокисляющей активностью, и изучение их в качестве основы биопрепарата для деструкции нефтяных углеводородов.

Задачи исследований:

1. Выделить из нефтезагрязненных экосистем штаммы микроорганизмов, обладающие углеводородокисляющей активностью и изучить их культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства.

2. Провести скрининг наиболее активных штаммов-деструкторов сырой нефти и провести их генетическую идентификацию.

3. Изучить влияние культурально-морфологической изменчивости бактериальных штаммов на их физиолого-биохимические свойства и подобрать оптимальные питательные среды для получения наиболее устойчивых вариантов культур с максимальной активностью в отношении деградации нефтяных углеводородов.

4. Определить эффективность использования бактериальных штаммов для биодеградации углеводородов сырой нефти.

Научная новизна работы. Из нефтезагрязненных экосистем выделены и идентифицированы новые штаммы бактерий, проявляющие деструкционную активность в отношении нефтяных углеводородов.

Впервые изучена фенотипическая диссоциация Bacillus firmiis штамм SDS-1 и Staphylococcus xylosus штамм SK, выделены и описаны колониально-морфологические варианты этих бактерий.

Для каждого штамма впервые изучена эмульгирующая способность и определена оптимальная питательная среда, на которой индекс эмульгирования максимален.

Впервые изучена способность штаммов Bacillus firmus SDS-1 и Staphylococcus xyiosus SK участвовать в биотрансформации нефти.

Практическая значимость. Предложены новые штаммы Bacillus cereus AI, Bacillus firmus SDS-1, Pseudomonas aeruginosa XI и Staphylococcus xyiosus SK, которые могут быть использованы в качестве деструкторов нефтяных углеводородов.

В модельных условиях выявлено, что наибольшей активностью среди изученных микроорганизмов в отношении нефтяных углеводородов обладают штаммы, имеющие меньшее количество диссоциативных переходов.

Представленные экспериментальные данные показывают способность штаммов Bacillus firmus SDS-J и Staphylococcus xyiosus SK продуцировать эмульгирующий агент и использовать нефтяные углеводороды в качестве источника питания и энергии в диапазоне солености 0,0-2,4 % и 0,0-10,0 % NaCl соответственно, что указывает на их галотолерантность.

Штаммы Bacillus firmus SDS-1 и Staphylococcus xyiosus SK помещены во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов, подана заявка на выдачу патента Российской Федерации, что позволяет рекомендовать данные штаммы бактерий для разработки биопрепарата для деградации нефтяных углеводородов.

Результаты исследований являлись частью хоздоговорных работ «Разработка биологического способа защиты экосистемы Северного Каспия от разливов нефтяных углеводородов при их поиске, добыче и транспортировке компанией ОАО «ЛУКОЙЛ» и научно-исследовательской работы по гранту РФФИ 05-0496507 «Перспективные биотехнологии очистки вод и почв от нефтяных углеводородов». Инновационные проекты, включающие результаты диссертационных исследований, отмечены золотой медалью IV-ro Московского Международного салона инноваций и инвестиций (Москва, 2004) (проект «Перспективные технологии очистки вод и почв от нефтепродуктов»); серебряной медалью УПГ-го Московского Международного салона инноваций и инвестиций (Москва, 2008) (проект «Селекция природных микроорганизмов для биоремедиации природных и техногенных экосистем»); Дипломом 1-Я степени

конкурса инновационных проектов Каспийского инновационного форума (Астрахань, 2009).

Материалы исследований используются в учебном процессе - для подготовки студентов и нет шута рыбного хозяйства, биологии и природопользования и являются составной частью фундаментальной исследовательской темы «Исследование возможности восстановления техногенных экосистем для использования в народном хозяйстве» кафедры "Прикладная биология и микробиология" Астраханского государственного технического университета.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Нижневолжском конкурсе исследовательских работ (Астрахань, 2003), Молодежной конференции «Астраханская губерния в XXI веке» (Астрахань, 2003), Международной отраслевой студенческой научной конференции (Астрахань, 2005), 2-м Всероссийском конкурсе студенческих научных работ, посвященном 250-летию МГУ им. М.В.Ломоносова и 200-летию Московского общества испытателей природы (Москва, 2005), школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию со дня рождения С.И.Алиханяна (Москва-Пущино, 2006), VIII-м Московском международном салоне инноваций и инвестиций (Москва, 2008 г). Каспийском инновационном форуме (Астрахань, 2009), 1-ой открытой научно-практической конференции молодых работников Газопромыслового управления ООО «Газпромдобыча Астрахань» (Астрахань, 2009). Результаты исследований также представлены в отчетах о научно-исследовательской работе «Особенности биоразнообразия природных экосистем Нижнего Поволжья» кафедрьг «Прикладная биология и микробиология» АГТУ (госбюджетные, промежуточные 2005, 2006 г.г. УДК 34.35.12., № гос.регистрации 01.2.006.05145, заключительный УДК 34.35.12., № гос.регистрации 01.2.009.00158).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в Перечень ВАК. Подана заявка № 2009107427 (20/009939) на выдачу патента «Штамм Bacillus firmus SDS-J для деградации нефтяных углеводородов» / Сопрунова О.Б., Гальперина А.Р., Клюянова М.А.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методической части, изложения результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Материалы диссертации изложены па 236 страницах машинописного текста, иллюстрированы 23 таблицей н 43 рисунками.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выделение и первичный скрининг углеводородокисляющих микроорганизмов осуществляли из образцов почв, отобранных в районе нефтедобывающих скважин Республики Калмыкия, шсльфовых вод Северного Каспия, нефтебазы города Астрахани.

В работе использовали чистые культуры бактерий Bacillus cereus AI, Bacillus flrmus SDS-1, Pseudomonas aeruginosa XI и Staphylococcus xylosus SK (табл. 1).

Таблица 1

Список чистых культур микроорганизмов

№ Условное обозначение культуры Объект, из которого выделена культура Идентификация культуры

1 штамм AI Почва буровой площадки Баирская Республики Калмыкия Bacillus cereus AI

2 штаммы 4-1/4-2 Циано-бактериальные сообщества, выделенные из шельфовых вод Северного Каспия в районе разведочного бурения нефтяных скважин Bacillus Jirmus SDS-1

3 штамм X1 Почво-грунты нефтебазы, распложенной в черте города Астрахани Pseudomonas aeruginosa XI

4 штамм M1 Staphylococcus xylosus SK

Выделение чистых культур микроорганизмов. Для выделения чистых культур микроорганизмов с углеводородокисляющими свойствами использовали метод накопительных микробных культур (Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 1983). Для получения накопительной культуры из почвенных образцов использовали минеральную среду следующего состава (г/л): KNOj - 4,0; КН2Р04 - 0,6; Na2HP04 - 0,6; NTa2HP(V 12П:0 - 1,4; MgSO, - 0,8. Единственным источником углерода и .энергии служила сырая нефть, отобранная на Баирском

месторождении Республики Калмыкия. Культивирование проводили при температуре 28°С в стационарной культуре и на качалке при 190 об/мин. Чистые культуры микроорганизмов из накопительной культуры выделяли высевом суспензии на плотные питательные среды (МПА, агары Чапека, крахмальный, для углеводородокисляющих микроорганизмов) (Теппер, 2004; Практикум по микробиологии, 2005).

Выделение углеводородокисляющих микроорганизмов из циано-бактериальных сообществ вод Северного Каспия, производили на агаре Чапека и водном агаре по Эрскову. В чашки Петри при посеве добавляли одну из фракций: мазут, машинное и моторное масла, нефть (на 200 мл среды - 1% фракции). Для посева использовали суспензию циано-бактериальных тяжей, культивируемых в лабораторных условиях на жидкой среде SNAX с добавлением 0,27 % соли, а так же 1,0 и 2,0% по объему сырой стерильной нефти. Посев осуществлялся глубинным и поверхностным способами. Культивирование посевов производилось в термостате при температуре 22-25°С- (Сопрунова, 2005).

Определение культуральных, морфологических и физиолого-биохимических свойств культур проводили по стандартным методикам (Теппер, 2004; Практикум по микробиологии, 2005).

Предварительную идентификацию выделенных микроорганизмов проводили по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическтш признакам, используя «Определитель бактерий Берджи» Дж. Хоулта и др. (1997). Видовую идентификацию бактериальных штаммов проводили путем секвинирования фрагментов гена 16S рРНК в Центре Биоинженерии РАН и ФГУП «ГосНИИГенетика».

Определение физиолого-биохимических свойств чистых культур. Первичный скрининг бактериальных штаммов производили на основе изучения их способности усваивать жидкие нелетучие углеводороды методом лунок по Егорову (Егоров, 1976; Практикум по микробиологии, 1976; Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 1983; 2003) и методом Купера для определения эмульгирующей активности (Cooper, Goldenberg, 1987; Ившинаидр., 2004).

Изучение потребностей штаммов бактерий в различных источниках углерода и азота, осуществляли путем высева на ряд специфических сред (Руководство к

практическим занятиям по микробиологии, 1983; Теппер, 2004; Практикум по микробиологии, 2005):

- среда для изучения потребления источников углерода (г/л): пептон — 5,0; К2НР04 - 1,0; углеводы - 10,0;

- среды для изучения потребления молекулярного азота (Эшби, Федорова, Бейеринка и бобовый агар).

Для выделения и изучения устойчивых признаков колониально-морфологических вариантов, а также их стабильности использовали метод предельных разведении с последующим высевом глубинным способом на ряд специфических питательных сред (табл. 2) (Теппер, 2004; Практикум по микробиологии, 2005).

Таблица 2

Среды, используемые для выделения диссоциантов бактериальных штаммов

Штамм Набор питательных сред

Bacillus cereus А1 Bacillus firmus SDS-1 • МПА • КАА • Для эндоспорообразования • Для цистоподобных рефрактерных форм • Для получения стационарных клеток Сбалансированная по солевому составу среда, но лимитированная по азоту и фосфору (Р и N -0,2 и 1,0 г/л) МПА с содержанием ШС) - 4,0; 7,0 и 10,0 %

Pseudomonas aeruginosa XI • МПА • КАА • М^и1а • Кинга В • Сбалансированная по солевому составу среда, но лимитированная по азоту (6,0; 11,0 и 22,0 г/л) и фосфору (0,55, 0,3 и 1 г/л) • МПА с содержанием№С1 - 0,5; 1,0 и 2,0 %

Staphylococcus xylosus SK • МПА • ЖСА • Селективная среда для стафилококков

Определение литических свойств бактерий (протеолитических и

амилолитических) осуществляли в соответствии с общепринятыми методиками (Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 1983; Практикум по микробиологии, 2005).

Определение деструкционной способности исследуемых штаммов.

