Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологическая активность и восстановление засоленных почв при нефтяном загрязнении

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Биологическая активность и восстановление засоленных почв при нефтяном загрязнении"

ИБАТУЛЛИНА Инна Зайтуновна

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И ВОССТАНОВЛЕНИЕ ЗАСОЛЕННЫХ ПОЧВ ПРИ НЕФТЯНОМ ЗАГРЯЗНЕНИИ

03.02.08 - экология 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 МДР Шї

Москва-2012

005012011

Работа выполнена на кафедре земельных ресурсов и оценки почв Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Яковлев Александр Сергеевич кафедра земельных ресурсов и оценки почв МГУ имени М.В. Ломоносова

доктор биологических наук, профессор Кураков Александр Васильевич кафедра биологии почв МГУ имени М.В. Ломоносова

Официальные оппоненты: Марфенина Ольга Евгеньевна

доктор биологических наук, профессор кафедра биологии почв МГУ имени М.В. Ломоносова

Киреева Наиля Ахняфовна

доктор биологических наук, профессор кафедра биохимии и биотехнологии Башкирский государственный университет

Ведущая организация: ;' Российский государственный аграрный университет

' - МСХА им. К.А. Тимирязева

Защита диссертации состоится 27 марта 2012 г. в 15 ч. 30 мин. в аудитории М-2 на заседании диссертационного совета № 501.001.57 при МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, д. 1, стр. 12, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 20 февраля 2012 г.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании диссертационного совета. Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, д. 1, стр. 12, факультет почвоведения, Ученый совет.

Ученый секретарь диссертационного совета

Никифорова А.С.

Актуальность темы. Ежегодно в мире при добыче, транспортировке, хранении и использовании нефти и нефтепродуктов в окружающую среду попадает около 50 млн. т углеводородов. Ситуация усугубляется сопутствующими высокоминерализованными нефтепромысловыми водами и наличием токсичных реагентов в используемых при добыче нефти растворах (Рахимова и др., 2005). В результате неконтролируемых выбросов солесодержащих техногенных и природных вод из скважин концентрация солей в почве может возрасти на несколько порядков. Максимум концентрации солей и битуминозных веществ локализуется в органогенных горизонтах. Нефтедобыча часто ведется в южных регионах, где загрязнению нефтью подвергаются засоленные почвы, солончаки.

Загрязнение нефтью и высокоминерализованными нефтепромысловыми водами приводит к глубоким изменениям морфологических, агрохимических, водно-физических и биологических свойств почв (Минибаева и др., 1986; Кур а ко в и др., 2006; Ronald M. Atlas, 1995; Bastida et al., 2010; Yadav, Hassanizadeh,'2011 и др.). При одновременном воздействии нефти и солей создаются экстремальные условия для функционирования педобионтов, что снижает возможность самовосстановления почв и наземных биоценозов (Shaoping Kuang et al., 2011; Filatov et al., 2011 и др.). Сведений об интенсивности деградации нефти в засаленных лугово-каштано-вых почвах Ставропольского края и соровых солончаках Республики Казахстан мало, как и данных о воздействии нефти на микробиоту засоленных почв (Булатов, 1997; Hamdi et al., 2007). Можно полагать, что засоленность почв, жаркий и сухой вегетационный сезон будут негативно влиять на способность почв к самоочищению. Поэтому актуальными являются изучение влияния нефти на микробиоту данных почв, определение скорости разложения в них нефти, а также поиск и оценка биологических методов их восстановления.

Целью работы было исследование влияния нефтяного загрязнения на биологическую активность засоленных лугово-каштановых почв и соровых солончаков, интенсивности их самовосстановления и эффективности применения биологических препаратов для рекультивации.

Задачи:

1. Изучить микробиологические свойства засоленных лугово-каштановых почв Ставропольского края Российской Федерации и соровых солончаков северо-западного региона Казахстана.

2. Определить влияние нефтяного загрязнения на микробиоту и биологическую активность засоленных лугово-каштановых почв и соровых солончаков и оценить интенсивность их самовосстановления.

3. Выявить микроорганизмы, способные к деструкции нефти в засоленных почвах, и подобрать микробную ассоциацию для разложения нефтяных углеводородов в этих условиях.

4. Оценить эффективность биологических препаратов для очистки засоленных лугово-каштановых почв от нефтяного загрязнения.

Научная новизна. Впервые проведена оценка скорости самоочищения от нефти засоленных лугово-каштановых почв и соровых солончаков. Изучены закономерности изменения микробных сообществ этих почв при самовосстановлении. Установлено, что способность к восстановлению нефтезагрязненньтх засоленных почв ниже по сравнению с незасоленными, и если самовосстановление от нефти засоленной лугово-каштановой почвы протекает довольно активно, то в соровом солончаке этот процесс практически полностью ингибирован. Показано, что рекультивация с применением бактериальных и грибных препаратов повышает био-

логическую активность и интенсивность деградации нефти в засоленных лугово-каштановых почвах. Получены данные, свидетельствующие о накоплении в засоленных лугово-каштановых почвах патогенных и условно патогенных микроорганизмов при нефтяном загрязнении. Выявлены факторы, влияющие на интенсивность самоочищения и эффективность биологической рекультивации засоленных лугово-каштановых почв. Выделены микроорганизмы, способные к эффективной деструкции нефти в специфичных условиях почв Ставропольского края.

Практическая значимость. Результаты работы MOiyr быть использованы для оценки допустимых уровней загрязнения нефтью засоленных лугово-каштановых почв и соровых солончаков и разработки биотехнологий восстановления нефте-загрязненных засоленных почв.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях «Современные проблемы загрязнения почв» (Москва, 2007 г), «Докучаевские молодежные чтения» (Санкт-Петербург, 2008, 2009, 2011 гг.), «Ломоносов-2008» (Москва, 2008 г.), «JIo-моносов-2010» (Москва, 2010 г.), «Ресурсный потенциал почв - основа продовольственной и экологической безопасности России» (Санкт-Петербург, 2011 г.); международной ассамблее EGU (Вена, Австрия, 2009 г.); Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные достижения в почвоведении, экологии, сельском хозяйстве на пути к инновациям» (Москва, 2008 г.).

Публикации. По теме исследований опубликованы четыре работы в изданиях, рекомендованных ВАК, две статьи в сборниках, а также тезисы, изданные в материалах российских и международных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 175 страницах, состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов, результатов и обсуждения, состоящих из восьми глав, заключения, выводов, списка литературы (238 источников, из них 78 на иностранных языках), приложения. Работа иллюстрирована 23 рисунками, содержит 35 таблиц.

Личный вклад автора в работу. Автором проведены аналитический обзор литературы, лабораторные эксперименты, а также микробиологические и химические анализы исследуемых почв, интерпретация полученных результатов и статистическая обработка данных.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В данной главе предоставлен обзор литературы, посвященной проблеме нефтяного загрязнения и его влияния на морфологические и физико-химические свойства почвы, микробиоту, ферментативную активность, растительный покров. Изложены способы рекультивации нарушенных территорий, особенности биологического метода очистки почв от нефтяного загрязнения, нормирование допустимого содержания нефтепродуктов в почве в связи с их способностью к самоочищению.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили лугово-каштановая солончаковатая легкосуглинистая среднемощная почва (A-BCa-BCCs-C(g)Sa) на древнеморских суглинках (Нефтекумский р-н Ставропольского края) и соровые солончаки (Asa-Gsa) тер-

ритории нефтяного месторождения Северные Бузачи (Казахстан). В лабораторном опыте в течение одного года исследовали микробиоту и интенсивность самоочищения нефтезагрязненных образцов гумусового горизонта лугово-каштановой почвы и соровых солончаков. Для сравнения использовали фоновые незагрязненные образцы этих почв. В лабораторных условиях изучали также нефтезагрязненпые образцы лугово-каштановых почв с различным возрастом загрязнения нефтью (5 и 18 мес.) и способом рекультивации (самовосстановление, вспашка и обработка биопрепаратом). В работе изучали влияние биологических препаратов: биопрепарат компании «Элита-комплекс» (г. Екатеринбург) на основе Rhodococcus sp., «Биосорбент на основе бактериально-грибной композиции для очистки водоемов и почв от нефтепродуктов» (Институт биологии Коми НЦ УрО РАН) и грибная композиция, подобранная в ходе изучения микромицетов из засоленных местообитаний.

Методы исследований. Определение агрохимических показателей почв проводили по стандартным методикам (Аринушкина, 1970; Минеев, 2001). Содержание С в почвах определяли по методу Тюрина в модификации Никитина, раство-римого'калия (К+) и подвижного фосфора - методом Мачигина (для анализа щелочных почв), общего азота - методом Кьельдаля, кислотность водной вытяжки (pH) - потенциометрически. Общее содержание солей в почвах определяли весовым методом при выпаривании водной вытяжки на водяной бане.

Содержание нефтепродуктов в почвах определяли методом экстракции СС14 (Методика, ПНД Ф16.1:2.2.22-98Ю, 1998). Фракционный состав нефтяных углеводородов в почвах со свежим загрязнением определяли методом капиллярной газожидкостной хроматографии (Методика, ПНД Ф16.1.38-02. 2002). Определение базального дыхания (БД) проводили методом газовой хроматографии (Anderson, Domsch, 1978). Активность фермента дегидрогеназы (АД) определяли колориметрическим методом с использованием 2,3,5-трифенил-тетразолия хлористого (Ха-зиев, 1976, 1982). Полифенолоксидазную активность почв оценивали на модифицированной среде Чапека с ABTS (2,2-азино-бис-(3-этилбензтиазолин-6-супьфа-нат) аммония) (0.250 г/л среды) (Steffen et al., 2000; Semenova, Zavarzina, 2003).

Численность КОЕ микромицетов устанавливали методом посева почвенной суспензии из серийного разведения на среду Чапека с pH 4.5 (Методы почвенной..., 1991). Посев проводили в пятикратной повторное™. Численность КОЕ разных групп бактерий и грибов определяли методом посева почвенной суспензии на соответствующие питательные среды: аммонификаторы - на мясо-пептонном агаре (МПА), актиномицеты - на крахмал-аммиачном агаре (КАА), аэробные азотфик-саторы и олигонитрофилы - на среде Эшби, нитрификаторы - на среде Виноград-ского, целлюлозолитики - на среде Гетчинсона, сахаролитики - на среде Чапека-Докса с pH 6.5. Прямой учет численности и биомассы спор и фрагментов мицелия грибов проводили методом люминесцентной микроскопии при окрашивании препаратов флуорохромом Fluorescent Brightener 28 (SIGMA, аналог Calcoßuor White ST). Токсичность нефтяных углеводородов определяли по смертности жаброногих рачков артемий Artemia salina L. в водных экстрактах из почвенных образцов (ФР 1.39.2006.02 505).

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Statistica 6.0, MS Exel 10.0, GRAPHS (Новаковский, 2004).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Агрохимические показатели почв

Засоленная лугово-каштановая почва содержит от 1.5 до 2.4% солей. Нефтяное загрязнение обусловило высокое содержание Сорг в лугово-каштановой почве, которое составляет 2.8-3.7% по сравнению с 1.2% в фоновых образцах. Фоновая лугово-каштановая почва имеет слабощелочную реакцию рН, в нефтезагрязненных образцах значения рН более высокие - 8.0-9.1.

Содержание легкорастворимых солей в соровых солончаках - 6.8-9%, засоление имеет C1-S04 характер. Отношение C1/S04 варьирует по профилю от 1 до 17, солевая корка на поверхности почвы на 98% состоит из NaCl. Содержание С032~ в верхних слоях составило 1.8-9.6%, с глубиной количество увеличивается до 8.39.5%. Почвы характеризуются нейтральным и щелочным рН, низкими гидролитической кислотностью (0.35-1.05 мг-экв/100 г) и ЕКО (Ca+Mg, мг-экв/100 г- 23.238.2), содержание аммонийного азота - 2.6-10.5 мг NH4/100 г, нитратов - 1.4-2.0 мг NOj/lOO г, гумуса - 0.2-0.6%, валовых форм азота - 0.007-0.020%, фосфора -0.06-0.15% (Фаизов, 1980; ОВОС, 2001-2005; Тыныбаева, 2006).

Влияние нефтяного загрязнения на микробиоту засоленных лугово-каштановых почв и соровых солончаков

Фоновая не загрязненная нефтью засоленная лугово-каштановая почва характеризуется максимальным разнообразием микромицетов (изолировано 27 видов, светло- и темнопигментированный стерильный мицелий); численность микромицетов составила 81 тыс. КОЕ/г в.с.п. Таксономический состав почвенных микромицетов характеризуется обилием представителей родов Pénicillium (7 видов), Aspergillus (4 вида), Acremonium (3 вида), а роды Fusarium, Verticillium, Rhizopus, Chaetomium, Trichoderma, Cladosporium представлены одним-двумя видами.

Загрязнение нефтью подавляет жизнедеятельность и без того немногочисленной микробиоты засоленных почв. Численность микромицетов в нефтезагрязненных засоленных лугово-каштановых почвах понизилась по сравнению с фоновой почвой в два раза при дозе нефти 0.2%. В структуре микромицетов почвы доминировали представители родов Pénicillium, Aspergillus, Acremonium, Fusarium, Chaetomium, Rhizopus, Cladosporium, Mucor, светло- и темнопигментированный мицелий. Более высокие дозы нефти привели к большему снижению численности микромицетов: при концентрации нефти 1% - в семь раз (до 12 тыс. КОЕ/г в.с.п.), преобладали микромицеты родов Aspergillus, Chaetomium, Paecilomyces, Pénicillium, Fusarium и светло- и темнопигментированный стерильный мицелий, при 5 и 10%-ной концентрации нефти численность грибов снизилась до 5 и 11 тыс. КОЕ/г в.с.п. соответственно. При концентрации нефти в почве 0.2-10% отмечали резкое снижение численности эколого-трофических групп микроорганизмов.

Через 1.5 мес. после загрязнения нефтью (доза 8.5%) михобиота по-прежнему характеризуется низкой численностью и видовым разнообразием. Численность микромицетов в почвах с сроком загрязнения 19.5 мес. -5.5 тыс. КОЕ/г в.с.п. Выделено 29 видов и отмечен рост количества видов, характерных для фоновой незагрязненной почвы. Численность и разнообразие видов грибов в почве с загрязнением нефтью сроком 6.5 мес. занимали промежуточное положение между свежим и 19.5-месячным загрязнением. Расчет коэффициента сходства Сьеренсена-Чекановско-

го между комплексами микромицетов исследованных вариантов опыта подтверждает выявленные изменения. Видовое сходство микромицетов в фоновых и вариантах со свежим нефтяным загрязнением минимальное и составляет 22-32%, с загрязнением сроком 6.5 и 19.5 мес. - 42-52%.

В микробной биомассе нефтезагрязненных засоленных лугово-каштановых почв высока доля спор грибов; бактериальной биомассы не более 0.1-2.0% от общей.

Из фоновых соровых солончаков выделено 20 видов микромицетов - представители родов Pénicillium (б видов), Aspergillus (Звида), Cladosporium (3 вида), Мисог (2 вида) и родов Actinomortierella, Chaetomium, Oideodendron (по одному виду). Численность грибов в соровых солончаках составляет около 50 тыс. КОЕ/г в.с.п.

Количество микромицетов и видовой состав в соровых солончаках резко снизился после внесения испытанных доз нефти. Среди доминирующих грибов были представители Cladosporium, Oideodendron, светло- и темноокрашенный стерильный мицелий, Мисог, Pénicillium nStachybotrys.

Биомасса спор и мицелия в нефтезагрязненных почвах, в особенности соровых солончаков, была значительно ниже, чем в фоновых почвах. Грибная биомасса в фоновой почве представлена преимущественно в виде спор, в нефтезагрязненных образцах количество мицелия на порядки ниже (при микроскопии обнаруживаются только единичные гифы), что указывает на подавление жизнедеятельности грибов при нефтяном загрязнении и высокую засоленность почв, а также крайне низкое поступление растительных субстратов и щелочную реакцию среды.

Загрязнение засоленных лугово-каштановых почв нефтью приводит к снижению численности целлюлозоразрушающих микроорганизмов в десятки раз. Вместе с тем, в нефтезагрязненных почвах активизируется дегидрогеназа, катализирующая разложение нефтяных углеводородов. Максимальная дегидрогеназная активность в засоленной лугово-каштановой почве и соровом солончаке отмечена при дозах нефти 0.2 и 1%. Базальное дыхание существенно не снизилось в засоленной лугово-каштановой почве, концентрации 0.2-5% нефти приводили к стимуляции эмиссии углекислого газа. В соровом солончаке, напротив, выделение диоксида углерода было подавлено в нефтезагрязненных образцах (табл. 1).

Способность к самовосстановлению нефтезагрязненной засоленной лугово-каштановой почвы

В длительном лабораторном опыте при инкубации почв с разным уровнем загрязнения нефтью исследовали темпы восстановлению структуры микробного комплекса, ферментативной активности и снижения концентрации поллютанта.

Комплекс почвенных микромицетов. В первый месяц после загрязнения нефтью почвы из нее выделяется значительно меньшее число видов, чем из контрольной почвы. При загрязнении почвы нефтью в концентрации 0.2% в ней доминировали Aspergillus sp., Pénicillium sp., Pénicillium sp.l, в концентрации 1% - Pénicillium camemberti, Pénicillium sp. 1 и светлоокрашенный стерильный мицелий, при 5% -P. oxalicum, Verticillium terrestre, светлоокрашенный стерильный мицелий, при 10% -Acremonium sp. TuFusarium sp.

Повышение видового разнообразия микромицетов в лугово-каштановой почве при нефтяном загрязнении от 0.2 до 10% начинается после двухмесячного периода.

При загрязнении почв нефтью в концентрации 0.2% по окончании годичного эксперимента сходство почвенной микобиоты с фоновой составило 37.1%, при дозах

Влияние нефти на основные показатели биологической активности засоленных почв

Показатели Концентрация нефти

биологической активности Фон 0.2% 1% 1 5% 10%

Лугово-каштановая солончаковатая почва

Количество видов 27 13 9 8 6

Численность микромицетов 81 35 12 5 11

(тыс. КОЕ/г в.с.п.)

Базальное дыхание 358 525 351 378 348

(ммоль СОг/г субстрата/ч)

Активность дегидрогеназы 0 4.4 4.8 1.1 0.8

(мк л Шг су бстр ата/ч)

Биомасса (мг/г в.с.п.) 0.09 0.03 0.13 0.05 0.03

Соровый солончак

Количество видов 20 5 5 5 5

Численность микромицетов 49 3 5 2 10

(тыс. КОБ7г в.с.п.)

Базальное дыхание 10.9 ±0 Следы Следы 10.8 ± 1.4 Следы

(ммоль СОг/г субсграта/ч)

Активность дегидрогеназы 0 0.23 0.21 0.14 0.01

(мкл Нт/г су бстр ата/ч) 0.003

Биомасса (мг/г в.с.п) 0.03 0.01 0.01 0.006

1 и 5% - соответственно 34.3 и 37.9%. В случае 10%-ного загрязнения почвы нефтью всего шесть видов грибов были общими с фоновыми почвами {Acremonium sp., Aspergillus fumigatus, Pénicillium aurantiogriseum, P. spinulosum, Pénicillium sp.l и светлоокрашенный стерильный мицелий). Представители Aspergillus sp„ Fusarium sp., Gliocladium sp., Paecilomyces sp., Pénicillium brevicompactum, обильные в почве, загрязненной год назад, не доминировали в фоновых лугово-каштановых почвах. Коэффициент сходства микромицетных комплексов этих почв составил 18.8%.

Численность микромицетов в засоленных лугово-каштановых почвах снижалось в первую неделю при загрязнении почв нефтью во всех испытанных концентрациях. Увеличение численности грибов наблюдали ко второму месяцу при всех дозах нефти (рис. 1), что может служить показателем их постепенного восстановления. Меньшую численность КОЕ грибов в загрязненных почвах по сравнению с контролем отмечали и при дальнейшей инкубации, но к концу года она приближается к таковому в фоновой почве.

Микроорганизмы на комочках обрастания. Групповое разнообразие микроорганизмов при обрастании почвенных комочков на среде Виноградского в чашках Петри показало, что внесение 0.2% нефти не влияет на их соотношение в течение всего эксперимента (одного года). При 1%-ном загрязнении почвы нефтью в первую неделю было ингибировано развитие мицелиальных грибов и не росли бактерии, дрожжи и актиномицеты, а через три недели наблюдали развитие всех четырех групп микроорганизмов. При 5%-ной дозе нефти частично лимитировалось

200 180

0 7 21 60 90 180 360

КЗЗфон (контроль) —»—0,2% • О 1% -А-5% -а- 10%

Рис. 1. Численность микро.чицетов в засоленных лугово-каштановых почвах при разном уровне загрязнения нефтью в течение одного года.

развитие всех групп микроорганизмов на первой неделе опыта. При дозе нефти 10% подавлен рост микромицетов в течение первой недели, и полного восстановления разнообразия микроорганизмов не произошло по истечении одного года.

Появление мицелия в структуре грибной биомассы наблюдали по истечении 3 мес. инкубации почв. Доля мицелия достигла 56-71% в биомассе в почвах с разным уровнем загрязнения. К концу опыта в почвах снова доминировал споровый компонент.

Эколого-трофические группы микроорганизмов (ЭГТМ). В период с 7 по 21-е суг. при внесении нефти в концентрации 0,2% наблюдали увеличение исследуемых групп микроорганизмов, за исключением сахаролитиков и целлюлоз олити-ков. К третьей неделе общая численность микроорганизмов превышала фоновые значения в два раза. К концу года численность микроорганизмов в нефтезагряз-ненной почве была выше, чем в фоновой: количество аммонификаторов, азотфик-саторов и сахаролитиков - в два раза, усваивающих минеральный азот, олиготро-фов - в три, целлюлозолитиков - в 20 раз. Такую тенденцию наблюдали и на варианте с 1%-ным загрязнением, но количество микроорганизмов было ниже, чем при внесении 0.2% нефти в почву. При загрязнении почвы нефтью в 5-10% количество изученных трофических групп микроорганизмов было значительно меньше, чем при концентрации нефти 0.2%. Численность аммонификаторов, олиготрофов, азот-фиксаторов и олигонитрофилов в нефтезагрязненной почве к концу года была близка к их первоначальным значениям в фоновой почве.

Ферментативная активность. Рост активности дегидрогеназы характерен для лугово-каштановых почв со всеми концентрациями загрязнителя по истечении 6 мес. инкубации. Максимальное увеличение активности фермента отмечено в почвах с концентрацией нефти 0.2 и 1%. Для засоленных лугово-каштановых почв было также характерно проявление активности полифенолоксидазы. Активизация фермента происходит уже после первой недели, но только в почвах с концентрацией загрязнения 0.2 и 1%. При более высоких дозах нефти проявление полифено-локсидазной активности наблюдали только к концу эксперимента, к 365-м суткам.

В самом начале эксперимента максимальная респираторная активность характерна для варианга с загрязнением 0.2%. К 365-м суткам активность дыхания в нефтезагрязненных почвах и контроле стала сходной.

120.0

100.0

..451

6% 9% 17% щ„ 28% 42%

8% 15%

-S-1% -*r- 5%

-•-10%

0.0

--—-^-63%

92 182 365 сутки

0 7 21 61

Рис. 2. Динамика деградации нефти в засоленных лугово-кашгановых почвах в течение года.

Интенсивность деградации нефти. Снижение концентрации нефти наблюдали в течение всего срока эксперимента, что связано с постепенным восстановлением микробного сообщества и, как известно, увеличением численности микроорганизмов, способных усваивать нефтяные углеводороды, и испарением легких токсичных фракций нефти. Максимальная деградация нефти в течение года отмечена в почвах с загрязнением в 0.2% и составляет более 63% сгг ее исходной концентрации. Деградация нефти в почвах с большим уровнем загрязнения (дозы нефти 1 и 5%) также проходила активно и достигла 42 и 31% соответственно (рис. 2).

Полученные данные свидетельствуют о том, что более чем 40% нефти может разрушиться в течение года в засоленной лугово-каштановой почве без проведения дополнительных мероприятий по их восстановлению при уровне загрязнения 0.2-1%.

Комплекс почвенных микромицетов. В соровых солончаках при загрязнении нефтью наблюдается снижение численности и видового разнообразия грибов. Через неделю после загрязнения почвы в дозе 0.2% количество выделенных видов оставалось низким - Aspergillus Candidus, A. flavipes, светло- и темноокрашенный стерильный мицелий, A. niger, Pénicillium oxalicum, Stemphylium botryosum. При загрязнении нефтью в концентрациях 1, 5 и 10% было еще более резкое сокращение видового разнообразия микромицетов. При дальнейшей инкубации низкое сходство видового состава грибов в соровых солончаках при всех уровнях загрязнения и фоновых сохранялось (табл. 2).

Незначительное повышение количества грибного мицелия было отмечено после трехмесячного периода при дозе нефти 0.2 и 5%.

Микроорганизмы на комочках обрастания. Просмотр под микроскопом почвенных комочков соровых солончаков в чашке Петри на минеральной среде Виног-радского показал их достаточно активное обрастание грибами, одноклеточными бактериями и актиномицетами, дрожжами (3 балла по пятибалльной шкале). Вне-

Способность к самовосстановлению нефтезагрязненных соровых солончаков

Коэффициенты сходства видового состава мнкромнцетов в нефтезагрязненных н фоновых соровых солончаках

Доза нефти, % Сроки отбора проб, сутки

0 7 21 90 180 360

0.2 25% 13% 12% 23% 21% 38%

1 25% 10% 18% 20% 21% 30%

5 25% 5% 10% 25% 20% 13%

10 19% 5% 5% 15% 15% 25%

сение в почву нефти в концентрации 0.2% не оказывало влияния на микробиоту -обрастание почвенных комочков во все периоды учета было примерно одинаковым. Высокие дозы загрязнения (1, 5 и 10%) привели к ингибированию роста ми-целиальных грибов и актиномицетов, представители которых не были отмечены на протяжении всего эксперимента. Появление грибов наблюдали только по истечении срока экспозиции (один год).

Эколого-трофическис группы лшкроорганизмов. Нефтяное загрязнение оказало существенное влияние на структуру микробного комплекса солончаков. Даже внесение самых низких доз нефти (0.2%) вызывало резкое снижение численности этих групп. Затем в период с 7 по 62-е сут. наблюдали увеличение количества микроорганизмов, а через 6 мес. - повторное уменьшение численности эколого-тро-фических групп микроорганизмов, а к концу года вновь их увеличение. При загрязнении солончаков в концентрации нефти 1% развитие микроорганизмов было подавлено в течение 3 мес., а затем отмечена активизация их жизнедеятельности, кроме целлюлозолитиков, количество которых значительно снизилось и в конце года не превышало 1 тыс. КОЕ/г в.с.п.

При более высоком загрязнении почвы (5%) численность микроорганизмов всех трофических групп резко снижалась. Через неделю отмечали постепенное увеличение количества микроорганизмов, за исключением целлюлозолитиков. К концу года численность сахаролитиков, главным образом дрожжей, превышала фоновый показатель в 2.5 раза, а количество аммонификаторов и усваивающих минеральный азот микроорганизмов было на фоновом уровне. 10%-ное загрязнение почвы нефтью привело к максимальному уменьшению численности микроорганизмов. В течение года отмечено восстановление численности сахаролитических микроорганизмов, главным образом дрожжей. Их количество возросло до 1.26 млн. КОЕ/г, что значительно превышало фоновые значения. Численность других групп микроорганизмов уступала начальным значениям, целлюлозолитические микроорганизмы не выделялись и по истечении года.

Интенсивность деградации нефти. Результаты наших исследований потенциала самоочищения соровых солончаков от нефти показали, что уменьшение содержания нефти происходит при самой низкой ее концеетрации (0.2-1%) и достигает 1.6-1.7% (по массе) от ее начального содержания в почве. Загрязнение соровых солончаков нефтью в концентрациях свыше 1% приводит к подавлению жизнедеятельности микроорганизмов. Деградация нефти не отмечается при загрязнении соровых солончаков нефтью в концентрации более 5%. Высокая засоленность соровых солончаков является основным фактором, сдерживающим развитие микроорганизмов, способных активно усваивать нефтяные углеводороды при загрязнении.

В связи с малой численностью микроорганизмов и высоким содержанием солей ферментативная активность в соровых солончаках, очень низка. Активность фермента дегидрогеназы в десятки раз меньше, чем в лугово-каштановых почвах, полифенолоксидазная активность и базальное дыхание соровых солончаков также подавлены. При низкой активности микроорганизмов большую роль имеет, по-видимому, физико-химическое разложение нефти в этой почве.

Анализ факторов, влияющих на самоочищение засоленных почв от нефти

Выделены основные факторы, влияющие на деградацию нефти и изменение биологической активности изученных почв: тип почвы, концентрация нефти, срок загрязнения.

Показано, что среднее значение всех показателей для засоленных лугово-каш-тановых почв выше, чем для соровых солончаков, кроме остаточного содержания нефти. Это подтверждается более интенсивной деструкцией нефти в засоленных лугово-каштановых почвах по сравнению с соровыми солончаками (табл. 3).

Анализ влияния концентрации нефти на показатели биологической активности не выявил значимых различий в интенсивности базального дыхания и запасах грибной биомассы (табл. 4).

Значения показателей биологической активности изучаемых почв снижаются на первых стадиях разложения нефти. Постепенно с увеличением численности микроорганизмов происходит рост БД и АД при одновременном уменьшении концентрации нефти в почвах (табл. 5).

Таблица 3

Средние значения показателей биологической активности почв и остаточного содержания нефти в почвах по фактору «Тип почвы»

Показатель

Тип почвы

Соровый солончак Лугово-каштановая почва

Базальное дыхание (БД) 35.3 ± 84а

Содержание нефти (СН) 41.4 ± 38.8а Биомасса (БМ) 0.02 ±0а

Численность микромицетов (ЧМ) 16 ± 17.7а

Активность дегидрогеназы (АД) 0.5 ± 0.7а

305.9 ±69.3Ь 35.8 ± 33.9а

0.04 ± 0Ь 39.5 ± 40.6b 10.8 ± 12.8b

Примечание: здесь и далее а, Ь, с - однородные группы (LSD-test).

Таблица А

Средние значения показателей биологической активности почв и остаточного содержания пефти в почвах по фактору «Концентрация нефти»

Показатель

Концентрация нефти, %

0

1

10

БД БМ ЧМ АД

233.2 ±141.5а

0.03 ±0а 32.4 ± 18.2а 11.4 ± 12.4а

215.4 ± 174.7а

0.03 ± 0а 48.1 ± 50.lb 11.2 ± 14а

183.7 ± 133.8а 0.02 ±0а 19.2 ± 27.1с 1.3 ± 2.5Ь

197.6 ± 147.8а 0.02 ± Оа 14.9 ± 21.8с 0.5 ± 0.7Ь

Средине значения показателей биологической активности почв и остаточного содержания нефти в почвах по фактору «Срок нефтяного загрязнении»

Срок нефтяного загрязнения, сутки

0 7 21 62 92 180 365

БД 246.6±205.6а 175.9+164Ь 155±149Ь 148.4±130Ь 265.9±16а 258.6±25а 306±45.5а

СН 40.8±39а 40.1±38.3а 39.7±37.8а 38.1±36.4а 34.1±32.4а 37.9±35.3а 36±34а

БМ 0.04±0.05ab O.OliO.Old O.OliO.Old 0.02±0.01cd 0.05±0.01а 0.03±0.01Ьс 0.04±0.03ab

4M 10.4±10.3а 22.4±21.4а 20.1±28.8а 57.8i49.6b 1б.5±11.3а 42.4±39.6Ь 45.5i44.lb

АД 1.4±19а 2.1±4.9ab 5.8±9.6abc 4.5±6.6ab 11.7±9.6cd 7.7±11.7bcd 12.1±18.2d

Многофакторный дисперсионный анализ показал, что тип почвы и срок загрязнения значимо влияют на биологическую активность соровых солончаков и луго-во-каштановой почвы (они определяют до 69 и 28% общей дисперсии соответственно). Концентрация нефти также существенно определяет все показатели за исключением БМ (2-98% общей дисперсии). В целом эти факторы с высокой достоверностью описывают общую вариабельность скорости деградации нефти и базального дыхания почв.

Грибная композиция для рекультивации засоленных почв от нефтяного загрязнения

В нашей работе была предпринята попытка подобрать грибную композицию, способную к биодеструкции нефти в условиях повышенного засоления.

Грибная композиция была составлена из представителей родов Fusarium, Acremonium, Verticillium и дрожжей Debariomyces. При совместном посеве культур этих микроорганизмов на среду Чапека они не подавляли рост друг друга, т.е. не оказывали явного антагонистического действия.

Показано, что микроорганизмы, входящие в состав грибной композиции, усваивают нефтяные углеводороды при повышенном содержании солей в питательной среде и искусственно засоленной дерново-подзолистой почве. Установлена способность внесенной грибной композиции ускорять разложение нефтяных углеводородов в искусственно засоленных почвенных образцах.

Влияние биопрепаратов на микробиоту засоленных лугово-каштановых почв

Влияние биопрепаратов на микобиоту почвы. Через 1.5 мес. инкубации при внесении биосорбента в засоленной лугово-каштановой почве преобладали Microascus brevicaulis и стерильный темнопигментированпый мицелий. В варианте с препаратом «Элита-комплекс» доминировали Aspergillus brasiliensis, Phialo-spora sp. и темпоокрашенный стерильный мицелий, численность других видов была низкой, а при внесении грибной композиции доминантами в почве были Aspergillus fumigatus, Pénicillium funiculosum и темнопигментированпый стерильный мицелий.

В почвах с самым старым сроком загрязнения (18 мес.) через 1.5 мес. количество грибов было наибольшим при внесении биопрепарата «Элита-комплекс». В ней доминировали Pénicillium chrysogenum и Aspergillus fumigates, часто встречались светло- и темнопигментированные стерильные мицелии, Acremonium sp. и Aureobasidium pullulons. Почва варианта с биосорбентом характеризовалась обилием Fusarium moniliforme и темноокрашенного стерильного мицелия и в меньшей степени - представителей Fusarium solani, Paecilomyces lilacinus, P. variotii, Phialospora sp. и Gliocladium deliquescens, входящего в состав биосорбента. Внесение грибной композиции привело к появлению среди доминантов Pénicillium funiculosum и Trichoderma hamatum, характерных для фоновых почв и видов из грибной композиции (Acremonium alcalophilum и Fusarium solani).

Влияние биопрепаратов на численность эколого-трофических групп микроорганизмов и биологическую активность почв. Необходимо отметить избирательное стимулирование биопрепаратами различных физиологических групп микроорганизмов: препарат «Элита-комплекс» активизирует развитие сахаролитиков и микроорганизмов, усваивающих минеральный азот, «Сорбонафт» - аммонификаторов и сахаролитиков, грибная композиция - аммонификаторов и олигонитрофилов с азотфиксаторами.

Максимальные значения АД отмечены в почвах со сроком загрязнения 6.5 мес. без предварительной рекультивации (25.8 ± 0.2 мкл Н2/г субстрата/ч) при использовании препарата «Элита-комплекс». При внесении грибной композиции и биосорбента дегидрогеназная активность была ниже - на уровне 10.3 ± 0.4 и 12.7 ± 2.5 мкл Н,/г субстрата/ч для почв 6.5-месячного загрязнения без рекультивации соответственно.

Корреляция между БМ и АД составляет в разных вариантах 0.70-0.78, что говорит о высокой ферментативной активности почвенных микроорганизмов.

Наибольшая полифенолоксидазная активность характерна для засоленных лу-гово-каштановых нерекультивированных почв с внесением грибной композиции при загрязнении 5 и 18 мес. назад, а также с внесением биосорбента в нерекульти-вированную почву с пятимесячным сроком загрязнения. В остальных вариантах полифенолоксидазная активность нефтезагрязненных почв была незначительной или отсутствовала.

Влияние биопрепаратов на уровень остаточного содержания нефти в почвах. Использование бактериальных и грибных биопрепаратов привело к активизации нефтедеструкции в изучаемых почвах (рис. 3).

Показано, что в течение 1.5 мес. происходит изменение состава нефтепродуктов при самоочищении почвы от свежего нефтяного загрязнения и под влиянием биологической рекультивации (рис. 4).

Минимальные значения остаточного содержания нефти отмечены для почв со свежим загрязнением (34.6%) и образцов с загрязнением 5 мес. назад с предварительной рекультиваций (32.4% от исходного количества). Максимальные значения содержания нефти отмечены в почвенных образцах со старым загрязнением 18 мес. (92% в контроле для нерекультивированных почв и 90% при использовании препарата «Элита-комплекс» в образцах с предварительной рекультивацией).

Сравнительное изучение влияния биопрепаратов на деградацию нефти показало, что наибольшее снижение концентрации нефти отмечено в почвах со свежим

Рис. 4. Газо-жидкостная хроматография метанонафтеновой фракции нефти в пробах засоленных лугово-каштановых почв со свежим загрязнением.

1 - контроль, 2 - грибная композиция, 3 - «Элита-комплекс», 4 - биосорбент

Влияние препаратов на содержание нефтн в почвах через 1.5 мес. (мг/кг В.С.П.).

Возраст загрязнения, Содержание нефти до Контроль Биопрепарат

(без внесения «Элита- Грибная Биосорбент

мес. эксперимента препаратов) юмплекс» композиция

1.5 85090 ±4255 51280 ± 2564 30360* 1518 40600 *2030 29480 ± 1474

6.5 47800 ±2390 39100± 1955 37400* 1870 33260* 1663 30530* 527

19.5 25890 ± 1295 19900 ± 995 21500 ± 1075 19400*970 18800 * 940

загрязнением (до 66% от начальной концентрации) (табл. 6). В почвах с загрязнением сроком 5 и 18 мес. деградация нефти проходила значительно медленнее. Связано это с тем, что в почвах со старым нефтяным загрязнением содержание легкодоступных для микроорганизмов фракций нефти уменьшается и увеличивается доля трудно разлагаемых битумных веществ. Скорость разложения нефти была минимальной в контроле (без внесения грибной композиции и других биопрепаратов); значение коэффициента биодеградации составляет 0.79.

Максимальное уменьшение содержания нефти установлено при использовании биосорбента (содержание нефти в свежезагрязненных почвах снизилось на 65.4%, в почве с 18-месячным загрязнением - на 31.3%). Биопрепарат компании «Элита-комплекс» показал высокую активность при разложении свежей нефти (содержание нефти снизилось примерно на 64% от начальной концентрации), в то время как в вариантах с загрязнением 5 и 18 мес. его эффективность была низкой (на уровне 22%).

Ускорение процесса деструкции нефти при внесении биопрепаратов подтверждается результатами анализа активности фермента дегидрогеназы. Наибольшие значения АД отмечены в почвах, в которые были внесены бактериологические препараты (табл. 7).

Итак, установлено, что действие препаратов на деструкцию нефти и микобио-ту засоленной лугово-каштановой почвы зависит от возраста нефтяного загрязнения. В почвах со свежим загрязнением содержание нефти уменьшалось быстрее, чем в почвах со старым загрязнением. Снижение содержания нефти было наиболее эффективным при внесении в засоленную лугово-каштановую почву грибной композиции и биосорбента (табл. 8).

Таблица 7

Активность фермента дегидрогеназы в засоленных лугово-каштановых почвах, мкл Нг/г субстрата/ч

Возраст нефтяного загрязнения, мес. Контроль Биосорбент «Элита-комплекс» Грибная композиция

1.5«-» 0 6.4 ±0.5 9.7 ±0.4 6.8 ±0.4

6.5 «-» 1.4 ±0.7 12.7 ±2.5 25.8 ±0.2 10.3 ±0.4

6.5 «+» 0.3 ±0.2 9.0 ±0.8 10.9 ±0.2 9.7 ±0.4

19.5 «-» 0.09 ±0.02 5.2 ± 1.9 0.9 ± 0.4 0.9 ±0.1

19.5 «+» 0.2 ±0.1 5.1 ±0.9 16.0 ±3.1 14.2 ±0.1

Примечание: «-» - отсутствует предварительная рекультивация, «+» - проводилась предварительная рекультивация препаратом «Элита-комплекс».

Котфф::::::е:і!:.! бнодеградацин н-алкапов в образцах засоленных лугово-каштановых почв, загрязненных свежен нефтью

Препарат

£(Пристаи+фитан)/ £( н-гептадекан + н-октодекан)

(< С25) / (>С23) (отношение легюй фракции к тяжелой фракции)

Биосорбент «Элита-комплекс» Грибная композиция Самоочищение Чистая нефть

Отношение четных н-алканов к нечетным н-алканам

2.12 1.11 2.75 0.79 0.65

1.32 1.75 1.15 2.53 2.03

0.90 0.94 0.91 0.94 0.95

Полученные нами результаты коррелируют с показателями базального дыхания исследуемых почв (рис. 5). Интенсивное почвенное дыхание отмечено в почвах, загрязненных 19.5 мес. назад«-» при использовании препарата «Элита-комплекс»; количество выделившегося С02 практически совпадает с базальным дыханием почвенных образцов с загрязнением нефтью 6.5 мес., в которые был внесен биосорбент и бактериальный препарат. Применение грибной композиции повышает дыхание только в почвенных образцах со свежим загрязнением и уступает препарату «Элита-комплекс» и биосорбенту в вариантах с более старыми загрязнениями (6.5 и 19.5 мес.).

400 350 300 250 200 150 100 50 0

350 300 250 200 150 100 50 0

—¿1

- л ■ І-"-' .....І'"...... ......... гг.......... -........-.....Зз

1 Б5 18

.....л...... -ЇГ — _____";_......'

18

1 5

Рис. 5. Базальное дыхание в почвенных образцах в засоленной лугово-каштановой почве разного возраста загрязнения. А - без предварительной рекультивации, Б - с предварительной рекультивацией.

1 - биосорбент, 2 - «Элита-комплекс» 3 - грибная композиция, 4 - контроль.

Выделены основные факторы, влияющие на деградацию нефти и изменение биологической активности почв: возраст нефтяного загрязнения, проведение предварительной рекультивации или ее отсутствие, а также вид биопрепарата для очистки от загрязнения (табл. 9).

Таблица 9

Влияние факторов на показатели биологической активности засоленной лугово-каштановой почвы

Показатель Факторы Число степеней свободы Доля общей дисперсии, обусловленная фактором, % Критерий Фишера

Базальное Возраст 3 4% 1.05

дыхание Пр едв ар ите ль ная 1 6% 5.14

рекультивация

Препарат 4 63% 12.75

Содержание Возраст 3 18% 16.38

нефти Предварительная 1 3% 7.94

рекультивация

Препарат 4 72% 50.22

Активность Возраст 3 7% 1.06

дегицрогеназы Предв^зительная 1 0% 0.13

рекультивация

Препарат 4 53% 5.84

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Определен уровень нефти, при котором происходят существенные изменения в структуре почвенных микроорганизмов в засоленных лугово-каштановых почвах и соровых солончаках. На них предлагается ориентироваться при разработке рекомендаций по их рекультивации.

Установлено, что уже при дозе нефти 0.2% имеет место резкое сокращение численности микромицетов и изменение относительного обилия видов в микро-боценозе. Происходят также изменения в структуре эколого-трофических групп микроорганизмов. Резко снижается численность целлюлозолитических и сахаро-литических микроорганизмов.

Микробиота лугово-каштановых почв и особенно соровых солончаков менее устойчива к загрязнению нефтью, чем незасоленные почвы. Если в этих почвах заметные модификации в структуре микробного комплекса и ферментативной активности установлены при небольшом загрязнении нефтью (0.2%), то в торфяниках, например, такие изменения в микобиоте отмечали при значительно более высоком содержании нефтепродуктов (Терехова, 2007; Рафикова, 2008; Хабибулли-на, Ибатуллина, 2011).

Кардинально отличается скорость самовосстановления от нефти засоленной лугово-каштановой почвы и сорового солончака. Самоочищение лугово-каштано-

вых почв довольно активно проходит при нефтяном загрязнении на уровне 0.21.0%. снижение содерж-ания нефти составляет 42-63% в течение года. Самовосстановление этих почв не прекращается и при более высоком содержании нефти (5, 10%), но интенсивность его ниже. Микробиота соровых солончаков уже при концентрации нефти 0.2% не способна быстро восстановить первоначальную структуру, а убыль нефтяных углеводородов по истечении года не превышала нескольких процентов от исходного количества, т.е потенциал к самовосстановлению у этих почв крайне низок.

Из засоленных лугово-каштановых почв выделены микроорганизмы, способные проявлять углеводородокисляющую активность при повышенном содержании солей в субстрате: представители родов Fusarium, Pénicillium, Candida и ряд других.

Показано, что использование биопрепаратов повышает биологическую активность нефтезагрязненной засоленной лугово-каштановой почвы и активизирует в ней процессы разложения поллютанта. Применение биопрепаратов приводит к снижению токсичности нефтезагрязненных почв по отношению к живым организмам. Максимальное увеличение скорости деструкции нефти разного возраста загрязнения засоленной лугово-каштановой почвы установлено при применении биосорбента «Сорбонафт».

ВЫВОДЫ

1. Влияние нефтяного загрязнения на микробиоту засоленных лугово-каштановых почв и соровых солончаков проявляется уже при концентрации 0.2%. Низкие концентрации нефти активизировали развитие дрожжевых грибов и микроорганизмов азотного цикла в почвах. Увеличение концентрации нефти приводит к значительным изменениям в структуре микромицетов и эколого-трофических групп микроорганизмов. В почвах растет относительная доля фитотоксичных и условно патогенных микромицетов. Наиболее чувствительной группой микроорганизмов являются целлюлозолитические микроорганизмы: при небольших концентрациях нефти их численность повышалась, а более высокие дозы нефти (1-5% и выше) приводили к подавлению их развития. Процесс самоочищения почв от нефти сопровождался восстановлением численности аммонификаторов, олиготрофов и азот-фиксаторов с олигонитрофилами.

2. Интенсивность самовосстановления нефтезагрязненных засоленных лугово-каштановых почв значительно выше (деградация нефти составила 30-60% за год) по сравнению с соровыми солотаками (0.1-1.7%). Это обусловлено существенно большей биологической активностью и запасами микробной биомассы в лугово-каштановых почвах. В сравнении с другими почвами (торфяно-глеевые -дерново-подзолистые - серые лесные - черноземы) засоленные лугово-каштано-вые почвы и солончаки характеризуются меньшим потенциалом самовосстановления.

3. Определены основные факторы, влияющие на биологическую активность и способность засоленных почв к самоочищению от нефти: тип почвы, возраст (срок) загрязнения, концентрация нефти.

4. Выделены и испытаны микроорганизмы, способные к деградации нефтяных углеводородов в условиях повышенного засоления почв. Они могут быть исполь-

зованы для составления активных композиций микроорганизмов для рекультивации нефтезагрязненных почв.

5. На эффективность биологических препаратов для нефтеочистки засоленных лугово-каштановых почв влияет возраст загрязнения и состав биопрепарата. В почвах со старым нефтяным загрязнением скорость деструкции ниже, чем в почвах с более свежим. Установлены различия в действии биологических препаратов на микробиоту почв: препарат «Элита-комплекс» активизирует развитие саха-ролитиков и актиномицетов, биосорбент - деятельность аммонификаторов и саха-ролитиков, грибная композиция - аммонификаторов, олигонитрофилов и азотфик-саторов. Снижение содержания нефти было наиболее эффективным при внесении в засоленную лугово-каштановую почву грибной композиции и биосорбента.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ Статьи в журналах, рекомендованных ВАК

1. Ибатуллина И.З., Семенова Т.А., Виноградова Ю.А, Кураков A.B., Яковлев A.C. Влияние биопрепаратов на микобиоту нефтезагрязненных засоленных лугово-каштановых почв. Микология и фитопатология. 2011, том 45, вып. 6, стр. 40-48.

2. Хабибуллина Ф.М., Ибатуллина И.З. Изменение структуры и состава мик-робиоты нефтезагрязненных торфяно-глеевых почв Крайнего Севера в процессе самоочищения и рекультивации // Теоретическая и прикладная экология. №3, 2011, стр. 76-86.

3. Ибатуллина И.З., Виноградова Ю.А., Хабибуллина Ф.М. Микробиота засоленных лугово-каштановых почв Ставропольского края при загрязнении нефтью и биорекультивации»//Изв. СамарскогоНЦРАН,т. 13, № 1(5). 2011, стр. 1194-1199.

4. Ибатуллина И.З., Семенова Т.А., Яковлев A.C. Особенности биодеградации нефти в лугово-каштановых почвах Ставропольского края. Почвоведение, № 3,2012, стр. 376-384.

Изобретения и патенты

5. Патент № 2299181, Российская Федерация, МПК6 C02F 3/34C12N 1/26 C12R 1/77 C12R 1/645. Биосорбент для очистки водной поверхности от нефти и нефтепродуктов / Ф.М. Хабибуллина, И.Б. Арчегова, И.З. Ибатуллина и др.; ИБ Коми НЦ УрО РАН; № 2005124814/13; от 03.08.2005; опубл. 20.05.2007. Бюл. № 14.

Статьи в сборниках

6. Терехова В.А., Ибатуллина И.З., Пацаева C.B., Хомякова Д.В. Анализ совместимости и нефтедеградационной активности почвенных микромицетов и бактерий. Матер. Междунар. конф. «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды». Саратов, 14-16 сентября 2005.

7. Терехова В.А., Ибатуллина И.З. Взаимодействие грибов и бактерий в ходе очистки нефтесодержащих природных сред. Матер. Междунар. конф. «Грибы и водоросли в биоценозах - 2006», М., 31 янв.-З фев. 2006.

Материалы н тезисы российских и зарубежных международных конференций

8. Ибатуллина И. Изучение процесса самоочищения нефтезагрязиенных почв Западного Казахстана (месторождение Северные Бузачи). Матер. Всерос. науч. конф. «XIV Докучаевские молодежные чтения». СПб., 2011.

9. Ибатуллина И.З., Яковлев A.C. Особенности трансформации микробиоты нефтезагрязиенных лугово-каштановых почв Ставропольского края под воздействием биопрепаратов. Матер. Междунар. конф. «Ресурсный потенциал почв - основа продовольственной и экологической безопасности России». СПб. 2011.

10. Ибатуллина И.З. Виноградова Ю.А. Изменение структуры и состава микробиоты лугово-каштановых солончаковатых почв после нефтяного загрязнения в процессе самоочищения и биологической рекультивации. Тез. Междунар. науч. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010». М., 2010.

11. Ибатуллина И.З. Ферментативная активность в засоленных нефтезагрязиенных почвах при биорекультивации. Матер. Всерос. науч. конф. «XII Докучаевские молодежные чтения». СПб., 2009.

12. Постникова Т.О., Ибатуллина И.З. Характеристика совместимости микроорганизмов - биодеструкторов нефти. Матер. XII Междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005». М., 12-16 апр. 2005.

13. Хабибуллина Ф.М., Терехова В.А., Арчегова И.Б., Ибатуллина И.З., Яковлев A.C. Микосорбент для очистки водной поверхности от нефтяных загрязнителей. VIII междунар. семинар-презентация инновационных науч. и техн. проектов. Пущино, 2005.

14. Попутникова Т.О., Ибатуллина И.З. Влияние органо-минерального сорбента на биоремедиацшо нефтезагрязиенных почв. Матер. Всерос. науч. конф. «IX Докучаевские чтения «Почвы России. Проблемы и решения». СПб., 1-3 мар. 2006.

15. Терехова В.А., Попутникова Т.О., Ибатуллина И.З. Оценка экологической токсичности нефтезагрязненных почв и биопрепаратов по стандартным биотестам. Матер. IV Междунар. конф. «Освоение Севера и проблемы природовосста-новления». Сыктывкар, 10-14 окт., 2006.

16. Тыныбаева Т.Г., Ибатуллина И.З., Кураков A.B. Биотестирование токсичности соровых солончаков, насыпных грунтов и отходов на газо-нефтяном месторождении Северные Бузачи (Казахстан). Междунар. науч. конф. «Современные проблемы загрязнения почв». Сб. матер. Ф-т почвоведения МГУ, М., 2007.

17. Ибатуллина И.З. Биологическая активность нефтезагрязненных засоленных почв Ставропольского края. Матер. Междунар. науч. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008». М., 2008.

18. Ибатуллина И.З. Создание микробиологического препарата для проведения рекультивации нефтезагрязненных засоленных почв. Тез. Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием «Фундаментальные достижения в почвоведении, экологии, сельском хозяйстве на пути к инновациям». М., 23-25 апр., 2008.

19. Ибатуллина И.З. Курапова А.И. Перспективы использования аборигенных микроорганизмов для очистки нефтезагрязненных засоленных почв Ставропольского Края. Матер. Междунар. науч.-практ. конф. «Плодородие почв - уникальный природный ресурс - в нем будущее России». XI Докучаевские чтения. СПб., 2008.

20. Ибатуллина И.З. Ферментативная активность в засоленных нефтезагрязненных почвах при биорекультивации. Всерос. науч. конф. XII Докучаевские мо-

лод. чтения, поев. 130-летию первой генетической почвенной классификации В.В. Докучаева «Почвы и продовольственная безопасность России». 2-6 мар. 2009 г. СПб.

21. F.M. Khabibullina, I. IbatulHna. Soil micromycetes in the vicinity ofthe Uchta petroleum refinery// International conference on Alpine and Polar Microbiology. Innsbruck (Austria), 2006. P. 94

22. F.M. Khabibullina, I. Ibatullina, V. Terekhova, I. Archegova. A mycosorbent cleaning oil-polluted water-bodies//International Conference on Alpine and Polar Microbiology. Innsbruck (Austria), 2006. P. 94.

23. F.M. Khabibullina, I.B. Archegova, A.A. Shubakov, I.Z. Ibatullina. Microorganisms for oil decontamination in the north// 13th International Biodeterioration and Biodégradation symposium. Madrid (Spain), 2005. P. 124.

24. Ibatullina I., Khabibullina F. Mycobiota of peat-gleyic soils during the process of recultivation. Organic soils: Impact of land-use change on peat lands degradation» in the debate Soil System Sciences during European Geosciences Union, General Assembly, Vienna, Austria, 19-24 April 2009.

Благодарности. Выражаю глубокую признательность научным руководителям д.б.н. А.С. Яковлеву и д.б.н. А.В. Куракову за плодотворное сотрудничество, консультации и ценные советы. Искренне признательна сотрудникам кафедры земельных ресурсов и оценки почв за интерес к работе и полезные советы. Сердечно благодарю Хабибуллину Ф.М., Семенову Т. А., Терехову В.А., Завгороднюю Ю.А., Васенева В.И., Курапову А.И., Манучарову Н.А., Степанова A.JI., а также сотрудников кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова за неоценимую помощь в работе, поддержку и ценные советы.

Подписано в печать:

20.02.2012

Заказ № 6683 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ибатуллина, Инна Зайтуновна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.

ЛОМОНОСОВА ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ

КАФЕДРА ЗЕМЕЛЬНЫХ РЕСУРСОВ И ОЦЕНКИ ПОЧВ

61 12-3/607

На правах рукописи ИБАТУЛЛИНА Инна Зайтуновна

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И ВОССТАНОВЛЕНИЕ ЗАСОЛЕННЫХ ПОЧВ ПРИ НЕФТЯНОМ ЗАГРЯЗНЕНИИ

03.02.08 - экология 03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

д.б.н., проф. Яковлев A.C. д.б.н., проф. Кураков A.B.

Москва - 2012

Содержание

Содержание................................................................................................................2

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................7

ГЛАВА 1.Нефтяное загрязнение: воздействие на почвы и биоту.................7

1.1. Влияние нефти и нефтепродуктов на морфологические и физико-химические свойства почвы................................................................................7

1.2. Влияние нефти и нефтепродуктов на растения и почвенные животные.............................................................................................................12

1.3. Влияние нефти на почвенные микроорганизмы......................................13

1.4. Ферментативная активность нефтезагрязненных почв...........................18

ГЛАВА 2. Рекультивация нефтезагрязненных почв.....................................22

2.1 Самовосстановление нефтезагрязненных почв........................................22

2.2 Рекультивация нефтезагрязненных почв...................................................23

ГЛАВА 3. Нормирование допустимого содержания нефтепродуктов в почве...................................................................................................................31

3.1 Предельно допустимые концентрации (ПДК) нефтяных углеводородов в почве.......................................................................................31

3.2 Разработка допустимых остаточных концентраций нефти в почве (ДОСНП).............................................................................................................32

3.3. Потенциал самоочищения почв.................................................................41

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................................42

1.1. Характеристика объектов исследования..................................................42

1.1.1. Почвы......................................................................................................42

1.1.2. Основные характеристики нефти......................................................43

1.1.3. Описание микробиологических препаратов.......................................43

1.2. Методы исследования.................................................................................44

1.2.1. Определение агрохимических показателей почв................................45

1.2.2. Определение содержания нефтепродуктов.......................................45

1.2.3. Определение н-алканов (С14 - С22) в почве.......................................46

1.2.4. Посев и учет численности микроорганизмов.....................................47

1.2.5. Определение биомассы микроорганизмов методом люминесцентной микроскопии.....................................................................49

1.2.6. Определение ферментативной активности почв.............................50

1.2.7. Определение эмиссии диоксида углерода из почв...............................52

2

1.2.8. Выделение чистых культур нефтеокисляющих микроорганизмов.. 53

1.2.9. Анализ совместимости культур нефтеокисляющих микроорганизмов............................................................................................53

1.2.10. Проверка способности выделенных микроорганизмов использовать нефть в качестве источника питания...............................53

1.2.11. Исследование способности грибной композиции к деградации нефтяных углеводородов в дерново-подзолистой почве...........................54

1.2.12. Биотестирование экологическойтоксичности...............................54

Изучение интенсивности самоочищения засоленных почв от нефти55

Изучение эффективности применения биопрепаратов и грибной композиции для очистки нефтезагрязненных лугово-каштановых почв...........................................................................................................56

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ........................................................................58

Влияние нефтяного загрязнения на микробиоту засоленных лугово-каштановых почв и соровых солончаков........................................................58

Способность к самовосстановлению нефтезагрязненной засоленной лугово-каштановой почвы................................................................................63

Способность к самовосстановлению нефтезагрязненных соровых солончаков.........................................................................................................74

Анализ факторов, влияющих на самоочищение засоленных почв от нефти .............................................................................................................................83

Грибная композиция для рекультивации засоленных почв от нефтяного загрязнения........................................................................................................86

Подбор микроорганизмов, определение их углеводородокисляющей активности..........................................................................................................89

Влияние биопрепаратов на микробиоту засоленных лугово - каштановых почв.....................................................................................................................93

Факторы, влияющие на деградацию нефти и биологическую активность почв...................................................................................................................118

ВЫВОДЫ...............................................................................................................125

Список литературы...............................................................................................127

Приложение...........................................................................................................154

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Ежегодно в мире при добыче, транспортировке, хранении и использовании нефти и нефтепродуктов в окружающую среду попадает около 50 млн. т углеводородов. Ситуация усугубляется сопутствующими высокоминерализованными

нефтепромысловыми водами и наличием токсичных реагентов в используемых при добыче нефти растворах (Рахимова и др., 2005). В результате неконтролируемых выбросов солесодержащих техногенных и природных вод из скважин концентрация солей в почве может возрасти на несколько порядков. Максимум концентрации солей и битуминозных веществ локализуется в органогенных горизонтах. Нефтедобыча часто ведется в южных регионах, где загрязнению нефтью подвергаются засоленные почвы, солончаки.

Загрязнение нефтью и высокоминерализованными

нефтепромысловыми водами приводит к глубоким изменениям морфологических, агрохимических, водно-физических и биологических свойств почв (Минибаева и др., 1986; Кураков и др. 2006; Atlas, 1995; Bastida et al., 2010; Yadav, Hassanizadeh, 2011 и др.). При одновременном воздействии нефти и солей для функционирования педобионтов создаются экстремальные условия, что снижает возможность самовосстановления почв и наземных биоценозов (Shaoping Kuang et al., 2011, Filatov et al., 2011; и др.).

Несмотря на имеющийся обширный мировой опыт рекультивации нефтезагрязненных земель, среди исследователей нет единого мнения о преимуществах того или иного метода. В разных почвенно-климатических зонах скорость самовосстановления нефтезагрязненных почвенных экосистем сильно варьирует. В связи с этим необходимы многолетние региональные исследования в лабораторных и полевых условиях с целью подбора наиболее оптимальных и рентабельных методов ремедиации

техногенно нарушенных земель с учетом свойств почвы, состава и концентрации нефти в почве, ее податливости к деградации, ферментативной активности естественной микробиоты (Савкина, 1979; Сухова и др., 2002; Терехова, Семенова, 2001; Margesin et al., 1999, 2000).

Разработка средств очистки почвы от нефтяных загрязнений представляет собой активно развивающееся направление экологии и биотехнологии. Имеющиеся в научной литературе данные свидетельствуют о том, что ассоциации микроорганизмов способны более полно и быстро разлагать углеводородные субстраты по сравнению с индивидуальными штаммами (Горленко, Кузнецова, 1966; Андерсон и др., 1994; Войкова, Конев, 1994). Иммобилизация биологических препаратов на носителях позволяет ещё более увеличить эффективность и сократить время очистки. Все это делает современные технологии ремедиации нефтезагрязненных объектов дорогими, трудоемкими и снижает их привлекательность для нефтедобывающих предприятий. Поэтому поиск приемов, позволяющих упростить процесс рекультивации нефтезагрязненных почв без потерь ее качества, является актуальным, в особенности, при проведении восстановительных работ в районах распространения засоленных почв.

Восстановление аридных территорий в настоящее время является актуальной проблемой. Рекультивация этих земель осложняется сухим климатом (Yadav et al., 2011), сильными ветрами, засолением почв и высокой минерализацией грунтовых и поверхностных вод. В связи с этим актуально создание препаратов на основе галотолерантных видов микроорганизмов, способных функционировать и использовать нефть в качестве источника углеродного питания при повышенной минерализации субстрата.

В Ставропольском крае РФ, входящем в состав Прикаспийской нефтегазоносной провинции, разработка месторождений проводится уже около 150 лет, что привело к значительному загрязнению территории.

В Республике Казахстан, месторождение Северные Бузачи эксплуатируется с 90-х годов на крайне засоленных почвах, соровых солончаках.

Изучение и мониторинг биологических, химических и агрохимических показателей почв являются необходимыми при проведении очистки территорий от нефтяных загрязнений.

Сведений об интенсивности деградации нефти в засоленных лушво-каппановых почвах Ставропольского края и соровых солончаках Республики Казахстан мало, как и данных о воздействии нефти на микробному засоленных почв (Булатов и др., 1997). Можно полагать, что засоленность почв, жаркий и сухой вегетационный сезон будут негативно влиять на способность почв к самоочищению. Поэтому актуальными являются изучение влияния нефти на микробиоту данных почв, определение скорости разложения в них нефти, а также поиск и оценка биологических методов их восстановления.

Целью работы было исследование влияния нефтяного загрязнения на биологическую активность засоленных лугово-каштановых почв и соровых солончаков, интенсивности их самовосстановления и эффективности применения биологических препаратов для рекультивации. Задачи:

1. Изучить микробиологические свойства засоленных лугово-каштановых почв Ставропольского края Российской Федерации и соровых солончаков Северо-Западного региона Казахстана

2. Определить влияние нефтяного загрязнения на микробиоту и биологическую активность засоленных лугово-каштановых почв и соровых солончаков и оценить интенсивность их самовосстановления.

3. Выявить микроорганизмы, способные к деструкции нефти в засоленных почвах и подобрать микробную ассоциацию для разложения нефтяных углеводородов в этих условиях

4. Оценить эффективность биологических препаратов для очистки засоленных лугово-каштановых почв от нефтяного загрязнения.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1.Нефтяное загрязнение: воздействие на почвы и биоту

1.1. Влияние нефти и нефтепродуктов на морфологические и физико-химические свойства почвы

Степень изменения почв зависит от времени загрязнения, ландшафтно -геохимических особенностей местности, состава и количества нефтяных отходов (Орлов и др., 2000). Нефть представляет собой комплекс углеводородов - алифатических, алициклических и ароматических соединений и азот-, серо- и кислородосодержащих органических компонентов (National Research Council, 1985; Киреева и др., 2000; Пиковский и др., 2003).

Особенностью нефти является наличие помимо линейных углеводородов сопутствующих веществ. Сюда входят полициклические углеводороды, тяжелые металлы, радиоактивные металлы, углеводородные газы, сероводород, минерализованные пластовые и сточные воды, рассолы, соли щелочных металлов, высокие концентрации солей натрия (Солнцева, 1988, Соловьева, 2005).

Значительное влияние на природные системы оказывают твердые метановые углеводороды (парафины), содержание которых в нефти достигает 15-20 %. Парафины содержатся практически во всех нефтях, влияют на ее вязкость и устойчивость поллютантов в природных системах. Твердый парафин плохо разрушается и с трудом окисляется (Сангаджиева, 2004).

Ароматические углеводороды наиболее токсичные компоненты нефти.

Наиболее опасна группа полиароматических углеводородов (ПАУ),

являющихся продуктами неполного сгорания ископаемого топлива и

органических веществ. Некоторые низкомолекулярные ПАУ обладают

острой токсичностью, а большая часть высокомолекулярных ПАУ

7

относится к канцерогенам, терратогенам и генотоксикантам. Среди них наиболее опасными являются углеводороды с пятью конденсированными кольцами (3,4-бензпирен; 1,2,5,6-дибензантраценыидр.).

Среди морфологических изменений при нефтяном загрязнении в почвах отмечают следующие - интенсивное образование кутан по граням структурных отдельностей, смену окраски почвенных горизонтов с последующим преобладанием серых и темно-коричневых оттенков, а так же ухудшение структуры почвы (Киреева и др., 2001).

Из-за образования гидрофобной нефтяной пленки на поверхности

почвенных частиц и агрегатов, почва лишается способности адсорбировать

и удерживать влагу, для нее характерны пониженные по сравнению с

незагрязненными почвами значения гигроскопической влажности,

водопроницаемости и влагоемкости. Глубина просачивания нефти в

зависимости от уровня загрязнения может ограничиваться только верхними

горизонтами (до 5-15 см) (Пиковский, 1988) или достигать 1-2 метров, а

мощность битуминозного слоя - 40-50 см. При этом верхняя часть гумус

содержащего горизонта приобретает смолисто-черную окраску, происходит

склеивание отдельных структурностей. Размеры вертикальной и

горизонтальной миграции можно прогнозировать (Булатов и др., 1997;

Солнцева, 1998). Немаловажную роль в процессах миграции нефтяного

загрязнения играет сорбционная способность почво-грунтов. Она зависит от

физико-химических свойств грунтов, в первую очередь от капиллярных сил,

которые определяются гранулометрическим составом грунта и его

влажностью. Зависимость миграции нефти и нефтепродуктов в почвах от

уровня их влажности подтверждена экспериментально и показана

расчетными методами (Солнцева, 1998): чем сильнее увлажнена почва, тем

меньше возможность внутрипочвенного закрепления нефти и тем выше

активность ее радиального и латерального перемещения. При высоком

загрязнении почв глубина проникновения нефти и нефтепродуктов может

достигать значительных величин: в почвах Западной Сибири - на глубину

8

1,5 м, в южной тайге в дерново-подзолистых пахотных почвах - глубже 1.52.0 м; в лесостепи в пойменных луговых почвах - глубже 2.0 м. Вспашка верхних горизонтов почв усиливает радиальное просачивание нефти, вследствие чего в пахотных почвах при одинаковой техногенной нагрузке нефть и нефтепродукты накапливаются в более глубоких горизонтах, чем в аналогичных целинных почвах. Наиболее глубоко (до 8.5 м) нефтепродукты продвигаются в субстратах легкого механического состава — гравистых отложениях, песках, супесях, а также трещиноватых породах. По мере перемещения вниз уровень насыщения нефтью в грунте снижается. Ниже определенного уровня насыщения - уровня остаточного насыщения, составляющего 10-12 % (Булатов и др., 1997), нефть перестает мигрировать и становится неподвижной. Мигрируя по почвенному профилю, нефтяные углеводороды приводят к загрязнению грунтовых вод (Zhang et al., 1998; Zhang, 1998; Yadav, Hassanizadeh, 2011; Marinelli, Durnford, 1996; Кузнецов и др., 2000). При достижении нефтью уровня грунтовых вод дальнейшее движение ее вниз прекращается. При этом легкие фракции могут всплывать на поверхность. Кроме того, нефть перемещается по направлению естественного уклона поверхности грунтовых вод.

При высоком нефтяном загрязнении (150 мл/кг и выше) влага не просачивается, и верхний горизонт не увлажняется, транспирация влаги через загрязненные горизонты также затрудняется. В результате склеивания минеральных частиц и растительных остатков изменяется структура почвы. Таким образом, нефтяное загрязнение кардинально изменяет водно-воздушный режим почвы (Кураков, Гузев, 2003). В конечном итоге, нарушение аэрации почвенного профиля приводит к снижению окислительно-восстановительного потенциала, появлению устойчивых признаков восстановительных процессов (Савкина и др., 1979). В таких условиях затруднено разложение высокотоксичных нефтяных углеводородов микроорганизмами и они долго сохраняются в нижних частях почвенного профиля в анаэробной обстановке (Пиковский, 1993).

При постоянном нефтяном воздействии на почвенный покров в районах нефтедобычи формируются специфичные нефтегенные почвы (Ягубов и др., 2002). В загрязнённых почвах снижается емкость поглощения катионов (Гайнутдинов и др., 1988; Трофимов и др., 2000; Понасенко, 2002), изменяется содержание и состав гумуса, увеличивается общее содержание органического углерода. На фоне относительного снижения содержания гуминовых и фульвокислот в 1,5-3 раза увеличивается содержание негидролизуемого остатка до 71-80%, в составе которого возрастает содержание N и Р, и на 10% понижается степень гумификации органического вещества (Трофимов, Розанова, 2002; Кахаткина и др., 1985). Есть данные об увеличении доли фульвокислот в органическом в