Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробная ремедиация нефтезагрязненных агродерново-карбонатных почв и техногенных поверхностных образований в подзоне южной тайги

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Микробная ремедиация нефтезагрязненных агродерново-карбонатных почв и техногенных поверхностных образований в подзоне южной тайги"

На правах рукописи

Баландина Алевтина Власовна

„

МИКРОБНАЯ РЕМЕДИАЦИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ АГРОДЕРНОВО-КАРБОНАТНЫХ ПОЧВ И ТЕХНОГЕННЫХ ПОВЕРХНОСТНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ

03.02.08 - ЭКОЛОГИЯ (биОЛОГН)';

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005545627

Пермь-2013

005545627

Работа выполнена на кафедре физиологии растений и микроорганизмов в ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» и на кафедре микробиологии ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацев-тическая академия»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Еремченко Ольга Зиновьевна

Научный консультант:

доктор фармацевтических наук, профессор Одегова Татьяна Федоровна

Официальные оппоненты:

Артамонова Валентина Сергеевна - доктор биологических наук, доцент, ФГБУН «Институт почвоведения и агрохимии Сибирского отделения РАН», ведущий научный сотрудник

Егорова Дарья Олеговна - кандидат биологических наук, ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН», старший научный сотрудник

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный политехнический университет»

Защита диссертации состоится «05» декабря 2013 г. в 15— на заседании диссертационного совета Д 212.189.02 на базе ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследова-тельский университет» по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Букирева, д. 15, в зале заседаний Учёного Совета.

Адрес сайта: http://www.psu.ru E-mail: novoselova@psu.ru Тел.: 8(342)239-62-17 Факс: 8(342)237-16-11

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»

Автореферат разослан 01 Ноября 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета --- Шибанова Наталья Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Нефтяная промышленность признана загрязнителем окружающей природной среды, наносящим ущерб биосфере. Отдельные территории вследствие разливов нефти приближаются по состоянию к районам экологического бедствия. Создается угроза устойчивой, часто необратимой, трансформации компонентов природной среды при нарушении нормального функционирования экосистем и ухудшения процессов жизнедеятельности растений, животных, человека.

Нефтезагрязнение сопровождается изменением физических, химических и биологических свойств почв (Пиковский, 1988; Звягинцев, 1989; Солнцева, 1998; Артамонова, 2002; Назарько, 2008; Оборин и др., 2008; Лысак, 2010). Естественное самоочищение почв от загрязнения нефтью и нефтепродуктами может длиться десятилетиями. Традиционные методы восстановления нефтезагрязненных почв (сжигание, закапывание) являются не только малоэффективными, но и экологически вредными. При сжигании нефтепродуктов страдает растительность и животное население; в результате пиролиза нефти и ее компонентов образуются токсичные пол и циклические ароматические углеводороды. Засыпка нефтяных пятен резко снижает скорость деструкции нефти, создает неблагоприятную анаэробную обстановку и т.д. Поэтому особую актуальность приобретает поиск безопасных для окружающей среды и человека средств и методов биологической ремедиации загрязненных нефтью почв.

Изменение свойств почвы при нефтезагрязнении и скорость деструкции нефти определяются не только дозой поллютанта, но и в значительной степени исходной микробиологической активностью почвы. В условиях подзоны южной тайги исследованы процессы деструкции нефти, изменение микробиологической и биохимической активности почв при нефтезагрязнении. Несмотря на множество работ по восстановлению почв, обилию созданных биопрепаратов (Ившина и др., 1996; Илларионов, 1996; Кристофи и др., 1996; Красавин и др., 2006; Оборин и др., 2008), вне внимания исследователей осталась проблема ремедиации дерново-карбонатных почв, подверженных нефтезагрязнению в районах нефтедобычи предуральского региона.

В антропогенно нарушенных ландшафтах, в том числе, на территориях добычи, хранения нефти и нефтепродуктов, почвы часто механически разрушены, на их месте сформированы техногенные поверхностные образования (ТПО). ТПО отличаются особыми свойствами, пониженной биологической активностью и специфическим сообществом микроорганизмов, особенно на фоне загрязнения поллютантами. При рекультивации нефтезагрязнных ТПО первоочередной задачей становится повышение численности и активности углеводородокисляющих микроорганизмов, которые ликвидируют токсический эффект нефти и создадут благоприятные условия для развития растительности.

Цель исследований. В условиях подзоны южной тайги оценить изменение свойств нефтезагрязненных агродерново-карбонатных почв и техногенных поверхноностных образований па наначалыюм этапе биологической ремедиации.

Объекты исследований. Объектами исследований являлись нефте-загрязненные агродерново-карбонатиые глинистые почвы и техногенные поверхностные образования.

Предмет исследований. Агрохимические и микробиологические свойства нефтезагрязненных агродерново-карбонатных почв и техногенных поверхностных образований при внесении биопрепаратов.

Основные задачи исследований:

1. Установить изменение остаточного количества нефти в почвах и ТПО при внесении биопрепаратов.

2. Изучить трансформацию агрохимических свойств агродерново-карбонатных почв и ТПО на начальном этане ремедиации.

3. Оценить микробиологические свойства и биохимическую активность поверхностных слоев почв и почвогрунтов на фоне применения биопрепаратов.

4. Провести оценку эффективности применения селекционных штаммов микромицетов Phoma eupyrena и Cephaliophora tropica в ремедиации нефтезагрязненной агродерново-карбонатной почвы.

Научная новизна. Получены новые данные об изменении агрохимических свойств агродерново-карбонатных почв и численности аборигенных углеводоро-докисляющих микроорганизмов при нефтезагрязнении и на фоне применения биопрепаратов. Установлено влияние селекционных штаммов микромицетов Phoma eupyrena и Cephaliophora tropica на сообщество углеводородокисляющих микроорганизмов в нефтезагрязненных агродерново-карбонатных почвах.

Впервые показано повышение микробиологической и биохимической активности нефтезагрязненных техногенных поверхностных образований в результате применения биопрепаратов.

Практическое значение. В нефтезагрязненных агродерново-карбонатных почвах и ТПО на начальном этапе ремедиации с препаратами «Альбит» и «Байкал ЭМ1» существенно снизилась нагрузка нефти, были созданы условия для получения всходов и развития культурных злаков. Применение биопрепаратов может быть рекомендовано для очистки почвогрунтов на территориях добычи нефти и складирования нефтепродуктов (нефтебазы, шламовые амбары и др.), для восстановления нефтезагрязненных почв.

Защищаемые положения:

1. Агродерново-карбонатиые почвы имеют богатый пул углеводородокисляющих бактерий и микромицетов, что определило их потенциальную способность к очищению при нефтезагрязнении.

2. Для ремедиации нефтезагрязненных техногенных поверхностных образований с низкой биологической активностью следует применять биопрепараты, содержащие ассоциацию углеводородокисляющих микроорганизмов.

Апробация работы и публикации. Материалы исследований были доложены на II Международной научно-практической конференции «Дождевые черви и плодородие почв» (Владимир, 2004 г.), на II Международной научной конференции «Современные проблемы загрязнения почв» (Москва, 2007 г.), на пятой научно-практической конференции «Экологические работы на месторожде-ниях нефти Тнмано-Печерской провинции. Состояние и перспективы» (Сыктывкар, 2008 г.), на российской научно-практической конференции ПГФЛ в рамках 14-ой международной выставки «Медицина и здоровье» (Пермь, 2008 г.).

По теме исследований опубликовано 12 работ, в том числе 5 статей в изданиях, входящих в утвержденный Высшей аттестационной комиссией перечень рецензируемых научных журналов.

Получен патент на изобретение №2421291 от 20.06.2011 г. «Способ рекультивации почв, загрязненных нефтыо и нефтепродуктами». Имеется акт внедрения за работы по ремедиации нефтезагрязненных ТПО Керженецкой нефтебазы.

Личное участие автора. Автором проведены планирование, организация и проведение полевых опытов, интерпретация и обобщение результата экспериментов. Микробиологические исследования выполнены автором, агрохимические исследования - при личном участии на кафедре химии почв факультета почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова.

Структура и объем диссертации. Материал диссертации изложен на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирован таблицами (18) и рисунками (7). Работа состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы, содержащего 186 источников, из которых 166 на русском и 20 на иностранных языках; имеет 15 приложений.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность за консультативную помощь О.С. Якименко - кандидату биологических наук, старшему научному сотруднику кафедры химии почв Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, а также А.К. Злотникову - кандидату биологических наук, старшему научному сотруднику Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина. Автор благодарит за научные консультации ректора Пермской фармацевтической государственной академии, заведующую кафедрой микробиологии, профессора, доктора фармацевтических наук Т.Ф. Одегову. Особая благодарность - научному руководителю доктору биологических наук, профессору О.З. Ерёмчепко за помощь в работе, постоянное внимание и поддержку.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы

В главе приведены сведения о деградации нефтезагрязненных почв и основные приемы их восстановления. Рассматривается характеристика нефти и ее влияние на агрохимическое состояние почв, микробиологическая и ферментативная активность нефтезагрязненных почв. Приведены примеры влияния нефтяного загрязнения на почвенную биоту. Описаны критерии оценки загрязненности почв и приемы восстановления. Отмечено преимущество биологических методов очистки почв на основе мобилизации углеводородокисляющих микроорганизмов.

Глава 2. Объекты и методы исследования

Методика полевых опытов

Мелкоделяночные полевые опыты проведены на территории опытного участка в Ильинском районе Пермского края. Объектом исследований были агродерново-карбонатные глинистые почвы, которые сформировались на пермских карбонатных породах. Эти почвы занимают 288 тыс. га, 1,8 % территории Пермского края; распахано 203 тыс. га дерново-карбонатных почв. Редкие почвы на пермских породах рекомендованы для включения в Красную книгу почв Пермского края (Еремченко и др., 2010).

В полевых исследованиях 2003-2004 гг. испытано сравнительное действие биопрепаратов биогумус (из расчета 3 т/га), вермикомпост (из расчета 3 т/га), штамм дрожжевой культуры (из расчета 500 л/га), «Альбит» (из расчета 200 л/га), «Байкал ЭМ1» (из расчета 100 л/га), а также навоза (из расчета 40 т/га), диамонийфосфата (из расчета 60 кг/га) и извести (из расчета 4 т/га) на свойства агродерново-карбонатной почвы, загрязненной нефтью в дозе 20 л на 1 м . Загрязнение почвы и внесение ремедиантов произведено в мае 2003 г. В мае 2004 г. на участке посеяна смесь злаков: овсяница красная (Festuca rubra subsp Rubra), овсяница обыкновенная (Festuca pratensis Huds), мятлик луговой (Роа pratensis L.), костер безостый (Bromus inermis Leysser), райграс пастбищный (Lolium perenne L.). Количество остаточной нефти в пахотном слое 0-20 см определили летом 2003, весной и осенью 2004 г. В начале осени 2004 г. определили агрохимические свойства почвы, накопление бенз(а)пирена и массу трав.

В опытах 2007 г. исследовано совместное действие препарата «Альбит» и штаммов микромицетов Phoma еиругепа и Cephaliophora tropica на свойства агродерново-карбонатной почвы при разных дозах загрязнения нефтью (5, 10 и 20 л/м ). Нефть внесли в почву во второй половине мая 2007 г. Через неделю после загрязнения был внесен препарат «Альбит» в виде суспензии из расчета 50, 100 и 200 л/га (соответственно увеличению уровня загрязнения нефтью). В препарате «Альбит» концентрация Phoma еиругепа и Cephaliophora tropica составляла не менее 1010 клеток/мл. Рыхление слоя 0-20 см проводили один раз в неделю в течение двух месяцев, одновременно поливали дозой 20 л/м . Агрохимические свойства и остаточное количество нефти в почве определили через 70 дней после начала ремедиации. Отбор почвенных проб для учета численности микроорганизмов произведен через 7 дней после загрязнения и через 35, 70 дней после внесения ремедиантов.

Исследования по микробной ремедиации ТПО были проведены в течение лета 2004 г. на территории Керженецкой нефтебазы в Нижегородской области. На нефтебазе ТПО представлены слоистыми фунтами неоднородного гранулометрического состава с участками перемешенного почвенного материала, неравномерно пропитанные свежей и остаточной нефтью. В июне 2007 г. на загрязненный нефтью участок внесли биопрепараты «Альбит» + «Байкал ЭМ1» из расчета 200 л/га в соотношении 1:1 на фоне применения диамонийфосфата (из расчета 40 кг/га) и рыхления на глубину 0-20 см. Посев трав провели в середине лета, спустя один месяц после обработки нефтезагрязненных ТПО биопрепаратами. Многолетние травы посеяны с нормой 20 кг/га: овсяница красная (Festuca rubra subsp Rubra), овсяница обыкновенная (Festuca pratensis Huds), мятлик луговой (Роа praténsis L.), костер безостый (Bromus inermis Leysser), райграс пастбищный {Lolium perenne L.). Всходы трав появились через 15 дней после посева. Через 25 дней растения образовали покров на загрязненном участке, подвергнутом ремедиации.

Пробы почвогрунта отобраны через месяц после начала ремедиации из шести точек загрязненного участка на глубину 0-20 см - для агрохимических и биохимических свойств и десяти точек по слоям 0-10 и 1020 см - для микробиологических свойств; для сравнения взяты образцы с незагрязненной (фоновой) территории.

Характеристика биопрепаратов

Действующим веществом биопрепаратов являются живые организмы либо продукты их жизнедеятельности. Биогумус - продукт переработки органических отходов калифорнийским червем (сертификат 0070045338). Вермикомпост - биогумус с содержанием 25 - 30 % червей (сертификат №0070045338). Навоз - органическое удобрение, полученное в результате твердых и жидких выделений крупного рогатого скота на подстилочный материал.

«Альбит» - комплексный препарат, обладающий свойствами регулятора роста, фунгицида, удобрения (патент №2147181). «Байкал ЭМ1» - универсальный концентрат в виде жидкости, содержащий более 80 штаммов почвенных микроорганизмов; номер государственной регистрации № 05 - 9800 (9801 - 9803) - 0369 (0386) - 1. Штамм дрожжевой культуры - суспензия микробных клеток в концентрации не менее 1010 кл/мл. Штамм Phoma eupyrena - сапротроф, выделяемый из почв, подстилки, навоза, гниющих растительных остатков (Кириленко, 1977). Штамм Cephaliophora tropica -сапротроф, выделенный из ризосферы молодого клена (Crook, 1955).

Методы лабораторных исследований

Использованы следующие методы почвенных исследований: pH водной суспензии - потенциометрическим методом; pH солевой суспензии -потенциометр ическим методом; содержание углерода органических соединений - ГОСТ 23740-79; содержание нитратного азота - ГОСТ Р53219-2008; содержание подвижных соединений калия - по методу Кирсанова в модификации ЦИНАО (ГОСТ 26207); содержание подвижных соединений фосфора - по методу Мачигина в модификации ЦИНАО (ГОСТ-26205);

массовая доля нефтепродуктов - методом люминесцентно-капиллярного безэталонного полуколичественного анализа (РД-39-0147098-015-90); содержание углеводородов нефти - методом жидкостной хроматографии (РД-39-0147098-015-90); содержание бенз(а)пирена - методом вольтамперометрии (ГОСТ Р-506984-94); денитрифицирующую активность почвы - по методу М.В. Фёдорова (ГОСТ 12.4.011-89); азотофиксирующую активность почвы - ГОСТ 27593-88; определение активности каталазы по перманганатометрическому методу Джонсона и Темпле; определение активности дегидрогеназы и инвертазы проводили по методу А.Ш. Галстяна.

Для определения численности и таксономического состава комплекса углеводородокисляющих микроорганизмов применяли метод посева на агаризированную глюкозо-пептонно-дрожжевую среду и среду Чапека с гексадеканом (Лысак и др., 2003). Посевы проводили стандартным способом из тысячного разведения в 5 кратной повторности после предварительной обработки на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-1 (22 кГц; 0,44 А; 2 мин) (Звягинцев, 1991). Для ингибирования развития грибов в среду добавляли 50 мг нистатина на 0,5 л среды.

Посевы инкубировали при комнатной температуре 3-7 суток, затем проводили подсчет и микроскопирование выросших колоний. Идентификацию микроорганизмов до рода проводили на основании изучения культуральных и микроморфологических признаков (Хоулт и др., 1997). Общую численность микроорганизмов определяли прямым микроскопическим методом с использованием красителя акридина оранжевого в камере Гаряева (Звягинцев, 1991).

Глава 3. Результаты и их обсуждение

Изменение свойств агродерново-карбонатной почвы на фоне применения биопрепаратов, удобрений и извести (2003-2004 гг.)

По мере развития процесса ремедиации уменьшалась нагрузка нефти в слое 0-20 см агродерново-карбонатной почвы (табл. 1). Применение биопрепаратов и удобрений ускорило в несколько раз деградацию нефти, благодаря их действию к концу наблюдений деградировано 40-50 % нефти, внесенной на поверхность агродерново-карбонатной почвы в количестве 20 л/м . Наименьшее остаточное количество нефти содержалось в почве на фоне препарата «Альбит». Этот биопрепарат не содержит живые клетки микроорганизмов, по-видимому, его действие на нефтезагрязненную почву обусловлено активизацией аборигенной ассоциации микроорганизмов.

Внесение биопрепаратов, удобрений и извести не существенно повлияло на актуальную кислотность почвы, которая находилась в пределах нейтрально-слабощелочных значений реакции среды. Наибольшее количество органического углерода отмечено на фоне извести и навоза; в первом случае -это результат замедленного разложения нефти, а во втором - последствие внесения органического удобрения. Меньшим содержанием органического углерода (9-12 %) характеризовались варианты с биопрепаратами «Альбит», «Байкал ЭМ1», биогумус и вермикомпост, что отразило повышенную скорость деградации нефти.

В результате загрязнения нефтью в почве увеличилось содержание нитратов более чем в 2 раза относительно фонового уровня (табл. 2). По-видимому, накоплению нитратов способствуют физико-химические и биохимические процессы разрушения соединений нефти. Повышенное

Таблица 1

Содержание нефти в агродерново-карбонатной почве (0-20 см) по вариантам

опыта, мг/кг

№ Вариант Срок наблюдений

№ 18.06.03 15.05.04 22.09.04

1. Фон 0 0 0

2. Нефть 20 л/м2 200 191 180

3. Нефть 20 л/м2 + биогумус 119 116 100

4. Нефть 20 л/м2 + вермикомпост 119 114 101

5. Нефть 20 л/м' + дрожжевые культуры 105 104 100

6. Нефть 20 л/м2 + навоз 141 138 120

7. Нефть 20 л/м2 + «Альбит» 118 112 91

8. Нефть 20 л/м2 + «Байкал М1» 136 130 120

9. Нефть 20 л/м' + диаммонийфосфат 159 141 121

10. Нефть 20 л/м2 + известь 169 146 140

Таблица 2

Агрохимические показатели нефтезагрязненной агродерново-карбонатной __почвы, слой 0-20 см (22.09.2004 г.) _

№ Площадка рНвод с % n-n03, мг/100 г р2о5, мг/100 г к2о, мг/100 г

I Фон 7,25 2,1 39,4 6,5 3,2

2 Нефть 20 л/м2 7,40 - 90,2 6,6 3,5

3 Нефть 20 л/м' + биогумус 7,32 12,0 26,67 7,65 4,00

4. Нефть 20 л/м' + вермикомпост 7,30 11,8 26,7 7,6 4,0

5. Нефть 20 л/м' + дрожжевые культуры 7,03 14,1 34,0 16,2 13,4

6. Нефть 20 л/м' + навоз 7,08 16,5 195,7 13,8 10,8

7. Нефть 20 л/м' + «Альбит» 7,44 10,1 69, 5 15,1 12,1

8. Нефть 20 л/м' + «Байкал эм1» 7,26 9,6 17,7 10,2 7,2

9. Нефть 20 л/м'+ диаммонийфосфат 7,70 13,2 103,8 11,4 8,9

10. Нефть 20 л/м' + известь 7,60 17,2 64,6 12,2 9,8

количество нитратов отмечено также на вариантах с применением навоза и диаммонийфосфата, содержащих соединения азота в органической и/или минеральной формах.

В результате применения биогумуса, вермиком поста, препаратов «Альбит» и «Байкал ЭМ1», дрожжевых культур и извести в почве содержится меньше нитратного азота, чем на загрязненном контрольном варианте. Вероятно, в процессе ремедиации формируется замкнутый круговорот соединений азота при участии растений и микроорганизмов без накопления нитратов в почве. На вариантах с биопрепаратами повышено количество подвижных фосфатов и калия в пахотном слое почвы, что в основном связано с присутствием питательных элементов в составе биопрепаратов.

В результате загрязнения в почве обнаружено присутствие бенз(а)пирена, на контроле его количество приближалось к ПДК. Заметно ниже количество бенз(а)пирена в загрязненной агродерново-карбонатной почве на вариантах с дрожжевыми культурами и навозом, биогумусом и вермикомпостом (табл. 3). И в три раза меньше его содержание в почве на фоне применения препаратов «Альбит» и «Байкал ЭМ1».

Зеленая масса сеяных злаков отражает общую картину биодеградации нефти по вариантам опыта (табл. 3). Повышенная масса трав отмечена на вариантах с биогумусом и вермикомпостом, и, особенно, с препаратами «Альбит» и «Байкал ЭМ1»; на фоне последних она увеличилась в 2 раза относительно варианта с контрольным загрязнением почвы.

Таблица 3

Масса надземной части злаков и количество бенз(а)пирена в слое 0-20 см агродерновокарбонатной почвы по вариантам опыта (22.09.2004 г.)

Вариант Бенз(а)пирен, мг/кг почвы Зеленая масса, кг/м2

Нефть 20 л/м2 19,0 • 10"3 0,8

Нефть 20 л/м2 + биогумус 5,1 • 10"3 1,5

Нефть 20 л/м2 + вермикомпост 6,2 • 10"3 1,5

Нефть 20 л/м2 + дрожжевые культуры 8,9 • 10"3 1,6

Нефть 20 л/м2 + навоз 9,9 • 10"3 1,4

Нефть 20 л/м2 + «Альбит» 4,8 • 10"3 1,7

Нефть 20 л/м2+ «Байкал ЭМ1» 4,9 • 10"3 1,6

Нефть 20 л/м2 + диаммонийфосфат 17,8 • 10° 1,2

Нефть 20 л/м2 + известь 15,9 • 10"3 1,0

Для выявления наиболее эффективных ремедиантов нефтезагрязненной агродерново-карбонатной почвы был использован метод математической оптимизации. Из каждой выборки показателей состояния почвы (х,, х2, х3, Х4,... х„ ) по вариантам опыта выбран экстремум — минимальное (хтт) или максимальное (хтах) значение показателя. Для показателей рН, содержания органического углерода, нефти и бенз(а)пирена в качестве экстремума были выбраны минимальные значения; а для количества подвижных фосфатов и калия, продуктивности трав - максимальные значения. Относительно экстремума рассчитали нормированные значения каждого показателя:

хк = xmm / xn, или xk = xn / Xmax. Сложив нормированные значения показателей, получили суммарный критерий оптимизации по каждому варианту ремедиации. При данном подходе был учтен комплекс экологически важных свойств, отражающих состояние нефтезагрязненной почвы в процессе микробной ремедиации. Исходя из суммарных критериев оказались лучшими варианты ремедиации с применением биопрепаратов «Альбит», «Байкал ЭМ1» и дрожжевых культур; суммарный коэффициент оптимизации составлял на их фоне 7,3-7,9, по сравнению с 5,3-6,5 на остальных вариантах опыта с применением биогумуса, вермикомпоста, навоза, диаммонийфосфата и извести.

Изменение свойств агродерново-карбонатной почвы на фоне применения препарата «Альбит» и штаммов Phoma еиругепа и Cephaliophora tropica (2007 г.)

Благодаря применению препарата «Альбит» за период около двух месяцев количество углеводородов в нефтезагрязненной почве снизилось на варианте 5 л/м2 нефти на 50 %, на варианте 10 л/м2 - на 40 %, на варианте 20 л/м2 - на 55 % относительно контрольного загрязненного варианта. На фоне действия биопрепарата величина рН оставалась в пределах показателей нейтрально-слабощелочной среды, в почве уменьшилось количество нитратов и возросло содержание подвижных форм фосфатов и калия. Внесение препарата «Альбит» со штаммами Phoma еиругепа и Cephaliophora tropica незначительно повлияло на процесс деструкции нефти по сравнению с вариантом использования одного препарата.

В незагрязненной агродерново-карбонатной почве опытного участка установлена таксономическая структура и численность колониеобразующих единиц (КОЕ) сообщества углеводородокисляющих микроорганизмов. Ассоциация бактерий включала следующие роды: Rhodococcus (108 КОЕ/г почвы) = Agrobactrium (108) > Bacillus (107) > Pseudomonas (106) = Clavibacter (106) > Xanthomonas (105); сообщество мицеальных микромицетов представлено родами: Pénicillium (108) = Phytoptora (108) > Fusarium (106) = Rhizoctonia (106).

Через неделю после разлива нефти в микробоценозе агродерново-карбонатной почвы не обнаружены КОЕ бактерий родов Pseudomonas, Rhodococcus, Bacillus и Agrobactrium. Численность родов Clavibacter и Xanthomonas составила всего 102 КОЕ/г почвы. В тоже время в нефтезагрязненной почве присутствовали микромицеты в количестве сотни и тысячи КОЕ/г почвы, отсутствовал лишь Pénicillium.

Через 35 дней с начала ремедиации в верхнем слое загрязненной почвы также присутствовали бактерии Clavibacter и Xanthomonas, при меньшей дозе загрязнения (5 л/м2) появились Agrobactrium (104 КОЕ/г) и Pseudomonas (102 КОЕ/г). Обнаружены КОЕ микромицетов при всех дозах загрязнения почвы нефтью (табл. 4).

Применение препарата «Альбит» существенно изменило структуру и численность бактериального сообщества. Через 35 дней ремедиации на его фоне в почве отмечены все характерные для незагрязненной почвы роды бактерий; с увеличением дозы загрязнения численность КОЕ, как правило,

Таблица 4

Численность микроорганизмов в агродерново-карбонатной почве через 35 дней после начала ремедиации, КОЕ/г почвы, опыты 2007 г.

Вариант опыта Pseudomonas Rhodococcus Bacillus Xanthomonas Clavibacter Agroba-cteriun Rhizoctonia Phytoptora Pénicillium Fusarium

Нефть 5 л/м2 102 0 0 10 103 104 103 104 104

Нефть 5 л/м2, «Альбит» 104 103 104 102 10i 104 102 10* 104 10*

Нефть 5 л/м'', «Альбит», Phoma еиругепа 106 105 105 104 103 105 102 102 106 0

Нефть 5 л/м2, «Альбит», Phoma еиругепа, Cephaliophora tropica 106 103 104 105 105 106 10 102 105 0

Нефть 10 л/м2 0 0 0 0 102 103 103 104 id1 103

Нефть 10 л/м2, «Альбит» 103 102 105 103 104 104 103 10* 105 103

Нефть 10 л/м2, «Альбит», Phoma еиругепа 105 104 103 102 103 103 102 102 104 102

Нефть 10 л/м2, «Альбит», Phoma еиругепа, Cephaliophora tropica 104 102 102 104 104 104 102 10 104 103

Нефть 20 л/м2 0 0 0 0 0 Ю1 103 103 105 103

Нефть 20 л/м2, «Альбит» 105 105 103 103 105 103 102 10* 103 10*

Нефть 20 л/м2, «Альбит», Phoma еиругепа 104 103 102 102 103 0 103 103 103 104

Нефть 20 л/м2, «Альбит», Phoma еиругепа, Cephaliophora tropica 103 102 103 103 102 103 103 102 103 102

снижалась на 1-2 порядка. Усиление токсичности нефти не сказалось на Xanthomonas. Не установлено определенного влияния препарата на численность КОЕ микромицетов на всех уровнях загрязнения. Среди грибов самую высокую численность показал Pénicillium (105 КОЕ/г при дозах 5 и 10 л/м2, 103 КОЕ/г при дозе 20 л/м ), который отсутствовал на варианте без биопрепарата.

Внесение в почву препарата «Альбит» совместно селекционными штаммами микромицетов незначительно повлияло на численность микроорганизмов. Через 35 дней ремедиации по дозам загрязнения нефтью 5 и 10 л/м в почве проявилась тенденция к увеличению численности некоторых родов бактерий в 10 и 100 раз, в тоже время в 10 раз уменьшалась количество КОЕ грибов. На варианте 5 л/м2 нефти численность КОЕ Phoma еиругепа выше, чем у остальных групп микроорганизмов, но при больших дозах нефти его преимущество не выражено.

Через 70 дней в нефтезагрязненной почве присутствовали все группы микроорганизмов, но их численность не превышала 102 - 104 КОЕ/г почвы (табл. 5). Под воздействием препарата «Альбит» отмечены существенные изменения в

Таблица 5

Численность микроорганизмов в афодерново-карбонатной нефтезафязненной

Вариант Pseudomonas Rhodococcus Bacillus Xanthomonas Clavibacter Agrobacterium Rhizoctonia Phytoptora Pénicillium Fusarium Phoma еиругепа Cephaliophora tropica

л Нефть 5 л/м 10 104 102 102 104 104 102 104 10J 10 - -

Нефть 5 л/м2 + «Альбит» 10' 10ö 10; 10' 10J 10' 0 0 10J 0 - -

Нефть 5 л/м2 + «Альбит» + Phoma еиругепа 10s 107 106 105 0 106 0 0 106 102 10ш _

Нефть 5 л/м2 + «Альбит» + Phoma еиругепа, Cephaliophora tropica 10* 10; 10b 10k 102 106 0 0 10° 10' ¡0' 10J

Нефть 10 л/м2 102 102 10J 102 104 104 103 104 10^ 10J - -

Нефть 10 л/м2 + «Альбит» 103 10b 10J 10b 104 10J 0 0 10J 10z - -

Нефть 10 л/м2 + «Альбит» + Phoma еиругепа 104 106 105 104 102 105 102 102 105 102 107

Нефть 10 л/м2 + «Альбит» + Phoma еиругепа, Cephaliophora tropica 107 106 106 106 0 104 0 0 106 102 107 106

Нефть 20 л/м2 102 102 - 102 103 102 104 10> 102 104 - -

Нефть 20 л/м2 + «Альбит» 104 105 105 104 103 103 103 105 103 102 - -

Нефть 20 л/м2 + «Альбит» + Phoma еиругепа 104 104 103 104 103 104 0 0 103 103 106

Нефть 20 л/м2 + «Альбит» + Phoma еиругепа, Cephaliophora tropica 104 105 105 105 0 104 0 0 104 102

Примечание. Знак «-» - отсутствие данных.

ассоциации микроорганизмов. Численность бактерий на варианте с дозой нефти 5 л/м2 возросла до 10 -107 КОЕ/г почвы, была понижена на вариантах с дозой нефти 10 и 20 л/м2, соответственно 104-106 и 103-105 КОЕ/г почвы. При меньших дозах зафязнения (5 и 10 л/м2) в почве не обнаружены КОЕ микромицетов Phytoptora, Fusarium, Rhizoctonia.

На фоне внесения в почву препарата «Альбит» совместно селекционными штаммами микромицетов слабо представлены или отсутствовали бактерии Clavibacter и фибы Phytoptora, Fusarium, Rhizoctonia. Численность КОЕ (106 -Ю10) селекционного штамма Phoma еиругепа существенно возросла по сравнению с предшествующим сроком наблюдений; у Cephaliophora tropica она составила 105 - 106 КОЕ/г почвы.

Установлена положительная корреляционная зависимость между содержанием углеводородов и нитратов в почве (табл. 5), отрицательная связь у количества углеводородов и численности бактерий, количества углеводородов и численности КОЕ Pénicillium-, однако, с углеводородами положительно связана численность КОЕ микромицетов Rhizoctonia и Fusarium. Следовательно, с увеличением нагрузки нефти в агродерново-карбонатной почве происходило угнетение бактерий и грибов Pénicillium, однако численность КОЕ Rhizoctonia и Fusarium нарастала.

Содержание подвижных форм фосфора и калия прямо пропорционально связано с численностью большинства родов микроорганизмов, кроме численности КОЕ двух родов микромицетов (Rhizoctonia, Fusarium). По-видимому, активность углеводородокисляющих микроорганизмов Pseudomonas, Rhodococcus, Bacillus, Xanthomonas, Pénicillium обусловлена обеспеченностью подвижными формами фосфора и калия. Активное размножение этих микроорганизмов подавляло численность микромицетов.

Связь между показателем нефтезагрязнения (содержание углеводородов) и агрохимическими, микробиологическими параметрами была учтена при расчете нормированных показателей. В качестве экстремума взяты минимальные значения для pH, содержания углеводородов и нитратов. Микромицеты Rhizoctonia, Phytoptora, Fusarium включают фитопатогенные виды, увеличение их численности в почве может вызвать заболевание у культурных растений. Поэтому для численности КОЕ этих родов микромицетов использовали в качестве экстремума минимальное, но отличное от нуля, значение. Максимальные значения - экстремумы отобраны для содержания подвижных фосфатов и калия, а также для численности КОЕ Pseudomonas, Rhodococcus, Bacillus, Xanthomonas, Clavibacter, Agrobacterium.

Таблица 6

Коэффициенты корреляции между численностью микроорганизмов и

агрохимическими свойствами (через 70 дней ремедиации)

Показатели pH УВ N03" P2O5 K2O

Pseudomonas -0,40 -0,73* -0,76* 0,84* 0,75*

Rhodococcus -0,43 -0,79* -0,84* 0,79* 0,84*

Bacillus -0,39 -0,8* -0,79* 0,77* 0,78*

Xanthomonas -0,24 -0,68* -0,80* 0,88* 0,82*

Clavibacter 0,39 0,14 0,39 -0,40 -0,42

Agrobacterium -0,31 -0,83* -0,54 0,52 0,58

Rhizoctonia 0,01 0,79* 0,77* -0,81* -0,77*

Phytoptora -0,16 0,40 0,55 -0,72* -0,66*

Pénicillium -0,58 -0,70* -0,67* 0,68* 0,68*

Fusarium 0,20 0,60* 0,64* -0,67* -0,67*

Примечание. Символ * - достоверная корреляционная зависимость между микробиологическими и агрохимическими свойствами при 95 % уровне вероятности

На вариантах с применением биопрепарата суммарные коэффициенты оптимизации в 1,7 раза превышали коэффициенты оптимизации контрольных загрязненных вариантов. При использовании препарата «Альбит» со штаммами

микромицетов Phoma eupyrena, Cephaliophor atropica суммарный коэффициент оптимизации не превысил значение коэффициента на вариантах с одним препаратом «Альбит».

Таким образом, опыты по ремедиации агродерново-карбонатной почвы с применением препарата «Альбит», показали, что препарат активизировал аборигенную углеводородокисляющую микробиоту, особенно бактериальную, и ускорил процесс деструкции нефти. За период около двух месяцев количество углеводородов снизилось на варианте 5 л/м нефти в 2 раза, на варианте 10 л/м2 - на 40 %, на варианте 20 л/м2 - на 55 % относительно контроля. На фоне действия препарата в почве отмечено повышенное количество подвижных форм фосфатов и калия, уменьшение содержания нитрат-ионов, внесенных с нефтью.

Селекционные штаммы микромицетов Phoma eupyrena, Cephaliophora tropica, внесенные совместно с препаратом «Альбит», понизили численность КОЕ аборигенных микромицетов, в том числе, включающих фитопатогенные виды.

Результаты исследований по ремедиации ТПО Перед началом ремедиации верхние слои (0-20 см) ТПО имели нейтральную реакцию среды (рис. 1). Содержание углеводородов колебалось от

16 14

° рН Сорг,% У.В, % N-N03 Р205, К2О,мг/100г

мг/ мг/100 г ЮОг

Рисунок 1. Изменение агрохимических свойств слоя 0-20 см ТПО в процессе

ремедиации (различия статистически достоверные) 2 до 15 %, органического углерода - от 3 до 16 %, что обусловлено неравномерным загрязнением нефтью. В значительной степени варьировало количество нитратов. Количество подвижных фосфатов и калия в ТПО было низким и в меньшей степени изменялось по точкам отбора проб ТПО.

д До ремедиации

И „

После ремедиации

Спустя месяц с начала процесса ремедиации отмечено незначительное подкисление ТПО, но реакция среды остается в пределах нейтральных значений. Заметно снизилось содержание органического углерода и особенно углеводородов (в среднем в 5 раз ниже). Благодаря удобрениям и биопрепаратам возросло содержание подвижных питательных элементов (рис. 1).

ТПО территории нефтебазы характеризовались низкой фоновой биохимической активностью. В соответствии с критериями обо гашен ноет и почв ферментами Д.Г. Звягинцева (1978) верхний слой ТПО был очень бедным по активности инвертазы и дегидрогеназы.

Спустя один месяц после начала ремедиации в слое 0-20 см иефте-загрязненных ТПО повышена активность каталазы по сравнению с фоновым уровнем (рис. 2). По степени обогащенности инвертазой ТПО были бедными, что лучше фонового уровня. По активности дегидрогеназы они относятся к среднеобогащенным и богатым. Ферментативная активность отражает развитие микробной ремедиации, направленной на деструкцию нефти. Скорость азотфиксации в ТПО понижена относительно фонового показателя (рис. 3), что характерно для нефтезагрязненных почв. Скорость денитрификации. в среднем не отличалась от фонового уровня, по-видимому, в нефтезагрязненном почвогрунте не развиты анаэробные процессы восстановления азота.

2,5 2 1,5 1

0,5 О

< Активность каталазы

№ образца

I проба из фонового П Ю; 2, 3. 4, 5 - пробы из нефтезагрязменного П Ю в процессе

ремедиации

Рисунок 2. Активность каталазы, см3 0,1 КМп04/г, мин:

Скорость азотфиксации

I проба из фонового Т110; 2. 3. 4. 5 - пробы из нефтезагрязненного ТПО в процессе

ремедиации

Рисунок 3. Скорость азотфиксации, нмоль С2Н4/г, 24 ч.:

До рсмедиации поверхностные слои нефтезагрязненных ТПО имели низкую микробиологическую активность, были неоднородными по ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов. В пробах чаще других бактерии встречались Clotridium, Rhodococcus и Pseudomonas численностью от 10 до 104 КОЕ/г почвогрунта, реже обнаружены Bacillus и Erwinia (табл. 7). В половине проб были КОЕ микромицетов Pythium, Fusarium, Rhizoctonia, Synchyltsium (от 10 до 1 (V на I г почвогрунта). В отдельных пробах присутствовали КОЕ AspersUlus, Mucor, Phylophtora.

После проведения мероприятий по ремедиации ТПО изменилась численность углеводородокисляющего микробного сообщества. Во всех пробах были бактерии Rhodococcus, Clotridium, Bacillus, Pseudomonas, их численность сильно колебалась (10 - 10|Н КОЕ/г почвогрунта), численность КОЕ всех грибов также возросла, в том числе, редко встречаемых до ремедиации AspersUlus, Mucor, Phylophtora (табл. 7).

Таблица 7

Численность микроорганизмов в ТПО нефтебазы до начала и в процессе ремедиации, КОЕ/г почвы

Показател ь Erwinia Bacillus Rhodococcus Clotridium Pseudomonas AspersUlus Mucor Phylophtora Pythium Fusarium Rhizoctonia Synchyltsium

До ремедиации

Количество

проб 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20

Среднее < 10 10 10 10 10 < 10 < 10 < 10 < 10 < 10 10 10

Минимальное

значение 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Максимальное значение 104 104 103 10' 103 I02 I02 102 102 102 10:' 10"'

В процессе ремедиации

Количество

проб 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20

Среднее 10 10' I0J I04 104 10" 10 10 I02 102 102 102

Минимальное

значение 0 10 10 I02 0 0 0 0 0 0 0 0

Максимальное 10'° I08 10'°

значение 104 10; 10° 104 I0J 104 104 I0J I0i

По-видимому, в благоприятных условиях ремедиации активно размножалась как аборигенная микробиота, так и микроорганизмы, внесенные с препаратом «Байкал ЭМ1». Благодаря углеводородокисляющим бактериям и грибам количество нефти в ТПО за месяц снизилось в среднем в 5 раз.

К анализу численности микробного сообщества ТПО до начала и спустя один месяц после начала ремедиации применили ранее описанный

метод оптимизации. Для углеводородокисляющих микроорганизмов Bacillus, Rhodococcus, Clotridium, Pseudomonas, Aspersilhis, Pythium, Synchyllsium при расчете нормированных показателей в качестве экстремума использовали максимальные значения. Для родов, включающих фитопатогенные виды {Fusarium, Rhizoctonia, Erwinia, Mucor, Phylophtora), были применены минимальные (но отличные от нуля) экстремумы. Критерии оптимизации поверхностных слоев нефтезагрязненных ТПО до ремедиации колебались в пределах 0-5,5. После проведения мероприятий по ремедиации ТПО границы колебаний критериев оптимизации составили 3-12, при этом критерий ниже 5 единиц имели 5 проб из 20 (25 %). По отдельным точкам отбора критерий оптимизации для микробного сообщества ТПО увеличился в десятки раз.

ВЫВОДЫ

1. В незагрязненной агродерново-карбонатной почве сообщество углеводородокисляющих микроорганизмов представлено ассоциацией бактерий Rhodococcus, Agrobactrium, Bacillus, Pseudomonas, Clavibacter, Xanthomonas и микромицетов Pénicillium, Phytoplora, Fusarium и Rhizoctonia. При нефтезагрязнении в агродерново-карбонатной почве сократилась численность бактерий и отмечена тенденция к увеличению количества КОЕ микромицетов Rhizoctonia и Fusarium.

2. На начальном этапе ремедиации нефтезагрязненной агродерново-карбонатной почвы под действием биопрепаратов ускорились процессы деструкции нефти. Применение препаратов «Альбит» и «Байкал ЭМ1» слабо повлияло на величину pH и способствовало увеличению содержания подвижных фосфатов и калия; на их фоне снизилось количество бенз(а)пирена, а масса злаков повысилась в 2 раза относительно контроля.

3. Под воздействием препарата «Альбит» в нефтезагрязненной агродерново-карбонатной почве за 70 дней летнего периода отмечено снижение нагрузки нефти на 50 % при дозе 5 л/м2, на 40 % при дозе 10 л/м2 и на 55% при дозе 20 л/м2. При этом отмечен рост численности бактерий Rhodococcus, Clotridium, Pseudomonas, Bacillus, Xanthomonas, Agrobacterim и проявилась тенденция к снижению КОЕ микромицетов Phytoplora, Fusarium, Rhizoctonia.

4. Внесение препарата «Альбит» со штаммами Phoma еиругепа и Cephaliophora tropica незначительно повлияло на деструкцию нефти по сравнению с вариантом отдельного использования препарата. В процессе ремедиации проявилась тенденция к снижению численности КОЕ родов микромицетов Phytoplora, Fusarium, Rhizoctonia.

5. В нефтезагрязненных ТПО при совместном применении биопрепаратов «Альбит» и «Байкал ЭМ1» на фоне рыхления и удобрений (диаммонийфосфат) за период около одного месяца в 5 раз уменьшилась нагрузка нефти, повысилось содержание подвижных форм азота, фосфора и калия; уровень активности инвертазы, дегидрогеназы и каталазы превысил фоновую величину, однако оставался подавленным процесс азотфиксации.

6. Нефтезагрязненные ТПО территории нефтебазы в слое 0-20 см характеризовались низкой численностью микроорганизмов и неоднородностью их ассоциаций. В процессе ремедиации ТПО численность КОЕ бактерий и микромицетов увеличилась на несколько порядков. Через месяц с начала ремедиации состояние поверхностных слоев ТПО позволило получить всходы и сформировать покров из сеяных злаков.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ Публикации в рецензируемых изданиях:

1. Злотников А.К., Садовникова Л.К., Баландина A.B.. Злотников K.M., Казаков A.B. Биопрепарат Альбит в технологии очистки почв от нефтяного загрязнения // Нефтегазовое дело. 2006. №2. С. 2-10.

2. Злотников А.К., Садовникова Л.К., Баландина A.B.. Злотников K.M., Казаков A.B. Использование биопрепарата Альбит для рекультивации нефтезагрязненных почв // Вестник РАСХН. 2007. №1. С. 65-67.

3. Баландина A.B., Одегова Т.Ф., Казаков A.B., Кузнецов Д.Б. Применение штаммовых культур грибов-сапрофитов в методике рекультивации почв, загрязненных нефтью // Фундаментальные исследования. 2013. №6. С. 668-672.

4. Одегова Т.Ф., Баландина A.B.. Бурлакова K.M., Злотников K.M., Злотников А.К., Казаков A.B. Способ рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Патент №2421291. 2011. С. 21.

5. Баландина A.B., Еремченко О.З., Одегова Т.Ф., Кузнецов Д.Б. Микробная ремедиация техногенных поверхностных образований Керженецкой нефтебазы // Фундаментальные исследования. 2013. №10 (часть 2). С. 328-333.

6. Баландина A.B., Еремченко О.З., Одегова Т.Ф., Кузнецов Д.Б. Результаты исследований по ремедиации дерново-карбонатных почв // Фундаментальные исследования. 2013. №10. С. 95-99.

Иные научные публикации:

7. Садовникова Л.К., Баландина A.B. Восстановление нефтезагрязненных земель с использованием биотехнологических методов // Дождевые черви и плодородие почв: материалы 2-й международной научно-практической конференции. Владимир, 2004. С. 232-233.

8. Злотников А.К., Садовникова Л.К., Баландина A.B.. Злотников K.M., Казаков A.B. Биопрепарат Альбит в технологии биоремедиации нефтезагрязненных почв // Современные проблемы загрязнения почв: материалы 2-й международной научной конференции. М., 2007. С. 283-285.

9. Баландина A.B.. Садовникова Л.К. Ремедиация нефтезагрязненных почв с помощью биопрепаратов // Современные проблемы загрязнения почв: материалы 2-й международной научной конференции. М., 2007. С. 260-262.

10. Баландина A.B.. Бурлакова Е.М., Казаков A.B. Использование биопрепаратов на нефтезагрязненных почвах // Медицина и здоровье: материалы российской научно-практической конференции ПГФА в рамках 14-ой международной выставки. Пермь, 2008. С. 176-177.

11. Баландина A.B.. Рудакова И.П., Злотников K.M., Одегова Т.Ф., Бабиян Л.К., Сыропятов Б.Я., Дранишникова О.Н. Изучение высокоактивного комплексного препарата Альбит // Медицина и здоровье: материалы российской научно-практической конференции ПГФА в рамках 14-ой международной выставки. Пермь, 2008. С. 178-179.

12. Баландина A.B.. Кузнецов Д.Б. Остаточные нефтепродукты в дерново-карбонатных почвах после рекультивации и самоочищения // Успехи современного естествознания. №7. 2013. С.95-100.

Подписано в печать 30.10.2013. Тираж 100 экз. Усл. печ. л 1,31 Заказ №122/2013 Формат 70x100/16 Набор компьютерный Отпечатано в типографии «А-Ризо» 614016. г. Пермь, ул. Седова, 22/2-220 т.(342)295-29-51

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Баландина, Алевтина Власовна, Пермь

ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая

академия»

04201453059

На правах рукописи

Баландина Алевтина Власовна

МИКРОБНАЯ РЕМЕДИАЦИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ АГРОДЕРНОВО-КАРБОНАТНЫХ ПОЧВ И ТЕХНОГЕННЫХ ПОВЕРХНОСТНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ

ТАЙГИ

03.02.08 - экология (биология)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор О.З. Еремченко

Научный консультант: доктор фармацевтических наук профессор Т.Ф.Одегова

Пермь 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

Введение..................................................................................................................................................................3

Глава I. Обзор литературы......................................................................................................................8

1.1. Нефть: состав, свойства, влияние на природные

объекты..............................................................................................................................................8

1.2. Методы восстановления нефтезагрязненных почв........................23

Глава 2. Условия, материалы и методы исследований................................................39

2.1. Природные условия территории исследований..................................39

2.2. Методы проведения полевых опытов............................................................44

2.3. Характеристика препаратов, использованных в

ремедиации..................................................................................................................................50

2.4. Методы лабораторных исследований........................................................52

Глава 3. Результаты и их обсуждение..........................................................................................54

3.1. Результаты исследований по ремедиации агродерново-

карбонатной почвы................................................................................................................54

3.1.1. Изменение свойств почвы на фоне применения биопрепаратов, удобрений и извести....................................................54

3.1.2. Изменение свойств почвы на фоне применения препарата «Альбит» и штаммов Phoma eupyrena и Cephaliophora tropica................................................................................................62

3.2. Результаты исследований по ремедиации ТПО..................................78

3.2.1. Изменение агрохимических свойств ТПО..............................78

3.2.2. Биохимическая активность ТПО..................................................80

3.2.3. Изменение микробиологических свойств ТПО..................84

Выводы......................................................................................................................................................................88

Список литературы........................................................................................................................................90

Приложения..........................................................................................................................................................110

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Нефтяная промышленность признана загрязнителем окружающей природной среды, наносящим ущерб биосфере. Отдельные территории вследствие разливов нефти приближаются по состоянию к районам экологического бедствия. Создается угроза устойчивой, часто необратимой, трансформации компонентов природной среды при нарушении нормального функционирования экосистем и ухудшения процессов жизнедеятельности растений, животных, человека.

Нефтезагрязнение сопровождается изменением физических, химических и биологических свойств почв (Пиковский, 1988; Звягинцев, 1989; Солнцева, 1998; Артамонова, 2002; Назарько, 2008; Оборин и др., 2008; Лысак, 2010). Естественное самоочищение почв от загрязнения нефтью и нефтепродуктами может длиться десятилетиями. Традиционные методы восстановления нефтезагрязненных почв (сжигание, закапывание) являются не только малоэффективными, но и экологически вредными. При сжигании нефтепродуктов страдает растительность и животное население; в результате пиролиза нефти и ее компонентов образуются токсичные полициклические ароматические углеводороды. Засыпка нефтяных пятен резко снижает скорость деструкции нефти, создает неблагоприятную анаэробную обстановку и т.д. Поэтому особую актуальность приобретает поиск безопасных для окружающей среды и человека средств и методов биологической ремедиации загрязненных нефтью почв.

Изменение свойств почвы при нефтезагрязнении и скорость деструкции нефти определяются не только дозой поллютанта, но и в значительной степени исходной микробиологической активностью почвы. В условиях подзоны южной тайги исследованы процессы деструкции нефти, изменение микробиологической и биохимической активности почв при нефтезагрязнении. Не смотря на множество работ по восстановлению почв,

обилию созданных биопрепаратов (Ившина и др., 1996; Илларионов, 1996; Кристофи и др., 1996; Красавин и др., 2006; Оборин и др., 2008), вне внимания исследователей осталась проблема ремедиации дерново-карбонатных почв, подверженных нефтезагрязнению в районах нефтедобычи предуральского региона.

В антропогенно нарушенных ландшафтах, в том числе, на территориях добычи, хранения нефти и нефтепродуктов, почвы часто механически разрушены, на их месте сформированы техногенные поверхностные образования (ТПО). ТПО отличаются особыми свойствами, пониженной биологической активностью и специфическим сообществом микроорганизмов, особенно на фоне загрязнения поллютантами. При рекультивации нефтезагрязнных ТПО первоочередной задачей становится повышение численности и активности углеводородокисляющих микроорганизмов, которые ликвидируют токсический эффект нефти и создадут благоприятные условия для развития растительности.

Цель исследований

В условиях подзоны южной тайги оценить изменение свойств нефтезагрязненных агродерново-карбонатных почв и техногенных поверхностных образований на начальном этапе биологической ремедиации.

Объекты исследований

Объектами исследований являлись нефтезагрязненные агродерново-карбонатные глинистые почвы и техногенные поверхностные образования.

Предмет исследований

Агрохимические и микробиологические свойства нефтезагрязненных агродерново-карбонатных почв и техногенных поверхностных образований при внесении биопрепаратов.

Основные задачи исследований

1 Установить изменение остаточного количества нефти в почвах и ТПО при внесении биопрепаратов.

2 Изучить трансформацию агрохимических свойств агродерново-карбонатных почв и ТПО на начальном этане ремедиации.

3 Оценить микробиологические свойства и биохимическую активность поверхностных слоев почв и почвогрунтов на фоне применения биопрепаратов.

4 Провести оценку эффективности применения селекционных штаммов микромицетов Phoma виру re па и Cephaliophora tropica в ремедиации нефтезагрязненной агродерново-карбонатной почвы.

Научная новизна

Получены новые данные об изменении агрохимических свойств агродерново-карбонатных почв и численности аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов при нефтезагрязнении и на фоне применения биопрепаратов. Установлено влияние селекционных штаммов микромицетов Phoma eupyrena и Cephaliophora tropica на сообщество углеводородокисляющих микроорганизмов в нефтезагрязненных агродерново-карбонатных почвах.

Впервые показано повышение микробиологической и биохимической ч активности нефтезагрязненных техногенных поверхностных образований в

результате применения биопрепаратов.

Практическое значение

В нефтезагрязненных агродерново-карбонатных почвах и ТПО на начальном этапе ремедиации с препаратами «Альбит» и «Байкал ЭМ1» существенно снизилась нагрузка нефти, были созданы условия для получения всходов и развития культурных злаков. Применение биопрепаратов может быть рекомендовано для очистки почвогрунтов на

территориях добычи нефти и складирования нефтепродуктов (нефтебазы, шламовые амбары и др.), для восстановления нефтезагрязненных почв.

Защищаемые положения

1. Агродерново-карбонатные почвы имеют богатый пул углеводородокисляющих бактерий и микромицетов, что определило их потенциальную способность к очищению при нефтезагрязнении.

2. Для ремедиации нефтезагрязненных техногенных поверхностных образований с низкой биологической активностью следует применять биопрепараты, содержащие ассоциацию углеводородокисляющих микроорганизмов.

Апробация работы и публикации

Материалы исследований были доложены на II Международной научно-практической конференции «Дождевые черви и плодородие почв» (Владимир, 2004 г.), на II Международной научной конференции «Современные проблемы загрязнения почв» (Москва, 2007 г.), на пятой научно-практической конференции «Экологические работы на месторождениях нефти Тимано-Печерской провинции. Состояние и перспективы» (Сыктывкар, 2008 г.). на российской научно-практической конференции ПГФА в рамках 14-ой международной выставки «Медицина и здоровье» (Пермь, 2008).

По теме исследований опубликовано 12 работ, в том числе 5 статей в изданиях, входящих в утвержденный Высшей аттестационной комиссией перечень рецензируемых научных журналов.

Получен патент на изобретение №2421291 от 20.06.2011 г. «Способ рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами» (приложение 1). Имеется акт внедрения за работы по ремедиации нефтезагрязненных ТПО Керженецкой нефтебазы (приложение 2).

Личное участие автора

Автором проведено планирование, организация и проведение полевых опытов, интерпретация и обобщение результата экспериментов. Микробиологические исследования выполнены автором, агрохимические исследования - при личном участии на кафедре химии почв факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова.

Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирован таблицами (18) и рисунками (7). Работа состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы, содержащего 186 источников, из которых 166 на русском и 20 на иностранных языках; имеет 15 приложений.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность за консультативную помощь О.С. Якименко - кандидату биологических наук, старшему научному сотруднику кафедры химии почв Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, а также А.К. Злотникову - кандидату биологических наук, старшему научному сотруднику Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина. Автор благодарит за научные консультации ректора Пермской фармацевтической государственной академии, заведующую кафедрой микробиологии, профессора, доктора фармацевтических наук Т.Ф. Одеговой. Особая благодарность - научному руководителю доктору биологических наук, профессору 0.3. Ерёмченко за помощь в работе, постоянное внимание и поддержку.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. НЕФТЬ: СОСТАВ, СВОЙСТВА, ВЛИЯНИЕ НА ПРИРОДНЫЕ

ОБЪЕКТЫ

Компоненты нефти и их влияние на живые организмы

Нефть - это жидкий полимер, состоящий из большого числа углеводородов разнообразного строения и высокомолекулярных смолисто-асфальтеновых веществ. В нем растворено некоторое количество воды, солей, микроэлементов. Нефть представляет собой смесь около 1000 индивидуальных веществ, из которых большая часть (80-90%) - жидкие углеводороды с числом атомов углерода в молекуле от 1 до 40 и гетероатомные органические соединения преимущественно сернистые, азотистые и кислородные, содержание которых в нефти не более 4-5%. Остальные компоненты - растворенные углеводородные газы с числом атомов углерода в молекуле от 1 до 4, их содержание в нефти колеблется от десятых долей до 4%; вода (от следов до 10%); минеральные соли (хлориды); растворы солей органических кислот, а так же механические примеси. Средний элементный состав нефти (в %): С - 83-87; Н - 12-14; 8 - 0,5-6,0; N -0,02-1,7; 0-0,005- 3,6.

Нефти всех месторождений мира отличает, с одной стороны, огромное разнообразие видов, с другой - единство ее состава и структуры, сходство по некоторым параметрам. Элементарный состав разнообразных индивидуальных представителей нефти во всем мире изменяется в пределах 3-4 % по каждому элементу (табл. 1).

Главные нефтеобразующие элементы - углерод, водород, азот, сера, кислород. Десятые и сотые доли процента нефти составляют многочисленные микроэлементы, набор которых в любой нефти примерно одинаков.

Таблица 1

Классификация нефти по углеводородному составу

Свойства нефти и групповой состав: Классы нефти, %

метановые метано-нафтеновые нафтеновые нафтеново-ароматические

(А1) (А2) (Б2) (Б1)

Метановые 40-55 20-40 5-15 0-10

Нафтеновые 35-45 45-60 50-60 46-60

Ароматические 5-10 10-25 20-30 20-35

Выход бензиновых фракций при 200 °С 30-45 25-35 10-25 5-15

В биогеохимическом воздействии нефти на экосистемы участвует

множество углеводородных и не углеводородных компонентов, в том числе

минеральные соли и микроэлементы. Многие исследователи (Пиковский.

№ -у -У

1981; Оборин, 1984; Оборин и др., 2008) отмечают, что легкая фракция нефти

оказывает сильное токсическое действие на микробные сообщества и

почвенных животных.

С содержанием легкой фракции коррелируют другие характеристики

нефти: углеводородный состав, количество смол и асфальтенов. С

уменьшением содержания легкой фракции ее токсичность снижается, но

возрастает токсичность ароматических соединений, относительное

содержание которых растет.

К циклическим углеводородам нефти относятся нафтеновые и

ароматические. О токсичности нафтенов сведений не имеется, они даже

могут оказывать стимулирующее действие на живые организмы.

Ароматические углеводороды - наиболее токсичные компоненты нефти (Петров, 1984; Оборин и др., 2008).

Смолы и асфальтены - высокомолекулярные не углеводородные компоненты нефти, содержащие основную часть микроэлементов нефти, в том числе почти все металлы. Вредное экологическое влияние смолисто-асфальтеновых компонентов на почвенные экосистемы заключается не в химической токсичности, а в значительном изменении водно-физических свойств почвы.

Сернистые соединения (сероводород, меркаптаны, сульфиды, дисульфиды, тиофены, тиофаны, свободная сера) оказывают вредное влияние на живые организмы. Особенно сильным токсическим действием обладают сероводород и меркаптаны.

Токсичные действия одних компонентов могут быть нейтрализованы

другими, поэтому токсичность нефти не определяется токсичностью

отдельных соединений, входящих в ее состав. Поэтому, оценивая

последствия влияния нефти на экосистемы, учитывают влияние комплекса

V? " и

соединений в целом (Гайнутдинов. 1979: Фроловская. 1981: Пиковский.

Л

1988).

Попадая на земную поверхность, нефть оказывается в качественно новых условиях существования: из анаэробной обстановки с очень замедленными темпами геохимических процессов она попадает в аэрируемую среду, в которой огромную роль играют биогеохимические факторы, и прежде всего геохимическая деятельность микроорганизмов (Савкина и др., 1979).

Загрязнение почвы нефтью приводит к резкому изменению ее свойств: почва становится гидрофобной, в связи, с чем резко меняются ее агрофизические и особенно водно-физические свойства. Резко нарушается соотношение углерода и азота, уменьшается содержание доступных растениям питательных веществ (нитратного азота, подвижного фосфора, обменного калия). Эти изменения, а также непосредственное токсическое

воздействие поллютантов на растения являются причиной гибели и снижения

продуктивности сельскохозяйственных культур на загрязненных почвах

ч? ч/ У

(Кромка, 1991; Костина, 1993; Салангинас, 2003; Оборин и др., 2008).

Особенно сильным фитоксическим влиянием обладают легкие фракции

нефти.

Вредное влияние тяжелых фракций нефти обусловлено образованием

механического барьера между семенами, корневой системой и окружающей

средой, затрудняющего водно-воздушный и пищевой режимы. Почвенная

биота также испытывает значительное угнетение. Действие нефти на живые

организмы почвы в значительной степени определяется ее концентрацией. В

низких концентрациях нефть оказывает стимулирующее действие на

почвенную биоту, так как она является энергетическим субстратом для

большой группы микроорганизмов и содержат вещества, стимулирующие

X/ У

рост и развитие растений (Розанова, 1980; Хазиев,1981).

Сильное загрязнение почвы нефтью сопровождается острым токсическим действием нефти на живые организмы, особенно в первоначальный период после загрязнения.

Было сформулировано положение о том, что независимо от природы загрязняющего агента изменения микробиоты почвы в ответ на возрастающие антропогенные нагрузки выражаются в последовательной смене адаптивных зон. Под адаптивной зоной понимается интервал концентраций изучаемого агента, определяющий совокупность изменений активно функционирующего в почве микробного сообщества. Каждая из выделенных зон соответствует определенному уровню антропогенной нагрузки.

Низкому уровню загрязнения нефтью (зона гомеостаза) соответствуют флуктуационные изменения микробной системы почв, которые затрагивают только интенсивность микробиологических процессов, но не имеют негативных последствий для почвенной микробиоты.

Средний уровень загрязнения (зона стресса) приводит к возникновению сукцессионных изменений, которые выр