Определение способности бактериальных штаммов трансформировать нефть осуществляли количественным методом измерения массовой доли нефтепродуктов на анализаторе жидкости «Флюорат-02» (Другов и др., 2000). Параллельно с этим осуществляли определение титра и состав диссоциантов в культуралыюй жидкости путем высева на селективные агаризованные среды оптимальные для каждого штамма.

Определение фитотоксичности исследуемых культур микроорганизмов.

Фитотоксичность исследуемых культур бактерий оценивали биотестом с помощью семян кукурузы и кресс-салата. Степень фитотоксичности штаммов определяли по ростовым эффектам: количеству проросших семян и длине проростков и корней (Берестецкий, 1982; Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991 ).

Результаты экспериментов обрабатывали общепринятыми методами математической статистики, выражали в виде графиков и таблиц с помощью пакета программы Microsoft Excel 2007, использовали текстовый редактор Microsoft Word 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Скрининг и идентификация штаммов бактерий, обладающих углеводородокисляющей активностью

Выделение углеводородокисляющих микроорганизмов из нефтезагрязненных экосистем. В результате проведенных исследований установлено, что в составе микрофлоры нефтезагрязненных почв и почво-грунтов Прикаспийской Низменности преобладают следующие рода углеводородокисляющих бактерий:

Bacillus>Arthrobacter>Rhodococcus>Acinetobacter>Pseudomonas>Micrococcus>Sta phylococcus. Бактериальные ассоцианты циано-бактериальных сообществ вод Северного Каспия представлены бациллярными формами.

Всего из исследуемых образцов методом накопительных микробных культур выделено 64 бактериальных штамма углеводородокисляющих микроорганизмов.

На основе изучения окислительных и эмульгирующих свойств установлено, что выделенные чистые культуры бактерий обладают не только способностью использовать жидкие нефтяные углеводороды, но и достаточно высокой

эмульгирующей активностью (до 60,9 %). На основе этих данных отобрано 5 наиболее активных штаммов бактерий, использующих нефть в качестве единственного источника углерода и энергии: из почво-грунтов нефтебазы, расположенной в черте города Астрахани - штаммы XI и Ml, из нефтезагрязненных почв Республики Калмыкия - штамм AI, из циано-бактериального сообщества вод Северного Каспия - штаммы 4-1/4-2.

Идентификация наиболее активных углеводородокисляющих бактериальных штаммов путем секвенирования фрагментов гена 16S рРНК позволила идентифицировать тестируемые штаммы следующим образом: AI -Bacillus cereus; XI - Pseudomonas aeruginosa; Ml - Staphylococcus xylosus\ 4-1/4-2 идентичны - В. firmus.

Изучение потребностей исследуемых бактериальных штаммов в источниках углерода и азота. При изучении исследуемых штаммов использовать различные источники углерода (Теппер, 2004; Практикум по микробиологии, 2005) установлено, что данные штаммы бактерий различаются по культурально-морфологическим свойствам, то есть способны к диссоциации внутри однородной микробной популяции. Различия в виде колоний обычно выявляются не на любой плотной среде, а только на богатой углеводами. Различия на клеточном уровне выражаются в способе расхождения делящихся клеток (образуются либо цепочки клеток, лежащие на прямой, как у R-вариантов, либо расположенные под утлом одна к другой V-образные формы, как у S- и М-вариантов) (Нетрусов, 2006).

Все исследуемые штаммы характеризуется широким спектром поглощения различных углеводов (табл. 3) и способны расти на предложенных средах, применяемых для изучения потребности бактерий в молекулярном азоте (Теппер, 2004; Нетрусов, 2005), при этом у них наблюдается образование Н-тина диссоциантов.

Таким образом, при изучении штаммов В. cereus AI, В. firmus SDS-l, Ps. aeruginosa XI и St. xylosus SK использовать различные соединения углерода и молекулярный азот, была выявлена способность диссоциировать на морфотипы (R, S, М и Н-тип). В связи с этим, возникает необходимость изучения гетерогенности исследуемых бактериальных культур.

Таблица 3

Культурально-морфологическая изменчивость исследуемых бактериальных штаммов, возникающая при росте на средах'с различными источниками углерода

штамм Источник углерода

арабиноза ксилоза манит | сорбит I рамноза глюкоза дульцит 1 галактоза раффиноз лактоза | сахароза мальтоза крахмал

В. сегеш АI - Я Я Я Я Я Я Б Я Я Б 8 Я

- И И Я И Я Б 8 Я Я в Я Я

Рэ. остатка XI М - И М м Я М М М м М м Я

Й. Х}'105ШЖ в 8 в 8 в 8 Б Б Б в в 8 8

2. Выделение и изучение днссоциантов углеводородокисляющих бактерий

Выделение и изучение днссоциантов исследуемых бактерий. Для

выделения и изучения диссоциативных вариантов микробной популяции использовался метод предельных разведений с последующим высевом глубинным способом на ряд специфических для каждого вида бактерий питательных сред (Практикум по микробиологии, 2005).

В популяции штамма В. сегеш А1 отмечены диссоциативные переходы 4-х типов, которые по способности расщепляться на различные варианты располагаются в следующей последовательности: 8>Я>11>М (рис. 1а). В результате исследований получено 26 диссоциантов. Наличие спор обнаружено у 8-форм, выделенных на средах богатых органикой и минеральными веществами, а также у диссоциантов выросших на среде с 4,0 % ШО.

При изучении явления гетерогенности штамма В. Агтш ХОК- / получено 14 диссоциантов, обладающих диссоциативными переходами 2-х типов (8>Я) (рис. 16). Для штамма В. $гтш в отличие от В. сегеш А1, отмечено отсутствие

роста при культивировании на КАА, МПА с повышенным содержанием ЫаС1 (7,0 и 10,0 %) и среде с высоким содержанием азота и фосфора (1,0 г/л). Наличие спор для диссоциантов В. Агтш характерно для всех 8- и Я-вариантов,

выделенных на большинстве сред, за исключением МПА с 4,0 % №С1 и среде для образования ЦРФ.

В целом, для штаммов В. сегеш А1 и В. /тпш SDS-1 характерно практически одинаковое количество Я- и в-типов диссоциантов (рис. 1а, 16).

100% 90% £ 80%

1 70%

я 60% о

| 50%

о 40%

| 30%

¡5 20% 10% 0%

М11А МПА 4,0% N301

МПА МПА КАА

7,0 % 10,0 % N«01 N»01

ЭСО ЦРФ СТАЦ N-0,2;

Р-0,2

N-1.0; Р-0,2

N-1,0; N-0,2; Р-1,0 Р-1,0

а)

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

МПА 4,0 ЭСО ЦРФ СТАД N-0,2; N-1,0; N-0,2; % N»01 Р-0,2 Р-0,2 Р-1,0

!. ■ И-форма К 8 фирма Ю( \1-ф«рма Н Н-форма I

В)

Рис. 1. - Индексы диссоциации исследуемых штаммов: а) В. сегеш А1

Агтш 808-1; в) Рх. аегистова XI.

100% 90% ^ 80%

I 7°% | 60%

| 50%

§ 40% Н

3 30%

а 2(,% 10% 0%

МПА МПА МПА МПА КАА М1ци1п Книга N-6.0; N-«,0; ГЧ- N. И- И- N. 140,5°« 1,1) % 2,0 */о В Р-0,55 Р-1,0 11,0; 11,0; П.0; 22,0; 22,0: 22,0; N001 N301 N»01 Р-0,55 Р-0.3 Р-1,0 Р-0.3 Р-0,55 Р-1,0

Среды для выдсленя двссоциантов

Для популяции штамма Ps. aeruginosa XI отмечены диссоциативные переходы 4-х типов, располагающиеся в следующей последовательности: S>M>R>H (рис. 1в). В результате исследований выделен 21 диссоциант.

При выделении диссоциантов отмечено, что фосфор является одним из сильных селектирующих факторов. Избыток фосфора в среде с углеводами способствует увеличению S-варианта в популяции В. cereus AI, В. firmus SDS-1 и Ps. aeruginosa X1.

Изучение культуралыю-морфологической изменчивости показало, что исследуемые штаммы бактерий по способности расщепляться на различные варианты располагаются в следующей последовательности: Ps. aeruginosa Xl>B. cereus A1>B. firmus SDS-I> St. xylosus SK. Таким образом, наиболее устойчивым является штамм St. xylosus SK для которого не обнаружено диссоциативных переходов, существует только одна S-форма на всех вариантах сред.

Изучение литическнх свойств диссоциантов. При изучении амилолитической активности диссоциантов В. cereus AI установлено, что полный гидролиз крахмала осуществляют S-формы, до декстринов - R-формы; В. firmus SDS-1 - полный гидролиз - R-форма, а частичный - S-форма; Ps. aeruginosa XI -полный и частичный гидролиз S-формы. Для диссоциантов штамма St. xylosus SK не обнаружено наличия амилолитической активности. На основе исследования протеолитической активности установлено, что диссоциантов В. cereus AI, способных усваивать казеин в качестве субстрата можно расположить в следующей последовательности: S>R>MH; Ps. aeruginosa XI - S>M>RH. Для всех трех диссоциантов штамма St. xylosus SK, выделенных на МПА, ЖСА и селективной среде для стафилококков, отмечено наличие слабой протеолитической активности. Диссоцианты штамма В. firmus SDS-1 не обладают протеолитической активностью.

Изучение способности диссоциантов расти на твердой среде с сырой нефтыо и нефтепродуктами. Способность диссоциантов исследуемых культур использовать жидкие нефтяные углеводороды, определенная методом Егорова, показала активность усвоения углеводородов всеми диссоциантами бактерий. Однако, у разных типов диссоциантов внутри одного штамма эта активность выражена в разной степени. Установлено, что наибольшую способность усваивать

нефтяные углеводороды, в том числе «жесткие» нефтепродукты проявляет S-форма штаммов В. cereus А1, Ps. aeniglnosa XI, St. xylosus SK и R-форма штамма В. flrmus SDS-1.

Определение эмульгирующей активности. Для определения эмульгирующей способности выделенных диссоциантов исследуемых бактериальных штаммов их культивировали на специфической минеральной среде в течение суток. Для получения супернатанта культуралыюй жидкости ее центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 минут. После чего к 4 мл исследуемого супернатанта в качестве гидрофобного субстрата добавляли 4 мл керосина и встряхивали в течение 10 минут. Изменение индекса эмульгирования определяли через 24 ч как величину отношения высоты эмульсионного слоя к общей высоте жидкости в пробирке и выражали в процентах.

В результате проведенных исследований установлено, что источники питания влияют на способность продуцировать внеклеточные метаболиты, обладающие эмульгирующими свойствами у исследуемых культур.

Бактерии рода Bacillus характеризуются средними показателями индекса эмульгирующей способности. У S-варианта штамма В. cereus AI, выделенного на среде с высоким содержанием азота и фосфора, максимально этот показатель составляет 37,7%, а у R-типа штамма В. firmus SDS-I, выделенного на среде для стационарных форм - 31,37 %.

Максимальная эмульгирующая способность штамма Ps. aeruginosa X 1 характерна для S-типа диссоцианта (52,31 %), изолированного на среде с максимальным содержанием азота (2,2 г/л) и средним - фосфора (0,055 г/л).

Для всех трех диссоциантов штамма St. xylosus SK характерно наличие эмульгирующей активности. Наибольший индекс эмульгирования (23,99 %) отмечен у диссоцианта, выделенного на ЖСА.

Таким образом, экспериментальное изучение активности роста чистых культур в присутствии нефти и нефтепродуктов, а также эмульгирующей активности показало, что различные диссоцианты имеют разную активность в отношении углеводородов. Так, наиболее стабильные результаты показали диссоцианты S-типа штаммов Ps. aeruginosa XI, В. cereus AI, полученные на средах по дефициту азота и фосфора (N-22,0; Р-0,55 и N-1,0; Р-1,0 соответственно),

St. xylosus SK (МПА) и R-типа штамма В. firmus SDS-1 (на среде для стационарных форм), что позволило их выбрать как самые активные для дальнейших исследований.

3. Изучение процесса биодеструкции нефти исследуемыми бактериальными

штаммами

Следующей задачей нашего исследования являлось изучение процесса биодеструкцни нефти наиболее активными вариантами штаммов исследуемых бактерий в лабораторных модельных экспериментах на основании количественного определения содержания нефти в системах с внесением культур бактерий и определения титра и состава диссоциантов в культуральной жидкости.

При постановке опытов использовали пенициллиновые флаконы, в которые вносили жидкую среду оптимального состава, культуру исследуемых штаммов бактерий и 2,0 % сырой стерильной нефти. В качестве контроля использовали модельные системы без внесения нефти. Продолжительность опыта составила 10 суток.

В эксперименте использовали культуры бактерий находящиеся в стационарной фазе роста: St.xylosus SK, Ps.aeruginosa XI - 4 часа; B.flrmus SDS-1, B.cereus A J - 8 часов.

Проведенные исследования показали, что на протяжении всего эксперимента изменение содержания нефти в системах в процессе экспозиции напрямую зависит от изменения численности микроорганизмов и их способности распадаться на диссоциативные варианты.

Максимальная убыль нефти за 10 суток эксперимента (91%) наблюдалась при внесении штамма St.xylosus SK. При этом за 3-е суток эксперимента убыль нефти составила 86,3% (рис. 2а). Для клеток бактериального штамма отмечено отсутствие диссоциативных переходов (рис. За).

Убыль нефти при внесении штаммов B.cereus AI и Ps.aeruginosa XI практически одинакова (69,8% и 74,0% соответственно) (рис. 26, 2в). Ранее, при культивировании данных штаммов бактерий на селективных средах было отмечено, что они являются наиболее подверженными популяционной вариабельности, которая выражается в их способности распадаться на 26 и 21 тип диссоциантов соответственно.

б)

в)

Продолжительность эксперимента, сутки штроль 55 с внесением культуры мнкрооргашпмя

г)

Рисунок 2. - Динамика убыли нефти в эксперименте при внесении: a) St. xylosus SK; б) В. cereus АI в) Ps. aeruginosa XI г) В. firmus SDK-1.

а>

.6)

__U________

В)

Г)

Рисунок 3. - Динамика численности клеток в эксперименте при внесении: а) St.xylosus SK б) Ps. aeruginosa XI; в) В. cereusAl; г) B.firmus SDK-1.

Возможно, их нестабильность проявляется и на биохимическом уровне, чем и объясняется их низкая деструкционная активность в отношении нефтяных углеводородов.

Для бактерии штамма Ps. aeruginosa XI наибольшее снижение нефтяных углеводородов (62,1%) отмечено на 5-е сутки экспонирования (рис. 2в), когда происходит увеличение численности клеток после резкого снижения в течение первых 3-х суток (на 3 порядка) и преобладанием в популяции S-варианта. В дальнейшем при доминировании R-формы снижение содержания нефти не столь весомое, хотя и происходит дальнейший рост численности микроорганизмов (рис. 36).

Бактерии рода Bacillus характеризуются различным отношением к нефтяным углеводородам, что выражается в особенностях кинетики роста и фенотипической изменчивости штаммов (рис. Зв, Зг). Для штамма В. cereus AI значительное снижение суммарных нефтяных углеводородов (60,1%) наблюдается к 7 суткам эксперимента (рис. Зв) при смене популяции на S-морфотип. При культивировании штамма В. firmus SDK-I на среде с нефтью на 3-й и 5-е сутки опыта обнаружено доминирование в популяции Н-типа диссоциантов (рис. Зг), образование которого ранее не происходило при культивировании на специфических средах, что, однако не влияет на деструкционную активность данного штамма (рис. 2г). Убыль нефти при доминировании Н-формы в течение 7-и суток опыта составила 58,3%, в целом за 10 суток эксперимента - 82,5%.

Таким образом, на основе проведенных исследований установлено, что исследуемые штаммы бактерий по способности деградации сырой нефти располагаются в следующей последовательности: St. xylosus SK (91,0%) > В. firmus SDS-I (82,5%) > Ps. aeruginosa XI (74,0%) > B. cereus AI (69,8%). Показано, что фенотипическая изменчивость оказывает влияние на активность штаммов. Наибольшей деструкционной способностью обладает штамм St. xylosus SK для которого не обнаружено расщепления бактериальной популяции на диссоциативные варианты.

Изучение фитотоксичности бактериальных штаммов. Известно, что штаммы микроорганизмов, являющиеся перспективными для процессов биоремедиации нефтезагрязненных экосистем должны быть нетоксичными для

живых организмов (Бельков, 2001). В связи с этим провели изучение токсичности исследуемых штаммов бактерий на семенах кукурузы и кресс-салата, так как растения особенно чувствительны к факторам внешней среды в ранние периода роста, когда прорастает семя и формируется проросток (Логинов, 2005).

Оценку фитотоксичности штаммов В. cereus AI, В. firmus SDS-I, Ps. aeruginosa XI и St. xylosus SK осуществляли по методу Берестецкого (Берестецкий, 1982). Для оценки степени токсичности использовали суспензии культур микроорганизмов с титром 107 КОЕ/мл.

Семена тест-культуры (кукурузы и кресс-салата) проращивали в течение 8 суток во влажных камерах на фильтровальной бумаге с добавлением 20 мл воды и 1 мл исследуемых бактериальных суспензий при постоянной температуре. В качестве контроля использовали семена кукурузы и кресс-салата, не обработанные культуральной суспензией.

Наличие в испытуемом образце фитотоксинов определяли по проценту проросших семян кукурузы и кресс-салата.

В процессе исследования воздействия суспензии микроорганизмов на прорастание семян кукурузы были обнаружены различия между штаммами по признаку токсигенности. Однако, ни один из исследуемых штаммов полностью не подавлял прорастание семян растений (рис. 4 а-б).

^ Вариант опыта

а) б)

Рисунок 4. - Оценка токсичности исследуемых штаммов по проращиванию семян (?/о): а) кукурузы; б) кресс-салата (1 - контроль; 2 - В.сегеи5 А1; 2 - В.Агтт 51)5-7; 3 - Ps.aeruginosa XI; 4 - 81.ху1о5ш Ж).

Таким образом, на основании проведенных нами исследований по изучению эмульгирующей и деструкционной активности, а также фиготоксичности выделенные штаммы бактерий В. firmtts SDS-1 и St. xylosus SK, можно рекомендовать для разработки бактериальных препаратов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современные технологии биоремедиации нефтезагрязненных экосистем основаны, главным образом, на применении бактериальных препаратов, эффективность применения которых определяется специфическими свойствами штамма-деструктора и жизнеспособностью клеток, однако, она может снижаться за счет появления в популяции неактивных форм, то есть диссоциантов. Поэтому, для получения биомассы интродуцируемых микроорганизмов необходимо поддержание культур в лабораторных условиях с сохранением их деструктивной активности, что может достигаться путем контроля микробной популяции на культуралыю-морфологическом и биохимическом уровне.

В связи с этим провели изучение фенотипической изменчивости бактериальных штаммов Bacillus cereus AI, Bacillus firmus SDS-1, Pseudomonas aeruginosa XI, Staphylococcus xylosus MI, выделенных из нефтезагрязненных экосистем Прикаспийской низменности. Изучение явления диссоциации показало, что исследуемые штаммы бактерий по способности расщепляться на различные варианты располагаются в следующей последовательности: Ps. aeruginosa Xl>B. cereus A1>B. firmus SDS-1> St. xylosus SK, что влияет на их активность в отношении нефтяных углеводородов. Наибольшей деструкционной способностью (91,0%) обладает штамм St. xylosus SK для которого не обнаружено расщепления бактериальной популяции на диссоциативные варианты.

9884), можно рекомендовать для разработки бактериальных препаратов, используемых в условиях Прикаспийской низменности.

ВЫВОДЫ

1. Из исследованных нефтезагрязненных экосистем Прикаспийской низменности выделено 64 штамма бактерий, обладающих углеводородокисляющей активностью, относящиеся к родам: Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Rhodococcus.

2. При изучении способности выделенных чистых культур микроорганизмов использовать нефтяные углеводороды в качестве единственного источника углерода, отобрано 4 наиболее активных штамма, идентифицированные как Bacillus cereus AI, Bacillus firmus SDS-1, Pseudomonas aeruginosa XI. Staphylococcus xylosus Ml.

3. При изучении фенотипической диссоциации на питательных средах, различающихся по своему компонентному составу, получено 26 колониально-морфологических варианта штамма В. cereus AI, 14 - В. firmus SDS-1, 21 - Ps. aeruginosa XI и 3 - St. xylosus SK. По способности расщепляться на различные варианты исследуемые штаммы располагаются в следующей последовательности: В. cereus AI - S>R>H>M; В. firmus SDS-1 - S>R и Ps. aeruginosa XI - S>M>R>H; Staphylococcus xylosus SK S-форма, что свидетельствует о способности к диссоциации кокковых форм бактерий только на биохимическом уровне, и отсутствием на культурально-морфологическом.

