Новые микробиологические препараты для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды

Логинов, Олег Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новые микробиологические препараты для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Новые микробиологические препараты для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды"

На правах рукописи

ЛОГИНОВ ОЛЕГ НИКОЛАЕВИЧ

НОВЫЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ВОССТАНОВЛЕНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Специальность: 03.00.23 - «Биотехнология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

I Щелково-2004

2005-4 12343

На правах рукописи

ЛОГИНОВ ОЛЕГ НИКОЛАЕВИЧ

НОВЫЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ВОССТАНОВЛЕНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Специальность: 03.00.23 - «Биотехнология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Щелково - 2004

Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра РАН и ГУП «Опытный завод Академии Наук Республики Башкортостан»

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Мелентьев Александр Иванович

Официальные оппоненты: Вахитов Венер Абсатарович,

доктор биологических наук, профессор Воробьева Галина Ивановна, доктор биологических наук, профессор Гоготов Иван Николаевич, доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: Центр Биоинженерии РАН, г. Москва

Защита состоится 9 сентября 2004 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности Россельхозакадемии по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево ВНИТИБП РАСХН

С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности

Автореферат разослан Зо о/2004 :

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

«*ОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ | БИБЛИОТЕКА

ЛПОТЕКА

Ю.Д. Фролов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Техногенная нагрузка на почву, интенсивность которой имеет тенденцию к возрастанию, оказывает негативное влияние на функционирование агроэкосистем. Одним из ведущих факторов, ухудшающих агроэкологические свойства почв, является их загрязнение различными ксенобиотиками. Интенсификация сельскохозяйственного производства предполагает широкое применение пестицидов, что увеличивает опасность загрязнения продуктов растениеводства. Развитие биотехнологических способов защиты сельскохозяйственных растений от болезней связано с разработкой новых биопрепаратов, не только функционально эффективных, но и экологически безопасных как для человека, так и для почвенной микробиоты.

Известно, что некоторые представители бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter выступают в качестве антагонистов широкого спектра фитопатогенных грибов, вызывающих заболевания зерновых и овощных культур. Значительный интерес исследователей вызывает также способность этих микроорганизмов стимулировать рост и развитие растений, усваивать атмосферный азот в процессе своей жизнедеятельности. В связи с этим, разработка и внедрение в сельскохозяйственную практику биологических препаратов и биологических удобрений на основе бактерий Pseudomonas и Azotobacter, приобретает особое значение.

Среди высоко токсичных загрязнителей окружающей среды выделяются нефтепромысловые поллютанты (нефть и продукты ее переработки, нефтяные шламы и т.д.). Наиболее перспективные методы биоремедиации загрязненных объектов основаны на способности различных микроорганизмов усваивать углеводороды нефти. Поэтому поиск их отдельных видов и консорциумов, обладающих высокой скоростью роста, возможностью деструкции различных углеводородов и разработка экономичных, технологически простых в использовании биопрепаратов остается актуальной проблемой.

Цель и задачи исследований. Целью исследований являлась разработка новых биопрепаратов для зашиты сельскохозяйственных растений от болезней и восстановления окружающей среды от последствий нефтяного загрязнения. В соответствии с целью были поставлены основные задачи:

1. Выделить и охарактеризовать новые штаммы бактерий-антагонистов грибных фитопатогенов родов Pseudomonas и Azotobacter.

2. Определить химическую структуру метаболитов с антибиотическими свойствами, продуцируемых бактериями-антагонистами родов Pseudomonas и Azotobacter.

3. Оценить эффективность применения новых штаммов бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter для улучшения развития сельскохозяйственных растений и зашиты их от болезней.

4. Выделить из нефтезагрязненных почв наиболее активные штаммы аборигенных микроорганизмов-деструкторов нефтепродуктов.

5. Разработать биопрепарат на основе этих штаммов и оценить его эффективность для ремедиации почв и водных поверхностей, загрязненных нефтью.

6. Разработать технологическую схему производства биопрепаратов для сельского хозяйства и восстановления окружаюшей среды.

Научная новизна. Из природных и техногенных местообитаний выделена и идентифицирована группа новых штаммов родов Pseudomonas и Azotobacter , проявляюших антагонистическую активность в отношении аэрогенных и почвообитающих фитопатогенных грибов. Штаммы Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, Pseudomonas putida ИБ 17, Azotobacter vinelandii ИБ 1 и Azotobacter vinelandii ИБ 4 запатентованы в Российской Федерации в качестве основы биопрепаратов для защиты растений от грибных инфекций. Показано, что все выделенные штаммы микроорганизмов продуцируют фитогормоны, а штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 предложен в качестве продуцента цитокининов. Штамм Pseudomonas species ИБ 182, обладающий

высокой хитинолитической активностью, может быть использован для получения хитиназ (Пат. РФ № 2187553).

Впервые показано, что бактерии штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, являющиеся основой биопрепарата «Елена», способны продуцировать новый антибиотик, представляющий собой трипептид глицерина и подавляющий развитие фитопатогенных микромицетов.

Впервые определена химическая структура нового антибиотика, продуцируемого бактериями штамма Azotobacter vinelandii ИБ 4, являющихся основой биопрепарата «Азолен» и представляющего собой политиофосфат тетрааминосахарозы.

Выделен и идентифицирован природный консорциум микроорганизмов-нефтедеструкторов, содержащий штаммы бактерий Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3. Указанный консорциум микроорганизмов, являющийся основой биопрепарата «Ленойл», обладает высокой деструктивной активностью по отношению к нефти и нефтепродуктам (Решение Роспатента от 14.01.2004 о выдаче Патента РФ по заявке № 2002121985/13).

Разработаны новые способы очистки водных поверхностей от нефти и нефтепродуктов, биологической рекультивации отбеливающей земли, содержащей нефтепродукты, основанные на использовании биопрепарата «Ленойл» (Решение Роспатента от 10.06.2004 о выдаче Патента РФ по заявке № 2002132519/13; Решение Роспатента от 21.04.2004 о выдаче Патента РФ по заявке № 2002135839/13).

биологической рекультивации отбеливающей земли, являющейся крупнотоннажным отходом нефтепереработки. Разработан и внедрен на ГУП «Опытный завод Академии Наук Республики Башкортостан» технологический регламент опытно-промышленного производства новых биопрепаратов. Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- новые штаммы бактерий Рзеиёошопаз аигеоГашеш и Рз. рийда, обладающие комплексом свойств, положительно влияющих на развитие растений;

- новые штаммы бактерий ЛгоЛоЬайег уте1апёи, обладающие совокупностью полезных свойств, стимулирующих развитие растений;

- структура и свойства новых метаболитов РвРЯ микроорганизмов, обладающих антагонистической активностью по отношению к фитопатогенам;

- новый природный консорциум микроорганизмов-нефтедеструкторов, способный окислять углеводороды как алифатического, так и ароматического ряда;

- методы концентрирования биомассы в процессе производства биопрепаратов для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды.

Апробация результатов. Основные результаты исследований были представлены на Международной научно-практической конференции «Хозяйственно-питьевая и сточные воды: проблемы очистки и использования» (Пенза, 2000), Всероссийской конференции «Почва, жизнь, благосостояние» (Пенза, 2000), Международной научно-практической конференции «Промышленные и бытовые отходы: проблемы хранения, захоронения, утилизации, контроля» (Пенза, 2000), II Всероссийской научно-практической конференции «Отходы-2000» (Уфа, 2000), XIV Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2001), VI Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях» (Москва, 2001), XV Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2002), I Международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), Все-

российской научно-практической конференции «Роль средств химизации в повышении продуктивности агроэкосистем» (Уфа, 2003), II Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2003), Семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2003» (Пущино, 2003), II Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), II Всероссийской научной Мегле^конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем» (Уфа, 2003), научно-практической конференции «Теоретические и практические вопросы мониторинга, предупреждения, ликвидации и рекультивации последствий нефтяного загрязнения» (Ханты-Мансийск, 2003).

Публикации. Основные результаты исследований изложены в 62 научных публикациях, включая 10 патентов Российской Федерации.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из двух томов. Том I содержит введение, обзор литературы, экспериментальную часть (5 глав), заключение, выводы, список цитируемой литературы; том II содержит 36 приложений. I том работы изложен на 296 страницах, содержит 72 таблицы и 22 рисунка. Список цитируемой литературы включает 343 наименования, из них 199 на русском языке.

Личный вклад автора. Автору принадлежит формулирование проблемы, постановка целей и задач, планирование экспериментов. Он принимал личное участие на всех этапах исследований, в обобщении и интерпретации полученных результатов, в подготовке научных публикаций.

В работе использованы материалы, полученные аспирантами и соискателями, проводившими исследования под руководством автора.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам лаборатории биологически активных веществ с.н.с, к.т.н. Силищеву Н.Н., н.с, к.б.н. Свешниковой Е.В., м.н.с. Четверикову С.П., м.н.с. Пугачевой Е.Г.,

аспиранту Васильевой Н.С., сотрудникам лаборатории прикладной микробиологии с.н.с, к.б.н. Бойко Т.Ф., с.н.с, к.б.н. Галимзяновой Н.Ф. за постоянную помощь в проведении экспериментов и обсуждении результатов. Автор выражает огромную признательность главному агроному Мелеузовского района РБ Хадыеву И.Р., доценту Башкирского государственного аграрного университета, к.б.н. Исаеву Р.Ф., зам. директора ГУСП «Рощинский» Маслову В.М., начальнику отдела по внедрению новых технологий ГУП «Совхоз Алексеевский» Майстренко Т.Г. за содействие в проведении полевых экспериментов, коллективу проектного и производственно-технического отделов, механической службы ГУП «Опытный завод АН РБ» за содействие в организации производства опытных партий биопрепаратов. Автор сердечно благодарит свою жену Светлану за терпение и моральную поддержку в выполнении данной работы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили микроорганизмы родов Pseudomonas, Azotobacter, Bacillus, Arthrobacter, выделенные из различных источников в лаборатории биологически активных веществ Института биологии УНЦ РАН. В качестве тест-объектов при скрининге антагонистических свойств служили различные фитопатогенные грибы из коллекции Института биологии и Всероссийской коллекции микроорганизмов. Физиолого-биохимические свойства выделенных микроорганизмов изучали общепринятыми методами (Герхардт, 1984; Скворцова, 1981). Идентификацию бактерий проводили по определителю бактерий Берджи.

Способность образовывать ауксины и цитокинины у псевдомонад и азотобактера определяли с помощью иммуноферментного анализа по методу Ку-дояровой Г.Р. и др. (1986). Способность к гидролизу хитина и фосфатов изучали по стандартным методикам (Герхардт, 1984).

Выделение метаболитов бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter, проявляющих активность к фитопатогенам, осуществляли по оригинальной методике, разработанной в лаборатории БАВ ИБ УНЦ РАН. Активность метаболитов определяли по способности подавлять развитие гриба Bipolaris sorokiniana в жидкой среде Чапека. Степень очистки метаболитов Pseudomonas определяли методом адсорбционной ВЭЖХ с использованием колонок Ultrasphere Si с подвижной фазой вода + аммиак (рН 7,4), детектирование проводили по УФ-поглощению при 220 нм. Оценку очистки метаболитов Azotobacter проводили при помощи ВЭЖХ на колонке в системе с

подвижной фазой ацетонитрил: вода = 75 :25, детектор - рефрактометр.

Аминокислотный состав метаболитов Pseudomonas определяли на анализаторе Г339М (ЧССР), ИК-спектры записывали на спекрофотометре Specord M 80 (Германия) в области 400-4000 см-1 (в вазелиновом масле или в тонком слое). Спектры ЯМР 13С регистрировали на спектрометре Bruker AMX-Ш-300 (Германия) при рабочей частоте 300,13 МГц с внутренним стандартом -тетраметилсиланом (ТМС) и растворителем CD3OD. Расшифровку спектров проводили при помощи программы ChemNMR Pro.

Элементный состав метаболитов определяли на С, Н, N - анализаторе HP Model 185 В (США) и по общепринятым методикам (Климова, 1967).

Углеводородокисляющую способность бактерий, входящих в консорциум «Ленойл», определяли титрованием выделившегося и поглощенного щелочью углекислого газа. Количество углеводородов, подвергнувшихся биоконверсии, определяли гравиметрическим способом.

Изучение влияния бактерий Pseudomonas и Azotobacter на растения проводили на злаковых (пшеница сорта «Жница»), овощных (картофель сорта «Невский»). В качестве эталонов средств защиты растений от болезней служили химические протравители Дивидент, Феразим и ТМТД, а также биопрепараты Фитоспорин, Агат-25 и Планриз.

При изучении динамики численности интродуцированных культур Pseudomonas и Azotobacter в ризосфере сельскохозяйственных растений

использовали стрептомицинустойчивый клон Ps. aureofaciens ИБ 51Str+ и ампицилинрезистентный штамм Az. vinelandii ИБ 4amp, сохранившие свойства исходных штаммов. Учет численности интродуцента и аборигенной микрофлоры проводили методом разведений, производя посев на соответствующие среды (Звягинцев, 1991).

В качестве флокулянтов на стадии выделения биомассы микроорганизмов использовали катионогенный водорастворимый полиэлектролит «Каусто-мин-15» по ТУ 2227-222-00203312-2002 и водорастворимый полимер «Гивпан» по ТУ 2216-00-04698227-99. Время перемешивания культуральной жидкости с флокулянтом составляло 2 мин. Оптическую плотность культуральной жидкости и супернатанта измеряли на фотоэлектроколориметре марки КФК-2 (длина волны 540 нм, толщина кюветы - 1,7 мм). В кювету сравнения вносили супер-натант, полученный при центрифугировании культуральной жидкости на лабораторной установке марки ОПн-8УХЛ 4.2 (число оборотов — 8000 об/мин, время центрифугирования - 20 мин).

Статистическую обработку результатов проводили по стандартным компьютерным программам.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Скрининг природных бактерий pp. Pseudomonas и Azotobacter -антагонистов фитопатогенов, и изучение их агробиотехнологических свойств, оказывающих влияние на растения.

С точки зрения агробиотехнологии микроорганизмы, входящие в состав биопрепаратов, должны проявлять различные механизмы положительного влияния на растения. Во-первых - продукция различных метаболитов, непосредственно стимулирующих развитие растений и, во-вторых, -©посредственная стимуляция роста растений за счет подавления развития почвенных фитопатогенов.

Методом накопительных культур из почвенных образцов, отобранных в различных районах Республики Башкортостан, а также из сточных вод биологических очистных сооружений г.Орска и г.Стерлитамака выделено 8 штаммов-антагонистов, 5 из которых были отнесены к роду Pseudomonas и 3 — к роду Azotobacter. По совокупности культуральных и физиолого-биохими-ческих характеристик 2 штамма были идентифицированы как Pseudomonas aureofaciens (ИБ 51, ИБ 6), 2 штамма- как Pseudomonas putida (ИБ 56, ИБ 17), 3 штамма - как Azotobacter vinelandii (ИБ 1, ИБ 3, ИБ 4), для штамма Pseudomonas sp. ИБ 182 видовая принадлежность не определена.

Для исследования антагонистических свойств выделенных культур микроорганизмов был определен спектр антигрибной активности штаммов (табл. 1). Показано, что все изучаемые штаммы подавляют жизнедеятельность достаточно широкого спектра фитопатогенных и фитотоксичных грибов.

Таблица 1

Размеры зон ингибирования роста грибных фитопатогенов штаммами бактерий pp. Pseudomonas и Azotobacter (третьи сутки инкубации при 28 °С)

Виды фитопатогенных грибов Диаметр зоны ингибирования роста гриба, мм

Р. aureofaciens ИБ 51 Р. aureofaciens ИБ б P.putida ИБ 56 P.putida ИБП Pseudomonas sp. ИБ182 Аz. vinelandii ИБ 1 Az. vinelandii ИБЗ Az. vinelandii ИБ4

Fusarium culmorum 9,2*2,3 21,0*3,2 18,7*1,1 14,3*2,4 18,3*3,2 21,0*2,1 22,0±3,0 20,0±2,5

Fusarium eibbosum 35,1*2,7 10,3*3,4 12,2*2,3 12,5*3,3 8,4*2,1 20,5*1,9 6,0*2Д 18,0*2,2

Fusarium eraminearum 7,4*1,1 - - - - 11,3*1,5 8,5±2,4 14,4*1,4

Fusarium nivale 31,4*2,3 18,8*3,1 10,0*2,1 12,8±2,7 10,0±3,3 9,0*1,7 5,5±2,3 9,5±0,5

Fusarium OXYSDOrum 29,1 ±2,5 10,2±2,8 7,4±1,3 11,0±3,9 10,5*2,2 12,7*2,2 - 10,4±2,1

Fusarium semitectum 9,3*1,7 14,5*3,4 22,3*3,8 26,7±4,9 15,3±1,1 15,0*2,0 19,5*1,6 14,2*1,1

Fusarium solani 9,1*2,3 10,1*2,7 12,1±2,7 12,3*2,5 13,7±2,2 12,5*2,1 12,0*1,3 9,0*0,5

Fusarium avenaceum 16,1*2,5 8,2*3,2 8,2*1,4 9,3±2,5 9,4*1,1 18,0*1,3 12,0*1,7 19,0*2,3

Bipolaris sorokiniana 33,7*3,3 35,0*1,5 30,3*4,7 25,0*2,3 25,0*3,3 28,0*2,0 19,7±2,5 21,0*2,1

Alternaria alternate 19,2*3,5 15,5*1,2 14,0*3,3 18,0*2,2 14,0*2,5 30,0*4,3 12,0*2,1 14,0*2,0

Penicillium funiculosum 31,7*3,2 - 10,0*2,6 14,5*2,4 - 11,0*3,3 21,0*1,5 14,0*1,6

- отсутствие зоны подавления роста тест-гриба

Важным фактором при разработке биопрепаратов, используемых в сельскохозяйственной практике в качестве биологических средств защиты растений от фитопатогенов, а также биопрепаратов, стимулирующих рост и повышающих продуктивность растений, является определение комплекса свойств, присущих ризосферным микроорганизмам.

