Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Каталазная активность углеводородокисляющих бактерий

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Каталазная активность углеводородокисляющих бактерий"

005007957

На правах рукописи

Гоголева Ольга Александровна

КАТАЛАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ

03.02.03 - «Микробиология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 Ш 2012

Оренбург-2012

005007957

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Немцева Наталия Вячеславовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Заслуженный работник высшей школы РФ, профессор, зав. кафедрой биологии ГБОУ ВПО Оренбургской государственной медицинской академии Минздравсоцразвития России

Кандидат биологических наук, зав. микробиологии ГБОУ ВПО Тюменской государственной медицинской академии Минздравсоцразвития России

Соловых Галина Николаевна

Тимохина Татьяна Харитоновна

Ведущая организация

ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России

Защита состоится J6» февраля 2012 г. атасов на заседании диссертационного совета Д 208.066.03 при Оренбургской государственной медицинской академии в зале заседаний диссертационного совета по адресу: 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6.

Тел.: (3532) 77-59-95; факс: (3532) 77-24-59; e-mail: orerria@esoo.ru). официальный сайт: www.orgma.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Оренбургской государственной медицинской академии Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан <43>> 2012 г., автореферат и текст объяв-

ления размещен на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, ^

профессор ¿у с . Немцева Наталия Вячеславовн

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Проблема поиска микроорганизмов-деструкторов актуальна, поскольку загрязнение окружающей среды сырой нефтью и продуктами ее переработки носит глобальный характер. Самоочищение водоемов от нефтяного загрязнения - сложный, многоступенчатый процесс, включающий микробную трансформацию нефти и нефтепродуктов (Миронов О.Г., 2000; Куликова И.Ю., 2005; Жуков Д.В., Мурыгина В.П., Калюжный C.B. 2006; Buckley et al., 1976).

Основным источником углеводородокисляющих микроорганизмов являются пресноводные и морские экосистемы, как загрязненных, так и незагрязненных территорий (Израэль Ю.А., Цыбань A.B., 1989; Бердичевская М.М., 1991; Коронелли Т.В., 1994). В плане поиска активных деструкторов, наряду с исследованием биологических свойств монокультур и ассоциаций бактерий, оценивается их способность к деструкции нефти и нефтепродуктов (Ившина И.Б., Бердичевская М.В., 1995; Куюкина М.С. и др., 1999; Звягинцева И.С., 2001; Плотникова Е.Г., 2001; Сопрунова О.Б., 2005; Atlas R.M. et al., 1992; Kaledine L., 1997).

В аэробных условиях разные группы микроорганизмов способны к биодеградации углеводородов, входящих в состав нефти. При этом важнейшим фактором окисления является достаточное количество кислорода, расход которого достигает 3300 г на 1 л сырой нефти (Миронов О.Г., 2002; Перетрухни И.В. и др., 2006). Несмотря на то, что для каждого микроорганизма характерен свой специфический набор ферментов и особый путь окисления углеводородов, этот процесс катализируется системами оксигеназ и оксидаз (Готгшалк Г., 1982). Кроме того, в природной среде наряду с биоокислением протекают и процессы самоокисления нефти и нефтепродуктов, которые проходят по свободно-радикальному механизму и связаны с образованием пероксидов (Петров A.A., 1984; Мочалова О.С., Антонова Н.М., Гурвич Л.М., 2002; Rojo F., 2009). При этом окислительный стресс, спровоцированный действием внешних факторов и формированием кислородных радикалов, сопровождается сильными изменениями в метаболизме бактерий, что может приводить, с течением времени, к гибели клетки (Современная микробиология ..., 2005; Белозерская Т.А., Гесслер H.H., 2006). Поэтому в процессе эволюции микроорганизмы выработали механизмы защиты, основанные на де-токсикации активных форм кислорода с участием каталазы, пероксидазы и супероксиддисмутазы (Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н., 2006). Исходя из этого, реакция ферментных систем является важным показателем активности процесса нефтедеструкции.

Также известна реакция ферментных систем почв на нефтяное загрязнение. По данным Киреевой с соавторами (2001), наиболее чутко на загрязнение реагирует каталазная активность почв. Степень обогащенности почв ферментами зависит, в том числе, и от микробной составляющей, однако, данные о каталазной активности микроорганизмов, входящих в состав почвенного биоценоза отсутствуют. Недостаточно изучена роль ферментов окислительного стресса в процессе микробной деструкции нефти.

Все вышеизложенное определило цель и задачи данного исследования. Цель работы. Определить значение каталазной активности ушеводо-родокисляющих бактерий в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов. Основные задачи:

1. Выделить углеводородокисляющие бактерии из микробных ассоциаций водоемов с различным уровнем антропогенной нагрузки и определить их видовой состав.

2. Определить биологические свойства углеводородокисляющих бактерий выделенных из водоемов.

3. В эксперименте оценить динамику каталазной активности чистых культур и ассоциаций углеводородокисляющих бактерий в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов.

4. Разработать способ отбора активных деструкторов нефти и нефтепродуктов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Каталазная активность способствует адаптации и выживанию бактерий, а также является индикатором их способности к биодеградации нефти и нефтепродуктов.

2. Каталазная активность углеводородокисляющих микроорганизмов, обладая диапазоном реакции, чутко реагирует на изменение содержания нефти и нефтепродуктов в среде и может быть использована при поиске новых активных штаммов-деструкторов.

Научная новизна. В результате исследования изучена распространенность и видовой состав углеводородокисляющих бактерий в эвтрофных и ме-зотрофных водоемах в зависимости от сезонной динамики и антропогенной нагрузки на них. Определены доминирующие виды планктонных углеводородокисляющих бактерий. Показано, что значительную долю в общей численности углеводородокисляющих микроорганизмов эвтрофных озерных экосистемах занимали грампозитивные бактерии (включая группу нокардиоформ-ных актиномицет, а также роды Bacillus, Micrococcus), тогда как в мезотроф-ных - грамотрицательные бактерии, представленные видами рода Pseudomonas. В реке Илек, испытывающей высокую антропогенную нагрузку, видовой состав верхнего и среднего течения представлен видами группы нокардио-формных актиномицет, тогда как в нижнем течении доминировали виды Pseudomonas и Alcaligenes.

Распространенность и выраженность каталазной активности зависела от таксономической принадлежности выделенных бактерий и антропогенной нагрузки испытываемой водоемами. В мезотрофных водоемах численно доминировали штаммы с более высокими значениями каталазной активности (более 4,6 усл.ед.), по сравнению с эвтрофными (от 3,1 до 4,5 усл.ед"). Наиболее высокие значения каталазной активности были отмечены среди грам-негативных штаммов рода Pseudomonas, а среди грампозитивных - у Xanthobacter sp.

На основании изучения биологических свойств показано, что доля углеводородокисляющих бактерий с уровнем антилизоцимной активности от 6

до 10 мкг/мл была ниже в мезотрофных водоемах и составила 20 %, по сравнению с эвтрофными (более 30%), свидетельствуя об их экологическом неблагополучии.