4. Изучение углеводородокисляющей и эмульгирующей активности бактериальных культур позволило подобрать оптимальные питательные среды для получения наиболее устойчивых диссоциантов для проявления максимальной активности в отношении нефтяных углеводородов: 5-типы В. cereus AI, Ps. aeruginosa XI и St. xylosus SK, полученные на средах по дефициту азота и фосфора (N-1,0; Р-1,0 и N-22,0; Р-0,55 соответственно) и МПА; А'-тип В. firmus SDS-1, полученный на среде для стационарных форм.

фенотипической изменчивости штаммы 5/. .ху!05114 Ж и В. /¡ппш Ж!?-/ можно рекомендовать в качестве основы биопрепаратов для деградации нефтяных углеводородов.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Сашаджнева О.С., Клюякова М.А., Сопрунова О.Б. О возможности активизации биодсструкнни нефтяных углеводородов II Южно-Российский вестник геологии, географин н глобальной энергии. Научно-техническ-нй журнал Л"»3. Изд-во АГУ, 2003, С. 197-198.

2. Сашаджнева О.С., Клюянова М.А., Сопрунова О.Б.Экспернменталыюе изучение биологической очистки нефтезагрязненных почв накопительной микробной культурой // Экологические системы и приборы, 2004, № 11, С. 12-15.

3. Сангаджиева О.С., Клюянова М.А., Сопрунова О.Б.Углеводородокисляющие микроорганизмы нефтезагрязненных почв Республики Калмыкия // Материалы Международной научно-практической конференции: «Проблемы и перспективы реабилитации техногенных экосистем». 20-24 сентября 2004г. Астрахань: изд-во АГТУ, 2005г., С. 101-104.

4. Клюянова М.А. Экспериментальное изучение процессов биодеградации нефтяных углеводородов в почвах накопительной микробной культурой // Сборник научных студенческих работ: «Биотехнология - охране окружающей среды». М.: Изд-во ООО «Графикон-принт», 2005, С. 212-215.

5. Клюянова М.А., Сопрунова О.Б. Углеводородокисляющие микроорганизмы нефтезагрязненных почв аридной зоны // Материалы Международной научной конференции: «Экология и биология почв: проблемы диагностики и индикации». Ростов-на-Дону: Ростиздат, 2006, С. 256-257.

6. Клюянова М.А. Углеводородокисляющие микроорганизмы почв аридной зоны // Сборник тезисов 10-ой Путинской школы конференции молодых ученых, посвященной 50-летию Путинского научного центра РАН: «Биология - наука XXI века». Пущино, 1721 апреля 2006г., С. 230-231.

7. Клюянова М.А. Углеводородокисляющие бактерии почв аридной зоны // Сборник тезисов Международной школы конференции посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна: «Генетика микроорганизмов и биотехнология». Москва-Пущино, 28 ноября-1 декабря 2006г., С. 128-129.

8. Клюянова М.А.. Сопрунова О.Б. Управление структурой сообществ бактериальных диссоциантов как перспективный подход повышения эффективности биоремедиации // Материалы Четвертого Московского Международного конгресса: «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 12-16 марта 2007г., М.: ЗАО «Экспо-биохимтехнологии», РХТУ и. Д.И. Менделеева, 2007. часть 2, С. 115.

9. Сопрунова О.Б., Клюянова М.А. Штаммы деструкторы нефтяных углеводородов И Вестник АГТУ. науч.журн. 1(36)/2007 январь-февраль. С. 180-183. (принята в печать 1 марта 2006 г.).

10. Сопрунова О.Б., Клюянова М.А. Эколого-физнологические особенности бактериальных штаммов, изолированных из нефтезагрязненных экосистем Нижнего Поволжья // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе, 2008, № 5. - С. 64-68.

11. Клюянова М.А. Сопрунова О.Б. Фенотипическая изменчивость бактерий как фактор регуляции биотехнологических процессов // Сборник тезисов Международной школы конференции посвященной 40-летшо создания института ГосНИИгенетика: «Генетика микроорганизмов и биотехнология». Москва-Пущино, 20-24 октября 2008г., С. 140-141.

12. Клюянова М.А. Морфо-физиологическая шменчивость бактерий как фактор регуляции биотехнологических процессов // Материалы международной научно-практической конференции: «Фундаментальные аспекты биологии в решении актуальных экологических проблем». - Астрахань, 2008. - С. 111-115.

13. Клюянова М.А. Перспективы использования аборигенной микрофлоры для разработки эффективных природоохранных технологий // Сборник тезисов докладов 1-ой открытой научно-практической конференции молодых работников Газопромыслового управления ООО «Газпром добыча Астрахань». - Астрахань, типография «Факел», 2009. -С.60-61.

14. Заявка на выдачу патента № 2009107427 (20/009939), заявл. 20.02.2009 г. «Штамм Bacillus firmus SDS-1 для деградации нефтяных углеводородов» / Сопрунова О.Б., Гальперина А.Р., Клюянова М.А.

Отпечатано с готового оригинал-макета в ООО «Типограф-У» 450098, г.Уфа, ул.Комсомольская, 2 Заказ №109, т.ЮО, 2009, Формат 60x90 1/16. Уч. п.л. 1,5, усл. печ. л. 1,4 Бумага офсетная. Отпечатано методом ризографии.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Клюянова, Мария Александровна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Основные пути интенсификации биодеградации нефти в окружающей среде

1.1.1 Стимуляция естественной нефтеокисляющей микрофлоры

1.1.2 Интродукция углеводородокисляющих микроорганизмов

1.2 Использование аборигенных микроорганизмов

1.3 Биопрепараты, используемые при очистке нефтезагрязненных экосистем

1.4 Приемы дополнительной стимуляции микроорганизмов для биодеградации нефтезагрязненных экосистем

1.4.1 Технологии ускорения биодеструкции нефти

1.4.2 Применение иммобилизованных нефтеокисляющих микроорганизмов при очистке почвы и воды

1.4.3 Образование биосурфактантов углеводородокисляющими микроорганизмами

1.4.4 Явление диссоциации, как перспективный подход увеличения эффективности процесса биодеградации

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Объекты исследований

2.2 Выделение чистых культур микроорганизмов

2.3 Определение физиолого-биохимических признаков чистых культур

2.4 Определение деструкционной способности исследуемых штаммов

2.5 Определение фитотоксичности исследуемых культур микроорганизмов

3. СКРИНИНГ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ НОВЫХ ШТАММОВ

БАКТЕРИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ У Г ЛЕВ ОДОРОДОКИС ЛЯЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ

3.1 Получение чистых культур углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязненных экосистем

3.1.1 Получение чистой культуры углеводородокисляющих микроорганизмов из почвенных образцов

3.1.2 Получение чистой культуры углеводородокисляющих микроорганизмов ассоциантов цианобактерий

3.1.3 Изучение культуральных, морфологических и физиолого-биохимических свойств выделенных культур микроорганизмов

3.1.4 Окислительные и эмульгирующие свойства выделенных культур

3.2 Идентификация наиболее активных углеводородокисляющих штаммов

3.3 Изучение потребностей исследуемых штаммов микроорганизмов в источниках углерода и азота

3.3.1 Использование соединений углерода

3.3.2 Использование молекулярного азота

4. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ДИССОЦИАНТОВ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ

4.1 Выделение диссоциантов штаммов углеводородокисляющих бактерий

4.2 Изучение литических свойств диссоциантов

4.3 Изучение способности диссоциантов расти на твердой среде с сырой нефтью и нефтепродуктами

4.4 Определение эмульгирующей активности

5. ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА БИОДЕСТРУКЦИИ НЕФТИ ИССЛЕДУЕМЫМИ БАКТЕРИАЛЬНЫМИ ШТАММАМИ

5.1 Изучение особенности влияния исследуемых микроорганизмов на процесс деградации нефтяных 121 углеводородов

5.2 Изучение фитотоксичности штаммов микроорганизмовдеструкторов нефтяных углеводородов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка основы биопрепарата для деградации нефти при загрязнении природных сред"

Актуальность проблемы.

Актуальной проблемой современной экологии является восстановление нефтезагрязненных почвенных и водных экосистем, так как зачастую нефтяное загрязнение приводит к необратимым изменениям биологического равновесия и разнообразия. В связи с этим, проблемы, связанные с разработкой способов и методов защиты окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, являются в настоящее время наиболее остро стоящими и актуальными.

Эффективность применения бактерий в качестве деструкторов нефтяных углеводородов может снижаться за счет появления в популяции неактивных форм микроорганизмов, то есть диссоциантов. Известно (Милько и др., 1991; Нетрусов, 2006), что диссоцианты могут синтезировать разное количество биологически активных веществ, спектр которых может различаться. Так, например, у М-клеток, как правило, образуется максимальное количество экзопродуктов, а R-варианты активнее разрушают ксенобиотики, так как они устойчивее к токсическим веществам. Основными факторами, влияющими на образование биосурфактантов способствующих активному разложению нефтяных углеводородов, относятся условия культивирования продуцента (природа и концентрация источников углерода и азота), рН, температуры, фазы роста культуры и концентрация микроорганизмов (Desai et all., 1997; Картель, 2007; Гоготов и др., 2008).

Задачи исследования:

Научная новизна работы.

1. Из нефтезагрязненных экосистем выделены и идентифицированы новые штаммы бактерий, проявляющие деструкционную активность в отношении нефтяных углеводородов.

2. Впервые изучена фенотипическая диссоциация Bacillus firmus штамм SDS-1 и Staphylococcus xylosus штамм SK, выделены и описаны колониально-морфологические варианты этих бактерий.

3. Для каждого штамма впервые изучена эмульгирующая способность и определена оптимальная питательная среда, на которой индекс эмульгирования максимален.

4. Впервые изучена способность штаммов Bacillus firmus SDS-1 и Staphylococcus xylosus SK участвовать в биотрансформации нефти.

Практическая значимость. Предложены новые штаммы Bacillus cereus Al, Bacillus firmus SDS-1, Pseudomonas aeruginosa XI и Staphylococcus xylosus SK, которые могут быть использованы в качестве деструкторов нефтяных углеводородов.

Представленные экспериментальные данные показывают способность штаммов Bacillus firmus SDS-1 и Staphylococcus xylosus SK продуцировать эмульгирующий агент и использовать нефтяные углеводороды в качестве источника питания и энергии в диапазоне солености 0,0-2,4 % и 0,0-10,0 % NaCl соответственно, что указывает на их галотолерантность.

Штаммы Bacillus firmus SDS-1 и Staphylococcus xylosus SK помещены во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов, подана заявка (№2009107427 (20/009939) «Штамм Bacillus firmus SDS-1 для деградации нефтяных углеводородов») на выдачу патента Российской Федерации, что позволяет рекомендовать данные штаммы бактерий для разработки биопрепарата для деградации нефтяных углеводородов.

