Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование процессов ремедиации нефтезагрязненных природных объектов с использованием биопрепарата "Ленойл"

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Исследование процессов ремедиации нефтезагрязненных природных объектов с использованием биопрепарата "Ленойл""

На правах рукописи

Нуртдинова Лариса Амирхаиовна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ РЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПРИРОДНЫХ ОБЪЕКТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОПРЕПАРАТА «ЛЕНОЙЛ»

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2005

Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра РАН и в ЮганскНИПИнефти в рамках темы «Ферменты и метаболиты почвенных и ризосферных микроорганизмов» (ГР № 01200210612)

Научный руководитель:

доктор биологических наук Логинов Олег Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Киреева Наиля Ахняфовна

доктор биологических наук, профессор Гоготов Иван Николаевич

Ведущая организация:

Институт экологии и генетики микроорганизмов Пермского научного центра УрО РАН

Защита состоится 27 декабря 2005 г. в 1000 часов на заседании Диссертационного Совета КМ 002.136.01 при Институте биологии Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г.Уфа, Проспект Октября, 69.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г.Уфа, Проспект Октября, 69.

Автореферат разослан « ь ноября 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Р. В .Уразгильдин

гооь-и 22fOb И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди высокотоксичных загрязнителей окружающей среды выделяются нефтепромысловые поллютанты (нефть и продукты ее переработки, нефтяные шламы и т.д.). Наиболее перспективным направлением биоремедиации нефтезагрязненных объектов является применение биологического метода, основанного на использовании биопрепаратов, позволяющих ускорить разложение нефти и нефтепродуктов, не нанося дополнительного ущерба нарушенной экосистеме. На сегодняшний день разработаны и производятся различные биопрепараты, предназначенные для ремедиации природных объектов от последствий загрязнения нефтью и нефтепродуктами. В Институте биологии Уфимского научного центра РАН разработан и запатентован в Российской Федерации новый высокоэффективный биопрепарат «Ленойл», созданный на основе консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter spesies (Пат. RU № 2232806). Исследование применимости биопрепарата «Ленойл» в процессах биологической рекультивации почв, содержащих нефть или нефтепродукты, и очистки водных объектов от нефтяного загрязнения является актуальной проблемой.

Цель исследования. Исследование возможности использования биопрепарата «Ленойл» для ремедиации нефтезагрязненных почв и водных объектов.

Задачи исследования.

1. Определить спектр окислительной активности консорциума микроорганизмов биопрепарата «Ленойл» и чистых культур микроорганизмов, входящих в его состав, в отношении различных классов углеводородов.

2. Определить эффективность использования биопрепарата «Ленойл» для биологической рекультивации почв, загрязненных нефтью.

3. Провести сравнительную оценку эффективности биопрепарата «Ленойл» относительно известных коммерческих биопрепаратов для очистки нефтезагрязненных почв.

4. Разработать технологию биологической рекультивации техногенного отхода - отработанной отбеливающей земли, содержащей нефтепродукты, с использованием биопрепарата «Ленойл».

5. Разработать способ очистки водных поверхностей от нефтяного загрязнения, основанный на ^ тарата «Ленойл».

Научная новизна. Разработан новый способ очистки водных поверхностей от нефтяного загрязнения, основанный на использовании биопрепарата «Ленойл».

Определены величины окислительной активности консорциума микроорганизмов биопрепарата «Ленойл» и чистых культур микроорганизмов, входящих в его состав, по отношению к нефти и продуктам ее переработки, индивидуальным углеводородам и жирам растительного и животного происхождения.

Практическая значимость. Доказана высокая эффективность использования биопрепарата «Ленойл» для биологической рекультивации различных почв и грунтов, загрязненных нефтью, и очистки водных поверхностей от нефтяного загрязнения.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на I Международном Конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), научно-практической конференции «Теоретические и практические вопросы мониторинга, предупреждения, ликвидации и рекультивации последствий нефтяного загрязнения» (Ханты-Мансийск, 2003), конференции НТО нефтяников и газовиков им. И.М. Губкина «Охрана окружающей среды при освоении углеводородных ресурсов» (Сочи, 2003), ХУП Международной научно-технической конференции «Химические реагенты, реактивы и процессы малотоннажной химии (Уфа, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе патент Российской Федерации.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, экспериментальной части (3 главы), выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 99 страницах, содержит 21 таблицу и 3 рисунка. Список использованной литературы включает 151 наименование, из них 120 на русском языке.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность за неоценимую помощь и поддержку при выполнении работы сотрудникам Института биологии УНЦ РАН с.н.с., к.т.н. Н.Н. Силищеву, с.н.с., к.б.н. Т.Ф. Бойко, зав. контрольно-аналитической лабораторией, к.б.н. С.П. Четверикову.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследований являлся биопрепарат «Ленойл». Основу биопрепарата составляет консорциум нефтеокисляюпщх микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ЦБ ДТ-5, выделенный в Институте биологии Уфимского научного центра РАН. Промышленное производство биопрепарата «Ленойл» осуществляется на ГУЛ «Опытный завод Академии наук Республики Башкортостан» в соответствии с техническими условиями ТУ 9291-016-22657427-2002.

В работе использовались как промышленные образцы биопрепарата «Ленойл», так и полученные в лабораторных условиях. Биомассу консорциума бактерий Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ-5 получали культивированием на жидкой среде Раймонда (Егоров, 1976) следующего состава, г/л: Na2C03 0,1; СаС12 - 0,01; MnS04-7H20 - 0,02; FeS04-7H20 - 0,02; NaH2P04 - 1,5; К^ДРО^ - 1,0; MgS04-7H20 - 0,2; NH4N03 2,0; дрожжевой автолизат - 1,0; источником углерода служило дизельное топливо - 1 %; вода дистиллированная - до 1 л.

Окислительную активность консорциума в целом, а также микроорганизмов, входящих в его состав, определяли по конечному продукту окисления, т.е. по выделению углекислого газа.

Культивирование микроорганизмов проводили в колбах объемом 500 мл. В качестве питательной среды использовали 250 мл среды Диановой-Ворошиловой для углеводородокисляющих бактерий с добавлением 1% (2,5 мл) источника углерода и 5 мл трехсуточной культуры консорциума (или чистой культуры микроорганизмов, входящих в состав консорциума) с содержанием клеток 1,0-108 КОЕ/мл. С помощью дозатора-компрессора со скоростью 520 мл/мин в герметично закрытые колбы подавали стерильный атмосферный воздух. Аэрируемый воздух, прошедший через колбу с микроорганизмами, окисляющим нефтепродукты, улавливали поглотителем углекислого газа, в качестве которого использовали 200 мл 0,1 н. NaOH. Из колб с поглотителем посуточно отбирали аликвоту 10 мл и оттитровывали 0,1 н. HCl. Окислительную активность определяли по количеству образованного углекислого газа, оттитрованного кислотой.

л

В экспериментах при тех же условиях был использован контрольный образен - с реактивами, нефтепродуктами, но без микроорганизмов. Длительность эксперимента составляла 3 суток.

В лабораторном модельном эксперименте изучали процессы биодеградации нефти и возможность биологической рекультивации чернозема выщелоченного: гумус по Тюрину - 8,40%, азот (валовой) - 0,60%, Р205 (по Чирикову) - 4,39 мг/100 г почвы, Нг (по Каппену) - 9,30 мг-экв/100 г почвы, поглощенный кальций и магний (по Каппену-Гильковицу) 28,5 и 8,2 мг-экв/100 г почвы, соответственно, рН солевой 5,85, рН водный 6,46, C:N - 8, загрязненного сырой нефтью Арланского месторождения (плотность 883-891 кг/м3), содержание воды (мас.%) - 1-4; солей (мг/л) - до 4000; серы (мас.%) - 2,3; парафина (мас.%) - 3; смол (мас.%) 35,5; асфальтенов (мас.%) -6-11; H2S - 3,5 и торфа Сингапайского (данные «Юграпромторф»): влажность (%) - 55; зольность (%) - до 33; степень разложения (%) - до 45; рН - 4,4; гуминовых кислот (мас.%) -31, загрязненного сырой нефтью Правдинского месторождения (АО «Юганскнефтегаз») (плотность 871-891 кг/м3), содержание: воды (мас.%) 0,5-5; солей (мг/л) - до 600; серы (мас.%) - 1,3; парафина (мас.%) -3,3; смол (мас.%) - 8,5; асфальтенов (мас.%) - 5-9; H2S (мг/л) - 1,7.

В сосуды с 10 кг тщательно перемешанных чернозема или торфа вносили нефть из расчета 10, 20, 30 мас.% и биопрепараты с титром 2,0-106 КОЕ/мл.

Для создания оптимальных условий жизнедеятельности микроорганизмов вносили азотно-фосфорные минеральные удобрения (из расчета 0,25 г/кг почвы или торфа). Образцы инкубировали при комнатной температуре 20°С±2°С в течение 60 суток. Влажность в сосудах в течение всего срока опыта поддерживали на уровне 60% полной влагоем-кости.

Численность основных групп микроорганизмов, участвующих в биотрансформации нефти и нефтепродуктов, определяли посевом почвенной суспензии на элективных питательных средах. Численность угаеводоро-докисляющих микроорганизмов учитывали на минеральной среде Цука-муры с нефтью в качестве единственного источника углерода (Сэги, 1983), бактерий, усваивающих органический азот - на мясо-пептонном агаре (Звягинцев, 1980).

Содержание нефтепродуктов определяли весовым методом после экстракции углеводородов из навески почвы или торфа гексаном на аппарате Сокслета (Богомолов, 1984) или спектрофотометрическим методом (Груздякова, 1993). Структурный состав нефтепродуктов определяли методом газовой хроматографии с масс-селективным электродом (Хмельницкий, Бродский, 1990). Анализ почвенных экстрактов проводили на хромато-масс-спектрометрической системе, включающей газовый хроматограф НР-5890 и масс-селективный детектор НР-6890.

Для наблюдения за процессом биодеградации образцы анализировали через 15, 30, 45 и 60 суток.

Производственные испытания различных вариантов предложенной технологии биологической рекультивации отработанной отбеливающей земли осуществлены в 2003-2004 гг. на отвалах ОАО «Орскнефтеоргеинтез». На выбранных участках общей площадью 20000 м2 (2003 г.) и 15000 м2 (2004 г.) слоем 50 см была отсыпана отработанная отбеливающая земля, по краям устроена обваловка. С целью увеличения содержания в грунте доступного кислорода был применен оксигенный реагент - 3%-ная перекись водорода в количестве 1,3 л/м2. С мая месяца четырежды за сезон участки обрабатывали биопрепаратом «Ленойл» с титром живых клеток микроорганизмов 108 КОЕ/мл из расчета 10 литров на 1 м2 поверхности. Для активизации микробного разложения углеводородов грунт ежемесячно рыхлили, поливали, вносили минеральные удобрения. Поскольку утилизация полиароматических соединений микроорганизмами может идти за счет процесса соокисления с органическими веществами (РоЙш1ип & а1., 1992), в качестве удобрений были также использованы органические отходы - меласса и автолизат отработанных пивных дрожжей (0,05 кг/м2).

Лабораторные эксперименты по оценке эффективности способа очистки воды от нефтяного загрязнения заключались в следующем. В резервуар, представляющий собой стеклянный сосуд прямоугольной формы объемом 10 л, наливали водопроводную воду в объеме 6 л, сырую нефть Правдинского месторождения (или товарное дизельное топливо) в объеме 0,5 л и суспензию микроорганизмов биопрепарата «Ленойл» с титром 1,2-10* КОЕ/мл в объеме 200 мл. Аэрация в резервуаре обеспечивалась лабораторным перистальтическим насосом, при

этом входной патрубок насоса для принудительного забора воды находится ниже уровня нефтяной пленки, а выходной патрубок с резиновой трубкой, снабженной перфорированными отверстиями для распределения откачиваемой из резервуара воды, - над поверхностью нефтяной пленки. Эксперименты проводили при температуре 20°С.

Статистическую обработку результатов проводили, используя ^критерий Стьюдента на 5% уровне значимости. Данные, полученные в опытах, были обработаны на персональном компьютере с помощью программы Ехсе1-2002.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. ИССЛЕДОВАНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ БИОПРЕПАРАТА «ЛЕНОЙЛ»

Целью исследований являлось изучение спектра окислительной способности в отношении нефти и продуктов ее переработки, а также жиров растительного и животного происхождения как под воздействием биопрепарата «Ленойл», так и под воздействием составляющих этот консорциум микроорганизмов в отдельности.

В работе использовали промышленный образец биопрепарата «Ленойл», соответствующий ТУ 9291-016-22657427-2002, полученный при культивировании консорциума микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ-5 в ферментере объемом 6 м3.

Результаты определения окислительной активности консорциума микроорганизмов биопрепарата «Ленойл», а также индивидуальных штаммов бактерий Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3, входящих в состав консорциума, по отношению к индивидуальным углеводородам парафинового ряда (гептан, декан, ун-декан, додекан), нафтеновым углеводородам (циклогексан), ароматическим углеводородам (бензол, толуол, о-ксилол, нафталин), нефти и нефтяным фракциям (дизельное топливо, базовое смазочное масло, парафин, церизин), к некоторым окисленным углеводородам (изопропиловый спирт, гексадеканол, фенол) и жирам растительного и животного происхождения приведены в табл. 1. Как следует из

Таблица 1

Окислительная активность микроорганизмов консорциума «Ленойл»

Субстрат Окислительная активность, мг С02/г субстрата

АЛЬгоЬайег зр ВасШиз Ьгеув «Ленойл»

Гептан 77 113 170

Декан 33 104 140

Ундекан 94 161 175

Додекан 116 153 181

Парафин И 127 177

Церизин 14 18 21

Гексадеканол 91 215 219

Фенол 36 30 43

Циклогексан 99 90 110

Бензол 85 69 96

Толуол 93 81 89

о-Ксилол 76 92 100

Нафталин 88 53 92

Изопропиловый спирт 62 71 89

Нефть 84 112 144

Дизельное топливо 60 138 163

Смазочное масло 99 104 120

Жир говяжий 148 173 176

Жир свиной 63 172 170

Масло растительное 104 116 128

представленных данных, окислительной способностью по отношению к углеводородам различного химического строения обладают в определенной степени оба штамма бактерий. Величина окислительной активности консорциума микроорганизмов превосходит аналогичный показатель для изолированных чистых культур штаммов бактерий, входящих в состав консорциума. При этом и окислительная активность штамма Bacillus brevis отличается более высоким значением, чем у штамма Arthrobacter sp., и является, очевидно, определяющей величиной для всего консорциума в целом. Исключение составляют углеводороды циклической структуры (бензол, толуол, нафталин, циклогексан) - в этих случаях окислительная активность штамма Arthrobacter sp. является превалирующей величиной, превышающей по своему значению аналогичный показатель для Bacillus brevis.

Окисление микроорганизмами различных углеводородов связывается с наличием у них ферментной оксигеназной системы, позволяющей им включать молекулярный кислород непосредственно в углеводород, образуя при этом окисленные соединения (Голубовская, 1978). В связи с этим можно предположить, что ферментативные системы микроорганизмов, входящих в состав консорциума, содержат оксигеназы; при этом оксигеназная система штамма Bacillus brevis более специфична для линейных углеводородов (рис. 1, б), а оксигеназная система штамма Arthrobacter sp. - для циклических углеводородов (рис. 1, а, в).

При биохимическом окислении таких субстратов, как нефть и нефтяные фракции, содержащих в своем составе сложные смеси углеводородов различных классов, окислительная активность консорциума микроорганизмов значительно превосходит эту характеристику для каждого из штаммов микроорганизмов, входящих в его состав (рис. 1, г).

Биопрепарат «Ленойл» и микроорганизмы, входящие в его состав, способны окислять и различные жиры животного и растительного происхождения (табл. 1).

Таким образом, показано, что биопрепарат «Ленойл» обладает способностью к окислению широкого спектра углеводородов как в консорциуме, так и его составляющими, причем наибольшие величины окислительной активности приходятся на консорциум. Результаты исследований

А -«Ленойл» В - ВасШш ЬгеуЬ ♦ - АгШгоЬа^ег яр.

Рис. 1. Динамика окисления отдельных классов углеводородов микроорганизмами консорциума «Ленойл»:

а) ароматических углеводородов

б) парафиновых углеводородов

в) нафтеновых углеводородов

г) нефти и смазочных масел

подтверждают данные о том, что бактериальные ассоциации, в отличие от биопрепаратов, содержащих отдельные штаммы, более эффективно утилизируют нефть и нефтепродукты.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ РЕМЕДИАЦИИ

ПОЧВ, ГРУНТОВ И ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЬЮ, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОПРЕПАРАТА «ЛЕНОЙЛ»

В модельном эксперименте проведена сравнительная оценка эффективности биопрепарата «Ленойл» относительно других коммерческих биопрепаратов для очистки нефтезагрязненных почв. В качестве последних использованы «Деворойл» - консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов рр. Pseudomonas, Rhodococcus и Yarowia, «Дестройл» - чистая культура нефтеокисляющих микроорганизмов р. Acinetobacter и «Бацис-пецин» - биопрепарат на основе штамма Bacillus sp. 739.

Анализ микрофлоры чернозема выщелоченного, проведенный перед загрязнением почвы нефтью, показал, что доля аборигенных угле-водородокисляющих микроорганизмов в составе микробиоценоза невелика и характеризуется величиной 2-103 КОЕ/г почвы. Численность гетеротрофных микроорганизмов в почве до внесения биопрепаратов составляла 697-106 КОЕ/г. Внесение нефти привело к существенному уменьшению численности гетеротрофных микроорганизмов во всех вариантах эксперимента в первые 15 суток инкубации. В целом динамика изменений гетеротрофных бактерий характеризовалась постепенным восстановлением их численности к концу инкубации до уровня, определенного в чистой почве. Если при 10% загрязнении применение «Деворойла», «Ленойла» и «Дестройла» способствовало процессу восстановления численности гетеротрофных бактерий, то при 20% уровне нефтяного загрязнения аналогичная картина наблюдается только при использовании «Деворойла» и «Ленойла». При максимальной концентрации загрязнителя ни один из применяемых препаратов не обеспечивал восстановления численности гетеротрофных микроорганизмов.

Доля углеводородокисляющей микрофлоры возрастала на протяжении всего эксперимента, причем при 10% уровне загрязнения увели-

чение численности было существенным в варианте с использованием «Деворойла», «Ленойла» и «Дестройла». Высокие дозы нефти оказывали более выраженное токсическое влияние как на интродуцирован-ные, так и аборигенные углеводород окисляющие микроорганизмы. Тем не менее к концу инкубации в вариантах с применением «Деворойла» и «Ленойла» численность углеводородокисляющей микрофлоры при 10 и 20% уровне загрязнения была сопоставима с величиной, характеризующей общую численность гетеротрофных микроорганизмов. Очевидно, возрастание доли углеводородокисляющих микроорганизмов происходило, с одной стороны, за счет микроорганизмов, входящих в состав препаратов, а с другой стороны, за счет переориентации метаболизма ряда аборигенных микроорганизмов на утилизацию углеводородов нефти. В варианте с внесением «Бациспецииа» также наблюдалось возрастание количества углеводородокисляющих микроорганизмов, однако их численность оставалась на более низком уровне, чем при использовании других биопрепаратов. При загрязнении максимальной дозой поллютанта количество углеводородокисляющих микроорганизмов во всех исследуемых вариантах эксперимента находилось на более низком уровне.

Изучение динамики численности гетеротрофных микроорганизмов в торфе, величина которых до внесения биопрепаратов составляла 446-106 КОЕ/г, показало, что загрязнение нефтью привело к значительному снижению их количества во всех вариантах опыта. Возрастание активности гетеротрофных микроорганизмов отмечено к 60 суткам инкубации при 10% уровне загрязнения торфа в варианте с «Деворойлом» и «Ленойлом». Следует отметить, что в отличие от загрязненной почвы, в торфе лишь биопрепарат «Ленойл» при 20% уровне загрязнения снимал токсическое действие поллютанта. Внесение «Ленойла» в этом варианте эксперимента привело к увеличению численности гетеротрофов почти вдвое от их количества в незагрязненном торфе.

Для биопрепаратов, содержащих нефтеокисляющие бактерии, характерно существенное увеличение к концу эксперимента количества углеводородокисляющих микроорганизмов. Наибольшая численность углеводородокисляющих микроорганизмов была зарегистрирована при 10% уровне загрязнения торфа в варианте с биопрепаратом «Ленойл».

Таблица 2

Скорость деградации нефти в почве при различных уровнях загрязнения

Степень загрязнения, % «Деворойл» «Ленойл" «Дестройл» «Бациспецин»

сутки сутки сутки сутки

15 30 45 60 15 30 45 60 15 30 45 60 15 30 45 60

Остаточное содержание нефти, г/кг 10 37,6 29,1 26,1 19,4 42,4 31,2 21,0 14,7 45,9 28,3 27,4 27,1 71,2 58,4 43,2 36,7

20 135 110 90,6 76,4 138 99,7 89,4 59,7 141 109 97,5 87,2 168 137 110 104

30 261 224 198 176 269 216 187 156 263 249 235 220 288 259 229 205

Скорость биодеградации, (г/кг/супси) 10 4,16 0,57 0,2 0,45 3,8 0,75 0,68 0,42 3,6 1,17 0,06 0,02 0,85 1,01 0,43

20 4,33 1,67 1,29 0,95 4,13 2,55 0,69 1,98 3,93 2,13 0,77 0,69 2,13 2,07 1,8 0,4

30 2,6 2,46 1,73 1,47 2,07 3,53 1,93 2,07 2,47 0,93 0,93 1,0 0,8 1,93 2,06 1,6

Таблица 3

Скорость деградации нефти в торфе при различных уровнях загрязнения

Степень загрязнения, % «Деворойл» «Ленойл» «Дестройл» «Бациспецин»

сутки сутки сутки сутки

15 30 45 60 15 30 45 60 15 30 45 60 15 30 45 60

Остаточное содержание нефти, г/кг 10 39,6 30,7 28,0 20,4 46,8 23,2 19,9 15,7 44,6 28,1 28,0 27,0 76,2, 64,5 51,7 42,2

20 146 98,6 89,4 81,2 158 101 88,4 66,2 158 110 96,2 82,2 187 170 148 124

30 261 231 210 198 275 220 191 165 264 253 239 229 291 267 239 210

Скорость биодеградации (г/кг/сугки) 10 4,0 0,59 0,18 0,51 3,54 1,57 0,22 0,28 3,69 1,10 0,007 0,07 1,59 0,78 0,85 0,63

20 3,60 3,16 0,61 0,55 2,80 3,80 0,84 1,48 2,80 3,20 0,92 0,93 0,87 1,13 1,47 1,60

30 2,60 2,00 1,40 0,80 1,67 3,67 1,93 1,73 2,40 0,73 0,93 0,67 0,60 1,60 1,87 1,93

В табл. 2 представлены результаты определения хода деградации нефти в черноземе выщелоченном. Максимальная скорость утилизации углеводородов была отмечена в первые 15 суток эксперимента во всех вариантах опыта. Исключение составили вариант при загрязнении высокой дозой нефти (30%) и использовании препаратов «Ленойл» и «Бациспецин», в первом случае максимум утилизации приходился на 30-е сутки, во втором на 45-е сутки. Динамика скорости деградации углеводородов несколько различалась в разных вариантах опыта и зависела как от концентрации нефти, так и от вида препарата.

Наибольшая скорость деградации нефти в торфе, так же как и в почве, наблюдалась через 15 суток инкубации для всех биопрепаратов (табл. 3). Следует отметить, что только «Бациспецин» обеспечивал возрастание скорости деградации в течение всего срока наблюдений при среднем и максимальном уровнях загрязнения торфа.

По эффективности разложения нефти при 10 и 20% уровнях загрязнения как в черноземе выщелоченном, так и в торфе препараты располагаются в одинаковом порядке: «Ленойл», «Деворойл», «Дестройл», «Бациспецин». При 30% загрязнении чернозема выщелоченного по уменьшению эффективности разложения нефти препараты располагаются следующим образом: «Ленойл», «Бациспецин», «Дестройл», «Деворойл»; а в торфе - «Ленойл», «Деворойл», «Бациспецин», «Дестройл».

Таким образом, исследования, проведенные в модельных условиях, показали, что биопрепараты, содержащие ассоциации микроорганизмов («Деворойл», «Ленойл»), способны адаптироваться к высоким дозам нефти и эффективно утилизировать субстрат независимо от типа почв и особенностей загрязнителя. Биопрепараты - монокультуры («Бациспецин», «Дестройл»), очевидно, целесообразно использовать при концентрациях поллютантов не более 10%.

Производственные испытания различных вариантов технологии биологической рекультивации отработанной отбеливающей земли с использованием биопрепарата «Ленойл» осуществлены в 2003-2004 гг. на отвалах ОАО «Орскнефтеоргсинтез».

Проведение комплекса рекультивационных мероприятий, предусмотренных различными вариантами технологии биологической очистки отработанной отбеливающей земли, позволило значительно снизить оста-

точное содержание углеводородов в грунте. Применение в 2003 году биопрепарата «Ленойл» на фоне минеральных удобрений снизило остаточное содержание углеводородов в грунте за четыре месяца на менее загрязненных участках в 3,5 раза и в 3,9 раз по сравнению с началом летнего сезона (табл. 4). Применение биопрепарата «Ленойл» показало хорошие результаты и в процессе рекультивации относительно сильно загрязненного грунта (содержание углеводородов около 25 мас.%), позволив снизить их концентрацию в 1,8 раз.

Дополнительное внесение на рекультивируемый участок активного ила позволило ускорить процесс разложения нефтепродуктов в началь- 4

ный период. В первые месяцы вегетационного сезона темпы удаления нефтепродуктов из отработанной отбеливающей земли, смешанной с активным илом, были выше, чем на участках, обработанных только биопрепаратом «Ленойл», возможно, потому, что взаимодействие микроорганизмов активного ила с углеводородами в грунте началось раньше, а их большое разнообразие позволяло быстрее утилизировать промежуточные продукты разложения.

Для активизации процессов окисления углеводородов в загрязненной отбеливающей земле, содержащей их более 20 мас.%, в схему рекультивационных мероприятий 2004 года было введено применение оксигенного реагента - перекиси водорода и увеличена частота внесения биопрепарата для поддержания более высокого титра угле-водородокисляющих микроорганизмов в грунте. Последний вариант технологии биологической рекультивации отбеливающей земли продемонстрировал в 2004 году достаточно высокую эффективность. За вегетационный сезон разложению подверглось 60,9 мас.% содержавшихся в грунте нефтепродуктов, тогда как в 2003 году (до использования оксигенных соединений) удавалось достигнуть только 44,5 мас.% их деструкции.

Наибольшая скорость разложения углеводородов в отбеливающей земле наблюдалась в процессе проведения производственных испытаний в конце лета - начале осени. В этот же период в рекультивируемой отбеливающей земле была зарегистрирована максимальная численность угле-водородокисляющих микроорганизмов (порядка 109 КОЕ/г). В течение летнего периода численность микроорганизмов этой группы составляла

Таблица 4

Динамика разложения нефтепродуктов в грунте рекультивируемых участков 2003 года

(ОАО «Орскнефтеоргсянтез»)

Даты отбора проб Участки

№ 1 («Ленойл») № 2 («Ленойл») № 3 («Ленойл» и активный ил)

Содержание, г/кг Степень деструкции, мас.% Скорость деструкции, г/кг-сутки Содержание, г/кг Степень деструкции, мас.% Скорость деструкции, г/кг-сутки Содержание, г/кг Степень деструкции, мае % Скорость деструкции, г/кг-сутки

18.0603 189,5±16,5 1,3 0,07 247,4±19,8 1,0 0,07 183,2±27,5 3,6 0,2

19.08.03 127,6±20,б 33,5 1,0 159,4±15,4 36,2 1,5 75,8±4,3 60,1 1,8

13.09 03 78,5±4,4 59,1 2,0 143,9±10,7 42,4 0,6 52,1±3,3 72,6 0,9

17.10.03 52,9±2,8 72,4 0,8 138,7±19,8 44,5 0,2 46,9±7,2 75,3 0,2

порядка 107 КОЕ/г, что достаточно для активного протекания процесса деструкции углеводородов в грунте.

Таким образом, результаты производственных испытаний свидетельствуют о том, что комплексная технология с применением биопрепарата «Ленойл», минеральных удобрений, оксигенных реагентов и агротехнических мероприятий может с успехом применяться для рекультивации сильно загрязненных грунтов или грунтов, содержащих труднодоступные углеводороды. Причем использование в процессе ее реализации отходов других производств - мелассы, автолизата отработанных пивных дрожжей и избыточного активного ила биологических очистных сооружений позволяет повысить ее эффективность.

Серьезной проблемой, особенно для нефтедобывающих регионов Западной Сибири, остается нефтяное загрязнение водных поверхностей озер, болот и других водных источников, находящихся на территории производственной деятельности предприятий по добыче и транспорту нефти. Эффективность существующих биотехнологических способов ликвидации нефтяного загрязнения в условиях непроточных и неаэрируемых водоемов при высокой степени нефтяного загрязнения является весьма низкой.

Разработан и запатентован в Российской Федерации новый способ очистки водной поверхности от нефти и нефтепродуктов, сущностью которого является внесение в загрязненную воду бактериальной культуры, представляющей собой консорциум микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ-5 с общим титром не менее 10® КОЕ/мл (Патент RU № 2241032). Аэрация в водоеме, загрязненном нефтью или нефтепродуктами, для под держания жизнедеятельности аэробных микроор-ганизмов-нефтедеструкторов осуществляется принудительным забором нефтезагрязненной воды и распределением ее методом дождевания по поверхности водного объекта.

Результаты проведенных лабораторных экспериментов свидетельствовали о высокой эффективности нового способа: так, в эксперименте длительностью 6 суток степень очистки воды от сырой нефти составила 98,5 мас.%, а от дизельного топлива - 99,6 мас.%.

В 2002 году биопрепарат «Ленойл» был испытан для очистки водного объекта от нефтяного загрязнения на территории Ханты-Мансийского

округа в таежной зоне. Полигон был заложен на верховом болоте, расположенном на территории НГДУ «Правдинскнефть» К-29, обрабатываемая площадь 3517 м2. Мониторинг осуществлялся Научно-исследовательским институтом экологии и рационального использования природных ресурсов (г. Тюмень). Исходное содержание нефтяных углеводородов на полигоне составило 272,42 г/кг для верхнего горизонта (0-5 см) и 57,68 г/кг для нижнего (5-20 см).

Наряду с биопрепаратом «Ленойл» в испытаниях использованы и известные биопрепараты «Дизойл» (ООО «Салют-Технолоджис-вест») и «Деградойлас с МД» (ООО «Сервисэкология»). По оценке специалистов НИИ экологии и рационального использования природных ресурсов, для участка, где был использован биопрепарат «Ленойл», характерным является общее повышение численности микроорганизмов на два порядка по сравнению с фоном, что указывает на интенсификацию процесса разложения нефти. При этом коэффициент биодеградации составил через 3 месяца после обработки биопрепаратом величину, равную 1,76 (для сравнения: коэффициент биодеградации для биопрепарата «Дизойл» составил 1,34, для биопрепарата «Деградойлас с МД» - 0,61 и в контроле, т.е. без использования биопрепаратов - 0,56).

Полученные результаты позволяют рекомендовать препарат «Ленойл» для биологической ремедиации водных объектов от нефтяного загрязнения.

выводы

1. Определена величина окислительной активности консорциума микроорганизмов биопрепарата «Ленойл» и чистых культур микроорганизмов, входящих в его состав, по отношению к нефти, различным нефтепродуктам, а также к жирам растительного и животного происхождения. Показано, что биопрепарат «Ленойл» обладает способностью к окислению широкого спектра углеводородов как в консорциуме, так и его составляющими, причем наибольшие величины окислительной активности приходятся на консорциум.

2. В модельных экспериментах доказана эффективность использования биопрепарата «Ленойл» для биологической рекультивации почв (выщелоченный чернозем, торф), загрязненных нефтью. Степень биодеградации нефти в почве и торфе при 10%-ном уровне загрязнения составляет за 60 суток соответственно 85,3% и 84,3%.

3. В модельных экспериментах проведена сравнительная оценка эффективности биопрепарата «Ленойл» относительно известных коммерческих биопрепаратов для очистки нефтезагрязненпых почв. Показано, что биопрепарат «Ленойл» превосходит по эффективности такие известные биопрепараты, как «Деворойл», «Бациспецин» и «Дес-тройл», способен адаптироваться к высоким дозам нефти и эффективно утилизировать субстрат независимо от типа почв и особенностей загрязнителя.

4. Разработана и апробирована в производственных испытаниях в ОАО «Орскнефтеоргсинтез» технология биологической рекультивации отработанной отбеливающей земли, содержащей нефтепродукты, с использованием консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ-5 в составе биопрепарата «Ленойл».

5. Разработан и запатентован в Российской Федерации новый способ очистки водных поверхностей от нефтяного загрязнения, заключающийся во внесении в загрязненную воду бактериальной культуры, представляющей собой консорциум микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ-5 с общим титром не менее 108 КОЕ/мл, и принудительной аэрации водного объекта.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Логинов О.Н., Бойко Т.Ф., Артемова С.А. Данилова Е.А., Галим-зянова Н.Ф., Яковлев ВН., Нуртдинова Л.А. Эффективные микроорга-низмы-нефтедеструкторы для биологической рекультивации почв //Материалы I Международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (14-18 октября 2002 г., Москва). М., 2002. С. 294.

Loginov O.N, Boyko T.F., Artemova S.A., Danilova E.A., Galimzyanova N.F., Yakovlev V.N., Ntirtdinova L A. Effective microorganisms-oil destructors for biological recultivation of soil //1 -st International Congress «Biotechnology -state of the art prospects of development». October, 14-18.2002. M., 2002. P. 295.

2. Бойко ТФ., Галимзянова Н.Ф., Нуртдинова Л.А., Силищев Н.Н., Логинов О Н Опыт промышленного использования биопрепарата «Jle-нойл» для очистки верхового болота от загрязнения //Тезисы докладов научно-практической конференции «Теоретические и практические вопросы мониторинга, предупреждения, ликвидации и рекультивации последствий нефтяного загрязнения» (18 20 ноября 2003 г., г.Ханты-Мансийск), С. 23.

3. Яковлев В.Н., Нуртдинова Л.А., Бормашова Н.Г., Галеева Г.Р., Логинов О.Н. Применение биотехнологических методов для рекультивации нефтезагрязненных поверхностей // Тезисы докладов конференции НТО нефтяников и газовиков им. И.М. Губкина «Охрана окружающей среды при освоении углеводородных ресурсов» (30 сентября - 5 октября, г.Сочи). - М., 2003. - С. 22.

4. Логинов О.Н., Нуртдинова Л.А., Бойко Т.Ф., Четвериков СЛ., Силищев H Н. Оценка эффективности нового биопрепарата «Ленойл» для био-ремедиации нефтезагрязненных почв //Биотехнология. - 2004. -№ 1. -С. 77-82.

5. Логинов О.Н., Четвериков С.П., Гусаков В.Н., Нуртдинова Л.А., Силищев H H Окислительная активность микроорганизмов биопрепарата «Ленойл» //Башкирский химический журнал. - 2004. - Т. 11, № 2. - С. 55-57.

6. Логинов ОН., Нуртдинова Л.А., Бойко Т.Ф., Силищев Н.Н., Гай-синаХ.А., Яковлев В.Н. Новые микроорганизмы биодеструкторы для ре-

культивации нефтезагрязненных поверхностей //Интервал. - 2004. -№ 1 (60). -С. 39-42.

7. Пат. 2241032 Российская Федерация, 7 С 12 N 1/20. Способ очистки водных поверхностей от нефтяного загрязнения /О.Н.Логинов, Н.Н.Си-лищев, Л.А.Нуртдинова, В.Н.Яковлев. Заявлено 03.12.2002; опубл. 27.11.2004. Бюл. 33.

8. Нуртдинова Л А., Четвериков С.П., Силищев H.H., Логинов О Н. Окисление растительных и животных жиров микроорганизмами биопрепарата «Ленойл» //Материалы XVII Международной научно-технической конференции «Химические реагенты, реактивы и процессы малотоннажной химии» (12-14 ноября 2004 г., Уфа). Уфа: Гос. изд-во научн-техн. лит-ры «Реактив», - 2004. - С. 60-61.

9. Бакаева М.Д., Биккинина А.Г, Нуртдинова Л А., Бойко ТФ., Га-лимзянова II. Ф., Силищев H.H., Усманов М.А., Логинов ОН. Опыт рекультивации загрязненной углеводородами отработанной отбеливающей глины с применением биопрепарата «Ленойл» //Башкирский химический журнал. - 2005. - Т. 12, № 3. - С. 126-128.

10. Логинов О.Н., Биккинина А.Г., Силищев Н.Н, Бойко ТФ., Га-лимзянова Н. Ф., Нуртдинова Л. А. «Способ рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами» //Заявка на изобретение № 2005130840/13 (034576) от 04.10.2005 г.

Подписано в печать 24.11.05. Формат 60 х 84 ,/]6. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Печать офсетная. Усл.печ.л. 1.39. Уч.-изд.л. 1,40. Тираж 100 экз. Тип. чак.№ 93.

Отпечатано на оборудовании издательства «Гилем». 450077, г.Уфа, Кирова, 15. Тел.: (3472) 73-05-93, 72-36-82

Р24559

РНБ Русский фонд

2Щ6А 27398

с

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Нуртдинова, Лариса Амирхановна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах и их способность к самоочищению

1.1.1. Изменение свойств почв в условиях нефтяного загрязнения

1.1.2. Микроорганизмы - деструкторы нефти и нефтепродуктов

1.2. Биотехнологические методы очистки окружающей среды от нефтяного загрязнения

1.2.1. Методы ремедиации нефтезагрязненных почв

1.2.2. Бактериальные препараты для интродукции микроорганизмов при ликвидации нефтяных загрязнений

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Скрининг микроорганизмов-нефтедеструкторов

2.2. Изучение фенотипических характеристик выделенных культур

2.3. Исследование окислительной активности микроорганизмовдеструкторов нефти и нефтепродуктов

2.4. Изучение эффективности процесса биодеструкции нефти в лабораторных и полевых экспериментах

2.5. Статистическая обработка результатов

3. ИССЛЕДОВАНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ

БИОПРЕПАРАТА «ЛЕНОЙЛ»

4. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ

РЕМЕДИАЦИИ ПРИРОДНЫХ ОБЪЕКТОВ В УСЛОВИЯХ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ

4.1. Выделение перспективных штаммов микроорганизмов деструкторов нефтяных углеводородов

4.2. Оценка эффективности биопрепарата «Ленойл» для биоремедиации нефтезагрязненных почв 52 4.3. Изучение возможности использования биопрепарата «Ленойл» для биоремедиации отбеливающей земли, содержащей нефтепродукты 58 5. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ БИОПРЕПАРАТА «ЛЕНОЙЛ» ДЛЯ БИОРЕМЕДИАЦИИ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ ОТ НЕФТЯНОГО

ЗАГРЯЗНЕНИЯ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование процессов ремедиации нефтезагрязненных природных объектов с использованием биопрепарата "Ленойл""

Актуальность проблемы. Среди высоко токсичных загрязнителей окружающей среды выделяются нефтепромысловые поллютанты (нефть и продукты ее переработки, нефтяные шламы и т.д.). Наиболее перспективным направлением биоремедиации нефтезагрязненных объектов является применение биологического метода, основанного на использовании биопрепаратов, позволяющих ускорить разложение нефти и нефтепродуктов, не нанося дополнительного ущерба нарушенной экосистеме. На сегодняшний день разработаны и производятся различные биопрепараты, предназначенные для ремедиации природных объектов от последствий загрязнения нефтью и нефтепродуктами. В Институте биологии Уфимского научного центра РАН запатентован в Российской Федерации новый высокоэффективный биопрепарат «Ленойл», созданный на основе консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter spesies (Пат. RU № 2232806). Исследование применимости биопрепарата «Ленойл» в процессах биологической рекультивации почв, содержащих нефть или нефтепродукты, и очистки водных объектов от нефтяного загрязнения является актуальной проблемой.

Цель исследования. Исследование возможности использования нового биопрепарата «Ленойл» для ремедиации нефтезагрязненных почв и водных объектов.

Задачи исследования.

1. Определить спектр окислительной активности консорциума микроорганизмов биопрепарата «Ленойл» и чистых культур микроорганизмов, входящих в его состав, в отношении различных классов углеводородов.

2. Определить эффективность использования биопрепарата «Ленойл» для биологической рекультивации почв, загрязненных нефтью.

3. Провести сравнительную оценку эффективности биопрепарата «Ленойл» относительно известных коммерческих биопрепаратов для очистки нефтезагрязненных почв.

4. Разработать технологию биологической рекультивации техногенного отхода - отработанной отбеливающей земли, содержащей нефтепродукты, с использованием биопрепарата «Ленойл».

5. Разработать способ очистки водных поверхностей от нефтяного загрязнения, основанный на использовании биопрепарата «Ленойл».

Научная новизна. Разработан новый способ очистки водных поверхностей от нефтяного загрязнения, основанный на использовании биопрепарата «Ленойл».

Определены величины окислительной активности консорциума микроорганизмов биопрепарата «Ленойл» и чистых культур микроорганизмов, входящих в его состав, по отношению к нефти и продуктам ее переработки, индивидуальным углеводородам и жирам растительного и животного происхождения.

Практическая значимость. Доказана высокая эффективность использования биопрепарата «Ленойл» для биологической рекультивации различных почв и грунтов, загрязненных нефтью, и очистки водных поверхностей от нефтяного загрязнения.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на I Международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), научно-практической конференции «Теоретические и практические вопросы мониторинга, предупреждения, ликвидации и рекультивации последствий нефтяного загрязнения» (Ханты-Мансийск, 2003), конференции НТО нефтяников и газовиков им. И.М. Губкина «Охрана окружающей среды при освоении углеводородных ресурсов» (Сочи, 2003), XVII Международной научно-технической конференции «Химические реагенты, реактивы и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе патент Российской Федерации.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Нуртдинова, Лариса Амирхановна

ВЫВОДЫ

1. Определена величина окислительной активности консорциума микроорганизмов биопрепарата «Ленойл» и чистых культур микроорганизмов, входящих в его состав, по отношению к нефти, различным нефтепродуктам, а также к жирам растительного и животного происхождения. Показано, что биопрепарат «Ленойл» обладает способностью к окислению широкого спектра углеводородов, как в консорциуме, так и его составляющими, причем наибольшие величины окислительной активности приходятся на консорциум.

2. В модельных экспериментах доказана эффективность использования биопрепарата «Ленойл» для биологической рекультивации почв (выщелоченный чернозем, торф), загрязненных нефтью. Степень биодеградации нефти в почве и торфе при 10%-ном уровне загрязнения составляет за 60 суток, соответственно, 85,3% и 84,3%.

3. В модельных экспериментах проведена сравнительная оценка эффективности биопрепарата «Ленойл» относительно известных коммерческих биопрепаратов для очистки нефтезагрязненных почв. Показано, что биопрепарат «Ленойл» превосходит по эффективности такие известные биопрепараты, как «Деворойл», «Бациспецин» и «Дестройл», способен адаптироваться к высоким дозам нефти и эффективно утилизировать субстрат независимо от типа почв и особенностей загрязнителя.

4. Разработана и апробирована в производственных испытаниях в ОАО «Орскнефтеоргсинтез» технология биологической рекультивации отработанной отбеливающей земли, содержащей нефтепродукты, с использованием консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ-5 в составе биопрепарата «Ленойл».

5. Разработан и запатентован в Российской Федерации новый способ очистки водных поверхностей от нефтяного загрязнения, заключающийся во внесении в загрязненную воду бактериальной культуры, представляющей собой консорциум микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ о

ДТ-5 с общим титром, не менее 10° КОЕ/мл, и принудительной аэрации водного объекта.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нуртдинова, Лариса Амирхановна, Уфа

1. Андресон Р.К., Телин А.Г., Галимзянова Н.Ф., Агафарова Я.М., Багаутдинов Ф.Я., Бойко Т.Ф., Гарипов Т.Т. Биологическая рекультивация почвы, загрязненной нефтью, в промысловых условиях //Защита от коррозии и охрана окружающей среды.-1997.-№ 4-5.-С. 21-23.

2. Аниськина М.В., Тарбаева В.М., Маркарова М.Ю. Биоиндикация как метод оценки генотоксичности нефтяных загрязнений почв// Современные проблемы бтоиндикации и биомониторинга: Тез. докл. XI межд. симп. по биоиндикаторам. Сыктывкар.-2001 .-С.8.

3. Борзенков И.А., Ибатуллин P.P., Милехина Е.И., Сидоров Д.Г., Храмов И.Т., Беляев С.С. Использование микроорганизмов при ликвидации нефтяныхзагрязнений почв //Конф. «Интродукция м-ов в окруж. среду», 17-19 мая, 1994 г.: Тез. докл.-М., 1994.-С. 14-15.

4. Бочарникова Е.А. Влияние нефтяного загрязнения на свойства серо-бурых почв Апшерона и серых лесных почв Башкирии: Автореф. дис. канд. биол. наук.-М., 1990.-16 с.

5. Вельков В.В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы //Биотехнология.-1995.-№ 3-4.-С. 20-27.

6. Вельков В.В. Стандартизация формата описаний промышленных технологий биоремедиации //Биотехнология.-2001.-№2.-С. 70-76.

7. Войкова И.В., Конев Ю.Е. Микробиологическая очистка воды и почвы от нефти и нефтепродуктов //Конф. «Интродукция м-ов в окруж. среду», 17-19 мая, 1994 г.: Тез. докл.-М., 1994.-С. 12-13.

8. Волде М.И. Сапротрофные бактерии в почвах, загрязненных нефтью //Межд. конф. студ. и аспирантов по фундам. наукам «Ломоносов-96», Москва, 1996 г.: Тез. докл. Почвоведение.-М., 1996.-С. 14.

9. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем /Отв. ред. М.А.Глазовская.-М.: Наука, 1988.-264 с.

10. Габбасова И.М., Хазиев Ф.Х., Сулейманов P.P., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф. Стимулирование микрофлоры нефтезагрязненной серой лесной почвы спомощью органических добавок //Башкирский экологический вестник.-1999.-№2(5).-С. 14-18.

11. Гилязов М.Ю. Нефтезагрязненные почвы Республики Татарстан// Агрохимический вестник.-2001 .-№6.-С.21 -24.

12. Головлев Е.Л. Проблемы интродукции микроорганизмов-деструкторов //VI Конф. РФ «Новые направления биотехнологии». 24-26 мая, 1994 г.: Тез. докл.-Пущино, 1994.-С. 4.

13. Головлева Л.А. Микробные методы деконтаминации почв и грунтовых вод //Биотехнология.-1992.-№ 5.-С. 60-64.

14. Головченко А.В., Полянская Л.М. Влияние нефти на численность, биомассу и жизнеспособность грибов в верховых торфяниках// Микробиология. 2001. №1. С.111-117.

15. Голодяев Г.П., Никитина З.И. Состояние интродуцированных популяций нефтеокисляющих микроорганизмов в экосистемах береговой зоны Дальнего Востока //Конф. «Интродукция м-ов в окруж. среду», 17-19 мая, 1994 г.: Тез. докл.-М., 1994.-С.29.

16. Голодяев Г.П., Никитина З.И. Санация нефтезагрязненных почв юга Дальнего Востока //Тез. докл. II Съезда Об-ва почвоведов, Санкт-Петербург, 27-30 июля, 1996 г. Кн. l.-M., 1996.-С. 246-247.

17. Голубовская Э.К. Биологические основы очистки воды.- М.: Высшая школа, 1978.-268 с.

18. Гриценко А.И., Акопова Г.С., Максимов В.М. Экология. Нефть и газ. М.: Наука, 1997.-597 с.

19. Грищенков В.Г., Гаязов P.P., Токарев В.Г., Кочетков В.В., Филонов А.Е., Воронин A.M. Бактериальные штаммы-деструкторы топочного мазута: характер деградации в лабораторных условиях //Прикладная биохимия и микробиология.-1997.-Т. 33, № 4.-С. 423-427.

20. Драчук С.В., Кошкарова Н.В., Фирсов Н.Н. Микрофлора почв, загрязненных нефтепродуктами// Экология. 2002. №2. С. 148-150.

21. Дядечко В.Н., Толстокорова JI.E., Гашев С.Н. О биологической рекультивации нефтезагрязненных песочных почв Среднего Приобья //Почвоведение.-1990.-№> 9.-С. 148-151.

22. Егоров Н.С., Олескин А.В., Самуилов В.Д. Биотехнология. Проблемы и перспективы. М., 1987.-459 с.

23. Еловикова Е.А. Иммунофлуоресцентный анализ в экологических исследованиях бактерий рода Rhodococcus //IV Молод, науч. конф. Ин-та биол. «Актуальные проблемы биологии», Сыктывкар, 11-12 апр., 1996: Прогр. и тез.-Сыктывкар, 1996.-С. 44.

24. Биотехнология: состояние и перспективы развития» (10-14 ноября 2003 г., Москва). М.-2003.-Ч. 2.-С. 27.

25. Жегневская Л.В., Барахнина В.Б. Изучение биодеградации углеводородовнефти //Матер. 47 научн-техн. конф. студ., аспирантов и мол. ученых Уфим.гос. нефт. техн. ун-та, Уфа, 1996 г., Т. l.-Уфа, 1996.-С. 124.

26. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии.-М.: МГУ.1980.-233 с.

27. Звягинцев Д.Г., Гузев B.C., Левин С.В., Селецкий Г.И., Оборин А.А. Диагностические признаки различных уровней загрязнения почвы нефтью// Почвоведение.-1989.-№ 1 .-С.72-78.

28. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы /Под ред. Дж.Вудворда. М., «Мир».-1988.-215 с.

29. Каталог культур микроорганизмов.-Пущино-Москва, 1992.-363 с. Квасников Е.И., Ключникова Т.М. Микроорганизмы деструкторы нефти в водных бассейнах.-Киев: Наукова думка, 1981.-165 с.

30. Киреева Н.А. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. -Уфа: БашГУ, 1994.-172 с.

31. Киреева Н.А. Деструкция нефти в почве культурами углеводородокисляющих микроорганизмов //Биотехнология.-1996.-№1 .-С. 51-54.

32. Киреева Н.А. Состояние комплекса актиномицетов нефтезагрязненных почв //Вестн. Баш. ун-та.-1996.-№ 1.-С. 42-45.

33. Киреева Н.А., Водопьянов В.В., Мифтахова A.M. Влияние нефтяного загрязнения на целлюлазную активность почв// Почвоведение.-2000.-№6.-С.748-753.

34. Киреева Н.А., Водопьянов В.В., Мифтахова A.M. Биологическая активность нефтезагрязненных почв.-Уфа: Гилем, 2001.-376с.

35. Киселева Н.И., Марченко А.И., Воробьев А.В., Жариков Г.А. Изучение влияния фенантрена на рост растений// Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды: Тез. докл. конф. Пущино: ИФБМ РАН, 2001.-С.82-83.

36. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Семененко М.Н. Определение активности углеводородокисляющих бактерий с использованием н-алканов, меченых тритием //Прикладная биохимия и микробиология.-1988.-Т. 24, № 2.-С. 203207.

37. Коронелли Т.В. Экофизиологические основы и практический опыт интродукции углеводородокисляющих бактерий в природные экосистемы //Конф. «Интродукция м-ов в окружающую среду». 17-19 мая 1994 г.: Тез. докл.-М., 1994.-С. 53.

38. Кожевин П.А. Экология микроорганизмов: эксперименты в природе //Природа.-1985.-№ 7.-С. 78.

39. Логинов О.Н., Бойко Т.Ф., Подцепихин А.К. Очистка отвалов отработаннойотбеливающей земли //II Всероссийская научн-практ. конф. «Отходы 2000»ноябрь 2000 г., Уфа), тез. докл., Уфа, 2000.-Т. З.-С. 105-107.

40. Логинов О.Н., Костюченко В.П., Комаров С.И., Бойко Т.Ф., Подцепихин А.К.

41. Технология биологической очистки отвалов отработанной отбеливающейземли//Нефтепереработка и нефтехимия.-2000, № 11.-С. 18-20.

42. Логинов О.Н., Бойко Т.Ф., Костюченко В.П., Комаров С.И., Подцепихин А.К.,

43. Галимзянова Н.Ф. О биологической очистке технологических отвалов отнефтепродуктов //Почвоведение.-2002, № 4.-С. 481-486.

44. Уфа.-2002.-Т. 1.-С. 178-179.

45. Логинов О.Н., Васильева Н.С., Силищев Н.Н., Бойко Т.Ф. Технологические аспекты опытно-промышленного производства биопрепарата-нефтедеструктора «Ленойл» //Башкирский химический журнал.-2003.-Т. 10, № 4.-С. 76-77.

46. Мац А.А., Мурыгина В.П., Ивашко Р.С., Мещерская М.В. Биодеградация углеводородов Rhodococcus sp. (R. ruber) 1418 и Rhodococcus sp. (R. erythropolis) 1715 //Конф. «Интродукция м-ов в окружающую среду». 17-19 мая 1994 г.: Тез. докл.-М., 1994.-С. 68-69.

47. Методы общей бактериологии. В 3 т. /Под ред. Ф.Герхардта и др.-М.:Мир, 1984.-Т. 1-3.

48. Методы почвенной микробиологии и биохимии /Под ред. Д.Г. Звягинцева.-М.:Изд-во Моск. ун-та, 1991.-304 с.

49. Миронова Р.И., Носкова В.П., Расулова Г.Е., Холоденко В.П. Биодеградация и биосорбция плавающей нефти природными микромицетами //Биотехнология.-1996.-№ 7.-С. 44-48.

50. Мордухова Е.А., Кочетков В.В., Поликарпова Ф.Я. и др. Синтез индолил-3-уксусной кислоты ризосферными псевдомонадами: Влияние плазмид биодеградации нафталина //Прикладная биохимия и микробиология.-1998.-Т. 34, №3.-С. 287-292.

51. Мукашева Т.Д., Шигаева М.Х. Биодеградация тенгизской нефти местными штаммами микроорганизмов //Материалы I Межд. Конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития» (14-18 октября 2002 г., Москва). М., 2002.-С. 475.

52. Муратова А.Ю., Турковская О.В. Деградация минеральных масел селекционированной микробной ассоциацией //Прикладная биохимия и микробиология.-2001 .-Т. 37, № 2.-С. 175-180.

53. Определитель бактерий Берджи: В 2 т. /Под ред. Дж. Хоулта и др.-М.:Мир, 1997.-Т. 1.

54. Пат. 2019527 Российская Федерация. Способ очистки почв от нефтяных загрязне-ний /Т.В.Коронелли, Э.И.Аракелян, Т.И.Комарова, В.В.Ильинский //Б.И.-1994.-№ 17.

55. Пат. 2023686 Российская Федерация. Консорциум микроорганизмов, используе-мых для очистки почвенных и солоновато-водных экосистем от загрязнения нефтепродуктами /И.А.Борзенков, Е.И.Милехина, С.С.Беляев, М.В.Иванов //Б.И.-1994.-№ 22.

56. Пат. 2053205 Российская Федерация. Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов /М.Д.Белонин, Е.А.Рогозина, Р.М.Свечина,

57. A.В.Хотянович, Н.А.Орлова //Б.И.-1996.-№ 3.

58. Пат. 2077397 Российская Федерация. Способ рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами /Р.К.Андресон, Ф.Х.Хазиев,

59. Плешакова Е.В., Дубровская Е.В., Турковская О.В. Приемы стимуляции аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры// Биотехнология.-2005.-№1.-С.42-50.

60. Пунтус И.Ф., Филонов А.Е., Кошелева И.А., Гаязов P.P., Карпов А.В., Воронин A.M. Выделение и характеристика микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов //Микробиология.-1997.-Т. 66, № 2.-С. 269-272.

61. Разумовская З.Г., Чижик Г.Я., Громов Б.В. Лабораторные занятия по почвенной микробиологии.-Л.:Изд-во Ленингр. ун-та, 1960.-184 с.

62. Рыбальский Н.Г., Лях С.П. Экобиотехнологический потенциал консорциумов микроорганизмов. М.: ВНИИПИ, 1990, 177 с.

63. Сидоров Д.Г., Борзенков И.А., Милехина Е.И., Беляев С.С., Иванов М.В. Микробиологическая деструкция мазута в почве при использовании биопрепарата Деворойл //Прикладная биохимия и микробиология.-1998.-Т. 34, №3.-С. 281-286.

64. Современные методы исследования нефтей /Отв. ред. А.И.Богомолов JL: Изд-во Недра, 1984.-431 с.

65. Солнцева Н.П., Никифорова Е.М. Оценка влияния добычи нефти на почвы Пермского Прикамья// Миграция загрязняющих веществ в почвах и сопредельных средах: Труды V Всес. Совещ. Обнинск 12-15 янв. 1987-г. Л.: Гидрометиздат, 1989.-С.52-62.

66. Соловов В.Л., Новохатко Т.Н., Шумская Г.И. //Тез. докл. конф. «Проблемы, способы и средства защиты окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами». М., 1995.-С. 73-74.

67. Сулейманов С.С. Изменение свойств нефтезагрязненных серых лесных почв при биологической рекультивации. Автореф. дисс. . канд. с/х. наук. Уфа. 1999. 24с.

68. Суржко Л.Ф., Финкельштейн З.И., Баскунов Б.П., Янкевич М.И., Яковлев

69. B.И., Головлева Л.А. Утилизация нефти в почве и воде микробными клетками //Микробиология.-1995.-Т. 64, № З.-С. 393-398.

70. Сэги Йожеф Методы почвенной микробиологии.-М.: Изд-во Колос, 1983.-296 с.

71. Тишкина Е.И. Влияние нефтяного загрязнения на свойство серых лесных почв Предуралья и пути восстановления их плодородия: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Воронеж: ВГУ, 1990.-23 с.

72. Финкельштейн З.И., Баскунов Б.П., Алиева P.M., Головлев Е.Л., Головлева Л.А. Микробная деградация нефти и нефтепродуктов //Биотехнол. защиты окруж. среды: Тез. докл. конф., Пущино, 18-19 окт., 1994 г.-Пущино, 1994.-С. 5-6.

73. Хазиев Ф.Х., Мукатанов А.Х., Хабиров И.К. Почвы Башкортостана. Уфа. 1995.-384 с.

74. Хмельницкий Р.А., Бродский Е.С. Масс-спектрометрия загрязнений окружающей среды.-М.: Химия, 1990.-182 с.

75. Щеблыкин И.Н., Биттеева М.Б., Бирюков В.В. //Трубопроводный транспорт нефти.-1995.-№ З.-С. 19-28.

76. Шуру бор Е.В. Полициклические ароматические углеводороды в системе «почва-растение» в районе нефтепереработки (Пермское прикамье)// Почвоведение.-2000.-№ 12 .-С. 1509-1514.

77. Anderson Т.А., White D.C., Walton В.Т. Degradation of hazardous organic compounds by rhizosphere microbial communities //Biotransformations: microbial degradation of health risk compounds. Amsterdam: Elsever Science, 1995.-P. 205225.

78. Atlas R.M. Microbial hydrocarbon degradation bioremediation of oil spills// J.

79. Chem. Technol. Biotechnol. 1991. №52. P.149-156.

80. Binet Ph., Portal J.M., Leyval C. Fate of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in the rhizosphere and mycorrhizosphere of ryegrass //Plant and Soil.-2000.-№ 227.-P. 207-213.

81. Boopathy R. Factors limiting bioremediation technologies //Bioresource Technology.-2000.-Vol. 74.-P. 63-67.

82. Bossert, I., Bartha R. The fate of petroleum in soil ecosystems// Petroleummicrobiology. New York: Macmillan Publishing Co., 1984.-P. 435-473.

83. Bowen G.D., Rovira A.D. The rhizosphere, the hidden half //Plant roots: thehidden half. New York: Marcel Dekker, 1991.-P. 641-649.

84. Buyanosky G.A., Kremer R.J., Gajda A.M., Kazemi H.V. Effect of corn plants andrhizosphere populations on pesticide degradation //Bull. Environ. Contam.

85. Toxicol.-1995.-Vol. 55.-P. 689-696.

86. Burd G., Ward O.P. Bacterial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons on agar plates: The role of biosurfactants //Biotechnol. Techn.-1996.-Vol. 10, № 5.-P. 371-374.

87. Dakora F.D., Phillips D.A. Root exudates as mediators of mineral acquisition in low-nutrient environments //Plant and Soil.-2002.-Vol. 245.-P. 35-47.

88. Field J.A., Jonf E.D., Costa G.F., Bont J.A. Biodegradation of polyaromatic hydrocarbons by new isolates of white rot fungi// Appl. Environ. Microbiol.-1992.-V58, №7.-P. 2219-2226.

89. Gibson D.T. Microbial degradation of organic compounds. N.-Y.- Basel: Marcel Dekker Inc., 1984.-536 p.

90. Kramer U., Chardonnens A.N. The use of transgenic plants in the bioremediation of soils contaminated by trace elements //Appl. Microbiol. Biotechnol.-2001.-№55.-P. 661-672.

91. Margesin R., Zimmerbauer A., Schinner F. Monitoring of bioremediation by soil biological activities //Chemosphere.-2000.-Vol. 40.-P. 339-346.

92. Meagher R.B. Phytoremediation of toxic elemental and organic pollutants //Curr. Opin. Plant Biol.-1999.-№3 .-P. 519-524.

93. Piutti S., Hallet S., Rousseaux S., Philippot L., Soulas G., Martin-Laurent F. Accelerated mineralisation of antrazine in maize rhizosphere soil //Biol. Fertil. Soils.-2002.-№36.-P. 434-441.

94. Pothuluri J.V., Freeman J.P., Evans F.E., Cerniglia C.E. Fungal metabolism of acenaththene by Cunninghamella elegans //Applied and Environmental Microbiology.-1992.-Vol. 58.-P. 3654-3659.

95. Prenafeta-Boldu F. X., Kuhn A., Luykx D., Anke H., van Groenestijn J. W., de Bont J. A. M. Isolation and characterisation of fungi growing on volatile aromatic hydrocarbons as their sole carbon and energy source// Mycol. Res.-2001.-V105.-P.477-484.

96. Reilley K.A., Banks M.K., Schwab A.P. Dissipation of polycyclic aromatic hydrocarbons in the rhizosphere //J. Environ. Qual.-1996.-Vol. 25, № 2.-P. 212219.

97. Solnseva N.P. Oil pollution of soils: Geochemical aspects and ecology //Global Changes and Geogr.: 16 U Conf., Moscow, Aug. 14-18, 1995. Abstr.-Moscow, 1995.-P. 404.

98. Sugiura К., Ishihara M., Shimauchi Т., Harayama S. Physicochemical properties and biodegradability of crude oil //Environ. Sci. and Technol.-1997.-Vol. 31, № 1.-P. 45-51.

99. Tiehm A. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in the presence of synthetic surfactans //Appl. and Environ. Microbiol.-1994.-Vol. 60, № l.-P. 258263.