С применением известных методик выделенные штаммы бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter были описаны с точки зрения этих свойств, характерных для PGPR-микроорганизмов (Plant Growth Promoting Rhizobacteria -ризобактерии, способствующие росту растений) (табл. 2).

Среди исследованных штаммов наибольшей фитогормональной активностью обладают штаммы P.aureofaciens ИБ 51, P.aureofaciens ИБ 6, Azotobacter vinelandii ИБ 1. Штаммы P. putida ИБ 56, P. putida ИБ 17 и Pseudomonas sp. ИБ 182, Az. vinelandii ИБ 4 могут растворять неорганические фосфаты. Штаммы Azotobacter vinelandii ИБ 1, ИБ 3, ИБ 4 отличаются высокой степенью нитрогеназной активности. Штамм Pseudomonas sp. ИБ 182 также обладает нитрогеназной и кроме того, хитинолитической активностью.

Таким образом, у новых штаммов бактерий pp. Pseudomonas и Azotobacter выявлен комплекс свойств, положительно влияющих на рост и развитие растений, а также предупреждающих развитие инфекций, вызываемых грибными фитопатогенами.

Таблица 2

Характеристика выделенных штаммов pp. Pseudomonas и Azotobacter

Штаммы Цитокинин-подобные вещества, нг/мл КЖ ИУК, нг/мл КЖ Нитрогеназная активность, мкг Ыг/мл/час Хитиноли- тическая активность Растворение минеральных фосфатов

P.aureofaciens ИБ 51 205 878 0,08 - -

P.aureofaciens ИБ 6 680 511 - - -

Р. putida ИБ 56 40 38 - - +

Р. putida ИБ 17 - 255 - - +

Pseudomonas sp. ИБ 182 18 - 0,430 + +

Az. vinelandii ИБ 1 290 490 0,634 - -

Az. vinelandii ИБ 3 78,5 - 0,608 - -

Az. vinelandii ИБ 4 119 - 0,620 - +

2. Выделение, очистка и характеристика метаболитов псевдомонад и

азотобактера, обладающих фунгицидной активностью.

У бактерий p. Pseudomonas, в отличие от представителей Azotobacter, наиболее широко изучены свойства, характеризующие способность подавлять или замедлять рост почвенных фитопатогенов. Механизмы антагонистических взаимодействий псевдомонад и фитопатогенов различны. Это продукция сидерофоров, отвечающих за связывание и транспорт железа, и синтез антибиотических веществ. Нам представлялось наиболее интересным изучить вторичные метаболиты как псевдомонад, так и азотобактера с точки зрения их антагонистической активности к фитопатогенам. Для этого были апробированы собственные схемы выделения и очистки метаболитов, обладающих фунгицидной активностью.

Схема выделения и этапы очистки метаболитов, обладающих фунгицидной активностью, продуцируемых бактериями pp. Pseudomonas и Azotobacter представлены в табл. 3.

2.1.Аминокислотный и элементный составы метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью

Изучение свойств пептидных факторов, продуцируемых штаммом Bacillus sp. 739 (Широков А.В. и др.), показало, что активность пептидного метаболита с массой до 3 KDa не зависит в значительной мере от температуры. А максимум активности для изучаемых метаболитов штаммов P. aureofaciens ИБ 51, P. aureofaciens ИБ 6 и P. putida ИБ 17 наблюдался в диапазоне температур 25 - 60°С. При температуре 70°С происходила их значительная термоинактивация. В связи с этим можно было предположить, что метаболиты изучаемых псевдомонад имеют сложную координированную пептидную природу. Это предположение было подтверждено данными аминокислотного анализа гидролизатов изучаемых метаболитов. Данные аминокислотного и элементного

анализов (табл. 4, 5) также показали, что метаболиты изучаемых штаммов неидентичны по своему составу, различие составляет в одну аминокислоту, чем и определяется разница в их молекулярных массах.

В состав метаболита штамма P. aureofaciens ИБ 51 входит 19 аминокислот, штаммов ИБ 6 и ИБ 17 - по 18 аминокислот. В основном аминокислотные составы схожие, за некоторым исключением. У метаболита штамма Р. aureofaciens ИБ 51 в составе не наблюдается лейцина, который присутствует в составе метаболитов штаммов ИБ 6 и ИБ 17, а аспарагиновая кислота и треонин присутствуют в удвоенном количестве.

2.2. ИК- иЯМР 13С- спектроскопия метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью

Сравнение спектров выделенных метаболитов, полученных экспериментально, с расчетными данными в ChemNMR Pro позволило составить их предполагаемую конфигурацию, изображенную на рис. 1.

Анализ данных ИК- и ЯМР |3С- спектроскопии показал, что молекулы изучаемых метаболитов содержат глицериновый остов, что характеризуется наличием химических сдвигов (ХС) 65 и 74 м.д. и характерными полосами поглощения в ИК -спектрах на 2968 и 1408 см"1. К молекуле глицерина через эфирные атомы кислорода посредством карбонильных групп (1044 см"', 170 м.д.) присоединены три полипептидные цепочки, на наличие которых указывает увеличение площади пиков аминогрупп (3100-3200 см-1) и изменение пропускания в области 1500 характерной для аминных и ацетамидных групп.

Этапы очистки метаболитов, обладающих фунгицидной активностью, бактериями pp. Pseudomonas и Azotobacter

Таблица 3

продуцируемых

Этап Штамм Объем, мл; Вес, г АСВ, % АСВ общ., г Активность Степень очистки Выход по активности, % Выход по АСВ, %

Всего ед. ед./г АСВ

Супернатант КЖ P. aureofasiens ИБ51 2000 2,18 43,600 4000 91,743 1 100 100

Р. aureofasiens ИБб 2000 2,15 43,000 4000 93,023 1 100 100

P. putida ИБ17 2000 2,20 44,000 4000 90,909 1 100 100

Az. vinelandii ИБ4 2000 1,25 25,000 800 32,000 1 100 100

Ультрафильтрация P. aureofasiens ИБ51 1600 0,85 13,600 3200 235,294 3 80 31

P. aureofasiens ИБ6 1600 0,78 12,480 3200 256,410 3 80 29

P. putida ИБ17 1600 0,80 12,800 3200 250,000 3 80 29

Az. vinelandii ИБ4 1600 0,65 10,400 640 61,538 2 80 42

Концентрирование упариванием под вакуумом P. aureofasiens ИБ51 100 12,8 12,880 3125 242,624 3 78 29

P. aureofasiens ИБ6 100 12,2 12,250 3125 255,102 3 78 28

P. putida ИБ17 100 12,3 12,300 3125 254,065 3 78 28

Az. vinelandii ИБ4 105 9,74 10,227 628 61,406 2 79 41

Осаждение метанолом P. aureofasiens ИБ51 80 10,1 8,144 3077 377,824 4 77 19

P. aureofasiens ИБ6 85 9,20 7,820 3091 395,269 4 77 18

P. putida ИБ17 80 9,90 7,920 3077 388,510 4 77 18

Az. vinelandii ИБ4 1,5 99,0 1,485 6

Осаждение ацетоном P. aureofasiens ИБ51 8,1 72,5 5,873 3000 510,812 6 75 13

P. aureofasiens ИБб 9,2 57,8 5,319 3067 576,612 6 76 12

P. putida ИБ17 8,8 58,8 5,181 2933 566,107 6 73 12

Таблица 4

Эквимолярное содержание аминокислот в структуре триглицеридпептидов, продуцируемых псевдомонадами

Эквимолярное содержание аминокислот в

Аминокислота триглицеридпептиде культуры

ИБ 17 ИБ 51 ИБ 6

Аспарагиновая 1 2 1

килота

Треонин 1 2 1

Серии 1 1 1

Глутаминовая 2 2 2

кислота

Пролин 2 2 2

Глицин 4 4 4

Алании 2 2 2

В алии 1 1 1

Метионин 1 1

Лейцин 1 - 1

Лизин 1 1 1

Гистидин 1 1 1

Таблица 5

Элементный состав метаболитов, обладающих фунгицидной активностью бактерий рр. Рзеиёошопаз и АгсЛоЬайег

Элемент Содержание элемента (%) в составе метаболита культуры

Р. ашш1а-скпБ ИБ51 Р.риМа ИБ17 Р. аигасГа-с1еш ИБ6 Ал ■текпёи ИБ1 А/. ■утекпёп ИБЗ А/. ■утекМИ ИБ4

Углерод 48,6 50,2 50,0 5,2 14,3 3,5

Водород 6,4 6,5 6,6 1,6 3,0 17

Азот 16,0 16,1 16,1 0,1 0,1 1,5

Сера 17 1,8 1,8 12,2 6,8 5,1

Фосфор - - - 34,1 22,5 34,2

Рис. 1. Пространственная конфигурация молекулы триглицеридпептида псевдомонад

2.3. Элементный состав, ИК- и ЯМР13С- спектроскопия метаболитов Агс^оЬайег уте1ашШ, обладающих фунгицидной активностью

Результаты спектрального анализа метаболитов, продуцируемых штаммами Аг^оЪайег уте1аш!и, представлены в табл. 6. Наличие в спектрах ЯМР 13С химических сдвигов 62,2; 63,0; 66,8; 71,7; 71,8; 78,9; 106,1 м.д. показывает, что основу метаболитов составляет молекула сахарозы, аминированная, в четырех положениях. На наличие аминогрупп указывают характерные полосы поглощения в ИК-спектре на 2800-3200 см-1, а также данные элементного анализа, представленные в табл. 5. Так как фосфат- и сульфатионов в исследуемых веществах обнаружено не было, то учитывая результаты элементного анализа и полос в ИК-спектре, характерных для Р- и 8-связей (1296 СМ1),, можно говорить о наличии в структуре метаболитов

политиофосфатного "хвоста" различного состава для каждого штамма, а предполагаемую структуру самих метаболитов можно представить в виде политиофосфатов тетрааминосахарозы (рис. 2).

Таблица 6

Результаты спектрального анализа метаболитов, продуцируемых штаммами Azotobacter vinelandii

Данные ЯМР ^ Данные ИК-

Хим.сдвиг , Хим.сдвиг Волновое число Функциональная

эксперимент, м.д. расчет, м.д. ИК- спектра, см-1 группа

62,2 62,2 2800-3300 Амино

63,0 62,3 724 С-Н

66,8 67,7 1296 CH3-X(X=P,S)

71,7 и 71,8 71,8 и 71,9

74,8 и 76,5 74,7

78,9

83,4 и 83,8

94,6 92,3

106,1 103,2

Рис. 2. Вероятная структура антигрибных метаболитов, продуцируемых штаммами Azotobacter vinelandii

Присутствие в структуре метаболитов полифосфатного "хвоста" косвенным образом согласуется с данными о том, что бактерии рода Azotobacter при росте на молекулярном азоте в латентной фазе образуют значительное количество высокомолекулярных кислотонерастворимых полифосфатов, которые служат резервом фосфора и энергии, а также

используются для регенерации АТФ. При активации синтетических процессов или при фосфорном голодании клетки, накопленные полифосфаты могут потребляться на синтез различных органических веществ, возможно, и веществ с антибиотическими свойствами.

2.4. Антигрибная активность триглицеридпептидов Pseudomonas и политиофосфата тетрааминосахарозы Azotobacter

В связи с тем, что выделенные триглицеридпептиды и политиофосфаты тетрааминосахарозы являются новыми группами метаболитов бактерий pp. Pseudomonas и Azotobacter, было интересно определить величину их фунгицидной активности и соотнести ее с таковыми известных метаболитов бактерий рода Bacillus, обладающих антигрибной активностью.

Методом разведений выявлена минимальная ингибирующая концентрация для ряда фитопатогенных грибов (табл. 7), которая является сопоставимой с величинами ингибирования фитопатогенов известными бациллярными пептидными метаболитами.

Таблица 7

Спектр фунгицидной активности метаболитов, продуцируемых бактериями pp. Pseudomonas, Azotobacter и Bacillus

Штамм -продуцент Минимальная ингибирующая концентрация подавления следующих видов патогенных грибов, мг/мл

Fusarium culmorum Fusarium gibbosum Fusarium oxysporum Fusarium solani Fusarium semitectum Fusarium avenaceum Fusarium moniliforme Helmintho- sporium sativum Altemaria alternata Pénicillium funiculosum

Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 0.1-0.2 0.5-0.6 >1 0.5-0.6 0.5-0.6 0.5-0.6 0.8-1.0 0.1-0.2 0.3-0.4 " 0.3-0.4

Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 0.1-0.2 0.5-0.6 0.5-0.6 0.1-0.2 0.5-0.6 0.2-0.3 0.8-1.0 0.1-0.2 0.3-0.4 0.3-0.4

Pseudomonas putida ИБ 17 0.1-0.2 0.3-0.4 >1 0.5-0.6 0.2-0.3 0.3-0.4 0.3-0.4 0.1-0.2 >1 0.2-0.3

Azotobacter vinelandii ИБ 4 >1 >1 >1 >1 >1 >1 >1 0.5-0.6 >1 >1

Bacillus sp. 739 (фракция 0-20 кДа) 0.2-0.3 0.3-0.4 0.5-0.7 0.5-0.7 0.8-1.0 0.2-0.3 0.5-0.7 0.5-0.7 0.8-1.0 -

Bacillus sp. 739 (фракция 0-3 кДа) 0.1-0.2 0.2-0.3 0.2-0.3 0.2-0.3 0.1-0.2 0.1-0.2 0.5-0.7 0.2-0.3 0.3-0.4 -

3. Оценка эффективности применения выделенных штаммов бактерий pp. Pseudomonas и Azotobacter для защиты растений от болезней и повышения урожайности сельскохозяйственных культур

Эффективность предпосевной бактеризации семян яровой пшеницы для защиты от корневых гнилей оценена в полевом мелкоделяночном эксперименте. Кроме того, изучено влияние интродукции бактерий-антагонистов на аборигенную микробиоту ризосферы пшеницы.

По результатам опыта наиболее эффективными культурами показали себя штаммы P. aureofaciens ИБ 51, Az. vinelandii ИБ 1 и Az. vinelandii ИБ 4 (табл. 8). Биологическая эффективность данных микроорганизмов по защите пшеницы от корневых гнилей составила на период уборки урожая 15,7%, 12,3 % и 10,4%, соответственно, по сравнению с контролем. Необходимо подчеркнуть, что предпосевная обработка семян пшеницы культурами штаммов P. aureofaciens ИБ 51, Pseudomonas sp. ИБ 182, Az. vinelandii ИБ 1, Az. vinelandii ИБ 3, Az. vinelandii ИБ 4 не только способствовала снижению заболевания растений корневыми гнилями, но и положительно повлияла на элементы структуры урожая (в результате применения биопрепаратов отмечено увеличение длины растений, числа колосков в колосе, массы 1000 зерен) и урожай в целом. Кроме того, было установлено, что в варианте с обработкой семян штаммом P. aureofaciens ИБ 51 содержание белка в зерне по сравнению с контролем увеличилось на 13,3%, в варианте с использованием штамма Az. vinelandii ИБ 4 - на 6,1%.

При исследовании динамики численности отдельных групп ризосфер-ной микробиоты выявлено, что интродукция бактерий-антагонистов в ризосферу являлась возмущающим фактором для двух сообществ - микромице-тов и спорообразующих микроорганизмов. Причем численность грибов на ранних стадиях развития растений при интродукции снизилась, а количество бактерий рода Bacillus - возросло. Показано также, что интродуцированные

Таблица 8

Влияние бактеризации семян пшеницы сорта Жница штаммами-антагонистами рода Pseudomonas на элементы структуры урожая и поражение растений корневыми гаилями

« 05

8 О.

0 «

s к

I §

I |

tr S

8.Н

8 а

I §

F *

'S i

ß" а■

си

си § о с

¡4 О

■81

S.S

о w к

Q S в>

<2 Е §

Контроль

90,1±2,6

5,4±0,7

9,б±0,7

15,3±3,1

33,5±2,1

33,4±2,2

57,7±7,9

20,4±1,2

Фнтоспорин

0,5

85,9*1,9

5.1*0,2

9,2±0,1

11,9±1,9

Зб,5±5,5

27,3±7,б

61,91:4,1

23,1±1,8

Агат-25К

0,04

91,2± 12,5

5,0±1,б

10,2±2,2

11,5±4,8

3б,3±б,3

28,2±8,9

53,9*8,9

22,2±4,3

Феразим

94,2*22,1

б,1±0,5

18,0±3,4

35,3±4,9

Р. aureofaciens ИБ 51

104

6,2±0,5

18,2±2,4

58,б±3,4

Р. aureofaciens ИБ 6

104

93,3+24,0

5,9±0,9

10,7±3,1

17,4+5,9

37,5±14,9

28,0±4,б

5б,б±6,9

21,1±1,5

Р. putida ИБ 17

10"

99,4± 13,3

5,4±1,0

11,6±5,1

15,8±3,7

34,9*4,9

32,4±8,7

53,9±5,4

Pseudomonas sp. 182

ИБ

10"

б,0±0,2

18,9±4,8

38,б±3,3

32,0±5,6

55,4±7,б

20,б±5,9

Az. vinelandii ИБ 1

104

97,9±9,36

5,7±1,б

16,5±4,1

54,7±5,4

5,1

Az. vinelandii ИБ 3

10'

5,1±1,2

18,0±4,5

3,1

Az. vinelandii ИБ 4

104

5,9±0,2

16,9*2,6

15,9

♦различия по сравнению с Контролем существенны при р=0,95.

штаммы-антагонисты не оказывали подавляющего влияния на других представителей аборигенной бактериальной микробиоты ризосферы пшеницы.

Применение биологического метода в борьбе с головневыми инфекциями зерновых культур достаточно редко становилось объектом изучения исследователей. Целью следующих экспериментов была оценка эффективности применения биопрепаратов на основе штаммов бактерий рода Pseudomonas для подавления твердой головни пшеницы.

При проведении опыта на пшенице в закрытом грунте с искусственным заражением семян установлено, что предпосевная обработка семян биопрепаратами вызывала значительное снижение поражения растений твердой головней с биологической эффективностью 14,7-81,9 % (табл. 9). Отмечено, что при использовании биопрепаратов на основе псевдомонад из расчета 104 КОЕ/семя (I) биологическая эффективность защиты была значительно ниже, чем в варианте 106 КОЕ/семя (II) или вообще отсутствовала. Анализ данных по урожаю зерна показал, что использование биопрепарата Фитоспорин и штамма P. aureofaciens ИБ 51 (II) позволило увеличить собранный урожай на 38,9% и 72,2 %, соответственно.

В условиях полевого эксперимента, по сравнению с испытаниями в закрытом грунте эффективность биологических средств защиты в подавлении твердой головни пшеницы снизилась. Максимум биологической эффективности в борьбе с болезнью был отмечен для биопрепаратов на основе штаммов P. putida ИБ 17 (II) и P. aureofaciens ИБ 51 (II) - 40,7 % и 29,3%, соответственно.

Таким образом, показано, что бактерии-антагонисты рода Pseudomonas, могут быть эффективно использованы для защиты яровой пшеницы от твердой головни.

Целью дальнейшего исследования была оценка возможности использования изучаемых штаммов бактерий p. Pseudomonas и Azotobacter для защиты картофеля от ризоктониоза.

*различия по сравнению с Контролем существенны при р=0,95.

Как видно из табл. 10, предпосадочная обработка клубней картофеля сорта Невский штаммами P.auгeofaciens ИБ 51, P.putida ИБ 6, Az.vinelandii ИБ 1, Az.vinelandii ИБ 4 привела к значительному снижению поражения проростков ризоктониозом. а для штамма ИБ 4 была отмечена стимуляция роста, которая выражалась в увеличение длины проростков по сравнению с контрольным вариантом в 1,72 раза.

Таблица 10

Эффективность подавления развития ризоктониоза картофеля сорта Невский штаммами-антагонистами

*различия по сравнению с Контролем существенны при р=0,95; нд-нет данных.

Таким образом, в вегетационных и полевых мелкоделяночных опытах доказана эффективность применения штаммов pp. Pseudomonas и Azotobacter для защиты пшеницы от корневых гнилей, твердой головни, а также против ризоктониоза картофеля. Показано также, что выделенные штаммы псевдомонад и азотобактера стимулируют рост и развитие растений и по эффективности использования на сельскохозяйственных культурах не уступают известным биопрепаратам Фитоспорин, Планриз, Агат-25К.

4. Разработка и испытания нового биопрепарата-нефтедеструктора «Ленойл».

Из серой лесной почвы, искусственно загрязненной дизельным топливом, выделен природный консорциум микроорганизмов, состоящий из двух штаммов бактерий, идентифицированных как Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3.

Результаты определения окислительной активности консорциума микроорганизмов, а также штаммов бактерий, входящих в состав консорциума, по отношению к нефти и различным углеводородам приведены в табл. 11.

Таблица 11

Окислительная способность микроорганизмов консорциума ИБ ДТ 5

Окислительная активность,

Субстрат мг СО2/г субстрата/3 сут.

Arthrobacter sp. Bacillus brevis «Ленойл»

Гептан 77 113 170

Декан 33 104 140

Ундекан 94 161 175

Додекан 116 153 181

Парафин 11 127 77

Церизин 14 18 21

Гексадеканол 91 215 219

Фенол 36 30 43

Циклогексан 99 90 110

Бензол 85 69 96

Толуол 93 81 89

о-Ксилол 76 92 100

Нафталин 88 53 92

Изопропиловый спирт 62 71 89

Нефть 84 112 144

Дизельное топливо 60 138 163

Смазочное масло 99 104 120

Подсолнечное масло 104 116 128

Жир говяжий 148 173 176

Жир свиной 63 172 170

Как следует из представленной таблицы, способностью окислять углеводороды различного химического строения обладают в определенной степени оба штамма бактерий. Величина окислительной активности консорциума микроорганизмов превосходит аналогичный показатель для чистых культур штаммов бактерий, входящих в состав консорциума. При этом и окислительная активность штамма Bacillus brevis отличается более высоким значением, чем у штамма Arthrobacter sp., и является, очевидно, определяющей величиной для всего консорциума в целом. Исключение составляют углеводороды циклической структуры (бензол, толуол, нафталин, циклогексан) - в этих случаях окислительная активность штамма Arthrobacter sp. является превалирующей величиной, превышающей по своему значению аналогичный показатель для Bacillus brevis.

Окисление микроорганизмами различных углеводородов связывается с наличием у них ферментной оксигеназной системы, позволяющей им включать молекулярный кислород непосредственно в углеводород, образуя при этом окисленные соединения. В связи с этим можно предположить, что ферментативные системы микроорганизмов, входящих в состав консорциума, содержат оксигеназы; при этом оксигеназная система штамма Bacillus brevis более специфична для линейных углеводородов, а оксигеназная система штамма Arthrobacter sp. - для циклических углеводородов.

При биохимическом окислении таких субстратов, как нефть и нефтяные фракции, содержащих в своем составе сложные смеси углеводородов различных классов, окислительная активность консорциума микроорганизмов значительно превосходит эту характеристику для каждого из штаммов микроорганизмов, входящих в его состав.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что культуры Bacillus brevis и Arthrobacter species, составляющие консорциум, взаимно дополняют друг друга при окислении сложных углеводородных смесей. Данный консорциум был нами предложен в качестве биологической основы биопрепарата-нефтедеструктора«Ленойл».

В модельном лабораторном эксперименте изучали процессы биодеградации нефти и возможность биологической рекультивации торфа, загрязненного сырой товарной нефтью Правдинского месторождения (АО «Юганскнефтегаз»). Для ускорения биодеградации использовали вышеописанный консорциум микроорганизмов ИБ ДТ 5. Результаты экспериментов приведены в табл. 12.

Таблица 12

Степень биодеградации нефти в торфе

№№ п/п Препарат Исходное содержание нефти в почве, г/кг Степень биодеградации за период времени, мас.%

15 сут 30 сут 45 сут 60 сут

1. Контроль 46,2 16,2 50,6 52,0 52,6

2. ИБ ДТ 5 124,3 70,4 80,9 82,3 83,5

3. ИБ ДТ 5 231,3 26,0 31,9 34,0 37,0

4. ИБ ДТ 5 392,9 25,9 28,6 43,9 45,3

Как показывают результаты экспериментов, интродукция микроорганизмов-деструкторов позволила резко увеличить степень биодеградации углеводородов нефти уже в начальной стадии проведения эксперимента; так, если степень биодеградации в течение 15 суток в контроле (т.е. под действием аборигенной микрофлоры) составляла всего 16,2 мас.%, то при внесении консорциума микроорганизмов ИБ ДТ 5 этот показатель для 10%-ного уровня загрязнения увеличивался до 70,4 мас.%. При этом полная степень биодеградации за эксперимент длительностью 60 сут составила 83,5 мас.%. Необходимо отметить, что испытанный консорциум микроорганизмов способен эффективно снижать содержание нефти в почве и при весьма высоком исходном уровне загрязнения (от 23,1 до 39,2 мас.%) - степень биодеградации в этом случае за 60 сут эксперимента составила от 37,0 до 45,3 мас.%. Полученные результаты свидетельствуют о достаточно высокой деструктивной активности нового консорциума микроорганизмов.

В модельном эксперименте проведена сравнительная оценка эффективности нового биопрепарата «Ленойл» относительно других коммерческих биопрепаратов для очистки нефтезагрязненных почв. Препаратами-аналогами являлись: Деворойл - консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов pp. Pseudomonas, Rhodococcus и Yarowia; Дестройл - чистая культура нефтеокисляющих микроорганизмов p. Acinetobacter sp.; Бациспецин - биопрепарат на основе штамма Bacillus sp. 739.

В табл. 13 представлены результаты определения хода деградации нефти в черноземе выщелоченном.

Максимальная скорость утилизации углеводородов была отмечена в первые 15 суток эксперимента во всех вариантах опыта. Исключение составили варианты, загрязненные высокой дозой нефти (30%) при использовании препаратов "Ленойл" и "Бациспецин", в первом случае максимум утилизации приходился на 30 сутки, во втором — на 45 сутки.

Динамика скорости деградации углеводородов несколько отличалась по вариантам и зависела как от концентрации нефти, так и от вида препарата.

В табл. 14 представлены данные по изучению эффективности «Ленойла» для очистки от нефти торфяно-глеевой почвы, характерной для районов Зап. Сибири. Наибольшая скорость деградации нефти в торфе, также как и в почве, наблюдалась через 15 суток инкубации для всех биопрепаратов. Следует отметить, что только "Бациспецин" обеспечивал возрастание скорости деградации в течение всего срока наблюдений при среднем и максимальном уровнях загрязнения торфа.

По эффективности разложения нефти при 10 и 20 % уровнях загрязнения препараты расположились как в черноземе выщелоченном, так и в торфе в одиноковом порядке: "Ленойл', "Деворойл", "Дестройл', "Бациспецин"; при 30% загрязнении в черноземе выщелоченном: "Ленойл", "Бациспецин", "Дестройл", 'Деворойл"; в торфе — "Ленойл', "Деворойл", "Бациспецин", "Дестройл" (табл. 15).

Исследования, проведенные в модельных условиях, показали, что биопрепараты, содержащие ассоциации микроорганизмов ("Деворойл", "Ленойл") способны адаптироваться к высоким дозам нефти, эффективно утилизировать субстрат независимо от типа почв и особенностей загрязнителя. Биопрепараты — монокультуры ("Бациспецин", "Дестройл"), очевидно, целесообразно использовать при концентрациях поллютантов не более 10 %.

Разработан способ рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами, путем внесения в почву добавки, содержащей микроорганизмы активного ила биологических очистных сооружений и оксигенные соединения, отличающийся тем, что в качестве добавки дополнительно используют биомассу микроорганизмов биопрепарата «Ленойл», вносимой в количестве 3-5 мас.% по отношению к активному илу.

Реализация разработанного способа рекультивации на отвалах ОАО «Орскнефтеоргсинтез», где в 2002-2003 гг. по указанной технологии было обработано 15,0 тысяч тонн отбеливающей земли, показала, что степень биодеградации нефтепродуктов на этом объекте составила 69,9-74,3 мас.%.

Скорость деградации нефти в почве при различных уровнях загрязнения.

Таблица 13.

Степень загрязнения, % "Деворойл" "Ленойл" "Дестройл" "Бациспецин"

Сутки Сутки Сутки сутки

15 30 45 60 15 30 45 60 15 30 45 60 15 30 45 60

Остаточное содержание нефти, г/кг 10 37,6 29,1 26,1 19,4 42,4 31,2 21,0 14,7 45,9 28,3 27,4 27,1 71,2 58,4 43,2 36,7

20 135 ПО 90,6 76,4 138 99,7 89,4 59,7 141 109 97,5 87,2 168 137 ПО 104

30 261 224 198 176 269 216 187 156 263 249 235 220 288 259 229 205

Скорость биодеградации, (г/Кг/сутки) 10 4,16 0,57 0,2 0,45 3,8 0,75 0,68 0,42 3,6 1,17 0,06 0,02 1,9 0,85 1,01 0,43

20 4,33 1,67 1,29 0,95 4,13 2,55 0,69 1,98 3,93 2,13 0,77 0,69 2,13 2,07 1,8 0,4

30 2,6 2,46 1,73 1,47 2,07 3,53 1,93 2,07 2,47 0,93 0,93 1,0 0,8 1,93 2,06 1,6

Таблица 14

Скорость деградации нефти в торфе при различных уровнях загрязнения.

Степень загрязнения, % "Деворойл" "Ленойл" "Дестройл" "Бациспецин"

Сутки Сутки Сутки сутки

15 30 45 60 15 30 45 60 15 30 45 60 15 30 45 60

Остаточное содержание нефти, г/кг 10 39,6 30,7 28,0 20,4 46,8 23,2 19,9 15,7 44,6 28,1 28,0 27,0 76,2, 64,5 51,7 42,2

20 146 98,6 89,4 81,2 158 101 88,4 66,2 158 110 96,2 82,2 187 170 148 124

30 261 231 210 198 275 220 191 165 264 253 239 229 291 267 239 210

Скорость биодеградации (г/кг/сутки) 10 4,0 0,59 0,18 0,51 3,54 1,57 0,22 0,28 3,69 1,10 0,007 0,07 1,59 0,78 0,85 0,63

20 3,60 3,16 0,61 0,55 2,80 3,80 0,84 1,48 2,80 3,20 0,92 0,93 0,87 1,13 1,47 1,60

30 2,60 2,00 1,40 0,80 1,67 3,67 1,93 1,73 2,40 0,73 0,93 0,67 0,60 1,60 1,87 1,93

Таблица 15

Степень биодеградации нефти в почве и торфе (%) за 60 суток эксперимента

Препараты Степень загрязнения, % Степень биодеградации нефти, %

Почва Торф

"Деворойл" 10 80,6 79,6

20 61,8 59,4

30 4,2 34,0

"Ленойл" 10 85,3 84,3

20 70,2 66,9

30 47,9 45,0

"Дестройл" 10 72,9 73,0

20 56,4 58,9

30 26,8 23,6

"Бациспецин" 10 63,3 57,8

20 47,8 38,0

30 31,6 30,0

5. Опытно-промышленное производство биопрепаратов для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды

Широкомасштабное использование в сельском хозяйстве биопрепаратов на основе бактерий Pseudomonas и Azotobacter сдерживается отсутствием стандартной технологии их производства. При этом технологическая стадия концентрирования биомассы микроорганизмов из культуральной жидкости при производстве различных биопрепаратов является определяющей для экономики этих процессов. Результаты расчетов капитальных и эксплуатационных расходов технологического процесса промышленного производства биопрепарата «Елена» приведены в табл. 16 для трех вариантов осуществления стадии выделения биомассы: вакуумная выпарка КЖ, микрофильтрация КЖ и седиментационное

осаждение КЖ с использованием флокулянта. Полученные данные свидетельствуют о том, что наименьшая величина как капитальных, так эксплуатационных расходов связана с вариантом седиментационного метода выделения биомассы.

Таблица 16

Результаты расчетов капитальных и эксплуатационных расходов технологического процесса промышленного производства биопрепарата «Елена»

Варианты осуществления стадии выделения

биомассы микроорганизмов из культуральной

жидкости

Показатель седиментация

вакуумная выпарка микрофильтрация с использованием флокулянта

1. Стоимость оборудования и СМР, руб. 6722500 6478500 5510000

2. Сырье, руб./т 12345 12339 12586

3. Энергоресурсы (электроэнергия, пар, вода техническая), руб./т 1319 994 632

4. Заработная плата с начислениями, руб./т 5672 3807 2779

5. Заводская себестоимость, руб./т 48935 37055 30499

В связи с этим разработан способ выделения биомассы микроорганизмов-антагонистов фитопатогенов с использованием в качестве флокулянта водорастворимого полимера «гивпан», представляющего собой продукт гидролиза полиакрилонитрильного сополимера акрилонитрила с метакрилатом.

Использование разработанного способа не снижает антагонистическую активность выделяемых микроорганизмов, обуславливающую основную функцию биопрепаратов на их основе.

Графическая интерпретация результатов экспериментов по осаждению биомассы микроорганизмов с использованием гивпана в качестве флокулянта приведена на рис. 3.