Результаты исследований являлись частью хоздоговорных работ «Разработка биологического способа защиты экосистемы Северного Каспия от разливов нефтяных углеводородов при их поиске, добыче и транспортировке компанией ОАО «ЛУКОЙЛ» и научно-исследовательской работы по гранту РФФИ 05-04-96507 «Перспективные биотехнологии очистки вод и почв от нефтяных углеводородов». Инновационные проекты, включающие результаты диссертационных исследований, отмечены золотой медалью 4-го Московского Международного салона инноваций и инвестиций (Москва, 2004) (проект «Перспективные технологии очистки вод и почв от нефтепродуктов»); серебряной медалью VIII-го Московского Международного салона инноваций и инвестиций (Москва, 2008) (проект «Селекция природных микроорганизмов для биоремедиации природных и техногенных экосистем»); Дипломом 1-й степени конкурса инновационных проектов Каспийского инновационного форума (Астрахань, 2009).

Материалы исследований используются в учебном процессе - для подготовки студентов института рыбного хозяйства, биологии и природопользования и являются составной частью фундаментальной исследовательской темы «Исследование возможности восстановления техногенных экосистем для использования в народном хозяйстве» кафедры "Прикладная биология и микробиология" Астраханского государственного технического университета.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Нижневолжском конкурсе исследовательских работ (Астрахань, 2003), Молодежной конференции «Астраханская губерния в XXI веке» (Астрахань, 2003), Международной отраслевой студенческой научной конференции (Астрахань, 2005), 2-м Всероссийском конкурсе студенческих научных работ, посвященном 250-летию МГУ им. М.В.Ломоносова и 200-летию Московского общества испытателей природы (Москва, 2005), школеконференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию со дня рождения С.И.Алиханяна (Москва-Пущино, 2006), VIII-m Московском международном салоне инноваций и инвестиций (Москва, 2008 г), Каспийском инновационном форуме (Астрахань, 2009), 1-ой открытой научно-практической конференции молодых работников Газопромыслового управления ООО «Газпромдобыча Астрахань» (Астрахань, 2009). Результаты исследований также представлены в отчетах о научно-исследовательской работе «Особенности биоразнообразия природных экосистем Нижнего Поволжья» год кафедры «Прикладная биология и микробиология» (госбюджетные, промежуточные 2005, 2006 г.г. УДК 34.35.12., № гос.регистрации 01.2.006.05145, Инв № 02.2006 03305; заключительный УДК 34.35.12., № гос.регистрации 01200900158, Инв № 0220.0900153).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в Перечень ВАК. Подана заявка № 2009107427 (20/009939) на выдачу патента «Штамм Bacillus firmus SDS-1 для деградации нефтяных углеводородов» / Сопрунова О.Б., Гальперина А.Р., Клюянова М.А. и

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Проблемы, связанные с разработкой способов и методов защиты окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, являются в настоящее время наиболее остро стоящими и актуальными. Этому способствуют различные факторы: сложная химическая природа и разнородность состава нефти различных месторождений; взаимосвязь химических, физических и биологических факторов при попадании нефти и нефтепродуктов в природные экосистемы. Отсюда — методические трудности определения нефти в воде и почве и, как следствие этого, отсутствие единых действенных методик индикации нефтяного загрязнения и отслеживания процессов трансформации нефтяных углеводородов, как в природных экосистемах, так и при осуществлении и отслеживании процессов различных способов очистки.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Клюянова, Мария Александровна

ВЫВОДЫ

2. При изучении способности выделенных чистых культур микроорганизмов использовать нефтяные углеводороды в качестве единственного источника углерода, отобрано 4 наиболее активных штамма, идентифицированные как Bacillus cereus Al, Bacillus firmus SDS-1, Pseudomonas aeruginosa XI, Staphylococcus xylosus Ml.

3. При изучении фенотипической диссоциации на питательных средах, различающихся по своему компонентному составу, получено 26 колониально-морфологических варианта штамма В. cereus Al, 14 — В. firmus SDS-1, 21 — Ps. aeruginosa XI и 3 — St. xylosus SK. По способности расщепляться на различные варианты исследуемые штаммы располагаются в следующей последовательности: В. cereus Al - S>R>H>M; В. firmus SDS-1 -S>R и Ps. aeruginosa XI - S>M>R>H; Staphylococcus xylosus SK S-форма, что свидетельствует о способности к диссоциации кокковых форм бактерий только на биохимическом уровне, и отсутствием на культурально-морфологическом.

4. Изучение углеводородокисляющей и эмульгирующей активности бактериальных культур позволило подобрать оптимальные питательные среды для получения наиболее устойчивых диссоциантов для проявления максимальной активности в отношении нефтяных углеводородов: S-типы В. cereus Al, Ps. aeruginosa XI и St. xylosus SK, полученные на средах по дефициту азота и фосфора (N-1,0; Р-1,0 и N-22,0; Р-0,55 соответственно) и МПА; i^-тип В. firmus SDS-1, полученный на среде для стационарных форм.

5. Все исследуемые бактериальные штаммы обладают способностью разлагать углеводороды сырой нефти и по активности располагаются в следующей последовательности: St. xylosus SK (91 %)>B. firmus SDS-1 (82,5%)>Ps. aeruginosa XI (74,0%)>5. cereus A1 (69,8%). Наиболее активные и устойчивые к фенотипической изменчивости штаммы St. xylosus SK и В. firmus SDS-1 можно рекомендовать в качестве основы биопрепаратов для деградации нефтяных углеводородов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В связи с этим провели изучение фенотипической изменчивости бактериальных штаммов Bacillus cereus Al, Bacillus firmus SDS-1, Pseudomonas aeruginosa XI, Staphylococcus xylosus Ml, выделенных из нефтезагрязненных экосистем Прикаспийской низменности. Изучение явления диссоциации показало, что исследуемые штаммы бактерий по способности расщепляться на различные варианты располагаются в следующей последовательности: Ps. aeruginosa XI>В. cereus А1>В. firmus SDS-1 > St. xylosus SK, что влияет на их активность в отношении нефтяных углеводородов. Наибольшей деструкционной способностью (91,0 %) обладает штамм St. xylosus SK для которого не обнаружено расщепления бактериальной популяции на диссоциативные варианты.

Совокупность положительных результатов по изучению эмульгирующей и деструкционной активности, фитотоксичности исследуемых штаммов показала, что наиболее активными из всех исследованных являются штаммы St. xylosus SK и В. firmus SDS-1, использующие нефтяные углеводороды в качестве источника питания и энергии в диапазоне солености 0,0-2,4 % (заявка на изобретение №2009107427 (20/009939) «Штамм Bacillus firmus SDS-1 для деградации нефтяных углеводородов») (Приложение 24) и 0,0-10,0 % NaCl соответственно, что указывает на их галотолерантность. Таким образом, депонированные в ВКПМ штаммы St. xylosus SK и В. firmus SDS-1 (№ В-9278, № В-9884 соответственно), можно рекомендовать для разработки бактериальных препаратов, используемых в условиях Прикаспийской низменности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Клюянова, Мария Александровна, Уфа

1. Алексеева Т.П., Бурмистрова Т.И., Терещенко Н.Н., Стахина Л.Д., Панова И.И. Перспективы использования торфа для очистки нефтезагрязненных почв // Биотехнология. 2000. - №1. - С. 58-64.

2. Ананько Г.Г., Пугачев В.Г., Тотменина О.Д., Репин В.Е. Устойчивость нефтеокисляющих микроорганизмов к низким температурам // Биотехнология. 2005.- № 5.- С. 63-69.

3. Андреева И.С., Емельянова Е.К., Загребельный С.Н., Олькин С.Е., Резникова И.К., Репин В.Е. Психротолерантные штаммы-нефтедеструкторы для биоремедиации почв и водной среды // Биотехнология. — 2006. № 1. — С. 43-52.

4. Андресон Р.К. Биотехнологические методы ликвидации загрязнений почв нефтью и нефтепродуктами / Обзор, информ. Сер. Защита от коррозии и охрана окружающей среды. М.: ВНИИОЭНГ, 1993. - С. 2.

5. Андресон Р.К., Калимуллин А.А., Агафарова Я.М., Бойко Т.Ф. Использование биопрепаратов для очистки и рекультивации нефтезагрязненных почв //Нефтепромысловое дело. 1995. - №6. - С. 234-235.

6. Аринбарсова А.Ю., Артемьева А.А., Киселев А.В. Ферментативная активность клеток Arthrobacter globiformus 193, иммобилизованных на крупнопористых керамических носителях // Прикладная биохимия и микробиология. 1982. - Т. 18. - № 3. - С. 331-339.

7. Арчегова И.Б. Восстановление земель на Крайнем Севере. Сыктывкар: Коми научный центр УрО РАН, 2000. - 152 с.

8. Арчегова И.Б. Постехногенные экосистемы Севера. — С.-Пб.: Наука, 2002.-159 с.

9. Ю.Бациллы. Генетика и биотехнология / Под ред. К. Харвурда М.: Мир, 1992.-531с.

10. П.Беккер З.Э. Физиология и биохимия грибов. — М.: Изд-во МГУ, 1988. -215 с.

11. Боронин A.M. Плазмиды резистентности и биодеградации бактерий рода Pseudomonas: Дисс.докт.биол.наук. — М., 1987. 500 с.

12. Вавилин В.А. Время оборота биомассы и деструкция органического вещества в системах биологической очистки. М.: Наука, 1986. - 143 с.

13. Вельков В.В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы // Биотехнология. -1995. №3-4. - С. 70-76.

14. Вельков В.В. Стандартизация формата описаний промышленных технологий биоремедиации // Биотехнология. 2001. - № 2. - С.70-76.

15. Волченко Н.Н., Карасева Э.В. Скрининг углеводородокисляющих бактерий — продуцентов повехностно-активных веществ биологической природы и их применение в опыте по ремедиации нефтезагрязненной почвы и нефтешлама // Биотехнология. 2006. - № 2. — С. 57-62.

16. Волченко Н.Н., Карасев С.Г., Нимченко Д.В., Карасева Э.В. Гидрофобность клеток как критерий отбора бактерий — продуцентов биосурфактантов // Микробиология. — 2007. Т. 76. - № 1. — С. 126-128.

17. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. Сб. науч. трудов / Под ред. В.М. Глазовской. — М.: Наука, 1988. — 254 с.

18. Гарейшина М.З., Кузнецова Т.А., Остробоков С.И. Влияние закачки аэрированных растворов минеральных солей на микрофлору воды призабойных зон нагнетательных скважин нефтеместорождений // Микробиология. 1991. - Т.60. - №4. - с. 741-745.

19. Гоготов И.Н., Ходаков Р.С. Образование поверхностно-активных веществ бактерий Rhodococcus erythropolis sH-5 при росте на разных источниках углерода // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. — Т. 44. - № 2. - С. 207-212.

20. Головлев Е. JI. Проблемы интродукции микроорганизмов-деструкторов // Тез. докл. 6-ой конф. РФ "Новые направления биотехнологии". 24-26 мая, 1994 г.- Пущино, 1994.- С. 4.

21. Головлев E.JI. Метастабильность фенотипа у бактерий // Микробиология. 1998. - Т.59. - № 2. - С. 149-155.

22. Градова Н.Б., Третьякова В.П., Осипова В.Г., Давидова Е.Г. Физиологические особенности дрожжей, развивающихся на средах с углеводородами p. Candida II Микробиологическая промышленность. — 1974.-Т. 113.-№5.-С. 1-4.

23. Грищенков В.Г., Гаязов P.P., Токарев В.Г. и др. // Прикл.биохим.микробиол. 1997. - Т. 33. - № 4. - С. 423-427.

24. Гузев В.С, Кураков А.В. Нефтезагрязнённые почвы: модификация свойств, мониторинг и биотехнологии рекультивации // Нефтяные загрязнения: контроль и реабилитация экосистем / Под ред. С.В. Котелевцева, А.П. Садчикова М.: МГУ, 2003.- С48-109.

25. Гусев М.В., Линькова М.А., Коронешли Т.В. Влияние нефтяных углеводородов на рост цианобактерий // Микробиология. 1982. - Т. 51.-№6. - С. 932.

26. Дзержинская И.С., Сопрунова О.Б. Батаева Ю.В., Петровичева Е.В., Райская Г.Ю. Перспектива использования цианобактерий в биоремедиации территорий нефтегазового комплекса // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. 2008. - № 5. — С. 51-54.

27. Дорошенко Е.В., Лойко Н.Г., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Горнова И.Б., Климанова Е.В., Эль-Регистан Г.И. Характеристика диссоциантов Bacillus cereus II Микробиология. 2001. - Т.70. - №6. - С.811-819.

28. Другов Ю.С., Родин А.А. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов. — С.-Пб., 2000. 250 с.

29. Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Гашев С.Н. О биологической рекультивации нефтезагрязненных песочных почв Среднего Приобья // Почвоведение. 1990. - № 9. - С. 148-151.

30. Емцев В.Т., Селицкая О.В., Алехин В.Г. Новый микробный биопрепарат "Псевдомин" для рекультивации почв, загрязненных нефтепродуктами //Тез. докл. Всерос. конф. "Микробиология почв и земледелие". С.-Пб., 1998.-С. 133.

31. Ермоленко 3. М., Чугунов В.А., Герасимов В. Н., Мартовецкая И.И., Холоденко В.П. Влияние некоторых факторов окружающей среды на выживаемость внесенных бактерий, разрушающих нефтяные углеводороды // Биотехнология. 1997.- № 5. -С. 33-38.

32. Журина М.В., Стрелкова Е.А., Плакунов В.К., Беляев С.С. Влияние состава реконструированных биопленок на активность парафинокисляющих бактерий // Микробиология. 2008. — Т. 77. - № 5. -С. 701-703.

33. Ившина И. Б., Филп Д., Куюкина М. С, Кристофи Н. Биоремедиация почв, загрязненных сырой нефтью // Междунар. конф., посвящ. памяти акад. А. А. Баева, Москва, 20-22 мая 1996 г.- М., 1996.—С. 160-349.

34. Ильинский В.В. Микробиологический мониторинг нефтезагрязненного загрязнения водных экосистем: теория и практика // Нефтяныезагрязнения: контроль и реабилитация экосистем: Учеб.-метод. пособие. М.: Изд-во ФИАН, 2003. - С. 4-47.

35. Исмаилов Н.М. Биодеградация нефтяных углеводородов // Микробиология. 1985.-Т. 1. -№ 1.-С. 835-841.

36. Исмаилов Н.М. Микробиологическая и ферментативная активность нефтезагрязненных почв // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем / Под ред. В.М. Глазовской М.: Наука, 1988. - С. 42-56.

37. Калакуцкий JI.B., Озерская С.М., Евтушенко Л.И. Российская коллекция микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. -Т.32.-№ 1.-С. 144-154.

38. Картель Н.А., Бричкова Г.Г. Рамнолипиды: перспективы их использования для фиторемедиации // Биотехнология. 2007. - № 4. — С. 47-60.

39. Квасников В.И. Клюшникова Т. М. Микроорганизмы деструкторы нефти в водных бассейнах. - Киев: Наукова думка, 1981. - 132с.

40. Киреева И.Ю. Использование биогумуса для ускорения деструкции нефти в почве // Биотехнология. — 1995. № 5-6. - С. 32-35.

41. Киреева Н. А., Кузяхметов Г. Г. Способы ускорения биологического разрушения нефтяных углеводородов в почве // Тез. докл. Науч. конф. по прогр. «Ун-ты России».- Уфа, 1995. С. 61-62.

42. Киреева Н.А., Новоселова Е.И., Хазиев Ф.Х. Использование активного ила для рекультивации почв, загрязненных нефтью // Почвоведение. -1996. -№ 11.-С. 1399-1403.

43. Киреева Н.А. Активизация микробиологических процессов нефтезагрязненных почв // Тез. докл. Всероссийской конференции "Микробиология почв и земледелие". С.-Пб., 1998. - С. 100-101.

44. Киреева Н. А., Новоселова Е. И., Хазиев Ф. X. Изменение свойств серой лесной почвы при загрязнении нефтью и в процессе рекультивации // Башкирский экологический вестник. 1998. - № 3. - С. 3-7.

45. Киреева Н.А., Водопьянов В.В., Мифтахова A.M. Биологическая активность нефтезагрязненных почв // Уфа: Гил ем, 2001.-376 с.

46. Киреева Н.А., Онегова Т.С., Жданова Н.В. Способ биологической очистки нефтезагрязненного водоема // Нефтяное хозяйство. — 2005. № 4.-С. 127-129.

47. Кисин Д.В., Колесов А.И. Препараты серии "Биодеструктор"-эффективные средства для ликвидации нефтяных загрязнений // Нефтяное хозяйство. -1995. №5-6. - С. 83-85.

48. Козляк Е.И., Соломин З.Г., Якимов М.М., Фадюшина Т.В. Сорбция клеток Pseudomonas fluorescens 16п2 на различных носителях // Прикладная биохимия и микробиология. 1993. - Т. 29. - № 1. - С. 138143.

49. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Ильинский В.В. и др. Видовая структура углеводородокисляющих бактериоценозов водных экосистем разных климатических зон // Микробиология. 1994. — Т. 63. - № 5. - С. 917-923.

50. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. — 1996. — Т. 32. № 6. — С. 579-585.

51. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Ильинский В.В., Кузьмин Ю.И., Кирсанов Н. Б., Яненко А. С. Интродукция бактерий рода Rhodococcus в тундровую почву, загрязненную нефтью // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. - Т. 33. - № 2. - С. 198-201.

52. Куликова И.Ю. Разработка биопрепарата для ликвидации аварийных разливов нефти в море // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. 2008. - № 5. - С. 59-62.

53. Куликова И.Ю., Дзержинская И.С. Микробиологические способы ликвидации последствий аварийных разливов нефти в море // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. 2008. - № 5. - С. 24-29.

54. Куличевская И. С, Гузев В. С, Паников Н. С. Популяционная динамика углеводородокисляющих дрожжей, интродуцированных в нефтезагрязненную почву // Микробиология.- 1995. Т. 64. - № 5.- С. 668-673.

55. Кураков А.В., Гузев B.C. Нефтезагрязнённые почвы: модификация свойств, мониторинг и биотехнологии рекультивации / Нефтяные загрязнения: контроль и реабилитация экосистем // Под ред. С.В. Кетелевцева. М.: Изд-во МГУ, 2003.- С. 48-94.

56. Кураков А.В., Ильинский В.В, Котелевцев С.В., Садчиков А.П. Биоиндикация и реабилитация экосистем при нефтяных загрязнениях / Под ред. А.П. Садчикова, С.В. Котелевцев. — М.: Изд-во «Графикон», 2006.-336 с.

57. Левич А.П., Максимов В.Н., Булгаков Н.Г. Экспериментальная и теоретическая экология фитопланктона: управление структурой и функциями сообществ М.: Изд-во НИЛ, 1997. -188 с.

58. Логинов О.Н. и др. Биотехнологические методы очистки окружающей среды от техногенных загрязнений / Под ред. О.Н. Логинова, Н.Н Силищева, Т.Ф. Бойко, Н.Ф. Галимзяновой.- Уфа: Гос-е изд-во научно-технической литературы «Реактив», 2000. — 100 с.

59. Логинов О.Н. Бактерии Pseudomonas и Azotobacter как объекты сельскохозяйственной биотехнологии / Под ред. О.Н.Логинов. — М.: Наука, 2005.-166 с.

60. Максимов В.Н. Основные понятия общей экологии // Экология микроорганизмов. М.: Изд-во ACADEMA, 2004. - С. 12-28.

61. Мамедьяров М.А., Исмаилов Н.М., Двейрин В.Л. Влияние молочной сыворотки и стоков производства дрожжей на рост углеводородокисляющих микроорганизмов и разложение ими нефти // Изв. АН АзССР Сер. биол. наук. 1984. - № 5. - С. 94-100.

62. Мельников Д.А. распределение признаков биодеградации углеводородов и оценка технологически важных свойств нефтеокисляющих бактерий: Автореф. дис. канд. биол. наук. — Краснодар: Кубан. гос. аграр. ун-т, 2005.-25 с.

63. Методы почвенной микробиологии и биохимии: Учебное пособие / Под ред. Д.Г.Звягницева. М.: Изд-во МГУ, 1991.-304с.

64. Милько Е.С., Егоров Н.С. Гетерогенность популяций бактерий и процесс диссоциации (корине- и нокардиоподобных бактерий). М.: Изд-во МГУ, 1991.-144с.

65. Милько Е.С., Мартынкина О.П. Морфологические и физиолого-биохимические особенности диссоциантов Pseudomonas aeruginosa II Микробиология. 1996. - Т. 65. - С. 352-356.

66. Милько Е.С. Никитенко Л.А. Влияние физических и химических факторов среды на рост диссоциантов Pseudomonas aeruginosa II Микробиология. 1998. - Т. 34. - № 2. - С. 171-174.

67. Милько Е.С., Ильиных И.А. Влияние пониженных концентраций углерода, азота и фосфора в среде на динамику роста трех диссоциантов Pseudomonas aeruginosa II Микробиология. 2001. - Т. 70. - С.607-610.