На модели альго-бактериальной ассоциации показано, что каталазная активность бактерий симбионтов способствовала их сохранению и выживанию.

Впервые выявлено изменение каталазной активности штаммов-деструкторов в процессе потребления углеводородов. Установлена тесная корреляционная связь между степенью снижения каталазной активности штамма-деструктора и эффективностью потребления нефти или нефтепродуктов. Разработан новый подход к отбору штаммов активных деструкторов нефти и нефтепродуктов (патент РФ № 2396340 (2010); патент РФ № 2426781 (2011)).

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые сведения, имеющие теоретическое значение для понимания процессов биодеструкции углеводородов. Выявлено, что каталазная активность углеводородо-кисляющих бактерий является отражением интенсивности процесса деструкции нефти микроорганизмами.

Прикладным аспектом работы является использование разработанных подходов для выбора штаммов-деструкгоров нефти и нефтепродукта. Изолированы из объектов внешней среды и поддерживаются в чистой культуре 40 штаммов углеводородокисляюших бактерий. Штамм Gordona terrae - активный деструктор нефти и нефтепродуктов, размещен во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИ Генетики (ВКПМ, г. Москва) под номером Ас-174.

Апробация работы. Основные результаты исследования доложены и обсуждены на Международной конференции «Биоиндикация в мониторинге пресноводных экосистем» (Санкт-Петербург, 2006); IX Съезде Гидробиологического общества при РАН (Тольятти, 2006); 2-ом Байкальском Микробиологическом симпозиуме с международным участием (Иркутск, 2007); X Съезде Гидробиологического общества при РАН (Владивосток, 2009); XI Всероссийской конференции «Персистенция микрорганизмов 2009» (Оренбург, 2009); Межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Оренбург, 2011); школе-конференции молодых ученых «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2011).

Инновационные разработки отмечены дипломами на Международном форуме по нанотехнологиям «Роснанотех» (Москва, 2010); Международном научно-промышленном форуме «Единая Россия» (Нижний Новгород, 2010); «Региональном молодежном инновационном конвенте» (Оренбург, 2011); золотой медалью X Московского международного салона инноваций и инвестиций (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 4 работы - в изданиях рекомендованных ВАК, получено 2 патента РФ на изобретение: «Штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 для разложения

нефти и нефтепродуктов» (№ 2396340, 2010) и «Способ выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов» (№ 2426781,2011).

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу по материалам и методам исследования, три главы собственных исследований, заключение, выводы, приложения. Библиографический указатель содержит 146 источников литературы, из них 114 отечественных и 32 зарубежных. Текст иллюстрирован 16 таблицами и 36 рисунками, включая оригинальные микрофотографии.

Связь работы с научными программами. Диссертационное исследование является фрагментом работы, проводимой в рамках научно-исследовательской темы открытого плана НИР ИКВС УрО РАН «Механизмы взаимодействий симбионтов в природных ассоциациях водных микроорганизмов» (№ гос. регистрации 01.20.02 16537); Ассоциативный симбиоз водных микроорганизмов и его значение в санитарной и экологической практике гос. регистрации 01201067428); Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биоразнообразие» (проект № БР-9-040); Госшн-тракта № 9 (276/06-000874.1) с Комитетом по охране окружающей среды и природных ресурсов Оренбургской области «Экспериментальное изучение и обоснование использования факторов микробной персистенции в экологической практике».

_СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объект и методы исследования. Материалом для исследования послужили углеводородокисляющие бактерии, выделенные из природных водоемов Оренбургской области, штаммы бактерий, выделенные из ассоциации с зеленой водорослью Chlamydomonas reinhardii Dang. (Институт микробиологии РАН, г. Москва), а также дериваты К12 Escherichia coli, различающиеся по наличию гена, кодирующего катал аз ну ю активность (штаммы Um 1 (Cat\ Lac") и CSH 7 (CatLac") из коллекции P. Loewen, любезно предоставленные д.б.н. O.H. Октябрьским (Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь). Были обследованы пойменные озера Беленовское и Рудничное Оренбургского района, Оренбургской области и река Илек на всем ее протяжении.

Пойменные водоемы характеризуются одинаковым происхождением, сходными морфометрическими и гидрохимическими показателями, но различаются интенсивностью антропогенной нагрузки. Озеро Рудничное не вовлечено в хозяйственную деятельность человека, тогда как на берегу озера Беленовское, располагаются два населенных пункта и фермерские хозяйства.

Река Илек испытывает сильную антропогенную нагрузку, воды реки относятся к 4 «а» классу качества. В верховьях Илека находится крупное Ак-тюбинское водохранилище, ниже по течению реки располагаются различные по величине населенные пункты, в том числе г. Актюбинск, и крупные хими-

ческие производства: Акгюбинский завод хромовых соединений, завод ферросплавов, Актюбинская ТЭЦ.

Отбор планктонных проб воды проводили в течение 2004 - 2008 гг. Пробы бактериопланктона обрабатывали стандартно (Кузнецов С.И., Дубинина Г.А., 1989). Чистые культуры бактерий получали бактериологическим методом с использованием элективных сред. Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили на основании морфологических, тинк-ториальных, культуральных и биохимических свойств (Определитель бактерий Берджи..., 1997), а также согласно определителю нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий (Weyant R.S. et al., 1996) и руководству Нестеренко с соавт. (1985). Определение типа клеточной стенки проводили в лаборатории химического мутагенеза Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (г. Пермь, зав. лабораторией член-корр. РАН, д.м.н. Демаков В.А.) стандартными методами (Звягинцев Д.Т., 1991).

Лизоцимную и антилизоцимную активность микроорганизмов определяли чашечным методом (Бухарин О.В., 1984). Содержание перекиси водорода при деструкции углеводородов нефти оценивали в реакции хемшпоми-несценции по методу Хайруллина P.M., Ахметовой И.Э. (2001) на кафедре фармацевтической и общей химии ГБОУ ВПО Оренбургской государственной медицинской академии (г. Оренбург, зав. кафедрой д.м.н., профессор Красиков С.И.). Каталазную активность бактерий определяли качественным и количественным методами (Вейант Р. и др., 1999; Бухарин О.В. и др., 2000). Полноту потребления нефти или нефтепродуктов определяли флуориметри-ческим методом на анализаторе жидкости «Флюорат-02» в аккредитованной лаборатории испытательного центра ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области», г. Оренбург.

Результаты экспериментальных исследований были подвергнуты статистической обработке с помощью пакета программ Statistica 6,0, а также процессора электронных таблиц "Microsoft Excel 2003" for Windows XP.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определение биологического разнообразия углеводородокисляющих бактерий в озерах Беленовское, Рудничное и в реке Илек проводилось впервые и ограничивалось планктонным сообществом.

При оценке биологического разнообразия и свойств углеводородокисляющих бактерий учитывались следующие характеристики и свойства:

• видовой состав углеводородокисляющего бактериопланктона;

• численность углеводородокисляющих бактерий;

• виды, доминирующие по численности;

• биологические свойства выделенных штаммов.

Видовая структура и биологические свойства углеводородокисляющего бактериопланктона природных водоемов

В бактериопланктоне изученных водоемов за период исследования обнаружено 34 вида углеводородокисляющих бактерий, которые были пред-

ставлены грампозитивными бактериями (группа нокардиоформных актино-мицет и виды родов Bacillus, Micrococcus, Xanthobacter) и грамнегативными бактериями (роды Pseudomonas, Pantoea, Acinetobacter, Enterobacter). В озерном углеводородокисляющем бактериопланктоне доминировали грамнега-тивные виды, представленные, в основном, родом Pseudomonas. Большую долю в общей численности углеводородокисляющего сообщества озера Беленовское занимали грампозитивные бактерии, их доля составляла 30%, тогда как в озере Рудничное доля этих бактерий была не более 5%.

Из озера Беленовское было выделено 9 штаммов углеводородокисляю-щих бактерий, представленных видами Pseudomonas fluorescens (штаммы № 2013, 2013/1), Pseudomonas putida (штамм № 2015), Pseudomonas sp. (штамм № 2011), Pantoea agglomerans (штамм № 2012), Acinetobacter sp. (штамм № 2014), Bacillus sp. (штамм № 1013), Micrococcus sp. (штамм № 1011) и один изолят был отнесен к группе нокардиоформных актиномицет (штамм № 1012).

Из озера Рудничное было выделено В штаммов углеводородокисляю-щих бактерий представленных видами Pseudomonas fluorescens (штамм № 2051), Pseudomonas putida (штаммы № 2052, 2023), Pseudomonas aeruginosa (штаммы № 2025, 2053), Pseudomonas sp. (штамм № 2024), Enterobacter sp. (штамм № 2022), Xanthobacter sp. (штамм № 1021).

Распространенность каталазной активности среди исследуемых изоля-тов составила 100%. В углеводородокисляющем бактериопланктоне озера Беленовское доминировали штаммы со значениями каталазной активности от 3,1 до 4,5 усл. ед. (рис. 1). В углеводородокисляющем бактериопланктоне озера Рудничное доминировали штаммы со значениями каталазной активности более 4,6 усл.ед., второе место по численности занимали штаммы со значениями признака от 3,1 до 4,5 усл. ед. Доля штаммов с более низкими значениями исследуемого признака (менее 3,0 усл. ед.) была незначительна (рис. 2).

Рис. 1 - Распределение бактерий в за- Рис. 2 - Распределение бактерий в зависимости от выраженности каталаз- висимости от выраженности каталазной активности (озеро Беленовское), ной активности (озеро Рудничное).

Доля штаммов обладающих антилизоцимной активностью от 5 до 10 мкг/мл в озере Рудничное составила 25%, тогда как в озере Беленовское доля этих штаммов была выше - 33,3%.

Видовое разнообразие и численность углеводородокисляющих бактерий в озерах было подвержено сезонной динамике. Наибольшее видовое разнообразие в углеводородокисляющем сообществе озер было отмечено в осенний период. В озере Беленовское в этот период численно доминировали микроорганизмы из группы нокардиоформных актиномицет, а также Р. fluorescens, а в в озере Рудничное - Enterobacter sp. (штамм № 2022) и Р. aeruginosa (штамм № 2053). Высокая численность углеводородокисляющих бактерий в осенний период связана с тем, что к осени в водоеме происходит накопление органических веществ, в том числе и высокомолекулярных соединений, что стимулирует развитие данной группы бактерий.

Наиболее показательным периодом, свидетельствующим о загрязнении водоема нефтью и нефтепродуктами, является зима. В это время года углево-дородокисляющие бактерии выделяли только из бактериоплантктона озера Беленовское. По данным ряда авторов, присутствие углеводородокисляющих бактерий в зимний период характерно для эвтрофированных водоемов, тогда как в олиготрофных экосистемах данная группа бактерий в зимний период отсутствует, либо ее численность незначительна. Так же высокая численность углеводородокисляющих бактерий косвенно свидетельствует о присутствии углеводородов в экосистеме зимой (Миронов О.Г. и др., 1985; Atlas R.M. etal., 1978).

Углеводородокисляющий бактериопланктон реки Илек был представлен как грамнегативными, так и грампозитивными микроорганизмами. Грам-негативные бактерии были представлены видами родов Pseudomonas и Alcaligenes: P. putida № 2377, Р. fluorescens № 2131, A. piechaudii, P. putida № 2374, P. fluorescens № 2271, P. putida № 2378, P. fluorescens № 2132, Alcaligenes sp, № 2273, Alcaligenes sp. № 2376.

Грампозитивные штаммы относились к группе нокардиоформных актиномицет (штаммы № 1131, 1132,1133,1134,1135,1375,1374/1,1274).

Наибольшую численность углеводородокисляющих бактерий регистрировали в верхнем и среднем течении р. Илек (станции 1, 6, 7, 8). Здесь в углеводородокисляющем бактериопланктоне доминировали микроорганизмы, относящиеся к группе нокардиоформных актиномицет. В нижнем течении численность углеводородокисляющих бактерий была значительно ниже, здесь доминировали грамнегативные изоляты, представленные видами родов Pseudomonas и Alcaligenes.

Высокая численность углеводородокисляющих бактерий, особенно видов группы нокардиоформных актиномицет, в верхнем и среднем течении реки Илек свидетельствует о загрязнении нефтепродуктами (Коронелли Т.В., 1996а; Миронов О.Г., 1972; Рубцова С.И., 2002).

Распространенность каталазной активности у микроорганизмов из уг-леводородокисляющего бактериопланктона реки Илек составила 100%. Доля углеводородокисляющих микроорганизмов с каталазной активностью в диа-

пазоне от 3,1 до 4,5 усл.ед. в верхнем и среднем течении р. Илек составила более 80 %, тогда как в нижнем течении их доля была менее 50% и увеличилось количество изолятов с большими (> 4,6 усл. ед.) и меньшими значениями каталазной активности (< 3,0 усл. ед.).

В верхнем и среднем течении численно доминировали углеводородо-кисляющие микроорганизмы с каталазной активностью в диапазоне от 3,1 до 4,5 усл.ед., тогда как в нижнем течении доля этих бактерий была менее 50%, одновременно увеличилась доля изолятов с большими и меньшими значениями каталазной активности (рис. 3,4).

24,6 3,1-4,5 S3,0 усл.ед

24,6 3,1-4,5 <3,0 услед-

Рис. 3 - Распределение бактерий в Рис. 4 - Распределение бактерий в

верхнем и среднем течении р. Илек, в нижнем течении р. Илек, в зависимо-

зависимости от выраженности ката- сти от выраженности каталазной ак-

лазной активности тивности

Среди выделенных грамнегативных микроорганизмов большинство обладали антилизоцимной активностью. Диапазон антилизоцимного признака у выделенных бактерий колебался от 2 до 10 мкг/мл. В углеводородокис-ляющем сообществе р. Илек доля бактерий со значениями признака от 5 до 10 мкг/мл составляла более 30%.

Таким образом, эвтрофные водоемы характеризовались высокой численностью, высоким видовым богатством, присутствием бактерий группы нокардиоформных актиномицет. В углеводородокисляющем бактериопланк-тоне таких водоемов доминировали бактерии со значениями каталазной активности от 3,1 до 4,5 усл.ед., а также присутствовала значительная доля бактерий с высокой антилизоцимной активностью.

В процессе лабораторных исследований из альго-бактериальной ассоциации были выделены углеводородокисляющие микроорганизмы, идентифицированные на основании морфологии, биохимимических свойств и химического состава клеточной стенки как Rhodococcus rubropertinctus (штаммы Б, Ж), Bacillus sp. (штамм Р) и Micrococcus roseus (штамм Р2). Бактерии-

симбионты вида Rhodococcus rubropertinctus (штаммы Б, Ж) были способны потреблять нефть и нефтепродукты в качестве единственного источника углерода и энергии. Самая высокая каталазная активность (3,96±0,18 и 3,45±0,06 усл. ед.) отмечалась у штаммов R. rubropertinctus (Б и Ж), тогда как у Bacillus sp. (Р) она была самой низкой среди всех бактерий-симбионтов. В опыте по сокультивированию зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii с ее бактериями-симбионтами1 выявлено рост-сгимулирующее действие штаммов с высоким уровнем каталазной активности (R. rubropertinctus). Стимулирующее влияние бактерий-симбионтов выражалось в увеличении скорости роста и более длительном сохранении культуры водоросли. Полученные данные свидетельствуют, что катал аз ну ю активность микроорганизмов можно рассматривать в качестве одного из факторов, обеспечивающих выживание бактерий в ассоциации с водорослью. Это продгверждено в эксперименте по лабораторному сокультивированию хлорококковой водоросли Coelastrum microporum с дериватами от К12 Escherichia coli, различающимися по наличию гена, кодирующего каталазную активность (штаммы Um 1 (Cat -, Lac-) и CSH 7 (Cat +, Lac-).2

В ассоциации с водорослью каталазоположительный штамм Е. coli (Cat+) имел более высокую численность и более длительное время сохранялся в ассоциации, по сравнению с каталазоотрицательным штаммом Е. coli (СаГ).

В результате удалось установить, что в природных ассоциациях в условиях антибактериального влияния пероксида водорода водорослей каталазная активность бактерий-ассоциантов является одним из факторов выживания микроорганизмов.

Каталазная активность углеводородокисляющих бактерий в условиях потребления нефти и нефтепродуктов

На следующем этапе работы была предпринята попытка оценить значение каталазной активности углеводородокисляющих бактерий при потреблении нефти и нефтепродуктов.

Исследование проводили на примере как чистых культур углеводородокисляющих бактерий Gordona terrae ИКВС № 19, Rhodococcus rubropertinctus ИКВС № 15, Rhodococcus erythropolis ИКВС № 11, Acinetobacter sp. ИКВС № 2122, Pseudomonas alcaligenes ИКВС № 20121, так и ассоциации Gordona terrae ИКВС № 19 с Acinetobacter sp. ИКВС № 2122.

На начальном этапе оценили динамику содержания пероксидов в среде в зависимости от интенсивности потребления нефтепродуктов (дизельного топлива) бактериями. В присутствии R. erythropolis, не использующего нефтепродукт в качестве источника углерода и энергии, регистрировали более высокое содержание пероксидов и более длительное нахождение их в среде. Напротив, в присутствии активного деструктора нефтепродукта G. terrae содержание пероксидов в среде было меньше.

1 автор выражает благодарность д б.н. Николаеву Ю.А. (Институт микробиологии РАН им. С.Н. Виноград-ского, г. Москва) за помощь в работе

2 работа проводилась совместно с к.б.н. Игнатенко М.Е.

Таким образом, интенсивность образования пероксидов зависела от способности углеводородокисляющих бактерий потреблять нефтепродукты, (рис. 5).

Первоначальная концентрация дизельного топлива в эксперименте составляла 610±0,5 мг/дм3, что соответствовало 100 % содержанию нефтепродукта в исходной среде. Среди грампозитивных штаммов максимальное потребление дизельного топлива отмечено у штамма G. terrae (содержание нефтепродукта в среде к шестым суткам составило 4,4±1,8 %) и у штамма R. rubropertinctus (содержание дизельного топлива в среде к двадцать третьим суткам составило 62±4,1 %). Штамм R. erythropolis не использовал дизельное топливо в качестве источника углерода (рис. 6).

ч 160

- G. terrae

•R. erythropolis

Рис. 5 - Содержание пероксидов в среде в зависимости от интенсивности потребления нефтепродукта.

v--

• G. terrae •

6 12 Rehrytropoüs "

j

--I

23 35 супси

" R. mbropertinctus Контроль

Рис. 6 - Динамика потребления нефтепродукта грампозитивными микроорганизмами.

В эксперименте с грамнегативными штаммами максимальное потребление нефтепродукта было отмечено у штамма Ас'те1оЬас1ег хр. (к шестым суткам содержание нефтепродукта в среде снизилось до 64,1±1,3 %). Минимальное содержание дизельного топлива при росте этого штамма зафиксировано на 28 сутки - 29,5±1,9 %. В эксперименте со штаммом Р. ака^епея динамика потребления нефтепродукта в среде была иной, минимальное содержание дизельного топлива отмечено на 35 сутки - 81,9±0,5 % (рис. 7).

100

•g 80

ff 60 -

s

E

Л

X 40 ■

w

X

Й ?П -

§

0 -1

Гч~

ч

Ч

ч

ч.

28

35

- Acinetobacter sp.

Р. alcaligenes

- контроль

Рис. 7 - Динамика потребления нефтепродукта грамнегативными микроорганизмами.

Потребление нефтепродукта сопровождалось увеличением численности исследуемых микроорганизмов.

Далее нами была определена динамика каталазной активности штаммов в процессе деструкции дизельного топлива. Максимальное снижение каталазной активности было отмечено у штамма G. terrae - на 50,1±5,4 % к 12 суткам, у штамма R. rubropertinctus - на 36,8±7,6 % к 23 суткам. У R. erythropolis зарегистрировано незначительное снижение каталазной активности к 35 суткам эксперимента, вероятно, связанное с отмиранием бактериальной массы (рис. 8).

В эксперименте с грамотрицательными штаммами максимальное снижение каталазной активности наблюдали у Р. alcaligenes к 6 суткам на 20±0,4%, тогда как у Acinetobacter sp. к 28 суткам на 45±0,3 % (рис. 9).

Далее перешли к эксперименту с ассоциацией G. terrae + Acinetobacter sp., контролем служили монокультуры G. terrae и Acinetobacter sp. Отмечено, что интенсивнее нефть Сорочинского месторождения потреблялась G. terrae, как в монокультуре, так и в" ассоциации с Acinetobacter sp. Остаточно'е содержание углеводородов к 35 суткам в эксперименте с монокультурой G. terrae составило 29,9±2,6 %, в ассоциации G. terrae + Acinetobacter sp -30,8±2,9 %.

При росте на нефти Сорочинского месторождения снижение каталазной активности микроорганизмов в ассоциации G. terrae + Acinetobacter sp.