Процесс седиментации под действием флокулянта для различных бактериальных суспензий имеет свои особенности. Так, бактериальные суспензии, содержащие биомассу псевдомонад, сравнительно быстро и довольно четко (процент осветления на уровне 90%) разделимы на супернатант и осажденную биомассу. Время, необходимое для концентрирования биомассы микроорганизмов из той или иной культуральной жидкости с указанным уровнем процента осветления, зависит от особенностей ее физико-химического состава и составляет в условиях эксперимента от 100 мин для Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 до 150 мин для Pseudomonas putida ИБ 17 и 220 мин для Pseudomonas aureofaciens ИБ 6. При этом концентрация флокулянта для достижения необходимого результата должна составлять 0,5-0,8 мас.% от культуральной жидкости. В эксперименте по концентрированию биомассы микроорганизмов, полученной при культивировании штамма Azotobacter vinelandii ИБ 1, степень осветления культуральной жидкости в процессе флокуляции не превысила 70% (рис. 3, г), что, очевидно, связано с наличием в культуральной жидкости экзополисахаридов, секретируемых этим штаммом в процессе ферментации и значительно повышающих вязкость культуральной жидкости.

Рис. 3. Характеристика процесса выделения биомассы из культуральной жидкости Р8. аигео!ас1еш ИБ 17(а), Р8. рийда ИБ 51(6), Р8. аигео1ас1епз ИБ 6(в) и Azotobacter уте1апёи(г) под действием флокулянта гивпан при его содержании: 1 - нативная культуральная жидкость; 3 - 0,3%; 5 - 0,8%. 2-0,1%; 4-0,5%;

Для концентрирования биомассы консорциума микроорганизмов биопрепарата «Ленойл» использован катионогенный водорастворимый полиэлектролит Каустомин-15, представляющий собой поли-К, Ы-диметил-Ы-(2-гид-рокси)-пропиламмоний хлорид. Использование процесса флокуляции при осаждении консорциума микроорганизмов с применением Каустомина-15 (0,1% об.) позволяет за время, равное 95 мин практически полностью (на 99%) выделить биомассу, сохраняя при этом стабильность видового состава микроорганизмов-нефтедеструкторов (рис. 4).

Рис. 4. Характеристика процесса выделения биомассы микроорганизмов биопрепарата "Ленойл" из культуральной жидкости под действием флокулянта Каустамин-15 при его содержании:

1-0,01%; 4-0,5%;

2- 0,06%; 5- 0,8%.

3- 0,1%;

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Развитие биотехнологических методов в растениеводстве и ремедиации природных объектов связано с разработкой новых микробиологических препаратов, целенаправленно улучшающих воздействие на окружающую среду.

Применение биопрепаратов для сельского хозяйства, обладающих комплексным действием и сочетающих свойства антагонистов фитопатогенов, а также стимулирующих рост и развитие растений, позволяет не только предотвратить развитие инфекций, но и значительно повысить урожайность злаковых и овощных культур. Следует отметить при этом, что использование биопрепаратов на основе таких типичных представителей почвенной микробиоты, какими являются бактерии родов Pseudomonas и Azotobacter, не нарушает экологического равновесия в аборигенном сообществе почвенных микроорганизмов. Таким образом, применение в сельском хозяйстве биопрепаратов «Елена» и «Азолен», отвечающих всем этим принципам, на наш взгляд, будет весьма перспективно.

Эффективность применения биопрепаратов для ремедиации техногенно нарушенных природных объектов и, в частности, для восстановления нефтезагряз-ненных почв и грунтов в значительной степени зависит от обоснованности выбора микроорганизмов-нефтедеструкторов, составляющих основу таких препаратов. Использование для интродукции в нефтезагрязненный объект консорциумов микроорганизмов - деструкторов нефти и нефтепродуктов, являющихся естественными природными симбиотическими ассоциациями различных штаммов микроорганизмов, позволяет эффективно осуществлять биологическую рекультивацию такого сложного техногенного отхода нефтепереработки, каким является отбеливающая земля, содержащая в своем составе как смолистые вещества, так и полициклические ароматические углеводороды. Применение для восстановления окружающей среды биопрепарата «Ленойл», основу которого составляет природный консорциум микроорганизмов-нефтедеструкторов, позволит эффективно снижать токсическое действие отходов нефтепереработки и нефтедобычи.

ВЫВОДЫ

1. Из природных мест обитания выделены, идентифицированы и охарактеризованы как PGPR (Plant growth promoting rhizobacteria) новые штаммы бактерий: Pseudomonas sp. ИБ 182, Ps. aureofaciens ИБ 6 и ИБ 51, Ps. putida ИБ 17 и ИБ 56, Azotobacter vinelandii ИБ 1, ИБ 3 и ИБ 4 для получения препаратов против грибных инфекций растений и повышения урожая.

2. Выделен и охарактеризован новый природный консорциум нефтеокис-ляющих микроорганизмов, представленный бактериями Bacillus brevis и Arthrobacter sp., как биологическая основа препаратов для рекультивации нефтезагрязненных почв и водных поверхностей.

3. Обнаружены ранее неописанные антигрибные соединения, продуцируемые бактериями рода Pseudomonas, по химической природе относящиеся к триглицеропептидам.

4. Обнаружена новая группа антигрибных веществ, продуцируемых бактериями вида Azotobacter vinelandii ИБ 1, ИБ 3, ИБ 4 которые, согласно данным физико-химических методов анализа, представляют собой политиофосфаты тетраминосахарозы.

5. В вегетационных и полевых мелкоделяночных опытах доказана эффективность использования новых штаммов псевдомонад и азотобактера для защиты посевов пшеницы от корневых гнилей, твердой головни, альтернариоза, а также овощных культур: огурца от бактериозов, фасоли -от корневой гнили, картофеля - от фитофтороза и черной парши.

6. Выявлено стимулирующее воздействие предложенных новых штаммов псевдомонад и азотобактера на рост и развитие растений пшеницы и качество урожая. Применение биопрепаратов «Елена» (на основе Ps. aureofaciens ИБ 51) и «Азолен» (на основе Az. vinelandii ИБ 4) способствовало повышению содержания белка в зерне на 13,3% и 6,1%, соответственно.

7. Разработаны способы рекультивации отработанной отбеливающей земли, загрязненной нефтяными маслами, и водных поверхностей от нефтяных загрязнений с использованием консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ-5 в составе биопрепарата «Ленойл».

8. Разработан новый способ концентрирования биомассы микроорганизмов с использованием флокулянтов, экономически и технологически наиболее приемлемый для производства биопрепаратов «Елена», «Азолен» и «Ленойл».

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ

Производственные испытания биопрепаратов «Елена» и «Азолен» подтвердили эффективность их применения на посевах яровой пшеницы сортов Казахстанская-10 (СПК «Нугуш», Мелеузовский р-н Республики Башкортостан), Симбирка (СПК им. Салавата, Мелеузовский р-н, РБ), на озимой пшенице сорта Безенчукская-380, горохе, картофеле (там же) и на томатах в защищенном грунте сортов Гамаюн (совхоз «Рощинский», г.Стерлитамак) и Энерго (совхоз «Алексеевский», г.Уфа).

Внедрение новых способов рекультивации в ОАО «Орскнефтеоргсинтез», основанных на использовании препарата «Ленойл» и активного ила БОС, позволило за период 2002-2003 гг. осуществить очистку более 15 тыс. тонн отбеливающей земли, являющейся техногенным отходом нефтепереработки.

По результатам исследований разработана и утверждена в установленном порядке следующая нормативно-техническая документация:

- ТУ 9291-016-22657427-2002. Биопрепарат «Ленойл»;

- Токсиколого-гигиенический паспорт биопрепарата «Ленойл»;

- Санитарно-эпидемиологическое заключение на биопрепарат «Ленойл»;

- Санитарно-эпидемиологическое заключение на ТУ 9291-016-22657427-2002 «Биопрепарат «Ленойл». Технические условия;

- Временный технологический регламент на получение опытной партии биопрепарата «Ленойл» на опытной установке цеха И-10 № ВР-1-02;

- Руководящий документ (РД). Технологические приемы, повышающие эффективность биологического разложения отходов, содержащих сырую нефть и нефтепродукты;

- Проект биологической рекультивации отходов, содержащих нефтепродукты, на территории отвалов ОАО «Орскнефтеоргсинтез» с заключением государственной экологической экспертизы, санитарно-эпидемиологическим заключением и заключением санитарно-эпидемиологической экспертизы градостроительной и проектной документации;

- Свидетельство на товарный знак «Ленойл» № 253033;

- Рабочий проект. Опытно-наработочная установка получения сухого биопрепарата «Ленойл». Раздел 4. Технологические решения. Пояснительная записка.

- Экологический сертификат соответствия биопрепарата «Ленойл»;

- ТУ 9291-017-22657427-2002. Биопрепарат «Елена», Ж.

- Санитарно-эпидемиологическое заключение Главного государственного санитарного врача РФ на фунгицид Биопрепарат «Елена, Ж».

- На производственных площадях ГУП «Опытный завод Академии Наук Республики Башкортостан» спроектирована и принята в эксплуатацию опытно-промышленная установка по производству биопрепаратов. За период 2002-2003 гг. на установке осуществлена наработка биопрепаратов «Ленойл» в количестве 250 тонн, «Елена» - 2 тонны, «Азолен» - 200 кг.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Логинов О.Н., Усанов Н.Г., Мелентьев А.И. Штамм бактерий Bacillus sp. для получения препарата против грибных возбудителей болезней злаковых культур //Патент РФ № 1743019, Б.И. № 14,1994.

2. Логинов О.Н., Силищев Н.Н., Бойко Т.Ф., Галимзянова Н.Ф. Биотехно-логиические методы очистки окружающей среды от техногенных загрязнений //Гос. изд-во научн-техн. лит-ры «Реактив», Уфа.-2000.-99 с.

3. Логинов О.Н., Костюченко В.П., Комаров СИ., Бойко Т.Ф., Подцепихин А.К. Технология биологической очистки отвалов отработанной отбеливающей земли //Нефтепереработка и нефтехимия.-2000, № 11.-С. 18-20.

4. Логинов О.Н., Мелентьев А.И., Силищев Н.Н., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф., Свешникова Е.В. Роль бактерий-антагонистов фитопатогенов в защите сельскохозяйственных растений от болезней //Изд-во «Гилем».-Уфа.-2001.-66 с.

5. Логинов О.Н., Костюченко В.П., Комаров СИ., Силищев Н.Н., Бойко Т.Ф., Подцепихин А. К. Способ рекультивации отбеливающих земель, загрязненных нефтепродуктами //Патент РФ № 2183142, Б.И. № 16, 2002. '

6. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Силищев Н.Н., Мелентьев А.И., Галим-зянова Н.Ф., Бойко Т.Ф. Штамм бактерий Pseudomonas species - продуцент хитинолитических ферментов //Патент РФ № 2187553, Б.И. № 23,2002.

7. Логинов О.Н., Бойко Т.Ф., Костюченко В.П., Комаров СИ., Подцепихин А.К., Галимзянова Н.Ф. О биологической очистке технологических отвалов от нефтепродуктов /ЛПочвоведение.-2002, № 4.-С 481-486.

8. Широков А.В., Мелентьев А.И., Логинов О.Н., Актуганов Г.Э. Белковые и пептидные факторы Bacillus sp. 739 - ингибиторы роста фитопатогенных грибов //Прикладная биохимия и микробиология.-2002.-Т. 38, № 2.-С. 161165.

9. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Исаев Р.Ф., Силищев Н.Н., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф. Биопрепараты против твердой головни пшеницы //Защита и карантин растений.-2002, № 9.-С. 39.

10. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Силищев Н.Н., Мелентьев А.И., Га-лимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф. Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами //Патент РФ № 2203945, Б.И. № 13,2003.

11. Логинов О.Н., Чураев Р.Н., Силищев Н.Н., Фатихова Р.Г., Назаров А.М., Базунова М.В., Смолянец Е.Ф., Рагулин В.В. Реагент для подавления роста микроорганизмов //Патент РФ № 2211315, Б.И. № 24,2003.

12. Логинов О.Н., Пугачева Е.Г., Исаев Р.Ф., Силищев Н.Н., Бойко Т.Ф., Галимзянова Н.Ф. Биологические средства защиты картофеля от болезней //Аграрная наука.-2003, № 7.-С. 24.

13. Кузьмина Л.Ю., Логинов О.Н., Бойко Т.Ф., Исаев Р.Ф., Свешникова Е.В., Мелентьев А.И. Эффективность бактериальных препаратов при защите растений яровой пшеницы от твердой головни //Сельскохозяйственная биология.-2003, № 5.-С. 69-73.

14. Свешникова Е.В., Логинов О.Н., Исаев Р.Ф., Силищев Н.Н., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф. Для борьбы с болезнями картофеля //Защита и карантин растений.-2003, № 10.-С. 35.

15. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Силищев Н.Н., Мелентьев А.И., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф., Исаев Р.Ф. Штамм бактерий Pseudomonas putida для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами //Патент РФ № 2213774, Б.И. № 28,2003.

16. Логинов О.Н., Силищев Н.Н., Погосова СВ. Технологические аспекты опытно-промышленного производства биопрепарата на основе бактерий рода Pseudomonas //Башкирский химический журнал.-2003-Т. 10, № 4.-С. 73-75.

17. Логинов О.Н., Четвериков СП. Биосинтез низкомолекулярных метаболитов бактериями Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 //Биотехнология.-2003, № 5.-С 22-25.

18. Пугачева Е.Г., Логинов О.Н., Силищев Н.Н. Новое микробиологическое удобрение Азолен //Материалы Всероссийской научно-практической

конференции «Роль средств химизации в повышении продуктивности аг-роэкосистем» (4-6 июня 2003 г., г.Уфа).-Уфа, БГАУ.-2003.-С. 295-297.

19. Свешникова Е.В., Логинов О.Н., Силищев Н.Н., Хадыев И.Р., Исаев Р.Ф. Новый биопрепарат комплексного действия «Елена» //Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Роль средств химизации в повышении продуктивности агроэкосистем» (4-6 июня 2003 г., г.Уфа).-Уфа, БГАУ.-2003-С. 310-313.

20. Логинов О.Н., Васильева Н.С., Силищев Н.Н., Бойко Т.Ф. Технологические аспекты опытно-промышленного производства биопрепарата-неф-тедеструктора «Ленойл» //Башкирский химический журнал.-2003-Т. 10, № 4.-С. 76-77.

21. Логинов О.Н., Четвериков СП., Гусаков В.Н. Триглицеридпептиды -новая группа антигрибных метаболитов псевдомонад (Pseudomonas) //Доклады Академии Наук.-2003.-Т. 393, № 5.-С. 562.

22. Логинов О.Н., Нуртдинова Л.А., Бойко Т.Ф., Четвериков СП., Силищев Н.Н. Оценка эффективности нового биопрепарата «Ленойл» для биореме-диации нефтезагрязненных почв//Биотехнология.-2004.-№ 1.-С 77-82.

23. Логинов О.Н., Пугачева Е.Г., Силищев Н.Н., Мелентьев А.И., Бойко Т.Ф., Галимзянова Н.Ф. Штамм бактерий Azotobacter vinelandii для получения биопрепарата для борьбы с болезнями пшеницы, вызываемыми грибными фитопатогенами, и повышения урожая //Патент РФ № 2224791, Б.И. № 6, 2004.

24. Логинов О.Н., Силищев Н.Н., Чураев Р.Н., Бойко Т.Ф., Галимзянова Н.Ф., Данилова Е.А., Подцепихин А.К., Султанов И.М., Четвериков СП. Консорциум микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов //Решение Роспатента от 14.01.2004 г. о выдаче Патента РФ по заявке № 2002121985/13.

25. Логинов О.Н., Четвериков СП., Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Высокоэффективная жидкостная хроматография низкомолекулярных бакте-

риальных метаболитов белковой природы, обладающих фунгицидной активностью //Журнал аналитической химии.-2004-Т. 59, № 3-С. 275-279.

26. Логинов О.Н., Васильева Н.С., Силищев Н.Н., Гусаков В.Н. Исследование процесса выделения биомассы микроорганизмов с использованием флокулянта //Биотехнология.-2004.-№ 2.-С. 55-57.

27. Пугачева Е.Г., Логинов О.Н., Четвериков СП., Силищев Н.Н. Изучение влияния условий культивирования на нитрогеназную активность штаммов бактерий рода Azotobacter //Башкирский химический журнал.-2004-Т. 11, № 2.-С. 51-54.

28. Логинов О.Н., Четвериков СП., Гусаков В.Н., Нуртдинова Л.А., Силищев Н.Н. Окислительная активность микроорганизмов биопрепарата «Лен-ойл» //Башкирский химический журнал.-2004.-Т. 11, № 2.-С. 55-57.

29. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Пугачева Е.Г., Шарафутдинов A.M., Силищев Н.Н. Биопрепараты для томатов в защищенном грунте //Аграрная наука.-2004,№3.-С.7-8.

30. Логинов О.Н., Нуртдинова Л.А., Бойко Т.Ф., Силищев Н.Н., Гайсина Х.А., Яковлев В.Н. Новые микроорганизмы-биодеструкторы для рекультивации нефтезагрязненных поверхностей //Интервал.-2004.-№ 1 (60).-с. 39-42.

31. Логинов О.Н., Пилюгин В.В., Костюченко В.П., Комаров СИ., Силищев Н.Н. Способ рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами //Решение Роспатента от 21.04.2004 г. о выдаче Патента РФ по заявке №2002135839/13.

32. Логинов О.Н., Силищев Н.Н., Нуртдинова Л.А., Яковлев В.Н. Способ очистки водных поверхностей от нефтяного загрязнения //Решение Роспатента от 10.06.2004 г. о выдаче Патента РФ по заявке №2002132519/13.