68. Милько Е.С., Крейер В.Г., Егоров Н.С., Лойко Н.Г., Голод Н.А. Развитие и популяционный состав смешанных (S+M) культур Pseudomonas aeruginosa в поздней стационарной фазе роста // Микробиология. — 2008. -Т.77.-№. 3.- С. 318-323.

69. Мукатанов Ф.Х., Ривкин П.Р. Влияние нефти на свойства почв // Нефтяное хозяйство. 1980. - № 4. — С. 53-54.

70. Муратова А.Ю., Турковская О.В., Антонюк Л.П., Макаров О.Е., Позднякова Л.И., Игнатов В.В. Нефтеокисляющий потенциал ассоциативных ризобактерий рода Azospirillum II Микробиология. -2005. Т. 74. - № 2. - С. 248-254.

71. Назарько М.Д., Щербаков В.Г., Александрова А.В. Перспективы использования микроорганизмов для биодеградации нефтяных загрязнений почв // Изв. вузов, пищевая технология. — 2004. № 4. — С. 89-91.

72. Нейштейн С .Я. Развитие принципов гигиенического нормирования содержания в почве вредных элементов // Гигиена населенных мест: Водоснабжение, охрана водоемов, почвы: Респуб. межвед. сб. Киев, 1980.-Вып. 19.-С. 90-95.

73. Нетрусов А.И. Микробиология: учебник для студ. высш. учеб. Заведений / Под ред. А.И. Нетрусова, И.Б. Котовой. М.: Издательский центр «Академия», 2006. — 352с.

74. Никовская Г.Н. Адгезионная иммобилизация микроорганизмов в очистке воды // Химия и технология воды. 1989. - Т. 11. - № 2. — С. 158-169.

75. Николаев Ю.А., Милько Е.С. Адгезивные и ростовые свойства R- и S-диссоциантов Pseudomonas fluorescens II Микробиология. 2000. - Т. 69. -№ 2. - С. 293-294.

76. Николаев Ю.А., Плакунов В.К. Биопленка «город микробов» или аналог многоклеточного организма? // Микробиология. — 2007. — Т. 76. -№2.-С. 149-163.

77. Общая микробиология / Под ред.проф. А.Е. Вершигоры. К.: Выща шк.

78. Головное изд-во, 1988.-343с. 93.Определитель бактерий Берджи. Пер. с англ. / Под ред. Дж. Хоулта и др. М.: Мир, 1997. - В 2-х томах.

79. Патент №2019527 Россия, C02F3/34, Е02В15/04, С09К17/00. Новый способ очистки почв от нефтяных загрязнений / Т.В. Коронелли, Э.И. Аракелян, т.И. Комарова, В.В. Ильинский. № 93017464/26; Заявл. 30.04.1994; Опубл. 15.09.1994. - Бюл. №4.

80. Патент №2033975 Россия, C02F3/34, Е02В15/04. Способ получения бактериального препарата для очистки водной среды от загрязнений нефтепродуктами / Г.А. Кожанова. № 494060/13; Заявл. 28.06.1991.; Опубл. 30.04.1995. - Бюл. № 12.

81. Патент №2035402 Россия, Способ биологической очистки сточных вод / Н.А. Залетова, В.В. Попов, JI.B. Башкатова. Опубл. 20.05.1995. - Бюл. №14.

82. Патент №2045482 Россия, C02F3/34. Способ очистки воды и почвы от загрязнений нефтью и нефтепродуктами / Г. А. Шугина.- № 94013883/13; Заявл. 28.04.94; Опубл. 10.10.95. Бюл. № 28.

83. Патент №2049739 Россия, C02F3/34, Е02В15/04, В09С1/10, C09K3/32, В09С101:00. Способ очистки почвы от загрязнения нефтью и нефтепродуктами / О.Н. Антропова, JI.C. Jley. №5003092/13; Заявл. 19.09.1991.; Опубл. 10.12.1995.

84. Патент №2253209 Россия А01В79/02. Способ рекультивации нефтезагрязненных почв / А.В. Назаров, С.А. Иларионов, В.В. Горелов, И.Г. Калачникова, В.М. Щукин, Ю.К. Наргович, В.Н. Басов № 2003132619/12; Заявл. 06.11.2003; Опубл. 10.06.2005.

85. Тотменина, В.Е. Репин, Г.М. Тулянкин. № 2004102634/13; Заявл. 29.01.2004.; Опубл. 27.12.2005.

86. Патент 5436160 США, МКИ6 C10G 32/00, C02F3/00. Bioremediation of hydrocarbon contaminated soil / Varadaraj R., Book J., Robbins M. L. / № 190391; МКИ 435/264.

87. Патент РФ № 95102959/13 от 20.07.96 г. Толстокорова Л.Е. Щипанов В.П., Морозова Т.Н., Поденко Л.С. Биореагент для очистки воды и почвы от нефтяных загрязнения.-Б.И.-№20, 1996-- 123 с.

88. Пирог Т.П., Шевчук Т.А., Волошина И.Н., Грегирчак Н.Н. Использование иммобилизованных на керамзите клеток нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки воды от нефти // Прикл. биохимия и микробиология. 2005. — Т 41. - № 1. — С. 58-63.

89. Плакунов В.К., Журина М.В., Беляев С.С. Устойчивость нефтеокисляющего микроорганизма, Dietzia sp. к гиперосмотическому шоку в реконструированных биопленках // Микробиология. — 2008. Т. 77. -№ 5.-С 581-589.

90. Плешакова Е.В., Дубровская Е.В., Турковская О.В. Приемы стимуляции аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры // Биотехнология. 2005. - № 1. - С. 42-50.

91. Практикум по микробиологии / Под ред.Н.С. Егорова. Учебное пособие. — М.: Изд-во Моск.ун-та. 1976. -306с.

92. Практикум по микробиологии: Учебное пособие для суд. высш. учеб. заведений / Под ред. А.И. Нетрусова. — М.: Издательский центр «Академия», 2005. 608 с.

93. Программа BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast

94. Программа TREECON http://www.cme.msu.edu

95. Пуриш JI. М., Рожанская А. М., Пиляшенко-Новохатный А. И., Козлова И. А. Влияние техногенных факторов на микробные сообщества грунтов // Микробиол. ж. 1996.- Т. 58. - № 3.- С. 17-24.

96. Пырченкова И.А., Гафаров А.Б., Пунтус И.Ф., Филонов А.Е., Воронин A.M. Выбор и характеристика активных психрофильных микроорганизмов-деструкторов нефти // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. - Т. 42. - № 3. - С. 298-305.

97. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Практическое пособие / Под ред. Н.С. Егорова.- 2-е изд.-М.: Изд-во Моск.ун-та, 1983.- 251с.

98. Рыбальский Н.Г., Лях С.П. Экобиотехнологический потенциал консорциумов микроорганизмов М.: ВНИИПИ, 1990. - 175 с.

99. Самонин В.В., Еликова Е.Е. Изучение закономерности адсорбции бактериальных клеток на пористых носителях // Микробиология. 2004. -Т. 73.-№6.-С. 810-816.

100. Сафонова Е.Ф. Биодеградация компонентов нефтяного загрязнения с участием микроводорослей и цианобактерий: Автореф.дис. канд.биол.наук. — С.-Пб., 2004. — 17 с.

101. Сидоров Д. Г., Борзенков И. А., Милехина Е. И., Беляев С. С, Иванов М. В. Микробиологическая деструкция мазута в почве при использовании биопрепарата Деворойл // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - Т. 34. - № 3. - С. 281-286.

102. Синицин А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И. Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М.: Изд-во МГУ, 1994. -228 с.

103. Скрябин Г.К., Головлева Л.А. Использование микроорганизмов в органическом синтезе. М.: Наука, 1976. - 235 с.

104. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев: Наук, думка, 1990. - С. 84-111.

105. Современная микробиология. Прокариоты: В 2-х томах. Т. 1. Пер.с англ./Под ред. Й.Ленгелера, Г.Древса, Г.Шлегеля. М.: Мир, 2005. - 656 с.

106. Солнцева Н.П. Геохимическая трансформация дерново-подзолитых почв под влиянием потоков высокоминерализованных сточных и пластовых вод // Техногенные потоки веществ в ландшафтах и состояние экосистем.-М.: Наука, 1981.-С. 155-193.

107. Сопрунова О.Б. Особенности функционирования альго-бактериальных сообществ техногенных экосистем: Автореф.дис. д-ра биол.наук. М.: МГУ, 2005.-44 с.

108. Стабникова Е.В., Селезнева М.В., Рева О.Н., Иванов В.Н. Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородов для очистки нефтезагрязненных почв // Прикладная биохимия и микробиология. -1995. Т. 31. - № 5. - С. 534-539.

109. Стабникова Е.В., Селезнева М.В., Дульгеров А.Н., Иванова ВН. Применение биопрепарата «Лейстан» для очистки почвы от углеводородов нефти // Прикладная биохимия и микробиология. — 1996. -Т. 32. -№2.-с. 219-223.

110. Стабникова Е. В. Скрининг носителя для бактерий, очищающих почву от нефтяных загрязнений // Микробиологический журнал.— 1998.— Т. 60. № 2.— С. 85-90.

111. Суржко Л.Ф., Филькенштейн З.И., Баскунов Б.П., Янкевич М.И., Головлева Л.А. Утилизация нефти в почве и воде микробными клетками // Микробиология. 1995. - Т. 64. - № 3. - С. 393-398.

112. Теппер Е.З. Практикум по микробиологии: Учебное пособие для вузов / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева / Под ред. В.К. Шильниковой. 5-е изд., перераб. И доп. - М.: Дрофа, 2004. - 256 с.

113. Феофанов Ю.А. Развитие теоретических основ технологии очистки воды иммобилизованными на подвижных носителях биоценозами // Изв. вузов, строительства. 1997. -№6. - С. 101-105.

114. Финкельштейн З.И., Баскунов Б.П., Алиева P.M., Головлев ЕЛ., Головлева Л.А. Микробная деградация нефти и нефтепродуктов // Тез. докл. конф «Биотехнол.защиты окруж.среды», Пущино, 18-19 октября 1994г. Пущино, 1994. - С. 5-6.

115. Фурсова П.В., Милько Е.С., Ильиных И.А., Максимов В.Н., Левич А.П. Определение потребностей диссоциантов Pseudomonas aeruginosa в углероде, азоте и фосфоре // Микробиология. 2004. - Т. 73. - № 1. - С. 45-50.

116. Хабибулин С.С., Николаев Ю.А., Лойко Н.Г., Голод Н.А., Милько Е.С., Воейкова Т.А, Эль-Регистан Г.И. Ауторегуляция фенотипической диссоциации у Bacillus licheniformis II Журн. микробиологии, эпидимиологии и иммунологии. 2006. — Т. 75. - № 6. — С. 9-13.

