Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование углеводородокисляющих бактерий рода Pseudomonas для биоремедиации нефтезагрязненных почв

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Использование углеводородокисляющих бактерий рода Pseudomonas для биоремедиации нефтезагрязненных почв"

я-з З 03 л

На правах рукописи

СТАНКЕВИЧ ДАРЬЯ СЕРГЕЕВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ РОДА PSEUDOMONAS ДЛЯ БИОРЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ

ПОЧВ

Специальность 03.00.07 — микробиология

Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2002

Работа выношена на кафедре микробиологии Московской се 1ьскохозяйственнои «адечии имени К А Тимирязева и на опытной базе таборатории биотехнологии Слргутского государственного университета

На\ чный руководите!!.

Доктор биологических наук профессор В. Т. Емцев

()фишгальные оппоненты

Доктор биологических наук, профессор Л. И. Воробьева Кандидат биотогическич наук И. К Кравченко

Ведущая организация

Государственный научный Центр прикладной микробиологии

Защита диссертации состоится 2002 г в ' ^ ч на 1ассдании

шсссртационного совета Д 220 043 03 в Московской ссльскохо ¡яисгвеннои академии имени К А Тими > -

Адрес 12"550 Мо им! <

С „пссертациеи мол лк;>

Автореферат разосла

Ученый секретарь

тнссертационного совета / , х—>

кандидат сетьскохозяйственных наук, ¡хуСА^' у

профессор ' В А. Калинин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время добыча нефти и производство нефтепродуктов играют в нашей жизни огромную роль. Но чем больше масштабы производства, тем больше и масштабы нефтяного загрязнения окружающей среды. Нефть и нефтепродукты признаны приоритетными загрязнителями планеты (Израэль, Ровин-ский. 1986). В первую очередь процесс добычи нефти отражается на загрязнении почвы. Это приводит к отторжению земель из сельскохозяйственного использования, в связи с чем проблема рекультивации нефтезагрязненных почв становится весьма актуальна.

Определяющую роль в процессах самоочищения почв от нефти играют микроорганизмы (Гусев, Коронелли, 1981; Славнина, Середина, 1992). Большинство известных биотехнологических способов очистки основано на использовании чистых и смешанных культур микроорганизмов в сочетании с различными веществами или приемами, стимулирующими их активность (Исмаилов, 1985; Rosenberg, 1985). Эти способы зарекомендовали себя как эффективные и наиболее естественные средства охраны природной среды. Микроорганизмы, используемые в препаратах для ускорения биоремедиации нефтезагрязненных почв, обладают значительно большей эффективностью, чем природные формы, благодаря направленному отбору (Гузев и др., 1989; Квасников, Клюшникова, 1981). Знания по физиологии и экологии нефтеокис-.'1ЯЮЩИХ микроорганизмов и условиях их успешной интродукции в природные экосистемы необходимы для развития экологической биотехнологии в нашей стране. Недостаток отечественных биопрепаратов-деструкторов нефти неизбежно приведет к заполнению национального рынка импортными аналогами, зачастую худшего качества. и как следствие, поставит Россию в необратимую зависимость от импорта (Кирее-ва. Новоселова, 1996).

Цель работы - выделить из почвы эффективные штаммы микроорганизмов-деструкторов нефтепродуктов и разработать с их использованием способ биоремедиации нефтезагрязненной почвы. Задачи исследования

• получить методами аналитической селекции и выделить в чистой культуре пер-

спективные штаммы-ми!

икроорганиамоа-десарукгороа, нефти;

USri IРА-ГЬНАЯ | НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА

ГАэск. сельского.} академии им. К. А.л'Гкіі>ір;іч.зва _

• идентифицировать выделенные микроорганизмы, выявить их углеводородокис-лякмцую способность и оптимизировать условия роста для получения микробной биомассы;

• разработать технологию приготовления и применения новою микробного препарата на основе наиболее активного выделенного штамма для биоремедиации неф-гезагрязненных почв; изучить его эффективность в условиях реального нефтяного загрязнения;

• исследовать эффективность нового микробного биопрепарата в сравнении с другими аналогичными препаратами для рекультивации почв, загрязненных нефтепродуктами.

Научная новизна. Впервые из нефтезагрязненной почвы выделены бактериальные штаммы, способные к росту на средах с высокими концентрациями нефтепродуктов (свыше 10% от объема среды), использующие углеводороды, входящие н окп» дизельного топлива, сырой нефти и мазута и качестве единственных источников углерода. Полученные кулыуры идентифицированы и отнесены к роду Pseudomonas виду pulida (st. 91-96 и st. 9:1V). Показано, что при внесении выделенных штаммов в почву, загрязненную нефтепродуктами, существенно снижается фитотоксичность почвы, а численность и соотношение отдельных групп микроорганизмов приближаются к соответствующим показателям незагрязненной почвы.

Выявлено, что при биоремедиации нефтезагрязненных почв (Сургутский район, Тюменская обл.) с использованием биопрепарата «Псевдомин» на основе одного из выделенных штаммов (Pseudomonas putida st. 91-96) в течение 2.5 месяцев происходит почти полное разложение нефтепродуктов. При совместном использовании с ним минеральных удобрений эффективность достигает 9Х, 1%. Микробиологический анализ образцов рекультивируемой почвы выявил высокую активность штамма и способность размножаться в загрязненной почве.

Практическая значимость. На основе выделенного из нефтезагрязненной почвы штамма бактерий-деструкторов углеводородов нефти разработана технология приготовления нового микробного препарата «Псевдомин» для биоремедиации почв, загрязненных нефтепродуктами и оптимизированы способы его применения совместно с различными мелиорантами. Новый биопрепарат «Псевдомин», пройдя серию полевых и лабораторных испытаний, зарекомендовал себя как хороший деструктор нефти.

Среди 14 испытанных биопрепаратов, «Псевдомин» по суммарному деградационно-му действию на нефтепродукты в почве явился одним из лучших.

Результаты работы могут быть использованы для дальнейших биотехнологических исследований и при разработке комплексных технологий по восстановлению исфтезагрязненных почв, завершающей стадией которых является микробиологическая. Биопрепарат «Псевдомин» может быть рекомендован для использования в северных нефтедобывающих регионах, где климат характеризуется коротким теплым' периодом, в качестве активного агента биоремедиации нефтезагрязненных почв^ ускоряющего процесс разложения нефтепродуктов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международной научной конференции «Тетро-НР'98» (Югославия, Чачак. 1998 г.); на III экологическая конференция студентов и молодых ученых вузов г. Москвы «Охрана окружающей среды на пороге третьего тысячелетия в интересах устойчивого развития» (Москва, апрель, 1999 г.); на III съезде Докучаевского общества почвоведов (Суздаль, 2000 г.); на Международной конференции «Микробиология и биотехнология на рубеже XXI столетия» (Минск, июнь, 2000 г.); на Второй Интернациональной Ирано-Российской конференции «Agriculture and natural resources» (Москва, февраль, 2001г.) п на научной конференции молодых ученых ТСХЛ (Москва, июнь, 2001г.). Пуб.ткаиии. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Объем и структура диссертаиии. Работа изложена на 131 страницах машииописно-I о текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и выводов. 'Экспериментальный материал иллюстрирован 17 рисунками и 19 таблицами в icKcie. Список литературы включает 179 наименований, в том числе 58 — на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ, МЕТОДЫ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

. . Объектами исследования являлись:

Почвы. Для проведения лабораторных исследований по изучению динамики различных групп микроорганизмов в нефтезагрязненной почве использовали два типа зональных почв - дерново-подзолистую среднесуглинистую (опытное поле МСХА, Москва, озимая пшеница) и чернозем типичный (Курская область. Курский район, картофель). Образцы отбирались из горизонта А,„,х с глубины 0-20 см.

о

Полевой опыт (l Cypiyt, 1юмснская обл ) проводился n.i yiaciKC насыпною нссчашно ipyiira, расположенном но im. icpjnoitoi о yijia laiOKoiuclicainoio ipyöonpo-пол i llo'mi.i опытного участка нодюяы иллкжиалыю-жслсшстс

I кфтепродукты В качестве за!рязнителя в модетьных лабораторных, опытах не пользовались три типа нефтепродуктов - дизельное топливо (на 75% состоящее из лс1ки\ углеводородов, в основном» алканов). сырая Талаканская нефть ( гегкая фракция (около 50%) состоит в основном из изо- и циклоалканов, по содержанию серы относится к 1 классу - малосернистые нефти (I ОСГ 912-66) и флотский чазу! (иреоб-ыдает тяжелая фракция - ароматические vi чсводороды) предоставленные ВНИИ по переработке нефти (Москва)

В полевом опыте по биоремедиации нефтезагрязненнои почвы и в сравнительных лабораторных испытаниях различных микробных биопрепаратов для биодегра-лаиии нефтепродуктов использовался газоконденсат (ГОСТ 17 1 4 01-80) состоящий па 40% из легких и на 60% из тяжелых упеводородов (алифатических ароматических и ациклических)

Микроорганизмы В работе использовались чистые культуры впервые выдетенных in нефтезагрязненной почвы штаммов микроорганизмов-деструторов иефти огне сенные к роду Pseudomonas - Ps putida st 91-V6hPs putida st 9 1V

Получение накопительных и выдепение чистых культур микроорганизмов зф-феюивно разлагающих нефтепродукты, веюсь на среде следующего состава пч (NH4)jHP04 -3,0. КН2Р04 - 2,0, VaCI - 0 5, MgS04 7НгО - О 3 СаС12 6ЬЬО - U 1 I еС1, 6И20 - 0 01, специально подготовленный безуперодный агар (Мишустин. Ру-пон 1957) - 20,0, дистиллированная вода - 1000 мл В качестве источника уг 1срода в среду добавляли от 0,5 до 5% нефтепродукта (дизельное топливо) Идентификация микроорганизмов проводилась по Определите но бактерий Берджи Дж Хоутта и др (1997) а также с помошью монографий «Бактерии рода Pseudomonas» (Смирнов, Ки-прианова 1990) и «Идентификация почвенных бактерии рода Pseudomonas» (Сквор-цопа 1983)

Для изучения динамики чиспениости и видового состава отдельных групп микроорганизмов нефтезагрязненной почвы в качестве питательных сред испочьзовали МПА (для микроорганизмов, использующих органические формы азота) КАЛ (для использующих минеральный азот) и нитритный агар (для автохтонной группы мик-

роорганизмов). Посевы проводились методом предельных почвенных разведений глубинным способом в четырехкратной повторности (Теппер и др., 1987; Егоров, 1998). Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы «Statistica 6.0».

На основе одного из выделенных штаммов микроорганизмов рода Pseudomonas (st. 91-96) был изготовлен новый торфяной микробный биопрепарат «Псевдомин» для рекультивации нефтезагрязненных почв. Препарат готовили методом инокуляции стерильного торфа культуральной суспензией. Титр готового препарата составлял 6,3* I07 КОЕ/г абс .сухого вещества препарата.

Полевой опыт по рекультивации почвы, загрязненной нефтепродуктами, с использованием «Псевдомина» был проведен на опытной базе лаборатории биотехнологии Сургутского государственного университета на участке насыпного песчаного грунта, расположенном возле кранового узла газокоиденсатного трубопровода. Для определения содержания нефтепродуктов и почве пользовались методом газовой хроматографии. Анализ образцов почв, загрязненных нефтепродуктами проводился в ПИИ разведки нефти (г. С.-Петербург).

Лабораторные исследования нового микробного препарата проводились совместно с лабораторией биотехнологии Сургутского Государственного университета, на базе ОАО «Сургутнефтегаз». Эффективность «Псевдомина» изучалась в сравнении с рядом других аналогичных биопрепаратов, разработанных различными научно-исследовательскими организациями.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Выделение из нефтезагрязнеиной почвы бактериальных штаммов-деструкторов, их идентификация, изучение свойств и способности к биодеградации нефтепродуктов

Как правило, штаммы углеводоролокисляютих микроорганизмов, способные к эффективному разложению нефтепродуктов в почве, выделяют из самбй загрязненной почвы, имеющей контакт с загрязнителем в течение продолжительного времени (Stolzenbach et al., 1993; Лысак, Лапыгина, 1994; Ягафарова. Скворцова, 1996). Благодаря искусственному отбору, эти микроорганизмы обладают более выраженными де-градационными свойствами, чем природные формы того же вида. В нашей работе пу-

тем многократных пересевов микробного сообщества нефтезагрязненной почвы на среды, содержащие нефтепродукт в высокой концентрации (свыше 10%), было получено два штамма бактерий-биодеградаторов нефтепродуктов. Штаммы были идентифицированы и отнесены к роду Pseudomonas виду putida. Штамм 91-96 был выделен ■из дерново-подзолистой почвы, загрязненной нефтепродуктами, отобранной вблизи ЛЗС и нефтехранилища (Москва и Московская обл.). Штамм 9:1V был получен из смеси дерново-подзолистой окультуренной почвы с песком, длительное время подвергавшейся искусственному загрязнению нефтепродуктами (в концентрации более 10%) в лабораторных условиях. В таблице 1 представлены основные характеристики выделенных штаммов:

Таблица 1

Основные морфологические и физиологические особенности выделенных штаммов

Признак Pseudomonas штамм 91-96 Pseudomonas штамм 9-.IV

Общая характеристика Короткие тонкие одиночные палочки; подвижные; грамотрица-тельные; спор нет.

Штрих на МП А: рост обильный; штрих широкий, матовый; профиль штриха выпуклый.

Рост по уколу в мясо-пентонной желатине: рост поверхностный; форма укола нитевидная; разжижения нет: газообразования нет.

Мяео-псптонный бульон: сплошная, тонкая, ирризирующая пленка; муть умеренная, однородная, постоянная; осадок скудный.

Колонии на МПА: рост быстрый; колонии крупные (3-5 мм); поверхность гладкая; структура однородная; край ровный.

()птиму м температуры 28-30

Рост при 42°С Нет

Оптимум р11 6,0-6,5 6,0-6,3

Пределы рН 5,2-7,0 5,0-6,8

Образование окраски: МИД: Картофельный агар: Растворимый зеленый пигмент (флуоресценция) Нет

Источники углерода Моно- и дисахариды, малат, сорбоза, дульцит, инулин, глицерин Моно- и дисахариды, малат, сорбоза, инулин

Источники азота NH/, NO3', пептон, аспара-гин, альбумин NHj*, NO3', пептон, аспарагин

Была установлена способность обоих штаммов утилизировать углеводороды

путем как сопряженного метаболизма, так и в монокультуре. Оба штамма были способны к активному росту на средах, куда были внесены нефтепродукты в качестве единственного источника углерода. При концентрации в среде нефтепродуктов, содержащих преимущественно легкие фракции (дизельное топливо, сырая нефть). 2 и

5% наблюдался активный рост культур; 10%-ная концентрация данных загрязнителей. хотя и задерживала развитие изучаемых штаммов, не являлась для них предельной. При добавлении мазута в концентрации 10% рост штамма Ps. putida 91-96 проявлялся слабо, штамма Ps. putida 9:IV отсутствовал. Это связано с большим содержанием трудно деградабельных для микроорганизмов компонентов, входящих в состав мазута.

2. Определение изменения численности различных групп микроорганизмов в нефтезагрязненной почве при внесении бактерий рода Pseudomonas в качестве агента биодеградации нефти

Углеводородокисляющие микроорганизмы, вносимые в нефтезагрязненную почву в количествах, превышающих любую природную популяцию одного вида и обладающих свойствами, активированными в процессе искусственного отбора, значительно перестраивают микробный комплекс, сложившийся в почве под влиянием загрязнителя. В модельном опыте изучалось воздействие различных нефтепродуктов на отдельные группы почвенных микроорганизмов, а также изменения численности этих групп под влиянием внесения активных штаммов выделенных углеводородокисляю-|цих бактерий рода Pseudomonas (Р. pulida st. 91-96 и Р. putida st. 91:IV) в нефтезагрязненную почву. Использовались три типа нефтепродуктов, различных по фракционному составу и в неодинаковой степени подвергающихся деградации - дизельное топливо, сырая нефть и мазут - в концентрации 500 мг/кг почвы.

Как показывают результаты опыта (рисунки 1-6), при внесении данной концентрации нефтепродуктов в почву, происходит не только стимулирование развития общего количества микроорганизмов, но и перераспределение доминантных видов сообщества. Сразу после внесения загрязнителя в вариантах со всеми типами нефтепро-дукгов численность всех групп микроорганизмов практически не отличается от контрольной, т.к. специфический углеводородокисляющий микробоценоз почвы еще не сформировался. Внесение в нефтезагрязненную почву активных культур бактерий-Гжодеградаторов с титром 3,8-4,6х105 КОЕ/г обеспечило увеличение общей численности микроорганизмов в соответствующих вариантах менее, чем на порядок (рис. 1 и 4). Такое небольшое увеличение численности обусловливалось адгезией клеток на поверхности почвенных частиц, а также стрессом микроорганизмов и утратой жизнеспособности клеток.

JtrJI

il -

í

Жал

< »

jÉEQjtoo » • ^й^ШЗТПЗШьюзаса

OKuKipQ» вЛТ O JT P m « w> ОДТ-Р>рахі»«9 |\

Oh m гол» вНсфт» ОНгф хрипли» ОИсфг» P p<nd> M * \

"I '

ОЬоетрсЛк «JT OJT-ftp-md* n* ОД F) » * (V

' " сиїЙгаіЛй

JtUtttittTM .

meurt»* ВНсфт» вНсфп, ^ fRMMte м 9 » OHe4<b-flpt№dte«f>

in і'Л)MМШЛп

О « ♦ Ч G » Р (•» • Г

P*t І гіімеоег** КТН «ее^оергенминю* jf*o {*&,»(-Mta« „» WAA t n

ПОИ 174Є СгЦПИ' НИМИ И«Ь en DC долам« ПСк M

fneec/jof«-* >ucrr*ou^> Ьж »рмі рсда f кЛл« «

Okmr^it. • 1» □ far (Se***» Ч OVuM-f pu.4*«»

О Hf -we»«» <Ц OM*«r<-fteunA*M*fV

fut 2 HjMff'tix) sMun«>wM.mM «fyotçnan« w« учи мва*мы ив MA » «ррпож* Э Ил«нечив «ic em юг т» мгирдоу »ччмо» ЧА • «рлсмм

ОКмпрм» ВДТ . рЛТ*Р<р1в(Ья9|У

OlianpM» вИ*фі» OH^ivftpu«!»»« CV

її І» * • ■ • J і» L-

— *иуд|"г™ З і • '

.'. m. —

l^éttT.

і GUecítílffiilffl^fcndbá ÊÂÏQ

ОКмлрм* «ЛТ вЛТ'Рі puní»« «1-4» ОДТНЧрцщЬя«^

Qk«*TpM» вДТ ВЗТ-ГіріамЬяФЬ* О ДТ*Л pvñ* я * Г/

jfíjjU

і,-h

і JÉfiÛ

^jffijffijtoio ^ ї^вв^ійзйавозій -

OKowipMk VHc+ib ОриыЬ * »1-9» OHe#fv*Pi pvbdia 4 IN

Ofonpcm 9Ht*n OIW+t»-Fi f*di » « J-*> OH«^t».tf4 piAda я «TV

О Кастро» A Mu>1 CI Мяуі-f» pMi • ♦>•«» ОЧи^тНЧ pun* я * (V

ОМ«ф>» akltni 0M**r»hpi«4>**1-* ОМют-ГірміАя»Л

ОКвитри» •М*і>т ОМ»*т«Л pulid» QMajyr^t pwid) я « (V

РЖ 4 №ш»цмна wniitfi»»*фрорг»«иэд.учтцааам«»мМП* ідарноа» Рисі И»ми»ии««шисстиwicooywawi».нёКАЛ ідариоао-поддолисте» почшл. мнмохиной ■ «а»т«ірсду<там» лр* «итроімиї • йот лшаолиспи лочм аатиои>ииойрцп»>**я>*>ап«првд»|т»ш пои имірвктам • ям

ігпмсчюродсшстииіизі бапаря» рода Рмийотопм угл—одородателиощн» баетарий роим Рииболмпаа

Рис в vowcmm« •wnewoov ммфооргвиишоа учиїьммимЕ на на. а дариою-юиолиствйпонм мциімииой мммшии мфталрмуктами. пои икіродяам» а ива упнолооыиюсгтиуа бжгарми род» Pseudomonas

Через неделю после начала эксперимента в вариантах с внесением дизельного топлива, содержащего легкодоступные углеводороды происходит резкое увеличение количества сапротрофов, учитываемых на МГ1А, в обоих типах почв (рисунки 1 и -1) Количество же микроорганизмов, использующих минеральный азот достигает максимума только на 15-е сутки (рисунки 2 и 5) В сообществе \і теводороцокистяюших микроорганизмов доминируют псевдомонады

При внесении в почву сырой нефти - лучшего питательного субстрата дзя pj i-вигия углеводородокисляющеи микрофлоры - наблюдался наиботее активный рост группы микроорганизмов, усваивающих органический азот, и их общая чиє іенность оставалась высокой до конца эксперимента (рис 1 и 4) Среди микроорганизмов, учи-імв.ісмьіх на КАА преобладали актиномицеты {максимальная численность бы іа дое пи нута на 30 сутки опыта) В вариантах с внесением дополнительных количеств у-іенодородокисляющих культур специфический микробныи комплекс формируется быстрее, процесс утилизации нефтепродукта протекает интенсивнее, помому по мерс расходования основного энергетического субсірата (30-е сутки жспсримсны при ы-I рязнении почвы сырой нефтью) появляются виды, характерные для незагрязненных почв (Baciltus mveotdes, В megaterium) К концу эксперимента соотношение основных таксонов, учитываемых на МПА, приближается к контрольному

Общая численность автохтонной группы также увеїичивается под действием дизельного топлива и нефти (рисунки 5 и 6), однако видовои состав сильно ооедняет ся - развиваются преимущественно родококки Преобтадание родококкои над всеми другими таксонами автохтонной микрофлоры наблюдалось и при внесении в почву и других нефтепродуктов В черноземной почве отмечалось довочьно значительное ко-чичество микрококков (около 7% при загрязнении нефтью и окото 12% при загрязнении почвы мазутом от общего чиста всех автохтонных микроорганизмов) Нокардис-полобные микроорганизмы и бактерии рода Arthrobacter в »тот период икеюг небольшую численность в обоих типах почв При внесении в почву активных микроор-I анизмов-деструкторов в более поздние сроки эксперимента в нефтезагрязненнои почве развиваются бактерии родов Nocardia, Arthrobacter Mycobacterium Місготопоьрога, к концу опьгга доля родококков преобладавших в нач ше, состав іхеі лишь около 15% в черноземе и около 18% в дерново-подзолистои почве от общего числа группы

Через 150 суток общая численность микроорганизмов в вариантах с внесением активных штаммов-биодеградаторов практически достигла уровня незагрязненной почвы (рис 1-6) Изменились и внешние признаки загрязненной почвы Под воздействием углеводородокисляющих бактерий произошло ослабление характерного запаха нефтепродуктов, уменьшилась липкость почвы, загрязненной мазутом и практически исчезла маслянистая пленка с поверхности частиц почвы, подвергавшейся загрязнению дизечьным топливом и сырой нефтью

3 Изучение степени биодеградации нефтепродуктов в почве под действием микробных препаратов на основе углеводородокисляющих бактерий рода Pseudomonas (полевой опыт)

Д тя целей практического применения одного из выделенных углеводородокис-1Я1оших штаммов (Pseudomonas putida st 91-96) был изготовлен торфяной микробный препарат «Псевдомин» Препарат готовили путем инокуляции торфа культуральной кидносгыо, титр готового препарата составлял 6,3x10' КОЕ/г абс сухого вещества препарата Его эффективность была исследована в полевых условиях на участке за-1 ря женной газоконденсатом почвы

На базе Сургутского Государственного университета были проведены полевые испытания, в которых кроме нашего препарата «Псевдомин», в сравнительных i оях применялся микробный препарат «Нафтокс» на основе бактерий рода Pseudomonas (ВНИИ разведки нефти и ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, I Санкт-Петербург) Цеть данных испытаний - оценить перспективы использования биопрепаратов при рекультивации кефтезагрязненных почв в устовиях севера (г С ургут, Ханты-Мансийский АО, Тюменская область. Западная Сибирь), где климатические условия характеризуются суровой и длительной зимой, коротким, часто жарким петом и коротким весенне-осенним периодом, в течение которого не успевают развернуться процессы естественной микробной биодеградации В качестве биотеста, характеризующего степень очистки грунта, использовался костер безостый

В таблице 2 и на рисунке 7 представлены результаты изменения содержания нефтепродукта в почве под воздействием биопрепаратов

Таблица 2

Влияние микробных препаратов «Псевдомина» и «Нафтокса» на биодеградацию газового конденсата в почве (производственный опыт (длительность 2,5 месяца), г. Сургут).

Показатели Серии опыта

Контроль Псевдомин Нафтокс

1« 2 3 4 1 2 3 4

(Хэшее количество органического вещества в загрязненной почве, мг/кг почвы 690,7 718,6 707,1 740,3 693,1 719,8 726,4 702,0 614,6

Общее количество нефтепродукта, мг/кг почвы 525,9 531,6 508,2 563,8 519,6 538,9 543,2 511,7 495,2

Остаточное количество органического вещества, мг/кг почвы 286,0 39,5 13,4 57,7 58,2 11,5 17,4 38,6 47,9

Остаточное количество нефтепродукта, мг/кг почвы 217,7 29,2 9,7 44,0 43,7 8,62 13,0 28,1 38,6

/^■радировано нефтепродукта, % 58.6 94,5 98,1 92,2 91.6 98.4 97.6 94,5 92,2

Количество растений /1 м"- 42 72 34 36 75 65 47 32

Масса растений, гПм' - 82 100 51 13 113 109 67 24

* Варианты опыта: Контроль - почва, загрязненная газоконденсатом; 1-Биопрепарат; 2-Киоирепарат + N120? нюК«; 3-Биопрепарат + МипРнюКчо + торф; 4-Биопрепарат + ЫииРиюКч» торф ч- опилки; ** В таблице приводятся средние данные из трех определений; *** ПДК для нефтепродуктов 100 мг/кг почвы

Диаграмма на рисунке 7 иллюстрирует зависимость количества зеленой массы костра безостого от остаточного содержания нефтепродуктов в рекультивируемой почве.

I Остаточное содержание исфтетіродуїст 08, мг/кг

□ Зеленая . масса костра безостого, г/м2

Рис. 7. Соотношение остаточных количеств нефтепродукта и зеленой массы костра безостого при рекультивации нефтезагрязненной почвы с помощью биопрепаратов «Псевдомина» и «11афтокса».

Как видно из таблицы 2, внесение в почву «Псевдомина» за время эксперимента (2 5 месяца) привело почти к полной биодеградации нефтепродукта - он был трансформирован на 91,6-98,4% При внесении в песчаный грунт торфа и опилок эффективность очистки несколько снизилась, однако обеспечила деградацию нефтепродукта значительно ниже ПДК Эффективность действия «Псевдомина» при дополни-leTMtoM внесении минерального удобрения увеличивалась, что объяснялось уменьшением дефицита биогенных эаементов необходимых для развития бактерий сома пляюших основу биопрепарата

Диарамма на рисунке 7 иллюстрирует результаты опыта по рекутьтивации почвы загрязненной нефтепродуктами с использованием биопрепаратов и растений

Посев костра безостого в качестве тест-культуры, на фоне действия испытываемых препаратов, выявил резко отрицатетыгую реакцию растения на уровень ta-фяшении ночвы нефтепродуктом Зеленая масса коефа была тем меньше чем больше йьию оекпочное содержание I локопденеаы Kotффилиеш корреляции Ilupemu (Дмшриев 1995) был отрицательным и составлял -07

Определение численности микроорганизмов в нефтезагрязненной почве, ре-кутьгивируемой с помощью биопрепаратов, проводилось методом посева последова-ге [ьных почвенных разведений на плотную питательную среду МПА, к которой был юб плен нефтепродукт (газоконденсат) в качестве селекционирующего агента и до-iio пине ibiioixi источника у!лерода jjm yi 1Сводородокиеляю1Ци\ бакчерии Регулы i-гы определения чиспенности микроорганизмов представлены в таблице 3

Таблица 3

Численность микроорганизмов (учитываемых на МПА + 0 5% нефтепродукта), в I ч бактерий рода Pseudomonas, внесенных в рекультивируемую почву с биопрепара-_тамн (КОЕ/r абс сукой почвы)_

Варианты опыта

Контроль

Псевдомик + костер безостый

Серии опыта

Нафтокс + костер безостый

Кош роль 1 10J 1

1 Ьнопрепарлт | 1 8 66 I О4 2 42 104

2 Ыкшрепарат •<- М|10Р(801Сд0 | ' 1 23 10° S 43 !0"

3 Ьиопрепарат->-Ni2oPisoK-«o - торф 3 90 Ю6 1 10 1Ü6

4 Биопрепарат-i-NiioPisoKflo - торф опилки 2 01 10" 1 58 10"

Из таблицы 3 видно, что общая численность микроорганизмов, учитываемых на МПА + 0,5% газоконденсата, существенно увеличивается с внесением удобрений, главным образом минеральных, что согласуется с литературными данными (Холоденко и др., 1996; Cunlla, Ferreira, 1997; Алексеева и др., 2000). После заливки почвы нефтепродуктом общее количество микроорганизмов увеличивается почти на порядок. Можно предположить, что рекультивируемая почва (до заливки) уже содержала значительное количество почвенных бактерий, способных к использованию нефтепродукта, которые при появлении нового подходящего субстрата, активизировались.

Таким образом, созданный нами на основе бактерий Pseudomonas putida биопрепарат «Псевдомин» активно разлагает нефтяные загрязнения. Его применение будет способствовать деградации растворенных и высокоэмульгированных нефтепродуктов, освобождение от которых можно считать пределом возможности механических способов очистки. Оптимальная биодеградация нефтепродуктов, при использовании данного препарата, происходит при pH 6,5-7,5 и обеспечении хорошей аэрации.

В целом, процесс биоремедиации нефтезагрязненных почв с помощью биопрепарата «Псевдомин» на основе углеводородокисляющих бактерий Pseudomonas putida, как показывает анализ остаточных количеств нефтепродукта и определение численности микрофлоры, значительно ускоряется и это не приводит к отрицательным последствиям для почвенных условий, так как не нарушается баланс почвенной микрофлоры. Новый микробный препарат можно признать весьма эффективным для биодеградации нефтепродуктов в почве, однако для нас представляло интерес исследовать его эффективность в сравнении с другими аналогичными препаратами.

4. Сравнительные испытания биопрепарата «Псевдомин» и других микробных биопрепаратов при их воздействии на застарелое нефтяное загрязнение почвы (лабораторный опыт)

В полевых экспериментах эффективность действия «Псевдомина» изучалась в сравнении с препаратом «Нафтокс». Впоследствии нам представилась возможность сравнить его эффективность и с другими аналогичными биопрепаратами для биоремедиации нефтезагрязненных почв. Лабораторные испытания проводились совместно с лабораторией биотехнологии Сургутского Государственного университета, на базе

ОАО «Сургутнефтегаз» Целью проведенных исследований являлась оценка способности предложенных биопрепаратов активизировать процесс разложения нефтяных ыгризпишй в испытуемых образцах почвы в лабораторных условиях

Эффективность препаратов оценивалась по следующим критериям Критерии I Установить время, в течение которого достигается 50%-ная эффективность, т е провести отбор препаратов, быстро расщепляющих углеводороды нефти. Критерий 2 Оценить эффективность воздействия биопрепаратов при достижении максимального снижения уровня загрязнения за 11 недель

В гтблице 4 отражены относительные количественные показатели эффективности препаратов в соответствии с обоими критериями оценки (за первые 5 недель и по окончании опыта, через 11 недель эксперимента)

I аблица 4

Эффективность (%) биопрепаратов при деструкции нефтепродуктов в почве

Препарат Длительность воздействия, недели

1 2 | 3 1 4 5 И

Девороил і , 8 22 36 54 '40 47 ,49.41 і 54 46 64 92

Девороил 2 8 20 61,49 63 03 67 22 68 37 72 51

Девороил (паста) 15 54 40 51 42 28 50 25 53 74 64 83

Ьиоприн 8 22 31 29 35 08 49 42 51 10 62 3

Иіішіол 15 22 58 94 63,98 1 67 56 | 68 85 78 53

Фасрзаим 27 71 58 32 61 45 63 80 I 66 75 74 74

Деі радоилас 81 29 60 39 99 46 05 52 72 53 82 -

Дчрадоилас 9 8 73 29 69 36 72 48 82 1 59 06 -

Речедиаст 20 00 65 32 65 67 72 37 73 07 -

n ь70 8 52 63,36 66 28 72 34 72.84 -

V 4-і') 15 82 67 37 68 54 69 5 74,54 -

V 670 (холод) 9 26 132 76 42,30 48 72 49 61 -

1ІСЧПОМШІ ("ни»к" )* 11,26 26,98 41,68 42,44 52,59 75 66

Пссплимин (-ВІ 1С" >** 16,85 25,36 27,90 30,98 34,60 41 12

1Нфгокс( низк ) 32,02 і 41 38 44 09 46 31 50 49 73 40

Пафгокс( выс > '12 50 60 10 61,13 64 21 65 58 72 43

11аф токе жидк ( ІІИЖ')" -8.62 1.97 24 63 41 87 46 80 70 94

11аф токе жидк ( выс )** 10 53 15 60 21,24 28,57 32,10 44 74

•начальная концентрация нефтепродукта в почве около 200 мг/кг почвы ••начальная концентрация нефтепродукта в почве около 600 мг/кг почвы

Примечание во всех вариантах, за исключением кювет с внесением пссвдомина чафтпкеа и ішфтакса жидкого, через 3 недети проведена дополнительная обработка почвы биопрепаратами

Некоторые из испытываемых биопрепаратов проявили высокую эффективность лишь в первой серии опыта, результаты которой не были подтверждены во второй серии. Результаты определения степени биодеградации нефтепродукта были статистически недостоверны, поэтому, в таблице 4 в последней графе не указана суммарная эффективность этих препаратов (прочерк). Результаты первой серии испытании данных препаратов не учитывались в итоговом ранжировании препаратов (таблица 5). Из таблицы 4 видно, что препарат «Псевдомин» за первые 5 недель не проявляет высокой активности, т. е. по критерию 1 он имеет довольно низкую оценку (10 место среди представленных препаратов), но через 11 недель он проявил высокую эффективность и результаты его действия были стабильны (2 место по критерию 2).

На рисунке 8 представлена диаграмма, иллюстрирующая суммарную эффективность препаратов, прошедших обе серии испытаний при биодеградации нефтяного чагрязнения.

ч» но

1 70 1 Ы)

I 50

3 40

§ .10 20

10 I)

"75753"

УЗ?

19.М

ТЕ —

74 74 75.7

I 2..

5 2

? а

эффективности биопрепаратов

наименование биопрепарата

Рис. 8. Оффективность биопрепаратов за 11 недель эксперимента, %.

Для повышения эффективности биопрепаратов в нефтезагрязненную почву совместно с ними вносились минеральные удобрения (Ы$оР5о), призванные стимулировать развитие углеводородокисляющей микрофлоры препарата в начальный период. песок и мел (условия аэрации и кислотности соответственно). Подкормка минеральными удобрениями проводилась и в течение опыта (примерно через полтора месяца в половинной дозе). В этих условиях по прошествии полного срока эксперимента «Псевдомин» получил высокую оценку в соответствии с критерием 2 (табл.4, рис.

Микроорганизмы, составляющие основу «Псевдомина» наиболее сильно отзывались на внесение минеральных удобрений по сравнению с другими препаратами Стимулирование их действия было особенно заметно в варианте с низким начальным уровнем загрязнения — около 200 мг/кг почвы (табл 9) В этом случае эффективность препарата возрастала на 22, 1% относительно варианта без внесения удобрений

На рисунке 9 отражена эффективность воздействия «Псевдомина» на нефте-нрочукты при дополнитеи»ном внесении минеральных удобрений Для сравнения приведены аналогичные данные по «Нафтоксу»

■ первичная обработка □ подкормка

контроль

псевдомин

и-шмсноеоыис пре 1а;ип*

Рис 9 Влияние внесения минеральных удобрений на эффективность биодеградации исф1епродуктов биопрепаратами

С \ четом обоих критериев оценки способности препаратов к деструкции заста-рс н 1х нефтяных загрязнении представленные биопрепараты за исключением тех, шя которых результаты первой серии опытов не подтверждены второй, можно расположить в стед>ющий ряд

Таблица 5

Ранжирование биопрепаратов по эффективности с учетом обоих критериев оценки

Наименование препарата Ранг в соответствии с критериями оценки I и 2

Инипол 1

Фаерчайм Деворойл 2 -1

Псевдомин 3

Нафтокс 4

Деворойл 1 5

Нафтокс жидк 6

Деворойл паста 7

Биоприн 8

* Ранжирование проводилось совместно с ОАО «Сургутнефтегаз» ** В таблице не представлены препараты результаты испытаний которых в 1 серии ■ кстримента не подтверждены ио второй

На основании полученных экспериментальных данных, «Псевдомин» уступает по эффективности иниполу, фаерзайму и деворойлу 2. Но его можно признать безусловно перспективным деструктором нефтепродуктов в почве, значительно ускоряющим разложение загрязнителя. Исходя из принятых критериев оценки эффективности биопрепаратов, (т.е. скорости разложения нефтяных загрязнений и общей конечной эффективности биодеградации нефтепродукта), «Псевдомин» стоит на третьем месте. Эффективность его составляла 75,7% при нефтяном загрязнении около 200 мг/кг. Выявлено повышение эффективности действия «Псевдомина» при совместном внесении с ним минеральных удобрений. Деградационная активность препарата увеличивается на 22,1%.

Сравнивая результаты полевых и лабораторных опытов, различия в степени эффективности «Псевдомина» можно объяснить разностью углеводородного состава и возрастом загрязнителя, использовавшегося в эксперименте (в сравнительном лабораторном опыте изучалось воздействие на застарелое нефтяное загрязнение). Несмотря на более низкую эффективность биопрепарата в лабораторных условиях, чем в полевых, в сравнении с другими 13 препаратами, разработанными различными научно-исследовательскими организациями, «Псевдомин» проявил себя эффективным деструктором нефтепродуктов в почве и может быть рекомендован для биоремедиации I юфтезагрязленных территорий.

ВЫВОДЫ

1. Впервые из нефтезагрязненной почвы выделены бактериальные штаммы, способные к росту на средах с высокими концентрациями нефтепродуктов (свыше 10% от объема среды), использующие углеводороды, входящие в состав дизельного топлива, сырой нефти и мазута в качестве единственных источников углерода и энергии. Изучение морфологии и физиологии выделенных бактерий позволило отнести их к роду Pseudomonas виду putida (штамм 91-96 и штамм 9:IV).

2. Исследованы изменения биологических характеристик почв, загрязненных различными типами нефтепродуктов, при использовании выделенных штаммов псевдомонад в качестве активного агента биоремедиации. Установлено, что при внесении выделенных углеводородокисляюших бактерий в почву, загрязненную дизельным топливом, в течение 150 суток ослабляется токсическое воздействие последней на растения.

Выявлено, что при интродукции в почвы подвергшиеся высокому (500 чг/кг почвы) »агрязнению различными типами нефтепродуктов - дизельного топлива, сырой 1 з иканской нефти и флотского мазута - штаммов Ps putida 91-96 и Ps putida 9 IV происходит интенсивное раззожение ими нефтепродуктов в период 7-30 сутки В микробном углеводородокисзяющем комплексе преобладают внесенные бактерии, IKTHBHO утилизирующие углеводородный субстрат

3 Разработана технология изготовления торфяного микробного биопрепарата «Псевдомин» на основе одного из вылеченных углеводородокисляющих штаммов Pseudomonas putida (st 91-96) Выявлена их способность размножаться в торфе и длительное время сохранять жизнеспособность в почве, что указывает на возмож-нос!ь д-ппельного последействия на нефтепродукты, остающиеся в почве

4 Выявлено, что при биоремедиации нефтезагрязненных почв (Сургутский район Поменская обл ) с использованием биопрепарата «Псевдомин» в течение 2,5 месяцев происходит почти полное разложение нефтепродуктов При использовании минеральных удобрений эффективность достигает 98 1% (при начальной концентрации нефтепродукта около 500 мг/кг)

- Восстановление микробного комплекса нефтезагрязненной почвы происходит в ус ювиях хорошей аэрации и pH почвенного раствора близком к нейтральному

5 Показано, что «Псевдомин» в сравнении с рядом подобных препаратов-бнодеструторов разработанных различными организациями, обладает высокой эффективностью Так, при загрязнении почвы нефтепродуктами в концентрации около 200 мг/кг почвы, его эффективность составила 75,7% Причем, значительное положите 1ьное влияние на активность препарата оказали минеральные удобрения При юно шительном внесении азотных и фосфорных удобрений в процессе рекультивации почвы, степень эффективности «Псевдомина» увеличилась на 22,1% Высокая упеводородокистяюшая активность штамма Pseudomonas putida st 91-96 составляющего основу биопрепарата, простота изготовления и применения, а также от носитепьная быстрота и стабильность действия позволяют считать «Псевдомин» пригодным для биоремедиации нефтезагрязненных территорий в условиях Севера, i le теш ыи период непродолжителен и процессы естественной биодеградации не успевают разверну гься

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Емцев В. Т., Селицкая О. В., Станкевич Д. С. Микробная рекультивация нефтезагряз-ненных почв // "Savremena Poljoprivreda", vol.46, Vanredni Broj. - 1998. - Novi Sad, Jugoslavia. - str.21 -26.

2. Станкевич Д. С. Использование бактерий рода Pseudomonas для очистки почвы от загрязнения нефтепродуктами // III экологическая конференция студентов и молодых ученых вузов г. Москвы «Охрана окружающей среды на пороге третьего тысячелетия в интересах устойчивого развития». Москва, 27 апреля 1999 г. Т.1, С. 108-111.

3. Станкевич Д. С. Микроорганизмы - деструкторы нефтепродуктов в почве и их использование // Международная конференция «Микробиология и биотехнология на рубеже XXI столетия». Минск, 1-2 июня 2000 г. - Минск, 2000. - С. 214.

4. Емцев В. Т., Селицкая О. В., Станкевич Д. С., Алехин В. Г. Микробная биоремедиация нсфтеэагрязненных почв // III съезд Докучаевского общества почвоведов. Суздаль, 2000 г. Кн. 2. С. 18-19.

•5. Stankevich D. Bioremediation of the Oil-Contaminated Soil and Microbial Biopreparation "Pseudomine" // The Second International Iran and Russia Conference "Agriculture and Natural Resources", Moscow, February 1-2,2001, Abstracts. - P. 30-31.

6. Емцев В. Т., Селицкая О. В., Станкевич Д. С. Рекультивация нефтезагрязненных почв с использованием биопрепаратов Международная научно-практическая конференция "Экологически безопасные технологии в сельскохозяйственном производстве XXI века. Владикавказ, 2001.-С. 180-181.

7. Stankevich D. Bioremediation of the Oil-Contaminated Soil and Microbial Biopreparation "Pseudomine" // The Second International Iran and Russia Conference "Agriculture and Natural Resources", Moscow, Feb., 1-2,2001, Proceedings. - P.l 18-122.

8. Станкевич Д. С. Бактерии рода Pseudomonas — эффективные биоремедиаторы нефтезагрязненных почв I/ Конференция молодых ученых МСХА. Москва, МСХА, 5-6 июня 2001. vvww.timakad.ru

9. Stankevich D., Emtsev V. The problem of oil-contaminated soil and microbial preparations // Acta Agricultural Serbica. - 2002. - V. 5, N 9. - P. 3-10.

10. Emtsev V., Stankevich D. Microbial preparations and its using for bioremediation of petroleum contaminated soil //17 World congress of Soil Science. Soil Science: Confronting New Realites in the 21s1 Century. - Bangkok (Thailand), 14-21 Aug., 2002. Full paper is accepted.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Объем _Зак *f%3_Тираж JCC

AHO «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Станкевич, Дарья Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Проблема нефтяного загрязнения окружающей среды и восстановление природных экосистем.

1.2 Влияние нефтяного загрязнения на свойства почвы и почвенную биоту.

1.3 Микробная деструкция нефти в почве и факторы, влияющие на ее интенсивность.

1.4 Бактерии рода Pseudomonas и их биологические особенности. Углеводородокисляющие штаммы видов рода Pseudomonas, способные к эффективной биодеструкции углеводородов нефти.

1.5 Биоремедиация нефтезагрязненных почв и применение биопрепаратов на основе микроорганизмов-деструкторов нефти, в т.ч. бактерий рода Pseudomonas.

1.6 Проблема выживания интродуцированных микроорганизмов, экологическая безопасность микробного метода очистки нефтезагрязненных почв.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

И. ОБЪЕКТЫ, МЕТОДЫ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

2.1 Методика изучения влияния нефтепродуктов на физико-химические свойства и фитотоксичность почвы.

2.2 Методика изучения динамики численности микрофлоры в неф-тезагрязненной почве.

2.3 Методика выделения из почвы штаммов микроорганизмов, способных к разложению нефтепродуктов.

2.4 Методы изучения свойств выделенных углеводородокисляющих штаммов рода Pseudomonas и методика оптимизации питательных сред для их культивирования.

2.5 Методика изучения изменения фитотоксичности нефтезагряз-ненной почвы при внесении углеводород окисляющих бактерий.

2.6 Методика изучения динамики численности различных групп микроорганизмов нефтезагрязненной почвы при внесении штаммов бактерий-деструкторов нефтепродуктов.

2.7 Методика приготовления торфяного микробного биопрепарата «Псевдомин» на основе выделенных штаммов микроорганизмов рода Pseudomonas.

2.8 Методика проведения полевого эксперимента по изучению эффективности разложения нефтепродуктов в почве под действием микробных биопрепаратов.

2.9. Методика проведения сравнительного исследования эффективности различных биопрепаратов для деструкции углеводородов на нефтезагрязненных почвах.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Изучение влияния нефтепродуктов на физико-химические свойства и фитотоксичность почв.

3.2 Изучение динамики численности различных групп микроорганизмов при загрязнении почвы нефтепродуктами.

3.3 Выделение из нефтезагрязненной почвы бактериальных штаммов деструкторов нефти.

3.4 Изучение морфологических, культуральных и физиолого-биохимических особенностей выделенных из загрязненной почвы бактерий, способных к трансформации нефтепродуктов.

3.4.1 Идентификация выделенных углеводородокисляющих бактерий.

3.4.2 Изучение роста и развития выделенных бактерий на питательных средах с различными источниками углерода и азота.

3.4.3 Изучение способности выделенных бактерий к росту на средах с различными концентрациями нефтепродуктов.

3.5 Исследование изменения фитотоксичности почвы, загрязненной нефтепродуктами, при дополнительном внесении углеводородо-кисляющих бактерий рода Pseudomonas.

3.6 Определение изменения численности различных групп микроорганизмов в нефтезагрязненной почве при внесении бактерий рода Pseudomonas в качестве агента биодеградации нефти.

3.7 Изучение степени биодеградации нефтепродуктов в почве под действием микробных препаратов на основе углеводородокисляю-щих бактерий рода Pseudomonas (полевой опыт).

3.8 Сравнительные испытания биопрепарата «Псевдомин» и других микробных биопрепаратов при их воздействии на застарелое нефтяное загрязнение почвы (лабораторный опыт).

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование углеводородокисляющих бактерий рода Pseudomonas для биоремедиации нефтезагрязненных почв"

Актуальность проблемы

В настоящее время добыча нефти и производство нефтепродуктов играют в нашей жизни огромную роль. Но чем больше масштабы производства, тем больше и масштабы нефтяного загрязнения окружающей среды. Они поистине огромны. Нефть и нефтепродукты признаны приоритетными загрязнителями планеты (Израэль, Ровинский, 1986; Amadi et al., 1993). В первую очередь процесс добычи нефти отражается на загрязнении почвы. Нарушается равновесие в экосистеме вследствие изменения состояния почвенного покрова и геохимических свойств. В почве устанавливается новое динамическое состояние, параметры которого сильно отличаются от исходных (Киреева, 1996). Это приводит к отторжению земель из сельскохозяйственного использования, в связи с чем проблема рекультивации нефтезагряз-ненных почв становится весьма актуальна.

Естественное очищение почв, вод и других природных объектов от нефтяного загрязнения является длительным процессом, зависящим от природных условий (Bossert, Bartha, 1984; Пиковский, 1993). Определяющую роль в процессах самоочищения почв от нефти играют микроорганизмы (Гусев, Коронелли, 1981; Славнина, Середина, 1992). Большинство известных биотехнологических способов очистки основано на использовании чистых и смешанных культур микроорганизмов в сочетании с различными веществами или приемами, стимулирующими их активность (Исмаилов, 1985; Rosenberg, 1985). Эти способы зарекомендовали себя как эффективные и наиболее естественные средства охраны природной среды. Направленное регулирование жизнедеятельности углеводородокисляющих микроорганизмов в природных субстратах (почве, воде и др.), построенное на углубленном познании их биологии, призвано сыграть большую роль в решении ряда актуальных проблем современности, связанных с многочисленными случаями нефтяного загрязнения почв и водных бассейнов (Квасников, Клюшникова, 1981; Гузев и др., 1989). Однако в природоохранных мероприятиях, направленных на борьбу с нефтяными загрязнениями, биотехнологические препараты пока не играют заметной роли, что ведет к увеличившемуся риску загрязнения окружающей среды и повышению энергоемкости механических способов очистки. Знания о физиологии и экологии нефтеокисляющих микроорганизмов и условиях их успешной интродукции в природные экосистемы необходимы для развития экологической биотехнологии в нашей стране. Недостаток отечественных биопрепаратов-деструкторов нефти неизбежно приведет к заполнению национального рынка импортными аналогами, зачастую худшего качества, и как следствие, поставит Россию в необратимую зависимость от импорта (Киреева, Новоселова, 1996).

Цель работы - выделить из почвы эффективные штаммы микроорганизмов-деструкторов нефтепродуктов и разработать с их использованием способы биоремедиации нефтезагрязненной почвы.

Задачи исследования;

• получить методами аналитической селекции и выделить в чистой культуре перспективные штаммы микроорганизмов-деструкторов нефти;

• идентифицировать выделенные микроорганизмы, выявить их углеводо-родокисляющую способность и оптимизировать условия роста для получения микробной биомассы;

• разработать технологию приготовления и применения нового микробного препарата на основе наиболее активного выделенного штамма для биоремедиации нефтезагрязненных почв; изучить его эффективность в условиях реального нефтяного загрязнения;

• исследовать эффективность нового микробного биопрепарата в сравнении с другими аналогичными препаратами для рекультивации почв, загрязненных нефтепродуктами.

Научная новизна

Впервые из нефтезагрязненной почвы выделены бактериальные штаммы, способные к росту на средах с высокими концентрациями нефтепродуктов (свыше 10% от объема среды), использующие углеводороды, входящие в состав дизельного топлива, сырой нефти и мазута в качестве единственных источников углерода. Полученные культуры идентифицированы и отнесены к роду Pseudomonas виду putida (st. 91-96 и st. 9:IV). Показано, что при внесении выделенных штаммов в почву, загрязненную нефтепродуктами, существенно снижается фитотоксичность почвы, а численность и соотношение отдельных групп микроорганизмов приближаются к соответствующим показателям незагрязненной почвы.

Выявлено, что при биоремедиации нефтезагрязненных почв (Сургутский район, Тюменская обл.) с использованием биопрепарата «Псевдомин» на основе одного из выделенных штаммов (Pseudomonas putida st. 91-96) в течение 2,5 месяцев происходит почти полное разложение нефтепродуктов. При совместном использовании с ним минеральных удобрений эффективность достигает 98,1%. Микробиологический анализ образцов рекультивируемой почвы выявил высокую активность штамма и способность размножаться в загрязненной почве.

Показано, что «Псевдомин» в сравнении с рядом подобных биопрепаратов, разработанных различными научно-исследовательскими организациями, обладает достаточно высокой эффективностью. Так, среди 14 испытанных биопрепаратов, «Псевдомин» по суммарному деградационному действию на нефтепродукты в почве явился одним из лучших.

Практическая значимость

На основе выделенного из нефтезагрязненной почвы штамма бактерий-деструкторов углеводородов нефти разработана технология приготовления нового микробного препарата «Псевдомин» для биоремедиации почв, загрязненных нефтепродуктами и оптимизированы способы его применения совместно с различными мелиорантами. Новый биопрепарат «Псевдомин», пройдя серию полевых и лабораторных испытаний, зарекомендовал себя как эффективный деструктор нефти. Результаты работы могут быть использованы для дальнейших биотехнологических исследований и при разработке комплексных технологий по восстановлению нефтезагрязненных почв, завершающей стадией которых является микробиологическая. Биопрепарат «Псевдомин», благодаря своей высокой эффективности, быстроте действия и простоте применения, может быть рекомендован для использования в северных нефтедобывающих регионах (где климат характеризуется коротким теплым периодом) в качестве активного агента биоремедиации нефтезагрязненных почв, ускоряющего процесс разложения нефтепродуктов.

Работа выполнена в 1996-2001 году на кафедре микробиологии Московской сельскохозяйственной академии имени К.А. Тимирязева и лаборатории биотехнологии Сургутского государственного университета.

Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю - профессору, д.б.н. В. Т. Емцеву, а также к.б.н. О. В. Селицкой, профессору, к.с-х.н. В. А. Калинину и профессору, д.с-х.н. В. Г. Алехину, за ценные консультации при выполнении данной работы; а также выражает признательность всем сотрудникам кафедры микробиологии за оказанное содействие и предоставленную возможность провести необходимые эксперименты.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Станкевич, Дарья Сергеевна

выводы

1. Впервые из нефтезагрязненной почвы выделены бактериальные штаммы, способные к росту на средах с высокими концентрациями нефтепродуктов (свыше 10% от объема среды), использующие углеводороды, входящие в состав дизельного топлива, сырой нефти и мазута в качестве единственных источников углерода и энергии. Изучение морфологии и физиологии выделенных бактерий позволило отнести их к роду Pseudomonas виду putida (штамм 91-96 и штамм 9:IV).

2. Исследованы изменения биологических характеристик почв, загрязненных различными типами нефтепродуктов, при использовании выделенных штаммов псевдомонад в качестве активного агента биоремедиации. Установлено, что при внесении выделенных углеводородокисляющих бактерий в почву, загрязненную дизельным топливом, в течение 150 суток ослабляется токсическое воздействие последней на растения.

- Выявлено, что при интродукции в почвы, подвергшиеся высокому (500 мг/кг почвы) загрязнению различными типами нефтепродуктов - дизельного топлива, сырой Талаканской нефти и флотского мазута - штаммов Ps. putida 91-96 и Ps. putida 9:IV происходит интенсивное разложение ими нефтепродуктов в период 7-30 сутки. В микробном углеводородокисляю-щем комплексе преобладают внесенные бактерии, активно утилизирующие углеводородный субстрат.

3. Разработана технология изготовления торфяного микробного биопрепарата «Псевдомин» на основе одного из выделенных углеводородокисляющих штаммов Pseudomonas putida (st.91-96). Выявлена их способность размножаться в торфе и длительное время сохранять жизнеспособность в почве, что указывает на возможность длительного последействия на нефтепродукты, остающиеся в почве.

4. Выявлено, что при биоремедиации нефтезагрязненных почв (Сургутский район, Тюменская обл.) с использованием биопрепарата «Псевдомин» в течение 2,5 месяцев происходит почти полное разложение нефтепродуктов. При использовании минеральных удобрений эффективность достигает 98,1% (при начальной концентрации нефтепродукта около 500 мг/кг).

- Восстановление микробного комплекса нефтезагрязненной почвы происходит в условиях хорошей аэрации и рН почвенного раствора, близком к нейтральному.

5. Показано, что «Псевдомин» в сравнении с рядом подобных препаратов-биодеструкторов, разработанных различными организациями, обладает высокой эффективностью. Так, при загрязнении почвы нефтепродуктами в концентрации около 200 мг/кг почвы, его эффективность составила 75,7%. Причем, значительное положительное влияние на активность препарата оказали минеральные удобрения. При дополнительном внесении азотных и фосфорных удобрений в процессе рекультивации почвы, степень эффективности «Псевдомина» увеличилась на 22,1%.

Высокая углеводородокисляющая активность штамма Pseudomonas putida st. 91-96, составляющего основу биопрепарата, простота изготовления и применения, а также относительная быстрота и стабильность действия позволяют считать «Псевдомин» пригодным для биоремедиации нефтезагрязненных территорий в условиях Севера, где теплый период непродолжителен и процессы естественной биодеградации не успевают развернуться.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Станкевич, Дарья Сергеевна, Москва

1. Абрамец А. М., Дударчик В. М., Ивашкевич J1. С. и др. Гуминовые препараты для мелиорации рекультивируемых песчаных почв // Химиз. с. х. - 1988. - № 3. -С. 68-71.

2. Алексеева Т. П., Бурмистрова Т. И., Терещенко Н. Н. и др. Перспективы использования торфа для очистки нефтезагрязненных почв // Биотехнология. -2000. -№ 1.-С. 58-64.

3. Алещенкова 3. Н., Самсонова А. С., Байкова С. В. и др. Использование Rhodococcus erythropolis для ускорения деградации дибутилфталата в почве // Биотехнология. 1997. - №11-12. - С. 59-63.

4. Алиев С. А., Гаджиев Д. А. Влияние загрязнения нефтяным органическим веществом на активность биологических процессов почв // Изв. АН АзССР. Сер. биол. наук. - 1977. - № 2. - С. 46-49.

5. Андерсон Р. К., Багаутдинов Ф. Я., Бойко Т. Ф. и др. Использование микробиологического метода для очистки нефтезагрязненных почв // Интродукция микроорганизмов в окружающую среду. Тез. докл. конференции. Москва 17-19 мая 1994 г.-С. 10.

6. Андрусенко М. Я., Рунов В. И. Углеводородокисляющие бактерии и лучистые грибы, выделенные из нефтеносных почв Узбекистана, как продуценты биомассы и биологически активных веществ // Микробиологическая промышленность. 1973.-В. 1.-С. 23-27.

7. Аристовская Т. В. Большой практикум по микробиологии / под общ. Редакцией проф. Г. Л. Селибера. М.: ВШ, 1962.

8. Артемьева Т. И., Штина Э. А. Экологические последствия загрязнения почв нефтью // Бактериальный фильтр Земли: Тез. докл. семинара, 30-31 мая 1985 г. -Пермь, 1985. -Т.1. -С.28-29.

9. Балашова Н. В., Кошелева И. А., Филонов А. Е. и др. Штамм Pseudomonas putida BS371 деструктор фенантрена и нафталина // Микробиология. - 1997. -Т.66, № 4. - С. 488-493.

10. Барышникова Л. М., Грищенков В. Г., Аринбасаров М. У. и др. Биодеградация нефтепродуктов штаммами-деструкторами и их ассоциациями в жидкой среде // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. - Т. 37, № 5. - С. 542-548.

11. Батанов Б. Н. Биотехногенная деградация и изменение биопродуктивности почв в бассейне нижнего течения р. Белой : Дис. канд. с-х. наук. 06.01.04. Уфа, 1999.

12. Белов П. С., Голубева И. А., Низова С. А. Экология производства химических продуктов и углеводородов нефти и газа. М.: Химия, 1991. - 256 с.

13. Белонин М. Д., Рогозина Е. А., Свечина Р. М. и др. Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов. Патент 2053205 Россия. Опубл. 27.01.96. Биология. №3.

14. Борзенков И. А., Ибатуллин Р. Р., Милехина Е. И. и др. Использование микроорганизмов при ликвидации нефтяных загрязнений почв. // Интродукция микроорганизмов в окружающую среду. Тез. докл. конф.-Москва 17-19 мая 1994 г. -С. 14-15.

15. Борзенков И. А., Милехина Е. И., Беляев С. С., Иванов М. В. Консорциум микроорганизмов, используемых для очистки почвенных и солоноватоводных экосистем от загрязнения нефтепродуктами: Патент № 2023686 РФ // Б. И. 1994. -№22.-С. 136.

16. Боровиков В. П. Программа «Статистика» для студентов и инженеров». 2-е изд. - М.: КомпьютерПресс, 2001. - 301 с.

17. Бусыгин Е. А. Влияние концентрации нефти на активную альгофлору, отражающую состояние почвы // Микроорганизмы в сельском хозяйстве. Тез. докл. 3 Всес. науч. конф., Москва, 23-25 декабря, 1986. -М.: МГУ, 1986. С. 124-125.

18. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем // под. ред. М. А. Глазовской. М.: Наука, 1988. - 254 с.

19. Габбасова И. М., Хазиев Ф. X., Сулейманов Р. Р., Галимзянова Н. Ф., Бойко Т. Ф. Стимулирование микрофлоры нефтезагрязненной серой лесной почвы с помощью органических добавок // Башкирский экологический вестник. 1992. -№2.-С. 14-19.

20. Герасимов В. Н., Ермоленко 3. М., Штучная Г. В. и др. Физиологические, ультраструктурные и морфо-популяционные особенности бактерий Mycobacterium flavescens, утилизирующих нефть и нефтепродукты // Биотехнология. 1996. -№5.-С. 17-24.

21. Гилязов М. Ю. Нарушение плодородия почв при загрязнении нефтепромысловыми сточными водами и приемы их рекультивации : Дис.кнд. с-х. наук. 06.01.04.-М., 1985.

22. Глазовская М. А. Способность природной среды к самоочищению. Природа. -1979.-№3.-С. 71-79.

23. Глазовская М. А., Пиковский Ю. И. Комплексный эксперимент по изучению факторов самоочищения и рекультивации загрязненных нефтью почв в различных природных зонах // Миграция загрязненных веществ в почвах и сопредельных средах. Л., 1985. - С.185-191.

24. Головлев Е. JI. Проблемы интродукции микроорганизмов-деструторов. // Новые направления биотехнологии. Тез. докл. VI конф. РФ. - Пущино 24-26 мая 1994 г.-С. 9.

25. Головченко А. В., Добровольская Т. Г., Чернов И. Ю. Структура бактериальных комплексов в заповедных ельниках // Плчвоведение. 1995. - №9. - С. 11211124.

26. Голодяев Г. П. Биодеградация нефтепродуктов в почвах и почвогрунтах. // Генезис и биология почв юга Дальнего Востока. Владивосток, 1994. - С. 253268.

27. Голодяев Г. П., Никитина 3. И. Санация нефтезагрязненных почв юга Дальнего Востока. // Тез. докл. I съезда почвоведов России. С.-Петербург, 1996. - С. 246-247.

28. Градова Н. Б., Кожевин П. А., Рабинович Н. JI. и др. Биотехнологические способы очистки почв, загрязненных синтетическими моющими средствами // Биотехнология. 1996. - № 11. - С. 46-50.

29. Грищенков В. Г., Гаязов Р. Р., Токарев В. Г. и др. Бактериальные штаммы-деструкторы топочного мазута: характер деградации в лабораторных условиях // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. - Т.ЗЗ, № 4. - С. 423-427.

30. Гродзинский А. М. Аллелопатия растений и почвоутомление. Киев: Наукова думка, 1991.-429 с.

31. Гузев В. С., Голышин П. Н. Пролонгированная катаболитная репрессия и проблема интродукции микроорганизмов в почву // Микробиология. 1994. - Т.66, Вып. 4.-С. 565-572.

32. Гузев В. С., Халимов Э. М., Волде М. И., Куличевская И. С. Регуляторное действие глюкозы на активность углеводородокисляющих микроорганизмов в почве // Микробиология. 1997. - Т.66, № 2. - С. 154-159.

33. Гусев М. В., Коронелли Т. В. Микробиологическое разрушение нефтяного загрязнения // Изв. АН СССР. 1981. - Сер. биол. -№ 6. - С. 835-844.

34. Давыдов М. Н., Мухитова Ф. К., Ибатуллин Р. Р. Анаэробная трансформация нефти под действием экстрактов клеток СВБ // Микробиология. 1998. - Т. 67, № 2. - С. 202-207.

35. Дмитриев Е. А. Математическая статистика в почвоведении. М.: Изд-во МГУ, 1995.-292 с.

36. Евдокимова Г. А., Месяц С. П., Мозгова Н. П. Пути биодеградации нефти в водоемах высоких широт. / Тез. докл. конф. «Интродукция микроорганизмов в окружающую среду». М.: ПНЦ РАН, 1994. - С.33-34.

37. Ермоленко 3. М., Холоденко В. П., Чугунов В. А. и др. Биологическая характеристика штамма микобактерий, выделенного из нефти Ухтинского месторождения // Микробиология. 1997. - Т.66, № 5. - С. 650-654.

38. Етеревская JI. В., Яранцева Л. Д. // Растения и промышленная среда. Киев: Наукова думка, 1976. С.73-75.

39. Звягинцев Д. Г. Почва и микроорганизмы. М.: МГУ, 1987. - 296 с.

40. Звягинцев Д. Г., Гузев В. С., Левин С. В. и др. Диагностические признаки различных уровней загрязнения почвы нефтью II Почвоведение. 1989. -№ 1. - С. 72-78.

41. Звягинцева И. С., Поглазова М. Н., Готоева М. Т., Беляев С. С. Влияние солености среды на деструкцию нефтяных масел нокардиеподобными бактериями // Микробиология. 2001. - Т.70, № 6. - С. 759-764.

42. Иванова А. Е. Углеводородокисляющие и сульфатвосстанавливающие бактерии высокотемпературных нефтяных пластов. / Автореф. дисс. канд. биол. наук. -М., 1998.

43. Израэль Ю. А., Ровинский Ф. Я. Комплексный фоновый мониторинг в СССР // Комплексный глобальный мониторинг состояния биосферы. Тр.Ш Междунар. симп., 14-19 окт. 1985. Ташкент, 1986. - С. 89-105.

44. Ильин Н. П., Калачникова И. Г., Каркишко Т.И. и др. Наблюдение за самоочищением почв от нефти в средней и южной тайге // Добыча полезных ископаемых и геохимия природных экосистем. М., 1982. - С. 245-258.

45. Ильичев Р. Б., Вакулинко М. В., Жариков С. Н., Ильичев Б. А. Содержание би-тумоидов в зональных почвах европейской части России // Почвоведение. -2001.-№ 11.-С. 1392-1401.

46. Исмаилов Н. М. Биодеградация нефтяных углеводородов в почве, инокулиро-ваной дрожжами // Микробиология. 1985. - Т. 54, №5. - С. 835-841.

47. Исмаилов Н. М. Микробиология и ферментативная активность нефтезагрязнен-ных почв. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем / под ред. М. А. Глазовской. М.: Наука, 1988. - С. 42-56.

48. Исмаилов Н. М., Пиковский Ю. И. Биодинамика загрязненной нефтью почвы // Миграция загрязненных веществ в почвах и сопредельных средах. Л., 1985. -С.195-198.

49. Калачникова И. Г., Колесникова Н. М. Динамика микробных популяций в дерново-подзолистой почве при воздействии нефтяного загрязнения // Биодинам.почв. Тез. докл. 3 Всес. симп., Харку, 25-27 октября, 1988. Таллин, 1988. - С. 83.

50. Капотина JI. Н., Моршакова Г. Н. Биологическая деструкция нефти и нефтепродуктов, загрязняющих почву и воду // Биотехнология. 1998. - № 1. - С. 85-92.

51. Картыжова JI. Я., 31менка Т. Г., Мохава С. В. Уздзеянне газавьпадау нафтапере-рапрацоучага прадкрыенства на мпсробны цэноз i улас1ДвасЩ дзярнова-падзолютай глебы. // Вэсщ акадэмп навук БССР серыя б1ялапчных навук. -Мшск, 1990. С.47-56.

52. Квасников Е. И., Клюшникова Т. М. Микроорганизмы деструкторы нефти в водных бассейнах. - Киев: Наукова думка, 1981. - 132 с.

53. Киреева Н. А. Биодеструкция нефти в почве культурами углеводородокисляю-щих микроорганизмов // Биотехнология. 1996. - № 1. - С. 51-54.

54. Киреева Н. А. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. -Уфа: Изд-во БашГу, 1994. 171 с.

55. Киреева Н. А. Микрофлора почв Башкирии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами // Ботанические исследования на Урале. Свердловск, 1988.

56. Киреева Н. А., Водопьянов В. В. Математическое моделирование биодеградации нефти в почве. // Биотехнология. 1996. - №8. - С. 55-59.

57. Киреева Н. А., Галимзянова Н. Ф. Влияние загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами на численность и видовой состав микромицетов // Почвоведение. -1995.-№ 2.-С. 211-216.

58. Коронелли Т. В. Экофизиологические основы и практический опыт интродукции углеводородокисляющих бактерий в природные экосистемы. // Интродукция микроорганизмов в окружающую среду. Тез. докл. конф., Москва 17-19 мая 1994г.-С. 53.

59. Коронелли Т. В., Комарова Т. И., Поршнева О. В., Ткебучева JI. Ф. Внеклеточные метаболиты углеводородокисляющих бактерий как субстрат для развития сульфатредукции // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. - Т. 37, № 5.-С. 549-553.

60. Красильников Н. А. Определитель бактерий и актиномицетов. М.; JL: Изд-во АН СССР, 1949.-830 с.

61. Лысак Л. В., Лапыгина Е. В. Деструкция нефти монокультурами и природными ассоциациями почвенных бактерий // Вестн. МГУ. Сер. 17., Почвоведение. -1994. -№1. - С.58-61.

62. Мальцева О. В. Особенности промежуточного метаболизма Pseudomonas aeruginosa, деградирующего чужеродные соединения. / Автореф. дисс. канд. биол. наук. Пущино, 1983.

63. Медведева Н. Г., Поляк Ю. М., Зиновьева С. В. и др. Микробная деструкция иприта бактериальными культурами // Биотехнология. 2000. - № 2. - С. 60-65.

64. Методы изучения почвы и высшие растения / под ред. Н. А. Красильникова. -М.: Изд-во АН СССР, 1958. 352 с.

65. Микроорганизмы и охрана почв / под ред. Д. Г. Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1989.-206 с.

66. Милько Е. С., Мартынкина Л. П. Морфологические и физиолого-биохимические особенности диссоциантов Pseudomonas aeruginosa // Микробиология. 1996. - Т. 65, № 3. - С. 352-356.

67. Мишустин Е. Н., Рунов Е. В. Успехи разработки приемов микробиологического диагностирования состояния почвы. Успехи современной биологии. - Т. 44, вып.2 (5). - 1957. - С. 256-268.

68. Мукатанов А. X., Ривкин П. Р. Влияние нефти на свойства почв. Нефтяное хозяйство, 1980. - № 4. - С. 53-54.

69. Мурзаков Б. Г., Биттеева М. Б., Морщакова Г. Н. и др. Бактерии деструкторы нефтепродуктов // Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия. Тез.докл. Всесоюзного симпозиума. - Оренбург, 1991. - С. 29.

70. Назина Т. Н. Микроорганизмы нефтяных пластов и использование их в биотехнологии повышения нефтеотдачи : Автореф. дис. В форме науч. докл.докт.биол. наук : 03.00.07. М., 2000. - 66 с.

71. Оборин А. А., Калачникова И. Г., Масливец Т. А. и др. / Самоочищение и рекультивация нефтезагрязненных почв Предуралья и Западной Сибири. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем / под ред. М. А. Глазовской. М.: Наука, 1988. - С. 140-168.

72. Огородников А. В., Хромых В. С. Экологическая измененность пойменных геосистем под влиянием нефтедобычи. // Проблемы экологии Томской области. -Томск, 1992. Т.2. - С. 46-48.

73. Одинцова С. В. Изучение возможности самоочищения нефтезагрязненных почвенных территорий ассоциациями нефтеокисляющих микроорганизмов // Докл. науч.-прак. конф. «ПромЭкол-97», С-Петербург, 12-14 ноября, 1997. СПБ, 1997.-С. 491.

74. Охрана окружающей природной среды. Постатейный комментарий к закону России.-М., 1993.-С. 224.

75. Панченко JI. В., Турковская О. В. Возможности использования микроорганизмов-деструкторов поверхностно-активных веществ в условиях многокомпонентных сточных вод // Биотехнология. 1999. - № 2. - С. 69-75.

76. Пароменская J1. Н., Гаранкина Н. Г., Моисеева И. Г., Круглов Ю. В. Альгологи-ческий метод определения фитотоксичности почв // Почвоведение. 2001. - № 6.-708-712.

77. Петухов В. Н., Фомченков В. М., Чугунов В. А., Холоденко В. П. Биотестирование почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с помощью растений // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - Т. 36, № 6. - С. 652655.

78. Пиковский Ю. И. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. -М.: Наука, 1988.-С. 7-22.

79. Пиковский Ю. И., Калачникова И. Г., Оглоблина А. И., Оборин А. А. Экспериментальные условия трансформации нефти в почвах // Миграция загрязненных веществ в почвах и сопредельных средах. Д., 1985. - С.191-195.

80. Плотникова Е. Г., Алтынцева О. В., Кошелева И. А. и др. Бактерии деструкторы полициклических ароматических углеводородов, выделенные из почв и донных отложений района солеразработок // Микробиология. - 2001. - Т.70, № 1,- С. 61-69.

81. Пономарева JI. В., Крунчак В. Г., Торгованова В. А. и др. Биоремедиация нефтезагрязненной почвы с использованием биопрепарата «Биосэт» и пероксида кальция // Биотехнология. 1998. - № 1. - С. 79-84.

82. Практикум по почвоведению / под ред. И. С. Кауричева. М.: Агропромиздат, 1986.-336 с.

83. Пунтус И. Ф., Филонов А. Е., Кошелева И. А. и др. Выделение и характеристика микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов // Микробиология. 1997. - Т.66, № 2. - С. 269-272.

84. Регламент рекультивации нефтезагрязненных заболоченных земель. М. -1993.-39 с.

85. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / под ред. проф. Н. С. Егорова. М.: Изд-во МГУ, 1983. - 215 с.

86. Рыбак В. К., Овчарова Е. П., Коваль Э. 3. Микрофлора почвы, загрязненной нефтью // Микробиол. Журнал. 1984. - Т. 46, №4. - С. 29-32.

87. Седых В. Н., Игнатьев JI. А., Семенюк М. В. Реакция растений на отходы бурения нефтяных скважин. Всхожесть семян и выживание сеянцев. Сообщение 1 // Сибирский экологический журнал. Новосибирск: Изд-во СО РАН - 1998. - Т. 5, №1. - С. 34-38.

88. Семенов А. М., Куличевская И. С., Халимов Э. М. и др. Лабораторные тесты для оптимизации интродукции в почву микроорганизмов-деструкторов нефти // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - Т. 34, № 5. - С. 576-582.

89. Сидоренко Н. Н. Микробные комплексы городских загрязненных почв : Авто-реф. дис.канд. биол. наук : 03.00.07. -М., 1999.-28 с.

90. Сидоров Д. Г., Борзенков И. А., Ибатуллин Р. Р. и др. Полевой эксперимент по очистке почвы от нефтяного загрязнения с использованием углеводородокисляющих микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. -Т.ЗЗ, № 5. - С. 497-502.

91. Сидоров Д. Г., Борзенков И. А., Милехина Е. И. и др. Микробиологическая деструкция мазута в почве при использовании биопрепарата Деворойл // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - Т.34, № 3. - С. 281-286.

92. Скворцова И. Н. Идентификация почвенных бактерий рода Pseudomonas. М.: 1983.-63с.

93. Скворцова И. Н. Количественная сезонная динамика психрофильного Псевдо-монаса в дерново-подзолистой почве // В кн.: Биодинамика и плодородие почвы. Таллин, 1979. - С. 97-99.

94. Скрябин Г. К., Головлева JI. А. Использование микроорганизмов в органическом синтезе. М.: Наука, 1976. - 235 с.

95. Славнина Т. П., Середина В. П. И др. Биологическое состояние почв при загрязнении нефтью. // Проблемы экологии Томской области. Томск, 1992. -Т.2. - С. 66-67.

96. Смирнов В. В., Киприанова Е. А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев: Нау-кова думка, 1990. - 264 с.

97. Солнцева Н. П., Пиковский Ю. И., Никифорова Е. М. и др. Проблемы загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами: геохимия, экология, рекультивация // Докл. симпоз. VII делегатск. съезда Всес. общества почвоведов. Ташкент, 1985.-4.6.-С. 246-254.

98. Стабликова Е. В., Селезнева М. В., Дульгеров А. Н., Иванова В. Н. Применение биопрепарата «Лестан» для очистки почвы от углеводородов нефти // Прикладная биотехнология и микробиология. 1996. - 32, №2. - 219-223.

99. Суржко Л. Ф., Финкелынтейн 3. И., Баскунов Б. П. и др. Утилизация нефти в почве и воде микробными клетками // Микробиология. 1995. - Т.64, № 3. - С. 393-398.

100. Суровцева Э. Г., Ивойлов В. С., Беляев С.С. Разрушение ароматической фракции нефти ассоциацией грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов // Микробиология. 1997. - Т. 66, № 1. - С. 78-83.

101. Таранова Л. А., Жданова Е. Б. Влияние бактерий и дрожжей на биохимическое окисление нефти // Нефть и газ Западной Сибири. Тез. докл. Международной научно-технической конференции, 21-23 мая, Тюмень. 1996. - С. 126.

102. Таранова Л. А., Трачевский В. В., Делеменчук Н. В. и др. Бактериальная деструкция катионных поверхносто-активных веществ // Биотехнология. 1996. -№9.-С. 32-37.

103. Теппер Е. 3., Шильникова В. К., Переверзева Г. И. практикум по микробиологии. Москва. - 1993. - 169 с.

104. Турковская О. В., Дмитриева Т. В., Муратова А. Ю. Штамм Pseudomonas aeruginosa продуцент биоПАВ // Прикладная биохимия и микробиология. -2001.-Т. 37, № 1.-С. 80-85.

105. Фомченков В. М., Холоденко В. П., Ирхина И. А., Петрунина Т. А. Влияние загрязнения водной среды нефтью и нефтепродуктами на барьерные свойства цитоплазматических мембран бактериальных клеток // Микробиология. 1998. -Т. 67,№3.-С. 333-337.

106. Хазиев Ф. X. Методы почвенной энзимологии. М.: Наука., 1990. - 190 с.

107. Халимов Э. М., Левин С. В., Гузев В. С. Экологические и микробиологические аспекты повреждающего действия нефти на свойства почвы // Вестн. МГУ.- Сер. 17., Почвоведение. 1996. - №2. - С.59-64.

108. Чугунов В. А., Ермоленко 3. М., Жиглецова С. К. и др. Создание и применение жидкого препарата на основе ассоциации нефтеокисляющих бактерий // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - Т. 36, № 6. - С. 666-671.

109. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Наука, 1988. - С. 281-301.

110. Шлыгин Н. И. Мониторинг состояния окружающей природной среды // Обзор. Сер. 87. Обнинск, ВНИИГМИ-МУД, 1986. - Вып. 4. - С. 47.

111. Щеблыкин И. И., Битеева М. Б., Бирюков В. В., Янкевич М. И. Биовосстановление загрязненной нефтью почвы при ликвидации последствий аварии на магистральном нефтепроводе Лисичанск-Тихорецк // Охрана окружающей среды.- 1995.-С. 19-28.

112. Ягафарова Г. Г., Гатаулина Э. М., Барахнина В. Б., Ягафаров И. Р., Сафаров А. X. Новый нефтеокисляющий микромицет Fusarium sp. // Прикладная биотехнология и микробиология. 2001. - Т. 37, №1. - С. 77-79.

113. Ягафарова Г. Г., Скворцова Н. Н. Новый нефтеокисляющий штамм бактерий Rhodococcus erythropolis 1339 Д // Прикладная микробиология и биохимия -1996.-Т. 32, № 2. -224-227.

114. Aeckersbery F., Rueter P., Rabus R., Widdek F. Hydrocarbon degradation by anaerobic bacteria // Beijerinck Centenn. Microb. Physiol, and Gene Regul. Emerg. Princ. And Apple. Hague, 10-14 Dec., 1995. - Book abstr. - Delft., 1995. - P. 7071.

115. Amadi A., Dickson A. A., Maate G. O. Remediation of oil-polluted soils. I. Organic and inorganic nutrient supplements on the perfomans of Maize // Water, Air and Soil Pollut. 1993. - V. 66, N 1-2. - P. 59-76.

116. Aronstein В. N., Alexander M. Surfactants at low concentrations stimulate biodeg-radation of sorbed hydrocarbons in samples of aquifer sands and soil slurries // Environ. Toxicol. Chem. 1992. - V. 11, N 9. - P. 1227-1233.

117. Atlas R. M. Biodegradation of hydrocarbons in the environment // Environmental biotechnology. 1988. - ed. G. S. Omenn Plenum. Press. - N.Y. - P. 211-222.

118. Atlas R. M. Microbial degradation of organic compounds within complex effluents // Environ. Hazard Asses. Effluents. Proc. Pellston Environ. Workshop, Cody, Wyo., 22-27 Aug., 1983. -N.Y.,1986. P. 163-171.

119. Atlas R. M., Bartha R. Hydrocarbon biodegradation and oil spill bioremediation (ed. by К. C. Marshall) // Adv. Microb. Ecol. 1992. - V. 12. - P. 287-338.

120. Benka-Coker M. O., Ekundayo J. A. Applikation of evaluating the ability of microbes isolated from an oil spill site to degrade oil // Environ. Monit. and Assess. -1997.-45.3.-P. 259-272.

121. Bergey's manual of determinative bacteriology. 9th edition. - 1.: 430 p.

122. Bertrand J. C., Caumette P., Mille G., Gilewicz M., Denis M. Anaerobic biodegradation of hydrocarbons // Sci. Progr. (Gr. Brit.). 1989. - V. 3. - P. 333-350.

123. Bossert I., Bartha R. The fate of petroleum in soil ecosystems / Petroleum Microbiology (ed by R. M. Atlas). New York: McMillan Co, 1984. - P. 434-476.

124. Brown-Lewis R. Oil-degrading microorganisms // Chem. Eng. Progr. 1987. - 83. -N10.-P. 35-40.

125. Byng G., Whitaker R., Cherna et al. Variable enzymoligical pattering in tyrosine biosynthesis as a means of determining naturalrelatedness among the Pseudomonada-ceae // J. Bacteriol. 1980. - 144, N 1. - P. 247-257.

126. Cerniglia С. E. Microbial transformation of aromatic hydrocarbons // Petroleum Microbiology (ed. by R. M. Atlas). New York: Micmillan Co. - 1984. - P. 99-128.

127. Chen С. T. Understanding the fate of petroleum hydrocarbons in the subsurface environment // Chemical Education. 1992. - 69, N 5. - P. 357-361.

128. Cipinyte V., Grigiskis S. Selection of petroleum-degrading bacterial strains // Microclimate and physica of soil: problems ecology education. Kaunas, 1997. - P. 812.

129. Cook J., Weller D. M. Management of take-all in consecutive crops of wheat or barley // Innovative approaches to plant disease control. N. Y., Wiley a. sons inc., 1987.-P. 41-76.

130. Cooney J. J., Summers R. J. Hydrocarbon-using microorganisms in three fresh water ecosystems // Prog. Third Inter. Biodegradation Symp. Appl. Sci. - London. -1976.-P. 141-156.

131. Cundell A. M., Traxler R. W. Microbial degradation of petroleum at low temperature // Marine pollution bulletin. 1973. - V. 4. - N 8. - P. 125-127.

132. Cunlla C.D., Ferreira L. S. G. Optimization of some environmental conditions to enhance gasoline biodegradation in soil microcosms bioaugmented with Pseudomonas putida // Rev. Microbiol. 1997. - 28, N 2. - P. 129-134.

133. Danilova M. N. Are northern ecosystems tolerant to petroleum pollution? / III Me-ждунар. конф. «Освоение Севера и проблемы рекультивации»: тез. докл. Сыктывкар, 1996.-С. 36-37.

134. Delaune R. D., Hambrick G. A., Patrick W. H. Degradation of hydrocarbons in oxidized and reduced sediments // Mar. Pollut. Bull. 1980. - V. 11. - P. 103-106.

135. Deyo B. G., Robbins G. A., Binkhost G. K. Use of portable oxygen and carbon dioxide detectors to screen soil gas for subsurface gasoline contamination ground water. 1993. - V. 31, N 4. - P. 598-604.

136. Ellis R., Adams R. S. Contamination of soils by Petroleum hydrocarbons. Advances in agronomy. — 1961.—N 13. — P. 197-216.

137. Falatko D. M., Novak J. T. Effects of biologically produced surfactants on the mobility and biodegradation of petroleum-hydrocarbons // Water Environ. Res. 1992. -V. 64, N 2. -P.163-169.

138. Fedorak P. M., Westlake D. W. S. Degradation of aromatic and saturates in crude oil by soil enrichments // Water, Air and Soil Pollut. 1981. -V. 16. -P. 367-375.

139. Fuhs G. W. Обзор. Разложение углеводородов микроорганизмами. Микробиологический синтез. 1965. -N 2. - Р. 1-10.

140. Funch W., Loibner А. P., Klimitisch A. et al. Bioremediation of soils contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons // Soil and Environment. Dordrecht etc., 1995.-V. 5/2.-P. 1209-1210.

141. Jain D. K., Lee H., Trevors J. T. Effect of addition in Pseudomonas aeruginosa UG2 inocula or biosurfactants on biodegradation of selected hydrocarbons in soil // In-dustr. Microbiol. 1992. - V. 10. - P. 87-93.

142. Jessen O. Pseudomonas aeruginosa and other green fluorescent pseudomonads. -Munksgaad, Copengagen, 1965. 240 p.

143. Jobson A. M., Cook F. D., Westlak D. W. S. Microbial utilization of crude oil // Appl. Microbiol. 1972. -V. 23, N 6. - P. 1082-1091.

144. Johnson J, Anderson R. S., Ordal E. J. Nucleic acid homologies among oxidase-negative Moraxella sp. // J. Bacteriol. 1970. - V. 101. -N 2. - P. 568-573.

145. Kator H., Miget R. J., Oppenheimer С. H. Utilization of paraffin hydrocarbons in crude oil by mixed cultures of marine bacteria / Simp, on Environ. Conserv. Soc of Petrol. Engin. Dallas, 1972. - Paper N SPE 4206.

146. Klein J. Mikrobiologische methoden zur Sanierung mineralolkontaminierter Boden // Mineralol. 1992. - V. 40. - B. 12. - S. 209-217.

147. Kopp-Holtwiesche B. Biocrack // BFE (Biotech. Forum Eur). 1992. - V. 9 - N 6. -P. 627-632.

148. McGill W. B. Soil restoration following oil spills // J. Canad. Petrol. Technol. -1977.-V. 16, N2.-P. 60-67.

149. Oberbremer A., Muller-Hurtig R. Aerobic stepwise hydrocarbon degradation and formation of biosurfactans by an original soil population in a stirred reactor // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. -V. 31. - P. 582-586.

150. Odu C.T.I. Oil degradation and microbiological chance in soils deliberately contaminated with petroleum hydrocarbons // Inst. Petrol. 1977. - N 5. - P. 1-11.

151. Palleroni N., Kunisawa R., Contopoulou R., Doudoroff M. Nucleic acid homologies in the genus Pseudomonas // Int. J. Syst. Bacteriol. 1973. - 23, N 4. - P. 333-339.

152. Ramos C., Molina L., Ronchel M. C. et al. Field release of biologically contained soil bacteria for environmental application // JIRCAS Intern. Symp. Ser. Japan intern, research. 1997. -N 5. - P. 21-29.

153. Rhodes M.E. The characterization of Pseudomonas fluorescens //J. Gen. Microbiol. 1959.-21, N 1.-P. 221-263.

154. Rosenberg E. Biotechnical oil cleaning // Rapp. Ingenjorsvetens Kapsakad. 1985. -N278.-P. 83-96.

155. Roy J. L., McCill V. В., Rawluk M. D. Petroleum residuces as water-repellent sub-staunces in weathered nonwettable oil-contaminated soils // Canad. J. Soil Sc. -1999. V. 79, N 2. - P. 367-380.

156. Shukla O.P. Biodegradation for Environmental Management // Everyman's Sci. -1990. V.25. - N 2. - P.46-50.

157. Shussler H. Sanierrung kontaminierter boden durch microorganismen: gefundede-nes fressen // Entsorga. 1986. - B. 5, H. 4. - P. 12-13.

158. Sikkema J, De Bont J. A. M., Poolman B. Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons // Microbiol. Rev. 1995. - V. 59. - N 2. - P. 201-222.

159. Sims J. L., Sims R. H., Matthews J. E. Approach to bioremediation of contaminated soil // Haz. Waste Haz. Matter. 1990. - V. 7. - P. 117-149.

160. Song H.G., Bartha R. Effects of jet fuel spills on the microbiol community of soil // Appl. Environ. Microbiol. 1990. -N 56. -P.646-651.

161. Song H.G., Wang X., Bartha R. Bioremediation potential of terrestial fuel spills // Appl. Environ. Microbiol. 1990. -N 56. -P.652-656.

162. Sorkhoh N. A., Ghannoum M. A., Ibrahim A. S. et al. Crude oil and hydrocarbon degrading strains of Rhodococcus: Rhodococcus strains isolated from soil and marine environments in Kuwait // Environ. Pollut. 1990. - V. 65. - P. 1-17.

163. Staff C.P. Mutant bacteria decontaminates spilled crude oil site // Chem. Process. (USA). 1982. - V. 45, N 14. - P.96.129

164. Stanier R.V., Palleroni N. J., Doudoroff M. The aerobic pseudomonas, a Taxonomic studu // J. Gen. Microbiol. 1966. - 43, N 2. - P. 159-271.

165. Stetzenbach L. D., Sinclair N. A. Degradation of anthracene and pyrene by soil bacteria // Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol., 1986. 86th Annu. Meet. - Washington: D. C. - 1986. - P. 302.

166. Stetzenbach L. D., Story S. P., Haldeman D. I., Army P. S. Hydrocarbon-degrading bacteria isolated from hydrocarbon contaminated sites at Johnson Atoll // Abstr. 37th Annu. Meet.Ariz. Nev. Acad. Sci., Las Vegas. - 1993. - P. 29.

167. Sullivan D. Soil remediation gains momentum // Chem. and Eng. News. 1991. -V.69, N 47. - P. 24-26.

168. Wang X., Bartha R. Effect of bioremediation on residues, activity and toxicity in soil contaminated by fuel spills // Soil Biol. Biochem. 1990. - N 22. - P. 501-505.

169. Ward A., Campoli-Richards D. M. Mupirocin A review of its antibacterial activity, pharmacokinetic properties and therapeutis use // Drugs. - 1986. - 32. - P.425-444.

170. Ward D. M., Brock T. D. Anaerobic metabolism of hexadecane in marine sediments // Geomicrobiol. J. 1978. - V.l. - P. 1-9.