Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Деградация нефти ассоциацией аэробных углеводородокисляющих микроорганизмов в различных типах почв

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Деградация нефти ассоциацией аэробных углеводородокисляющих микроорганизмов в различных типах почв"

На правах рукописи

ПАВЛИКОВА Татьяна Алексеевна

ДЕГРАДАЦИЯ НЕФТИ АССОЦИАЦИЕЙ АЭРОБНЫХ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ В РАЗЛИЧНЫХ ТИПАХ ПОЧВ

Специальность 03.00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре микробиологии Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева

Научный руководитель:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор О.Д. Сидоренко, доктор биологических наук, профессор И.М. Яшин, кандидат биологических наук, И.А. Борзенков

Официальные оппоненты:

Ведущая организация: Всероссийский Научно-исследовательский Институт Сельскохозяйственной Биотехнологии РАСХН

Защита состоится 23 июня 2004г. в 15°°часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.03 Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва, Тимирязевская ул., д. 49. Ученый совет МСХА им. К.А. Тимирязева.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ МСХА.

Автореферат разослан мая 2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время следствием безудержного и неконтролируемого внедрения человека в природу оказывается загрязнение почвы и водоемов ксенобиотиками, несвойственными биосфере. Наиболее серьезным и трудно устраняемым техногенным нарушением природы является нефтезагрязнение (Пиковский, 1988; Гузев и др., 1989; Киреева, 2001).

Значительный вклад в процесс биологического разрушения нефти вносят углеводородокисляющие микроорганизмы, являющиеся постоянным компонентом экосистемы. В последнее время успешно разрабатываются микробиологические технологии очистки природных сред от нефтяного загрязнения, основанные на использовании ассоциаций углеводородокисляющих микроорганизмов в сочетании с различными веществами, стимулирующими их активность (Сидоров и др., 1997; Чугунов и др., 200; Ягафарова, 2001). Важным условием микробиологической очистки загрязненных почв является способность различных групп микроорганизмов (бактерий, актиномицетов, дрожжей и микромице-тов), обладая высокой интродукционной жизнеспособностью, совместно разрушать углеводороды нефти (Звягинцев, 1989; Корнелли, 2001; Якушева, 2002).

Изучение ассоциаций углеводородокисляющих микроорганизмов и разработка методов их успешной интродукции в природные экосистемы позволят в дальнейшем развить экологическую биотехнологию в нашей стране.

Цель и задачи исследования. Основной целью нашей работы было выделение и подбор ассоциации аэробных углеводородокисляющих микроорганизмов, активно утилизирующих углеводороды нефти, изучение их способности к биоремедиации нефтезагрязненных почв и изучение влияния сырой нефти на почвенную микробиоту.

Для решения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить, выделить и подобрать условия культивирования чистых культур микроорганизмов, способных к усвоению углеводородов нефти.

2. Отобрать штаммы микроорганизмов-деструкторов с наибольшей глубиной окисления углеводородов нефти.

3. Установить таксономическую принадлежность и физиолого-биохимические особенности микроорганизмов-деструкторов нефти.

4. Разработать комплексный микробный биопрепарат, приводящий к деградации углеводородов нефти.

5. Исследовать действие сырых нефтей разных месторождений на почвенную

микрофлору и изучить особенности микробоценозов загрязненных нефтью почв.

Научная новизна.

- В работе впервые выделены в чистую культуру штаммы бактерий и микромицетов, использующие углеводороды высоко- и среднепарафинистой нефти в качестве единственного источника углерода. Выделенные штаммы микроорганизмов изучены и идентифицированы до вида: Rodococcus ruher PS02., Pseudomonasputida SP-203, Trichoderrm citrinoviride VS-89, Metairhizium anisopliaeAF-78, Aspergillus cameus SU-TM-03.

- Установлено, что ассоциация аэробных углеводородокисляющих микроорганизмов обладает высокой интродуктивной жизнеспособностью в нефте-загрязненных почвах. Они высоко активны в деструкции сырой нефти и ее легких фракций (н-алканов) при относительно-низких температурах (8-15°С).

- Впервые изучены микробоценозы нефтезагрязненных почв модифицированным методом прямого микроскопирования.

- Выявлена роль углеводородокисляющих штаммов микроорганизмов в деградации нефти в почвах и аллювиальном песке речной террасы.

Практическая ценность работы. На основе созданной ассоциации выделенных штаммов-деструкторов углеводородов нефти разработан комплексный биопрепарат, показавший высокую активность в окислении сырой нефти Сугмутского и Харьягинского месторождений. Препарат позволяет в течение 4 месяцев снизить токсичность почвы, загрязненной сырой нефтью, до уровня, не препятствующего росту растений. Результаты исследований могут служить основой для разработки технологии получения биопрепаратов для очистки почв и

водоемов, загрязненных сырой нефтью в широком температурном диапазоне (t=15 -28* С)

Апробация работы. Основные положения и результаты исследований представлены и одобрены на 36-ой Международной научной конференции «Агрохимические аспекты повышения продуктивности сельскохозяйственных культур» (Москва, 2002); на Всероссийской научно-технической конференции с международным участием «Высокоэффективные технологии, методы и способы для их реализации» (Москва, 2003); на заседании кафедры микробиологии МСХА им. К.А. Тимирязева (25 марта 2004 г).

Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 4 опубликованных работах, оформляется патент Российской Федерации.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследований, выводов и списка литературы. Экспериментальный материал приведен в 19 таблицах и 30 рисунках. Список литературы включает 130 наименований, в том числе 26 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Основными объектами исследований служили чистые культуры углевод-ородокисляющих микроорганизмов, выделенные в ходе эксперимента: Pseudomonas putida SP-203 (выделенный из нефтезагрязненной черноземной почвы), Rhodococcus ruberPS-02 (выделенный из нефтезагрязненной дерново-подзолистой почвы), Trichoderma citrinoviride VS-89 (выделенный из компоста,), Metarrhizium anisopliae AF-78 (выделенный из красновато-бурой почвы), Aspergillus carneus SU-TM-03 (выделенный из сырой нефти Сугмутского месторождения).

Материалом исследования являлись образцы почв: 1) дерново-подзолистая среднесуглистая почва (лесная опытная дача МСХА). 2) типичный

з

чернозем тяжелосуглинистый (Липецкая область). 3) аллювиальный песок речной террасы (пойма реки Волга). В работе дополнительно использовали красновато-бурую почву сухих саванн; компост высокого нагрева, запатентованный как органический почвогрунт (Сидоренко, патент РФ № 2110170).

Экспериментальное загрязнение почв проводили нефтью двух типов, полученных в НИИ газа и нефти им. Крылова (г. Москва):

-Нефть-А: нефть Харьягинского месторождения характеризуется как вы-сокопарафинистая, сернистая, температура застывания нефти +29°С.

-Нефть-Б: нефть Сугмутского месторождения среднепарафинистая, сернистая, температура застывания нефти +10°С.

Для изучения углеводородокисляющей активности микроорганизмы культивировали на жидкой минеральной среде Раймонда (Raymond, 1961) с 1% NaCl и сырой нефтью, легкими фракциями нефти (керосин, соляровое масло), тяжелой фракцией (мазут), а также ароматической фракцией (толуол) (0,5 -10%) (температура инкубирования 26-28°С).

Идентификацию полученных культур микроорганизмов проводили по культуральным, морфологическим и биохимическим признакам, используя определители бактерий Берджи, 1997; Вейант и др., 1999; Смирнов, 1990; определители грибов Domsch, Grams., Anderson, 1980; Саттон, Фотергилл, 2001; Би-лай и др., 1988; а также определитель грибов рода Trichoderma Samuel's, Petini, Kuhes, 2000.

Культивирование проводили при разных температурных режимах: при при 37°С, 28°С, 16°С и при 8°С, а также при разной аэрации: в стационарной культуре и на качалке (при 100 об/мин).

Изменение химического состава нефти и трансформацию углеводородов в процессе микробиологического воздействия изучали методом газовой хроматографии. Экстракцию углеводородов проводили по методу, принятому в лаборатории нефтяной микробиологии Института микробиологии им. С.Н. Вино-градского РАН, в собственной модификации. Анализу подвергали растворенную гексаном алифатическую фракцию нефти, анализировали на содержание в

нем различных групп углеводородов. Газохроматографический анализ углеводородного состава нефти проводили на хроматографе HP- 5890 серии 2 с использованием пламенно-ионизационного детектора. Условия проведения анализа: газ-носитель - гелий, скорость гелия через колонку-2 мл/мин, начальная температура - 100°С, конечная - 320°С.

Активность биопрепарата, созданного нами на основе выделенных уг-леводородокисляющих штаммов, проверяли в стеклянных сосудах с массой почвы 300г. Схема опыта:

М Образцы почв Нефть (ЗООмг/кг) Компост (3% от веса почвы) Биопрепарат (100мг/кг)

11 Дерново-подзолистая почва - - -

] 2 Черноземная почва - - -

1 3 Аллювиальный песок - - -

2 1 Дерново-подзолистая почва - + -

22 Черноземная почва - + -

23 Аллювиальный песок - + -

3 1 Дерново-подзолистая почва Нефть А - -

32 Черноземная почва Нефть А - -

3 3 Аллювиальный песок Нефть А - -

34 Дерново-подзолистая почва Нефть Б - -

3 5 Черноземная почва Нефть Б - -

3 6 Аллювиальный песок Нефть Б - -

4 1 Дерново-подзолистая почва Нефть А + -

42 Черноземная почва Нефть А + -

43 Аллювиальный песок Нефть А + -

44 Дерново-подзолистая почва Нефть Б + -

45 Черноземная почва Нефть Б + -

46 Аллювиальный песок Нефть Б +

5 1 Дерново-подзолистая почва Нефть А +

52 Черноземная почва Нефть А +

53 Аллювиальный песок Нефть А +

54 Дерново-подзолистая почва Нефть Б +

55 Черноземная почва Нефть Б +

56 Аллювиальный песок Нефть Б - +

Примечание: -Нефть - А: нефть Харьягинского месторождения

- Нефть - Б: нефть Сугмутского месторождения Согласно схеме опыта в верхние слои почвы вносили нефти в массе 300мг/кг от веса почвы, 3 % компоста и биопрепарат (Титр=10,0КОЕ/г препарата) на основе ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов в коли-

честве 100мг/кг. Углеводородокисляющую микрофлору активировали внесением растворов минеральных солей.

Изучали влияние нефтяного загрязнения на динамику микрофлоры. Учитывали численность мезофильных гетеротрофных микроорганизмов, численность микромицетов и углеводородокисляющих микроорганизмов.

Исследования ценозов микроорганизмов нефтезагрязненных почв проводили прямым методом учета, предложенным Н.Г. Холодным (стекла обрастания) в нашей модификации: препараты окрашивали по Граму. При микроско-пировании препаратов изучали структуру микробного ценоза, плотность обрастания и распределение микроорганизмов. Учитывали доминирующие формы, проводили микрофотосъемки.

Анализ остаточного содержания нефти в почве осуществляли методом извлечения суммы неполярных и малополярных углеводородов органическим растворителем - четыреххлористым углеродом (СС14) (Семенов и др., 1976; Эрнестова, 1979). Изменяли интенсивность поглощения каждого раствора на инфракрасном спектрометре модели "Jasco JR - S" (Япония) в интервале длин волн 2800-3200 см-1. Одну кювету (из кристаллов NaCl) заполняли CCU, предварительно пропущенного через колонку с окисью алюминия (кювета сравнения), другую — исследуемым раствором. Содержание нефти рассчитывали методом базисной линии. Последнюю проводили как касательную к основанию двух пиков, соответствующих симметричным и асимметричным валентным колебаниям и групп. Анализ вели по полосе асимметричных валентных колебаний метиленовых групп ( ).

Биологический тест на остаточную токсичность почвы определяли по прорастанию семян тест - растений: кресс-салата (Lepidium sativum) и пшеницы сорта "Московская — 35м (Triticum durum). В сосуды вносили семена тест растений. Фиксировали процент проросших семян и длину проростков. Пороговым считали промежуток времени, при котором прорастает лишь 70% (LD70) семян тест-растения. По всхожести семян и скорости роста тест - растений су-

дили об остаточной токсичности почвы в сравнении с контролем (интактная и нефтезагрязненная почва без биопрепарата).

Повторность опытов трехкратная. Результаты экспериментов обрабатывались методами математической статистики и выражались в виде графиков и таблиц с помощью пакета программ «Microsoft Excel». Обработку данных проводили с помощью программы "Stars", считали достоверный порог значимости полученных значений при Р>0,05 (критерий Стьюдента). Текстолого-редакционную работу выполняли с помощью пакета "Microsoft Word 2000".

Результаты исследований и их обсуждение

Выделение и отбор штаммов микроорганизмов, активно усваивающих углеводороды нефти

Методом накопительных культур из различных субстратов (искусственно загрязненные нефтью дерново-подзолистая и черноземная почвы; красновато-бурая почва; аллювиальный песок; компост высокого нагрева и образцы нефти Сугмутского и Харьягинского месторождений) на минеральной среде Раймонда с нефтью и 1% NaCl выделены 30 наиболее активных штаммов углеводоро-докисляющих микроорганизмов. При отборе использовали следующие показатели: помутнение среды (водной фазы), появление пигментов, образование осадка, эмульгирование и распад нефти, а также снижение рН культуральной жидкости.

При первичном скрининге общего числа выделенных углеводород-окисляющих микроорганизмов оставлены 13. Газохроматографический анализ показал их высокую активность в деструкции насыщенной фракции углеводородов (табл. 1). Для дальнейших исследований методом селективного аналитического отбора и по данным газохроматографического анализа нами оставлены наиболее активные штаммы микроорганизмов. Критериями отбора активных деструкторов служили такие показатели, как избирательное удаление нормальных н-алканов в насыщенной фракции нефти и снижение соотношения коэффициента труднодоступных соединений нефти пристан/фитан (табл. 1).

Определена таксономическая принадлежность активных штаммов микро-

организмов. В автореферате дана их краткая характеристика:

- Культуры с зеленовато-синей пигментацией, грамотрицательные, клетки палочковидные, вегетативные клетки подвижны; спор не обнаружено. Колонии вызывают посинение сред-Psendomonasputida (Смирнов, 1981; Берджи, 1997; Вейант и др., 1999).

- Культуры с розовой или кремовой пигментацией, грамположительные, аэробы, с палочковидными или нитевидными, часто ветвящимися клетками (810-12 мкм), складывающимися в характерные V-формы. Воздушный мицелий отсутствует - Rhodococcus ruber (Берджи, 1997).

- Гифы септированные, бесцветные, многократно супротивно разветвленные конидиеносцы, фиалиды вздутые у основания, расположенные на кони-диеносце в большинстве под углом 90° и несущие шаровидные конидии, собранные в головки, каждая из которых состоит из 10-20 одноклеточных бесцветных конидий. Колонии зеленого цвета с участками рыхлой войлочной поверхности - Trichoderm citrinoviride (Domsch et al, 1980; Gary Samuel's, 2000).

- Гифы септированные, бесцветные, фиалоконидии удлиненные, одноклеточные, почти бесцветные, элипсоидные, размером 6-9 х 2,5-4,5 мкм. Конидии сгруппированы в цепочки и колонки, в массе дают зеленую окраску. Колонии белые, цилиндрические, диаметром 5-6 мм. С возрастом их диаметр увеличивается до 15-20 мм и они становятся серыми - Metarrhizium anisopliae (Domsch et al, 1980; Саттон и др, 2001).

- Гифы септированные, бесцветные. Конидиеносцы 250-400 мкм в высоте, изогнутые, бесцветные. Апикальное расширение вздутий полушаровидное, практически полностью покрытое фиалидами. Стеригмы двухъярусные, располагаются рыхло в 2 яруса. Конидии шаровидные 2,5-3,5 мкм. Колонии дымчатые, серовато-зеленые, быстрорастущие. По фактуре колонии шерстистые - Aspergillus carneus (Domsch et al, 1980; Билай, 1988).

Выделенные активные штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов депонированы в коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева под кодом Asp.carneusSU-TM-03,Met.anisopliaeAF- 78, Trickcitrinoviride VS-89,Rh. ru-berPS-02, Psputida SP-203.

Таблица 1. Изменение состава насыщенных фракций углеводородов нефти в процессе микробной деградации.

Результаты газохроматографического анализа

Исследуемый микроорганизм пристав/ фитан пристан/ нС17 фитан/ нС18 % н-алканов в насыщ.фракции % ацикп.изопрвн. в насыщ.фракции ациклич. изопрвнУ н-алканы

контроль (нефть А) 1.14 0,76 0,76 44,1 11,05 0,25

Bacillus $рр. 1,05 1,16 1,71 35,51 12,56 0,35

Candida spp. 1,06 1,89 1,68 32,25 14,21 0,44

Arthrobacter spp. 1,01 1,02 1,35 35,55 13,32 0,37

Rhodococcus spp 0,85 2,54 1,91 18,56 19,97 1,07

Aspergillus spp. 0,98 1,98 1.51 29,13 15,62 0,56

Trihoderma spp. 0,99 2,01 1,52 20,18 15,5 0,76

Pseud. aeruginosa 1,05 1,16 1,01 29,9 12,2 0,4

Micrococcus spp. 1,08 1,15 1,14 28,9 13,8 0,47

Fusarium spp. 1,03 1,08 1,86 30,2 12,5 0,41

Mhetatisium spp 0,88 2,98 3,49 18,33 19,9 1,08

Pseudomonas putida 0,96 2,47 2,88 20,15 16,88 0,83

Nocardia spp. 1,09 1,05 1,98 35,8 10,01 0,27

Рост выделенных углеводородокисляющих микроорганизмов

Характер роста микроорганизмов обусловлен видом микроорганизма, условиями культивирования и особенностями углеводорода (Корнелли и др, 2001)

Таблица 2. Рост выделенных углеводородокисляющих микроорганизмов при разных температурных режимах.

№ -----Температура Штамм ' -— 8°C 16°C 28°C 37°C

1 Pseudomonas putida SP-203 8-5 8-5 10 8-5

2 Rhodococcus ruber PS-02 8-5 10 10 4-3

3 Trichoderma citrinoviride VS-89 4-3 8-5 10 4-3

4 Aspergillus cameus SU-TM-02 4-3 10 8-6 1-2

5 Metarrhizium cmisopliae AF-03 1-2 4-3 10 4-3

Примечание pocm бактерий и микромицетов оценивши в условных единицах (баллы) (Хомякова, 2003) За 10 баллов принимали активный быстрый рост с максимальным накоплением биомассы, в 8-5баллов оценивали среднийрост, в 4-3 - слабыйрост, в 1-2 - очень слабый имедленныйрост 0баллов - отсут-ствиероста за 20дней культивирования

Нами установлена психроактивность выделенных штаммов и способность нормально расти при температуре от 8°С до 16°С (табл. 2) Бактериальные штаммы Rh. ruber PS-02 и Ps. putida SP-203 способны к активному росту и использованию нефти при пониженной температуре 8°С. Микромицеты относятся к мезофильным микроорганизмам. Оптимальная температура для развития микромицета Asp carneus SU- TM-02 - 16°С.

В настоящее время доказано, что углеводородокисляющие бактерии способны окислять углеводороды нефти как в присутствии, так и в отсутствии кислорода. Однако, основная роль принадлежит аэробному процессу биодеградации (Самосова и др, 1982).

Таблица 3. Влияние аэрации на рост углеводородокисляющих

микроорганизмов

Л? Температура Штамм 16°C 28°C

Аэрирование Отсутствует 100 об/мин Отсутствует 100 об/мин

1 Ps. putida SP-203 8-5 10 8-5 10

2 Rh. ruber PS-02 8-5 10 10 10

3 Trich. citrinoviride VS-89 4-3 2-1 8-5 4-3

4 Asp. carneus SU-TM-02 8-5 4-3 4-3 2-1

5 Met. anisopliae AF-03 4-3 2-1 10 4-3

Примечание: рост микроорганизмов оценивали в условных единицах (баллы) (Хомякова, 2003).

Рост бактерий Ps. putida SP-203 и Rh. ruber PS-02 при аэрации заметно возрастает (как при 16°С, так и при 28°С) (таб. 3). Обратно противоположная тенденция роста и развития при аэрации наблюдается у углеводородокисляющих микромицетов: Tnch. alrinoviride VS-89, Asp. carneus SU-TM-02 и Met. amsopliae AF-03. Стационарные условия роста являются наиболее оптимальными для их развития.

Таким образом, все выделенные нами штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов являются строгими аэробами с оптимальной температурой развития в 28°С.

Химическая трансформация углеводородов нефти выделенными микроорганизмами

Нефть - сложная смесь алканов (парафиновых и ациклических насыщенных углеводородов), нафтенов и аренов различной молекулярной массы. Дополняют их кислородные, сернистые и азотистые производные углеводородов (Петров, 1984). В настоящее время известно, что окислению могут быть подвергнуты практически любые углеводороды, причём скорость их деградации прямо зависит от вида микроорганизма (Киреева, 1995; Корнелли, 2003).

Результаты проведенных нами газохроматографических исследований

и

выявили, что ассоциация микроорганизмов (Ps. putida SP - 203, Rh. ruber PS-02, Trick citrinoviride VS-89, Asp. carneus SU-TM-02 и Met. anisopliae AF-03) при росте в жидкой среде Раймонда с 5% нефти Харьягинского месторождения и 1% NaCl (t=26-28*C) в течение 10 дней разлагает более 50% углеводородов нефти.

На 5 сутки отмечается снижение содержания нефти на 18-25%. Происходит избирательное удаление н-алканов состава С12 — С30 (с 44,1% до 26,3%), снижается соотношение коэффициента труднодоступных соединений нефти пристан/фитан с 1,14 до 1,02.

На 10 сутки отмечается снижение содержания углеводородов нефти более чем на 50%. Суммарная концентрация нормальных алканов состава С12 — С30 уменьшается с 44,1% до 13,3%.

Рис.1 Хроматограмма насыщенной фракции контрольного образца нефти Харьягинского месторождения.

Рис. 2 Окисление углеводородов нефти ассоциацией микроорганизмов. Хроматограмма насыщенной фракции нефти Харьягинского месторождения после 10-дневной инкубации ассоциацией аэробных углеводородокисляющих микроорганизмов.

Увеличивается значение изопреноидного коэффициента с 11,05 до 18,7. Это свидетельствует о первом этапе окисления, когда происходит избиратель-

ное удаление легкодоступных н-алканов из насыщенной фракции нефти. В ходе окисления углеводородов снижается коэффициент пристан/фитан (с 1,14 до 0,69), меняется нефтяной паспорт и общий химический тип нефти (А'—► А2), что, предположительно, может рассматриваться в качестве основного геохимического процесса, приводящего к эволюции нефтей и определяющего, таким образом, большое разнообразие их состава в природе (Петров, 1984).

Таким образом, результаты изучения трансформации нефти выявили, что ассоциация микроорганизмов (Ps. putida SP - 203, Rh. ruber PS- 02, Trick citri-noviride VS - 89, Asp. carneus SU- TM- 02 и Met. anisopliae AF - 03) обладает высокой активностью в деструкции сырой нефти и ее легких фракций (н-алканов).

Особенности интродукции углеводородокисляющих микроорганизмов в компост и почву

Эффективность биологической очистки напрямую зависит от соблюдения и выполнения всех тонкостей процесса интродукции микроорганизмов в субстрат и далее в нефтезагрязненные системы (Гузев, Звягинцев, 1998).

Углеводородокисляющие микроорганизмы, составляющие основу разработанного нами биопрепарата, обладают высокой жизнеспособностью при внесении их в почву. Титр бактериальных клеток при инокуляции в компост составляет КОЕ/г, спор микромицетов - 1x10* КОЕ/г. По истечении 5, а далее 10 суток наблюдается постепенное снижение количества интродуцирован-ных микроорганизмов, что можно объяснить временной адаптацией внесенных в субстрат штаммов. Данная тенденция снижения численности интродуциро-ванных микроорганизмов стабилизируется лишь к 30 суткам и составляет в среднем от 1х106до 3,5x10" КОЕ/г. Также выявлено отсутствие Asp. carneus SU - TM- 02 в субстрате на 30 сутки.

Численность подавляющего большинства микроорганизмов после внесения их в нефтезагрязненную почву стабилизируется на определенном уровне. В редких случаях популяция гибнет. Как правило, гибель отмечается у микроор-

ганизмов, которые не могут переносить низких значений рН. Они отличаются большой интенсивностью обмена и требуют непрерывного притока питательных веществ (Киреева и др., 1997).

Таблица 4: Численность углеводородокисляющих микроорганизмов

в компосте

№ Штаммы Титр иннокулированных в субстрат низмов (КОЕ/г субстрата' микроорга-

В день ин~ нокуляиии Через 5 суток Через 10 суток Через 30 суток

1. Ps. putida SP - 203 (n=9) 1,1*1012± 9,8 1,8 х ю" ± 8,8* 2,2 х lO'^i 7,8* 1,7 х 1010± 8,9

2. Rh Ruber PS- 02 (h=9) 1,4 х 10|2± 10,1 3,5 х Ю" ± 10,0* 2,8 х 10" ± 10,5* 1,8 х 10й ± 11,0

3. Met. Anisopliae AF-78 (n=9J 1,1 х 10е± 10,0 4,1 х Ю'± 9,1* 5,2 х 10° ± 10,1* 1,8 х 10° ± • 5,5

4. Trick citrinaviride VS-89 (n=9) 1,4* 10* ± 7,5 8,9 х Ю' ± • 8,1 6,8 х 10'± 9,7* 4,9 х ю'± 10,0

5. Asp carneus SU - TM~ 03 (n=9) 1Дх 10s ± 7,5 1,1 х 10'± * 6,5 0,5 х Ю*± • 5,7 0x0°'

6. Ps. putida SP-203 + Rh. ruber PS -02{n=9) 1ДхЮ,2± 7,5 9,8 х Ю11 ± • 7,7 7,8 х Ю" ± 5,8 3,5 х Ю"± 10,3*

7. Met. anisopliae AF- 78 +Trich.citrinoviride VS-89 + Asp.carneus SU - TM- 03 (n=9) 1,2* ю» ± 8,5 4,2 х Ю7± 10,0* 2,1 х 106± в/ 1 х Ю6 ± 9,6

8. Все штаммы вместе (n=9) 1,2 х 10|о± 7,2 9,5 х Ю'± 1U* 8,0 х 10® ± 7,8 6,6 х Ю®± 10,2

Примечание: п - количество значений в выборке; М±т - средняя арифметическая и её ошибка;* - достоверная разница (р > 0,5) при сравнении показателей во времени

Выживаемость микроорганизмов изучена путем внесения соответствующих штаммов с компостом в различные типы нефтезагрязненных почв. Активная приспосабливаемость определена у бактериальных штаммов, менее активная - у микромицетов. Высокой жизнеспособностью обладает ассоциация Ря. риНйа ЗР -203 и Як гиЬег РЗ -02. Данная ассоциация сохраняет высокую численность даже по истечении 4 месяцев эксперимента. Наиболее благоприятные условия для развития интродуцированных микроорганизмов и наибольшая чис-

ленность выявлены в нефтезагрязненной черноземной почве. Наибольший процент интродуцированных микроорганизмов отмечен в почвах, загрязненных нефтью Сугмутского месторождения. Установлено отсутствие Asp. carnens SU-ТМ-03..

Таким образом, выявлена высокая жизнеспособность углеводородокис-ляющих микроорганизмов (за исключением штамма Asp. carneus SU-TM-03) при интродукции их в компост и нефтезагрязненные почвы.

Конструирование микробного консорциума для биопрепарата, разрушающего нефть

Одним из главных способов интенсификации микробного разложения углеводородов нефти является внесение различных биопрепаратов, содержащих биомассу специально подобранных штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов. В России наиболее известными биопрепаратами на основе углево-дородокисляющих микроорганизмов является «Путидойл (Евдокимова и др., 1994), «Псевдомин» (Емцев, Станкевич, 2002), «Экойл» (Ермоленко и др., 1994), «Деворойл» (Сидоров, Борзенков и др., 1997) и т.д. Однако, в литературе практически отсутствуют упоминания о применении штаммов микромицетов как одних из наиболее перспективных деструкторов нефти.

Для усовершенствования биотехнологических методов рекультивации нефтезагрязненных почв нами был сконструирован биопрепарат на основе штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов Ps. putida SP-203, Rh ruber PS-02, Trick citrinoviride VS-89 и Met. anisopliae AF-03 и органического субстрата, который показал хорошие результаты в лабораторных экспериментах по очистке почвы от сырой нефти. В качестве субстрата использовали компост высокого нагрева. После стерилизации компост заражали чистыми культурами, углеводородокисляющих микроорганизмов. В стерильные пакеты с субстратом отдельно вносили бактериальные разведения: (Часть №1, Титр=1х10,2КОЕ/г) и разведения спор микромицетов (Часть №2, Титр=1х10' КОЕ/г) (рис.3).

РЬс 3. Структура и состав биопрепарата «Макродегрин» на оспове ассоциации углеводородокислающих штаммов микроорганизмов

Влияния нефти на динамику численности различных групп микроорганизмов

Эффект воздействия нефти на почву проявляется в изменении комплекса почвенных микроорганизмов в целом. Нефть оказывает селекционное действие на почвешгую микробиоту, вызывая изменение состава, численности и организации микробного сообщества почвы. (Пиковский, 1991; Славина, 1992; Кирее-ва, 2001).

В лабораторном опыте по изучению динамики численности микроорганизмов в нефтезагрязненной почве с дополнительным внесением биопрепарата на основе углеводородокисляющих штаммов установлено:

Общее содержание микроорганизмов в нефтезагрязненных почвах в течение первых недель значительно снижается. При этом снижается доля доминирующих микроорганизмов контрольной почвы: Вас. mycoides, Mucor. spp. и др, и возрастает доля Ps. spp., Penicillum spp., Asp. Spp и др. Внесение в почву углеводородокисляющих микроорганизмов обеспечивает на начальном этапе

эксперимента увеличение общей численности микроорганизмов в вариантах с внесением биопрепарата.

По истечении двух и более шести месяцев эксперимента наблюдается достоверное увеличение числа гетеротрофов, микромицетов и углеводородо-кисляющих микроорганизмов в исследуемых почвах с внесением биопрепарата. В вариантах без дополнительного внесения углеводородокисляющих микроорганизмов общая численность была на порядок ниже.

Таким образом, дополнительное внесение биопрепарата повышает общую численность исследуемых групп микроорганизмов. Также нефть, за счет содержания веществ, стимулирующих рост микроорганизмов, активирует жизнедеятельность гетеротрофной и углеводородокисляющей микрофлоры.

Особенности микробоценозов нефтезагрязненных почв

В задачу наших исследований входило описание микробных ценозов нефтезагрязненных почв. Данные исследования по изучению нефтезагрязнсн-ных почв проведены нами впервые и представляют не только научный, но и практический интерес.

Наблюдения, проведенные в течение 10 месяцев эксперимента, показывают на доминирование в микробных пейзажах нефтезагрязненных почв гифов грибов (рис. 4)

Микробоценозы нефтезагрязненных почв (хЮОО)

Часто обнаруживается обрастание мицелия бактериальными клетками, что неоднократно встречается в вариантах с нефтезагрязненной черноземной

Рнс.4

Рис. 5

Рве. б

Рис.7

почвой. В одних случаях это приводит к гибели и лизису гриба, в других - оба микроорганизма выигрывают от такого тесного сожительства.

Бактериальная флора нефтезагрязненных почв характеризуется четкой дифференцировкой во времени. В начальные стадии (до 2 мес.) в загрязненных нефтью почвах доминируют представители палочек разной величины (рис.5). Далее (по истечении 2 месяцев) главенствующее место занимают гифы актино-мицетов и грибов. В вариантах без внесения биопрепарата часто доминируют дрожжеподобные клетки (рис.6).

Отмечена своеобразность ценозов аллювиального песка. Здесь преобладают гифы актиномицетов (рис.4) в течение практически всего эксперимента. В некоторых вариантах с нефтезагрязненным песком наблюдается обилие кокковых форм и палочек, в частности, в вариантах с внесением углеводородокис-ляющих микроорганизмов.

Рассматривая распределение микроорганизмов в почве необходимо подчеркнуть, что в вариантах с внесением биопрепарата в исследуемые почвы и песок наблюдается перераспределение основных доминирующих форм микроорганизмов нефтезагрязненной почвы на представителей интродуцированной ассоциации (Trick citrinoviride; рис. 7).

Исследование степени деградации нефти в почве

Первоначальное содержание нефти в почве рассматривали как 100%. К концу эксперимента (через 6 месяцев) наблюдалось достоверное снижение количества нефти во всех исследуемых вариантах (рис.8). Количество нефти снизилось в среднем на 50-60%. В вариантах с внесением биопрепарата содержание нефти понизилось на 79-82%. С наибольшей эффективностью процесс деградации нефти наблюдался в дерново-подзолистой почве (73-82%), менее активно - в черноземной почве (70-79%), наименее слабо - на речном песке (4045%).

Следует отметить, что в нефтезагрязненных почвах более эффективным процесс окисления установлен в вариантах со среднепарафинистой нефтью

Сугмутского месторождения. В загрязненном нефтью аллювиальном песке наиболее эффективно процесс деградации наблюдался с высокопарафинистой нефтью Харьягинского месторождения (рис.8).

1,1 3,1 3,4 4,1 4,4 5,1 5,4 1,2 3,2 3,5 4,2 4,5 5,2 5,5 1,3 3,3 3,6 4,3 4,6 5,3 5,6

Варианты опыта

Рис. 8. Изменение содержания нефти по сравнению с первоначальным внесением, %. (Примечание- штриховка - варианты с внесением иефти Харьягинского месторождения, без штриховки - нефть Сугмутского месторождения.)

Биологический тест на токсичность почвы

При оценке токсичности загрязненных нефтью почв успешное применение находят фитопробы с тест - растениями (Фомченков и др., 1996).

Нами оценивалась степень фитотоксичности нефтезагрязненной почвы. В качестве тест объектов использовали семена тест - растений: кресс-салата (Lepidium sativum) и пшеницы сорта «Московская - 35» (Triticum durum).

Выявлено, что токсическое действие нефти на всхожесть семян тест -растений проявляется при концентрации 3% от веса почвы. Семена тест-растений частично теряют всхожесть сразу после внесения нефти. Наименьшая всхожесть наблюдается в вариантах с песком, что свидетельствует о наибольшем угнетающем действии ксенобиотика. К четвертому месяцу исследований происходит полное снижение фитотоксичности. Всхожесть семян составляет 65-80% в вариантах без внесения биопрепарата. В вариантах с внесением ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов всхожесть семян достигает от 85 до 95% в зависимости от типа почвы. Наибольшее снижение токсичности отмечается в вариантах с внесением среднепарафинистой нефти Сугмутского

месторождения.

В результате действия разработанного нами микробиологического препарата на основе ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов наблюдается снижение токсичности нефтезагрязненной почвы до уровня, не препятствующего росту и развитию тест-растений.

Таким образом, в настоящей работе представлена дополнительная информация об углеводородокисляющих микроорганизмах и испытания нового биопрепарата, показавшего высокую эффективность при очистке почв от нефти. Данные исследования открывают дальнейшие перспективы его практического использования.

ВЫВОДЫ

1. Выделены микроорганизмы, усваивающие углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода. Данные микроорганизмы изучены и идентифицированы: Pseudomonas putida SP-203, Rhodococcus ruber PS-02, Trichoderma citrinoviride VS-89, Metarrhizium anisopliae AF-78, Aspergillus carneus SU-TM-03. Являясь психроактивными, они могут быть использованы при очистке нефтезагрязненных почв в районах с непродолжительным теплым периодом.

2. Разработан оригинальный способ культивирования углеводородокис-ляющих микроорганизмов на компосте высокого нагрева в качестве органического субстрата. На основе выделенных штаммов микроорганизмов создан биопрепарат для борьбы с нефтезагрязнениями, на который оформляется патент Российской Федерации.

3. Результаты газохроматографического анализа и ИК-спектроскопии служат показателями изменения фракционного состава нефти при культивировании микроорганизмов на модифицированных питательных средах с добавлением нефти. Газохроматографический анализ подтверждают высокую углево-дородокисляющую активность выделенной ассоциации (более 50% н-алканов за 10 дней культивирования).

4. Модифицирован и впервые использован метод Н.Г. Холодного при изучении динамики формирования структуры микробного ценоза, плотности обрастания и распределения доминирующих микроорганизмов в различных типах нефтезагрязненных почв.

5. Выделенные микроорганизмы-деструкторы, участвующие в ко метаболическом разложении сырой нефти, существенно снижают токсичность почв и способствуют не только прорастанию семян, но и росту тест-растений (кресс-салата и пшеницы).

6. Результаты эксперимента по очистке почв биопрепаратом показывают высокую активность микроорганизмов по отношению к углеводородам нефти (до 85% от начального содержания в почве). Разработанный биопрепарат может быть рекомендован как один из эффективных при очистке почв для ускоренной деструкции нефти и восстановления ее биологической активности.

7. Предложенная стратегия рекультивации нефтезагрязненных почв базируется на усилении биологической активности почв путем внесения ассоциации культур микроорганизмов-деструкторов.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1.Павликова Т.А. Биоремидиация почвы ассоциацией углеводородокис-ляющих микроорганизмов //Материалы Международной научной конференции «Агрохимические аспекты повышения продуктивности сельскохозяйственных культур».- «Бюллетень ВИУА №16».- М.: Агроконсалт, 2002. - С.445-447.

2. Сидоренко О.Д., Войно Л.И., Павликова Т.А. Влияние нефти на микрофлору почв и подбор ассоциации микроорганизмов, способных к ее деструкции //Сб. докл. Всероссийской научно-технической конференции- выставки с международным участием «Качество и безопасность продовольственного сырья и продуктов питания». - М.: Изд-во МГУП, 2002. - С. 176-178.

3. Сидоренко О.Д., Павликова Т.А. Деградация нефти ассоциацией угле-водородокисляющих микроорганизмов //Доклады ТСХА. Вып. 275. М.: Изд-во МСХА, 2003. - С. 265-272.

4. Войно Л.И., Павликова Т.А., Сидоренко О.Д. Устойчивость и изменение численности почвенных микроорганизмов при нефтезагрязнении почвы //Сб. докл. Всероссийской научно-технической конференции- выставки «Высокоэффективные технологии, методы и способы для их реализации». - М.: Изд-во МГУП, 2003. - С. 160-162.

Усл. печ.л. 1,16

Зак. 217

АНО «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Тир. 100 экз.

N1 06 75

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Павликова, Татьяна Алексеевна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Проблема нефтяного загрязнения окружающей среды и ее влияние нефти на почвенный микробоценоз.

1.1.1. Модифицирующее действие нефти на основные свойства почвы.

1.1.2. Специфичность действия углеводородов нефти на почвенный микробоценоз.

1.1.3. Способы рекультивации нефтезагрязненных почв.

1.2. Экологическая и морфолого-биохимическая характеристика уг-леводородокисляющих микроорганизмов.

1.2.1. Распространение микроорганизмов - деструкторов углеводородов нефти.

1.2.2. Морфологические и биохимические особенности углеводо-родокисляющих микроорганизмов.

1.3. - Химические аспекты деградации нефти аэробными углеводоро- • докисляющими микроорганизмами.

1.4. Биоремедиация нефтезагрязненных почв.

1.4.1. Проблема выживания интродуцированных микроорганизмов - деструкторов нефти.

1.4.2. Роль микробных биопрепаратов в биоремедиации почвенных экосистем, загрязненных нефтью.

Глава 2. Объекты, методы и условия проведения эксперимента

2.1. Объекты и условия проведения эксперимента.

2.2. Выделение, идентификация и изучение активных штаммов углево-дородокисляющих микроорганизмов.

2.3. Методика изучения микробиологического воздействия на химический состав нефти.

2.3.1. Методика изучения трансформации углеводородов микроорганизмами.

2.3.2. Газохроматографический анализ нефти.

2.4. Методика приготовления комплексного микробного биопрепарата на основе выделенных углеводородокисляющих штаммов микроорга-нимов.

2.5. Изучение приживаемости углеводородокисляющих штаммов микроорганизмов в компосте и почве.

2.6. Изучение микробных ценозов нефтезагрязненных почв.

2.7. Определение остаточного содержания нефти в почве.

2.7.1. Экстракция нефтепродуктов и их очистка.

2.7.2. ИК-спектрометрический анализ экстрактов.

2.8. Изучение влияния нефти на фитотоксичность нефтезагрязненных почв.

2.9. Использование электронно-вычислительной техники и методы статистической обработки результатов.

Глава 3. Результаты исследований

3.1. Выделение и отбор штаммов микроорганизмов, активно усваивающих углеводороды нефти.

3.2. Морфологические и физиолого-биохимические особенности выделенных углеводородокисляющих штаммов микроорганизмов.

3.2.1. Диагностика выделенных углеводородокисляющих бактерий рода Pseudomonas putida и Rhodococcus ruber.

3.2.2. Диагностика выделенных углеводородокисляющих мик-ромицетов рода Trichoderma citrinoviride, Metarrhizium anisoplia и Aspergillus carneus.

3.3. Исследование роста выделенных углеводородокисляющих микроорганизмов

3.3.1. Влияние температуры на рост углеводородокисляющих микроорганизмов.

3.3.2. Влияние аэрации на динамику роста микроорганизмов.

3.3.3. Особенности развития выделенных микроорганизмов на различных источниках углеводородов.

3.4. Химические механизмы трансформации углеводородов нефти выделенными бактериями и микромицетами.

3.5. Конструирование микробного консорциума для биопрепарата, разрушающего нефть.

3.5.1. Особенности инокуляции углеводородокисляющих микроорганизмов.

3.6 Изучение влияния нефти на динамику численности почвенных микроорганизмов в условиях лабораторного опыта.

3.6.1. Изменение общей численности гетеротрофных бактерий и почвенных микромицетов в нефтезагрязненной почве.

3.6.2. Динамика численности углеводородокисляющих микроорганизмов в нефтезагрязненной почве.

3.7. Особенности микробоценозов нефтезагрязненных почв.

3.8. Исследование степени деградации нефти в почве.

3.9. Сравнительное изучение микробиологических препаратов на основе углеводородокисляющих штаммов микроорганизмов.

3.10. Биологический тест на фитотоксичность почвы, загрязненной нефтью.

Выводы.

Список используемой литературы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Деградация нефти ассоциацией аэробных углеводородокисляющих микроорганизмов в различных типах почв"

Актуальность проблемы

Многочисленные нарушения экологического равновесия в природе, в конечном счете, приводят к экологическим катаклизмам. Следствием безудержного и неконтролируемого внедрения человека в биосферу оказывается загрязнение почвы и водоемов вредными веществами.

В настоящее время среди различных техногенных нарушений природы одним из наиболее серьезных и трудно устраняемых является нефтезагряз-нение. Нефть и ее компоненты (ароматические, нафтеновые и парафиновые углеводороды) являются одними из самых опасных загрязнителей, попадающих в почву в процессах добычи, транспортировки, переработки и хранения. Хронические разливы нефти приводят к быстрой и полной деградации ландшафтов (Израэль, Ровинский 1986; Amadi et al., 1993).

Для ускорения процесса самоочищения почв от нефти используются все природные резервы экосистемы, в том числе и биологические. Микробиологические методы очистки почв способны дополнять различные технологии, а в определенных ситуациях не имеют аналогов (Walker, 1985; Пиков-ский, 1993; Н.А. Киреева и др., 2001).

Значительный вклад в процесс биологического разрушения нефти вносят углеводородокисляющие микроорганизмы, являющиеся постоянным компонентом почвенных биоценозов. Микроорганизмы способны использовать углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода и доводить процесс трансформации органического вещества до полной минерализации. В результате биохимических процессов природные загрязнители превращаются в углекислый газ, воду, и другие экологически нейтральные соединения (Гузев, Корнелли 1981; Walker, 1985; Славина, Середина, 1992).

В настоящее время интенсивно разрабатываются и применяются методы микробиологической очистки природных сред от нефтяного загрязнения, основанные на использовании чистых или смешанных культур углеводоро-докисляющих микроорганизмов в сочетании с различными веществами, стимулирующими их активность. Эффективность этих методов может быть значительно повышена путем изменения соответствующих физико-химических условий среды и внесением ассоциации специально подобранных штаммов микроорганизмов, обладающих выраженными углеводородо-кисляющими свойствами. (Славина, Середина, 1992; Сидоров и др., 1997). Одним из важных условий микробиологической очистки нефтезагрязнений является способность различных групп микроорганизмов (бактерий, актино-мицетов, дрожжевых грибов и микромицетов) совместно «бороться» с загрязнением, а также обладать высокой иннокулятивной жизнеспособностью (Звягинцев и др., 2001).

За рубежом в последнее время широкое развитие получили биореме-диационные технологии на основе комплексных микробиологических препаратов. В отечественной же практике реальные методы по использованию комплексных микробиологических препаратов для очистки окружающей среды от углеводородного загрязнения упоминаются очень редко (Сидоров и др., 1997). Надеемся, что результаты изучения физиологии и экологии ассоциаций углеводородокисляющих микроорганизмов и разработка методов их успешной интродукции в природные экосистемы позволят в дальнейшем развить экологическую биотехнологию в нашей стране.

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение действия сырой нефти на почвенную микробиоту; выделение ассоциации аэробных микроорганизмов, активно утилизирующих углеводороды нефти и изучение их способности к биоремедиации нефтезагрязненных почв.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

• Выявить, выделить и культивировать в чистой культуре микроорганизмы, способные к потреблению углеводородов нефти.

• Отобрать штаммы микроорганизмов-деструкторов с наибольшей глубиной окисления углеводородов нефти.

• Установить таксономическую принадлежность и фцзиолого -биохимические особенности микроорганизмов-деструкторов нефти.

• Исследовать действие сырой нефти Харьягинского и Сугмутского мест о-рождений на почвенную микрофлору.

• Разработать комплексный микробный биопрепарат, способный к деград-ции углеводородов нефти.

• Изучить особенности микробоценозов нефтезагрязненных почв.

Научная новизна работы

Из загрязненных нефтью почв выделены бактериальные штаммы и штаммы микромицетов, использующие углеводороды, входящие в состав сырой нефти в качестве единственного источника углерода. Полученные культуры идентифицированы, изучены и отнесены к видам iRodococcus ruber PS-02., Pseuchmanas putida SP-203, Trichoderma ciirmovirkie VS-89, Metarrhizium aniscpliae AF-78, AspergMus carneus SU-TM-03. Выявлена высокая деструктивная способность микромицетов Trichoderma citrinovu'ide VS-89 и Metarrhizium arrisopliae AF-78, что ранее в литературе не отмечено. Установлено, что ассоциация углеводородо-кисляющих микроорганизмов обладает высокой иннокулятивной способностью. Показана высокая активность углеводородокисляющих микроорганизмов в деструкции сырой нефти и ее легких фракций (нормальных алканов) при относительно низких температурах (8-15°С). Изучены микробоценозы нефтезагрязненных почв. Выявлена роль углеводородокисляющих штаммов микроорганизмов в деградации нефти на песке.

Практическая значимость

На основе ассоциации выделенных аборигенных штаммов-деструкторов углеводородов нефти разработан комплексный биопрепарат, показавший высокую активность в окислении сырой нефти Сугмутского и Харьягинского месторождений и позволяющий в течение 4 месяцев снизить токсичность почвы, загрязненной сырой нефтью, до уровня, не препятствующего росту растений. Результаты проведенных исследований являются основой для разработки технологии получения новых биопрепаратов, используя аборигенные штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов g для очистки почв, загрязненных сырой нефтью в широком температурном диапазоне (t=15-28°C).

Работа выполнена в условиях лабораторного опыта, заложенного на кафедре микробиологии Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева (г. Москва) в 2001-2004 гг.

Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю — д.с-х.н., профессору Сидоренко О.Д. за ценные консультации и советы при выполнении данной работы;

- также выражает признательность сотрудникам лаборатории газовой / хроматографии НИИ газа и нефти (г.Москва) м.н.с. Назаровой Е.С и др; заведующему кафедрой органической химии МСХА (г. Москва) д.х.н., профессору Князеву В.Н. за предоставленную возможность провести необходимые газохроматографические и спектрометрические исследования;

- сотрудникам лаборатории нефтяной микробиологии Института микробиологии РАН (г.Москва) к.б.н. Милехиной Е.И. и др. за методическую поддержку и ценные консультации;

- заведующему лабораторией химии нефти НИИ нефти им. Крылова (г. Москва), к.тех.н. Ошмяну К.Д. за предоставленные образцы нефти;

- сотруднику кафедры микологии МГУ им. Ломоносова к.б.н. Александровой А.В. за помощь и ценные консультации в определении видовой принадлежности микромицетов;

- также сотрудникам кафедры микробиологии МСХА им. К.А. Тимирязева.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Павликова, Татьяна Алексеевна

ВЫВОДЫ

1. Выделены микроорганизмы, усваивающие углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода. Данные микроорганизмы изучены и идентифицированы: Pseudomonas putida SP-203, Rhodococcus ruber PS-02, Trichoderma citrinoviride VS-89, Metarrhizium anisopliae AF-78, Aspergillus carneus SU-TM-03. Являясь психроактивными, они могут быть использованы при очистке нефтезагрязненных почв в районах с непродолжительным теплым периодом.

2. Разработан оригинальный способ культивирования углеводородокисляющих микроорганизмов на компосте высокого нагрева в качестве органического субстрата. На основе выделенных штаммов микроорганизмов создан биопрепарат для борьбы с нефтезагрязнениями, на который оформляется патент Российской Федерации.

3. Результаты газохроматографического анализа и ИК-спектроскопии служат показателями изменения фракционного состава нефти при культивировании микроорганизмов на модифицированных питательных средах с добавлением нефти. Газохроматографический анализ подтверждают высокую углеводородокисляющую активность выделенной ассоциации (более 50% н-алканов за 10 дней культивирования).

4. Модифицирован и впервые использован метод Н.Г. Холодного при изучении динамики формирования структуры микробного ценоза, плотности обрастания и распределения доминирующих микроорганизмов в различных типах нефтезагрязненных почв.

5. Выделенные микроорганизмы-деструкторы, участвующие в коме-таболическом разложении сырой нефти, существенно снижают токсичность почв и способствуют не только прорастанию семян, но и росту тест-растений (кресс-салата и пшеницы).

6. Результаты эксперимента по очистке почв биопрепаратом показывают высокую активность микроорганизмов по отношению к углеводородам нефти (до 85% от начального содержания в почве). Разработанный биопрепарат может быть рекомендован как один из эффективных при очистке почв для ускоренной деструкции нефти и восстановления ее биологической активности.

7. Предложенная стратегия рекультивации нефтезагрязненных почв базируется на усилении биологической активности почв путем внесения ассоциации культур микроорганизмов-деструкторов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павликова, Татьяна Алексеевна, Москва

1. Андресенко М.Я., Рунов В.И. Углеводородокисляющие бактерии и лучистые грибы, выделенные из нефтеносных почв Узбекистана, как продуценты биомассы и биологически активных веществ//Микробиологическая промышленность. — 1973. №1. — С. 23-27.

2. Аристовская Т.В. Микробиология подзолистых почв. М: Наука, 1965. —168 с.

3. Артемьева Т.Н., Гилязов М.Ю., Фильченкова В.И. и др. Экологический мониторинг почв, нарушенных при нефтедобыче и методы рекультивации. Казань: 1988. -С. 9-10.

4. Артемьева Т.И., Штина Э.А. Экологические последствия загрязнения почв нефтью// Бактериальный фильтр Земли: Тез. докл. семинара, 30-31 мая 1985 г.-Пермь, 1985.-Т.1.-С. 28-29.

5. Билай В.И., Коваль Э.З. Аспергиллы. — Киев: Наукова думка, 1988. — С. 175-176. \

6. Билай В.И., Коваль Э.З. Рост грибов на углеводородах нефти. — Киев: Наук. думка, 1980. -С.79-100.

7. Борзенков И.А., Ибатуллин Р.Р., Милехина Е.И., и др. Использование микроорганизмов при ликвидации нефтяных загрязнений почв //Интродукция микроорганизмов в окружающую среду. Тезисы докл. конф. 17-19 мая 1994.-С. 14-15.

8. Борзенков И.А., Милехина Е.И., Беляев С.С., Иванова М.В. Консорциуммикроорганизмов, используемый для очистки почвенных и солоновато-водных экосистем от загрязнения нефтепродуктами: Патент №2023686 РФ //Б.И. 1994. №22. С. 136.

9. Бусыгин Е.А. Влияние концентрации нефти на активную альгофлору, отражающую состояние почвы // Микроорганизмы в сельском хозяйстве. Тез. докл. 3 Всес. науч. конф., Москва, 23-25 декабря 1986. М.: МГУ. -1986.-С. 124-125.

10. Виноградский С.Н. Микробиология почвы. Проблемы и методы. М: Изд. АН СССР, 1952. - с. 115.

11. Глазовская М.А. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. -М.: Наука, 1988. 254 с.

12. Глазовская М.А. Способность природной среды к самоочищению //Природа. 1979. - №3. - С. 71-79.

13. Глязов М.Ю. Изменение некоторых агрохимических свойств выщелоченного чернозема при загрязнении его нефтью //Агрохимия, 1980. — Т. 12. -С. 72-75.

14. Гузев B.C., Волде М.И., Куличевская И.С. и др. Влияние масляной кислоты на физиологическую активность углеводородокисляющих родококков //Микробиология. 2001.- Т. 70, №3. - С. 313-320.

15. Гузев B.C., Голышкин П.Н. Пролонгированная катаболитическая репрессия и проблемы интродукции микроорганизмов в почву //Микробиология.- 1994.- Т.66.- № 4.- С. 565-572.

16. Гузев B.C., Левин С.В., Звягинцев Д.Г. Диагностические признаки различных уровней загрязнения почвы нефтью //Почвоведение. 1998. -№1., С. 72-78.

17. Гусев М.В., Коронелли Т.В. Микробиологическое разрушение нефтяного загрязнения //Изв. АН СССР. 1981. - Сер. биол., №6. = С. 835-844.

18. Давыдова М.Н., Мухитова Ф.К., Ибатуллин P.P. Анаэробная трансформация нефти под действием экстрактов клеток Desulfovibrio desulfuricans //Микробиология. 1998.- Т.67, №2.- С.202-203.

19. Евдокимова Г. А., Месяц СП., Мозгова Н.П. Пути биодеградации нефти в водоемах высоких широт /Тез. докл. конф. «Интродукция микроорганизмов в окружающую среду» М.: ПНЦ РАН, 1994. - С. 33-34.

20. Звягинцев И.С., Поглазова М.Н., Готоева М.Т., Суровцева Э.Г. и др. Влияние солености среды на деструкцию нефтяных масел нокардие-формными бактериями //Миробиология. — 2001.-Т. 70, №6.- С. 759-754.

21. Зякун А.М., Кошелева И.А., Захарченко В.Н. и др. Использование отно13 12шений С /С для определения микробного окисления углеводородов //Микробиология. 2003.- Т.72, №5.- С. 666-671.

22. Иванова А.Е. Углеводородокисляющие и сульфатвосстанавливающие бактерии высокотемпературных нефтяных пластов /Автореф. дисс. канд. биол. наук. Москва, 1998.

23. Израэль Ю.А., Ровинский ФЛ. Комплексный фоновый мониторинг в СССР // Комплексный глобальный мониторинг состояния биосферы. Тр. III Междунар. симп., 14-19 окт. 1985. -Ташкент, 1986. С. 89-105.

24. Исмаилов Н.М. Биодеградация нефтяных углеводородов в почве, иноку-лированной дрожжами //Микробиология. 1985, Т. 54. - №5. - с. 835-841.

25. Исмаилов Н.М. Влияние нефтяного загрязнения на круговорот азота в почве //Микробиология, 1983. Т. 52. - №6. - С. 1003-1007.

26. Исмаилов Н.М. Микробиология и ферментативная активность нефтезагрязненных почв. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. /Под ред. М.А. Глазовской. М.: Наука, 1988. - С. 42-56.

27. Исмаилов Н.М., Пиковский Ю.И. Биодинамика загрязненной нефтью почвы //Миграция загрязняющих веществ в почве и сопредельных средах. — Л., 1985.-С. 195-198.

28. Калачникова И.Г., Колесникова Н.М. Динамика микробных популяций в дерново-подзолистой почве при воздействии нефтяного загрязнения //Биодинам. Почв. Тез. докл. 3 Всес. Симп. Харку, 25-27 октября, 1988. -Таллин, 1988.- С.83.

29. Квасников Е.И., Клюшникова Т.М. Миьфоорганизмы — деструкторы нефти в водных бассейнах. — Киев: Наукова думка, 1981. -132 с.

30. Киреева Н.А. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. Уфа: Изд-во БашГУ, 1995.- 171 с.

31. Киреева Н.А., Водопьянов В.В. Математическое моделирование биодеградации нефти в почве //Биотехнология. — 1996. №8. — С. 55-59.

32. Киреева Н.А., Водопьянова В.В., Новоселова Е.И. и др. Микробиологическая рекультивация нефтезагрязненных почв. — М.: ОАО «ВНИИОЭНГ», 2001. -3-39 с.

33. Киреева Н.А., Галимзянова Н.Ф. Влияние загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами на численность и видовой состав микромицетов //Почвоведение. 1995, №2.- С. 211-216.

34. Киреева Н.А., Жданова Н.В., Горина Т.С. // Нефт. хоз-во. 1997.- №4.- С. 51-52.

35. Кожевин П.А. Микробные популяции в природе. М.: Изд-во МГУ, 1989, 175 с.

36. Комарова Т.И., Милько Е.С., Корнелли Т.В. Влияние серы на рост углеводородокисляющих бактерий разных родов //Микробиология. 2003.-Т.72, №2.- С.275-276.

37. Корнелии Т.В., Дермичева С.Г., Семененко М.Н. Родококки как природный сорбент углеводородов //Микробиология. — 1986.- Т.55, №4.- С. 683686.

38. Корнелли Т.В., Комарова Т.И., Поршнева О.В., Ткебучева Л.Ф. Внеклеточные метаболиты углеводородокисляющих бактерий как субстрат для развития сульфатредукции // Прикл. биохимия и микробиол. 2001. - Т. 37.-№5.-С. 549-553.

39. Корнелли Т.В.//Прикл. Биохим. и микробиол. 1996.- №6.- С. 579-585.

40. Куличевская И.С., Милехина Е.И., Борзенков И.А., и др. Окисление углеводородов нефти экстремально-галофильными архебактериями //Микробиология. 1991.- Т.60, №5.- С. 860-866.

41. Лысак JI.B., Лапыгина Е.В. Деструкция нефти монокультурами и природными ассоциациями почвенных бактерий //Вестник МГУ. Сер. 17, Почвоведение. - 1994. - №1. - С. 58-61.

42. Мавроди Д.В., Коваленко Н.П., Соколов С.Л. и др. Идентификация ключевых генов катаболизма нафталина в почвенной ДНК //Микробиология. 2003.- Т.72, №5.- С. 672-680.

43. Методы общей бактериологии /Под ред. Герхардта Ф. и др. М.: Мир, 1984. Т. 1.-С. 67-70.

44. Методы таксономического анализа // Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Звягинцева Д.Г. М.: Изд-во МГУ, 1991.- С. 131-133.

45. Микроорганизмы и охрана почв /Под ред. Д.Г. Звягинцева.- М.: Изд-во МГУ, 1989.-С. 129-162.

46. Милехина Е.И., Сидоров Д.Г., Борзенков И.А. и др. Микробиологическая деструкция мазута в почве при использовании биопрепарата Деворойл //Прикл. биотехнология и микробиология. 1998. - Т. 34., №3. - С. 281286.

47. Мишустин Е.Н., Рунов Е.В. Успехи разработки приемов микробиологического диагностирования состояния почвы //Успехи современной микробиологии. Т. 44, вып. 2(5). - 1957. - С. 256-268.

48. Мукатанов А.Х., Ривкин П.Р. Влияние нефти на свойства почвы. Нефтяное хозяйство, 1980. - №4. - С. 53-54.

49. Назина Т.Н., Соколова Д.Ш., Григорян А.А. и др. Образование нефтевы-тесняющих соединений микроорганизмами из нефтяного месторождения Дацин (КНР) //Микробиология. 2003.- Т.72, №2.- С. 206-211.

50. Наплекова Н.Н. Анаэробное разложение целлюлозы микроорганизмами в почвах Зап. Сибири. — Новосибирск: Наука, 1974. — 249 с.

51. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т.: Пер. с англ. / под ред. Дж. Хо-улта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса М.: Мир, 1997. -432 с.

52. Пароменская JI.H., Гаранкина Н.Г., Моисеева И.Г. и др. Альгологический метод определения фитотоксичности почв //Почвоведение.- 2001.- №6.- С. 708-712.

53. Петров А.А. Углеводороды нефти. -М: Наука, 1984. -С.150-220.

54. Петухов В.Н., Фомченков В.Н.,Чугунов В.А. и др. Биотестирование почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами с помощью растений //Прикл. биохимия и микробиология. 2000. — Т.36, №6. — С. 652-655.

55. Пиковский Ю.И. , Калачникова И.Г., Оглоблина А.И. и др. Экспериментальные условия трансформации нефти в почвах // Миграция загрязняющих веществ в почвах и сопредельных средах. — JI. — 1985.- С. 191-195.

56. Пиковский Ю.И. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. М.: Наука, 1988.- С. 7-22

57. Пиковский Ю.И. Природные и техногенные потоки углеводородов в окружающей среде,- М: Изд-во МГУ, 1993.- 208 с.

58. Плотникова Е.Г., Алтынцева О.В., Комелева И.А. и др. Бактерии — деструкторы полициклических ароматических углеводородов, выделенные из почв и донных отложений района солеразработок //Микробиология. — 2001, Т. 70.-№1.-С. 61-69.

59. Поздеев O.K. Медицинская микробиология /Под ред. Акад. РАМН В.И. Покровского. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001. - С.267-272.

60. Пономарева JI.B., Крунчак В.Т., Торгованова В.А. и др. Биоремидиация нефтезагрязненной почвы с использованием биопрепарата «Биосэт» и пе-роксида кальция //Биотехнология.- 1998№ 1С. 79-84.

61. Розанова Е.П., Беляев С.С., Иванов М.В. и др. Микробиологические методы повышения нефтеотдачи пластов. М.: ВНИИОЭНГ, 1987.- 44 с.

62. Рыбак В.К., Овчарова Е.П., Коваль Э.З. Микрофлора почвы, загрязненной нефтью // Микробиол. журнал, 1984. Т. 46. - №4. - С. 29-32.

63. Самосова С.М., Фильченкова В.И., Усачева Г.М. и др. К вопросу о роли микроорганизмов в разложении нефтяного загрязнения /Мат. Симпозиума «Микроорганизмы, как компонент биогеоценоза» / Под ред. Мишустина Е.Н. Алма-Ата.: Каз. ГУ, 1982. - С. 54-55.

64. Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель патогенных и условно-патогенных грибов /Пер. с англ.- М.: Мир, 2001. 238 с.

65. Седых В.Н., Игнатьев Л.А., Семенюк М.В. Реакция растений на отходы бурения нефтяных скважин. Всхожесть семян и выживание сеянцев. Сообщение 1 //Сибирский экологический журнал. Новосибирск: Изд-во СО РАН- 1998.- Т.5, №1.- С.34-38.

66. Семенов А.Д., Страдомская А.Г., Павленко Д.Ф. ИК- спектрометрические методы определения нефтепродуктов в поверхностных водах. Сб. «Методы определения нефтепродуктов в поверхностных водах», JL, Гидроме-теоиздат, 1976, С. 47-55.

67. Сидоренко О.Д., Павликова Т.А. Деградация нефти ассоциацией углеводородокисляющих микроорганизмов //Доклады ТСХА. Вып. 275. М.: Изд-во МСХА, 2003. С. 265-272.

68. Сидоров Д.Т., Борзенков И.А., Иббатуллин P.P. и др. Полевой эксперимент по очистке почвы от нефтяного загрязнения с использованием углеводородокисляющих микроорганизмов //Прикл. биохимия и микробиология. 1997.- Т. 33, №5.- С. 497-502.

69. Скрябин Г.К., Головлева JI.A. Использование микроорганизмов в органическом синтезе. — М.:Наука, 1976. 235 с.

70. Славина Т.П., Середина В.П. и др. Биологическое состояние почв при загрязнении нефтью// Проблема экологии Томской обл. — Томск, 1992. — Т.2. -С. 66-67.

71. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas Киев: Нау-кова думка, 1990. - 246 с.

72. Солнцева Н.П., Пиковский Ю.И., Никифорова Е.М., и др. Проблемы загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами: геохимия, экология, рекультивация //Докл. симпоз. VII делегатск. съезда Всес. общества почвоведов. Ташкент. 1985. - 4.6. - С. 246-254.

73. Спицина Д.Н. Сравнительное изучение физиологических особенностей активных штаммов углеводородокисляющих бактерий /Автореф. дис. канд. биол. наук.- Москва, 1982.

74. Станкевич Д.С. Использование углеводородокисляющей бактерии Pseudomonas для биоремидиации нефтезагрязненных почв /Автореф. дис. канд. биол. наук. -Москва, 2002.

75. Суржко Л.Ф., Финкелыитейн З.И., Баскунов В.П. и др. Утилизация нефти в почве и воде микробными клетками //Микробиология — 1995, Т. 64. -№3.-С. 393-398.

76. Суровцева Э.Т., Ивойлов B.C., Беляев С.С. Разрушение ароматической фракции нефти ассоциацией грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов //Микробиология., 1997ю Т. 66, №1. - С. 78-83.

77. Таранова Л.А., Грачевский В.В., Делеменчук Н.В. и др. Бактериальная деструкция катионных поверхностно активных веществ //Биотехнология. -1996.-№9.-С. 32-37.

78. Таранова Л.А., Жданова Е.Б. Влияние бактерий и дрожжей на биохимическое окисление нефти //Нефть и газ Зап. Сибири. Тез. докл. Междунар. аучно-техн. конф. 21-23 мая, Тюмень. 1996. - с.

79. Теппер Е.З. и др. Практикум по микробиологии. М.: Колос, 1979.- С. 164-165.

80. Факторы и механизмы регуляции развития бактериальных популяций. Сб. научн. тр., Свердловск, УрО АН СССР., 1990.- С. 74-100.

81. Финкельштейн З.И., Баскунов Б.П., Головлева Е.А. и др. Превращение флуорена бактериями рода Rhodococcus //Микробиология. -2003.- Т.72, №6.- С. 746-752.

82. Хазиев Ф.Х., Фатхиев Ф.Ф. Изменение биохимических процессов в почвах при нефтяном загрязнении; и активация разложения нефти //Агрохимия, 1981. —Т. 1. -№10.— С. 102-111.

83. Халимов Э.М., Левин С.В., Гузев B.C. Экологические и микробиологические аспекты повреждающего действия нефти на свойства почвы // Вестник Московского Университета, серия 17 «Почвоведение», 1996. — №2. — С. 59-64.

84. Хомякова Д.В. Состав углеводородокисляющих микроорганизмов нефтезагрязненных почв Усинского района Республики Коми / Автореф. дис. канд. биол. наук. — Москва, 2003.

85. Чугунов В.А., Ермоленко З.М., Жиглецова С.Н. и др. Создание и применение жидкого биопрепарата на основе ассоциации нефтеокисляющих бактерий //Прикладная биохимия и микробиология. 2000.- Т. 36.- №6.- С. 666-671.

86. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Наука, 1988. - С. 283-301.

87. Штина Э.А. и др. Особенности почвенной альгофлоры в условиях техногенного загрязнения // Почвоведение, 1985. №10. - С. 97-106.

88. Щеблыкин И.И., Битеева М.Б., Бирюков В.В., Янкевич М.И. Биовосстановление загрязненной нефтью почвы при ликвидации последствий аварии на магистральном нефтепроводе Лисичанск-Тихорецк //Охрана окружающей среды. 1995. - С. 19-28.

89. Эрнестова Л.С. Способ анализа нефтепродуктов в сыпучих материалах. Авт. Свид. №673914 от 25.07.79.,бюл. Изобр. №26.

90. Ягафарова Г.Г., Гамаулина Э.М., Барахнина В.Б., Ягафаров И.Р. и др. Новый нефтеокисляющий микромицет Fusarium spp Л Прикладная биотехнология и микробиология. 2001. - Т. 37. - №1. — С. 77-79.

91. Ягафарова Г.Г., Скворцова Н.Н. Новый нефтеокисляющий штамм бактерий Rhodococcus erytropolis 1339 D //Прикладн. микробиол. и биохимия. 1996, Т. 32. - №2. - С. 224-227.

92. Якушева О.И., Наумова Р.П. Биотехнология очистки сточных вод нефтехимического комплекса //Проблемы био- и медэкологии Респ. Татарстан. Казань: Экоцентр, 1998. Вып. 1., С. 168-188.

93. Якушева О.И., Никонорова В.Н., Кияненко Г.В., и др. Особенности химического состава нефтешлама — отхода нефтехимического производства //Матер. VI междунар. конф. «Нефтехимия —2002». Нижнекамск,- 2002.-С. 271-276.

94. Amadi et al. A., Dickson A. A., Maate G.O. Remediation of oil polluted soils. J. Organic and inorganic nutrient supplements on the performans of Maize // Water, Air and Soil Pollut. 1993. - V.66, №1-2. - P. 59-76.

95. Atlas R.M. Biodegradation of hydrocarbons in the environment //Environmental biotechnology. 1988/ - ed. G.S. Omens Plenum. Press. - №1.- P. 211222.

96. Benka-Coker M.O., Ekundayo J. A. Application of evaluating the ability of microbes isolated from anoil spill to degrade oil // Environ. Monit. And assess -1997.-45.3-Н/259-272.

97. Bertrand J.C., Caumette P., Mille G., Gilewiez M., Denis M. Anaerobic biodegradation of hydrocarbons //Sci. Progr. (cr. Brit) -1989/ V.3., №2. - P. 6067.

98. Bliss P. J., Barnes D. Design basis for carbonaceous oxidation and nitrification in the activated sludge process // Process biochem. 1979. V. 14. - N.12. -P. 22-23.

99. Bossert J., Bartha R. The of petroleum in soil ecosystems / Petroleum Microbiology /et by R. M. Atlas)., -New York: McMillan Co, 1984. P. 434-476.

100. Brown Levis R. Oil - degrading microorganisms // Chem. Eng. Progr. -1987. - 83. -№10. - P. 35-40.

101. Cooneu J.J., Summers R.J. Hydrocarbon usting microorganisms in three fresh water ecosystem // Prog. Thind. Inter. Biodegradation Sump. - Appl. Sci. -London.- 1976.-P. 141-156.

102. Domsch K.H., Grams W., Anderson Т. H. Compendium of Soil Fungi.— London: Academic Press, 1980 890 p.

103. Fuhs G. Разложение углеводородов микроорганизмами // Микробиологический синтез. — 1965. №2. — Р. 110.

104. Gary J. Samuel's, Orlando Petini, Katrin Kuhes u. a. The Hypocrea schweinitzii complex and Trichoderma Sect. Longibrachiatum //Studies in My-colody.-2000, № 41.-P.50-52.

105. Gudin C., Syratt W.//Environ. Pollut.- 1975.- Vol. 8, № 2.-P.107-112.

106. Heimhard H.-J.//Umweltmagazin.- 1987.- Vol. 16, № 3.-P.18-20.

107. Klein J. Mikrobiologiche methoden zur Sanierung mineralolkontaminierten Boden // Mineralol. 1992. - V. 40. - B. 12-15.

108. McGill W.B. Soil restoration following oil spills //J. Canad. Petrol. Tech-nol.- 1977. V.16, #2. -p. 60-67.

109. Mitchell R., Fogel S., Chet H. Bacterial chemoreception: an important ecological phenomenon inhibited by hydrocarbons // Water Res. 1972. Vol. 6. — N.10.-P. 1137-1142.

110. Munoz F.M., Demmler G.J., Trevis W.R., et al. Trichoderma longibrachiatum infection in a pediatric patient with aplastic anemia / J. Clin. Microbiol. -№35.-P. 499-503.

111. Odu C.T.I. Oil degradation and microbiological change in Soils deliberately contaminated with petroleum hydrocarbons //Jnst. Petrol., 1977.- N.5.- P. 1-11.

112. Reymond R. L. // Develop. Industr. Microbiol. 1961. V. 2., P. 23-32

113. Rifai M.A. A revision of the genus Trichoderma /Mycol., Pap. 116. P. 155.

114. Song H.G., Bartha R. Effects of jet fuel spills on the microbial community of soil //Fhhl. Environ. Microbial. 1990. - №5. - P. 649-651.

115. Staff C.P. Mutant bacteria decontaminates spilled crude oil Site // Chem. Process. (USA). 1982. - V. 45, №14. - P. 96.

116. Stetzenbach L.D., Story S.P., Haldeman D.J., et al. . Hydrocarbon degrading bacteria isolated from hydrocarbon contaminated Sites at Johnson Atoll //

117. Abstr. 37 х" Annu. Meet. Ariz. Nev. Acad. Sci., Las Vegas. - 1993. - P. 29.

118. Tullock M. The genus Metarrhizium. /Trans. Br. Mycol., Soc. 66. P. 407411.

119. Walker J.D. // Mar. Technol. Soc. J.- 1985. Vol. 88, № 71 l.-P .134-151.