117. Худокормов А.А. Интенсификация процесса биодеструкции углеводородов актинобактериями в модельных системах и плевых условиях: Автореф. дис. канд.биол.наук / Ставроп. гос. ун-т. -Ставрополь. 2006. 21 с.

118. Шкидченко А.Н., Петрикевич С.Б., Кобзев Е.Н. Влияние длительности хранения суспензии микроорганизмов-нефтедеструкторов на их физиологическую активность // Биотехнология. 2004. - № 3. — С. 70-74.

119. Шлегель Г. Общая микробиология М.: Мир, 1987. — 562 с.

120. Ягафарова Г. Г., Гатауллина Э. М. Испытания биопрепарата "Родотрин" для ликвидации нефтяных загрязнений // Баш. хим. ж. 1995.- Т. 2. № 3-4. - С. 69-70.

121. Ягафарова Г.Г., Скворцова И.Н. Новый нефтеокисляющий штамм бактерий Rhodococcus erythropolis II Прикладная биохимия и микробиология. — 1996. Т. 32. - № 2. - с. 224-227.

122. Ягафарова Г.Г. Экологическая биотехнология в нефтегазодобывающей и нефтеперерабатывающей промышленности: Учеб.пособие. Уфа: Изд-во УГНТУ, 2001.-214 с.

123. Янкевич М.И., Хадеева В.В. и др. Комплексная биотехнология очистки воды промышленных предприятий от нефтезагрязнений // Тез. докл. 3 Между нар. конф. "Освоение Севера и проблемы рекультивации". -Сыктывкар, 1996. С. 234-235.

124. Atlas R.M., Bartha R. Stimulated biodegradation of oil slicks using oleophilic fertilizers // Env. Sci. technol. 1973. - V. 7. - № 3. - P. 538-541.

125. Atlas R.M., Bartha R. Hydrocarbon biodegradation and oil spill bioremediation (ed.by K.C. Mararshall) // Adv. Microb. Ecol. 1992. - V.12. -P. 287-338.

126. Bajpai R.K., Zappi M.E., Gunnison D. Additives for establishment of biologically active zones during in situ bioremediation // Annais of the New York Academy of Sciences. 1994. - V. 721. - P. 450-465.

127. Benca-Coker M. O., Ekandayo J. A. Applicability of evaluating the ability of microbes isolated from an oil spill site to degrade oil // Environmentall Monitoring and Assessment. -1997. V.45. - № 3. - P. 259272.

128. Bewley R.J. The Release of Genetically Modified Microorganisms -REGEM 2. / Eds. D. E. S. Stewart-Tull, M. Sussman. New York and London: Plenum Press, 1992. - P. 33-46.

129. Bragg J.R., Prince R.C., harner E.J. Effectiveness of bioremediation for the Exxon valdez oil spill // Nature. 1994. - V. 368. - № 6470. - P. 413-418.

130. Cohen Yehuda, Aizenshtat Zeev. Oil degradation by cyanobacterial mats / 10th Int.Symp.Phototroph.Prokariotes, Barcelona, Aug. 26-31, 2000: Program and abstr. Barcelona, 2000. - P. 82.

131. Comeau Y., Green C.W., Samson R. Role of inoculums preparation and density on the bioremediation of 2,4-D-contaminated soil by bioaugmentation // Appl. Microbiol.and Biotechnol. 1993. - V. 38. - № 5. - P. 681-687.

132. Cooper D.G., Goldenberg B.G. Surface-active agents from two Baciilus species I I Applied and Environmental Microbiology. 1987. - V. 53. - № 2. -P. 224-229.

133. De Lorenzo V. Designing microbial systems for gene expression in the field // Trends in biotechnol. 1994. - Vol. 12. - № 7. - P. 365-371.

134. Desai J., Banat I. Microbial production of surfactants and their commercial potential // Microbiology and molecular biology reviews. 1997. - V. 61. - № l.-P. 47-64.

135. Edwards U., Rogall Т., Bloeker H., Ende M.D., Boeettge E.C. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes, characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA // Nucleic Acids Research. 1989. -V.17. - P. 7843-7853

136. Ferguson S., Franzmann P., Snape I., Revill A., Trefry M., Zappia L. Effects of temperature on mineralization of petroleum in contaminated Antarctic terrestrial sediments // Chemosphere. 2003. - V. 52. - № 6. - P. 975-987.

137. Hommel R.K. and Ratledge C. Biosurfactants: production, properties, applications./Ed.N.Kosaric.-New York: Marcel Dekker, Inc., 1993.- P. 4-63.

138. Hua Z., Chen J., Lun S., Wang X. Influence of biosurfactants produced by Candida antarcrica on surfaceproperties of microorganism and biodegradation of n-alkanes // Water Ressearch. 2003. - V. 37. - № 17. - P. 4143-4150.

139. Hua Zhaozhe, Chen Yan, Du Guocheng, Chen Jian. Effects of biosurfactans produced by Candida antractica on the biodegradation of petroleum compounds // Word Journal of Microbiology and Biotechnology. 2004. — V. 20.-№ l.-p. 25-29.

140. Ivanov V.N., Kachur T.L., Dulgerov A.N., Saljuk A.J., Degradation of the oil hydrocarbons by thermophylic denitrifying bacteria // Мжробюл.ж. — 1995. Т. 57. - № 2. - С. 85-94.

141. Kommalapati H.R., Ray D. Bioenchancement of soil microorganisms in natural surfactant solutions // J. Environ. Sci. and Health. A. 1996. - V. 31. -№8.-P.1951-1964.

142. Lajoie C.A., Zylstra G.J., Deflaun M.F.et all. Development of field application vectors for bioremediation of soils contaminated withpolychlorinated biphenyls // Applied and Environmental Microbiology. -1993.-V. 59.- №6.-P. 1735-1741.

143. Levich A.P. Variational modeling theorems and aigocoenoses functioning principles // Ecological Modelling. 2000.-V. 131. - P. 207-227

144. Limbert E.S., Betts W.B. Influences of substrate chemistry and microbial metabolic diversity on the bioremediation of xenobiotic contamination // genet. Eng.and Biotechnol. 1996. - 16. - № 3. - P. 159-180.

145. Loynachan Т.Е. Low-Temperature Mineralization of crude oil in soil // J.Environ. Gual. 1978. - V. 7. - № 4. - P. 494-500.

146. Lu X.X., Zhang X., Li G.H., Zhang W.H. Production of biosurfactant and its role in the biodegradation of oil hydrocarbons // Journal of Environmental Science and Health, Part A. Tox. Hazard. Subst. Environ. Eng. 2003. V. 38. -№ 3. - P. 483-492.

147. Mills S.A., Frankenberger W.T.evaluation of phosphorus sources promoting bioremediation of diesel fuel in soil // Bull.of Environ.Contamin.and Toxicol. 1994. - V. 53. - № 2. - P. 280-284.

148. Mulligan C.N., Yong R.N., Gibbs B.F. // Environ. Prog. 1999. - V. 18. -P. 31-35.

149. Oberbremer A., Multer-Hurtig R. Aerobic step wise hydrocarbon degradation and formation of biosurfactans by organical soil population in a stirred reactor //Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1989. - V. 31. - № 5 -P. 582-589.

150. Ozaki S., Kishimoto N., Fujita T. Isolation and phylogenetic characterization of microbial consortia able to degrade aromatic hydrocarbons at high rates // Microb.and Environ. 2006. - V. 21. - № 1. - P. 44-52.

151. Providenti M.A., Lee H., Trevors J.T. Selected factors limiting the microbial degradation of recalcitrant compounds // Journal of Industrial Microbiology. -1993. T. 12. - № 6. - P. 379-395.

152. Robert M., Mercade M.E., Bosch M.P., Effect of the carbon source on biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa 44T1 // Biotechnology Letters. 1989. - V. 11. - P. 871 -874., V. - 46. - P. 451 -464.

153. Shouche M.S., Petersen J.N., Skeen R.S.et all. Alternating extraction/injecrion well interactions for in situ bioremediation // Appllied Biochemistry and Biotechnology. 1994. - V. 45. - № 6. - P. 775-785.

154. Song X., Song Y., Sun T. et all. Adaptability of microbial inoculators and their contribution to degradation of mineral oil and PAHs // J. Environ. Sci. -2006.-V. 18. -№ 2. -P. 310-317.

155. Sveum P., Faksness L.-G. Enhanced biological degradation of crude oil in a Spitsbergen tundra site // Proc. 16th Arct. and Mar. Oilspill Program Techn. Semin., June 7-9, 1993. Calgary, 1993. - V. 1. -P. 377-391.

156. Tellier J., Sirvins A., Gautier J.-C., Tramier B. Microemulsiion de substances mutritives, assimilables par des microorganisms, son procede de preparation, et ses applications. Soc. Nationale Elf Aquitaine (production) // Пат. фран., опубл. 04.03.83.

157. Toledo F.L., Calvo С., Rodelas В., Gonzalez-Lopes j. Selection and identification of bacteria isolated from waste crude oil with polycyclic aromatic hydrocarbons removal capacities // Syst. and Appl. Microbiol. — 2006. V. 29. - № 3. - P. 244-252.

158. Tramier J., Sirvins A. // Proc. Oil Spill Conf.: prev., Behav., Contr., Cleanup. San Antonio, Tex. Washington D.C., s.a. 1983. - P. 115-119.

159. Van Kemenede I., Anderson W. A., Scharer J. M., Moo-Young M. Bioremediation enhancement of phenanthrene contaminated soils by chemical pre-oxidation // Hazardous Waste and Hazardous Mater.- 1995. V. 12. - № 4. - P. 345-355.

160. Velikonja J., Kosaric N. Surfactant science caries. Biosurfactants / Ed. N. Kosaric. New York: Marcel Dekker. - 1994. - V. 48. - P. 419-446.

161. Weil Gerhard, Hugen Ralf Dieselo labbau mit in Polimer im-mobilisierten mikroorganismen //Korrespond. Abwasser. -1997. V.44. -№1.- P. 104-109.

162. Whyte L. G., Green С W., Inniss W. E. Assessment of the biodegradation potential of psychrotophic microorganisms // Can. J. Microbiol. 1996. - V. 42. - № 2.- P. 99-106.

163. Wu L., Yang H., Zhang X., Zhang L. Dalian qinggongye xueyuan xuebao // J. Dalian Inst. Light Ind. 2004. - V. 23. - № 2. - P. 88-91.

Информация о работе

Клюянова, Мария Александровна
кандидата биологических наук
Уфа, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка основы биопрепарата для деградации нефти при загрязнении природных сред - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы