Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах

Киреева, Наиля Ахняфовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах"

РГ8 ОД - 8 ОПТ 1996

На правах рукописи

КИРЕЕВА Н а и л я Ахняфовна

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВАХ

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 1996 г.

Работа выполнена в Башкирском государственном университете

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Хазиев Фангат Хаматович

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук

Сухаревнч Валентина Ивановна Квитко Константин Васильевич

Архинченко Ирина Александровна

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургский государственный аграрный университет

Защита состоится " " О К- Г и «^4996 года в " 10 " часов в аудитории На заседании диссертационного совета Д 063.25.09 в Санкт-Петербургском государственном технологическом институте (техническом университете).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Замечания и отзывы по данной работе, заверенные печатью, в одном экземпляре просим направлять по адресу: 198013, Санкт-Петербург, Московский пр., д. 26, Технологический институт, Ученый совет.

Автореферат разослан

<< »1

.1996 года

Ученый секретарь диссертационного совета Д 063.25.09

Лисицкая Т. Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Поступление нефти в окружающую среду связано с утечкой ее из поврежденных трубопроводов, фонтанированием из разбуренных и эксплуатационных скважин. Из-за высокой степени загрязнения имеет место отчуждение земельных угодий из сельскохозяйственного оборота, нарушается экологическое состояние природных ландшафтов, компонентов агроэ'косистем.

Значительная роль в освобождении почв от нефтепродуктов принадлежит почвенной микрофлоре. Восстановление плодородия почв после загрязнения их сырой нефтью растягивается на десятки лег. Это связано с тем, что несмотря на способность микроорганизмов разрушать практически любые компоненты нефти различной природы, они могут не иметь соответствующих условий доя их реализации. Поэтому дальнейшее изучение и разработка принципов и методов ускорения биодеградации нефти в почве имеет большой научно-практический интерес. В этой связи представляются наиболее оригинальными результаты опытов по моделированию в полевых и лабораторных условиях определенных экологических ситуаций, характерных для процессов загрязнения среды нефтью. Необходима разработка новых подходов к рекультивации загрязненных почв, основанных на активизации микробоценозов с учетом специфики почвенно-климатических условий.

Диссертация выполнена по плану НИР Башкирского государственного университета (№ темы ГР № 01860093031 87.17.03 шифр 3.22.05620).

Целью настоящих исследований явилось изучение активности микробиологических процессов в загрязненных нефтью и нефтепродуктами и рекультивируемых почвах Уральского региона России, процессов биодеградации нефти и нефтепродуктов в почве и разработка эффективных биотехнологических приемов рекультивации загрязненных почв.

В процессе достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:

- изучение влияния загрязнения нефтью и нефтепродуктами на физиологическое состояние почвенного мнкробоценоза и биологическую активность почв;

- изучение ферментативной активности загрязненной почвы;

- изучение продуктивности сельскохозяйственных культур, как показателя плодородия почв;

- обоснование микробиологических критериев оценки самоочищающей способности загрязненных почв при применении различных способов рекультивации;

- влияние агротехнических приемов рекультивации почв на видовой состав и численность микроорганизмов;

- обоснование рекомендуемых приемов ускорения биодеструкции нефти в почве.

- отбор культур эффективных углеводородокисляющих микроорганизмов.

- разработка математических моделей микробиологических процессов в почве, загрязненной нефтью.

Научная новизна работы. Впервые в регионе Южного Урала проведены многолетние, комплексные исследования по влиянию нефтяных углеводородов на почвенные микроорганизмы и микробиологические процессы с учетом специфики ночвенно-климатических условий. Проведенные исследования позволили экспериментально установить и теоретически обосновать новые научные положения в решении проблемы биотехнологической рекультивации нефтезагрязненных почв.

Показаны изменения в комплексах почвенных микромицетов, акти-номицетов, аэробных спорообразующих бактерий при загрязнении нефтью. Загрязнение почвы нефтяными углеводородами влияет на численность, содержание и распределение почвенных микромицетов, актиномицетов, бацилл. Высокий уровень загрязнения не только обедняет, но и формирует новые нетипичные для данных почв комплексы грибов, бацилл. Установлено ингибирующее действие нефти на активность аспарагиназы, глутамина-зы, амилазы, РНКазы, ДНКазы, АТФазы в почве. Изучена интенсивность деградации целлюлозы в нефтезагрязненной почве методом целлофановых мембран и описана линейная модель ее разрушения, установлено снижение субстрат-индуцированного дыхания почвы и увеличение метаболического коэффициента. Изучено влияние различных нефтяных фракций (легкий газойль коксования, гудрон, экстракт 2 масляной фракции, крекинг-остаток, асфальтит) на комплекс микробиологических показателей. На этой основе разработаны и внедрены методы экспресс-анализа нефтезагрязненных почв.

Впервые установлено, что нефтяное загрязнение снижает содержание белка в зерне, меняется фракционный состав белка в сторону ухудшения качеств. Под действием нефти ингибируегся активность ферментов (каталаза, альдолаза, протеиназа, амилаза) изменяется изоэнзимный спектр амилазы. В связи с этим продуктивность овса и изоферментный спектр амилазы предлагается использовать в качестве одного из критериев для оценки степени влияния нефтяного загрязнения.

Разработаны два биотехнологических подхода стимуляции групп микроорганизмов, участвующих в биодеградации нефти и нефтепродуктов. Первый - заключается в активизации естественной микрофлоры за счет обогащения ее природными органическими соединениями из отходов сельскохозяйственных производств. В частности, выявлено положительное влияние альтернативных источников органического вещества (сточные воды животноводческого комплекса, сидерагы, биогумус) на восстановление биологической активности нефтезагрязненных почв. Рациональное сочетание принципиально различных промышленных отходов позволяет снизить неблагоприятные эффекты от их раздельного поступления в окружающую среду.

Второй биотехнологический подход связан с внесением в загрязненную почву углеводородокисляющих микроорганизмов, адаптированных к нефтяному загрязнению. Показана эффективность использования ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов, состоящей из Arthrobacter sp. и Pseudomonas sp. и биопрепарата на их основе при локальной очистке нефтезагрязненных почв.

Правомерность разработанных биотехнологических подходов подтверждена при использовании комплексной биологической добавки на основе углеводородокисляющих дрожжей (активный ил).

Впервые построены математические модели изменения биологических показателей интенсивности биодеградации нефтяных дериватов в почвенных системах, которые позволяют прогнозировать динамику распада нефтепродуктов и длительность отчуждения почв из сельскохозяйственного оборота.

Практическая значимость работы. Установленные закономерности микробиологических процессов в нефтезагрязненной почве позволяют подобрать оптимальные способы восстановления ее биологической активности почв. С учетом специфических особенностей почв Башкирии разработаны рекомендации по активизации процессов биодеградации нефтяных углеводородов в почвах. Рекомендованные способы рекультивации загрязненной нефтью серой лесной почвы опубликованы в информационном листке ЦНТИ и внедрены на агробиостанции БашГУ (Уфимский район) и в Калтасинском районе Башкирии (колхоз "Рассвет"). Использованием комплексной технологии рекультивирована пашня в колхозе "Рассвег" Калта-синского района Башкортостана, загрязненная разливом нефти в результате прорыва магистрального нефтепровода. Результаты исследований были использованы при проведении микробиологической экспертизы по факту затопления нефтепродуктами лесного массива Салаватского лесничества (Башкирия). Рекомендации по рекультивации нефтезагрязненных почв апробированы в санитарно-защитной зоне предприятий нефтехимического комплекса (Уфа). На основе результатов исследований разработан и рекомендован для внедрения в практику мелиорации почв в качестве активного биодеструктора углеводородов биопрепарат.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были апробированы на Международных конференциях "Жизненные формы и стратегии организмов и их использование для биоиндикации состояния жизненной среды (Чешске-Будеевице, 1989), "Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды" (Томск, 1995), "Экология и охрана окружающей среды" (Пермь, 1995; Владимир, 1996), "Экотехнология-96" (Иркутск, 1996), "Ecmor V" (Leoben, 1996), на съездах Всесоюзного микробиологического общества (Алма-Ата, 1985), Всесоюзного общества почвоведов (Ташкент, 1985; Новосибирск, 1989), общества почвоведов РАН (Санкт-Петербург, 1996), на Всесоюзных и Всероссийских конференциях и симпозиумах "Микроорганизмы кйк компонент биогеоценоза" (Алма-Ата,

1982), "Мониторинг нефти и нефтепродуктов в окружающей среде" (Уфа, 1985), "Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйственных культур" (Вильнюс, 1986), "Микробиологические методы защиты окружающей среды" (Пущино, 1988), "Лгрофитоценозы и экологические пути повышения их стабильности и продуктивности" (Ижевск, 1988), "Ускорение социально-экономического развития Урала" (Свердловск, 1989), "Микробиология в сельском хозяйстве" (Кишинев, 1991), "Биология почв антропогенных ландшафтов" (Днепропетровск, 1991), на региональных конференциях (Казань, 1985, 1991; Свердловск, 1985, 1987,1988, 1990, Екатеринбург, 1992; Тамбов, 1987; Уфа, 1982, 1983, 1984, 1985, 1986, 1987, 1988, 1989, 1990, 1995, 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 86 научных работ, в том числе -1 монография.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов, заключения, списка литературы, приложения. Работа изложена на 322 страниц машинописного текста, в том числе 78 таблиц и 52 рисунка. Список литературы включает 594 наименования.

Автор благодарит проф., д.б.н. Ф.Х.Хазиева за ценные советы и консультации при осуществлении научных исследований и написании рукописи, заведующего кафедрой биохимии и биотехнологии Башкирского госуниверситета проф., д.б.н Ахметова P.P. за постоянную поддержку и внимание, а также коллег по работе, которые принимали участие в проведении экспериментов: к.ф.-м.н., доц. Водопьянова В.В., к.б.н. Е.И.Тишкину (Новоселову), к.б.н., доц. Кузяхметова Г.Г., к.б.н. Галимзянову Н.Ф. и др.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В многолетних полевых, микрополевых стационарных и модельных лабораторных опытах исследовалось влияние загрязнения в различных концентрациях нефтью и нефтепродуктами на микробиологические процессы в серой лесной тяжелосуглинистой, темно-серой тяжелосупшнистой почве, выщелоченном среднесуглинистом черноземе. Условия проведения опытов приведены в диссертации.

Исследования проводились на модельной нефти. В качестве модельной взята тюменская подготовленная (товарная, обессоленная, обезвоженная, рН = 6,7) нефть. Краткая физико-химическая характеристика приведена в диссертации.

Все аналитические определения в годы исследований проводили со свежими образцами. Разрыв со времени отбора и их поступления в лабораторию составлял 2-3 дня. Критериями суждения о биологической активности почвы и ее способности к самоочищению служили следующие параметры: определение биомассы микроорганизмов, количественный учет бактерий, численность некоторых физиологических групп микроорганизмов, со-

стояние комплекса почвенных микромицетов, активность некоторых окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов, интенсивность дыхания почвы, азотфиксирующая активность почвы, целлюлозолитиче-ская активность почвы, содержание остаточной нефти в почве, коэффициент минерализации нефтепродуктов, всхожесть семян, урожайность сельскохозяйственных культур.

В целях получения репрезентативных данных широко использовались методы математической статистики (Чундерова, Зубец, 1971; Дмитриев, 1972; Лакин, 1990). Полученные данные обрабатывались на современной вычислительной технике (программа 8(а1дгарЫс5, версия 3.0, пакет "М;цЬетаПса 2.1"). В таблицах и рисунках приведены усредненные данные.

ВЛИЯНИЕ ЗАГРЯЗНЕНИЯ НЕФТЬЮ И НЕФТЕПРОДУКТАМИ НА БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВ

Комплекс почвенных микроорганизмов Актиномицеты

Данные по влиянию нефтяного загрязнения почвы на численность ак-тиномицетов представлены в таблице 1. В полевых и в лабораторных опытах, как в начале, так и через 1 год, даже низкие концентрации загрязнителя

Таблица 1

Влияние различных доз нефти на численность актиномицетов (тыс.

КОЕ на 1 г абс. сухой почвы) в серой лесной почве

Варианты Годы после Варианты опыта, дозы нефти

опыта загрязнения 0 8 л/м2 16л/м2 25 л/мг

Без внесения 1 406 122 78 52

удобрений 2 435 147 76 50

3 495 136 85 45

4 512 153 82 44

Внесение М'К 1 424 164 82 65

2 531 165 85 58

3 523 157 85 55

4 564 187 89 52

Внесение I 512 186 86 120

перегноя 2 513 171 80 105

3 544 162 89 126

4 598 198 100 112

Внесение 1 622 218 120 78

ОТК+перегной 2 695 201 105 81

3 718 198 126 65

4 701 208 112 67

достоверно снижают численность актиномицегов. С увеличением концентрации ксенобиотика возрастает депрессия этой группы споровых организмов.

В загрязненных почвах доминируют медленнорастущие актиномице-ты. Общее разнообразие видов актиномицегов невелико. Средняя радиальная скорость роста колоний Кгер выше в почвах контрольных вариантов, т.е. наблюдается большее разнообразие видов.

Отдельные углеводороды неоднозначно влияют на численность актиномицегов. Так, через 3 дня и 1 мес. после загрязнения н-парафиновые и циклопарафиновые компоненты увеличивают численность актиномицегов в почве. Аналогичные данные получены и в дальнейшие сроки наблюдения. Ароматические углеводороды во все сроки наблюдения оказывают ингиби-рующее действие.

Таким образом, высокий уровень загрязнения нефтяными углеводородами ингибирует, обедняет комплексы почвенных актиномицегов. Численность актиномицегов в почве в определенной мере является показателем степени ее загрязнения нефтью и может быть использована для биологического мониторинга.

Микромицсты

Грибы оказались самыми устойчивыми микроорганизмами к нефтяному загрязнению в серой лесной почве. Нефть в дозе 8 л/м2 практически не влияет на их численность, при 16 л/м2 загрязнения численность грибов повышается в 1,5 раза, а дальнейшее увеличение концентрации нефти приводит к еще большему возрастанию численности сапрофитных грибов в почве. По-видимому, увеличение количества грибных зачатков связано с усилением споруляции в присутствии высоких концентраций нефти. Процесс спорообразования существенным образом способствует предохранению спорообразующей микрофлоры от негативного влияния ксенобиотиков, благодаря чему микроскопические грибы хорошо развиваются в загрязненной нефтью почве, превосходя по численности контрольный уровень.

Определение длины гиф показало, что наибольшего развития грибной мицелий достигает в почве, загрязненной высокими концентрациями нефти, максимальная активность грибов проявляется на третий и четвертый год после постановки опыта.

Важным последствием антропогенных воздействий является изменение состава сообществ и групп организмов. Изучение видового состава . комплекса микромицетов серой лесной почвы при загрязнении ее нефтью I показывает, что происходит изменения разнообразия комплексов: не толь- ' ко встречаемость и число выделенных видов, но и сам видовой состав грибов в комплексе (табл. 2). Внесение высоких концентраций нефти вызывает как бы "перерождение" типичного комплекса, в результате чего в загрязненных почвах оказываются обильно представленными виды, редко встречающиеся или вовсе не типичные для этой почвы. По нашим данным в за-

грязненной почве доминантами при высоких дозах становятся Aspergillus ustus, Pénicillium tardum, которые не являются характерными для этих почв. Обработка нефтью почвы стимулирует рост Graphium, Paecilomyces, Mortierella и делает типичными частыми Aspergillus flavus, Pénicillium sp., Aspergillus fumigatus и, наоборот, типичными редкими - Trichoderma, Chaetomium sp. Особенно устойчивыми оказались виды, относящиеся к родам Aspergillus, Pénicillium, Fusarium, Rhizopus. При изучении в лабораторных условиях установлено, что углеводороды нефти могут служить источником питания для организмов этих видов.

Таблица 2

Характеристика структуры комплексов микромицетов при загрязнении серой лесной почвы нефтью (частота встречаемости вида, %: 1 - пространственная, 2 - временная)__

Роды и виды Доза нефти, л/и2

0 8 16 25

1 2 1 2 1 2 1 2

Aspergillus niger 36 36 32 36 40 38 48 46

Aspergillus flavus 28 24 45 41 53 50 62 58

Aspergillus fumigatus 30 25 33 33 33 38 46 50

Aspergillus ustus 0,4 0,8 1 3 12 14 70 68

Rhizopus nigricans 35 35 44 46 50 50 51 50

Rhizopus sp 35 30 45 40 50 52 50 56

Fusarium moniliforme 30 30 36 32 48 50 48 50

Pénicillium tardum 0,2 0,1 1 4 18 21 73 70

Pénicillium sp. 32 28 47 42 59 53 58 58

Pénicillium brevicompactum 30 30 15 30 10 30 7 30

Graphium sp 0,2 0,2 22 22 42 42 54 50

Paecilomyces sp 15 15 53 51 51 51 69 62

Mortierella 32 30 38 40 52 50 68 64

Trichoderma 33 32 12 32 5 30 - 16

Chaetomium sp 32 32 2 30 - 15 - 11

Glioeladum sp. 10 12 8 16 8 14 12 11

Acremonium spp Не мдентнфнцированные, часто встречающиеся виды 4 16 8 17 не опред. не опред. 44 6 13 18

10 15 10 18

Проведенный анализ различных аспектов состава и структуры ми-кобиоты почв Башкирии позволяет сделать следующее заключение: загрязнение почв нефтяными углеводородами влияет на численность, содержание и распределение почвенных микромицетов. Высокий уровень загрязнения не только обедняет, но и формирует новые, нетипичные для данных почв комплексы грибов, в которых обычно доминируют виды с фитотоксиче-скими свойствами. Эти, результаты могут быть использованы для диагно-

стихи и прогнозирования микробиологического состояния почвы, подверженной загрязнению нефтяными углеводородами.

Аэробные целлюлозоразрушающне микроорганизмы н интенсивность деградации целлюлозы

Среди наиболее чувствительных к нефтяному загрязнению групп микроорганизмов, по нашим данным (табл. 3) являются аэробные целлюлозоразрушающне микроорганизмы, которые считаются одним из основных индикаторов плодородия почв. Известно, чем интенсивнее идет в почве нитрификация, тем энергичнее в ней размножаются целлюлозные микроорганизмы (Мишустин, 1984). Это подтверждается нашими исследованиями, в которых показана корреляция численности нитрификаторов в загрязненной почве со снижением численности целлюлозоразрушающих микроорганизмов. В нижележащих горизонтах почвы наблюдается сходная картина ингибирующего действия нефти на эту группу микроорганизмов (табл. 4). Цсллюлозолитическая способность почвы - один из показателей общей активности микроорганизмов почвы и плодородия почвы (Имшенецкий, 1953). Как видно из рисунка 1, нефтяное загрязнение инги-бирует процесс разложения льняного полотна, причем интенсивность разложения в почве зависит от дозы нефти. Рассмотрена возможность применения линейной модели для описания динамики разложения полотна в нефтезагрязненной почве (раздел 5 главы 7). Если в контрольном варианте при благоприятных экологических факторах 0° 30°, 60% от ПВ) целлюлозное полотно полностью разрушается через 10 недель (70 суток) после постановки опыта, то при загрязнении почвы нефтью в дозе 25% этот срок удлиняется до 20 месяцев.

Таблица 3

Влияние различных доз нефти на численность целлюлозоразрушающих микроорганизмов(х103 КОЕ/г абс. сухой почвы) в темно-серой лесной почве в зависимости от глубины (1 - 0-20 см; 2 - 20-30 см; 3 - 40-50 см)_

Год взятия Глубина Варианты опыта, дозы нефти в л/м2

проб 0 8 16 25

1981 1 2,8 1,8 1,8 1,0

2 2,3 1,7 1,3 1,0

3 1,6 1,0 1,0 0,5

1982 1 1,3 1,01 0,87 0,74

2 1,4 1,09 0,74 0,75

3 0,2 0,15 0,1 0,08

1983 1 3,2 1,9 1,1 0,5

2 2,5 1,95 0,85 0,3

3 1,8 1,05 0,5 0,05

1984 1 3,4 1,4 0,9 1,0

2 2,2 1,7 0,95 0,5

3 1,3 1,2 0,8 0,01

Время, сутки

: —»—контроль —»—0,5 —а— 3,5 —»<—15 —»—25

Рис. 1. Динамика разложения целлюлозы (льняного полотна) о нефте-загрязненной почве (в %)

Таким образом, целлюлозоразрушающие микроорганизмы, обычно используемые как показатели плодородия почв, чутко реагируют на загрязнение почвы нефтью. При этом численность целлюлозоразрушающих микроорганизмов снижается и не восстанавливается до исходного уровня в течение многих лет после загрязнения почвы нефтью, что естественно сказывается и на плодородии этих почв. Снижается и целлтолозолитическая активность почв, и следовательно, в результате нефтяного загрязнения нарушается одно из звеньев круговорота углерода в природе. На основании полученных данных целлюлозолитическую активность нефтезагрязненной почвы можно использовать как один из показателей для диагностики плодородия.

Микроорганизмы, участвующие в круговороте азота

В почве проходят многосторонние реакции, связанные с превращением азота. Цикл превращений азотсодержащих соединений в почве тесно связан с развитием и биохимической деятельностью аммонифицирующих, нитрифицирующих, денитрифицирующих и азотфиксирующих микроорганизмов. Численность микроорганизмов, использующих органические формы азота (на МПА), первоначально (через 3 дня) ниже, чем в контрольных вариантах почвы. Однако, уже через 1 мес. происходит восстановление численности и через 3 мес. она превышает контрольный уровень. Аналогичная картина наблюдается при изучении влияния нефтяного загрязнения на численность микроорганизмов, использующих минеральные формы азо-

та (на КЛА) (табл. 5) и через 1 год численность этих групп микроорганизмов в загрязненной почве выше, чем в контрольном варианте. Увеличение общей численности гетеротрофных микроорганизмов связано, вероятно, с внесением в почву свежего органического материала.

Коэффициент минерализации и иммобилизации - отношение числа микроорганизмов, выросших на крахмал-аммиачном агаре (КАА) к количеству микроорганизмов, учитываемых на мясо-пептонном агаре (Мишус-тин, 1975). Соотношение численности бактерий на КАА к численности бактерий на МПА, показывающее степень напряженности минерализационных процессов, происходящих в почве, при загрязнении нефтью (табл. 4) возрастает через 1 год после загрязнения в 3-5 раз. И в контрольной и в загрязненной почве эта величина >1, т.е. в микробных ценозах исследуемых почв преобладает эколого-трофическая группа микроорганизмов, потребляющих минеральные формы азота.

Наиболее чувствительны к нефтяному загрязнению нитрифицирующие бактерии, являющиеся агрономически важными группами микроорганизмов. И в лабораторных и полевых условиях их численность падает с увеличением концентрации нефти, не восстанавливается до уровня фонового и через 10 лет после загрязнения.

Нефтяное загрязнение уже на третий день при средних (5%) и высоких дозах (10-20%) снижает нигрификационную активность почвы. В дальнейшем при инкубации нефти с почвой нитрификационная активность резко падает, а затем вообще исчезает. Это коррелирует со снижением численности нитрифицирующих бактерий и с коэффициентом олиготрофности.

Таблица 4

Влияние нефтяного загрязнения на численность микроорганизмов, использующих органические (на МПА) и минеральные формы азота (на КАА) (х103 КОО/1 г абс. сухой почвы) (через 24 часа - 1 и 1 год - 2 после за-

Варианты Глуби- МПА КЛА Соотношение

опыта, дозы на, см КАА/МГ1А

нефти л/м2 1 2 1 2 1 2

0 0-10 748,7 860,8 1217,5 1428,0 1,63 1,66

10-20 637,8 724,5 981,3 1014,8 1,54 1,40

20-30 533,5 622,3 809,7 907,8 1,52 1,46

8 0-Ц) 616,8 1268,2 1001,0 10123,5 1,62 7,98

10-20 537,8 1018,2 814,8 7444,3 1,52 7,3.1

20-30 413,0 639,2 766,5 3518,8 1,85 5,50

16 0-10 504,2 1071,8 905,0 8335,5 1,79 7,77

10-20 401,3 866,0 737,0 5327,3' 1,84 6,15

20-30 306,0 671,5 649,0 3275,5 2,12 4,88

25 0-10 385,5 812,8 788,3 5426,8 2,05 6,'68

10-20 208,8 635,3 596,5 2123,8 2,86 3,34

20-30 142,5 430,0 528,7 1215,7 3,71 2,82

В итоге можно сказать, что многосторонние реакции связанные с превращением азота, энергичнее проходят в незагрязненных почвах. В загрязненных нефтью почвах имеется компенсационный механизм, предотвращающий или снижающий потери азота. Однако напряженность процессов, связанных с азотным обменом, изменена. Самое значительное влияние нефтяное загрязнение оказывает на нитрификационные процессы.

Интенсивность дыхания

Прн выявлении самоочшцающей способности нефтезагрязненных почв необходимо учитывать такой показатель, который в наибольшей мере характеризовал бы минерализационную активность почв. Этим показателем является интенсивность продуцирования СОг почвой, как интегральный показатель активности микробиологических процессов. По литературным данным (Губайдуллина, 1983; Vanloocke et al, 1975; Dibble, Bartha, 1979) в загрязненных нефтью почвах интенсивность дыхания может увеличиваться, что указывает на повышение численности микрофлоры, или же может снижаться, что показывает на интоксикацию почвы. Первоначально низкие дозы нефти усиливают интенсивность дыхания почвы (рис. 2). При средних и высоких дозах (25 л/м2) интенсивность дыхания снижается. Через год эмиссия СО2 в слабозагрязненной почве приближается к контрольному варианту опыта. В средне- и сильнозагрязненных почвах, наоборот, наблюдается повышение интенсивности дыхания. Повышенное продуцирование СОг и корреляция его с общей численностью микроорганизмов (г = 0.79, р > 0,95) свидетельствует о физиологической активности микроорганизмов в загрязненных почвах и характеризует высокую скорость окислительно-восстановительных процессов.

дня мес. мес. мес. мес.

Время взятия образцов для анализов Дозы нефти I-10 I-18 -л-75

Рис. 2. Влияние нефти на интенсивность продуцирования СОг (мг/г почвы) в серой лесной почве (дозы нефти в л/м:)

Таким образом, действуя на физико-химические свойства почв, нефть и нефтяные углеводороды изменяют ее биологические показатели и нарушают почвенный гомеостаз, что ведет к изменению качественных и количественных характеристик микроорганизмов.

Рассмотренные физиологические группы микроорганизмов неодинаково реагируют на воздействие нефти и нефтяных углеводородов. Первичные ответные реакции микроорганизмов почвы изучали на 2-3 сутки после внесения техногенного соединения в почву. Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о возможности использования микробиологических показателей для диагностики нефтяного загрязнения почвы. Численность некоторых физиологических групп микроорганизмов (нитрификаторов, целлюлозоразрушающих аэробов) может служить показателем активности процессов самоочищения почвы от загрязнения нефтяными углеводородами, а изменение численности микроорганизмов и динамика микробиологических процессов - индикатором состояния микробоценоза почвы при ее загрязнении. .

Ферментативная активность почв

Ферментативная активность почв - один из показателей потенциальной биологической активности почв, характеризующий потенциальную способность системы сохранять гомеост аз (Звягинцев, 1987).

В почве накапливается определенный "пул" ферментов, качественный и количественный состав которого характерен для данного типа почв. Представляет интерес изучение динамики отдельных ферментов при воздействии нефти, участие почвенных ферментов в процессах биодеградации и, наконец, выбор индикаторных ферментов с целью диагностики нефте-загрязненных почв.

Окислительно-восстановительные ферменты

Известно (Хазиев, Фатхиев, 1981), что с окислительно-восстановительными процессами, происходящими при участии различных ферментов, связан распад нефтяных уг леводородов в почве. Важнейшими и широко распространенными у почвенных микроорганизмов деструкторами нефти являются ферменты дегидрогеназы и каталазы. Уровень их активности в почве является определенным критерием состояния почвы в отношении самоочищающей способности ее от нефтяных ингредиентов: дегидрогеназа принимает непосредственное участие в разложении углеводородов (Розанова, 1967; Пиковский, 1988), а высокоактивный кислород, образующийся при участии каталазы, обеспечивает доступным кислородом микроорганизмы, участвующие в процессах разложения углеводородов.

Через 3 дня в микрополевом опыте после загрязнения всеми испытанными в наших опытах дозами нефти активность окислигельно-восста-.

новительных ферментов в темно-серой лесной почве достоверно снижается по сравнению с контрольной почвой (табл. 5). Эти изменения сохраняются и через год после загрязнения. Тем не менее через год после начала опытов активность окислительно-восстановительных ферментов несколько возрастает, заметно снижаются различия между активностью каталазы и дегидро-геназы почвы контрольного и слабозагрязненного варианта, что свидетельствует о способности почвенной экосистемы восстанавливать биологическую активность до исходного уровня в течение года при слабом загрязнении. Загрязнение нефтью влияет на активность окислительно-восстановительных ферментов по всему профилю почвы (табл. 5). В нижележащих слоях почвы прослеживается такая же тенденция, что и в А„а,.

Статистический анализ связи активности ферментов с численностью микроорганизмов показывает в целом достоверно положительные корреляционные отношения. При загрязнении почвы нефтью между активностью каталазы и общей численностью микроорганизмов коэффициент корреляции при р>0,95 составляет 0,82 - через год после постановки опыта и 0,34 - через три года. Корреляционная зависимость между активностью дегидрогеназы и численностью микроорганизмов обнаруживается лишь через год после загрязнения и составляет г = 0,68.

Таблица 5

Ферментативная активность загрязненной темно-серой лесной сред-несуглннистой почвы ___

Дозы нефти, Глубина Инвертаза, мг Каталаза, мл Дегндрогеназа,

л/м2 взятия глюкозы о2 мг формазана

образца см 1 2 1 2 1 2

Незагрязнен- 0-20 41,6 44,7 7,56 5,45 0,200 0,351

ная почва 20-30 43,4 39,3 1,03 2,93 0,059 0,159

40-50 27,3 24,4 0,65 1,98 0,020 Сл.

8 0-20 43,3 48,4 2,05 5,62 0,107 0,346

20-30 37,7 38,7 1,03 1,47 0,049 0,061

40-50 36,1 17,3 0,91 1,53 0,001 0,00

16 0-20 39,7 48,1 2,59 3,92 0,132 0,251

20-30 39,6 38,5 1,93 1,64 0,066 0,071

40-50 32,3 24,6 0.36 2,22 0,007 Сл.

25 0-20 41,3 40,7 3,14 2,22 0,077 0,203

20-30 41,0 42,4 1,32 2,02 0,047 0,049

40-50 29,3 24,8 0,43 2,21 0,004 0,003

Примечание. В графе 1 - через 3 дня после загрязнения, 2 - через 1 год.

Ферменты азотного обмена

В почве обнаруживаются гидролитические и окислительно-восстановительные ферментные системы, осуществляющие последовательное превращение азотсодержащих органических веществ через промежуточные

стадии до минеральной нитратной формы, и наоборот, восстанавливающие нитратный азот до аммиака (Купревич, Щербакова, 1966; Колоскова, Мур-тазина 1978; Хазиев, 1982).

Уреаза - фермент, с действием которого связаны процессы гидролиза и превращения в доступную форму азота мочевины - наиболее изученный фермент (Галстян, 1978; Хабиров, 1993). Согласно шкале Д.Г. Звягинцева (1978) почвы Приуралья по обогащенности уреазой относятся в основном к группе бедных (Хазиев, 1982). В нефтезагрязненных почвах активность уреазы возрастает как в полевых, так и в лабораторных опытах во всех рассматриваемых почвах (табл.6). Изменения активности этого фермента находятся в полном соответствии с ростом численности гетеротрофных микроорганизмов (табл. 4), повышением содержания аммиачных форм азота и общего азота в загрязненной почве. Активность других гидролитических ферментов азотного обмена - протеазы, аспарагиназы, глутаминазы - снижается под воздействием нефтяного загрязнения (табл. 6).

Таблица 6

Активность гидролаз азотного обмена в нефтезагрязненной серой лесной почве в слое Ana» (1 - через 1 мес., 2 - через 6 мес., 3 - через 12 мес.)

Дозы Протеаза, мг Уреаза, иг NH3 Аспарагиназа, мг Глутаминаза,

нефти, тирозина NHj мг NH3

л/м2 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

0 0,33 0,32 0,33 0,39 0,36 0,37 0,051 0,049 0,048 0,58 0,62 0,60

8 0,24 0,20 0,16 0,48 0,52 0,53 0,044 0,040 0,040 0,41 0,40 0,40

16 0,12 0,10 0,08 0,68 0,74 0,76 0,030 0,026 0,026 0,24 0,20 0,18

25 0,05 0,02 0,02 1,24 1,24 1,20 0,018 0,020 0,020 0,10 0,08 0,08

Большая роль в азотном обмене в почве принадлежит окислительно-восстановительным ферментам: нитратредуктазе, нитритредуктазе и гид-роксиламинредуктазе, которые в анаэробных условиях участвуют в процессах восстановления окисленных форм азота до аммиака. Загрязнение почвы нефтью неоднозначно действует на эти ферменты. Активность шггратре-дуктазы и нитритредуктазы снижается, а активность гидроксиламинредук-тазы повышается (данные приведены в диссертации).

Таким образом, нефтяное загрязнение почв неоднозначно влияет на активность ферментов азотного обмена. При этом наблюдается активизирующее действие нефти на уреазу и гидроксиламинредуктазу, ннгибирую-щее действие - на протеазу, аспарагиназу, глутаминазу, нитрат- и нитрит-редуктазу. Снижение активности ряда ферментов сопровождается появлением, по выражению Н.М.Исмаилова (1983), "компенсационных механизмов", стремящихся к сохранению в норме динамики азота в почве. Активность уреазы, нитрит- и нитратредуктазы можно использовать в качесгве одного из диагностических показателей загрязнения почв нефтью, так как, во-первых, эти ферменты меньше подвержены действию экологических факторов и, во-вторых, прослеживается четкая зависимость активности их от степени загрязнения почв.

Активность гидролитических ферментов, участвующих в круговороте углерода

Основная роль в круговороте углерода в почвах принадлежит карбо-гидразам, расщепляющим углеводы различной природы и происхождения.

Сразу после загрязнения темно-серой лесной почвы не обнаружено достоверных различий между активностью инвертазы почз загрязненных и незагрязненных вариантов (табл. 5). Повышение активности через год в образцах со слабой и средней дозами загрязнения, вероятно, связано с интенсивным разложением отмерших растительных остатков. Высокая концентрация нефти, ведущая к созданию анаэробиозиса в большей степени, чем слабая и средняя, создает лимитирующие условия для развития аэробных целлюлозоразрушающих микроорганизмов при обилии субстрата. Этим можно объяснить наблюдаемое снижение активности инвертазы в данном варианте. При определении ферментативной активности в нижележащих почвенных горизонтах (20-30 см, 40-50 см) получены аналогичные результаты (табл. 5).

Активность целлюлазы и амилазы снижается при воздействии нефти (данные приведены в диссертации).

Таким образом, рассмотрение функционирования только трех основных ферментов углеводного обмена при попадании нефтяных углеводородов в почву свидетельствует о глубоких изменениях происходящих в почве. Замедляются процессы распада растительных остатков, следствием чего является изменение трансформации органических соединений в сторону ухудшения. Прослеживается четкая зависимость активности карбогидраз от степени загрязнения почвы нефтью.

Фосфопщролазы

В почве фосфор представлен в виде неорганических и органических соединений. Недоступные формы фосфора усваиваются растениями благодаря деятельности фосфогидролаз, отщепляющих фосфор от органических соединений. Загрязнение серой лесной почвы снижает активность фосфата-зы. Причиной такого снижения активности фосфатазы может быть как обволакивание почвенных частиц нефтью, препятствующее поступлению субстрата, так и ингибирующее действие тяжелых металлов (Григорян, 1982), концентрация которых в нефтезагрязненных почвах увеличивается. Наблюдаемое нами снижение активности фосфатаз является одной из причин уменьшения содержания подвижного фосфора нефтезагрязненной почвы. Через год после загрязнения активность фосфатазы сохраняется на низком уровне, содержание подвижного фосфора с ростом дозы нефти уменьшается.

Нефтяные углеводороды ингибируют активность ДНКазы, РНКазы,

фитазы, АТФазы (данные приведены в диссертации).

Таким образом, попадание нефти в почву приводит к нарушению фосфорного режима почвы, уменьшению содержания подвижных фосфатов, к инактивации фосфогидролаз. В результате ухудшается фосфорное питание растений, обеспеченность их доступными формами фосфора.

Характер воздействия нефтяных углеводородов па почвенные ферменты обусловлен прежде всего химической структурой углеводородов. Наиболее сильными ингибиторами являются ароматические соединения, о грицательное влияние которых проявляется ко всем рассмотренным окислительно-восстановительным и гидролитическим ферментам. н-Парафино-вые и циклопарафиновые фракции, наоборот, оказывают в основном активирующее действие, особенно в низких концентрациях. Другой фактор, определяющий характер влияния нефтяного загрязнения, свойства самой почвы и, прежде всего, ее естественная буферность. Почвы с высокой буферной емкостью менее резко реагируют на загрязнение.

Загрязнение нефтью влияет на ферментативную активность по всему профилю почвы. При загрязнении почв нефтью нарушается обмен основных органогенных элементов в почве: углерода, азота, фосфора. Об этом прежде всего свидетельствуют изменения активности ферментных комплексов, участвующих в их круговороте.

Активность некоторьгх ферментов: каталазы, уреазы, нитрит- и нит-ратредуктазы, амилазы можно использовать в качестве индикаторных показателей загрязненности почв нефтью, так как степень изменения активности этих ферментов прямо пропорционально зависит от дозы загрязнителя и от времени пребывания его в почве. Кроме того, определение активности исследованных ферментов не представляет методических трудностей и может быть широко использовано для характеристики почв, загрязненных нефтяными углеводородами.

ПРОДУКТИВНОСТЬ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ НА НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВАХ

При рекультивации нефтезагрязненных земель большое значение имеет подбор видов растений, способных произрастать на таких землях. Механизм отрицательног о действия на биохимические процессы в растительных организмах слабо изучен.

Продуктивность овса

В полевых условиях на второй год после загрязнения наблюдается вьгеокая токсичность исследуемых доз нефти. Токсическое действие нефти проявляется в ингибировании развития вегетативных органов, в уменьшении ассимиляционной поверхности листьев (почти в 2 раза). Ингибнрова-

. ние синтеза органических веществ на фоне слабо развитой листовой поверхности является причиной низкой продуктивности растений. Максимальная доза нефти (25 л/м2) сильно ингибирует формирование репродуктивных органов, у большинства побегов колоски не образуются или их число не превышает 1-2. Нефтяное загрязнение отражается и на структуре урожая. Например, при сравнении с контролем доза нефти в 8 л/м2 снижает урожай зерна в 7 раз, соломы - 4 раза. Урожай соломы и всей надземной массы снижается в 9-10 раз. Масса тысячи зерен у растений, выросших в загрязненной почве уменьшается в 1,8 раз, а содержание общего азота - в 1,5 раза. Нефтяное загрязнение снижает общее содержание белка в зерне пропорционально концентрации ксенобиотика. Под влиянием нефтяного загрязнения изменяется и фракционный состав белков зерна. С повышением дозы нефти снижается содержание белков водосолерастворимой и кислото-растворимой фракции зерна. При этом, содержание щелочерастворимых -глютенинов и остаточных белков - повышается. Содержание белков спир-торастворимой фракции (авенинов) существенно не изменяется.

Электрофорез в ПАГе амилолитических ферментов эндосперма 4-х дневных проростков овса показал, что изоферментный состав почти идентичен для растений, выращенных как в загрязненной почве, так и в контрольной (рис. 3). Компоненты со средней электрофоретической подвижностью с выявляются только у растений, выращенных в почве без ксенобиотика. При загрязнении почвы.нефтью этот компонент практически исчезает. Кроме того, снижение амилолитической активности при увеличении дозы нефти проявляется в ослаблении интенсивности окраски компонента а при дозе 16 л/м2 и ослаблении компонента Ь при дозе 25 л/м2. Оба компонента находятся в зоне медленной подвижности. Белковые компоненты, находящиеся в зоне быстрой подвижности - (1, е, ^ сохраняются. "" Проведенные нами исследования показывают, что нефтяное загрязнение подавляет рост и развитие растений, значительно снижает общую продуктивность овса. Вероятно, углеводороды по мере накопления их на молекуле белка-фермента способствуют изменению структуры фермента с последующей его инактивацией. В связи с этим продуктивность овса и изоферментный спектр амилазы могут быть использованы в качестве одного из критериев для оценки степени влияния нефтяного загрязнения на эту культуру.

Таким образом, в модельных лабораторных и полевых условиях по: казано, что изменение биологической активности почв при воздействии на ; них нефти в первую очередь отражается на росте, развитии и в конечном ' счете продуктивности сельскохозяйственных культур. Обнаруживается прямая зависимость между дозой загрязнителя и степенью ингибирующего действия на развитие растений. Даже низкие дозы нефти снижают урожай овса посевного в несколько раз, при этом значительно ухудшается качество зерна. Аналогичная тенденция прослеживается при выращивании на нефте-загрязненных почвах ячменя двурядного (данные приведены в диссерта-

ции). При посеве бобовых растений (донник желтый, вика посевная в составе вико-ячменной смеси) выявлена меньшая устойчивость их по сравнению с овсом и ячменем к нефтяному загрязнению. Однако, нефтяное загрязнение стимулирует образование корней у донника, в связи с чем можно рекомендовать его для залужения этих почв в последующие годы. Овес и ячмень, выращенные на нефтезагрязненных почвах в связи с их устойчивостью, очевидно, необходимо выращивать только для последующей сидерации. При этом можно считать возможным использование продуктивности овса и ячменя при рекультивации нефтезагрязненных почв в качестве одного из критериев плодородия почв.

Степень загрязнения

О л/м

лшш

8 л/м

16 л/м1

швш

1Ш№

1Н1Н<

25 л/м

чини 1111111

Плотность окраски

сильная

слабая

средняя

шшшш

очень слабая

Рис. 3. Электрофореграммы в ПАГе изоэнзимных компонентов амилазы эндосперма 4-х дневных проростков

БИОДЕСТРУКЦИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ ПРИ РЕКУЛЬТИВАЦИИ

ПОЧВ

Приведенный в диссертации в главе 1 обзор литературы указывает на принципиальную возможность восстановления биологической активности нефтезагрязненных почв и нарушенного плодородия. Однако следует отметить, что искусственное перенесение данных, полученных в разных климатических зонах, на разные почвы на другие регионы неправомерно. Необходимы региональные многолетние комплексные лабораторные и полевые исследования.

Применение минеральных, органических и комбинированных

удобрений

Эффективность применения удобрений проверялась нами как лабораторными, так и полевыми опытами. Внесение минеральных удобрений, органических удобрений и их сочетания - традиционных мелиорантов, через год после загрязнения не восстанавливает численности актнномицетов до исходного, контрольного уровня (табл. 1). Внесение минерального и органического удобрений в первый год увеличивает численность грибных зародышей в почве, загрязненной нефтью в 2 раза, увеличивает - длину и биомассу мицелия, однако не снимает токсичности нефти для целлюлозораз-рушающих микроорганизмов. Внесение удобрений, особенно перегноя вместе с минеральными, способствует повышению численности микроорганизмов, утилизирующих различные формы азота. Положительный эффект применения органо-минеральных удобрений обусловлен оптимизацией соотношения питательных элементов в почвенном растворе и созданием определенной буферной емкости среды, что является чрезвычайно важным фактором для обменных процессов микроорганизмов.

Внесение удобрений в загрязненную нефтью серую лесную почву через год после постановки опыта не оказывает однозначного действия на активность ферментов. При внесении удобрений достоверно повышается активность каталазы, уреазы (кроме варианта с дозой нефти 8 л/м2), причем наибольший эффект наблюдаегся при совместном внесении КРК и перегноя. Удобрения не оказывают достоверного стимулирующего действия на процессы дегидрирования. Интенсивность же процессов углеводного обмена повышается на фоне ЫРК только при загрязнении слабой и средней дозами нефти и на фоне перегноя - при высокой дозе.

Внесение удобрений в почву интенсифицирует процессы минерализации нефти, особенно при использовании перегноя и комплекса МРК+ перегной. В этих вариантах разлагается за год 42,2- 48,3% нефти. С течением времени процесс разложения нефти в почве замедляется. В полевых условиях за год разлагаются 58,3% нефти, а при внесении удобрений - на 13,817,2% больше.

Интегрирующим показателем процессов самоочищения пахотных почв от нефтяного загрязнения является повышение продуктивности сельскохозяйственных культур. Внесение удобрений не приводит к полной нейтрализации отрицательного влияния нефти на рост и развитие растений. Урожайность овса в вариантах с удобрением повышается, но не достигает значения контрольного незагрязненного варианта. При высоких дозах загрязнения почвы нефтью внесение удобрений оказывает незначительный эффект. В структуре урожая преобладают доля соломы и мякины, а выход зерна снижается до 30%. и в качественном отношении урожай зерна практического значения не имеет. Однако, при всех дозах загрязнения внесение удобрений и, особенно, органо-минерального комплекса повышает содержание общего белка в зерне. Применение удобрений не изменяет изоэнзим-ный спектр амилаз эндосперма 4-х дневных проростков. Компоненты со средней электрофоретнческой подвижностью с по-прежнему не выявляются у растений, выращенных на загрязненных почвах даже на фоне различных видов удобрений.

Таким образом, применение минеральных, органических удобрений И их сочетания оказывает стимулирующее действие на процессы биодеградации нефтяных углеводородов в почве, но восстановления биологической активности загрязненной почвы до исходного уровня не происходит, что сказывается на продуктивности сельскохозяйственных культур.

Интенсификация биодеструкции нефтяных углеводородов сндератами

В лабораторных и микрополевых опытах нами изучалась возможность использования зеленой массы различных видов растений для биодеструкции нефтяных углеводородов в почве. В качестве сидерата для внесения в нефтезагрязненную почву использовалась зеленая масса донника, ви-ко-ячменной смеси и овса посевного.

В первый год наибольший эффект наблюдается при использовании зеленой массы донника. В последующие годы и другие сидераты (вико-ячменная смесь и овес) способствуют активизации окислительно-восстановительных и гидролитических процессов в почве. Численность основных физиологических групп микроорганизмов в последующие годы во всех вариантах опыта восстанавливается до исходного контрольного уровня. На втором году опытов вико-ячменный и овсяной сидераты по своей эффективности не уступают варианту с внесением донника. Такой эффект от применения сидеральных культур сохраняется в последующие годы. Внесение в загрязненную почву сидератов уже через 3 месяца повышает интенсивность дыхания почвы. Применение сидеральных культур значительно быстрее уменьшает содержание остаточной нефти в почве. Различия в составе применяемых сидератов влияют на скорость разложения нефти в первый период. Так при использовании донника процесс биодеградации происходит быстрее. В последующем интенсивность деструкции выравнивается

с другими вариантами. Использование сидератов уже на второй год рекультивации способствуют восстановлению продуктивности ячменя. Следует отметить, что через 3 года продуктивность ячменя при 1, 2, 5 и 10%-ных уровнях загрязнения выше на рекультивируемой почве с использованием сидератов, что свидетельствует о восстановлении биологической активности этих почв.

Использование отходов сельскохозяйственного производства

Использование сточных вод ЖВК для ускорения биодеструкции нефти в почве показывает, что, в основном, для всех рассмотренных физиологических групп микроорганизмов компоненты С В ЖВК оказывают положительное влияние: происходит снижение первоначального токсического действия нефти на гетеротрофы, микромицеты, целлюлозоразрушающие микроорганизмы. Вероятно, сточные воды ЖВК являются не только субстратом для микроорганизмов, но и источником разнородной в функциональном отношении микрофлоры. Орошение СВ ЖВК нефтезагрязненных почв ускоряет процесс разрушения льняного полотна.

Сточные воды ЖВК способствуют восстановлению дегидрогеназной активности. Активность других окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов (каталазы, полифенолоксидазы, уреазы, инвертазы, фосфатазы) также достигает уровня контрольного варианта.

Внесение СВ ЖВК сужает соотношение C:N в загрязненной почве и увеличивает содержание фосфора и обменного калия.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что сточные воды ЖВК оказывают благоприятное влияние на восстановление биологической активности нефтезагрязненных почв. Однако, для того, чтобы рекомендовать их для ускорения биодеструкции нефти в почве необходимы дальнейшие исследования и тщательное экологическое обоснование.

Применение биогумуса

В лабораторных и полевых опытах биогумус через 3 дня после за- ' грязнения несколько снижает токсичность нефти в отношении многих физиологических групп микроорганизмов. Внесение его повышает-активность биологических процессов в почве и увеличивает интенсивность ее дыхания. Применение биогумуса благоприятно сказывается и на биохимических параметрах почвы. До исходного уровня восстанавливается активность окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов. При этом следует отметить, что под влиянием биогумуса происходит повышение всхожести семян и значительно быстрее снижается содержание остаточной нефти (рис. 4).

Содержание нефти,

С одержа- 6

ние нефти, 4

% 2

м е с я ц

1 год

Содержание ^ нефти, %

^г^пт

1 месяц

год

□ без удобрения Шс использованием биогумуса

Рис. 4. Влияние биогумуса на содержание остаточной нефти при различном первоначальном загрязнении: А - 8 л/м2, Б -16 л/м:, В - 25 л/м2

Применение биогумуса позволяет поднять урожай ячменя и овса на нефтезагрязненной почве даже в первый год. В последующие годы урожай этих культур оказывается также несколько выше на рекультивируемой почве. Результаты лабораторных и микрополевых опытов свидетельствуют о том, что внесение биогумуса может быть рекомендовано как один из эффективных приемов ускорения деструкции нефти в почве и восстановления ее биологической активности. Однако необходимо практиковать неоднократное внесение биогумуса. Внесение биогумуса улучшает физико-

химические свойства нефтезагрязненной почвы, повышает деструктивную активность почвенных микроорганизмов.

Таким образом, нами использованы различные рекультивационные мероприятия на нефтезагрязненных почвах. Это - частое рыхление нефте-загрязненных почв, применение различных доз минеральных удобрений, перегноя и их комплекса, внесение различных сидератов, сточных вод животноводческого комплекса, биогумуса, использование поверхностно-активных веществ. Все эти мероприятия, очевидно, изменяют физико-химические условия в нефтезагрязненной почве. Они направлены в первую очередь на создание оптимальных условий жизнедеятельности почвенных микроорганизмов, на стимуляцию их деятельности и повышение метаболической деструктивной активности. Как показали результаты исследований, использование этих методов в той или иной степени способствует восстановлению биологической активности нефтезагрязненных почв, оптимизации микробиологических процессов в ней, усилению дегидрогеназной активности естественной микрофлоры почвы.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ В РЕКУЛЬТИВАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ

ПОЧВ

В настоящее время интенсивно разрабатываются методы рекультивации загрязненных нефтью почв, основанные на использовании чистых культур углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ), их ассоциаций или смешанных культур УОМ в сочетании с разными веществами, стимулирующими их активность.

Выделение углеводородокисляющих микроорганизмов, изучение условий их использования для деструкции нефти в почве

На начальном этапе методом накопительных культур на агаризован-ной среде 'Гаусона выделены УОМ из нефтезагрязненных почв и нефтепромысловых сточных вод. Всего было выделено 67 штаммов микроорганизмов. При первичном скрининге из указанного количества культур отобраны 17, которые проявляли нефтеокисляющую активность в значительной степени. Отбор проводился так же и среди коллекционных культур микроорганизмов.

Для определения условий максимальной утилизации нефти изучалась степень ее разложения под действием чистых культур микроорганизмов и их ассоциаций в жидкой среде Таусона с нефгыо. Разложение нефти при культивировании при температуре 22-24° происходит достаточно интенсивно. Максимальную биомассу культуры накапливают на 8-15 сутки. В течение этого времени разлагается до 45-60% нефти по сравнению с контрольным вариантом. Полное разложение нефти при поверхностном методе

культивирования и при данной температуре происходит в течение 80-90 суток. Причем визуально заметной деструкция нефти УОМ становится на 6-8 сутки, когда пленка нефти на поверхности среды разрушается и превращается во взвесь мельчайших капелек. Родовую и видовую идентификацию бактерий проводили на основании изучения морфологических, культураль-ных и физиолого-биохимических признаков в соответствии с общепринятыми методами по определителям Берги (Краткий определитель..., 1980; Berge's manual,..., 1984), руководству "Прокариоты" (The Prokariotes, 1981). В результате скрининга отобраны следующие культуры микроорганизмов, проявившие наибольшую способность утилизировать нефть: Candida maltosa ВКМУ-1506, полученная из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН; бактериальная культура Pseudomonas sp. № 6, выделенная из нефтезагрязненной почвы; природная ассоциация кулыур, состоящая из Pseudomonas sp. № 22, Arthrobacter sp. № 17, выделенная из нефтепромысловых сточных вод. Учитывая, что нефть является многокомпонентной смесью нами была проверена способность микроорганизмов окислять различные углеводороды по методу, предложенному Н.М.Исмаиловым (Исмаилов, Абдуллаева, 1983; Исмаилов, 1986).

В таблице 7 приведены результаты, полученные при изучении образования СОг покоящимися клетками выделенных культур УОМ при окислении ими нефти, нефтепродуктов и различных углеводородов (в виде реактивов), характеризующихся разной химической структурой. Коллекционная культура Candida maltosa утилизирует все составные компоненты нефти в качестве единственного источника углерода. Плохо утилизируется ароматические фракции, полученные при хроматографии нефти на колонке с окисью алюминия. Наибольшая эмиссия СО2 культурой Pseudomonas sp. № 6 наблюдается при инкубации с толуолом, псевдокумолом, нефтью, цик-логексаном; у Pseudomonas sp. № 22 из ассоциации УОМ - при инкубации с этилбензолом, псевдокумолом, мезитиленом; у Arthrobacter sp № 17, входящего в состав ассоциации - при инкубации с этилбензолом; у Pseudomonas sp. № 26 - при инкубации с этилбензолом, нефтью, мезителе-ном. Ассоциация УОМ, выделенная из нефтепромысловых сточных вод в наибольшей степени утилизирует нефть, псевдокумол, гексан, этилбензол. Изучение времени утилизации нефти и ее компонентов культурами микроорганизмов показывает, что наиболее эффективное разложение их идет в течение первых пяти часов. Через 8 часов количество выделенной углекислоты превышает предыдущее в 1,5-2,0 раза. По истечение 24 часов наблюдается полная утилизация отдельных углеводородов нефти. Однако нефть и i нефтепродукты утилизируются через 36 час. Это свидетельствуег о том, что | для утилизации отдельных компонентов многокомпонентного комплекса необходимо более длительное время. Полученные данные по утилизации нефти и нефтепродуктов культурами УОМ и их ассоциаций послужили основанием для изучения возможности применения их для ускорения биодеградации нефти и нефтепродуктов в почве. В лабораторных условиях в се-

рую лесную почву добавляли в различных концентрациях (0,5, 5, 8%) отдельные углеводородные фракции, нефть (0,5-20,0%) и одновременно с этим производили инокуляцию УОМ.

Таблица 7

Интенсивность выделения ССЬ (мкл/мг сухих клеток) культурами

Субстраты Candi- Pseudo- Arthro- Pseudomo- Ассоциа- Биопрепа- Ак-

da monas sp. bacter nas sp. ция УОМ рат на тив-

malt- sp. № 22, 17 основе ас- ный

osa №6 №22 № 17 №26 социации ил

Эндогенное (без 8 8 8 8 8 8 8 8

субстрата)

Нефть 34 32 24 18 22 44 40 41

Гексан 20 12 18 16 17 32 24 30

Октан 20 16 8 12 15 20 22 31

Декан - 18 18 14 - 20 30 -

Тетрадекан 16 - - - 12 15 - -

Гексадекаи 17 17 15 17 15 18 18 18

Циклогексан 25 26 - - - 26 26 26

Бензол 21 17 17 21 17 22 20 20

Толуол 17 42 21 - - - 16 -

Пара-ксилол 21 21 17 - - - 20 -

Орто-ксилол 17 17 14 15 17 18 21 21

Мета-ксилол 21 - - - 16 16 - -

1,2,5-трнме1ил- 17 12 - 12 - - - -

бешол

Этил бензол 34 28 25 22 30 26 25 26

Н-гексилбензол 13 16 22 20 20 20 20 20

Парадиэтил бензол 21 16 22 8 17 19 20 18

Нафталин 13 14 18 - - 18 21 -

2,6-метилнафталнн 13 13 12 12 16 15 14 13

2-метилнафталим 17 15 16 15 12 12 12 8

Псевдокумол 17 46 24 - - 38 34- -

Мезитилен 13 42 26 - 40 12 13 16

ПЛУ 10 8 7 2 2 10 10 10

Ароматические 1 4 5 6 7 6 6 7

фракции

Бензин 12 II 10 £5 12 14 17 20

Асфальтн г 10 8 12 15 16 14 9 12

Гудрон 12 11 - - 10 10 10 10

Крекинг остаток 14 8 - - 12 - 9 -

Дистиллят коксо- 8 9 7 11 - 10 9 8

вания

Экстракт 2 масля- 16 10 12 12 14 16 17 18

ной фракции

Легкий газойль 2 6 5 6 8 2 5 4

коксования

Внесение культур Candida maltosa, Pseudomonas sp. в нефтезагрязнен-ную почву в количестве 10ч кл/г почвы увеличивает интенсивность дыха-

ния. Инокуляция природной ассоциации УОМ в загрязненную почву сопровождается повышением интенсивности дыхания в 10-15 раз (табл. 8).

При внесении природной ассоциации УОМ содержание остаточной нефти в ночвс оказывается значительно меньше, чем за тот же срок при добавлении лишь одной из исследованных культур (табл. 8).

Таблица 8

Влияние комплекса УОМ и биопрепарата на интенсивность дыхания почвы (мг СОг/на 100 г почвы) и содержание остаточной нефти ( % к массе почвы)____

Варианты опытов Интенсивность дыхания Остаточная нефть

1 2 1 2

Контроль 2,4 2,6 - -

5% нефть 2,8 2,9 3,57 3,11

10% нефть 2,8 2,7 7,58 7,00

5% нсфть+УОМ 32,0 36,0 2,02 1,10

10% нефть+УОМ 24,3 35,8 5,12 3,94

5% нефть+биопрспарат 38,2 35,8 1,90 1,02

10% нефть+биопрспарат 42,2 41,4 4,90 3,54

Примечание. В таблицах 8 и 9 цифрами обозначены: 1 - через 3 месяца после загрязнения; 2 - через 1 год после загрязнения.

Применение монокультур УОМ и природной ассоциации благоприятно сказывается на биохимических свойствах почвы, восстанавливается до исходного уровня активность гидролитических и окислительно-восстановительных ферментов (табл. 9). При внесении УОМ в нефтезагрязненную почву увеличивается урожайность сельскохозяйственных культур (табл. 10).

Таблица 9

Влияние комплекса УОМ и биопрепарата на его основе на ферментативную активность нефтезагрязненной серой лесной почвы _

Варианты Ферменты

опытов дегидроге- катал аза, мл уреаза, мг инвертаза,

наза,мг о2 N43 мг глюкозы

формазана

1 2 1 2 1 2 1 2

Незагрязненная почва 1,66 1,44 12,39 12,90 0,63 0,60 19,82 19,23

5% нефти 0,92 0,81 7,11 6,53 0,39 0,30 11,69 11,1

10% нефти 0,63 0,34 4,63 3,95 0,20 0,14 9,07 9,20

5% нсфти+УОМ 1,28 1,19 8,68 9,86 0,52 0,50 17,86 18,41

10% нефти+УОМ 1,11 1,05 7,88 7,05 0,42 0,48 15,67 16,39

5% нефти+бнопрепарат 1,46 1,37 10,78 11,05 0,58 0,61 19,48 20,59

10% нефти+бнопрепарат 1,38 1,25 10,06 10,18 0,50 0,49 18,64 18,92

На основании экспериментальных данных представляется перспективным использование ассоциации УОМ для ускорения биодеградации

нефти в загрязненных почвенных экосистемах с целью локальной очистки, особенно в начальный период загрязнения.

Технология получения биопрепарата на основе углеводородокислякмцих микроорганизмов и применение в рекультивации нефтезагрязненных почв

Для усовершенствования биотехнологических методов рекультивации почв на основе природной ассоциации УОМ - наиболее эффективно разлагающей нефть в модельных опытах - был создан биопрепарат. Он представляет собой смесь комплекса углеводородокисляющих микроорганизмов в концентрации Ю9 клеток на 1 г почвы и целлюлозосодержащего субстрата - гречневой мякины, которая используется одновременно и как разрыхлитель, улучшающий аэрацию нефтезагрязненной почвы - в концентрации 2-3% по отношению к весу почвы. Биомассу УОМ выращивали в лабораторном стендовом ферментере типа АК-10 на жидкой среде Таусона с нефтью (или отдельными углеводородами) при 28()С до поздней экспоненциальной фазы развития, отделяли от культуралыюй жидкости, суспендировали в небольшом объеме раствора минеральных удобрений, используемых для активизации естественной микрофлоры и иммобилизовали на гречневой мякине. Биопрепарат обладает значительной окислительной активностью по отношению к различным углеводородам, о чем свидетельствует интенсивное выделение СОц при инкубации его с различными субстратами (табл. 7).

Таблица 10

Влияние комплекса УОМ н биопрепарата на продуктивность ячменя

Варианты опытов Урожайность, ц/га зерна Урожайность соломы, ц/га

Контроль 23,0 35,4

5% нефть 4,8 6,81

10% нефть 2,2 3,22

5% нефть+УОМ 22,1 31,6

10% нефть+УОМ 20,6 25,8

5% нефть+биопрепарат 24,2 36,8

10% нефть+биопрепарат 21,5 28,6

Внесение биопрепарата на основе УОМ, как и внесение ассоциации УОМ, способствует восстановлению численности физиологических групп микроорганизмов до уровня контрольного, что, очевидно, связано со снижением первоначального токсического действия нефти. Особо следует отметить благоприятное влияние биопрепарата на восстановление численности целлюлозоразрушающих аэробов - одной из агрономически ценной группы микроорганизмов. Применение биопрепарата благоприятно сказывается и на биохимических свойствах почв, восстанавливается до исходного уровня активность гидролитических и окислительно-восстановительных ферментов (табл. 9), увеличивается интенсивность продуцирования СО:

почвой (табл. 8), увеличивается урожайность сельскохозяйственных культур (табл. 10).

Через год наиболее интенсивный процесс разложения нефти наблюдается в почве, обработанной биопрепаратом (табл. 8).

Результаты лабораторных и микрополевых опытов свидетельствуют о том, что внесение биопрепарата на основе ассоциации УОМ может быть рекомендовано как один из эффективных приемов рекультивации для ускорения деструкции нефти в почве и восстановления ее биологической активности.

Использование активного ила, содержащего углеводородокисляющис дрожжи

Отличительной особенностью активного ила (АИ) биохимкомбината является присутствие в нем значительного количества углеводородокис-ляющих дрожжей (до 107 КОЕ/г ила), которые являются одним из основных компонентов комплекса активных микроорганизмов ила, используемых в рекультивации нефтезагрязиенных почв.

В лабораторных и в полевых условиях АИ через 3 дня после загрязнения нивелирует токсичность нефти для многих физиологических групп микроорганизмов. А И вызывает в загрязненной почве перестройку микробного ценоза, которая выражается в расширении видового разнообразия бактериальной флоры. Анализ развития отдельных групп показывает (микромицеты, особенно углеводородокисляющие), что АИ стимулирует жизнедеятельность микрофлоры. Органическое вещество ила, попадая в почву, служит энергетическим материалом для почвенной микрофлоры. Благодаря этому в почве усиливается активность микробиологических процессов, под влиянием которых происходит мобилизация питательных веществ. Косвенным доказательством последнего является повышение интенсивности дыхания почвой. Применение АИ благоприятно сказывается и на биохимических параметрах почвы, возвращая к исходному уровню активность окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов. При этом следует отмстить, что при использовании для рекультивации нефтезагрязиенных почв А И происходит повышение всхожести семян и значительно быстрее уменьшается содержание остаточной нефти в почве, возрастает коэффициент минерализации углеводородов (рис. .£5.

Использование АИ в качестве косубстрата способствует интенсификации процессов самоочищения почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Одновременно открывается возможность утилизировать ил, который является отходом предприятий и не находит квалифицированного применения. Однако, при внесении АИ необходимо осуществлять тщательный контроль, чтобы этот ил не содержал вредных токсикантов.

Содержание остаточной нефти в почве (в %)

I I Контроль

Незагрязненная почва (ЗГ1) —3 П + А И + о п и л ки

1 год 2 год

Урожайность ячменя (ц/га)

3 год

ц/га

1 год 2 год

Коэффициент минерализации

3 год

х1 /1 ООО

1 ,5 -г 1

0,5 -0

2 год

3 год

Рис. 5. Влияние внесения активного ила на содержание остаточной нефти в почве (исходная концентрация нефти 9,6%),.урожайность ячменя и коэффициент минерализации углеводородов (хЮ3)

МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ, ПРОИСХОДЯЩИХ В ПОЧВЕ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ НЕФТЬЮ

Как указывает. Н.С.Паников (1988), математическим моделям поведения микроорганизмов в почве не уделялось должного внимания. Рассмотрение моделей динамики разложения ксенобиотика и изменения численности микроорганизмов показывает, что в основном они строятся по схеме обобщения математических моделей кинетики потребления субстрата и роста биомассы,микроорганизмов (Перт, 1978). Анализ этих моделей показывает (Гимельфарб и др., 1974; Перт, 1978; Петросян, Захаров, 1986), что

они слишком упрощены и не могут адекватно описывать процессы, протекающие в нефтезагрязненной почве.

В качестве математической модели динамики изменения численности микроорганизмов в нефтезагрязненной почве, а также разложения нефти, рассматривалась следующая модель:

(¿5 У" сН к + л

ли Ы'-г)"*' т (1)

Л (Л + 5)(1+ ДГ)

где коэффициент у указывает критическое значение плотности нефти в почве; 5 - концентрация нефти, N - количество микроорганизмов. При плотности нефти в почве меньше у происходит увеличение численности изучаемой группы микроорганизмов, при большей, чем у - уменьшение этой численности.

Функция /(7) во втором уравнении модели (1) возникла в связи с необходимостью непосредственного учета времени протекания процесса в начальный период загрязнения:

1 1<0,1

/(О =

(* + 0,7)"

Ь1>ол

Анализ модели (1) и расчеты на ЭВМ показали, что при малых значениях т (порядка 0-1) и больших (/ (больших 1) данная модель плохо согласуется с экспериментальными данными. Причем с ростом т и убыванием д точность теоретически рассчитанных значений возрастает. Расчеты на ЭВМ показали, что в математической модели (1) можно считать <у=0.

Относительная погрешность модели (1) при значениях коэффициентов от экспериментальных данных не превышала 2 %. Интересно отметить, что это первое уравнение системы непосредственно не зависит от биологических факторов. Учитывая, что модель (I) достаточно точно описывает динамику биодеградации нефти в почве возникает вопрос о степени влияния микрофлоры почвы на процесс разложения нефти. Можно выделить на наш взгляд три фактора, влияние которых на процесс разложения нефти необходимо учитывать в первую очередь: 1) физико-химические факторы; 2) микрофлору, находящуюся в почве в момент внесения в нее нефти; 3) микрофлору, сохранившуюся в почве после внесения нефти.

Отсутствие в первом уравнении модели (1) численности микроорганизмов в почве указывает на то, что третий фактор не оказывает в первый год после загрязнения существенного влияния. Влияние этого фактора сказывается более сильно со временем, когда происходит некоторое восста-

иовление численности микроорганизмов и 40-50% нефти уже успевает разложиться.

Таким образом, в первый год загрязнения почвы нефтью необходимо учитывать влияние на процесс разложения двух факторов. Для расчленения этих факторов нами были проведены опыты по изучению динамики разложения нефти в стерилизованной почве. Этим было исключено влияние микрофлоры на процесс деградации почвы. Как отмечает МакГилл (McGill, 1977), путем испарения, разложения в силу действия фотохимических факторов из почвы удаляется от 20 до 40% легких и средних фракций нефти. Следовательно, значительная часть нефти может быть вынесена из • почвы без участия микроорганизмов и других биологических факторов. Однако, как указывает Ю.И.Пиковский (1988) количественно этот процесс не изучался.

В качестве математической модели разложения нефти нами рассмотрена следующая модель:

* „[--(—I)*?""] (2)

ц ц

где s(t) - концентрация нефти в момент времени /. Коэффициенты к и ц подбирались экспериментально. При приближении к коэффициенту k/ß отношения s/s а скорость разложения нефти падает и асимптотически стремится к нулю.

Расчет отношения k/ß подтвердил правильность выбранной модели: при всех степенях загрязнения k/fj. = 0,79+0,1. Таким образом, получено экспериментальное и теоретическое подтверждение предположения Мак-Гилла (McGill, 1977). В опытах разложение нефти за счет испарения и фотохимических эффектов составляет 20-25%, теоретически рассчитанное значение - 20-22%.

Рассмотрим влияние биологических факторов на разложение нефти в нестерильной почве. Для этого представим s(t)- количество оставшейся в почве нефти в момент времени t в виде:

s(t) =s,(t) +s2(t).

гдcs,(t) - составляющая нефти, которая может быть разложена без участия микроорганизмов, s2(t) - составляющая нефти, которая разлагается в ос: новном за счет биологических факторов. В качестве математической моде; ли рассматривалась:

*(0 = *о[— + (!-—) е"1 (3)

М И

Относительная погрешность модели (3) по сравнению с экспериментальными данными не превышает - 0,07%.

Одновременный расчет rio модели (3) коэффициента Л при уменьшенных концентрациях нефти в почве показал обратную зависимость этого коэффициента от концентрации. Это подтверждает важное место микроорганизмов в разложении нефти и необходимость создания в почве, загрязненной нефтью, условий благоприятных для деятельности микроорганизмов.

Таким образом, методом математического моделирования подтверждена концепция этапности деградации нефти в почве (Солнцева и др., 1985).

В целях изучения процесса биодеградации нефти в почве строилась математическая модель разложения нефти в стерильной почве под действием биопрепарата:

,(0 = J „[уч?"А, + 0 -j-Уе'"]- (4)

где s(i) =s,(t) + s2(t) - количество оставшейся в почве нефти в момент времени /, s,(t) - составляющая нефти, которая может быть разложена без участия биопрепарата, s2(l) - составляющая нефти, которая разлагается за счет биопрепарата. При этом степень погрешности построенной математической модели достаточно низкая (относительная погрешность не превышает 2,5%).

Для биодеградации нефти под действием биопрепарата в естественной почве рассматривалась модель:

/Ч г к -Л I к ,, . -Si к . - ¡1 I,

s(t) = ¿»[—re +—(i -r)e + 0--)е I (5)

где s(t) = s,(í) + s2(í) + S}(t) - количество оставшейся в почве нефти в момент времени t,s¡(t) - составляющая нефти, которая может быть разложена без участия биопрепарата и естественной микрофлоры, s2(t) - составляющая нефти, которая разлагается за счет биопрепарата, ss(t) - составляющая нефти, разлагаемая под действием естественной микрофлоры, весовой коэффициент у характеризуют величину нефти, разлагаемую под действием второго или третьего фактора.

Несмотря на то, что для полученных коэффициентов не прослеживается связь с соответствующими коэффициентами в стерильной почве, из полученных значений коэффициентов модели (5) (см. диссертацию) четко просматривается большое влияние биопрепарата (коэффициенты у и X) на динамику разложения нефти в почве.

Таким образом, нами разработаны первичные математические модели процессов разложения нефти в почве, динамики изменения численности микроорганизмов, ферментативной активности и разложения целлюлозы в нефтезагрязненной почве. Разработанные модели достаточно хорошо описывают изучаемые процессы. На основе построенных моделях можно по

новым данным строить более точные математические модели, дифференциально. учитывающие влияние тех или иных факторов. Эти же модели позволяют прогнозировать поведение различных групп микроорганизмов в нефтезагрязненной почве и процесс разложения нефти.

ВЫВОДЫ

1. Впервые изучено самоочищение наиболее типичных почв в регионе Южного Урала при загрязнении нефтью и нефтепродуктами и биотехнологические подходы к восстановлению их плодородия.

2. Нефть и нефтяные углеводороды угнетают биологическую активность почв. Под их влиянием модифицируется почвенная микробиота, изменяются напряженность и направление микробиологических процессов, ферментативная активность почв и снижается продуктивность сельскохозяйственных культур. Выявлено, что наибольшим ингибирующим действием на биологическую активность почв обладают ароматические фракции нефти.

По чувствительности к нефтяному загрязнению микроорганизмы можно разделить на четыре группы. Первая группа - индикаторные микроорганизмы, численность которых снижается при нефтяном загрязнении почв: актиномицеты, нитрификаторы, целлюлозоразрушающие. Вторая группа - микроорганизмы, численность которых несколько возрастает: азотфиксаторы, углеводородокисляющие. Третья группа состоит из микроорганизмов, которые неоднозначно реагируют на разные концентрации загрязнителя: при одних концентрациях их численность увеличивается, при других - уменьшается: аммонификаторы. К четвертой группе относятся микроорганизмы, отдельные виды которых по разному реагируют на нефтяные загрязнения: бациллы, грибы.

3. Численность углеводородокисляющих, нитрифицирующих, аэробных целлюлозоразрушающих микроорганизмов может служить показателем активности процессов самоочищения почвы от нефтяных загрязнений, изменения в соотношении численности микроорганизмов и динамика микробиологических процессов - индикатором состояния микробоценоза почвы. Активность ферментов (уреаза, каталаза, нитрит- и нитратредуктазы) можно использовать в качестве информативного индикаторного показателя степени загрязнения почв нефтью, продуктивность растений и изофер-ментный спектр амилазы эндосперма 4-х дневных проростков - в качестве критериев для оценки степени влияния нефтяного загрязнения на компоненты почвенной экосистемы.

4. При внесении комплекса минеральных и органических удобрений возрастает самоочищающая способность почв от нефтяного загрязнения. Разработанные агротехнологии рекомендованы для использования на се-

рых лесных почвах Башкирии, подвергшихся загрязнению нефтью (Акт внедрения прилагается).

Выявлено положительное влияние сидератов, сточных вод животноводческих комплексов на восстановление биологической активности нефте-загрязненных почв.

Неоднократное внесение биогумуса в загрязненную почву является одним из эффективных приемов ускорения биодеструкции нефти и восстановления ее биологической активности.

5. Из нефтепромысловых сточных вод выделена природная ассоциация углеводородокисляющих микроорганизмов, состоящая из Pseudomonas, Arthrobacter. Инокуляция загрязненной почвы углеводородо-кисляющими микроорганизмами на начальных этапах загрязнения стимулирует микробиологические и биохимические процессы в почве и активизирует процесс биодеградации нефти.

6. Разработана и предложена технология получения биопрепарата, включающего активную природную ассоциацию углеводородокисляющих микроорганизмов Pseudomonas, Arthrobacter и гречневую мякину. Внесение биопрепарата, приготовленного на основе комплекса углеводородокисляющих микроорганизмов, в нефтезагрязненную почву рекомендуется как один из эффективных приемов локальной очистки с целью ускорения деструкции нефти и нефтепродуктов.

7. Разработана и внедрена технология использования активного ила, содержащего углеводородокисляющие дрожжи, для рекультивации нефте-загрязненных почв. Показано, что активный ил обогащает почву ассоциацией активных микроорганизмов и компонентами, оказывающими благоприятное действие на свойства почв.

8. Предложены математические модели деградации нефти в почве. Модели подтверждают важную роль микроорганизмов в деструкции нефти и нефтепродуктов в почве и позволяют прогнозировать динамику их разложения.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Киреева H.A., Хазиев Ф.Х., Кузяхметов Г.Г. Роль микроорганизмов в самоочищении нефтезагрязненных почв// Микроорганизмы как компонент биогеоценоза: Матер. Всес. симп,- Алма-Ата, 1982,- С. 216-217.

2. Киреева H.A., Хазиев Ф.Х., Кузяхметов Г.Г. Влияние нефтяных загрязнений на биологическую активность почв// Научные основы и практические приемы повышения плодородия почв Южного Урала и Поволжья.-Уфа, 1982.-С. 235.

3. Кузяхметов Г.Г., Киреева H.A., Жарова A.M. Состав и численность почвенных микроорганизмов и водорослей в нефтезагрязненных почвах//

Научные основы и практические приемы повышения плодородия почв Южного Урала и Поволжья,- Уфа, 1982,- С. 239.

4. Киреева H.A., Тишкина Е.И. Ускорение деструкции нефти в черноземах микроорганизмами// Роль черноземов в решении Продовольственной программы,- Уфа, 1983,- С. 56-57.

5. Киреева H.A., Шабалина Л.В., Галимзянова Н.Ф. Влияние поверхностно-активных веществ на микроорганизмы: II. Неонол АФ-14 и ризо-сферная микрофлора пшеницы// БашГУ.- Уфа, 1984.- 12 с.- Деп. в ВИНИТИ 24.05.1984, Ы3393-84Деп.

6. Киреева H.A., Дубовик И.Е. Биоиндикация почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами// Мониторинг нефти и нефтепродуктов в окружающей среде: Матер. Всес. совещ.- Уфа, 1985,- С. 82-84.

7. Киреева H.A., Дубовик И.Е., Сайфуллина З.Н. Изучение возможностей ускорения деструкции нефти в почвах// Мониторинг нефти и нефтепродуктов в окружающей среде: Матер. Всес. совещ.- Уфа, 1985,- С. 85-88.

8. Киреева H.A., Тишкина Е.И., Хазиев Ф.Х. Участие микроорганизмов в самоочищении нефтезагрязненных почв// Достижения микробиологии - практике: Тезисы VII съезда ВМО.- Алма-Ата, 1985,- Т. 6,- С. 83.

9. Тишкина Е.И., Киреева H.A. Изменение биохимических и микробиологических параметров нефтезагрязненных почв// Тезисы докл. VII делегатского съезда Всесоюзного общества почвоведов,- Ташкент, 1985,- Кн. 2.-С. 188.

10. Киреева H.A., Кузяхметов Г.Г. Роль грибов и водорослей в загрязненных нефтью почвах// Ботанические исследования на Урале: Информационные материалы /УрО АН СССР .- Свердловск, 1985.- С. 4.

11. Минибаев Р.Г., Кузяхметов Г.Г., Киреева H.A., Сайфуллина З.Н. Анализ действия нефти на фитокомпоненты агроэкосистемы и вопросы рекультивации загрязненных нефтью земель// Синтаксономия и динамика антропогенной растительности: Межвуз. сб. научи. трудов/Башкирский госуниверситет.- 1986,-С. 144-158.

12. Тишкина Е.И., Киреева H.A. Окультуривание нефтезагрязненных серых лесных почв// Повышение плодородия почв в условиях интенсивной системы земледелия: Сб. статей/Башкирский филиал АН СССР.- 1986,- С. 145-151.

13. Тишкина Е.И., Киреева H.A. Микробиологические процессы и урожайность сельскохозяйственных культур в нефтезагрязненных почвах// Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйственных культур: Материалы конф.- Вильнюс, 1986.- С. 360.

14. Кузяхметов Г.Г., Киреева H.A. Ускорение биологического разрушения нефти и нефтепродуктов в почве (внедрение)// Информационный листок Башкирского ЦНТИ, 1987,- N485-87,.

15. Эмих Т.А., Киреева H.A., Касимова Д.И. Действие активного ила на физиологические процессы и ризосферную микрофлору томатов// Вопросы

биохимии и физиологии микроорганизмов. Физиология: Межвуз. научн. сб./Саратовский госуниверситет, 1987.-С. 32-36.

16. Киреева H.A., Сайфуллина З.Н. Некоторые пути ускорения биодеструкции нефти в почве// Микробиологические методы защиты окружающей среды: Тезисы докл. Вссс. конф./НЦБИ АН СССР. - Пущино, 1988.- С. 143.

17. Киреева H.A., Сайфуллина З.Н. Продуктивность агрофитоценозов ячменя в условиях нефтяного загрязнения почвы// Агрофнтоценозы и экологические пути повышения их стабильности и продуктивности: Тезисы докл. Всес. совещ,- Ижевск, 1988,- С. 91.

18. Киреева H.A. Микрофлора почв Башкирии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами// Ботанические исследования на Урале: Информационные материалы/УрО АН СССР,- Свердловск, 1988,- С. 44.

19. Хазиев Ф.Х., Тишкина Е.И., Киреева H.A. Влияние нефтепродуктов i на биологическую активность почв// Биологические науки, 1988,- № 10.- С. ' 93-99.

I 20. Хазиев Ф.Х., Тишкина Е.И., Киреева H.A., Кузяхметов Г.Г. Влияние нефтяного загрязнения на некоторые компоненты агроэкосистемы// Агрохимия, 1988.- № 2,- С. 56-61.

21. Киреева H.A. Почвенные микроорганизмы как индикаторы загрязнения нефтью// Жизненные формы и стратегии организмов и их использование для биоиндикации состояния жизненной среды: Тез. докл. Чехосло-вацко-Советской конференции,- Чешске-Будеевице, 7-11 авг. 1989.- С. 18-19.

22. Тишкина Е.И., Киреева H.A. Влияние различных нефтепродуктов на биологическую активность карбонатного чернозема//Тезисы докл. VIII Всес. съезда почвоведов.- Новосибирск, 1989,- Кн. 2,- С. 337.

23. Киреева H.A. Комплекс почвенных микроорганизмов при воздействии нефти и нефтепродуктов и вопросы рекультивации// Ускорение социально-экономического развития Урала: Матер. Всес. конф.- Свердловск,

1989,-Секция З.-Ч. 1.-С. 45-48.

24. Киреева H.A. Микроскопические грибы - биодеструкторы нефтяных углеводородов в почве// Ботанические исследования на Урале: Информационные материалы/УрО АН СССР,- Свердловск, 1990,- С. 41.

25. Киреева H.A. Микроскопические грибы и актиномицеты в почвах, загрязненных нефтью// Эколого-флористические исследования по споровым растениям Урала: Сб. научн. трудов/УрО АН СССР.- Свердловск,

1990,- С. 51-56.

26. Киреева H.A., Тишкина Е.И. Ускорение биодеструкции нефтяных загрязнений при рекультивации почв// Актуальные вопросы биотехнологии: Межвуз. сб./БашГУ,- Уфа, 1990,- С. 36-44.

27. Киреева H.A. Биологическая активность загрязненного нефтепродуктами чернозема выщелоченного// Почвы Среднего Поволжья и Урала, теория и практика их использования и охраны,- Казань, 1991,- Ч. II.- С. 212-214.

28. Киреева H.А. Восстановление плодородия нефтезагрязненных почв отходами сельскохозяйственного производства// Микробиология в сельском хозяйстве: Тезисы докл.- Кишинев, 1991.- С. 62.

29. Киреева Н.А., Дубовик И.Е., Сайфуллина З.Н. О возможности использования микробиологических показателей для оценки почв, загрязненных углеводородами// Основные направления биотехнологии в решении народнохозяйственных задач: Сб. статей/БНЦ УрО АН СССР.- Уфа, 1991,-С. 26-33.

30. Кузяхметов Г.Г., Киреева Н.А. Последействие нефтяного загрязнения на комплекс почвенных микроорганизмов// Основные направления биотехнологии в решении народнохозяйственных задач: Сб. статей/БНЦ УрО АН СССР,- Уфа:, 1991,- С. 34-38.

31. Киреева Н.А. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах,- Уфа: Изд-во БашГУ, 1994,- 171 с.

32. Киреева Н.А. Генотипическая чувствительность компонентов мик-робоценозов в почвах, загрязненных нефтепродуктами// Генетика, 1994.- Т. 30.- Приложение,- С. 69.

33. Жданова Н.В., Киреева Н.А., Матыцина О.И. Некоторые пути интенсификации биодеструкции нефти в почве// Нефтепромысловое дело, 1994,- № 5,- С. 31-32.

34. Киреева Н.А., Галимзянова Н.Ф. Влияние загрязнения почв нефтью н нефтепродуктами на численность и видовой состав микромицегов// Почвоведение, 1995,- № 2,- С. 211-216.

35. Kireeva N.A. The eiTect of oil contamination on a complex of soil micro-organisms// Fundamental and applied problems of environmental protection. Abstracts of International conférence. Tomsk, September, 12-16, 1995,- V. 2.- P. 195.

36. Киреева Н.А. Микробиологическая оценка почв, загрязненных нефтяными углеводородами// Башкирский химический журнал, 1995,- Т. 2,- № 3-4,- С. 65-68.

37. Киреева Н.А. Об устойчивости комплекса почвенных микроорганизмов при загрязнении нефтяными углеводородами// Экология и охрана окружающей среды: Тезисы докл. 2-ой Междун. Конф. 12-15 сентября 1995.-Пермь, 1995,-Ч. 2,-С. 63-64.

38. Киреева Н.А. Консортивные связи микроорганизмов и высших растений в нефтезагрязненной почве// Экология и охрана окружающей среды. Тезисы докл. 2-ой Междун. Конф. 12-15 сентября 1995,- Пермь, 1995.- Ч. 3,-С. 16-17.

39. Киреева Н.А. Интенсификация биодеструкции нефтяных углеводородов в почве сидератами// Вопросы биотехнологии: Межвуз. научн. сб./ БашГУ .-Уфа:, 1995,- С. 22-27.

40. Киреева Н.А. Использование отходов сельскохозяйственного производства в рекультивации нефтезагрязненных почв// Вопросы биотехнологии: Межвуз. научн. сб./БашГУ,-Уфа, 1995.-С. 15-21.

41. Кабиров P.P., Киреева H.A., Хазипова Р.Х. Влияние поверхностно-активных веществ на некоторые компоненты агроэкосистемы// Вопросы биотехнологии: Межвуз. научн. сб./БашГУ,- Уфа, 1995.- С. 139-145.

42. Киреева H.A. Использование биогумуса для ускорения деструкции нефти в почве// Биотехнология, 1995,- № 5-6,- С. 32-35.

43. Киреева H.A. Почвенные микроорганизмы как индикаторы загрязнения углеводородами// Реакция организмов на антропогенное воздействие: Межвуз. сб. научн. тр.- Уфа, 1995,- С. 17-29.

44. Киреева H.A. Биодеструкция нефти в почве культурами углеводоро-докисляющих микроорганизмов// Биотехнология, 1996.-№ 1.-С. 51-54.

45. Киреева H.A. Состояние комплекса актиномицетов нефтезагрязнен-ных почв// Вестник Башкирского университета, 1996,- № I,- С. 42-46.

46. Kireyeva N.A., Galimzyanova N.F. Influence of soil pollution by oil and petroleum products on the population and species composition of micromycetes// Eur. Soil Science, 1996,- V. 28,- № 4,- P. 96-106

47. Водопьянов В.В., Киреева H.A. Использование математической модели для прогнозирования динамики изменения численности микроорганизмов в нефтезагрязненных почвах// Тезисы 2 съезда общества почвоведов РАН,- Санкт-Петербург, 1996,- Кн. 1,- С. 55-56.

Киреева Наши Ахня^свна

КККРОВИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ D НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВАХ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

о !{ 3 JP № 020259 от 30.10.91

Подписано в печать 10.07.96. Формат (jOxfM/ÍG. Вум.чг.ч типографская 3. Печать офсетная. !<Ьмпьктгерньй набор. Усл.печ.л. 2,5. Уч.-изд.л. 3,-0. '1'ираж 100. Заказ 359.

Редакциошо-яадательский отдел [«широкого унине]ситота Ротапринт Банкирского ушведаитета. -150074. ,V'r.a, ул.^у^гчз.ЗЯ

Информация о работе

Киреева, Наиля Ахняфовна
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 1996
ВАК 03.00.23

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология