Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Самовосстановление и реабилитация природных биогеоценозов

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Самовосстановление и реабилитация природных биогеоценозов"

На правах рукописи

ИЛАРИОНОВ Сергей Александрович

САМОВОССТАНОВЛЕНИЕ И РЕАБИЛИТАЦИЯ ПРИРОДНЫХ БИОГЕОЦЕНОЗОВ

03.00.16 - экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Екатеринбург-2004

Работа выполнена в Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской Академии наук г. Пермь

Ведущая организация:

Институт биологии Республики Коми УрО РАН

Защита диссертации состоится 10 сентября 2004 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.067.02 при Уральской государственной сельскохозяйственной академии по адресу: 620219 г. Екатеринбург, ул. Карла Либкнехта, 42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уральской государственной сельскохозяйственной академии

Научный консультант:

Донник Ирина Михайловна доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты

Трапезников Александр Викторович доктор биологических наук

Тестов Борис Викторович доктор биологических наук, профессор

Ильязов Роберт Гиниятулович доктор биологических наук, профессор

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совещ^ — /

канд. вет. наук / В.М. Мельникова

2005-4 11910

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

От загрязнения нефтью и особенно нефтепродуктами страдают те районы, ще производится добыча, транспортировка и переработка нефти. При этом загрязненные участки выпадают из хозяйственного пользования, а их самовосстановление — процесс длительный и может занимать не один десяток лет (Н.П. Солнцева, Ю.И. Пиковский, 1980). О масштабах загрязнения углеводородами нефти можно судить по тому, что около трех процентов от добытой нефти попадает в окружающую среду (И.П. Иванов 1982). Так, в 2003 году в России было добыто 412 млн. тонн нефти - значит, что около 12,36 млн. тонн тем или иным путем попало в окружающую среду.

Другой особенностью нефтезагрязненых биоценозов является накопление в них канцерогенных и мутагенных полициклических ароматических углеводородов, которые могут сохраняться в загрязненной почве в течение длительного времени и тем самым представляют собой потенциальную опасность для всех живых организмов биоценоза (Д.С. Орлов и др., 2002 и др.). Так, в литературе описаны случаи возникновения в нефтезагрязненных районах уродливых форм растений, что свидетельствует о воздействии нефтяных углеводородов на их наследственный аппарат (М.Г. Попов, 1949; Н.Г. Несветайлова, 1953; Д. Куллини, 1981; D.W. Connel, G.J. Miller, 1981; В.Г. Грищенко, 1982).

Кроме того, известно, что при попадании углеводородов нефти в почву и их трансформации уменьшается доля всех собственных компонентов гумуса (Ю.И. Пиковский, 1993). В связи с этим, проблема загрязнения и восстановления территорий, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, является актуальной, особенно для нашей страны

Ситуация усугубляется в тех районах, где находятся крупнейшие месторождения нефти и для ее решения требуется учитывать такие факторы как короткий теплый период года, наличие вечной мерзлоты и высокую обводненность почв.

Процессы самоочищения, протекающие в нефтезагрязненной почве, зависят от многочисленных факторов, одним из которых является степень её загрязнения углеводородами нефти. При попадании в почву небольших доз сырой нефти наблюдается стимулирующий эффект (И.И. Шилова, 1988).

Нефтяные углеводороды могут аккумулироваться растениями, а затем передаваться по пищевой цепочке животным. Так, в хлороформенных экстрактах из растительной биомассы с площадок с 25-летним сроком загрязнения был обнаружен 3,4-бензпирен в концентрации, превышающей фоновые значения в 5 раз. Хлороформенные экстракты биомассы дождевых червей, собранных на площадках с 15-ним сроком загрязнения, содержали от 92,3 до 188,1 мкг/кг 3,4-бензпирена н его гомологов (АА. Оборин и др., 1988).

Сырая нефть по-разному воздействует на животный и растительный мир. Экспериментально установлено, что ингибирующий эффект действия сырой нефти на развитие различных видов водорослей наблюдается при концентрации от 10"5 до 1 мг/л, а при концентрации 10 мг/л наступает их гибель (P.P. Кабиров, Р.Г. Минибаев, 1982).

Изучение процессов самоочищения нефтезагрязненных территорий тесно связано с разработкой эффективных методов их рекультивации (восстановления). В настоящее время для очистки и восстановленпя нефтезагрязненных земель применяют механические, агрохимические и биологические методы.

Механические методы очистки направлены на сбор нефти с помощью различных автоматизированных и ручных приг.ппгпйвриий (Ьцчи1ггухм"м'"*'''гИ'' способы очистки основаны на использовании различного ЬсйЮ©е1*А4ЩО<1*ЛфЬНАв»> впитывают в себя углеводороды нефти, либо растворяют насть £ДОЛЙ1ВД£1Мфти, прочно связанных с

С.Петер ~ О» >0

частицами почвы. Биологические методы очистки нефтезагрязненной почвы на первом этапе используют мощный потенциал углеводородокисляющих бактерий. По способам очистки нефтезагрязненных участков с помощью микроорганизмов выделяют два подхода. Первый из них заключается в том, чтобы активизировать местную микробиоту нефтезагрязненной почвы, эффективно минерализующую углеводороды нефти. Второй подход предусматривает внесение в нефтезагрязненную среду консорциума или отдельных видов микроорганизмов, активно деградирующих сырую нефть и/или нефтепродукты. Либо применяют комбинированный метод, используя одновременно первый и второй подходы.

Цель настоящего исследования

Основная цель данной работы заключалась в выявлении общих закономерностей в процессах самовосстановления нефтезагрязненных почвенных биогеоценозов, а также разработке эффективных способов их восстановления.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи исследования:

1. Изучить процесс самовосстановления нефтезагрязненных почвенных экосистем и факторы, изменяющие его.

2. Определить состав и динамику численности микроорганизмов, участвующих в трансформации нефти в биогеоценозах, и оценить влияние прикорневой микрофлоры на процесс восстановления нефтезагрязненных территорий.

3. Исследовать основные причины, влияющие на фитотоксичность нефтезагрязненных почв, и определить основные виды многолетних растений, устойчивых к нефтяному загрязнению.

4. Оценить влияние отходов нефтедобывающей промышленности на объекты окружающей среды и разработать метод их ликвидации.

5. Разработать метод реабилитации территорий, загрязненных нефтью, на основе активирования микробиоты и применения вермикультуры.

Научная новизна и теоретическая значимость

Впервые предложена новая концепция восстановления нефтезагрязненных территорий, которая основывается на трансформации углеводородов нефти их в нетоксичные соединения, что позволяет частично сохранить в почве углерод углеводородов нефти и ускорить сроки восстановления нарушенных биоценозов.

Изучены количественные и качественные изменения, происходящие с углеводородами нефти в почве; оценено их влияние на микроорганизмы, а также представителей животного и растительного мира почвенного биоценоза. Установлено, что отмирание растений на нефтезагрязненных почвах происходит не в результате прямого воздействия углеводородов нефти, а путем воздействия токсинов, вырабатываемых почвенными микромицетами при использовании ими углеводородов нефти.

Практическая ценность

Для ускоренного восстановления нефтезагрязненных биоценозов разработан оригинальный метод детоксикации, позволяющий в короткий срок проводить ремедиацию нефтезагрязненных почвенных биоценозов.

Предложен метод восстановления нефтезагрязненных биоценозов путем использования для деструкции нефтяных углеводородов прикорневой нефтеокисляющей микробиоты.

Выделен и описан в чистую культуру новый вид ОовСопа атюа1в ер. поу.,-углеводородокисляющий микроорганизм, который зарегистрирован в Немецкой коллекции микроорганизмов как вид ОовСопа атюа1в 1ЕОМ (ЛБ 101418).

Для активирования почвенного биоценоза, подвергнутого нефтяному воздействию, разработан биопрепарат, основой которого являются термокаталитически обработанные растительные остатки с введенной в них нефтеокисляющей бактериальной культурой Gordonia amicalis sp. nov. Предложен метод восстановления нефтезагрязненных земель с помощью вермикультуры, который позволяет отказаться от идеи о полной деструкции нефтяных углеводородов, а напротив сохранить их в почве в трансформированном в гумусоподобное соединение. Данный метод позволяет в течение 2-х месяцев подготовить загрязненную почву для последнего этапа её восстановления - фиторекультивации. Кроме того, он позволяет сохранить углерод углеводородов нефти в нетоксичном гумифицированном виде.

Результаты работы реализованы: в практических рекомендациях по оценке уровня загрязнения земли углеводородами нефти для АО «Сургутнефтегаз», руководящум документе, созданном совместно с ПермНИИБ, рекомендацях, для создания технологий, которые применялись на практике при очистке нефтезагрязненных территорий в различных почвенко-климатических зонах.

Разработан метод получения фермента лизоцима из биомассы червя Esenia fetida, культивирование которого производилось при обработке нефтезагрязненного грунта.

Практические результаты работы реализованы на территории АО «Сургутнефтегаз», АО «Ноябрьскнефтегаз», ПО «Главтюменефтегаз», «ВерхнеВолжские нефтепроводы» (г. Н.-Новгород), «Пурнефтегаз» (совместно с ООО «Агроэкология»), ООО «Лукойл-Пермнефть», ООО «СИБУРхимпром».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный метод рекультивации нефтезагрязненных территорий, заключающийся в осуществлении перевода вредных для роста и развития живых организмов и растений в нетоксичные соединения, участвующие в почвообразовательном процессе, то есть осуществление детоксикации почвы, а не полную очистку ее от веществ-загрязнителей.

2. Использование в процессе восстановления нефтезагрязненных земель различных мелиорантов, в частности, мочевины, позволяющих трансформировать часть углеводородов нефти в гумусоподобное вещество.

3. Использование в ремедиации нефтезагрязненной почвы аборигенных почвенных микроорганизмов, дающих возможность за достаточной сжатые сроки и с небольшими финансовыми затратами осуществить восстановление загрязненного биогеоценоза.

4. Полученный в результате комплексной обработки нефтезагрязненный субстрат служит средой для выращивания почвенных червей, из которых получают дешевые по цене биологически активные вещества.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации доложены на Международной конференции (Пермь, 1985); на 9-м международном симпозиуме (Москва, 1989); на Всесоюзном симпозиуме (Москва, 1989); на Всесоюзном симпозиуме (Оренбург, 1991); Международном совещании (Томск, 1992); Конференции (Киров, 1993); Международной конференции (Москва-Пермь, 1993); Международном симпозиуме (Bath, 1993); Международной конференции (Пермь, 1994); Международной конференции (Сыктывкар, 1994); Международном симпозиуме (Киев, 1994); Международной конференции (Санкт-Петербург, 1995); 3-ей международной конференции (Санкт-Петербург, 1996); Международной научной конференции (Пермь, 1996); Международном совещании (Екатеринбург, 1996); 42nd OHOLO Conference (Eliat, Israel, 1998); Международной выставке-конференции (Екатеринбург, 1998); 4-ой международной конференции (Сыктывкар, 1998); Y International congress

(Ivano-Francovsk 1999); Четвертой, межд. конф. (Москва, 2000); Международном семинаре (Пермь, 2001); Third international conference (Rhoodes, Greece.2002); И-й международной конференции (Владимир, 2002); Международном конгрессе (Москва, 2003); Международной научно-практической конференции (Астрахань, 2004).

По теме диссертации опубликованы 35 научных работы, в том числе 2 монографии, два руководящих документа, 1 авторское свидетельство и 4 патента на изобретение.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, восьми глав, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 411 страниц машинописного текста, бб таблиц и 21 рисунков; список цитируемой литературы содержит 458 наименований, из них 128 на иностранных языках.

Связь работы с научными программами

Исследования по направлению диссертации были поддержаны РФФИ № 97-0517927; № 01-04-96492; программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Научные основы сохранения биоразнообразия России на 2002-2006 гг.» контракт № ЗК 447/02.

Список принятых сокращений:

ИКС - инфракрасная (спектроскопия); КРС - крупный рогатый скот; МПА - мясо-пептонный агар; ПАУ - полициклические ароматические углеводороды; ТСХ -тонкослойная хроматография; NPK - азот, фосфор, калий.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования служили биогеоценозы, загрязненные сырой нефтью месторождений Тюменской (зоны средней тайги) и Пермской областей (зоны южной тайги), как естественных аварийных разливов, так и с дозированным внесением нефти на экспериментальных площадках биостанции Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, а также шламовые амбары нефтедобывающих предприятий.

Отбор и подготовка почвенных и растительных образцов для микробиологических исследований, а также приготовление почвы для лабораторных вегетационных опытов проводили по методикам, указанным в руководстве «Методы почвенной микробиологии и биохимии» (1991).

Определение органического углерода и почвенного гумуса определяли по методу И.В. Тюрина (Практикум по агрохимии, 1989) Состав гумуса - по ускоренному пирофосфатному методу, разработанного М.М. Кононовой и С.А. Бельчиковой (Практикум по агрохимии, 1989). Элементный состав гумусовых веществ определяли на элементном анализаторе CHN-1 фирмы «KOWO» (Чехия). Электрофорез и определение молекуляной массы гуминовых кислот проводили в 10% акриламидном геле согласно методу (Т.В. Русина, СВ. Каспаров, 1985). Ферментативную активность почвы определяли по О.И. Колешко (Колешко, 1981).

Определение рН почвы производили милливольтметром типа рН-150 с помощью электродов ЭСЛ-15-11 (Практикум по агрохимии,1989).

Агрофизические - по соответствующим методикам (Агрофизические методы,

1966.

Для определения численности почвенной микрофлоры в опытах использовали метод десятичных предельных разведении с применением для пересчета таблиц

МакКреди (Практикум по микробиологии, 1976). Определение количества микромицетов проводили чашечным методом (Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 1995). Численность отдельных трофических групп почвенных микроорганизмов выявляли на питательных средах: нефтеокисляющих - на среде Раймонда в парах нефти (СИ. Кузнецов, Г.И. Дубинина, 1989), микромицетов - на среде Чапека, гетеротрофов - на универсальных средах, которые используются для учета общей численности аэробных и факультативно-анаэробных бактерий (Т.Н. Назина, 1983; Методы почвенной микробиологии, 1991).

Определение видовой принадлежности выделенных бактериальных культур проводили по Определителю бактерий Берджи (1997. Т. 1-2);. почвенных микромицетов - с использованием определителей (В.И. Билай, З.А. Курбацкая, 1990). Микроскопическое изучение клеток исследованных культур проводили с помощью светопольной и фазовоконтрастной микроскопии. Для окрашивания микромицетов использовали метод (И.Л. Бабьева, Г.М. Зенова, 1989). Стерилизацию семян и выращивание стерильных растений проводили по методике (Малый практикум по физиологии растений, 1994).

Рабочие суспензии бактериальных препаратов «Агат-25К» и «Триходермин» готовили согласно инструкциям, предложенным производителями. Для обработки растений использовали антибиотик нистатин по рекомендациям (М.Х. Шигаева, К.А. Тулемисова, 1977). Геоботанические полевые исследования растительности нефтезагрязненных почв проводили по общепринятым методикам (С.А. Овеснов, 1989). Анализ содержания нефти в почве проводили весовым методом с предварительной экстракцией ее хлороформом (Методическое руководство, 1979).

Хроматографический анализ метано-нафтеновой фракции остаточной нефти, полученной после фракционирования методом тонкослойной хроматографии, проводился на медной капиллярной колонке длиной 25 м и диаметром 0,5 мм на хроматографе Chrom-5 с пламенно-ионизационным детектором (К.А. Гольберг, М.С. Вигдергауз, 1990).

Снятие инфракрасных спектров нефракционированных нефтей производили на инфракрасном двухлучевом спектрофотометре УР-20 с призмой NaCl. Анализ жидких обезвоженных образцоы проводили в разъемных кюветах из бромистого калия (Методическое руководство, 1979).

Определение полициклических ароматических углеводородов производили на приборе СДЛ-2 по методу, разработанному Э.В. Шпольским с замораживанием пробы в инертном растворителе при температуре жидкого азота (Т.А. Алексеева, Т.А. Теплицкая, 1981).

Токсичность нефтезагрязненной почвы оценивали по всхожести, выживаемости и урожайности растений (А.В. Назаров, 2000), а также с использованием в качестве тест-объекта препарата лиофилизированных люминесцентных бактерий (биосенсор) «Эколюм», производимый предприятием НТЦ «Аргумент» (г. Москва). Токсичность и мутагенность почвы определяли также с помощью теста Эймса на штаммах Salmonella typhimurium ТА 1535 и ТА 1538 (Ames et al., 1984) на территории АО «Сургутнефтегаз», АО «Ноябрьскнефтегаз», ПО «Главтюменефтегаз», «ВерхнеВолжские нефтепроводы» (г. Н.-Новгород), «Пурнефтегаз» (совместно с ООО «Агроэкология»), ООО «Лукойл-Пермнефть», ООО «СИБУРхимпром»

Радиоизотопные исследования проводили на жидкостном сцинтилляционном счетчике «БЕТА-2».

Очистку лизоцима из красного калифорнийского червя Esenia fétida. осуществляли на хитине. Очищенные элюаты были подвергнуты электрофоретическому исследованию (Lehrer et al., 1991).

Материалом для настоящей работы служили - почва нефтезагрязненных биоценозов; почвенные микроорганизмы, растения, произрастающие на

нефтезагрязненных почвах; донные отложения шламовых амбаров и некоторых водных объектов; органы животных, обитающих на загрязненной территории и образцы воды.

Статистическую обработку материала производили с помощью компьютерных программ Microsoft Office 97 и программы Statistica 6 0. Все эксперименты поводились с не менее чем 3-х кратной повторностыо. Достоверность результатов полученных данных оценивали на основании t - критерия Стыодента.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Результаты изучения процессов самоочищения нефтезагрязненных почвенных биоценозов в Тюменской области

Изучение процессов самоочищения почв зоны средней тайги проводили в Сургутском районе Тюменской области. Район для экспериментальных площадок представлял собой волнистую, полого-увалистую равнину, сложенную речным аллювием, состоящим, в основном, из слабоожелезненного кварцевого песка. Разрезы закладывались на вершине увала в лишайниковом бору на подзолистой иллювиально-гумусовой почве.

Было заложено два участка: контрольный и загрязненный с уровнем загрязнения, соответствующим 24 л/м2 нефти. По данным тонкослойной хроматографии, нефть, экстрагированная из нефтезагрязненной почвы с годичным сроком инкубации, характеризуется понижением количества метанонафтеновых углеводородов (49,31 %) по отношению к сырой нефти и возросшим количеством смолистых фракций (27,08 %). Содержание данных компонентов в исходной нефти равно 71,8 % и 9,2 %, соответственно.

По своему структурно-групповому составу анализируемая нефть резко отличается как от исходной, так и от органического вещества почв. Анализ метанонафтеновых углеводородов методом газожидкостной хроматографии свидетельствует о резком снижении количества нормальных алканов. Легкие парафины нормального строения (C12-C16), составляющие 0,71 об. %, полностью исчезают к концу первого года инкубации. В контрольных образцах незагрязненной почвы данные углеводороды отсутствуют полностью. Что касается нормальных алканов с более длинной цепью атомов углерода (С17-С30), то после годичного периода инкубации они регистрируются в виде следов, при их концентрации в исходной нефти 99,32 об.%.

Согласно данным ИК-спектроскопии, после года инкубации появляются кислородсодержащие углеводороды. Это свидетельствует о том, что на первых этапах трансформации углеводородов нефти окисление не носит деструктивный характер. Количество остаточной нефти в верхнем слое почвы за это время уменьшилось в 2,1 раза.

На второй год инкубации количество остаточной нефти в верхнем слое почвы уменьшилось в 2,7 раза. Изменения в структурно-групповом составе характеризуется снижением содержания метанонафтеновых и возрастанием нафтеноароматических фракций, смолистых и асфальтеновых структур. Изменение структурного состава сопровождается и внутригрупповыми перестройками. Так, на фоне снижения общего количества метанонафтеновой фракции происходит перераспределение в ней н-алканов в сторону увеличения тяжелых компонентов и снижения доли изопреноидных структур (пристана и фитана). Что касается циклопарафинов, то можно констатировать, что площадь нафтенового «горба» на хроматограммах уменьшается в течение 4 лет в 2,4 раза.

Впутрифракционные изменения происходят и с нафтеноароматической группой углеводородов. Их возрастание сопровождается снижением моноциклических ароматических соединений и увеличением доли высококонденсированных структур, о чем свидетельствуют данные ИК-спектроскопии (изменение соотношений

интенсивностей «трезубца», отвечающего за поглощение ароматическими углеводородами в области 720-815 см"1). Эти данные подтверждаются исследованиями низкотемпературной спектрофлуориметрии.

Направленность биохимической деструкции нефти оценивалась методом ИК-спектроскопии. Наблюдения, проводимые в течение 4 лет, позволяют описать некоторую последовательность в преобразовании нефти.

Исходная сырая нефть отличается стойкими спектральными характеристиками. В ее спектрах фиксируются, главным образом, полосы поглощения С-С (1000-1500 см '') и С-Н (2850-2960 см "') связей. По мере биохимического окисления в спектрах остаточной нефти появляются полосы поглощения в областях 1000-1300 см1 и 17001740 см', что соответствует появлению спиртов и альдегидов, кетонов, кислот и сложных эфиров.

Биохимическое окисление нефти приводит к образованию кислородсодержащих структур - насыщенных и ненасыщенных; алифатических и ароматических альдегидов, кетонов, эфиров, альфа-кетоэфиров, орто-оксибензоатов, хиноидных соединений карбоновых кислот.

Физико-химические исследования через четыре года инкубации нефти свидетельствуют о том, что ее разложение в условиях северной тайги не закончилось. В этот период наблюдаются существенные перестройки в структурно-групповом составе, разложение нафтеноароматических и смолистых фракций. При деструкции сложных гибридных молекул смолисто-асфальтенового и нафтеноароматического ряда происходит увеличение количеств метанонафтеновых углеводородов.

Параллельно с изучением биодеградации нефти на экспериментальных площадках с дозированным внесением нефти подобный комплекс исследований проводился и на площадках, загрязненных нефтью в результате аварийных разливов.

Естественно, что действие техногенных потоков, представляющих собой комплексный загрязнитель, отличающийся от действия только сырой нефтью. Вторым существенным отличием обстановки на аварийных площадках является то, что одна и та же площадка может подвергаться аварийному загрязнению более одного раза и количество пролитой на площадке нефти может варьировать в очень широких пределах. И, наконец, третий важный момент заключается в том, что некоторые из аварийных площадок были подвергнуты так называемой «рекультивации» путем их сожжения и землевания (засыпки землей).

Объекты исследования аварийных нефтезагрязненных площадок в районе северной тайги находились на территории Быстринского, Федоровского и Западно-Сургутского месторождений ПО «Сургутнефтегаз». Площадки для изучения процессов самоочищения подбирались с учетом следующих требований: возможностью наблюдения за выбранной площадкой в течение нескольких лет; площадки, где произошли аварийные разливы, не должны отличаться друг от друга (по характеристике почвы, увлажненности и т.д.).

Для изучения выбирались площадки с аварийным разливом нефти, находящиеся как на сухих возвышенных местах, так и на увлажненных болотистых.

Как показали исследования, деструкция и перераспределение нефти по глубине зависит от места аварии. Так, на возвышенных сухих местах на песчано-подзолистой почве даже через 10 лет после аварийного разлива концентрация нефтяных битумоидов в центре площадки на глубине 0-6 см достигало 68 %. В пробах, отобранных с периферии участка, на той же самой глубине, содержание битумоидов составляло 15,9 %. В то же время, в более глубоких слоях почвы нефть практически отсутствовала.

Совершенно противоположная ситуация наблюдалась на участке с торфянисто-глеевой почвой. Даже через 9 лет после разлива в центре площадки на глубине одного метра количество остаточной нефти составлял 8,79 %.

Исследования аварийных разливов на верховых болотах переходного типа показали, что торф является прекрасным сорбентом нефтяных углеводородов, которые практически не вымываются водными потоками, что способствует естественной локализации нефтяного разлива и их длительному консервированию.

Почвы Тюменской области в районах средней тайги отличаются бедностью таксономического состава микроорганизмов, невысокой численностью физиологических групп и низкой биологической активностью.

По генетическим горизонтам численность микроорганизмов изменяется неравномерно. Наибольшее число микроорганизмов насчитывается в верхнем горизонте А0, так как в нем происходят активные процессы минерализации органического вещества. В процентном содержании в почвах северной тайги преобладают бактерии и грибы, а деятельность актиномицетов и аэробных спорообразующих бактерий угнетена. Численность углеводородокисляющих микроорганизмов также невысока и достигает несколько тыс. кл/г почвы.

При попадании в почву средней тайги сырой нефти происходит подавление жизнедеятельности, особенно сильно угнетается микрофлора верхнего горизонта. Через один год после разлива нефти численность всех учитываемых физиологических групп микроорганизмов значительно ниже таковых в контрольных почвах.

После двух лет резко возрастает численность углеводородокисляющих микроорганизмов. Более медленно растет численность гетеротрофов и грибов. Количество спорообразующих микроорганизмов остается практически неизменным.

На третий год численность углеводородокисляющей микрофлоры в почве резко падает до фонового уровня. По-видимому, данный феномен можно объяснить исчезновением легко усвояемых нормальных алканов из метано-нафтеновой фракции, что подтверждается данными газохроматографического анализа. В нефтезагрязненной почве возрастает количество аэробных спорообразующих бактерий. Как известно, данные микроорганизмы являются деструкторами более богатых энергией сложных органических соединений, чем углеводороды нефти.

Четвертый год характеризуется мощным развитием микромицетов и актиномицетов. Численность углеводородокисляющих микроорганизмов также возрастает.

В связи с неравномерным распределением углеводородов нефти по почвенному профилю и различными экологическими условиями для жизнедеятельности микроорганизмов, ответная реакция микробных ценозов почвенных горизонтов сильно различается.

Таким образом, физико-химические и микробиологические исследования нефтезагрязненных почв средней тайги показали, что как с углеводородами нефти, так и с почвенным микробным биоценозом происходят существенные изменения. Во-первых, сразу же после внесения сырой нефти в почву происходит интенсивное испарение летучих углеводородов, главным образом, нормальных алканов и некоторых ароматических углеводородов. Затем начинают функционировать почвенные микроорганизмы, которые вначале используют для своего роста и развития нормальные алканы, наиболее усвояемые. После того, как будут использованы н-алканы, микроорганизмы начинают потреблять ароматические углеводороды, трансформируя часть их в углеводороды метано-нафтеновой фракции. И, наконец, конечной стадией преобразования почвенной микрофлорой углеводородов нефти является трансформация тяжелых фракций нефти - асфальтенов и смол. Преобразование этих фракций протекает за счет процесса соокислення с вторично образованными метано-нафтеновыми углеводородами.

2.2.2. Изучение процессов самоочищения нефтезагрязненных почвенных биоценозов в Пермском Предуралье

Как показали физико-химические исследования нефти в почвах Пермского Предуралья (зона южной тайги), ее изменения совпадают с тем, что происходит с углеводородами нефти в почвах средней тайги. Однако, в условиях почв зоны южной тайги процессы трансформации нефти происходят более интенсивно. Так, по данным ИК-спектрометрни, уже через трое суток после внесения нефти в почву наблюдается усиление поглощения в областях 1075, 1120, 1170, 1285, 1700-1730 см'1, которые характерны для поглощения различных кислородсодержащих соединений типа эфиров, кетонов и альдегидов. По данным люминесцентно-битумннологических исследований, концентрация нефти через 3 дня после ее разлива составила 26,4 % в почвенном горизонте Ао. К концу месячного срока инкубации концентрация нефти в данном горизонте составляла уже 8,58 %. В то же время происходило увеличение остаточной нефти в более глубоких почвенных горизонтах.

Параллельно со снижением концентрации углеводородов нефти в почве экспериментальных площадок изменялся и структурно-групповой состав нефти. Анализы остаточной нефти из почв южной тайги с годичным сроком инкубации, так же как зоны средней тайги, характеризуются снижением доли метано-нафтеновых и возрастанием процента смолисто-асфальтеновых фракций.

По мере возрастания сроков наблюдаются структурно-функциональные изменения нефти еще более усиливаются, о чем свидетельствуют данные тонкослойной хроматографии и ИК-спектрометрии. Интенсивные процессы деструкции углеводородов нефти приурочены к 2-3 годам инкубации нефти в почве. В данный период отмечается максимально высокая концентрация кислородсодержащих соединений нефти.

Исследование остаточной нефти с шестилетним сроком инкубации показало, что загрязненные почвы отличаются от фоновых повышенным содержанием органических веществ. Так, на глубине 0-12 см их концентрация достигает 2,5 % при фоновом значении 0,01 %, а на глубине 30-50 см она уменьшается до 0,01 % при фоне 0,0009 %.

По своему структурно-групповому составу это трансформированное органическое вещество углеводородов нефти (битумоиды) резко отличается от исходной нефти низким содержанием метано-нафтеновых и высоким содержанием смолистых фракций.

По данным ГЖХ, нормальные алканы, выделенные из гумусового горизонта, идентифицируются как УВ растительного происхождения. В нижележащих почвенных горизонтах н-алканы отсутствуют вообще, нафтеновые структуры нефтяного ряда присутствуют в виде следов.

Объектами исследования являлись площадки, которые были загрязнены в результате аварийных проливов нефти. Такими площадками служили места, расположенные на территории Ярино-Каменноложского месторождения ПО «Полазнанефть».

Для изучения преобразования нефти были выбраны нефтезагрязненные участки с различным сроком инкубации, а именно: с 3-х, 8-ми, 15-ти и 25-летннм.

На участке с трехлетним сроком инкубации в пробах, отобранных с центральной части пятна, по данным комплекса физико-химических исследований, трансформация нефти соответствовала ситуации, которая наблюдалась при анализе образцов, взятых после двух лет инкубации на экспериментальных участках в районе южной тайги. Анализ проб, отобранных с середины нефтезагрязненной площадки, показал аналогичные результаты. Что же касается анализов проб почвы, отобранных с края нефгезагрязненного пятна, то по своему составу анализируемый битумоид больше сходен с битумоидами нефтяного происхождения, чем растительного.

ИКС анализ хлороформенных почвенных экстрактов, выделенных из почвы с восьмилетним и пятнадцатилетним сроком инкубации, позволяет достоверно диагностировать анализируемые структуры как нефтяные. Об этом свидетельствует -отсутствие дублета в области 720-735 см"1, четкий «трезубец» монополициклических ароматических соединений в области 750, 815 и 875 см-1, а также интенсивные полосы поглощения метальных (1380 см") и метиленовых (1460 см-1) групп.

Пробы битумоидов, выделенных из почв с 15 летним сроком инкубации, нельзя идентифицировать как углеводороды, имеющие только нефтяное происхождение. Рисунок ИК-спектра и данные люминесцентного анализа позволяют отнести эти битумоиды к группе «смешанных», т.е. смесь битумоидов нефтяного и растительного происхождения. Характерной особенностью ИК-спектров данного периода является присутствие в полосах поглощения дублета в области 720-735 см-1, свидетельствующего о наличии н-парафинов; полосы поглощения 835, 815 и 755 см-1 характерны для С-Н связей ароматических колец, и довольно высокая оптическая плотность кислородсодержащих групп в области 1700-1640 см'1.

Хлороформенные экстракты из почв, имеющих сроки загрязнения 25 лет и более, нельзя назвать имеющими нефтяное происхождение. Согласно данным люминесцентного и газожидкостного хроматографического анализа, эти экстракты относятся к битумам почв со следами, характерными для структур углеводородов нефти.

Данные ГЖХ позволили проследить изменения в составе метанонафтеновых фракций. Так, анализ хроматограмм исследуемых образцов, содержащих углеводороды нефти, показал следующее. Для исходной нефти Ярино-Каменноложского месторождения характерен набор н-алканов с длиной цепи углеродных атомов от С13 до С31 Отношение нечетных компонентов к четным приблизительно равно 1, а отношение изопреноидных углеводородов пристана к фитану С19/С20 равно около 1,54.

Для остаточной нефти, выделенной из экстрактов нефтезагрязненных почв, с 15 летним сроком инкубации это соотношение может достичь величины 8,4 при фоновых значениях 1,75-1,90.

Данный эффект объясняется высокой стойкостью пристана к микробиологическому воздействию, в то время как фитан легко расщепляется микроорганизмами, поэтому данное соотношение можно взять в качестве критерия биодеградации нефти. С увеличением времени инкубации происходит преобразование структуры фракций нефти. На фоне общего снижения н-алканов в составе фракции начинают преобладать углеводороды с более высокой температурой кипения, преимущественно нечетного ряда. Отношение нечетных структур к четным к 15-ти годам инкубации на вырубке смешанного леса имеет значение от 1,6 до 3,52. Это соотношение для н-алканов, выделенных из лесных почвенных проб, варьировало в диапазоне от 1,52 до 2,69 при фоновых значениях порядка 6-7.

Таким образом, анализ хлороформенных экстрактов из нефтезагрязненной почвы аварийных разливов в зоне южной тайги с 25-тилетним сроком инкубации показал, что по своему химическому составу он не отличается от битума почвы. Согласно другому критерию деструкции углеводородов нефти, содержанию в почве 3,4-бензпирена, оно также находится на уровне фоновых значений.

Загрязнение нефтью естественного почвенного биоценоза хвойно-лиственного леса приводит к значительным сдвигам в структуре микробной популяции. Микроорганизмы всех микробиологических групп реагируют на присутствие нефти повышением своей абсолютной численности. Однако, максимального уровня численности различные микроорганизмы достигают в разное время, в зависимости от стадии разложения углеводородов и почвенного горизонта, где они находятся.

Так, уже через пять дней после внесения нефти в почву численность гетеротрофов возрастает в горизонте Ао в 5,4 раза, ав А[ в 1,7 раза. В горизонте Аг численность гетеротрофной микрофлоры остается ниже контрольной.

Наиболее резкое увеличение численности во всех исследуемых почвенных горизонтах наблюдается в группе углеводородокисляющих бактерий. Она превышает фоновые значения бактерий вниз по горизонтам Ао, А| и Аг, соответственно, в 54, 32 и 2,6 раза. В группе актиномицетов под воздействием нефтяного загрязнения наблюдаются достоверные различия между их численностью в опытном и контрольном вариантах в горизонте Ао и Аг. Достоверно значимое увеличение численности после внесения нефти наблюдается в группе денитрификаторов и анаэробных азотфиксаторов во всех исследуемых горизонтах. Недостоверный характер носит изменения численности спорообразующих бактерий, грибов и дрожжей.

Через четыре месяца инкубации нефти в почве число гетеротрофных микроорганизмов во всех исследуемых горизонтах Ао, А1 и Аг превышает уровень контроля, соответственно, в 1,77; 2,55 и 11,8 раза. Численность углеводородокисляющих микроорганизмов в нефтезагрязненных почвах данного периода превышала таковую контрольных вниз по почвенному профилю в 110 (Ао), 72,3 (А1) и 200 (Аг) раз. Число бациллярных микроорганизмов в состоянии спор в почве, загрязненной нефтью, выше, чем в контрольной, однако, эти различия достоверны лишь для двух нижних почвенных горизонтов А1 и А1, и доля влияния

нефтяного загрязнения на увеличение спор составляет, соответственно, 49,1 % и 74,4 %.

Различия в численности грибов в опыте и контроле в горизонтах Ао и А1 недостоверны, и лишь в горизонте А2 наблюдается достоверное увеличение численности грибов.

Для группы дрожжей достоверные различия между опытом и контролем имеются лишь в горизонте Ао. Что касается целлюлозоразрушающих грибов, то их численность увеличилась в 4 раза только в горизонте Ао. В то время как в двух нижних горизонтах А1 и А2 их численность была ниже уровня контроля или приблизительно равна ему.

Увеличение численности актиномицетов носит достоверный характер лишь для горизонта А|, а доля влияния нефтяного загрязнения на изменение числа актиномицетов в опыте невелика и составляет 12,5 %.

Численность денитрифицирующих бактерий и анаэробных азотфиксаторов превышала уровень контроля во всех исследуемых горизонтах почвы.

Через 16 месяцев после внесения нефти в почву общее число бактерий, выросших на МПА, в двух верхних нефтезагрязненных почвенных горизонтах было ниже контрольного уровня в 4 (Ао) и 8,8 (А|) раза. В то время как в горизонте А2 число бактерий было выше контроля в 7,7 раза.

Численность углеводородокисляющих микроорганизмов превышала контрольные уровни во всех исследуемых почвенных горизонтах, соответственно, Ао - в 187, А| - в 18иА2-в7раз.

Количество бактерий, растущих на КАА, было ниже, чем в контрольных образцах, в горизонте Ао - в 2,3 раза, А1 - в 34 раза и А2 - в 2 раза.

Ниже контрольного уровня было содержание спор бацилл в нефтезагрязненной почве во всех исследуемых горизонтах Ао и А2 - в 1,8 раза, а в А1 - в 4,7 раза. Уровень численности микроскопических грибов превышал в 1,2 раза контрольный только лишь в горизонте Ао.

Нефтезагрязненная почва 16-месячного срока инкубации угнетала развитие актиномицетов. Их численность снижалась по горизонтам по сравнению с контролем в 4,5; 12 и Зраза.

По истечении 24 месяцев инкубации нефти в почве численность бактерий на МПА находилась ниже контрольного уровня в двух верхних горизонтах: Ао - в 1,4 раза

и А1 - в 2,2 раза. Однако, в пробах, отобранных из почвенного горизонта А численность бактерий на МПА была в 2 раза выше контроля. Численность углсводородокисляющих микроорганизмов уменьшается вниз по почвенным горизонтам по сравнению с контролем в 9, 2 и 7 раз. Отношение числа углеводородокисляющих бактерий к числу бактерий, растущих на МПА, в двух верхних горизонтах составляло величину 0,13, а в горизонте А2 - 0,84. В контрольной почве это отношение изменялось от верхнего к нижележащему горизонту, соответственно, как: Ао - 0,01; А| - 0,03; А2 - 0,26. На крахмало-аммиачной среде отмечалось увеличение численности бактерий в нефтезагрязненной почве в двух верхних горизонтах почвы в 4 и 2,5 раза, а в горизонте А2 количество бактерий оставалось ниже контрольного уровня в 5 раз, что указывает на более активные процессы минерализации в двух верхних горизонтах нефтезагрязненной почвы.

После двух лет инкубации нефти в почве коэффициент минерализации в горизонте Ао составлял 4,05 против 0,69 в контрольной почве. В горизонте А2 он был 16,06 против 2,89, а вот в горизонте А2 этот коэффициент был ниже, чем в контрольной почве и составлял 0,74 против 8,36 в контроле.

Бактериальный рост на разбавленном в 10 раз мясо-пептонном агаре был лучше, чем на среде с неразбавленным МПА. Так, в горизонте Ао численность бактерий на среде МПА 1:10 была на 2 порядка выше, а в двух нижележащих горизонтах А1 и А2 она была выше на 1 порядок. В контрольных образцах во всех исследуемых горизонтах численность бактерий на разбавленном МПА увеличивалась вниз по почвенному профилю.

Численность олигонитрофильных микроорганизмов данного периода самоочищения увеличилась по всем изученным почвенным горизонтам и составляла 5,5(А0),4(А1)и11(А2)раз.

Мицелиальные грибы активно функционировали в горизонте Ао и А2, где их численность превышала контроль в 3,6 и 7 раз, соответственно. Содержание же их в горизонте А1 снизилось в 3 раза.

Актиномицеты в почве с нефтью на этом этапе по-прежнему испытывали угнетение. Их содержание по сравнению с контролем снизилось в 4; 1,5 и 2 раза вниз по почвенному профилю.

Нефтезагрязненная почва оказывала неоднозначное действие на число аэробных спорообразующих микроорганизмов. В горизонте Ао их численность была ниже в 4 раза, в то время как в горизонте А1 превышала уровень контроля в 4 раза. В горизонте А2 она еще более повышалась и достигала 8-кратного увеличения.

После 28 месяцев инкубации нефти в почве снижение численности бактерий на МПА обнаруживается лишь в верхнем горизонте Ао, где она ниже в 2,5 раза по сравнению с контролем. В двух нижележащих горизонтах А1 и А2 численность бактерий на МПА превышала уровень контроля в 1,2 и 3 раза, соответственно.

Число углеводородокисляющих бактерий к этому периоду оставалось высоким и превышало уровень контроля вниз по профилю в 15, 8 и 2097 раз. По-видимому, такие различия были обусловлены очень низким углеводородокисляющим потенциалом фоновой почвы, что в значительной степени может быть объяснено временем сбора образцов.

Отношение числа углеводородокисляющих бактерий к числу их на МПА изменяется по почвенным горизонтам Наиболее высокое значение этого отношения наблюдается в горизонте А1 В горизонтах Ао и А2 они равны 0,12 и 0,58, соответственно. Если сравнить эти отношения в контрольной почве, то они на 2-3 порядка меньше, чем в нефтезагрязненной почве и имеют тенденцию к уменьшению с глубиной, а именно, Ао - 0,003; А, - 0,001 и А, - 0,0008.

Содержание спор аэробных спорообразующих бактерий в нефтезагрязненной почве было ниже в 1,5; 4,4 и 2,0 раза по исследуемым горизонтам, чем в контрольной почве.

Для данного периода отмечалось низкое содержание мицелиальных грибов, как в опытных, так и в контрольных образцах почвы. Количественное содержание актиномицетов в нефтезагрязненной почве снижалось вниз по почвенным горизонтам в 1,4; 1,5 и 2,5 раза по сравнению с контролем.

Таким образом, увеличение численности различных физиологических групп происходит в разное время, но, как правило, возрастание численности происходит вниз по почвенным горизонтам Ао, A1 и A2.

Наиболее быстро реагируют на внесение в почву нефти гетеротрофные бактерии и относящиеся к этой группе по способу питания углеводородокисляющие и денитрифицирующие бактерии.

Согласно проведенным нами исследованиям, которые совпадают с литературными данными, большую часть почвенного микробного биоценоза от 57,8 до 99,7 % составляют бактерии с гетеротрофным типом питания. Колебания численности именно этой группы микроорганизмов определяют изменение общего количества микроорганизмов в почве. По численности этой группы косвенно можно судить о состоянии микробного биоценоза. Так, если в течение трехлетнего периода инкубации численность гетеротрофных микроорганизмов остается значительно выше в загрязненной нефтью почве, чем в контрольной, данный факт может свидетельствовать о том, что в почве протекают активные микробиологические процессы, связанные с деструкцией углеводородов нефти.

2.2.3. Геоботанические исследования на экспериментальных и аварийных

площадках

Исследования влияния углеводородов нефти на рост и развитие растений проводили по двум направлениям: изучение процессов самозарастания экспериментальных площадок, обработанных высокой дозой нефти, и наблюдение за растительностью на площадках, подвергшихся аварийному разливу нефти (Пермское Предуралье).

На начальном этапе исследований изучалось формирование растительности на загрязненных нефтью опытных участках с целью выбора видов растений для дальнейших экспериментов, а также оценки воздействия растительности на деградацию загрязнителя. Для этого через один, два и три года после внесения в почву нефти в дозе 24 л/м2 были сделаны полевые геоботанические описания растительных сообществ нефтезагрязненных и незагрязненных участков. Дозу нефти 24 л/м2 относят к сильному загрязнению почвы, оказывающему наибольшее негативное влияние на почву, растения, почвенные микроорганизмы (И.И. Шилова, 1988; B.C. Гузев и др., 1989).

Внесение нефти в почву оказало сильное отрицательное воздействие на рост и биомассу растений в течение всех 3-х лет полевого модельного эксперимента. Наибольшее отличие между урожайностью загрязненных и незагрязненных площадок наблюдалось через год после закладки эксперимента; в данном случае урожайность на незагрязненных нефтью участках была в 12 раз выше, чем на нефтезагрязнеиных. В последующие годы различие в продуктивности растений между обоими типами площадок снижается: через 2 года урожайность растений на незагрязненной почве была выше в 3 и через 3 года - в 2 раза. Такая же закономерность прослеживается и по влиянию нефтяного загрязнения на проективное покрытие растительности на загрязненных и незагрязненных участках.

В целом, в процессе естественного самозарастания нефтезагрязненных площадок наиболее толерантными к нефтяному загрязнению были многолетние виды растений семейств сложноцветных (Asteraceae), бобовых (Fabaceae), злаковых (Роасеае). Из семейства сложноцветных были представлены следующие виды: Achillea millefolium, Cirsium arvense, Leiicanthemum vulgare, Pieris hieracioides, Tanacetum vulgare, Taraxacum officinale', из семейства бобовых - Lathyrus pratense, Trifolium medium, T. pratense, A'mó'kmpens, Vicia cracca, V. sepium; из семейства злаковых -Agrostis tenuis, Brontopsis inermis, Dactylis glomerata, Elytrigia repens, Festuca pratensis, Phleum pratense, Poa pratensis. При этом наиболее активно заселяли нефтезагрязненные площадки растения, способные к быстрому вегетативному размножению.

Наиболее перспективными видами растений для использования их в фитомелиорации нефтезагрязненных почв, учитывая их устойчивость к нефтяному загрязнению и способность к быстрому заселению нефтезагрязненных участков, являются: Bromopsis inermis, Elytrigia repens, Amokia repens.

На территории Ярино-Каменноложского месторождения была найдена площадка с аварийно разлитой нефтью, за которой проводилось наблюдение в течение 26 лет. Данная площадка начала зарастать на второй год после аварийного разлива. Зарастание площадки происходило неравномерно. Первые растения, которые появились на аварийной площадке, были Tussilago farfara, Sonchus arvensis, Chamaenerion angustifolium, Centaureajacea.

Обследование зоны восстановления через четыре года показало, что за прошедший период произошли отдельные изменения. Наблюдалась дальнейшая дифференциация растительности по более компактным и однородным сообществам. Относительно однородное сообщество Т. farfara сообщество расчленилось на шесть более мелких сообществ, причем только в од ом из них она осталась доминантой, в остальных сообществах доминантами стали злаки, S. arvensis и С. angustifolium.

Через шесть лет на месте погибшего фитоценоза сформировалось растительное сообщество, состоящее, главным образом, из мать-и-мачехи и злаковых. В центре пятна доминирующим видом была мать-и-мачеха, вторым по численности видом являлся иван-чай. Реже встречались такие виды, как Aegopodiumpodagraria, Centaureajacea, Deschampsia cespitosa и некоторые другие виды. Ближе к краю загрязнения доминировала мать-и-мачеха совместно с вышеуказанными видами.

Через 26 лет после загрязнения на месте погибшего фитоценоза сформировалось разнотравно-злаковое сообщество, представленное Deschampsia cespitosa, Dactylis glomerata, рядом растений, относящихся к родам: Poa, Agrostis и Urtica,

Epilobium и Filipendula образуют небольшие группировки. По окраине заливаемой территории обычно начинала расти Rubus ideaus. Betula pendule, произрастающие на загрязненной площадке растения были низкорослыми высотой до 2 метров с извилистыми стволами темно-коричневого цвета. Боковые ветки развивались на небольшой высоте от поверхности почвы. Ветки обладали меньшей эластичностью и хуже гнулись, чем у берез, произрастающих на незагрязненной территории.

Таким образом, при поверхностных разливах нефти практически вся растительность гибнет, и восстановление ее начинается через 2-3 года. Растениями-пионерами, обживающими нефтезагрязненную почву в районе Пермского Предуралья (подзоны южной тайги), являются Т. farfara, S. arvemis, С.jacea и С. angustifolium.

2.2.4. Изучение процессов восстановления нефтезагрязненных почв путем активизирования аборигенной мнкробиоты

Для ускорения процессов минерализации нефти были изучены следующие агротехнические мероприятия: рыхление почвы для ее лучшего аэрирования и внесение

минеральных удобрений - извести, гажи, навоза КРС, КРК и некоторых органических веществ.

Для дозы 8 л/м после месячного срока инкубации лучше всего стимулирует общую численность микроорганизмов внесение в почву гажи и КРК. Внесение этих же ингредиентов приводило к наибольшему увеличению численности углеводородокисляющих микроорганизмов. В то же время, наибольшая численность грибов наблюдалась при внесении в почву навоза КРС, извести и КРК. Ни одно из агротехнических мероприятий или их комбинаций не стимулировало рост и развитие актиномицетов. Число спорообразующих микроорганизмов увеличилось во всех изучаемых вариантах.

Через 3,5 месяца благоприятное воздействие на общую численность микроорганизмов продолжает оказывать внесение гажи и КРК. В то время как на развитие и рост углеводородокисляющих микроорганизмов лучше всего воздействало внесение в почву комбинации навоза, извести и КРК.

Численность мицелиальных грибов лучше всего возрастала при обработке почвы гажой и КРК. Также эффективно действоавало на увеличение численности рыхление почвы. На развитие актиномицетов наиболее благоприятно влияло внесение извести или комбинации из извести, КРК и навоза.

Через 16 месяцев после внесения в почву углеводородов нефти наибольшая численность микроорганизмов наблюдалась на площадках, обработанных известью или КРК. Внесение комбинации извести и КРК лучше всего сказалось на развитии углеводородокисляющих микроорганизмов и мицелиальных грибов. Меньше всего сказывается отрицательное воздействие нефти на актиномицеты, если почву обрабатывали гажой и КРК или навозом, известью и КРК.

При внесении в почву нефти в дозе 16 л/м2 и после месячного срока ее инкубации наибольшая общая численность микроорганизмов наблюдалась на площадках, обработанных гажой. Такой же эффект наблюдался для углеводородокисляющнх микроорганизмов и актиномицетов.

После 3,5-месячного срока внесения нефти наивысшая численность микроорганизмов наблюдалась на экспериментальных площадках, обработанных навозом КРС, известью и КРК. Практически одинаковый эффект оказывает на возрастание максимальной численности углеводородокисляющих микроорганизмов рыхление или внесение в почву комбинации навоза КРС, извести и КРК. Рыхление необходимо и для лучшего роста и развития грибов. Высокий стимулирующий эффект наблюдался у актиномицетов на площадках, обработанных известью и КРК.

Через 16 месяцев после внесения в почву нефти численность всех физиологических групп микроорганизмов увеличивается на площадках с навозом КРС, известью и КРК, кроме группы спорообразующих бактерий.

При обработке почвы нефтью в дозе 24 л/м2 после месячного срока инкубации наибольшая численность гетеротрофных микроорганизмов отмечалась при внесения в почву навоза и извести. Данная комбинация удобрений оказывала наилучший стимулирующий эффект на развитие углеводородокисляющих микроорганизмов и актиномицетов.

На рост и развитие грибов ни одна из форм агротехнической обработки не оказывала существенного влияния.

После 3,5 месяцев инкубации наибольшая общая численность микроорганизмов отмечена на почве, обработанной гажой и КРК. Наибольшая численность углеводородокисляющих микроорганизмов была на площадках с внесением в почву извести и КРК, а также при обработке почвы, используя всего лишь одно рыхление.

Наилучшее развитие грибов наблюдалось при известковании почвы с дальнейшим внесением в нее КРК и навоза КРС.

Наибольшая численность актиномицетов наблюдалась на экспериментальных площадках с внесением извести и МРК.

Через 16 месяцев инкубации нефти наибольшая численность микроорганизмов отмечалась на площадках с внесением гажи и МРК. Наибольший стимулирующий эффект на развитие углеводородокисляющих микроорганизмов оказывало известкование почвы с внесением навоза КРС и МРК. Наибольшее количество грибов отмечается на площадках с одним лишь рыхлением; так же хорошо сказывалось на их численности известкование с внесением МРК. Лучшее развитие актиномицетов отмечено на площадках с внесением извести и МРК.

2.2.5. Восстановление нефтезагрязненных почвенных биоценозов с применением биопрепарата

Приготовление биопрепарата осуществляли путем использования Оогёоша атюаШ и гуминовых кислот термокаталитически обработанного листового опада. Гуминовые кислоты получали путем термокаталитической обработки листового опада. Обработку листового опада проводили при трех температурных режимах: а) при температурной обработке в течение 5 минут; б) в течение 10 минут и в) в течение 20 минут. В качестве контроля использовали листовой опад без температурной обработки. Соли кобальта использовали как катализатор. Полученные из листового опада гуминовые кислоты были изучены методом электрофореза в полиакриламидном геле и определены их средневесовые молекулярные массы для каждого из исследуемых вариантов. Полученные результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1

Средневесовые молекулярные массы гуминовых кислот

Условное обозначение пробы Средняя молекулярная масса (дальтон)

М 72160

5М 74084

10М 72588

20М 70520

Гуминовые кислоты почвы 69500

Данные о молекулярно - массовом распределении на первый взгляд свидетельствуют о сходной природе гуминовых кислот почвы и гуминовых кислот термообработанных растительных остатков. Для подтверждения этой гипотезы были сняты ИК - спектры новообразованных гуминовых кислот и определен их элементный состав (табл. 2).

Инфракрасные спектры сравнивали в хорошо изученном интервале от 700 до 1750 см . Несмотря на очевидные отличия, спектры гуминовых кислот из листьев, почвы и листьев, подвергшихся температурной обработке, имеют некоторые сходные полосы поглощения.

Но, вместе с тем, при детальном анализе спектров проявляются и некоторые различия.

В области волновых чисел между 900 и 750 см-1 для образцов М, 5М, ЮМ и 20М имеются две или три полосы поглощения более или менее слабой интенсивности. Характер спектра в данной области позволяет судить о содержании ароматических компонентов в гуминовых кислотах и о присутствии колец более чем с двумя незамещенными атомами водорода. Следует отметить, что в спектре 20М данная область имеет более сглаженный характер, чем в спектрах М, 5М и ЮМ. В спектре гуминовых кислот, извлеченных из почвы, подобные полосы выражены слабо либо отсутствуют совсем.

Область 1100-1000 см-1, как и длинноволновая область, недостаточно хорошо изучена, что обусловлено влиянием многочисленных минеральных компонентов, присутствующих в гуминовых кислотах в виде примесей или находящихся с ними в соединении. Для малозольных препаратов гуминовых кислот всю область поглощения 1100 до 1000 см-1 можно отнести к спиртовым СОН.

В области 1100 до 1200 см-1 в спектрах гуминовых кислот, извлеченных из листьев, т.е. для образцов М, 5М, ЮМ и 20М проявляются средне- и слабоинтенсивные полосы поглощения, в общем нехарактерные для эталонных образцов гуминовых кислот, извлеченных из почвы. Можно предположить, что данные колебания обусловлены группировками, неспецифическими для «созревших» гуминовых кислот. Интенсивность этих полос поглощения наименьшая в спектре 20М (в спектре образца П они отсутствуют).

В области спектра от 1470 до 1370 см-1 все гумусовые кислоты имеют две, иногда большее число полос. Важнейшие полосы гуминовых кислот в этом диапазоне обусловлены деформационными колебаниями С-Н, хотя около 1390 см-1 могут проявляться деформационные колебания О-Н и колебания групп С-О. В этой области возможно наложение полос карбонильной группы, деформационных колебаний групп -СН, групп ОН некоторых спиртов и фенолов. Сложный характер поглощения и сильная зависимость его от состояния вещества заставляют придавать этой области ограниченное значение.

Интересные выводы позволяет сделать полоса поглощения при 1500-1510 см-1. Интенсивность данной полосы уменьшается по мере увеличения времени температурной обработки; для гуминовых кислот листьев данная полоса максимально выражена, для гуминовых кислот почвы — практически отсутствует. Эта полоса, в сочетании с поглощением около 1610-1620 см"1 свидетельствует о присутствии ароматических компонентов.

В области 1625-1600-см-1 обнаруживается третья, наиболее сильная полоса. В числе групп, поглощающих около 1600 см", являются ароматические С=С, карбонильные С=О, связанные водородной связью, хиноны, также связанные с группировками ОН водородной связью. Расширение полосы и сдвиг ее в длинноволновую область, по мнению ряда авторов, могут быть вызваны влиянием карбоксил - иона.

Таблица 2

Элементный состав гуминовых кислот (в массовых процентах)

Условное обозначение С N Н О (по остатку)

М 56.13 4.85 5.52 33.50

5М 55.93 4.83 5.34 33.90

10М 55.68 4.78 5.22 34.32

20М 55.47 4.70 5.02 34.81

П 53.28 4.20 4.78 37.74

Важной характеристикой, которая может быть выявлена на основе элементного состава (табл. 2), является степень окисленности гуминовых кислот. Объективным и независимым от метода определения окисленности является способ, учитывающий количество не только кислорода, но и водорода, а точнее, всех электроотрицательных и электроположительных по отношению к углероду атомов. Если в первом приближении учитывать только О и Н, то общая окислснность вещества выражается так: А(0,Н) = 2ро-дп,

где Qo - количество атомов кислорода, а рц - количество атомов водорода в молекуле. Эта разность равна избытку атомов водорода (или кислорода) над числом атомов кислорода (или водорода) по сравнению с их соотношением в молекуле воды. Для последней Л(0, Н) = 2(2о-(2н = 2-1- 2 = 0. При избытке водорода разность отрицательна, что отвечает восстановленному характеру вещества. При избытке кислорода разность положительна и соединение имеет более высокую окисленность. Для сравнения разных по величине молекул относительную степень окисленности приходится вычислять в расчете на 1 атом углерода. Обозначив степень окисленности символом можно записать:

а-

где Qc - число атомов углерода в молекуле. Абсолютное количество атомов Н, О и С при расчетах заменяют на их мольные количества в препарате.

Кроме кислорода электроотрицательными атомами в молекуле являются также N и 8. Но их мольная доля сравнительно невелика, и их можно при расчетах не принимать во внимание. Результаты расчетов степени окисленности приведены в табл. .3.

Таблица 3

Средний элементный состав (в атомных процентах) и степень окисленности

гумминовых кислот растительных остатков и почвы

Условное обозначение С N Н 0 го

М 37.16 2.75 43.45 16.64 -0.27

5М 37.57 2.77 42.56 17.1 -0.22

10М 37.78 2.78 • 42.02 17.42 -0.19

20М 38.17 2.77 41.06 18.00 -0.13

П 37.55 2.53 40.00 19.92 -0.004

Гуминовые кислоты растительных остатков, не подвергшихся температурно-каталитической обработке, имеют наибольшую долю высокомолекулярных фракций (табл. 1). По мере увеличения времени температурной обработки доля низкомолекулярных масс начинает расти. По мере дальнейшего увеличения времени температурной обработки в образцах 5М-20М намечается тенденция к уменьшению средневесовой молекулярной массы. Характерно, что средневесовая молекулярная масса образца 20 М практически равна средневесовой молекулярной массе гуминовых кислот почвы.

В дальнейшем к полученным термокаталитическим путем (режим обработки - 20 мин.) из листового опада гуминовым кислотам, добавляли биомассу углеводородокисляющего микроорганизма Оогёоша атюаШ.

При добавлении в нефтезагрязненную почву с нагрузкой нефти 24 л/м2 только одних гуминовых кислот процент остаточной нефти убывает на 12 % в течение одного месяца. С применением биопрепарата, т.е. гуминовых кислот и углеводородокисляющего микроорганизма Оогёоша атюаШ, процент убыли остаточной нефти в почве становиться еще ниже и достигает 21%.

Таким образом, созданный биопрепарат достаточно эффективно воздействует на деструкцию углеводородов нефти в почве. Эффективность его воздействия близка к современным бакпрепаратам, используемым в настоящее время для очистки нефтезагрязненных почвенных биоценозов.

2.2.6. Использование прикорневой микрофлоры растении в очистке нефтезагрязиенных почвенных биоценозов

Для оценки влияния растительности на деструкцию нефти в загрязненной почве была измерена корневая биомасса растений В. inermis и Т. praten.se, выросших на площадках через 1, 2 и 3 года после загрязнения, а также содержание остаточной нефти в почве площадок, зарастающих растениями, и участков, с которых растения постоянно убирались.

Через год после внесения нефти в почву биомасса корней выросших на ней растений была крайне низкой. При этом разница в содержании остаточной нефти в почве между площадками с растениями и без них была статистически недостоверной. Таким образом, через год растительность не оказала влияния на самоочищение загрязненных участков, несмотря на то, что общая численность бактерий и нефтеокисляющих микроорганизмов в ризосферной зоне растений через год после загрязнения из всех вариантов была наиболее высокой. В последующие годы наблюдалось увеличение массы корней растений, заселяющих нефтезагрязненную почву, и вместе с этим более значительное уменьшение остаточной нефти на площадках с растениями.

Через три года после загрязнения почва площадок, на которых формировалась растительность, содержала более чем в два раза меньше остаточной нефти, чем почва участков без растений.

Проведенный анализ численности нефтеокисляющих микроорганизмов свидетельствует о том, что их количество в ризосфере и ризоплане было выше, чем в почве без растений, в течение всего времени проведения эксперимента.'При этом, если численность гетеротрофных бактерий в ризосфере и ризоплане клевера лугового Т. pratense была выше, чем в почве без растений, на 1-2 порядка, а их количество в ризосфере костреца безостого часто было выше всего в несколько раз, в то время как численность нефтеокисляющих микроорганизмов в зоне ризосферы и ризопланы обоих растений была выше, чем в почве без корней растений, на 2-3 порядка. В целом в ризоплане численность микроорганизмов, способных к окислению углеводородов нефти, выше, чем в ризосфере, причем в ризосфере и ризоплане клевера лугового она выше, чем у костреца безостого.

Флюктуации численности микроорганизмов в ризосфере и ризоплане растений были более значительны, чем в почве без растений; так, в почве без корней растений количество микроорганизмов могло измениться в 2-4 раза, а в ризосфере и ризоплане — примерно на порядок. Численность микроорганизмов в почве находилась примерно на одном уровне, в то время как в ризосферной зоне, как правило, с развитием растений происходило увеличение численности микроорганизмов.

В ризосфере и ризоплане растений, выросших на нефтезагрязненной почве, в большинстве случаев количество нефтеокисляющих микроорганизмов было в 10 раз выше, чем у растений, выросших на почве без внесения нефти.

В. inermis и Т. pratense отличаются между собой по биомассе корней, а также количеству микроорганизмов в ризосфере и ризоплане, и одной из главных задач этого эксперимента являлось изучение роли корневой биомассы и численности нефтеокисляющих бактерий в ризосфере и ризоплане растений на очищение почвы от нефтяного загрязнения. Однако посадка растений в нашем опыте не оказала существенного влияния на снижение остаточной нефти в почве.

Отсутствие воздействия растений через микрофлору ризосферы и ризопланы на разложение нефти, по-видимому, обусловлено тем, что посаженные в почву, загрязненную нефтью, растения образовывали крайне низкую биомассу, недостаточную для ощутимого влияния на почвенную микробиоту. Урожайность надземной и подземной части растений, выросших на почве с нефтяным загрязнением,

была более чем в 100 раз меньше, чем у растений, высаженных в незагрязненную почву. При этом на почве с нефтью происходила гибель до 90 % и выше взошедших растений.

Анализ нефтезагрязненной почвы 2-х групп площадок (зарастающих растениями и площадок, с которых растительность постоянно убиралась) показал, что через год после загрязнения разницы в содержании остаточной нефти между этими площадками не было. Это связано, по-видимому, с преобладающим влиянием физических факторов удаления углеводородов из почвы на первом этапе ее восстановления, которое маскирует влияние незначительной корневой биомассы произраставших на площадках растений. Через 2 и 3 года после загрязнения наблюдалось увеличение массы корней -и более значительное уменьшение содержания остаточной нефти на площадках, зарастающих растениями, чем на площадках без растений. Через 3 года после загрязнения почва площадок, на которых сформировалась растительность, содержала остаточной нефти более чем в два раза меньше, чем почва участков без растений.

Численность бактерий в ризосфере и ризоплане растений подвержена постоянным изменениям, поэтому в течение 3-х летних месяцев была прослежена динамика численности нефтеокисляющих микроорганизмов в ризосфере и ризоплане В. inermis и Т. pratense , выращенных на незагрязненной почве и почве, загрязненной нефтью в дозах 2,4 л/м2 (слабый уровень загрязнения) и 7,3 л/м2 (средний уровень загрязнения). Для сравнения использовалась нефтезагрязненная почва без растений через месяц после внесения нефти в дозе 2,4 л/м2, и через 1 год - в дозе 7,3 л/м2.

Анализ полученных данных показал, что численность нефтеокисляющих микроорганизмов в ризосфере и ризоплане в течение всех 3-х месяцев проведения эксперимента была выше, чем в почве без растений. И если в почве без растений численность нефтеокисляющих микроорганизмов колебалась на одном уровне, то в ризосфере и ризоплане она увеличивалась вместе с развитием растений, и в конце опыта, как правило, превышала начальную на порядок и более. Но, несмотря на высокую численность нефтеокисляющих микроорганизмов в ризосфере и ризоплане, посадка растений в этом эксперименте не повлияла на уменьшение количества остаточной нефти.

Это связано с тем, что биомасса растений на нефтезагрязненной почве была крайне низкой - более чем в 100 раз меньше, чем на незагрязненной почве. Всхожесть растений на нефтезагрязненной почве не отличалась от таковой на чистой почве, однако, через 10-15 дней после прорастания наблюдалось внезапное резкое угнетение и гибель 90 % и более взошедших растений. Таким образом, основным сдерживающим фактором применения растительно-микробного взаимодействия в биорекультивации нефтезагрязненных почв является их фитотоксичность.

В литературе в качестве основных факторов неблагоприятного влияния нефтяного загрязнения на растения и почвенные микроорганизмы отмечены токсическое действие углеводородов нефти и изменение водно-воздушного режима почвы. Для оценки каждого из этих факторов нами был поставлен опыт в 4-х вариантах. В 1-м варианте семена замачивали на сутки и высаживали на поверхность почвы, при этом они испытывали только прямое токсическое действие углеводородов. Во 2-м варианте их не замачивали и так же высаживали на поверхность почвы, при этом, кроме токсического воздействия углеводородов, на них влиял недостаток воды в загрязненной почве. В 3-м - семена замачивали и высаживали внутрь слоя почвы, при этом, кроме токсического воздействия углеводородов, на них влиял недостаток кислорода в загрязненной почве. И в 4-м варианте семена не замачивали и высаживали в слой почвы, и при этом они испытывали комплексное воздействие всех неблагоприятных факторов в нефтезагрязненной почве.

В 1-м варианте снижение числа проросших растений отмечалось только при дозах нефти, превышающих 30 %, при которых нефть уже не сорбировалась почвой, а

образовывала на ней пленку, однако отдельные семена прорастали и сквозь нее. Во 2-м и 3-м вариантах отмечалось сходное влияние на прорастание семян недостатка воды и кислорода. Снижение всхожести в 2 раза отмечалось при дозе нефти в 20 %. Но во 2-м варианте снижение всхожести семян наблюдалось при дозах нефти, превышающих 10%, а в 3-м - после 5 %, что указывает на большую роль для прорастания семян недостатка воды, чем кислорода. Наименьшая всхожесть семян бьла отмечена в 4-м варианте при комплексном воздействии всех вышеуказанных факторов, при этом уменьшение всхожести семян наблюдалось после дозы нефти в 5%, а снижение всхожести в 2 раза - при 10 %, полное отсутствие прорастания - при 30 %.

Таким образом, в данном эксперименте не было обнаружено прямого токсического действия углеводородов нефти на прорастание семян. Однако полученные данные не объясняют массовую гибель взошедших растений, наблюдавшуюся нами в предыдущем опыте и отмеченную также целым рядом авторов. Поэтому после анализа полученных данных и сведений, указанных в литературных источниках, мы пришли к выводу, что такой эффект гибели растений не связан ни с прямым токсическим действием углеводородов нефти, ни с изменением водно-воздушного режима нефтезагрязненной почвы Для объяснения этого явления нами была выдвинута гипотеза микробного происхождения токсичности нефтезагрязненной почвы для растений.

С целью изучения микробной токсичности нефтезагрязненной почвы и выявления в ней токсинобразующей группы микроорганизмов была исследована выживаемость стерильных и нестерильных растений в почве с внесением нефти. Для этого растения Т. pretense были выращены в стерильных и нестерильных условиях на почве без нефти и почве с нефтяным загрязнением 30 %. В части вариантов с загрязнением и без него стерильность нарушалась добавлением накопительной культуры бактерий или сапрофитных грибов (Mucor sp, Aspergillus sp). Накопительные культуры микроорганизмов были выделены из ризосферы растений, выросших на почве с внесенной в дозе 30 % нефтью. Титр внесенных клеток составлял 103-104 кл/мл.

Полученные результаты представлены в табл. 4. На нестерильной нефтезагрязненной почве наблюдается гибель всех растений, в то время как в стерильных условиях выживаемость растений на почве с нефтью сравнима с выживаемостью растений на чистой почве с нестерильной средой.

Таблица 4

Влияние почвенной микрофлоры на выживаемость клевера _лугового в почве с нефтяным загрязнением (30%)_

Варианты опыта

Выживаемость, %

Почва с нефтью, нестерильные условия Почва с нефтью, стерильные условия Почва без нефти, нестерильные условия Почва без нефти, стерильные условия Почва с нефтью с внесением накопительной культуры бактерий Почва с нефтью с внесением накопительной культуры грибов

0

79,5+1,6 84,0+1,9 92,4+1,5

64,4+1.5 о

Была проанализирована их численность в ризосфере растений и почве при разных уровнях загрязнения нефтью. Полученные данные показывают, что при нефтяном загрязнении в корневой зоне растений происходит резкий рост численности

сапротрофных микромицетов, превышающий увеличение их численности в почве без растений.

Численность грибов в ризосфере и ризоплане клевера (A pratense) превышала таковую в почве без растений на два порядка, а в ризосфере и ризоплане В mermis - на порядок. В ризосфере и ризоплане растений, выросших на чистой почве, доля сапротрофных микромицетов составила всего десятые доли процента от общей численности микроорганизмов. С возрастанием дозы нефти доля микромицетов в ризосфере и ризоплане повышалась, при 20-30 %-ном загрязнении она составляла несколько десятков процентов, наибольшая доля микромицетов от общей численности микроорганизмов наблюдалась у клевера, при 30 %-ном загрязнении она достигала 69 % в ризосфере.

При инокуляции накопительной культуры грибов в нефтезагрязненную стерильную почву также наблюдается полная гибель растений. Это показывает, что основными микроорганизмами-токсинообразователями в загрязненной нефтью почве являются сапротрофные грибы, хотя при аналогичной инокуляции бактерий выживаемость растений также несколько снижается, по сравнению с выживаемостью растений, выросших на почве с нефтью в стерильных условиях.

Для оценки повышения токсичности нефтезагрязненной почвы вследствие роста численности сапрофитных микромицетов была изучена всхожесть семян клевера лугового на почвенных вытяжках из почвы без растений и из ризосферы клевера лугового и костра безостого, выращенных с различным уровнем нефтяного загрязнения.

Полученные данные показали (рис.1), что количество проросших семян зависело от численности сапротрофных микромицетов в почве.

Уровни загрязнения

Рис. 1. Воздействие нефтяного загрязнения на флору в зависимости от уровня загрязнения Уровни загрязнения 1 - без загрязнения; 2 - 1 % нефти; 3- 10% нефти, 4-20% нефти, 5 — 30% нефти. А - ризосфера клевера; В - ризосфера костреца; С - почва без растений с предварительно разлитой нефтью, Б- почва без растений со свежеразлнтой нефтью

Коэффициент корреляции между всхожестью семян и численностью грибов в почве, из которой готовилась вытяжка, составлял -0,8.

Таким образом, токсичность нефтезагрязненной почвы для растений вызвана ее микробным токсикозом, т.е. накоплением в почве метаболитов микроорганизмов, действующих на растения как токсины. При этом основной группой микроорганизмов, вызывающей токсикоз, являются сапротрофные микромицеты, развитие которых в зоне ризосферы и ризопланы растений стимулируется внесением в почву нефти.

Для проверки полученных в лабораторных условиях данных о роли сапротрофных микромицетов в фитотоксичности нефтезагрязненных почв было изучено на экспериментально загрязненных участках в полевом эксперименте влияние на выживаемость и урожайность растений противогрибных бактериальных препаратов «Агат-25» и «Триходермин», а также противогрибного антибиотика нистатина.

Обработка препаратами, защищающими растения от грибных заболеваний, привела к снижению численности микромицетов в ризосфере и ризоплане растений и повышению выживаемости и урожайности растений на нефтезагрязненных площадках. При этом коэффициент корреляции между численностью микромицетов в ризосферной зоне и выживаемостью растений был-0,46, а между численностью и урожайностью -0,36; коэффициенты корреляции между теми же показателями в ризоплане составляли -0,34 и - 0,24, соответственно.

Наименьшее количество микромицетов в зоне ризосферы и ризопланы отмечено у растений, обработанных бакпрепаратом «Агат-25» и антибиотиком нистатином. Однако наибольшая выживаемость и биомасса растений на нефтезагрязненной почве отмечалась при их обработке Агатом-25, в то время как разница между выживаемостью и биомассой растений при обработке их нистатином и «Триходермином» в большинстве случаев была статистически недостоверна. Это объясняется многосторонностью действия Агата-25 на растения (действие не только на грибных, но и на бактериальных возбудителей болезней, наличие стимуляторов роста, улучшение минерального питания растений).

Обработка нистатином и «Триходермином» повышала общую биомассу растений, выросших на нефтезагрязненной почве, в 2-3 раза, а бактериальным препаратом «Агат-25» — в 6-11 раз, при этом обработка первыми двумя препаратами повышала выживаемость растений на нефтезагрязненной почве в 2-3 раза, а Агатом-25 - в 4-10 раз.

В ризосфере и ризоплане растений, произраставших на незагрязненной почве, преобладали виды микромицетов Fusarium oxysporum и Penicillum sp., в зоне ризосферы и ризопланы на нефтезагрязненной почве во всех вариантах опыта, за исключением растений, обработанных нистатином, доминирующими были Mucor sp., Aspergillus sp., Penicillum sp., Fusarium sp. В ризосфере и ризоплане растений, обработанных нистатином, преобладали виды рода Fusarium.

С уменьшением сроков загрязнения наблюдалось увеличение численности микромицетов в зоне ризосферы и ризопланы растений и, соответственно, уменьшение биомассы и выживаемости растений. В тех случаях, когда количество микромицетов в ризоплане составляла порядка 108 КОЕ/г корней, и в большинстве случаев, когда численность грибов в ризосфере было 107 КОЕ/г почвы, наблюдалась полная табель растений.

Статистически достоверная разница в содержании остаточной нефти между площадками с посадкой растений и без нее в данном опыте была только в варианте с обработкой препаратом Агат-25 растений, росших на почве, загрязненной нефтью 4 года назад. В данном варианте растения, выросшие на нефтезагрязненной почве, имели наибольшую выживаемость, а также общую и корневую биомассу. Биомасса высушенных до постоянного веса корней растений в этом случае составляла около 50 г/м2, что, по-видимому, является минимальной массой, способной оказать влияние через микрофлору ризосферы и ризопланы на деструкцию углеводородов нефти.

Таким образом, применение противогрибных препаратов позволяет уменьшить численность микромицетов в зоне ризосферы и ризопланы, что увеличивает выживаемость и биомассу растений на нефтезагрязненной почве и способствует ее самоочищению от углеводородов нефти.

2.2.7. Гумификация углеводородов нефти в процессе восстановления нефтезагрязненных почв

Изучение процесса гумификации проводили в полевых условиях С этой целью было изучено влияние на процесс гумификации нефти азотсодержащих соединений неорганического происхождения - КМО3 и органического - мочевины. В первом варианте в нефтезагрязненную почву (24 л/м2) вносились минеральные удобрения, в состав которых входили соединения фосфора, калия и азота; во втором варианте -нитрат калия и в третьем - мочевину.

Данные о содержании углерода гуминовых и фульвокислот в нефтезагрязненной и контрольной почвах свидетельствют о том, что в первый период времени после загрязнения происходит уменьшение их суммарного содержания. В последующие годы суммарное количество гуминовых кислот и фульвокислот восстанавливается, а затем — превосходит количество их в контрольном образце. Влияние внесения удобрений сказывается на том, что для образцов почвы, в которые вносили удобрения, характерно более высокое содержание гумусовых кислот, чем для образцов почвы, в которых самоочистка от нефти протекала без использования мелиорантов.

В то же время обращает на себя внимание тот факт, что содержание гуминовых и фульвокислот изменяется неодинаково. В первый месяц после внесения нефти содержание гуминовых кислот в образце 1М составило 0,4%, а содержание фульвокислот - 0,31%, в то время, как в незагрязненной почве содержится 0,24 и 0,20 гуминовых и фульвокислот соответственно. Таким образом, в результате нефтяного загрязнения происходит одновременное уменьшение количества гуминовых и увеличение количества фульвокислот. В дальнейшем, по мере очищения почвы от нефти, происходит возрастание доли гуминовых и уменьшение доли фульвокислот в составе почвенного гумуса.

Для всех образцов почвы, подвергшихся нефтяному загрязнению, характерно более высокое содержание фульвокислот, чем в контрольном образце. Их количество колеблется, но в среднем остается на одном уровне. Для нефтезагрязненных почв, в которые вносили удобрения, характерно более высокое содержание фульвокислот, чем для почв, в которых процесс самоочистки протекал без мелиорантов.

Динамика изменения содержания гуминовых кислот подчиняется другим закономерностям. После резкого уменьшения их количества непосредственно после внесения нефти, начинается постепенное возрастание их доли в составе почвенного гумуса. Этот процесс протекает довольно медленно, и только на 4-й год после внесения нефти их количество приближается количеству гуминовых кислот в контрольном (исходном) образце. В последующем их содержание остается практически на том же уровне. В образцах почвы, в которые вносили нитраты, содержание гуминовых кислот выше, чем в тех, где самоочистка от нефти протекала без мелиорантов, и практически приближается к исходному содержанию гуминовых кислот в почве. Но в целом эти два ряда образцов почв не сильно отличаются друг от друга по количеству гуминовых кислот. Иная закономерность проявляется для образца, в который в качестве мелиоранта вносили мочевину. На пятый год после нефтяного загрязнения содержание гуминовых кислот в нем на 30% превосходит их исходный уровень.

Найденные закономерности предоставляют широкие возможности для использования процессов гумификации, протекающих в нефтезагрязненных почвах.

Итак, на основе приведенных выше закономерностей, можно предложить следующий механизм формирования гуминовых кислот в нефтезагрязненных почвах. После поступления в почву углеводородов нефти, происходит их частичная сорбция гумусом почвы, другая, несорбированная часть подвергается трансформации в «незрелые гуминовые кислоты»-фульвокислоты. По мере трансформации свободных углеводородов, происходит их десорбция из почвенного гумуса.

27

затель глубины гумификации Сг„:Сл., нефтезагпязненных

Образец*

95С 091

96С I 10

98С 0.79

99С 0 67

95Н 0,70

96Н 0.80

98Н 0,58

99Н 0,38

95М 124

96М 1.15

98М 0,73

99М 0 28

1М 0,12

К 1.23

Таблица 5 почв

* С - с добавлением минеральных веществ; Н - с добавлением нитратов; М - с добавлением мочевины.

В дальнейшем происходит процесс конденсации фульвокислот между собой и с гуминовыми кислотами.

Для характеристики изменения группового состава гумуса удобно пользоваться такой характеристикой, как степень гуматности (фульватности), которая характеризуется соотношением Сгк:Сфк. Данные о степени гуматности (фульватности) приведены в табл. 5. Этот показатель характеризует глубину гумификации. Найденные величины Сгк:Сфк лежат в пределах, характеризующих почвы от глее- и болотно-подзолистых (0.54) до серых лесных (1.1) и каштановых (1.63) почв.

Анализ молекулярно-массового распределения гуминовых кислот из нефтезагрязненной почвы подтверждает предположения, сделанные на основе изменения группового состава гумуса по мере самоочищения почвы от нефти. В первый месяц после внесения нефти в почву происходит обогащение гуминовых кислот легкомолекулярными фракциями и, соответственно, уменьшение их среднемолекулярной массы. В последующем происходит их конденсация и среднемолекулярная масса гуминовых кислот возрастает. Затем вновь наблюдается некое уменьшение среднемолекулярной массы образцов. В конечном итоге, через 5 лет после внесения нефти в почву этот показатель для всех образцов (с добавлением мочевины, с добавлением нитратов, без мелиорантов) приближается к исходному. Такая тенденция изменения среднемолекулярной массы, по видимому, отражает то, что гумификация в нефтезагрязненной почве протекает в два этапа. Первый этап описывается теорией М.М. Кононовой и представляет собой конденсацию нефтяных углеводородов с образованием более высокомолекулярных гуминовых кислот. Второй этап описывается теорией Л. Н. Александровой. На этом этапе происходит дальнейшее «созревание» и трансформация новообразованных гуминовых кислот, сопровождающееся уменьшением их среднемолекулярной массы.

Судя по диаграмме (рис.2), в первый период времени после нефтяного загрязнения атомные отношения элементов, входящих в состав гуминовых кислот, лежат в области, близкой той, что характерна для фульвокислот.

В последующие годы происходит дальнейшая трансформация гуминовых кислот и на четвертый - пятый год после внесения нефти их состав приближается к исходному уровню. Общее направление трансформации гуминовых кислот в процессе очищения почвы от нефтяного загрязнения заключается в деметилировании и дегидратации, причем процесс дегидратации выражен более явно. Это также говорит в пользу того предположения, что при поступлении нефти в почву гуминовые кислоты частично

сорбируют углеводороды нефти и в дальнейшем происходит их конденсация с отщеплением молекулы воды.

По мере очищения почвы от нефти образуются гуминовые кислоты с большей энтропией образования, величиной свободной энергии, энтальпии и теплоты сгорания. Это свидетельствует о росте степени разупорядоченности молекул, уменьшении суммы энергетических связей между атомами молекул гуминовых кислот в почвах, в которых прошел процесс очищения от нефтяного загрязнения, о возрастании вероятности их спонтанного окисления. Эти данные также согласуются с фактом более высоких значений ДО0, ДЭ0 у молекул ароматического ряда по сравнению с молекулами алифатического (табл. 6).

Таблица 6

Образец 0° I ЛИ» дэ®

кДж/г Дж/г

95С -20,19 -1,49 -2,18 -3,41

96С -21,40 -1,88 -2,72 -4,06

98С -18,09 -3,08 416 -4,86

99С -16,46 -5,91 -7,44 -6,48

95Н -22,50 -2,86 -4,03 -5,58

96Н -20,89 -3,21 -4,42 -5,60

98Н -19,27 -4,97 -6,48 -6,56

99Н -17,23 5,01 7,54 6,98

95М -24.77 -1,70 -2,59 -4,52

96М -22,86 -2,28 -3,43 -4,92

98М -21,32 -3.48 -5,03 -5.71

99М -19.02 -4 45 -6,47 -6,02

1М -17,04 -5,91 -7,47 -6,57

К -21,47 -2,37 -3,37 -4,77

Рис. 2. Диаграмма атомных отношений Н С-0 С гуминовых кислот 1 - потеря СН3, 2 - дегидратация, 3 - декарбоксилирование *

2.2.8. Рекультивация нефтезагрязненных почвогрунтов на территории нефтехимического предприятия

Рекультивация нефтезагрязненных почвогрунтов была проведена на территории АО «Нефтехимию) (г. Пермь) и включала весь комплекс мероприятий, необходимых для восстановления загрязненных почв. Для этого нефтезагрязненная территория, была разделена на 6 участков с учетом рельефа, площадью около 600 м2.

В результате химического анализа почвенных проб с участков, загрязненных нефтепродуктами, установлено, что наиболее часто встречающимися веществами-загрязнителями являются н-бутанол, изобутанол, н-масляный альдегид, изомасляный альдегид, 2-этилгексанол, бензол и толуол. Эти соединения присутствовали в загрязненной почве практически на всей территории завода. Кроме того, они относятся к разным классам химических соединений, оказывающих различное токсическое воздействие на живые организмы. Например, н-бутанол, как показали лабораторные эксперименты, оказывает сильное токсическое воздействие на ростки растений уже при низких концентрациях.

Ремедиацию загрязненной почвы проводили путем вспашки, внесения бакпрепрата и минеральных удобрений. Рекультивационные работы заканчивались посадкой на загрязненном почвогрунте растений, являющихся индикатором токсичности.

В течение летних месяцев было проведено три этапа агротехнических мероприятий на загрязненных участках нефтехимического завода. После каждого этапа агрохимической обработки производили индикаторные посевы многолетних трав. После обработки загрязненных участков на них был проведен посев ячменя и овса.

Анализы нефтепродуктов в почвах экспериментальных площадок показали не только снижение концентрации веществ-загрязнителей, но и изменение состава нефтепродуктов. Так, если после первого этапа агротехнической обработки основными загрязняющими веществами были н-бутиловый спирт и 2-этилгексанол, причем наиболее загрязненным оказался слой в 20-30 см, то при повторном отборе содержание этих веществ в пробах значительно снизилось, но в это же время в пробах появился новый, ранее отсутствующий загрязнитель 2-этилгексаналь.

В пробах почвы, отобранных после третьего этапа обработки, увеличился как качественный, гак и количественный состав нефтепродуктов. В некоторых пробах

содержание веществ-загрязнителей увеличилось, особенно заметно увеличилось содержание 2-эгилгексаналя. Эти изменения можно объяснить проникновением выше указанных нефтепродуктов из нижележащих почвенных слоев в верхние, вследствие выпадения осадков в виде дождя и повышения уровня грунтовых вод.

2.2.9. Влияние шламовых амбаров на окружающую среду и их рекультивация

Шламовые амбары являются одновременно потенциальным и реальным источником загрязнения окружающей среды.

Нами было обследовано три шламовых амбара, которые различались по времени ввода их в эксплуатацию и расположению в местностях с отличным друг от друга ландшафтом.

Чтобы оценить уровень загрязнения почвы остаточной нефтью и 3,4-бензпиреном, вокруг каждого амбара было заложено 12 пунктов отбора проб грунта. Пункты отбора проб располагались радиально по три с каждой стороны амбара на расстоянии от обваловки 1, 5 и 10 м. В каждой точке отбирали четыре пробы с глубины 0,2; 1; 2 и 3 м. Результаты исследования приведены в табл. 7.

Как видно из данной таблицы наиболее загрязненным является почвенный слой 020 см глубиной, но значения 3,4 - бензпирена в нем не превышают величины его ПДК в почве.

В то же время в пунктах отбора 4, 6, 12, 16 и 19 на глубинах от 8 до 20 метров наблюдаются достаточно высокие значения 3,4 - бензпирена, в трех точках отбора на глубинах 16 и 20 метров значения превышали значения ПДК 3,4 - бензпирена в почве. Такое распределение 3,4 - бензпирена на выше указанных глубинах, по-видимому, можно объяснить не проникновением 3,4 - бензпирена на данные глубины из верхнего почвенного слоя, а его микробиологическим синтезом.

Нами разработан и запатентован метод рекультивации шламового амбара путем экскавации твердой фазы котлована-шламонакопителя, вывозом ее на специально оборудованное операционное поле и ремедиацией загрязненного грунта путем метода детоксикации.

Для этой цели с помощью бульдозера была подготовлена горизонтальная площадка размером 50x100 м. Водоупорным основанием площадки был плотный глинистый грунт, служащий барьером для дождевых и грунтовых вод.

Вывезенный грунт распределялся по всей поверхности операционного поля слоем в 20-30 см. После этого в этот слой нефтезагрязненого грунта вносили торф, древесный опил, биогумус, минеральные удобрения и специальные добавки с целью аэрации, приданию почве определенной структуры и создания в ней благоприятных физико-химических условий для жизнедеятельности аборигенной почвенной микробиоты.

После внесения вышеуказанных мелиорантов на поле осуществлялся посев семян злаковых и бобовых культур с нормой высева 20 кг/га. Примерно через две недели после высева семян на операционном поле появились первые всходы семян.

Если среднее содержание остаточной нефти в грунте до обработки операционного поля составляло 8,2 %, то после его обработки в момент появления устойчивого травяного покрова на нем содержание остаточной нефти составляло уже 5,4 %.

Проективное покрытие всходов составило 94 %.

Таблица 7

Содержание остаточной нефти и 3,4-бсшпнрена в почвенных

обш зцах. отобранныхнатерриториишламовых амбаров

Глубина Месторождение Месторождение Западно-Ноябрьское

точки отбора "Пограничное", "Пограничное", месторождение,

отбора пробы, м Шламовый амбар № 1 Шламовый амбар №2 Шламовый амбар №3

пробы оста-точная 3,4-бенз- оста-точная . 3,4-бенз- оста-точная 3,4-бенз-

нефть мг/г пирен, мкг/кг нефть мг/г пирен мкг/кг нефть мг/г пирен, мкг/кг

1 0,2 0,01 1,82 0,1 10,58 0.010 7,61

1 0,25 8,54 0.8 12,06 0.400 9,73

2 0,6 5,15 0,006 3,17 0400 3,60

3 0,006 5,27 0,006 4,31 0.-100 9.38

2 0,2 0,05 1.47 0,006 3,24 6.250 12,70

I 0.2 4,75 0.006 1,28 3.130 9,18

2 0,1 2,81 0,006 2,65 0.100 6,59

3 0,1 3,10 0,006 1,37 0.600 15,33

3 0,2 0,25 2,82 0,006 2,14 3.13 19,07

1 0,05 3.54 0,006 3,08 1.5 6.54

2 0,025 4,31 0,006 1,19 1 18 18,72

3 0,001 3,59 0,006 1,08 0.4 4,03

4 0,2 6.25 3.12 0,025 4.71 0.025 , 1,31

1 1,5 7,13 0,06 8,35 6.25 19,27

2 1,18 4,10 0,025 3,27 0.4 5,32

3 0,4 8,01 0,006 2,32 0.025 1,12

5 0,2 0,4 16,93 0,3 21,09 0.1 7,26

1 0,4 6,23 0,05 8,34 0.4 3,45

2 0,6 4,42 0,006 2,52 3.13 12,97

3 0,8 4,51 0,006 1,89 6.25 3,23

6 0,2 4,69 3,53 0,025 5,67 5,68

1 3,3 4,81 0,006 3,35 6.25 10,83

2 0,06 3,82 0,006 2,28 3.13 5,74

3 0,2 1,94 0,006 3,17 6.25 5,80

7 0,2 0,2 2,0 0,006 4,37 0.1 1,63

1 1,8 8,87 0,025 6,78 0.4 8,52

2 2,006 7,81 0,006 5,27 9.32 29,00

3 3,05 8,45 0,025 4.28 0.8 5,56

8 0,2 0,006 2,73 0.02 3.43

1 0,050 3,86 0,1 7,37

2 0,006 1,,21 0.05 4,09

3 0,025 8,83 0.2 2,21

9 0,2 0,006 3,45 0.032 4,29

1 0,006 2,39 0.05 4,00

2 0,060 1,17 0.2 1,59

3 0,006 1,01 0.4 4,58

10 0,2 0,006 2,33 0.1 6.61

1 0,006 2,88 6.25 9,58

2 0,006 1,36 12.5 12,75

3 0,001 2.34 12.5 19,27

11 0,2 0,025 3,87 0.8 6,41

1 0,001 2,61 3.13 9.71

2 0,025 4,54 0.4 8.20

3 0,025 4,87 0,15 3,78

12 0,2 0,006 2,51 0.4 2,74

1 0,100 5,19 1.56 11,93

2 0,006 2,03 12,5 2.97

3 0,100 3,34 0.4 2.11

Мелиоранты, которые были внесены на операционное поле, тщательно перемешивались с нефтезагрязненым грунтом путем вспашки и дискования.

В пробах грунта, прошедшего детоксикацию, интегральная токсичность, измеренная биолюминесцентным методом, составила 0 или 1 балл. Это свидетельствует о том, что почва, прошедшая обработку, не токсична или малотоксична при содержании в ней 5,4 % остаточной нефти.

Согласно полученным данным, предлагаемый метод обработки нефтезагрязненного грунта вполне пригоден для его детоксикации.

2.2.10. Интенсивная технология восстановления нефтезагрязненных почв

Нами изучена возможность в течение одного месяца провести детоксикацию нефтезагрязненных почв с нагрузкой 24 л/м2 до уровня ее нетоксичности для растений.

Для эксперимента использовалась дерново-подзолистая средне суглинистая почва, отобранная на биостанции ИЭГМ УрО РАН с глубины ( 0-15 см),

На первом этапе лабораторного эксперимента почва была обработана сырой нефтью дозой 24 л/м, являющейся высокой степенью загрязнения почвы. Продолжительность этапа составляла трое суток.

На втором этапе в почву были внесены органические и минеральные вещества. Продолжительность этапа составила трое суток.

На третьем этапе в почву была внесена биомасса дрожжей. Продолжительность этого этапа составила две недели.

На четвертом этапе почва была обогащена биогумусом с вермикультурой (земляные черви).

Рис. 3 Динамика изменения численности гетеротрофных(1) и

углеводородокисляющих микроорганизмов(2).

Продолжительность этапа составила один месяц.

Для проверки проб почвы на мутагенность использовались только те пробы, у которых токсичность не превышала 50%. Учет результатов проводился в сравнении опытного и контрольного вариантов.

В период до загрязнения (контрольная почва) численность гетеротрофных микроорганизмов составляла 4,5 х 107 кл/г почвы. Загрязнение нефтью (степень экспериментального загрязнения высокая - 24 л/м2) изменило условия обитания микроорганизмов в почве и привело к снижению численности гетеротрофов на два порядка в течение трех первых суток (рис.3)

а

Рис 4 Динамика численности актиномицетов и грибов в контрольной почве и на различных этапах эксперимента 1 Актиномицеты, 2.Грибы

Аналогичные изменения численности, связанные с нефтяным загрязнением, произошли и в других группах микроорганизмов. Так, содержание в почве углеводородокисляющих микроорганизмов уменьшилось на два порядка с 4,0х10э до 7,5x10' клеток/г почвы, грибов и актиномицетов на три порядка с 2,55 х 10 до 2,5х102 и с 2,5 х 106 до 4,5 х 103кл/г почвы соответственно (рис.3); численность споровых бактерий снизилась на два порядка с 2,5х103 до 2,5x10' клеток/г почвы; анаэробных бактерий на один порядок с 4,5 х 106 до 4,5 х 105 клеток/г почвы (рис 5).

с

х Этапы эксперимента

Рис. 5. Динамика численности анаэробных и споровых микроорганизмов в контрольной почве и на различных этапах эксперимента I. Анаэробы, 2. Споровые

После обработки нефтезагрязненной почвы органическими и минеральными веществами на втором этапе лабораторного эксперимента, численность некоторых групп микроорганизмов продолжала снижаться (гетеротрофы и актиномицеты -снижение численности на один порядок, анаэробы - на два порядка), численность же остальных исследуемых цции ипмциици 111^4"" оста паст, на прежнем уровне.

Внесение биомассы ш&^еМАВДодоадедд^Ппе эксперимента, привело к увеличению численности «очти вШ^НфИКНикрофганизмов кроме споровых, в

лечение двух недель. Произошла значительная интенсификация роста углеводородокисляющих микроорганизмов и грибов, их численность возросла на четыре порядка, процесс увеличения численности характерен также для актнномицеюв - увеличение на три порядка Противоположный эффект наблюдается для спорообразующих бактерий, так как происходит уменьшение их численности на два порядка с 2,0 х 103 до 2,5 х 101 кл/г почвы.

Через месяц после внесения вермикультуры, на четвертом этапе лабораторного эксперимента, наблюдалось дальнейшее увеличение численности всех исследуемых физиологических групп микроорганизмов. Произошло не только восстановление исходного уровня численности микроорганизмов, но и превышение уровня их численности в почве до ее загрязнения нефтью. Так, количество углеводородокисляющих микроорганизмов превысило показатели контрольной почвы на два порядка и составило 7,5x105 кл/г почвы Численность гетеротрофных микроорганизмов, грибов и анаэробов превысила показатели контроля на один порядок. А численность актиномицетов и споровых бактерий восстановилась до исходного уровня нефтезагрязненной почвы.

Исследования почвы на третьем этапе эксперимента, спустя две недели после обработки ее биомассой дрожжей, показали, что всхожесть семян редиса несколько снизилась, со 170 до 140%, несмотря на это снижение, показатели всхожести в рекультивируемой почве были выше показателей в контрольной почве.

Токсичность почвы, загрязненной нефтью, и на различных этапах ее рекультивации определялась с помощью двух тест-систем, одна из которых основана на исследовании прорастания семян индикаторных растений в испытуемой почве, другая тест-система оценивает токсичность почвенных экстрактов по отношению к модельному тест-объекту - Sallmonella typhimurium.

В результате исследований по фитотоксичности, которые проводились на семенах редиса, было выявлено, что нефть оказывает сильное влияние на прорастание семян индикаторных растений. Так при загрязнении почвы нефтью на первом этапе лабораторного эксперимента, всхожесть семян редиса в этой почве была равна нулю, таким образом можно сказать, что загрязнение почвы большими концентрациями сырой нефти оказывает острое фитотоксическое действие.

После обработки почвы органическими и минеральными веществами на втором этапе лабораторного эксперимента, было зарегистрировано резкое увеличение всхожести семян редиса в исследуемой почве, всхожесть составила 173% по сравнению со всхожестью в контрольной почве, принятой за 100%.

По прошествии следующего этапа эксперимента была вновь оценена бактерицидность почвенного экстракта и отмечено резкое снижение выживаемости тест-объекта, она снизилась до 39,8%, бактерицидность при этом составила примерно 60%.

Через две недели после внесения в почву биомассы дрожжей, на третьем этапе лабораторного эксперимента, наблюдалось увеличение выживаемости клеток S.typhymurium на среде с экстрактом данной почвы. Выживаемость равнялась 73%, следовательно бактерицидность составила 27%. По прошествии месяца после обогащения почвы биогумусом с вермикультурой на четвертом этапе эксперимента, выживаемость клеток тест-объекта существенно возросла до 132%, что превысило показатели контроля на 32%.

Таким образом, при изучении токсичности нефтезагрязненной почвы на штамме ТА 1535 Salmonella typhimurium было отмечено острое бактерицидное действие почвенной вытяжки, приготовленной спустя шесть суток после загрязнения почвы углеводородами нефти и через трое суток после обработки этой почвы органическими и минеральными веществами (почвенная проба отбиралась по окончании второго этапа лабораторного эксперимента). Это может быть связано с тем, что возможно в

исходном состоянии сырая нефть не оказывает токсического действия на тестируемый микроорганизм, а экстракты почв, более долгое время загрязненных нефтью и обработанных органическими и минеральными веществами, уже являются бактерицидными вследствие некоторых изменений метаболизма почвенной микробиоты.

Дальнейшее проведение рекультивационных мероприятий, в частности, внесения биомассы дрожжей в почву на третьем этапе лабораторного эксперимента, приводит к увеличению выживаемости клеток S.typhimuгium на среде с экстрактом этой почвы. А обогащение почвы биогумусом с вермикультурой способствует восстановлению исходного уровня выживаемости клеток тест-объекта и последующему превышению этого фонового уровня.

Следовательно, через два месяца после загрязнения почвы нефтью в результате рекультивации удалось практически устранить токсическое действие нефти на прорастание семян индикаторного растения-редиса и на выживаемость клеток штамма ТА 1535 S.typhimuгium.

Мутагенность почвы загрязненной нефтью и на различных этапах ее рекультивации исследовалась в стандартном тесте Эймса на штаммах S.typhimuгium ТА 1535 и ТА 1538, после получения информации о степени бактерицидности этих почв. В зависимости от степени бактерицидности проб почвы определялся диапазон концентрации для определения мутагенной активности.

Изучение мутагенной опасности загрязненных нефтью и рекультивированных почв проводилось без метаболической активации. Показано, что образцы почвы, отобранные после первого и второго этапа эксперимента, имеют тенденцию к проявлению мутагенного эффекта. Кратность превышения среднего числа ревентантов над контрольными показателями на среде с экстрактами этих почв равнялось критическому значению (1,5), превышение которого свидетельствует о наличии мутагенного эффекта. .Для проб первого этапа, с сильным загрязнением нефтью, тенденция к проявлению мутагенности была отмечена только на штамме ТА 1535, а для проб второго этапа, с обработкой органическими и минеральными веществами, уже на двух индикаторных штаммов S.typhimuгium ТА 1535 и ТА 1538.

Таким образом, из исследованных образцов четырех этапов эксперимента по рекультивации нефтезагрязненных почв, ни один не обладал выраженным мутагенным действием, была отмечена лишь некоторая тенденция проявления мутагенного эффекта почвенных экстрактов первого и второго этапа эксперимента.

Первоначально в почве содержалось 100% нефти (на первом этапе), через три дня после обработки органическими и минеральными веществами (на втором этапе) содержание нефти в исследуемых образцах почвы снизилась на 9,1%. Через две недели после внесения в почву биомассы дрожжей (на третьем этапе) остаточная нефть составила 87,4% от первоначального содержания. Через месяц после обогащения почвы биогумусом с вермикультурой (на четвертом этапе) остаточное содержание нефти несколько возросло и составило 89,9%.

Таким образом, было установлено, что в данном эксперименте по рекультивации нефтезагрязненных почв не происходит резкого падения содержания нефти в почве, т.е. сильно выраженная деградация углеводородов нефти через ряд промежуточных соединений до воды и углекислого газа не характерна для данного способа рекультивации.

2.2.11. Использование вермикулыуры в процессе рекультивации нсфтезагрялшшых территорий

Для эксперимента использовалась дерново-подзолистая нефтезагрязненная почва, взятая после второго этапа обработки с применением интенсивной технологии восстановления нефтезагрязненная почвы.

После этого в почву вносили белковый препарат, содержащий белок животного происхождения (протеин), дрожжи и биомассу микроорганизмов. В таком состоянии почву оставляли в сухом месте при комнатной температуре и раз в три дня ее перемешивали и увлажняли до исходной влагоемкости. Затем в почву вносили культуру красного калифорнийского земляною червя Е1зеша ¡еШа, адаптированного к слабозагрязненной углеводородами нефти почве. После данной операции определяли фитотоксичность нефтезагрязненной почвы, предварительно удалив из почвы земляных червей. Результаты эксперимента представлены в табл. 8

Таблица 8

Характеристика некоторых параметров нефтезагрязненной почвы

до и ^ после обработки вермикультурой

Остаточная нефть Гумус Физиотогические группы микроорганизмов ( кл/г)

<%> Гетеротрофи ые Углеводоро докисляющ не Актином и ц еты Грибы Спорообраз ующис

Почва до обработки вермикультурой

1.S 3,4 10' .0' 10' . 10« ___ 10°

Почва после обработки вермикупиурой

0,7 7,8 ю- 10' 10' 10* 10'

Через два месяца культивирования земляных червей эксперимент заканчивали. Одним из первых признаков завершения процесса по наращиванию червей являлось внешний осмотр обработанной почвы. Она представляла собой рассыпчатую массу темно-коричневого цвета. Вторым признаком служило отсутствие запаха нефти.

Червей отделяли от почвы и подсчитывали число особей, образовавшихся после их двухмесячного культивирования. Среднее значение особей червей составило 1,95 тыс особей на 1м2.

Автор благодарен всем сотрудникам лаборатории техногенных экосистем, где она выполнялась, за помощь и подготовку данной работы. Особую признательность за постоянное внимание и помощь в работе автор хотел бы выразить к.г.-м.н. И.Г. Калачниковой и д.г.-м.н. А.А. Оборину.

Выводы

1. Изучен процесс самовосстановления нефтезагрязненных экосистем. Установлено, что определяющими факторами в данном процессе являются: количество нефти, попавшей в окружающую среду, среднегодовая температура местности и качественная характеристика почвенного покрова.

На территориях севера Тюменской области и Пермского Прикамья процессы самовосстановления нефтезагрязненных участков протекают по определенной схеме, но с разной интенсивностью, зависящей от температуры окружающей среды.

2. Разработан эффективный метод микробиологической детоксикации экосистемы, загрязненной углеводородами нефти, позволяющий в течение двухмесячного срока осуществить трансформацию токсических веществ в неопасные за счет термической обработки нефтесодержащего субстрата и последующего

преобразования его микроорганизмами в нетоксичные высокомолекулярные соединения, обеспечивающие восстановление нарушенного биоценоза.

3.При добавлении мочевины в загрязненные нефтью участки увеличивается на 30% количество гуминовых и фульвокислот, свидетельствующее о преобразовании углерода углеводородов нефти в нетоксичные гумусоподобные соединения.

4. Проведение предварительной температурной обработки нефтезагрязненных участков позволило элиминировать 2/3 первоначальной веса остаточной нефти. Введение мелиорантов (К, N, Р и органических добавок) способствовало активизации аборигенной микрофлоры, зависящей от температуры и влажности окружающей среды.

5. При загрязнении угодий углеводородами нефти от 1 до 30 % увеличивается в прикорневой части растений численность нефтеокисляюицих бактерий и несимбиотических микромицетов в среднем на 1-4 порядка.

6. При использовании микроорганизмов углеводородов нефти образуются соединения токсичные для флоры и фауны. Основной группой микроорганизмов, образующих токсины, являются несимбиотические микромицеты: Mucor, Aspeigillns, Penicilhim, Fnsarium, развитие которых стимулируется внесением в почву нефти.

Наиболее перспективными видами для формирования микробно-растительных нефтеокисляющих сообществ на нефтезагрязненных территориях являются: Вготорт inermis (Leys.) Holub , Elylrigia repens L. Nevski и Amoria ropens L.

7. Для ускоренного процесса минерализации нефти предложен препарат, состоящий из углеводородокисляющего микроорганизма Gordonia amicalis sp. now и обработанных термокаталитическим путем растительных остатков. Использование вермикультуры на завершающих этапах ремедиации нефтезагрязненных участков позволяет сбалансировать физиологический состав микробиоты и использовать нефтезагрязненную почву в качестве субстрата для наращивания биомассы земляного червя, который в свою очередь является материалом для получения дешевых ферментов, в частности, лизоцима.

8. От внедрения технологии детоксикации нефтезагрязненной грунта получен экономический эффект 870 руб. с одного куб. метра.

Практические предложения

В нефтезагрязненных районах рекомендуется проводить комплексную обработку пораженных участков, включающую: термическую обработку, активирование почвенной микрофлоры, путем внесения мелиорантов (содержащих N, Р, К) и проведение индикации с помощью высева биоиндикаторных растений.

В целом, предложенными в работе методами проведена реабилитация около 5 тыс. м3 нефтезагрязненного грунта на двух экспериментальных площадках Тюменской области и Пермского Предуралья.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Иларионов С.А., Каменских Т.Н., Колесникова Н.М. Влияние нефтяного загрязнения на биоценоз почв южной тайги // В кн.: "Бактериальный фильтр Земли" и значение природных углеводородокисляющих биоценозов для нефтяной биогеохимии и рекультивации земель и контроль загрязнения природной среды: Сбор. труд, научн. конф.- Пермь, 1985.- Т.1.- С. 33-34.

2. Оборин А.А., Калачникова И.Г., Иларионов С.А. Методические рекомендации по очистке нефтезагрязненных земель / Руководящий документ: ПО "Сургутнефтегаз".- Сургут, 1988. - 28 с.

3. Калачникова И.Г., Рубинштейн Л.М., Иларионов С.А. Фракционирование

изотопов углерода при антропогенных воздействиях // В кн.: Всесоюз. симп. по стабильным изотопам в геохимии: Мат. всесоюз. симп. - М, 1989. - С.ЗО.

4. Иларионов С.А., Каданникова И.Г., Благиных А.В., Плещева О.В. Характеристика экосистемы нефтезагрязненных почв // В кн.: Актуальные проблемы экологии: экологические системы в естественных и антропогенных условиях среды" (информационные материалы): Сб. труд, научн. конф.- Свердловск, 1989.- С.39-40.

5. Иларионов С.А. Биодеградация нефти в режиме периодического культивирования / В кн.: Регуляция микробных популяций: Сб. науч. труд,- Свердловск, 1990,-С.74-76.

6. Иларионов СА., Селезнев И.А. Микробиологическая' деструкция п-ксилола в режиме принудительной аэрации // В кн.: Физиология и биохимия микроорганизмов: Сб. науч. тр.- Екатеринбург, 1992.- С.88 - 91.

7. Середин В.В., Рахманкулов В.К., Иларионов С.А. Способ очистки грунтовых вод, загрязненных нефтью. Патент на изобретение № 5030348/13 от 20.08.93. Приоритет от 03.03.92.

8. Оборин А.А., Калачникова И.Г., Иларионов С.А. Научные основы рекультивации почвы и пресных водоемов, загрязненных нефтью// В кн.: Освоение Севера и проблемы рекультивации: Доклады II Междунар. конф.- Сыктывкар, 1994. -С.435-455.

9. Иларионов С.А., И.Г. Калачникова, СЮ. Иларионова, А.Н. Шкидченко Использование вермикультуры в рекультивации нефтезагрязненных земель// В кн.: Биоконверсия органических отходов и охрана окружающей среды: Материалы Межд. симп. - Киев, 1994.- С.68-69.

10. Селезнев И.А., Иларионов С.А. Тундровый почвенный биоценоз и воздействие на него буровой жидкости //В кн.: Освоение Севера и проблемы рекультивации: Доклады II Междунар. конф.- Сыктывкар, 1994.- С.471-472.

11. Селезнев И.А., Хмурчик В.Т., Иларионов С.А. Влияние бурового раствора на почвенный биоценоз тундры// В кн.: Перспективы развития естественных наук на Западном Урале: Тр. межд. науч. конф. Т.2. - Пермь, 1996,- С.27.

12. Карпов М.Ю., Иларионов С.А. Изменение численности микроскопических грибов и актиномицетов под действием сырой нефти // В кн.: Перспективы развития естественных наук на Западном Урале: Тр. межд. науч. конф. Т.2.- Пермь, 1996.-С.31.

13. Иларионов С.А. Основные подходы в рекультивации земель, загрязненных нефтью// В кн.: Перспективы развития естественных наук на Западном Урале: Тр. межд. науч. конф. Т.2.- Пермь, 1996.- С.98-99.

14. Иларионов С.А. Самоочищение нефтезагрязненных почв и их рекультивация // В кн.: Освоение Севера и проблемы рекельтивации: Докл. III Междунар. конф. -Сыктывкар, 1997. - С.333-336.

15. Ilarionov S.A. Scientific basis of biothenolgy of remediation of oilpolluted soil//In book: Enyironmental pollution: Assessment and Tretment: Proceed. Inter. Conf. environ, pollut. Edinburg, 1997.- P.92-94.

16. Khmurchik V.T., Ilarionov S.A., Seleznev LA. Oborin A.A. Rubinstein L.M. and Kolpakova E.G. Microbial potential opf springs attending various mineral deposits //

17. In book: Enyironmental pollution: Assessment and Tretment: Proceed. Inter. Conf. environ, pollut. Edinburg, 1997.- P. 104-106.

18. Карпов М.Ю., Быстрых А.А., Иларионов С.А. Микроскопические грибы и актиномицеты некоторых черноземных почв Пермской области // В кн.: Экологические основы стабильного развития Прикамья: Матер. Междунар. конф.-Пермь,2000.-С.69-70.

19

20

21

22.

23

24

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31

32.

33.

34.

Назаров А.В., Иларионов С.А. Углеводородокисляющая микрофлора ризосферы некоторых видов растений// В кн.:Экологические основы стабильного развития Прикамья: Матер. Междунар. конф.-Пермь, 2000.-С.92-93.

Иларионов С.А., Калачникова И.Г., Оборин А.А. Научные основы биотехнологии и рекультивации почв и очистки пресноводных водоемов, загрязненных нефтью // В кн.: Экологические основы стабильного развития Прикамья: Матер. Междунар. конф.-Пермь,2000.-С.313-314.

Кузнецов Ф.М., Иларионов С.А., Середин В.В., Иларионова СЮ. Рекультивация нефтезагрязненных почв / монография, Изд-во, ПГТУ. Пермь,2000.-104с. Оборин А.А., Иларионов С.А., Рубинштейн Л.М. Нафтидобиоз - природный процесс биосинтеза углеводородов биоценозом подземных вод глубоких и сверхглубоких горизонтов биосферы // В кн.: Новые идеи в геологии и геохимии горючих ископаемых (Нефтяная геология - итога XX века): Мат. четвер. межд. конф.- Москва, 2000.-С.237-239.

Назаров А.В., Иларионов С.А., Азизова Э.А. Формирование растительности на экспериментальных загрязненных площадках // В кн.: Вестник Пермского государственного университета: Вып. 2.- Биология.- Пермь, 2000.-С.80-84. Kim S.R., Drown R., Olfield С, Gilbert S.C., Ilarionov SA., Goodfellow M. Gordonia amicalis sp. Nov., a novel dibenzothiophene-desulphurizing actinomycete // Inter. J. Of System. And Evolut. Microbiol.- 2000.- V.50.-P.2031-2036.

Иларионов С.А., Калачникова И.Г. Комплексная технология рекультивации почв // В кн.: Технологии восстановления почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами: Справочник.- Москва, 2001.-С.52.

Иларионов С.А., Калачникова И.Г. Применение биотехнологических методов для конверсии органических веществ и их использование в ремидиации техногеннозагрязненных почв // В кн.: Научно-технический потенциал Западного Урала в области конверсии военно-промышленного комплекса: Матер. Междунар. сем.-Пермь, 2001.-С. 189-192.

Ilarionov S.A., Kalachnikova I.G., Sergeev V.A. Rehabilitation oil-polluted soil using product obtained in the proceess of organic wastes bioconversion // In book.: Oil and hydrocarbon spills, modelling analisis and control: Third inter. Conf. OIL Spill . Rhoodes, Greece, 2002.- P.94 - 97.

Иларионов С.А., Калачникова И.Г. Биоконверсия органических отходов с помощью вермикультивирования // В кн.: Дождевые черви и плодородие почв: Матер. II междунар. конф.- Владимир, 2002. -С.38-39.

Иларионов С.А., Пантюшина Л.П. Руководящий документ - инструкция по очистке и рекультивации природных объектов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами - Пермь, 2002.- 35 с.

Иларионов С.А., Сергеев В.А., Фусс В.А., Назаров А.В., Калачникова И.Г., Басов В.Н., Горелов В.В. Способ детоксикации нефтезагрязненных земель путем активирования почвенного микробного ценоза. Заявка № 2002115671/12 (021273). Приоритет от 25.07.2002.

Иларионов С.А., Сергеев В.А., Фусс В.А., Назаров А.В., Калачникова И.Г. Способ фиторекультивации нефтезагрязненных почв // Патент № 2002123819/13 (025252) от 10.03.2004. Приоритет от 6 сентября 2002.

Иларионов С.А., Назаров А.В., Калачникова И.Г. Роль микромицетов в фитотоксичности нефтезагрязненных почв // Экология. - 2003.- № 5.- С.241-246. Назаров А.В., Иларионов С.А., Калачникова И.Г. Способ повышения биомассы и урожайности растений на нефтезагрязненной почве. Заявка № 2003113298. Приоритет от 05.05.2003.

Назаров А.В., Иларионов С.А., Калачникова И.Г., Басов В.Н., Горелов В.В., Щукин В.М., Наргович Н.К. Способ повышения биомассы и урожайности

растений на нефтезагрязненной почве Заявка № 2003654356 Приоритет от 0610 2003

35 Иларионов С А Экологические аспекты восстановления нефтезагрязненных почв Изд во УрО РАН, Екатеринбург, 2004 - 194 С

ИЛАРИОНОВ Сергей Александрович

САМОВОССТАНОВЛЕНИЕ И РЕАБИЛИТАЦИЯ ПРИРОДНЫХ БИОГЕОЦЕНОЗОВ

Автореферат

ЛР №020769 от 20.04.98г.

Сдано в набор 20.07.2004. Подписано в печать 30.07.2004. Формат 60x84/16. Гарнитура "Таймс". Бумага для множительных аппаратов. Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ № 122

Отпечатано в типографии ООО "ИРА УТК" 620219, г.Екатеринбург, ул. К. Либкнехта, 42

№15076

РНБ Русский фонд

2005-4 11910