происходило более интенсивно, чем в экспериментах с их монокультурами. У Acinetobacter sp. в ассоциации с G. terrae выявлено более интенсивное снижение каталазной активности на 28,1±2,3 %, тогда как в монокультуре - лишь

Gordona terrae — — R. rubropertinctus — - R. erythropolis

Рис. 8 - Динамика каталазной активности при потреблении нефтепродукта грампозитивными микроорганизмами.

Acinetobacter sp. — — Ps. alcaligencs

Рис. 9 - Динамика каталазной активности при потреблении нефтепродукта грамнегативными микроорганизмами.

Максимальное снижение каталазной активности у Acinetobacter sp. наблюдали на 12 сутки, как в контроле (на 30±2,8 %) так и в опыте (на 32,3±3,4 %) (рис. 10). У G. terrae разницу между снижением каталазной активности в опыте и в контроле наблюдали через 12 суток. Каталазная активность G. terrae в ассоциации с Acinetobacter sp. начала увеличивалась через 12 суток, тогда как в монокультуре она продолжала снижаться. Следует отметить, что максимальное снижение каталазной активности у штамма G. terrae регистри-

ровали на 12 сутки как в контроле (на 41±3,7 %), так и в опыте (на 38,9±2,9 %).

Полученные результаты по сокультивированию углеводородокисляю-щих бактерий Acinetobacter sp. + G. terrae на нефти показали, что при совместном ее потреблении в первые двенадцать суток доминировал грамнегатив-ный штамм Acinetobacter sp., тогда как грампозитивный штамм G. terrae преобладал после 12 суток. Наблюдаемое явление, вероятно, связано с разной стратегией потребления углеводородов этими микроорганизмами.

110ч 0)

i

100 90 80 70 60 50 : 40

1 6 12 23 35 сутки

А численность G. terrae —— численность Acinetobacter sp.

каталазная активность G. terrae — — каталазная активность Acinetobacter sp.

Рис. 10 - Динамика численности и каталазной активности углеводородокис-ляющих штаммов при сокультивировании на нефти Сорочинского месторождения.

Известно, что особенности строения клеточной стенки G. terrae, характерные для группы нокардиформных бактерий, обеспечивают поглощение углеводородов путем пассивной диффузии, и их окисление начинается после полного пропитывания ими клеточной стенки этих бактерий. Грамнегатив-ные бактерии Acinetobacter sp. не имеют толстой гидрофобной клеточной стенки подобно G. terrae, поэтому углеводороды не способны проникать через этот барьер, в результате эти микроорганизмы используют другую стратегию. Известно, что они выделяют во внешнюю среду биоэмульгатор, для снижения гидрофобности углеводородов, способствуя их солюбилизации (Коронелли Т.В., 1996; Кураков A.B. и др., 2006; Hisatsuka К. and el., 1977). Возможно, поэтому в эксперименте на первом этапе деструкции углеводородов доминировал штамм Acinetobacter sp., а преобладание G. terae нарастало позднее. Представленные данные согласуются с результатами исследований углеводородокисляющего сообщества Можайского водохранилища, полученными Ильинским В.В. с соавторами (1998).

5 -4,5 --

Таким образом, у углеводородокисляющих штаммов в ходе эксперимента наблюдали увеличение численности и снижение их каталазной активности, тогда как у бактерий, не окисляющих углеводороды, подобной динамики не вьивлено. Учитывая известный феномен быстрой инактивации ферментов в условиях окислительного стресса, описанный рядом авторов (Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П.,1993; Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Би-зенкова М.Н., 2006), можно предположить, что для повторного накопления фермента требуется значительный промежуток времени, в течение которого защита бактериальной клетки с помощью каталазы становиться менее эффективной, что свидетельствует о наличии у микроорганизмов альтернативных механизмов клеточной защиты от активных форм кислорода. Подобные механизмы известны и связаны с продукцией неферментных антиоксидантов (трегалозы, гликогена, миколатов трегалозы) (Феофилова Е.П., 1992).

В наших исследованиях удалось обнаружить эффект снижения каталазной активности углеводородокисляющих бактерий в процессе нефтедеструк-ции, что позволяет предположить наличие эффективной защиты от активных форм кислорода, связанной с продукцией неферментных антиоксидантов, позволяющих бактериям сохранить энергию, не расходуя ее на синтез ферментов, в частности каталазы.

Прикладные аспекты использования углеводородокисляющих бактерий

В результате проведенных исследований была установлена прямая зависимость между уровнем каталазной активности бактерий-деструкторов и содержанием нефти или нефтепродукта в субстрате, что явилось основой для разработки новых подходов поиска штаммов деструкторов нефти и нефтепродуктов. В результате был разработан «Способ выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов», в основу которого положена способность бактерий снижать каталазную активность при потреблении углеводородов. К активным деструкторам нефти и нефтепродуктов предложено относить бактерии, каталазная активность которых в течение первых 612 суток культивирования снизилась на 30% и более (Патент РФ № 2426781, 2011).

Продуктом инновации является новый штамм углеводородокисляющих бактерий Gordona terrae ВКПМ Ас-1741, пригодный для высокоэффективной очистки загрязненных объектов внешней среды от нефти и нефтепродуктов. Его эффективность потребления нефти и нефтепродуктов составляет от 70% до 90%, в зависимости от вида углеводородов. Штамм размещен во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов с присвоением ему номера ВКПМ Ас-174. На штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 для разложения нефти и нефтепродуктов получен патент РФ № 239640 (2010).

Оценивая результаты работы в целом, можно выделить два основных момента:

• Каталазная активность углеводородокисляющих бактерий является индикатором их способности к биодеградации нефти и нефтепродуктов, а также способствует их адаптации и выживанию в природной среде.

• Обладая диапазоном реакции, каталазная активность углеводородокисляющих микроорганизмов чутко реагирует на изменение содержания нефти и нефтепродуктов в среде и может быть использована при поиске новых активных штаммов-деструкторов.

ВЫВОДЫ

1. В эвтрофных лентических водоемах выявлено высокое видовое разнообразие и численность углеводородокисляющих бактерий. Значительную долю в общей численности углеводородокисляющего бактериопланкто-на эвтрофных водоемов занимали грампозитивные бактерии (включая группу нокардиоформных актиномицет, а также роды Bacillus, Micrococcus), тогда как в мезотрофных - грамотрицательные бактерии, представленные микроорганизмами рода Pseudomonas.

2. Установлено, что видовое разнообразие и численность углеводородокисляющих бактерий изменяются в зависимости от сезона года, достигая максимума в осенний период, что является отражением накопления в водоеме органических веществ, включая высокомолекулярные соединения.

3. Выявленная в верхнем и среднем течении реки Илек высокая численность углеводородокисляющих бактерий, с доминированием группы нокардиоформных актиномицет, свидетельствует о поступлении в водоем нефтепродуктов.

4. Доля углеводородокисляющих бактерий с уровнем антилизоцим-ной активности от 6 до 10 мкг/мл была выше в эвтрофных водоемах и составила (более 30%), свидетельствуя об их экологическом неблагополучии, по сравнению с мезотрофными (20%).

5. В углеводородокисляющем бактериопланктоне эвтрофных водоемов, принимающем участие в разложении высокомолекулярных соединений, как автохтонного, так и аллохтонного происхождения, доминировали микроорганизмы с каталазной активностью в диапазоне от 3,1 до 4,5 усл.ед.

6. Из альго-бактериальной ассоциации Chlamydomonas reinhardtii Dang, были выделены бактерии-симбионты, обладающие каталазной активностью, оказывающие разнонаправленное воздействие на развитие водорослевых клеток. Показано, что каталазная активность симбионтов способствовала их сохранению и выживанию в природных ассоциациях.

7. Экспериментально установлена прямая зависимость между каталазной активностью углеводородокисляющих бактерий и концентрацией нефти или нефтепродукта. Установлено, что потребление углеводородов сопровождалось снижением каталазной активности и увеличением численности штамма-деструктора.

8. Каталазная активность отражает интенсивность процесса микробной деструкции, что позволяет предложить ее использование в качестве индикатора при отборе эффективных штаммов-деструкторов нефти и нефте-

продуктов. На основе предложенного подхода разработан «Способ выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов» (Патент РФ № 2426781 от 20.08.2011).

9. Выделен новый штамм углеводородокисляющих бактерий Gordona terrae ВКПМ Ас-1741, пригодный для высокоэффективной очистки загрязненных объектов среды от нефти и нефтепродуктов (Патент РФ № 2396340 от 10.08.2010). Эффективность очистки достигает от 70% до 90% в зависимости от вида углеводородов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гоголева O.A. Динамика каталазной активности углеводородокисляющих бактерий в условиях воздействия нефтепродуктов / Материалы IX Съезда Гидробиологического Общества РАН. Тольятти. 2006. с. 105

2. Гоголева O.A., Комлева Е.Б., Немцева Н.В., Яценко-Степанова Т.Н. Каталазная активность как биомаркер / Сборник тезисов докладов Международной конференции «Биоиндикация в мониторинге пресноводных экосистем». Санкт-Петербург. 2006. с.37-38.

3. Гоголева O.A., Немцева Н.В. Динамика каталазной активности углеводородокисляющих бактерий в процессе деструкции дизельного топлива / Микроорганизмы в системе рек, озер, водохранилищ. Материалы 2-го Байкальского Микробиологического симпозиума с международным участием. Иркутск. 2007. с. 53.

4. Николаев Ю.А., Плакунов В.К., Воронина H.A., Немцева Н.В., Плотников А.О., Гоголева O.A., Муравьева М.Е., Овечкина Г.В. В. Влияние бактерий-спутников на рост Chlamydomonas reinhardtii в их сообществе // Микробиология. №2. 2008. с.89-95.

5. Гоголева O.A. Характеристика нового штамма Gordona terrae эффективно утилизирующего углеводороды // Вестник ОГУ. №2.2009. с. 124

6. Немцева Н.В., Игнатенко М.Е., Селиванова Е.А., Гоголева O.A., Яцен-ко-Степанова Т.Н., Плотников А.О. Регуляция симбиотических взаимодействий в альго-бактериальных ассоциациях // ЖМЭИ. 2009. №4. с 62-65.

7. Гоголева O.A., Немцева Н.В. Биоиндикация процесса микробной деструкции нефти и нефтепродуктов. Отбор микроорганизмов-деструкторов / X Съезд Гидробиологического общества при РАН. Владивосток. 2009. С. 196.

8. Игнатенко М.Е., Гоголева O.A., Яценко-Степанова Т.Н., Немцева Н.В. Роль каталазы бактерий в формировании ассоциативных симбиотических связей с водорослями / X Съезд Гидробиологического общества при РАН. Владивосток. 2009. с.166.

9. - Штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 для разложения нефти и нефтепродуктов / Бухарин О.В, Немцева Н.В., Гоголева O.A. // Патент на изобретение № 2396340 от 10.08.2010. Бюл. № 22. 2010.

10. Способ выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов / Немцева Н.В., Гоголева O.A., Бухарин О.В. // Патент на изобретение № 2426781 от 20.08.2011. Бюл. №23. 2011.

11. Гоголева O.A. Углеводородокисляющий бактериоценоз пойменных озер // Вестник ОГУ. № 4. 2011. с. 3 ] -33.

12. Гоголева O.A., Немцева Н.В. Каталазная активность микроорганизмов как индикатор деструкции нефти и нефтепродуктов / Сборник тезисов докладов II Международной конференции «Биоиндикация в мониторинге пресноводных экосистем». Санкт-Петербург. 2011. с. 51.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность к.б.н. Н.В. Шараповой и д.м.н. С. И. Красикову (Оренбургская государственная медицинская академия, кафедра медицинской и фармацевтической химии); Н.М. Амерзяновой (ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области») за помощь при выполнении отдельных фрагментов работы, а также всем сотрудникам Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, оказавшим моральную и техническую поддержку в процессе диссертационного исследования.

Гоголева Ольга Александровна КАТАЛАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оригинал макет подготовлен в программе Word for Windows 2003.

Подписано в печать 29.12.2011 г. Формат 60x84 1/16 Усл. печ. л. 1,0. Печать оперативная, гарнитура Тайме. Тираж 100

экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гоголева, Ольга Александровна, Оренбург

61 12-3/640

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ КЛЕТОЧНОГО И ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО СИМБИОЗА УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РАН

На правах рукописи

Гоголева Ольга Александровна

КАТАЛАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ

03.02.03 - «Микробиология» Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Н.В. Немцева

Оренбург-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ............................................................................ 5

ГЛАВА 1. УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В ОЧИСТКЕ ЭКОСИСТЕМ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)............................................................................. 11

1.1. Нефтяное загрязнение экосистем и факторы влияющие на углеводородокисляющую активность микроорганизмов....................................................................... 11

1.2. Экология и таксономическая характеристика углево-дородокисляющих бактерий........................................ 14

1.3. Физиологические особенности углеводородоксляю-

щих микроорганизмов.......................................................... 18

1.4. Потребление углеводородов микроорганизмами........ 21

1.5. Механизмы деградации углеводородов микроорганизмами................................................................................... 23

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ............. 30

2.1. Физико-географическая и гидрохимическая характеристики исследуемых водоемов......................................... 30

2.2. Методы выделения и оценки биологического разнообразия углеводородокисляющего бактериопланктона.... 34

2.3. Методы культивирования бактерий......................... 37

2.4. Методы определения биологических свойств бактерий...................................................................... 38

2.5. Методы сокультивирования углеводородокисляю-

щих бактерий.......................................................................... 42

2.6 Методы сокультивирования водорослей и бактерий... 43

2.7 Методы статистической обработки полученных ре-

зультатов.............................................................. 44

ГЛАВА 3. ВИДОВАЯ СТРУКТУРА И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩЕГО БАКТЕРИО-ПЛАНКТОНА ПРИРОДНЫХ ВОДОЕМОВ...................... 46

3.1. Характеристика углеводородокисляющего бактерио-планктона озера Беленовское............................................ 47

3.2. Характеристика углеводородокисляющего бактерио-

планктона озера Рудничное....................................... 53

3.3 Характеристика углеводородокисляющего бактерио-планктона реки Илек............................................... 58

3.4. Характеристика бактерий-симбионтов зеленой одноклеточной водоросли Chlamydomonas reinhardlii Dang...... 66

3.5. Значение каталазной активности микроорганизмов в биоценозах...................................................................>........... 73

ГЛАВА 4. КАТАЛАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ УГЛЕВОДОРОДО-КИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ В УСЛОВИЯХ ПОТРЕБЛЕНИЯ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ..................... 79

4.1. Потребление нефтепродукта грампозитивными бактериями Gordona terrae ИКВС № 19, Rhodococcus rubropertinctus ИКВС № 15, Rhodococcus erythropolis

ИКВС № 11.......................................................... 80

4.2 Потребление нефтепродукта грамнегативными бактериями Acinetobacter sp.HKBC № 2122, Pseudomonas alcaligenes ИКВС № 20121................................................. 86

4.3. Потребление нефти Сорочинского месторождения штаммами Gordona terrae ИКВС № 19 и Acinetobacter sp.HKBC №2122.................................................................... 89

4.4. Потребление нефти Бугурусланского месторождения

штаммами Gordona terrae ИКВС № 19 и Acinetobacter

sp.HKBC № 2122........................................................................................................94

ГЛАВА 5 ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ,УГЛЕ-

ВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ..........................................100

5.1. Штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 для разложения нефти и нефтепродуктов..........................................................................100

5.2. Способ выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов................................................103

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................................................................113

ВЫВОДЫ..........................................................................................................................................................121

СПИСОК ОСНОВНОЙ ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ....................123

ПРИЛОЖЕНИЕ............................................................................................................................................139

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Проблема поиска микроорганизмов-деструкторов актуальна, поскольку загрязнение окружающей среды сырой нефтью и продуктами ее переработки носит глобальный характер. Самоочищение водоемов от нефтяного загрязнения - сложный, многоступенчатый процесс, включающий микробную трансформацию нефти и нефтепродуктов (Миронов О.Г., 2000; Куликова И.Ю., 2005; Жуков Д.В., Мурыгина В.П., Калюжный C.B. 2006; Buckley et al., 1976).

Основным источником углеводородокисляющих микроорганизмов являются пресноводные и морские экосистемы, как загрязненных, так и незагрязненных территорий (Израэль Ю.А., Цыбань A.B., 1989; Бердичев-ская М.М., 1991; Коронелли Т.В., 1994). В плане поиска активных деструкторов, наряду с исследованием биологических свойств монокультур и ассоциаций бактерий, оценивается их способность к деструкции нефти и нефтепродуктов (Ившина И.Б., Бердичевская М.В., 1995; Куюкина М.С. и др., 1999; Звягинцева И.С., 2001; Плотникова Е.Г., 2001; Сопрунова О.Б., 2005; Atlas R.M. et al., 1992; Kaledine L., 1997).

В аэробных условиях разные группы микроорганизмов способны к биодеградации углеводородов, входящих в состав нефти. При этом важнейшим фактором окисления является достаточное количество кислорода, расход которого достигает 3300 г на 1 л сырой нефти (Миронов О.Г., 2002; Перетрухин И.В. и др., 2006). Несмотря на то, что для каждого микроорганизма характерен свой специфический набор ферментов и особый путь окисления углеводородов, этот процесс катализируется системами оксиге-наз и оксидаз (Готтшалк Г., 1982). Кроме того в природной среде наряду с биоокислением протекают и процессы самоокисления нефти и нефтепродуктов, которые проходят по свободно-радикальному механизму и связаны с образованием пероксидов (Петров A.A., 1984; Мочалова О.С., Антонова K.M., Гурвич Л.М., 2002; Rojo F., 2009). При этом окислительный стресс,

спровоцированный действием внешних факторов и формированием кислородных радикалов, сопровождается сильными изменениями в метаболизме бактерий, что может приводить, с течением времени, к гибели клетки (Современная микробиология ..., 2005; Белозерская Т.А., Гесслер H.H., 2006). Поэтому в процессе эволюции микроорганизмы выработали механизмы защиты, основанные на детоксикации активных форм кислорода с участием каталазы, пероксидазы и супероксиддисмутазы (Чеснокова Н.П., Пону-калина Е.В., Бизенкова М.Н., 2006). Исходя из этого, реакция ферментных систем является важным показателем активности процесса нефтедеструк-ции.

Также известна реакция ферментных систем почв на нефтяное загрязнение. По данным Киреевой с соавторами (2001), наиболее чутко на загрязнение реагирует каталазная активность почв. Степень обогащенно-сти почв ферментами зависит, в том числе, и от микробной составляющей, однако, данные о каталазной активности микроорганизмов, входящих в состав почвенного биоценоза отсутствуют. Недостаточно изучена роль ферментов окислительного стресса в процессе микробной деструкции нефти.

Все вышеизложенное определило цель и задачи данного исследования.

Цель работы. Определить значение каталазной активности углево-дородокисляющих бактерий в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов.

Основные задачи:

1. Выделить углеводородокисляющие бактерии из микробных ассоциаций водоемов с различным уровнем антропогенной нагрузки и определить их видовой состав.

2. Определить биологические свойства углеводородокисляющих бактерий выделенных из водоемов.

3. В эксперименте оценить динамику каталазной активности чистых культур и ассоциаций углеводородокисляющих бактерий в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов.

4. Разработать способ отбора активных деструкторов нефти и нефтепродуктов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Каталазная активность способствует адаптации и выживанию бактерий, а также является индикатором их способности к биодеградации нефти и нефтепродуктов.

2. Каталазная активность углеводородокисляющих микроорганизмов, обладая диапазоном реакции, чутко реагирует на изменение содержания нефти и нефтепродуктов в среде и может быть использована при поиске новых активных штаммов-деструкторов.

Научная новизна. В результате исследования изучена распространенность и видовой состав углеводородокисляющих бактерий в эвтрофных и мезотрофных водоемах в зависимости от сезонной динамики и антропогенной нагрузки на них. Определены доминирующие виды планктонных углеводородокисляющих бактерий. Показано, что значительную долю в общей численности углеводородокисляющих микроорганизмов эвтрофных озерных экосистемах занимали грампозитивные бактерии (включая группу нокардиоформных актиномицет, а также роды Bacillus, Micrococcus), тогда как в мезотрофных - грамотрицательные бактерии, представленные видами рода Pseudomonas. В реке Илек, испытывающей высокую антропогенную нагрузку, видовой состав верхнего и среднего течения представлен видами группы нокардиоформных актиномицет, тогда как в нижнем течении доминировали виды Pseudomonas и Alcaligenes.

Распространенность и выраженность каталазной активности зависела от таксономической принадлежности выделенных бактерий и антропогенной нагрузки испытываемой водоемами. В мезотрофных водоемах числен-

но доминировали штаммы с более высокими значениями каталазной активности (более 4,6 усл.ед.), по сравнению с эвтрофными (от 3,1 до 4,5 усл.ед.). Наиболее высокие значения каталазной активности были отмечены среди грамнегативных штаммов рода Pseudomonas, а среди грампози-тивных - у Xanthobacter sp.

На основании изучения биологических свойств показано, что доля углеводородокисляющих бактерий с уровнем антилизоцимной активности от 6 до 10 мкг/мл была ниже в мезотрофных водоемах и составила 20 %, по сравнению с эвтрофными (более 30%), свидетельствуя об их экологическом неблагополучии.

На модели альго-бактериальной ассоциации показано, что каталазная активность бактерий симбионтов способствовала их сохранению и выживанию.

Впервые выявлено изменение каталазной активности штаммов-деструкторов в процессе потребления углеводородов. Установлена тесная корреляционная связь между степенью снижения каталазной активности штамма-деструктора и эффективностью потребления нефти или нефтепродуктов. Разработан новый подход к отбору штаммов активных деструкторов нефти и нефтепродуктов (патент РФ № 2396340 (2010); патент РФ № 2426781 (2011)).

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые сведения, имеющие теоретическое значение для понимания процессов биодеструкции углеводородов. Выявлено, что каталазная активность углеводородокисляющих бактерий является отражением интенсивности процесса деструкции нефти микроорганизмами.

Прикладным аспектом работы является использование разработанных подходов для выбора штаммов-деструкторов нефти и нефтепродукта. Изолированы из объектов внешней среды и поддерживаются в чистой культуре 40 штаммов углеводородокисляющих бактерий. Штамм Gordona

terrae - активный деструктор нефти и нефтепродуктов, размещен во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИ Генетики (ВКПМ, г. Москва) под номером Ас-174.

Апробация работы. Основные результаты исследования доложены и обсуждены на Международной конференции «Биоиндикация в мониторинге пресноводных экосистем» (Санкт-Петербург, 2006); IX Съезде Гидробиологического общества при РАН (Тольятти, 2006); 2-ом Байкальском Микробиологическом симпозиуме с международным участием (Иркутск, 2007); X Съезде Гидробиологического общества при РАН (Владивосток, 2009); XI Всероссийской конференции «Персистенция микрорганизмов 2009» (Оренбург, 2009); Межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Оренбург, 2011); школе-конференции молодых ученых «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2011).

Инновационные разработки отмечены дипломами на Международном форуме по нанотехнологиям «Роснанотех» (Москва, 2010); Международном научно-промышленном форуме «Единая Россия» (Нижний Новгород, 2010); «Региональном молодежном инновационном конверте» (Оренбург, 2011); золотой медалью X Московского международного салона инноваций и инвестиций ( Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 4 работы - в изданиях рекомендованных ВАК, получено 2 патента РФ на изобретение: «Штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 для разложения нефти и нефтепродуктов» (№ 2396340, 2010) и «Способ выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов» (№ 2426781,2011).

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу по материалам и методам исследования, три главы соб-

ственных исследований, заключение, выводы, приложения. Библиографический указатель содержит 146 источников литературы, из них 114 отечественных и 32 зарубежных. Текст иллюстрирован 16 таблицами и 36 рисунками, включая оригинальные микрофотографии.

Связь работы с научными программами. Диссертационное исследование является фрагментом работы, проводимой в рамках научно-исследовательской темы открытого плана НИР ИКВС УрО РАН «Механизмы взаимодействий симбионтов в природных ассоциациях водных микроорганизмов» (№ гос. регистрации 01.20.02 16537); Ассоциативный симбиоз водных микроорганизмов и его значение в санитарной и экологической практике (№ гос. регистрации 01201067428); Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биоразнообразие» (проект № БР-9-040); Госконтракта № 9 (276/06-000874.1) с Комитетом по охране окружающей среды и природных ресурсов Оренбургской области «Экспериментальное изучение и обоснование использования факторов микробной персистенции в экологической практике».

ГЛАВА 1. УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В ОЧИСТКЕ ЭКОСИСТЕМ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Развитие нефтедобывающей промышленности приводит к возрастающему поступлению в экосистемы, как сырой нефти, так и продуктов ее переработки. Нефть представляет собой сложную смесь алифатических, ароматических, сернистых, кислородных и азотистых соединений (Егоров H.H., Шипулин Ю.К., 1998; Хабиров И.К., Габбасова И.М., Хазиев Ф.Х., 2001; Шамраев A.B., Шорина Т.С., 2009). Попадая в окружающую среду нефть, подвергается влиянию химических, физических и биологических факторов, изменяя при этом свои первоначальные свойства. В результате взаимодействия с окружающей средой образуются продукты окисления, которые могут быть токсичнее исходных соединений. Поэтому нефть следует рассматривать как групповой токсикант, изменяющий свою токсичность во времени (Миронов О.Г., 2000). Основные компоненты нефти по токсичности распределяются в таком порядке: к наиболее токсичным относятся ароматические углеводороды, менее токсичны циклопарафины, еще менее - олефины и на последнем месте находятся парафины (Квасников Е.И., Клюшникова Т.М., 1981; Hammel К.Е., et al., 1992). ,

1.1 Нефтяное загрязнение экосистем и факторы, влияющие на углеводородокисляющую активность микроорганизмов.

Одной из важных экологических проблем, является проблема нефтяного загрязнения пресных водоемов, которые имеют не только рыбохо-зяйственное назначение, но и служат источниками питьевой воды для населения. Требования к качеству такой воды высоки, а нефтяные углеводороды способны оказывать неблагоприятное влияние, поскольку даже при малых их концентрациях вода приобретает неприятный запах и вкус и становится непригодной для использования (Пелешенко В.И. и др., 1991; Наливайко Н.Г. и др. 2007; Шамраев A.B., Шорина Т.С., 2009).

Попавшая в водоемы нефть может переноситься течениями на сотни и тысячи километров, проникать в толщу воды, накапливаться в донных осадках и таким образом, воздействует на все группы организмов: ней-стон, планктон, нектон и бентос. Существенное влияние на доступность нефти к биодеструкции оказывает физическое состояние нефтяных углеводородов в водной экосистеме. Большинство углеводородов нефти являются плохо растворимыми соединениями и при попадании в воду образуют тонкую пленку. После растекания нефти легкие углеводороды быстро испаряются, а небольшая часть растворяется в воде. Дальнейшая трансформация, биохимическое и химическое окисление нефти и нефтепродуктов в окружающей среде зависит от степени их дисперсности. Эмульгирование углеводородов существенно изменяет их свойства (Мочалова О.С. и др., 2002; Кураков A.B. и др., 2006). При эмульгировании нефти и нефтепродуктов образуется два типа эмульсий - прямые и обратные. Прямые эмульсии типа нефть в воде более доступны для биодеградации, чем обратные эмульсии, по типу вода в нефти (Петров A.A., 1984; Миронов О.Г., 2000). Диспергированная нефть адсорбируется на взвешенных частицах и опускается на дно, где подвергается бактериальной деградации.

Способность микроорганизмов потреблять нефтяные углеводороды зависит не только от формы нахождения нефти