Список тезисов докладов по теме диссертации

1. Логинов О.Н., Фатихова Р.Г., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф., Силищев Н.Н. Микрофлора сточных вод при их биологической очистке //Межд. научн-

практ. конф. «Хозяйственно-питьевая и сточные воды: проблемы очистки и использования (март 2000 г., Пенза), сб. материалов, Пенза, 2000.-С. 120-122.

2. Логинов О.Н., Бойко Т.Ф., Подцепихин А.К., Костюченко В.П., Комаров СИ., Силищев Н.Н. Технология биологической очистки отвалов отработанной отбеливающей земли //Всероссийская конф. «Почва, жизнь, благосостояние» (29-30 марта 2000 г., Пенза), тез. докл., Пенза, 2000.-С. 344-346.

3. Свешникова Е.В., Логинов О.Н., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф. Штамм бактерий Pseudomonas sp., обладающий антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам //Там же, С. 135-136.

4. Широков А.В., Логинов О.Н. Изучение свойств низкомолекулярных фракций вторичных метаболитов Bacillus sp. 739, обладающих фунгицидной активностью //Там же, С. 146-148.

5. Логинов О.Н., Артемова С.А., Дмитриев Ю.К., Бойко Т.Ф., Галимзянова Н.Ф., Силищев Н.Н. Исследование возможности биологической рекультивации шламонакопителя Стерлитамакского БОС ЗАО «Каустик» //Межд. научн-практ. конф. «Промышленные и бытовые отходы: проблемы хранения, захоронения, утилизации, контроля (сентябрь 2000 г., Пенза), тез. докл., Пенза, 2000.-С. 57-59.

6. Логинов О.Н., Бойко Т.Ф., Подцепихин А.К. Очистка отвалов отработанной отбеливающей земли //II Всероссийская научн-практ. конф. «Отходы-2000» (ноябрь 2000 г., Уфа), тез. докл., Уфа, 2000.-Т. З.-С. 105-107.

7. Логинов О.Н., Лакеев С.Н., Силищев Н.Н., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф., Артемова С.А., Дмитриев Ю.К., Ахметзянова Р.Ш., Скачков А.С. Изучение возможности биологической рекультивации шламонакопителя Стерлитамакского БОС ЗАО «Каустик» //Там же, С. 108-110.

8. Свешникова Е.В., Логинов О.Н. Штамм бактерий Pseudomonas putida 56 -антагонист фитопатогенов, проявляющий фитогормональную активность //VI Межд. конф. «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологииях» (26-28 июня 2001 г., Москва, МСХА), тез. докл., М., 2001.-С. 72.

9. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Пугачева Е.Г., Исаев Р.Ф., Силищев Н.Н. Бактеризация картофеля против ризоктониоза //Материалы XV Межд. научн-техн. конф. «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (7-10 октября 2002 г., Уфа). Гос. изд-во научн-техн. лит-ры «Реактив», Уфа.-2002.-Т. 1.-С. 106.

10. Свешникова Е.В., Логинов О.Н. Исследование условий хранения биопрепаратов на основе штаммов псевдомонад //Там же, С. 107-108.

11. Логинов О.Н., Четвериков СП. Разработка методов выделения веществ, обладающих ростстимулирующей и фунгицидной активностью, из культуральной жидкости микроорганизмов рода Pseudomonas //Там же, С. 108.

12. Логинов О.Н., Четвериков СП., Денисов А.А. Промышленное производство биопрепарата-нефтедеструктора «Ленойл» //Там же, С. 178-179.

13. Логинов О.Н., Данилова Е.А., Бойко Т.Ф. Биопрепарат «Ленойл» на основе микроорганизмов-нефтедеструкторов //Там же, С 179.

14. Логинов О.Н., Свешникова Е.В. Использование биопрепаратов для борьбы с твердой головней пшеницы //Материалы I Межд. Конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (14-18 октября 2002 г., Москва), М.,2002.-С 141.

15. Логинов О.Н., Пугачева Е.Г., Четвериков СП. Фунгистатическое и ростстимулирующее действие почвенных свободноживущих азотфиксиру-ющих бактерий рода Azotobacter //Там же, С. 143.

16. Логинов О.Н., Бойко Т.Ф., Данилова Е.А., Галимзянова Н.Ф., Яковлев В.Н., Нуртдинова Л.А. Эффективные микроорганизмы-нефтедеструкторы для биологической рекультивации почв //Там же, С. 294.

17. Логинов О.Н., Четвериков СП. Низкомолекулярные метаболиты Pseudomonas sp., обладающие ростстимулирующей и фунгицидной активностью //Там же, С. 496.

18. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Васильева Н.С, Силищев Н.Н. Биопрепараты в аспекте повышения качества урожая //Материалы II Российской

научн-практ. конф. «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (2-3 июня 2003 г., Москва), М„ РАЕН-МААНОИ.-2003.-С. 89-90.

19. Логинов О.Н., Пугачева Е.Г., Силищев Н.Н. Использование бактерий рода Azotobacter с целью защиты пшеницы от корневых гнилей и для повышения урожая //Там же, С. 96.

20. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Галимзянова Н.Ф. Исследование приживаемости интродуцированных псевдомонад-антагонистов в ризосфере яровой пшеницы //Там же, С. 98-99.

21. Логинов О.Н., Четвериков СП. Низкомолекулярные токсины псевд'о-монад — ингибиторы роста фитопатогенных грибов //Там же, С. 131.

22. Свешникова Е.В., Четвериков СП., Логинов О.Н. Агенты биологического контроля рода Pseudomonas, обладающие нитрогеназной активностью //Материалы II Московского Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (10-14 ноября 2003 г., г.Москва). М.-2003.-Ч. 1. -С. 226-227. ' -

23. Четвериков СП., Логинов О.Н. Новые антигрибные метаболиты пептидной природы Pseudomonas, способные к комплексообразованию с углеводами //Там же, С. 338-339.

24. Пугачева Е.Г., Логинов О.Н., Силищев Н.Н. Возможность использования культуральной жидкости штамма Azotobacter vinelandii ИБ 1, содержащей полисахарид, для повышения процесса нефтеотдачи //Там же, С 328-329.

25. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Четвериков СП., Пугачева Е.Г., Васильева Н.С., Силищев Н.Н. Новые биопрепараты для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды //Тез. докл. семинара-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2003» (2425 ноября 2003 г., г.Пущино, ИБФМ). Пущино.-2003.-С 74-75.

26. Бойко Т.Ф., Галимзянова Н.Ф., Нуртдинова Л.А., Силищев Н.Н., Логинов О.Н. Опыт промышленного использования биопрепарата «Ленойл» для очистки верхового болота от загрязнения //Тез. докл. научн.-практ. конф.

«Теоретические и практические вопросы мониторинга, предупреждения, ликвидации и рекультивации последствий нефтяного загрязнения» (18-20 ноября 2003 г., г.Ханты-Мансийск)

27. Пугачева Е.Г., Четвериков СП., Логинов О.Н., Силищев Н.Н. Исследование нитрогеназной активности бактерий Azotobacter vinelandii //Материалы II Всероссийской научной Internet-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем» (15-30.12.2003 г., г.Уфа). Уфа.-Гос. изд-во научн.-техн. лит-ры «Реактив».-2003.-С. 73.

28. Логинов О.Н., Васильева Н.С., Гусаков В.Н., Силищев Н.Н. Флокулянты в процессе концентрирования биомассы микроорганизмов // Там же, С. 9.

29. Свешникова Е.В., Пугачева Е.Г., Силищев Н.Н., Логинов О.Н. Использование бактериальных препаратов для томатов защищенного грунта //Там же, С. 8.

30. Четвериков СП., Логинов О.Н. Оценка окислительной способности нефти и нефтепродуктов микроорганизмами консорциума «Ленойл» //Там же, С .1О.

Отпечатано в ООО "Мещера" зак. № 102 тир. 100

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Логинов, Олег Николаевич

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биотехнологические методы защиты растений от болезней и повышения урожайности сельскохозяйственных культур.

1.1.1. Бактерии родов Pseudomonas и Azotobacter — антагонисты фи-топатогенных грибов и бактерий.

1.1.2. Бактерии родов Pseudomonas и Azotobacter как представители группы PGPR.

1.1.3. Колонизация ризосферы растений бактериями-антагонистами родов Pseudomonas и Azotobacter.

1.1.4. Применение биопрепаратов на основе псевдомонад и азотобактера для защиты растений от болезней.

1.2. Биотехнологические методы очистки окружающей среды от нефтяного загрязнения.

1.2.1. Влияние нефтяного загрязнения на микробиологические продесссы в почве.

1.2.2. Микроорганизмы - деструкторы нефти и нефтепродуктов.

1.2.3. Бактериальные препараты для интродукции микроорганизмов при ликвидации нефтяных загрязнений.

И. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследований.

2.2. Скрининг штаммов-антагонистов фитопатогенных грибов среди бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter.

2.3. Скрининг микроорганизмов-нефтедеструкторов.

2.4. Изучение фенотипических характеристик выделенных культур.

2.5. Определение у штаммов псевдомонад и азотобактера способности к синтезу фитогормональных веществ.

2.6. Определение нитрогеназной активности штаммов псевдомонад и азотобактера.

2.7. Определение у штаммов псевдомонад и азотобактера способности к разложению соединений фосфора.

2.8. Изучение влияния железа на антифунгальную активность штаммов пседомонад и азотобактера.

2.9. Исследование хитинолитической активности штаммов псевдомонад и азотобактера.

2.10. Изучение антагонистического воздействия штаммов псевдомонад и азотобактера на развитие грибных фитопатогенов.

2.11. Изучение условий культивирования, влияющих на биосинтез метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью.

2.12. Выделение метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью.

2.13. Методы изучения состава и структуры метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью.

2.14. Комплексообразование метаболитов Pseudomonas с углеводами, определение стехиометрии комплексов.

2.15. Изучение ростстимулирующей активности штаммов псевдомонад и азотобактера.

2.16. Изучение оптимальных способов хранения в лабораторных условиях штаммов-антагонистов pp. Pseudomonas и Azotobacter и консорциума микроорганизмов-нефтедеструкторов.

2.17. Исследование эффективности применения штаммов бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter против корневых гнилей пшеницы в лабораторных экспериментах.

2.18. Оценка эффективности применения штаммов бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter против возбудителей корневых гнилей пшеницы в условиях полевого эксперимента.

2.19. Оценка эффективности применения штаммов бактерий рода Pseudo-monas против твердой головни пшеницы в условиях закрытого и открытого грунтов.

2.20. Оценка эффективности применения штаммов бактерий родов Pseudo-monas и Azotobacter в качестве агентов биологического контроля заболеваний овощных культур в лабораторно-вегетационных опытах.

2.21. Характеристика агроклиматических условий вегетационных сезонов.

2.22. Получение антибиотикрезистентных модификаций штаммов Pseudo-monas aureofaciens ИБ 51 и Azotobacter vinelandii ИБ 4.

2.23. Изучение способности к колонизации корней растений у антибиотик-резистентных штаммов Ps. aureofaciens ИБ 51str и Az. vinelandii ИБ 4amp.

2.24. Исследование окислительной активности микроорганизмов — деструкторов нефти и нефтепродуктов.

2.25. Изучение эффективности процесса биодеструкции нефти в лабораторных и полевых экспериментах.

2.26. Исследование процесса концентрирования биомассы микроорганизмов в лабораторных условиях.

2.27. Математическая и статистическая обработка результатов. 96 III. СКРИНИНГ ПРИРОДНЫХ БАКТЕРИЙ РОДОВ PSEUDOMONAS И AZOTOBACTER - АНТАГОНИСТОВ ФИТОПАТОГЕНОВ И ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА В АСПЕКТЕ ОСНОВЫ БИОПРЕПАРАТОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОГО НАЗНАЧЕНИЯ.

3.1. Выделение и фенотипическая характеристика новых штаммов бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter - антагонистов фитопатогенных грибов.

3.2. Характеристика выделенных культур по наличию свойств, положительно влияющих на растение.

3.2.1. Фитогормоны, синтезируемые штамхмами псевдомонад и азотобактера.

3.2.2. Нитрогеназная активность штаммов псевдомонад и азотобактера.

3.2.3. Исследование у штаммов псевдомонад и азотобактера способности к разложению фосфатов.

3.3. Особенности антагонистического действия штаммов псевдомонад и азотобактера на фитопатогенные грибы.

3.4. Изучение ростстимулирующей активности штаммов псевдомонад и азотобактера.

3.5. Выделение, очистка и характеристика метаболитов, обладающих фунгицидной активностью, продуцируемых бактериями pp. Pseudomo-nas и Azotobacter.

IV. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ НОВЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ РОДОВ PSEUDOMONAS И AZOTOBACTER ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ БОЛЕЗНЕЙ И ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЙНОСТИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР.

4.1. Изучение влияния интродукции штаммов-антагонистов родов Pse-udomonas и Azotobacter на аборигенную почвенную микробиоту и колонизирующей способности интродуцированных штаммов.

4.1.1. Изучение влияния интродукции штаммов-антагонистов родов Pseudomonas и Azotobacter на микробиоту ризосферы пшеницы.

4.1.2. Изучение колонизирующей способности штаммов Pseudomonas aureofaciens ИБ 51str и Azotobacter vinelandii ИБ 4amp.

4.2. Изучение эффективности применения штаммов псевдомонад и азотобактера для защиты пшеницы от корневых гнилей, альтернариоза, твердой головни в условиях вегетационных, полевых и производственных испытаний.

4.3. Изучение эффективности применения штаммов псевдомонад и азотобактера в качестве агентов биологического контроля заболеваний овощных культур.

V. РАЗРАБОТКА И ИСПЫТАНИЯ НОВОГО БИОПРЕПАРАТА

НЕФТЕДЕСТРУКТОРА «ЛЕНОИЛ».

5.1. Характеристика нового консорциума микроорганизмов-нефтедеструк-торов.

5.2. Исследование окислительной активности консорциума микроорганиз

5.3. Испытания биопрепарата «Ленойл» для биологической рекультивации нефтезагрязненных объектов.

5.4. Разработка способов ремедиации природных объектов с использованием биопрепарата «Ленойл».

5.5. Разработка нормативно-технической документации на биопрепарат «Ленойл». 232 VI. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ОПЫТНО-ПРОМЫШЛЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА БИОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ-АНТАГОНИСТОВ И МИКРООРГАНИЗМОВ-НЕФТЕДЕСТРУКТОРОВ.

6.1. Исследование процесса выделения биомассы микроорганизмов из куль-туральной жидкости.

6.2. Разработка твердых препаративных форм биопрепаратов.

6.3. Технологическая схема опытно-промышленного производства биопрепаратов. 248 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 252 ВЫВОДЫ 257 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ 259 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 261 ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые микробиологические препараты для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды"

Цель и задачи исследований. Целью исследований являлась разработка новых биопрепаратов для защиты сельскохозяйственных растений от болезней и восстановления окружающей среды от последствий нефтяного загрязнения. В соответствии с целью были поставлены основные задачи:

3. Оценить эффективность применения новых штаммов бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter для улучшения развития сельскохозяйственных растений и защиты их от болезней.

6. Разработать технологическую схему производства биопрепаратов для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды.

Научная новизна. Из природных и техногенных местообитаний выделена и идентифицирована группа новых штаммов родов Pseudomonas и Azotobacter , проявляющих антагонистическую активность в отношении аэрогенных и почвообитающих фитопатогенных грибов. Штаммы Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, Pseudomonas putida ИБ 17, Azotobacter vinelandii ИБ 1 и Azotobacter vinelandii ИБ 4 запатентованы в Российской Федерации в качестве основы биопрепаратов для защиты растений от грибных инфекций. Показано, что все выделенные штаммы микроорганизмов продуцируют фитогормоны, а штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 предложен в качестве продуцента цитокининов. Штамм Pseudomonas species ИБ 182, обладающий высокой хитинолитической активностью, может быть использован для получения хитиназ (Пат. РФ № 2187553).

Выделен и идентифицирован природный консорциум микроорганизмов-нефтедеструкторов, содержащий штаммы бактерий Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3. Указанный консорциум микроорганизмов, являющийся основой биопрепарата «Ленойл», обладает высокой деструктивной активностью по отношению к нефти и нефтепродуктам (Решение Роспатента-от 14.01.2004 о выдаче Патента РФ по заявке № 2002121985/13).

Разработаны новые способы очистки водных поверхностей от нефти, и нефтепродуктов, биологической рекультивации отбеливающей земли, содержащей нефтепродукты, основанные на использовании биопрепарата «Ленойл» (Решение Роспатента от 10.06.2004 о выдаче Патента РФ- по заявке № 2002132519/13; Решение Роспатента от 21.04.2004 о выдаче Патента РФ по заявке №2002135839/13).

Практическая значимость. Разработаны для защиты сельскозяйствен-ных растений и повышения их урожайности новый биопрепарат «Елена» и новое микробиологическое удобрение «Азолен». Проведен комплекс производственных испытаний в условиях открытого и закрытого грунтов, подтвердивших эффективность новых разработок. Разработан для восстановления окружающей среды биопрепарат-нефтедеструктор «Ленойл», биопрепарат используется в настоящее время в ОАО «Орскнефтеоргсинтез» в процессе биологической рекультивации отбеливающей земли, являющейся крупнотоннажным отходом нефтепереработки. Разработан и внедрен на ГУП «Опытный завод Академии Наук Республики Башкортостан», технологический регламент опытно-промышленного производства новых биопрепаратов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- новые штаммы бактерий Pseudomonas aureofaciens и Ps, putida, обладающие комплексом свойств, положительно влияющих на развитие растений;

- новые штамхмы бактерий Azotobacter vinelandii, обладающие совокупностью полезных свойств, стимулирующих развитие растений;

- структура и свойства новых метаболитов PGPR микроорганизмов, обладающих антагонистической активностью по отношению к фитопатогенам;

2000), Всероссийской конференции «Почва, жизнь, благосостояние» (Пенза, 2000), Международной научно-практической конференции «Промы-шленные и бытовые отходы: проблемы хранения, захоронения, утилизации, контроля» (Пенза, 2000), II Всероссийской научно-практической конференции «0тходы-2000» (Уфа, 2000), XIV Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2001), VI Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях» (Москва,

2001), XV Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2002), I Международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), Всероссийской научно-практической конференции «Роль средств химизации в повышении продуктивности агроэкосистем» (Уфа, 2003), II Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2003), Семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2003» (Пущино, 2003), II Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), II Всероссийской научной Internet-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем» (Уфа, 2003), научно-практической конференции «Теоретические и практические вопросы мониторинга, предупреждения, ликвидации и рекультивации последствий нефтяного загрязнения» (Ханты-Мансийск, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 62 научные работы, в том числе 10 патентов Российской Федерации.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Логинов, Олег Николаевич

ВЫВОДЫ

2. Выделен и охарактеризован новый природный консорциум нефтеокисляю-щих микроорганизмов, представленный бактериями Bacillus brevis и Arthrobacter sp., как биологическая основа препаратов для рекультивации нефте-загрязненных почв и водных поверхностей.

3. Обнаружены ранее неописанные антигрибные соединения, продуцируемые бактериями рода Pseudomonas, по химической природе относящиеся к три-глицеропептидам.

4. Обнаружена новая группа антигрибных веществ, продуцируемых бактериями вида Azotobacter vinelandii ИБ 1, ИБ 3, ИБ 4, которые, согласно данным физико-химических методов анализа представляют собой политиофосфат-аминосахарозу.

5. В вегетационных и полевых мелкоделяночных опытах доказана эффективность использования новых штаммов псевдомонад и азотобактера для защиты посевов пшеницы от корневых гнилей, твердой головни, альтернариоза, а также овощных культур: огурца от бактериозов, фасоли — от корневой гнили, картофеля - от фитофтороза и черной парши.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ

Производственные испытания биопрепаратов «Елена» и «Азолен» подтвердили эффективность их применения на посевах яровой пшеницы сортов Казахстанская-10 (СПК «Нугуш», Мелеузовский р-н Республики Башкортостан), Сим-бирка (СПК им. Салавата, Мелеузовский р-н, РБ), на озимой пшенице сорта Бе-зенчукская-380, горохе, картофеле (там же) и на томатах в защищенном грунте сортов Гамаюн (совхоз «Рощинский», г.Стерлитамак) и Энерго (совхоз «Алексе-евский», г.Уфа).

- ТУ 9291-016-22657427-2002. Биопрепарат «Ленойл»;

- Токсиколого-гигиенический паспорт биопрепарата «Ленойл»;

- Санитарно-эпидемиологическое заключение на биопрепарат «Ленойл»;

- Санитарно-эпидемиологическое заключение на ТУ 9291-016-22657427-2002 «Биопрепарат «Ленойл». Технические условия;

- Временный технологический регламент на получение опытной партии биопрепарата «Ленойл» на опытной установке цеха И-10 № BP-1-02;

- Свидетельство на товарный знак «Ленойл» № 253033;

- Экологический сертификат соответствия биопрепарата «Ленойл»;

- ТУ 9291-017-22657427-2002. Биопрепарат «Елена», Ж.

На производственных площадях ГУП «Опытный завод Академии Наук Республики Башкортостан» спроектирована и принята в эксплуатацию опытно-промышленная установка по производству биопрепаратов. За период 2002-2003 гг. на установке осуществлена наработка биопрепаратов «Ленойл» в количестве 250 тонн, «Елена» - 2 тонны, «Азолен» - 200 кг.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Развитие биотехнологических методов в растениеводстве и ремедиации природных объектов связано с разработкой новых микробиологических препаратов, целенаправленно воздействующих на окружающую среду. Главная причина повышенного внимания к развитию биотехнологии состоит в тенденции к общей экологизации природопользования, что обусловлено заботой человечества об охране окружающей среды и рациональном, более эффективном использовании природных ресурсов.

Еще 10 лет назад коллегией Минсельхоза России было принято «Постановление о мерах по расширению производства и применения биологических средств защиты растений». Таким образом, биологическую защиту следует считать приоритетным направлением в интегрированной борьбе с вредителями и болезнями сельскохозяйственных растений.

Болезни культурных растений, вызываемые фитопатогенными грибами, уничтожают до 30% потенциального урожая. Кроме того, заражая культурные растения, грибы загрязняют их продуктами своей жизнедеятельности — микотоксинами, которые ухудшают потребительские качества сельскохозяйственного пищевого сырья, что снижает его биологическую полноценность и безопасность. Применяемые химические фунгициды небезопасны, загрязняют окружающую среду, патогенные грибы вырабатывают к ним устойчивость. Поэтому в последние годы большое внимание уделяется развитию экологически чистых биологических методов борьбы с болезнями растений, которые рассматриваются как альтернатива традиционным методам защиты растений, связанным с применением химических фунгицидов. Аналогичная тенденция по использованию биопрепаратов в сельском хозяйстве наблюдается во всех развитых странах, где объемы применения химических препаратов в растениеводстве неуклонно снижаются.

Разработка новых типов биопрепаратов для сельского хозяйства, обладающих комплексным действием, сочетающим антагонистическую активность по отношению к фитопатогенам с продукцией биологически активных веществ является актуальной задачей. Новые штаммы бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter, выделенные нами в ходе скрининга из различных природных и техногенных экониш, проявляют антагонистическую активность к широкому спектру фитопатогенных грибов, вызывающих болезни зерновых и овощных культур.

Антагонистическая активность изученных бактерий связана с продукцией антибиотиков. Показано, что метаболиты псевдомонад, обладающие фунгицидной активностью, представляют собой трипептиды глицерина. Способность к продукции псевдомонадами антибиотиков подобного типа показана впервые. Установлено, что антагонистическая активность штамма Az. vinelandii ИБ 4 обусловлена политиафосфатом тетрааминосахарозы.

Новые штаммы бактерий-антагонистов способны синтезировать ряд фитогормонов, стимулирующих развитие растений, кроме того изученные бактерии положительно влияют на азотное и фосфорное питание растений. Совокупность положительных свойств изученных штаммов позволяют считать их перспективной основой для создания биопрепаратов нового поколения. Следует отметить, что использование биопрепаратов на основе таких типичных представителей почвенной микробиоты, какими являются бактерии родов Pseudomonas и Azotobacter, не нарушает экологического равновесия в аборигенном сообществе почвенных микроорганизмов.

Испытание разработанных биопрепаратов «Елена» и «Азолен» в лабораторных и полевых условиях показало их эффективность для защиты пшеницы от корневых гнилей, альтернариоза. Биопрепарат «Елена» в вегетационных опытах показал возможность его применения для защиты пшеницы от поражения твердой головней. Разработанные биопрепараты также могут быть использованы для подавления развития бактериоза огурцов, корневых гнилей фасоли, некоторых болезней картофеля. Эффективность применения новых биопрепаратов подтверждена в производственных испытаниях на яровой и озимой пшенице, горохе, картофеле, томатах защищенного грунта. Таким образом, применение в сельском хозяйстве биопрепаратов «Елена» и «Азолен», на наш взгляд, будет весьма перспективно.

Одной из серьезных проблем защиты природной среды при добыче и переработке нефти является ликвидация нефтяного загрязнения почвы. Поэтому актуальность научных исследований по реабилитации нефтезагрязненных почв и возвращению их в народнохозяйственное использование очевидна. Устранение разливов нефти на почве и водных объектах позволяет значительно улучшить санитарное состояние не только территорий, непосредственно прилегающих к технологическим объектам, но и окружающей среды. В связи с этим разработка технологий биоремедиации нефтезагрязненных объектов является на сегодняшний день областью активных фундаментальных и прикладных исследований.

Эффективность применения биопрепаратов для ремедиации техногенно нарушенных природных объектов и, в частности, для восстановления нефтезагрязненных почв и грунтов в значительной степени зависит от обоснованности выбора микроорганизхмов-нефтедеструкторов, составляющих основу таких препаратов. Использование для интродукции в нефтезагрязненный объект консорциумов микроорганизмов - деструкторов нефти и нефтепродуктов, являющихся естественными природными симбиотическими ассоциациями различных штаммов микроорганизмов, позволяет повысить эффективность биологической рекультивации различных объектов (почвы, грунты, водные поверхности, загрязненные нефтью и нефтепродуктами, отходы нефтеперерабатывающих предприятий и т.д.).

Исследование природного консорциума бактерий (Bacillus brevis и Arthrobacter sp.), входящих в состав биопрепарата «Ленойл», показало, что эффективность деградации различных типов углеводородов выше у консорциума, чем у индивидуальных штаммов, входящих в его состав. Лабораторные эксперименты по использованию изучаемого консорциума бактерий для очистки почвы от нефти показали, что на различных типах почв (чернозем, торфяно-глеевая почва) даже при высоких концентрациях поллютанта (до 30%) эффективность деградации загрязнителя за 60 суток составляет 47,9-85,3%. Эффективность очистки воды от нефти и нефтепродуктов при использовании биопрепарата «Ленойл» в лабораторных условиях достигала 99,6%.

На основе проведенных исследований была разработана и внедрена на ОАО «Орскнефтеоргсинтез» технология очистки отбеливающей земли. Применение для восстановления окружающей среды биопрепарата «Ленойл», основу которого составляет природный консорциум микроорганизмов-нефтедеструкторов, позволит эффективно снижать токсическое действие отходов нефтепереработки и нефтедобычи и проводить биоремедиацию загрязненных почв и водоемов.

Одним из ключевых этапов внедрения новых биопрепаратов является разработка технологий их производства. При этом следует отметить, что получение концентрированных сухих препаратов биопрепаратов на основе псевдомонад и азотобактера сдерживается отсутствием стандартных подходов концентрирования биомассы этих микроорганизмов. В проведенных нами расчетах установлено, что использование микрофильтрации или вакуум-сушки экономически менее целесообразно, чем предложенный нами способ осаждения биомассы с сохранением начальных свойств седиментируемых культур. В проведенных исследованиях были найдены не токсичные для псевдомонад, азотобактера, а также бактерий, входящих в состав биопрепарата «Ленойл», осадители на основе водорастворимых высокомолекулярных полимеров. В ходе исследования установлены рабочие концентрации этих реагентов, способные быстро и с высокими выходами седиментировать культуры Pseudomonas, Azotobacter и микроорганизмы, входящие в состав биопрепарата «Ленойл». Использование разработанного нами метода концентрирования биомассы бактерий, не способных выдерживать повышенные температуры при концентрировании, позволяет существенно экономить эксплуатационные энергозатраты при производстве сухих форм биопрепаратов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Логинов, Олег Николаевич, Уфа

1. Андресон Р.К., Телин А.Г., Галимзянова Н.Ф., Агафарова Я.М., Багаутдинов Ф.Я., Бойко Т.Ф., Гарипов Т.Т. Биологическая рекультивация почвы, загрязненной нефтью, в промысловых условиях //Защита от коррозии и охрана окружающей среды.-1997.-№ 4-5.-С. 21-23.

2. А.с. 1359272 СССР. С 05 F 11/08. Штамм Azotobacter chroococcum для получения бактериального удобрения под томаты /Н.А.Троицкий, М.А.Новицкая, Т.М.Троицкий, В.М.Васильев. Заявлено 26.07.85; Опубл. 15.12.87. Бюл. 46.

3. А.с. 1458382 СССР. С 12 N 1/02. Способ очистки культуральной жидкости микроорганизмов-продуцентов протеолитических ферментов /С.С.Фокина, Э.А.Шишкова, Л.И.Орещенко, Н.В.Барсукова. Заявлено 01.10.1985; Опубл. 15.02.1989. Бюл. 6.

4. А.с. 1557160 СССР. С 12 N 1/02. Способ выделения биомассы микроорганизмов /П.П.Гнатюк, Т.Ю.Клопова, О.В.Головчанская и др. Заявлено 29.06.1987; Опубл. 15.04.1990. Бюл. 14.

5. А.с. 1805097 СССР. Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов /Г.Г.Ягафарова, И.Н.Скворцова, А.П.Зиновьев, И.Р.Ягафаров//Б.И.-1993.-№ 12.

6. Бажанов Д.П., Чернышев С.П. Растворение фосфата кальция азотфиксирующими ризосферными бактериями // Генетика и селекция на рубеже XXI в. Минск. -1999. -С. 166-168.

7. Белимов А.А., Кожемяков А.П. Смешанные культуры азотфиксирующих бактерий и перспективы их использования в земледелии // Сельскохозяйственная биология. -1992. №2. - С. 77-86.

8. Большой практикум по микробиологии /Под общей ред. проф. Г.Л.Селибера.-М.: Изд-во «Высшая школа», 1962.-492 с.

9. Бек М., Надьпал И. Исследование комплексообразования новейшими методами. — М.: Мир, 1989.-413 с.

10. Борзенков И.А., Ибатуллин P.P., Милехина Е.И., Сидоров Д.Г., Храмов И.Т., Беляев С.С. Использование микроорганизмов при ликвидации нефтяных загрязнений почв //Конф. «Интродукция м-ов в окруж. среду», 17-19 мая, 1994 г.: Тез. докл.-М., 1994.-С. 14-15.

11. Бурлуцкая Г.Р., Кубицова 3., Умаров М.М. Влияние азотфиксирующего штамма Pseudomonas fluorescens на развитие небобовых растений //Вестн. МГУ. Сер. 17 (почвоведение).-199l.-№ 1.-С. 54-58.

12. Вельков В.В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы //Биотехнология.-I995.-№ 3-4.-С. 20-27.

13. Войкова И.В., Конев Ю.Е. Микробиологическая очистка воды и почвы от нефти и нефтепродуктов //Конф. «Интродукция м-ов в окруж. среду», 17-19 мая, 1994 г.: Тез. докл.-М., 1994.-С. 12-13.

14. Волде М.И. Сапротрофные бактерии в почвах, загрязненных нефтью //Межд. конф. студ. и аспирантов по фундам. наукам «Ломоносов-96», Москва, 1996 г.: Тез. докл. Почвоведение.-М., 1996.-С. 14.

15. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем /Отв. ред. М.А.Глазовская.-М.: Наука, 1988.-264 с.

16. Габбасова И.М., Хазиев Ф.Х., Сулейманов P.P. Оценка состояния почв с давними сроками загрязнения сырой нефтью после биологической рекультивации //Почво-ведение.-2002.-№ 10.-С. 1259-1273.

17. Гарагуля А.Д., Бабич Л.В., Киприанова Е.А. и др. Способность различных видов бактерий рода Pseudomonas к колонизации корней пшеницы //Микробиол. журн.-1988.-Т. 50, № 6.-С. 77-81.

18. Головлев E.J1. Проблемы интродукции микроорганизмов-деструкторов //VI Конф. РФ «Новые направления биотехнологии». 24-26 мая, 1994 г.: Тез. докл.-Пущино, 1994.-С. 4.

19. Головлева Л.А. Микробные методы деконтаминации почв и грунтовых вод //Биотехнология.-1992.-№ 5.-С. 60-64.

20. Голодяев Г.П., Никитина З.И. Состояние интродуцированных популяций нефтеокисляющих микроорганизмов в экосистемах береговой зоны Дальнего Востока //Конф. «Интродукция м-ов в окруж. среду», 17-19 мая, 1994 г.: Тез. докл.-М., 1994.-С.29.

21. Голодяев Г.П., Никитина З.И. Санация нефтезагрязненных почв юга Дальнего Востока //Тез. докл. II Съезда Об-ва почвоведов, Санкт-Петербург, 27-30 июля, 1996 г. Кн. 1.-М., 1996.-С. 246-247.

22. ГОСТ Р 50459-92. Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения зараженности болезнями. Издание официальное.-Изд-во стандартов, 1993.-С. 1318.

23. Голубовская Э.К. Биологические основы очистки воды.- М.: Высшая школа, 1978. 268 с.

24. Грищенков В.Г., Гаязов P.P., Токарев В.Г., Кочетков В.В., Филонов А.Е., Боронин A.M. Бактериальные штаммы-деструкторы топочного мазута: характер деградации в лабораторных условиях //Прикладная биохимия и микробиология.-1997.-33, №4.-С. 423-427.

25. Груздякова Р.А. Спектрофотометрическое определение нефтепродуктов в пробах почвы //Гигиена и санитария.-1993.-№ З.-С. 73-74.

26. Гущина Ю.А., Евдокимов Е.В. Формальдегидрезистентные бактерии рода Pseudomonas как агенты биоконтроля и биостимуляции льна //Экология сегодня.-2001.-№ 1.-С. 65-67.

27. Долгова Е.М., Манько О.П., Зубко И.Я. и др. Препараты псевдобактерин-2 и псевдобактерин-3 против болезней пшеницы //Химия в сельском хозяйстве.-1997.-№ 1.-С. 13-14.

28. Доросинский JI.M. Бактериальные удобрения — дополнительное средство повышения урожая. М.: Россельхозиздат, 1965, 174 с.

29. Дядечко В.Н., Толстокорова JI.E., Гашев С.Н. О биологической рекультивации нефтезагрязненных песочных почв Среднего Приобья //Почвоведение.-1990.-№ 9.-С.148-151.

30. Егоров Н.С., Олескин А.В., Самуилов В.Д. Биотехнология. Проблемы и перспективы. М., 1987.-459 с.

31. Ермакова Н.И., Штершнис М.В. Новый биопрепарат РИЦ против болезней растений//Защита растений.-1994.-№ 12.-С. 18.

32. Есипов С.Е., АданинВ.М., Баскунов Б.П. Новый антибиотически активный флороглюцид из Pseudomonas aurantiaca // Антибиотики. -1975.-20, № 12. -С 10771081.

33. Жегневская J1.B., Барахнина В.Б. Изучение биодеградации углеводородов нефти //Матер. 47 научн-техн. конф. студ., аспирантов и мол. ученых Уфим. гос. нефт. техн. ун-та, Уфа, 1996 г., Т. l.-Уфа, 1996.-С. 124.

34. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии.-М.: МГУ.-1980.-233 с.

35. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы /Под ред. Дж.Вудворда. М., «Мир».-1988.-215 с.

36. Исмаилов Н.И., Пиковский Ю.И. Современное состояние методов рекультивации нефтезагрязненных земель //Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем.-М.: Наука, 1988.-С. 222-236.

37. Киприанова Е.А., Рабинович А.С., Бойко О.И., Каминская Л.Ю. Высокоактивное антибиотическое вещество, выделенное из бактерий рода Pseudomonas//AHTH6noTHKH. -1969.-14, №3. С. 228-231.

38. Киприанова Е.А., Рабинович А.С., Каминская Л.Ю. Химическая и биологическая характеристика антибиотических веществ, образуемых Pseudomonas aurantiaca // Физиологически активные вещества. -1971.- № 3-С. 283-290.

39. Киреева Н.А. Микробиологическая оценка почвы, загрязненной нефтяными углеводородами //Баш. хим. Ж.-1995.-2, № 3-4.-С. 65-68.

40. Киреева Н.А. Состояние комплекса актиномицетов нефтезагрязненных почв //Вестн. Баш. ун-та.-1996.-№ 1.-С. 42-45.

41. Ковальская Н.Ю. Новый тип азотфиксирующего растительно-бактериального симбиоза //Тез. докл. III съезда Докучаев, о-ва почвоведов. Суздаль, 11-15.07.2000 г. М.-2000.-Кн. 2.-С. 27-28.

42. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде (обзор) //Прикладная биохимия и микробиология.-1996.-32, № 6.-С. 579-585.

43. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Ильинский В.В., Кузьмин Ю.И., Кирсанов Н.Б., Яненко А.С. Интродукция бактерий рода Rhodococcus в тундровую почву, загрязненную нефтью //Прикладная биохимия и микробиология.-1997.-33, № 2.-С. 198-201.

44. Кочетков В.В., Чигалейчик А.Г., Петрикевич С.Б. Биопрепарат псевдобактерин-2 для защиты растений от широкого спектра фитопатогенов //Химия в сельском хозяйстве.- 1997.-№ 1.-С. 15-16.

45. Кочетков В.В., Чигалейчик А.Г., Петрикевич С.Б. Защита растений биопрепаратами в защищенном грунте //Химия в сельском хозяйстве.-1997.-№ 1.-С. 16-17. Кожевин П.А. Экология микроорганизмов: эксперименты в природе //Природа.-1985.-№ 7.-С. 78.

46. Кравченко JI.B., Макарова Н.М. Кинетика колонизации корневой поверхности злаков при интродукции ассоциативных бактерий //Микробиология.-1993.-Т. 62, № З.-С. 524-529.

47. Кузнецова М.А., Филиппов А.В. Ризоплан и фитофтороз картофеля //Защита рас-тений.-1995.-№ 8.-С. 19-20.

48. Лихолат Т.В., Шишова Т.К. Роль инокуляции пшеницы почвенными культурами Azotobacter, Bacillus и Enterobacter в ослаблении воздействия неблагоприятных факторов среды //Тез. докл. III съезда Докучаев, о-ва почвоведов.-М., 2000.-Кн. 2.-С. 35-36.

49. Макарова Л.А., Минкевич И.И. Погода и болезни культурных растений. Л.: Гид-рометеоиздат, 1977.-144 с.

50. Марфенина О.Е. Антропогенные изменения комплексов микроскопических грибов в почвах: Автореф. дис.д-ра биол. наук.-М., 1999.-49 с.

51. Мац А.А., Мурыгина В.П., Ивашко Р.С., Мещерская М.В. Биодеградация углеводородов Rhodococcus sp. (R. ruber) 1418 и Rhodococcus sp. (R. erythropolis) 1715 //Конф. «Интродукция м-ов в окружающую среду». 17-19 мая 1994 г.: Тез. докл.-М., 1994.-С. 68-69.

52. Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур /Под ред. К.В.Ново-жилова.-М., 1985.-130 с.

53. Методы общей бактериологии. В 3 т. /Под ред. Ф.Герхардта и др.-М.:Мир, 1984.-Т. 1-3.

54. Методы почвенной микробиологии и биохимии /Под ред. Д.Г.Звягинцева.-М.:Изд-во Моск. ун-та, 1991.-304 с.

55. Методы экспериментальной микологии /И.А.Дудка, С.П.Вассер, И.А.Эланская и др.-Киев: Наук, думка, 1982.-552 с.

56. Минеев В.Г., Шабаев В.П., Сафрина О.С. и др. Влияние бактерий рода Pseudomonas на урожай столовой свеклы и вынос азота растениями //Докл. ВАСХНИЛ.-1991.-№ 9.-С. 26-31.

57. Минеев В.Г., Сафрина О.С., Шабаев В.П. Химический состав растений столовой свеклы, инокулированных бактерией рода Pseudomonas //Докл. ВАСХНИЛ.-1991 .-№ 10.-С. 21-26.

58. Минеев В.Г., Сафрина О.С., Шабаев В.П. Влияние бактерий рода Pseudomonas на некоторые физиолого-биохимические процессы в растениях столовой свеклы //Докл. ВАСХНИЛ.-1992.-№ 1.-С. 16-21.

59. Миронова Р.И., Носкова В.П., Расулова Г.Е., Холоденко В.П. Биодеградация и биосорбция плавающей нефти природными микромицетами //Биотехнология.-1996.-№ 7.-С. 44-48.

60. Мирчинк Т.Г. Почвенная микология.-М.:Изд-во Моск. ун-та, 1988.-224 с. Михновская Н.Д., Шевцова И.И., Рубан Е.М. и др. К вопросу о неспецифической токсигенности некоторых представителей рода Pseudomonas //Микробиол. журн.-1988.-Т. 50, № 5.-С. 83-86.

61. Мишустин Е.Н., Шильникова В.К. Биологическая фиксация атмосферного азота. М.: Наука, 1968, 531 с.

62. Муратова А.Ю., Турковская О.В. Деградация минеральных масел селекционированной микробной ассоциацией //Прикладная биохимия и микробиология.-2001.-Т. 37, № 2.-С. 175-180.

63. Назарова JI.H., Наговицин В.А., Черемисина В.Г. Против комплекса болезней озимой ржи //Защита растений.-1995.-№ 8.-С. 18-19.

64. Назарова JI.H. Агат-25 на зерновых культурах //Защита и карантин растений.-2002.-№ 1.-С.21-22.

65. Никонорова А.К. Особенности взаимодействия Bacillus subtilis с Helminthosporium sativum Pam., King etBakke //Микология и фитопатология.-1996.-T. 30, вып. 5-6.-С. 69-73.

66. Нурмухаметов Н.М., Нагимова JI.M. Влияние продуктов обмена микроорганизмов на урожай яровой пшеницы //Повышение эффективности производства в сельском хозяйстве Респ. Башкортостан.-Уфа, 1998.-С. 184-188.

67. Ожиганова Г.У., Андреева М.Г., Заляева С.Ф. Изучение азотфиксирующей активности и способности к продуцированию физиологически активных веществ микроорганизмов рода Azotobacter // Амарант: агроэкология, перераб., использ. 1993-1994гг. Казань., С. 48-49.

68. Олюнина JI.H., Шабаев В.П. Продуцирование индолил-3-уксусной кислоты ризо-сферными бактериями рода Pseudomonas в процессе роста //Микробиология.-1996.-Т.6, № 6.-С. 813-817.

69. Определитель бактерий Берджи: В 2 т. /Под ред. Дж. Хоулта и др.-М.:Мир, 1997.Т. 1.

70. Орлова Е.Е., Богданова Е.Г. Трансформация гумусовых """веществ- "при нефтезагрязнениях почв //Тез. докл. II Съезда Об-ва почвоведов, Санкт-Петербург, 27-30 июня, 1996 г., Кн. l.-M., 1996.-С. 207-208.

71. Пат. 2019527 Российская Федерация. Способ очистки почв от нефтяных загрязнений /Т.В.Коронелли, Э.И.Аракелян, Т.И.Комарова, В.В.Ильинский //Б.И.-1994.-№ 17.

72. Пат. 2023686 Российская Федерация. Консорциум микроорганизмов, используемых для очистки почвенных и солоновато-водных экосистем от загрязнения нефтепродуктами /И.А.Борзенков, Е.И.Милехина, С.С.Беляев, М.В.Иванов //Б.И.-1994.-№ 22.

73. Пат. 2053205 Российская Федерация. Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов /М.Д.Белонин, Е.А.Рогозина, Р.М.Свечина, А.В.Хотяно-вич, Н.А.Орлова //Б.И.-1996.-№ 3.

74. Пат. 2074158 Российская Федерация 6 С 05 F 11/08. Штамм бактерий Azotobacter chroococcum, используемый для получения бактериального удобрения под амарант /Г.У.Ожиганова, И.А.Чернов, И.А.Дегтярева. Заявлено 02.09.94; Опубл. 27.02.97. Бюл. 13.

75. Пат. 2074159 Российская Федерация, 6 С 05 F 11/08 //(С 05 F 11/08, С 12 R 1:065). Штамм бактерий Azotobacter chroococcum, используемый для получения бактериального удобрения /Г.У.Ожиганова, Г.П.Ланских, И.А.Чернов. Заявлено 02.09.92; Опубл. 27.02.97.

76. Пат. 2077397 Российская Федерация. Способ рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами /Р.К.Андресон, Ф.Х.Хазиев, В.С.Дешура, ФЛ.Багаут-динов, Т.Ф.Бойко, Е.И.Новоселова //Б.И.-1997.-№ 11.

77. Петренко М.Б., Боровков А.В. Производные феназина из Pseudomonas sp. штамм 2/3 // Химия природ, соединений.-1970. №6.- С. 779.

78. Плетнева Т.Н., Ладыгина Г.Н., Дыдыкин A.M. Влияние азотобактера на урожайность, качество и некоторые болезни томатов сорта «Горьковский 44» //Тез. докл.конф. «80 лет селекционеру-генетику, акад. И.П.Елисееву». Н.Новгород.-1998.-С. 187-190.

79. Полянская JI.M., Звягинцев Д.Г. Популяционная экология актиномицетов в почвах и ее роль в управлении комплексом почвенных микроорганизмов //Изв. АН СССР. Сер. биол.-1984.-№ 5.-С. 746-753.

80. Полянская JT.M., Ведина О.Т., Лысак Л.В., Звягинцев Д.Г. Стимуляция роста растений культурами Bejerinckia и Clostridium //Микробиология.-2002.-Т. 71, № 1.-С. 123-129.

81. Попова Ж.П., Эськин С.Б., Матисова А.Н. О составе антифунгина — сырца // Бюл. ВНИИ с.-х. микробиологии. 1971.- Т. 15, № 1. -С. 79-80.

82. Практикум по микробиологии /Под ред. Н.С.Егорова.-М.:Изд-во Моск. ун-та, 1976.-308 с.

83. Придачина Н.Н., Новогрудская Е.Д., Кругляк Е.Б. Azotobacter chroococcum — продуцент нового противогрибкового антибиотика //Антибиотики.-1982.-Т. 27, № 1.-С. 3-5.

84. Промышленная микробиология /Под. ред. Н.С.Егорова. М., «Высшая школа».-1989.-688 с.

85. Пунтус И.Ф., Филонов А.Е., Кошелева И.А., Гаязов P.P., Карпов А.В., Воронин A.M. Выделение и характеристика микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов //Микробиология.-1997.-66, № 2.-С. 269-272.

86. Разумовская З.Г., Чижик Г.Я., Громов Б.В. Лабораторные занятия по почвенной микробиологии.-Л.:Изд-во Ленингр. ун-та, 1960.-184 с.

87. Редди Т.К., Боровков А.В. Моно-, ди- и триацетилфлороглюцины из Pseudomonas fluorescensZ/Химия природ, соединений. -1969.-№ 2.-С. 133. Рубенчик Л.И. Азотобактер и его применение в сельском хозяйстве. Киев: АН УССР, I960. - 328с.

88. Рыбальский Н.Г., Лях С.П. Экобиотехнологический потенциал консорциумов микроорганизмов. М.: ВНИИПИ, 1990, 177 с.

89. Садыков Б.Ф., Зуева Л.Д., Шлыков В.И. Круговорот азота в целинных и пахотных почвах //Микробиология,-1985.-Т., № 4.-С. 656-660.

90. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas.-Киев: Наук, думка, 1990.-264 с.

91. Смолин В.Ю., Шабаев В.П. Химический состав растений сои при применении клубеньковых бактерий с ризосферными псевдомонадами или эндомикоризнымигрибами и локальном внесении азотного удобрения //Агрохимия.-1992.-№ 11.-С. 73-79.

92. Смолин В.Ю., Сафрина О.С. Азотфиксация в ризосфере, урожай столовой свеклы и баланс азота в пойменной почве при применении азотфиксирующих бактерий рода Pseudomonas //Агрохимия.-1995.-№ 11.-С. 3-15.

93. Смирнов В.В., Киприанова Е.А., Гарагуля А.Д., Додатко Т.А., Клюев Н.А. Антибиотики ароматической природы из Pseudomonas cepacia //Микробиол. журн.-1991.-Т. 53, № 5.-С. 41-45.

94. Смирнов В.В., Киприанова Е.А., Гарагуля А.Д. и др. Антибиотическая активность и сидерофоры Pseudomonas cepacia //Прикладная биохимия и микробиология.-1990.-Т. 26, № 1.-С. 75-80.

95. Смирнов В.В., Киприанова Е.А., Гарагуля А.Д. и др. Антимикробные и энтомопа-тогенные свойства штаммов Pseudomonas aureofaciens //Прикладная биохимия и микробиология.-1999.-Т. 35, № 4.-С. 413-416.

96. Современные методы исследования нефтей /Отв. Ред. А.И.Богомолов JL: Изд-во Недра, 1984.-431 с.

97. Соловов B.JL, Новохатко Т.Н., Шумская Г.И. //Тез. докл. конф. «Проблемы, способы и средства защиты окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами». М., 1995.-С. 73-74.

98. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. 2001 год. Приложение к журналу «Защита и карантин растений».-№3, 2001 г.

99. Сторожук С.В., Сидоров И.Л., Соколов М.С. Высокое качество биопрепарата залог успеха //Защита растений,-1995.-№ 8.-С. 17.

100. Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М.: Химия, 1986. 288 с.

101. Суржко Л.Ф., Финкельштейн З.И., Баскунов Б.П., Янкевич М.И., Яковлев В.И., Головлева Л.А. Утилизация нефти в почве и воде микробными клетками //Микробиология.-1995.-64, № З.-С. 393-398.

102. Суховицкая Л.А., Сафронова Г.В., Клышко Г.М. Выживаемость Rizobium в монокультуре и бинарных популяциях с ризосферными бактериями //Прикладная биохимия и микробиология.-2002.-Т. 38, № 1.-С. 73-78.

103. Титаренко Л.Н., Вяткина Г.Г., Алещенко М.Н. Применение ризоплана на Северном Кавказе //Защита растений.-1995.-№ 8.-С. 17.

104. Хмельницкий Р.А., Бродский Е.С. Масс-спектрометрия загрязнений окружающей среды.-М.: Химия, 1990.-182 с.

105. Холмецкая М.О., Лобанок Е.В., Чернин Л.С. Синтез индолилуксусной кислоты некоторыми фитопатогенными и непатогенными бактериями //Докл. АН Белару-си.-1996.-Т. 40, № 2.-С. 80-83.

106. Шабаев В.П., Смолин В.Ю., Стрекозова В.И. Влияние азотфиксирующих родов Azospirillum и Azotobacter на баланс азота в почве при выращивании растений //Агрохимия.-1990.-№ 5.-С. 82.

107. Шабаев В.П., Смолин В.Ю., Мудрик В.А. СО2 газообмен растений сои и симби-отическая азотфиксация при двойной инокуляции клубеньковыми бактериями сризосферными псевдомонадами или эндомикоризными грибами //Изв. РАН. Сер. биол.-1995.-№ 6.-С. 693-701.

108. Шабаев В.П., Сафрина О.С., Мудрик В.А. Влияние ризосферной бактерии Pseudomonas fluorescens 20 и эндомикоризного гриба Glomus mosseae на урожай и рост редиса в зависимости от условий минерального питания //Агрохимия.-1998.-№ 6.-С. 34-41.

109. Шабаев В.П., Смолин В.Ю. Урожай рапса и вынос элементов минерального питания растениями при инокуляции семян культурой ризосферной бактерии Pseudomonas fluorescens 20 на фоне различных доз азотного удобрения //Агрохимия.-1999.-№ 5.-С. 67-73.

110. Aguilar J.E., Sanchez М. Efecto de una rizobacteria nitrofijadora у niveles de fertilizan-te en el comortamiento agronomico del tomate Lycopersicon esculentum var. //Acta ag-ron.-1998.-Vol. 48, № 1/2.-P. 60-70.

111. Ahl P., Voisard C., Defago G. Iron bound-siderophores, cyanic acid and antibiotics involved in suppression of Thielaviopsis basicola by a Pseudomonas fluorescens strain //Phytopathol. J.-1986.- № 2.-P. 121-134.

112. Ali Siddiqui I., Ehetshamul-Haque S., Shahid Shaukat S. Use of rhizobacteria in the control of root rot-root knot disease complex of mungbean // J.Phytopathol.-2001.-№ 6,-P.337-346.

113. Anderson A J., Hacking A.J., Dawas E.A. Alternative pathways for the biosynthesis ofalginate from fructose and glucose in Pseudomonas mendocina and Azotobactervinelandii. //J. Gen. Microbiol. -1987.-Vol. 133.-P. 1045-1052.

114. Andreeva N.B., Sorokina T.A., Khmel I.A. Chitinolytic activity of pigmented

115. Pseudomonas and Xanthomonas bacteria //Microbios.-1996.- № 350.-P.53-57.

116. Arima K., Imanaka H., Konsara M. et al. Pyrrolnitrin, a ne antibiotic substans, producedby Pseudomonas // Agr. and Biol. Chem.- 1964. -28, № 8. -P. 575-582.

117. Barries marines pour depolluer//Biofutur/-1996.-№ 156.-P. 15.

118. Bahme J.B., Schroth M.N. Spatial-temporal colonization patterns of a rhizobacteriumon undergraund organs of potato //Phytopathology.-1987.-Vol. 77, № 7.-P. 1093-1100.

119. Bakker P.A., Bakker A.W., Geets F.P. et al. Increase of potato tuber yields in shortrotations of potato by seed tuber treatment with fluorescent Pseudomonas sp.

120. Developm. in Plant Soil Sc. Dordrecht etc.-1989.-№ 40.-P. 163-170.

121. Beale J.M., Foster J. L. Carbogidrate fluxes into alginate biosynthesis in Azotobactervinelandii NCIB 8789: NMR investigations of the triose pools // Biochemistry. 1996.1. Vol.35.-P.4492-4501.

122. Becker J.O., Cook R.J. Role of siderophores in suppression of Pythium species and production of increased-growth response of wheat by fluorescent pseudomonads //Phytopathology.-1988.-Vol. 78, № 6.-P. 778-782.

123. Becker J.O., Hepfer C.A., Yuen G.V. et al. Effect of rhizobacteria and metham-sodium on growth root microflora of celery cultivars //Phytopathology.-1990.-Vol. 80, № 2.-P. 206-211.

124. Benka-Coker M.O., Ekandayo J. A. Applicability of evaluating the ability of microbes isolated from an oil spill site to degrade oil //Environ. Monit. and Asses.-1997.-45, № 3.-P. 259-272.

125. Bisacchi G.S., Hockstein D.R., Koster W.H., Parker W., Rathnum M.L, Unger S.E. Xylocandin: a new complex of antifungal peptides. II. Structural studies and chemical modifications.//J. Antibiot. -1987.-Vol. 40.-P. 1520-1529.

126. Brivonese A.C., Sutherland I. W. Polymer production by a mucoid strain of Azotobacter vinelandii in batch culture // Appl. Microbiol. And Biotechnol.-1989. Vol. 30, № 1. P.97-102.

127. Colin J.E., Maraite H. Caracterisation spectrophotometrique et activite biologique de siderophores de Pseudomonas fluorescents, antagonistes de bacteries phytopathogenes //Parasitica.-1987.-Vol.43, № 4.-P. 168-175.

128. Elsherif M., Grossmann F. Versuche zur biologischen Bekampfung einiger phytopathogener Pilze durch fluoreszierende Pseudomonaden unter Anwendung verschiedener Applikationsverfahren //Z. Pflanzenkrankh. und Pflanzenschutz.-1991 .-Bd. 98, №3.-S. 236-249.

129. Gamard P., Sauriol F., Benhamou N., Belanger R.R., Paulitz T.C. Novel butyrolactones with antifungal activity produced by Pseudomonas aureofaciens strain 63-28 // J. Antibiot. 1997.- Vol. 50. P. 742-749.

130. Gibson D.T. Microbial degradation of organic compounds. N.-Y.- Basel: Marcel Dek-ker Inc., 1984, 536 p.

131. Gordon-Lennox G., Walther D., Gindral D. Utilisation d'antagonistes pour l'enrobage des semences: efflcacite et mode d'action contre les agents de la fonte des semis //Bull. OEPP. Oxford etc.-1987.-Vol.17, № 4.-P. 631-637.

132. Henry M.B., Lynch J.M., Fermor T.R. Role of siderophores in the biocontrol of Pseudomonas tolaasii by fluorescent pseudomonad antagonists //J. Appl. Bacteriol.-1991.-Vol. 70, № 2.-P. 104-108.

133. Horan N.J., Jarman T.R., Dawas E.A. Studies on some enzymes of alginic acid biosynthesis in Azotobacter vinelandii grown in continuous culture // J.Gen. Microbiol.-1981-Vol. 129.-P. 2985-2990.

134. Howel C.R., Stipanovic R.D. Suppression of pythium ultimum-induced damping-off of cotton seedlings by Pseudomonas fluorescens and its antibiotic, pyoluteorin // Phytopathology.-1980. 70, № 8.-P. 712-715.

135. Janisiewicz W.J., Roitman J. Biological control of blue mold and gray mold on apple and peer with Pseudomonas cepacia //Phytopathology.-1988.-Vol. 78, № 12, Pt. 2.-P. 1697-1700.

136. Jayaswal R.K., Fernander M.A., Schroeder R.G. Isolation and characterization of a Pseudomonas strain that restricts growth of various phytopathogenic fungi //Appl. and Environ. Microbiol.-1990.-Vol. 56, № 4.-P. 1053-1058.

137. Kanner D., Gerber N., Bartha R. Pattern of phenazine pigment production by strain of Pseudomonas aeruginosa//J. Bacteriol.- 1978.-134, №2.-P. 690.

138. Kim K.K., Kang J.G., Moon S.S., Kang K.Y. Isolation and identification of antifungal N -butylbenzenesulphonamide produced by Pseudomonas sp AB2// J. Antibiotics. -2000.-Vol. 53-. P. 131-136.

139. Knight M., Hartman Ph., Hartman Z., Young V. Anew method of preparation of piocyanin and demonstration of an unusual bacterial sensivity // An. Biochem.- 1979. — Vol. 95, № l.-P. 19-23.

140. Konde B.R., Desai J.N. Influence of inoculum of Azotobacter on growth and yield of wheat//Food Faqrmg. Agric.- 1976.-Vol. 8, № 3.-P. 13-14.

141. Kucharski J., Wyszkowska J., Nowak G. Wplyw prekursorow etylenu i Azotobacter sp. na plonowanie bobiku i aktywnose drobnoustrojow glebowych. Rosliny straczkowe w hodowli i uprawie.-Warszawa, 1997.-S. 213-220.

142. Kumar V., Narula N. Solubilization of inorganic phosphates and growth emergence of wheat as affected by Azotobacter chroococcum mutants // Biol. Fertil. Soils. -1999. — Vol.28, №3.-P. 301-305.

143. Mahaffee W.F., Bauske E.M., Kloepper J.W. Structural changes in bacterial communities associated with introduction of plant growth-promoting rhizobacteria // Phytopathology.-1995 .-№ 10.-P.1191.

144. Mc Laughlin R.J., Sequeira L., Weingartner D.P. Biocontrol of bacterial wilt of potato with an avirulent strain of Pseudomonas solanacearum: Interactions with root-knot nematodes //Am. Potato J.-1989.-Vol. 67, № 2.-P. 93-107.

145. Mc Laughlin R.J., Sequeira L. Evaluation of an avirulent strain of Pseudomonas solanacearum for biological control of bacterial wilt of potato //Am. Potato J.-1988.-Vol. 65, № 5.-P. 255-268.

146. Nishijima F., Evans W.R., Vesper S.J. Enhances Nodulation of Soybean by Bradyrhizobium in Presense of Pseudomonas fluorescens // Plant ant Soil.-1988.-Vol.111, № l.-P. 149.

147. Nowak-Thompson В., Gould S.J., Kraus J., Loper J.E. Production of 2,4-diacetylphloroglucinol by the biocontrol agent Pseudomonas fluorescens Pf-5// Can. J. Microbiol. -1994. Vol. 40. P. 1064-1066.

148. Pandey A., Kumar S. Inhibitory effects of Azotobacter chroococcum and Azospirillum brasilense on a range of rhizospere fungi //Indian. J. Exp. Biol.-1990.-Vol. 28, № l.-P. 52-54.

149. Parente E., Crudele M.A., Aquino M. et al. Alginate production by Azotobacter vinelandii DSM 567 in batch fermentation // J. of Ind. Microbiol. And Biotechnol. 1998.№ 20.-P. 171-176.

150. Paulitz Т., Nowak-Thompson В., Gamard P., Tsang E., Loper J. A novel antifungal furanone from Pseudomonas aureofaciens, a biocontrol agent of fungal plant patogens// J. Chem. Ecol.- 2000. Vol. 26. P. 1515-1524.

151. Pietr S.J., Kempa R. Cucumber rhizosphere pseudomonads as antagonists of Fusarium //Interrelationships Between Microorganisms and Plants Soil: Proc. Int. Symp., June 2227, 1987,-Praha, 1989.-P. 411-417.

152. Pierson III L.S.P., Pierson E.A. Phenazine antibiotic production in Pseudomonas aureofaciens: role in rhizosphere ecology and pathogen suppression // FEMS Microbiology Letters. -1996. Vol. 136. P. 101-108.

153. Powell J.F., Vargas J.M., Nairet M.G. et al. Management of dollar spot on creeping bentgrass with metabolites of Pseudomonas aureofaciens (TX-1) // Plant Disease.-2000.-№ 1.-P. 19-24.

154. Rabie K.A.E., Nasr S.A., Mervat A.A. The effect of a symbiotic nitrogen fixers on the growth and endogenous growth substances of wheat plants //Ann. agr. Sc.-1995.-Vol. 40, № l.-P. 11-32.

155. Rhodes D.J., Logan C. Effects of fluorescent pseudomonads on the potato blacked syndrome//Ann. Appl. Biol.-1986.-Vol. 108, № 3.-P. 511-518.

156. Roitman J.N., Mahoney N.E., Janisiewicz W.J., Benson M. A new chlorinated phenylpyrrole antibiotic produced by the antifungal bacterium Pseudomonas cepacia //J. Agr. Food Chem.-1990.-Vol. 38, № 2.-P. 538-541.

157. Rosario Azcon, Barea J.M. Synthesis of auxins, gibberellins and cytocinins by Azotobacter vinelandii and Azotobacter biejierincii related to effects produced on tomato plants // Plant and soil. -1975.-№ 43. P.609-619.

158. Sarniguet A., Lucas P., Lucas M. Relationships between take-all, soil conduciveness to the disease, populations of fluorescent pseudomonads and nitrogen fertilizers //Plant ant Soil.-1992.-Vol. 145, № l.-P. 17-27.

159. Savithiry S., Gnanamanickam S.S. Bacterization of peanut with Pseudomonas fluorescent for biological control of Rhizoctonia solani and for enhanced yield //Plant and Soil.-1987.-Vol. 102, № l.-P. 11-15.

160. Simi Body, Schickler, Jlan Chet, Oppenheim Amos. The chitinae encoding Tn-7-based chiA gene endows Pseudomonas fluorescens with the capacity to control plant pathogenes in soil // Gene.-1994.-№ l.-C. 81-83.

161. Sindhu S.S., Lakshminarayana K., Singh D. Expression of hydrogenase activity in Azotobacter chroococcum and its possible role in crop productivity //Indian. J. exper. Biol.-1994.-Vol. 32, № 4.-P. 423-426.

162. Sobiczewski Piotr., Bruk Hanna Mozlivvosci i ograniczenia biologicznej ochronny jablek bakteriami Pantoea agglomerans i Pseudomonas sp. przed szara plesnia i mokra zgnilizna// Post. ochr. rosl.-1999.-№l.-C.139-147.

163. Solnseva N.P. Oil pollution of soils: Geochemical aspects and ecology //Global Changes and Geogr.: 16 U Conf., Moscow, Aug. 14-18, 1995. Abstr.-Moscow, 1995.-P. 404.

164. Sood M.C., Sharma R.C. Value of growth promoting bacteria, vermicompost and Azotobacter on potato production in Shimla hills //J. Indian Potato Assn.-2001.-Vol. 28, № l.-P. 52-53.

165. Sorensen D., Nielsen Т.Н., Christophersen C., Sorensen J., Gajhede M. Cyclic lipoundecapeptide amphisin from Pseudomonas sp. strain DSS73// Acta Crystallographica. -2001.- Section C: Crystal Structure Communications C57. P. 1123-1124.

166. Swinburne T.R. Stimulation of disease development by siderophores and inhibition by chelated iron // Iron, Siderophores and Plant Diseases: Proc. NATO Adv. Res. Workshop, Wye, July 1-5, 1985.- New York; London, 1986.-P. 217-226.

167. Takeda R. Pseudomonads pigments (II). Two pigments, penazinee-carboxylic acid and oxy chlororaphine, produced by P. aeruginosa T 359//J. Ferment. Technol.-1958.-36, №2. P. 286-290.

168. Takeda R. Pseudomonads pigments. IV. The structure of pyoluteorin //Bull. Agr. and Chem. Soc. Jap.-1959.-23, № 3. P. 165-171.

169. Tang Weizhen., Pasternak J.J., Bernard Glick R. Persistence in soil of the plant growth promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2 and genetically manipulated derived strains // Can.J.Microbiol.-1995.-№ 6.-P.445-451.

170. Tosi L., Zazzerini A. Evaluation of some and bacteria for potential control of safflower rust//J. Phytopatho1.-1994.-№ 2.-C. 131-140.

171. Tsuyumu S., Tsuchida S., Nakano T. et al. Antifungal activiti in cell-free culture fluid9of Pseudomonas solanacearum //Ann. Phytopathol. Soc. Japan.-1,989.-Vol. 55, № l.-P. 9-15.

172. Vargas-Garcia M.C., Lopez M.J., Elorrieta M.A. et al. Properties of polysaccharide produced by Azotobacter vinelandii cultured on 4-hydroxybenzoic acid // J. Appl. Microbiol. 2003. Vol. 94. P. 388-395.

173. Wessendorf J., Lingens F. Effect of culture and soil conditions on survival of Pseudomonas fluorescens R1 in soil //Appl. Microbiol, and Biotechnol.-1989.-Vol. 31, № l.-P. 97-102.

174. Wilson C.L., Chalutz E. Postharvest biological control of Penicillium rots of citrus with antagonistic yeasts and bacteria //Sc. hortic.-1989.-Vol. 40, № 2.-P. 105-112.

175. Zablotowicz R.M., Tipping E.M., Scher F.M. et al. In-furrow spray as a delivery system for plant growth-promoting rhizobacteria and other rhizosphere-competent bacteria //Can. J. Microbiol.-1991.-Vol. 37, № 8.-P. 632.

176. Zaspel J. Isolierung und Selektion fluoreszierender Pseudomonas-Arten als Antagonisten gegen Gaeumannomyces graminis (Sacc.) Arx et Olivier //Arch. Phytopathol. Pflzschutz.-1989.-Bd. 25, H. 2.-S. 123-130.

177. Zahir Z.A., Arshad M., Azam M., Hussain A. Effect of an auxin precursor tryptophan and Azotobacter inoculation on yield and chemical composition of potato under fertilized conditions //J. Plant Nutrit.-1997.-Vol. 20, № 6.-P. 745-752.7/ / of* sS^/jr j)

178. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ^

179. УФИМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ОПЫТНЫЙ ЗАВОД АКАДЕМИИ НАУК РБ»1. На правах рукописи1. ЛОГИНОВ ОЛЕГ НИКОЛАЕВИЧ

180. НОВЫЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ВОССТАНОВЛЕНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ0300.23 «Биотехнология»

Информация о работе

Логинов, Олег Николаевич
доктора биологических наук
Уфа, 2004
ВАК 03.00.23

Диссертация

Новые микробиологические препараты для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы