Иммобилизация отселектированных углеводородокисляющих микроорганизмов для интенсификации биотехнологических процессов очистки вод от нефтяных загрязнений

Хуснетдинова, Ландыш Завдетовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммобилизация отселектированных углеводородокисляющих микроорганизмов для интенсификации биотехнологических процессов очистки вод от нефтяных загрязнений
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Иммобилизация отселектированных углеводородокисляющих микроорганизмов для интенсификации биотехнологических процессов очистки вод от нефтяных загрязнений"

На правах рукописи

ХУСНЕТДИНОВА ЛАНДЫШ ЗАВДЕТОВНА

ИММОБИЛИЗАЦИЯ ОТСЕЛЕКТИРОВАННЫХ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ИНТЕНСИФИКАЦИИ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ОЧИСТКИ ВОД ОТ НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 9 [Г.? 2012

Ульяновск-2012

005012779

Работа выполнена на кафедре ботаники и зоологии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

МОРОЗОВ НИКОЛАЙ ВАСИЛЬЕВИЧ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Романова Елена Михайловна ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия», заведующая кафедрой биологии, ветеринарной генетики, паразитологии и экологии

доктор биологических наук, профессор Гильмутдинов Рустам Якубович ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», заведующий кафедрой патологической физиологии

Ведущая организация Федеральное государственное

бюджетное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» ФГБУ «ФЦГРБ-ВНИВИ», г.Казань

Защита состоится «20» апреля 2012 года в Ю00 на заседании диссертационного совета Д 220.065.01 при ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» по адресу: 432063, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; тел. 8 (8422) 44-30-58, факс: 44-3072; e-mail: kormlen@yandex.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия», с авторефератом на сайте академии www.ugsha.ru и Минобрнауки РФ www.vak.ed.gov.ru/

Автореферат разослан « ¿Гъ марта 2012 года

Учений секретарь ^__^ v

диссертационного совета JJ.A, Пыхтина

Актуальность проблемы. Прогрессивный рост урбанизации и развитие таких отраслей промышленного производства, как нефтедобывающая, нефтеперерабатывающая и нефтехимическая, приводят к загрязнениям природных вод нефтью и ее производными. В результате нарушается естественный круговорот веществ, подрывается экологическое равновесие, наносится огромный ущерб водным и наземным экосистемам.

Одним из основных загрязнителей природных экосистем являются нефть и нефтепродукты (Печуркин, 1990; Барышникова с соавт., 2001; Белоусова, 2002; Драчук с соавт., 2002; Морозов, 2006, 2009, 2010), которые входят в число экологически опасных соединений (Юровская, 1984; Castaldi et al., 1991; Арене с соавт., 1997; Шкидченко с соавт., 2002; Петрикевич с соавт., 2003; Федоров с соавт., 2006).

Альтернатива этому - применение методов очистки in situ (Пырченкова с соавт., 2006). Наиболее перспективными являются микробиологические способы, основанные на использовании организмов водных экосистем, и, в первую очередь, разнообразных таксономических групп углеводородокисляющих микроорганизмов. Как показано многочисленными исследованиями (Atlas, 1985; Salt et al., 1998; Van Hamme et al., 2003), именно биодеградация является первичным механизмом удаления углеводородных соединений. Предпочтение отдается микробным ассоциациям, либо специализированным, адаптированным к определенному составу химических загрязнений, культурам гетеротрофных микроорганизмов (Морозов, 2001; Пирог с соавт., 2005). Изучение видового разнообразия и физиологических свойств (Драчук с соавт., 2002) микроорганизмов, участвующих в биоокислении различных классов углеводородов подтверждает мнение целесообразности использования их в восстановлении естественных качеств окружающей водной среды.

Несмотря на известность факта изученности вопроса, проблема создания высокоэффективных и совместимых между собой ассоциаций нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов на базе аборигенных видов иммобилизованных на сорбентах-носителях, с широким спектром устойчивости их к изменяющимся условиям среды, была и остается очень острым вопросом современного состояния водных ресурсов загрязненных нефтью и ее персистентными соединениями.

В этой связи разработка новых биотехнологий защиты и восстановления природных вод, глубокая очистка и доочистка сточных вод от загрязнения нефтью и нефтепродуктами, с помощью отселектированных углеводородокисляющих микроорганизмов имеет важное народнохозяйственное значение.

Связь темы диссертации с плановыми исследованиями. Тема диссертации связана с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» (на основании Приказа от 02.02.2011 г. №156 Министерство образовании и науки Российской Федерации государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» реорганизован в форме присоединения к ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»), по теме «Эколого-биотехнологические пути регулирования управления качеством водных и земельных ресурсов» по приоритетному направлению фундаментальных исследований технологической платформы «БиоТех 2030» в области экобиотехнологии и биоресурсных центров в РФ.

Цель исследования - комплексное изучение биотехнологических путей интенсификации процессов очистки природных вод и технологических стоков от нефти отселектированными углеводородокисляющими микроорганизмами на основе иммобилизации их на органических субстратах растительного происхождения.

Основные задачи работы:

1.Выделение, идентификация и подбор индивидуальных штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов, участвующих в биодеградации нефтяных загрязнений.

2.Создание искусственного консорциума углеводородокисляющих микроорганизмов, эффективно ускоряющего процессы биоокисления нефти в природных и технологических водах.

3.Выбор сорбентов-носителей и получение иммобилизованных культур микроорганизмов-нефтедеструкторов.

4.Исследование роли свободных суспендированных и иммобилизованных клеток на сорбентах растительного происхождения штаммов-деструкторов нефти.

5.Изучение влияния абиотических факторов среды на деструктивную активность нефти углеводородокисляющими микроорганизмами. б.Оценка эффективности деструкции нефти и ее компонентов искусственно созданными консорциумами углеводородокисляющих микроорганизмов, иммобилизованными на сорбентах-носителях. 7.Разработка рекомендаций по практическому применению иммобилизованных клеток микроорганизмов на органических сорбентах для интенсификации процессов биоремедиации нефтяных загрязнений в природных водах и производственных стоках.

Основные положения, выносимые на защиту: 1.Выделенные и идентифицированные культуры микроорганизмов из сточных вод способны использовать нефть и нефтепродукты как

единственный источник углерода и энергии.

2.Мониторинг углеводородокисляющих культур деструкторов нефти способствовал получению консорциумов высокоэффективных, взаимно дополняющих культур известного состава с целью разработки биотехнологического направления восстановления качества водных ресурсов после нефтяного загрязнения.

3.Применение иммобилизованных ассоциаций углеводородокисляющих микроорганизмов на основе прикрепления их на органических сорбентах растительного происхождения обеспечивает высокую степень деструкции нефти и ее производных.

4 .Абиотические условия среды воздействуют на эффективность биоокисления нефти и нефтепродуктов суспендированными и иммобилизованными клетками углеводородокисляющих

микроорганизмов.

Научная новизна. Выделены и идентифицированы штаммы нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов (НиУОМ), обладающих широким спектром окисления различных классов углеводородов нефти. Подобраны культуры из многочисленных видов гетеротрофных бактерий, совместимых между собой для создания ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов, участвующих в биодеградации нефтяных загрязнений.

Выбран эффективный сорбент-носитель органического происхождения (гречишная и ячменная шелуха) для иммобилизации штаммов-деструкторов нефти и нефтепродуктов.

Дана оценка эффективности деструкции нефти и ее производных искусственно созданным консорциумом углеводородокисляющих микроорганизмов, иммобилизованных на растительных сорбентах, и их применение для интенсификации процессов очистки природных и сточных вод от нефтяных загрязнений.

Создан консорциум нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов промышленного образца для управляемого применения в борьбе с нефтяными загрязнениями в сточных водах, в природных водоемах, а также замазученных землях при аварийном или ином их поступлении.

Г0616ВТ (№ 23), Koch С., Schumann Р., Stackebrandt E. (1995); Arthrobacter globiformis Г0617ВТ (№ 24), Conn (1928); Mycobacterium sp. Г0618ВТ (№ 25), Lehmann and Neumann (1896); Bacillus subtilis Г0619ВТ (№ 26) Nakamura L.K., Roberts M.S., Cohan F.M. (1999); Flavobacterium balustinum Г0620ВТ (№ 27), Harrison (1929) на базе которых создан консорциум для очистки и доочистки нефтезагрязненных вод.

Результаты исследований предлагается использовать для биологического мониторинга состояния водных объектов при их загрязнении нефтяными углеводородами и управляемой интенсификации биодеградации нефти и нефтепродуктов с применением сорбентов растительного происхождения на основе целенаправленной иммобилизации углеводородокисляющих микроорганизмов, участвующих в процессе очистки.

Разработанные приемы и способы управляемой очистки вод от нефтяных загрязнений иммобилизованными на растительных сорбентах консорциумами НиУОМ отличаются своей экономичностью, так как эти сорбенты являются широко распространенными отходами сельскохозяйственного производства. Сорбенты также выступают в среде как легкоокисляемые субстраты, оказывающие благотворное влияние на жизнедеятельность углеводородокисляющих микроорганизмов и стимуляцию всего процесса биоочистки. Так как данные приемы выгодно отличаются экономичностью вследствие использования сорбента из отходов местного сырья растительного происхождения, есть возможность ее применения для восстановления естественных свойств загрязненных нефтью водных ресурсов.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на VI республиканской научной конференции «Актуальные экологические проблемы республики Татарстан» (Казань, 2004), на конференции «Экологические проблемы города Казани и прилегающих территорий» посвященной 1000-летию г. Казани (Казань, 2005), на конференции «Современные наукоемкие технологии» (Москва, 2005), VI всероссийской научно-технической конференции «Вузовская наука -региону» (Вологда, 2008), VI Всероссийской научной конференции молодых ученых «Наука. Образование. Молодежь» (Майкоп, 2009), на конференции «Инновационные подходы к естественнонаучным исследованиям и образованию» (Казань, 2009), X Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2009), на международной конференции 17th International Environmental Bioindicators Conference (Moscow, 2009), на конференции «Окружающая среда и устойчивое развитие региона: новые методы и технологии исследований» (Казань, 2009), на конференции «Современные проблемы органической и биологической химии, молекулярной биологии,

экологии и биотехнологии» (Москва, 2009), на международном конгрессе «Чистая вода. Казань» (Казань, 2010), на конференции «Природоохранные биотехнологии в XXI веке» (Казань, 2010), на конференции «Актуальные вопросы естествознания начала 21 века» (Казань, 2010; 2011).

Публикации: По материалам диссертационной работы опубликовано 17 работ, в том числе в 2 изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 141 страницах машинописного текста, включает 11 таблиц и 13 рисунков. Библиография содержит 248 наименований работ российских и зарубежных авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для выделения микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов были отобраны пробы из сточных вод ТЭЦ № 2, объединенных автохозяйств, накопителя мойки цистерн нефтебазы и городского коллектора ливневых вод г. Казани.

Выделение микроорганизмов-нефтедеструкторов проводили методом накопительной культуры, а также прямым высевом на селективные агаризованные среды с нефтью в качестве единственного источника углерода и энергии. Посевы делали в трех повторностях. Инкубацию проводили в термостате в течение 3-4 суток при температуре 28-30 "С (Практикум по микробиологии, 1976; Теппер с соавт., 2004).

В качестве накопительной культуры использовали синтетическую среду Раймонда (Кузнецов с соавт., 1989). Для определения степени биодеградации нефти и нефтепродуктов применяли агаризованную среду Бриса (Унифицированные методы исследования качества вод, 1977).

Способность микроорганизмов к росту оценивали визуально (помутнение среды, образование осадка, изменение эмульсии) в накопительной культуре. Бактерии высевали на МПА и определяли в чистую культуру. Чистоту выделенных культур микроорганизмов исследовали несколькими способами: визуальным и микроскопическим контролем. Культуры отселектировали по окислению нефти и се производных, а далее на основе изучения морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств микроорганизмов (Теппер, 2004; Нетрусов с соавт., 2005; Микробиология, 2007; Жарикова, 2008), идентифицировали до видового состава в соответствии с требованиями определителя Берджи (Определитель бактерий Берджи, 1997) и привлечением дополнительной литературы (Нестеренко с соавт., 1985; Аристархова, 1989).

В работе использовали штаммы НиУОМ, относящиеся к родам: Rhodococcus maris Г0611ВТ (№ 18); Rhodococcus luteus Г0612ВТ (№ 19); Pseudomonas gladioli Г0613ВТ (№ 20); Corynebacterium vitarumen Г0614ВТ (№ 21); Flavobacterium aguatile Г0615ВТ (№ 22); Micrococcus agilis Г0616ВТ (№ 23); Arthrobacter globiformis Г0617ВТ (№ 24); Mycobacterium sp. Г0618ВТ (№ 25); Bacillus subtilis Г0619ВТ (№ 26); Flavobacterium balustinum Г0620ВТ (№ 27). Культуры депонированы лабораторией-музеем штаммов микроорганизмов ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Для иммобилизации клеток НиУОМ в качестве сорбентов-носителей использовали гранулы с шелухой гречихи (ГШ) и шелухой ячменя (ЯШ).

Иммобилизацию клеток бактерий проводили с использованием гранул агар-агара с добавлением ГШ и ЯШ. Получившиеся гранулы переносили в цилиндр на 50 мл с бактериальной суспензией. Для проведения адсорбционной иммобилизации (Нетрусов с соавт., 2005; Центер с соавт., 2009) клетки односуточной культуры центрифугировали 3-4 тыс.об/мин в течение 10-15 мин при 20-22 °С. Далее отмывали в физиологическом растворе (рН = 7,2) и готовили суспензию, содержавшую 108—109 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл. Полученной бактериальной суспензией объемом 1 мл смачивали 1 см3 носителя. Процесс сорбции осуществляли в статических условиях при температуре 28 °С в течение 2 ч, далее при температуре 4 °С в течение 3 ч.

Сравнение углеводородокнсляющей активности штаммов по степени утилизации углеводородов в жидкой минеральной среде Раймонда использовали товарную и сырую нефть из Альметьевского и Еновского месторождений ОАО «Татнефть» (Республика Татарстан) и нефтепродукты (бензин, керосин, соляровое масло, турбинное масло, вазелиновое масло, мазут и др.). Культивирование проводили в колбах при разных температурных условиях от +4 °С до +28 "Сив условиях аэрации на круговой качалке (120 обУмин) при 22 °С.

Учет численности микроорганизмов проводили высевом из разведений на агаризованные среды по стандартной методике (Теппер с соавт., 2004; Нетрусов с соавт., 2005). Количество гетеротрофных микроорганизмов-нефтедеструкторов учитывали на агаризованных синтетических средах с нефтью в качестве единственного источника углерода. Прирост биомассы определяли по показателю оптической плотности клеточной суспензии на фотоэлектрическом КФК-3 при длине световой волны X = 600 им.

Аналитические методы. В качестве показателя окислительной активности штаммов микроорганизмов и их потенциальной способности к окислению нефти и углеводородсодержащих соединений использовали

значения биологического потребления кислорода (БПК5), химического потребления кислорода (ХПК) и содержание растворенного кислорода по общепринятым химическим и санитарно-бактериологическим показателям (Лурье с соавт., 1974).

Количество остаточных углеводородов в жидкой среде определяли весовым методом (экстрагентом служил четыреххлористый углерод).

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием методов математической статистики (Плохинский, 1970; Лакин, 1990), путем определения среднего арифметического (Х^,), среднеквадратического отклонения (5), ошибки среднего арифметического показателя (т), показателя достоверности (tg) разности двух сравниваемых величин, с применением программного обеспечения Excel (Microsoft Offic).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и идентификация микроорганизмов-нефтедеструкторов

На первом этапе выделение микроорганизмов-нефтедеструкторов из образцов сточных вод проводили параллельно двумя методами: методом накопительных культур и прямым высевом на агаризованные среды.

В процессе изучения было получено 32 штамма, из которых 10 видов были выбраны как активные нефтеокислители для дальнейших исследований.

Таблица 1

Физиолого-биохимические свойства культур микроорганизмов

№ штаммы гидролиз протеаз гидролиз казеина гидролиз амилазы активность катал азы 63 § 3 i § е 2 3 о образование сероводорода уреазыа рост на среде Эшби а ев

1. Г0611ВТ + + + + + + - +

2. Г0612ВТ + - - + + + + - -

3. Г0613ВТ + + - + + - + + +

4. Г0614ВТ + - - + • - + + +

5. Г0615ВТ - + - + + - - - -

6. Г0616ВТ + + - + - + - - _

7. Г0617ВТ - + + + + + + + _

8. Г0618ВТ + - + + • - + + +

9. Г0619ВТ - + - + + - - _

10. Г0620ВТ + + - + + - - - +

Примечание: «+» — положительная реакция,«-» — отрицательная реакция

Доминирующие формы бактерий были подвергнуты более глубокому изучению их морфологических, кулыуральных, физиолого-биохимических свойств (табл. 1).

Изучение морфологических и культуральных признаков показало, что выделенные штаммы микроорганизмов представлены преимущественно грамположительными и грамотрицательными палочковидными клетками, неподвижными, неспорообразующими. На агаризованной питательной среде образуют колонии с гладкой или матовой поверхностью, ровными, реже волнистыми краями, с плоским и выпуклым профилем; обладают биохимической активностью окислять различные углеводы, органические кислоты, нефть и нефтепродукты.

Выбор и создание искусственных ассоциаций активных нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов

На втором этапе исследований изучали отношение идентифицированных штаммов НиУОМ к нефти и ее производным, как к единственному источнику углерода и энергии.

Исследованиями показано, что степень усвоения нефти (товарной и сырой) и нефтепродуктов строго зависит как от состава углеводородов, так и от количества нефтяного загрязнения, контактирующего с микроорганизмами. Как правило, уже в течение 1-3 суток пленка нефти изменяется по структуре, переходя от черного до коричневого, а далее в светло-серый цвет в конце опыта.

Анализ динамики общей численности бактерий, включая НиУОМ, показал, что внесение нефти в минеральную среду вызывало возрастание численности, причем в зависимости от фракции углеводородов, включаемых в биодеградацию (рис. 1).

В течение первых 3-х суток число микроорганизмов во всех вариантах опыта возрастало и колебалось от 1,9 • 10 до 6,7 • 107 кл/мл, что, по-видимому, связано с адаптацией их к исходному субстрату, как единственному источнику углерода, и с началом его разложения. К концу эксперимента, на 9-10-е сутки численность микроорганизмов постепенно снижалась по мере уменьшения количества и усвояемой части нефти. Сравнение содержания гетеротрофных бактерий в опытах с нефтью показало стимулирующее влияние углеводородов на динамику микроорганизмов, участвующих в биоокислении, которая четко проявилась на третьи сутки и прослеживалась до конца эксперимента.

При деструкции нефти углеводородокисляющие микроорганизмы (на среде МП А) переходят в фазу интенсивного размножения лишь на 5—6-е сутки, численность их при этом достигала максимальной величины и колебалась от 3,0 • 107 до 8,6 • 107 кл/мл, так как нефть, являясь

органическим веществом, выступает в качестве питательного субстрата для их развития, что приводит к биодеградации нефти и самоочищению воды.

* * * 71 ш w ^

Рис.1. Численность углеводородокисляющих микроорганизмов на среде МПА (А - культуры: Rhodococcus maris, Rhodococcus luteus, Pseudomonas gladioli-, Б - Corynebacterium vitammen, Flavobacterium aguatile, Micrococcus agilis; В - Arthrobacter globiformis, Mycobacterium sp., Bacillus subtilis, Flavobacterium balustinum)

Отдельные виды углеводородокисляющих бактерий, такие как Rhodococcus maris, Pseudomonas gladioli, Micrococcus agilis, доминируют, благодаря своей численности, химической активности и продуктивности.

В результате проведения серий опытов по определению степени биодеградации сырой нефти и нефтепродуктов под воздействием НиУОМ, выявили, что деструкция фракций нефти начиная от бензина до керосина, вазелинового, турбинного и солярового масел идет быстрее, чем тяжелых фракций, таких как мазут и его компоненты (табл. 2).

В последующих исследованиях основное внимание уделяли подбору смешанных культур, искусственно составленных из отдельных штаммов. Для этого из многочисленных видов гетеротрофных микроорганизмов, выделенных из объектов окружающей среды и объединенных в ассоциацию, подбирали подходящие условия, обеспечивающие их совместное развитие для управляемого применения при ликвидации локальных или иных нефтяных загрязнений.

Таблица 2

Деструкция различных классов углеводородов нефте- и углеводородокисляющими микроорганизмами

Штаммы Углеводороды

нефть мазут бензин керосин толуол вазелиново е масло турбинное масло соляровое масло

Г0611ВТ + + + + + + + + + + ++ + + + + + + +

Г0612ВТ + + + + + + + + + + + + + + + + +

Г0613ВТ ++ + + + + + + + + + + + + + + + + +

Г0614ВТ + + + + + + +++ + + + + +

Г0615ВТ + + + + + + + + + + + + ++ + +

Г0616ВТ + + + + + + + + + + +++ + + + + + +

Г0617ВТ + + + + + + + + +++ + + + + + + +

Г0618ВТ + + + + + + + +++ + + + + + + +

Г0619ВТ + + ++ + + + + + + + + + + ++ + +

Г0620ВТ + + .+ + + + + + + + + + + + + + +

Примечание:«+++» - интенсивный рост,«++» - хороший рост, «+» — умеренный рост

Общепринято, в создании биопрепаратов на основе НиУОМ направленного действия, использовать два основных подхода. Первый основан на создании консорциума микроорганизмов, полученного посредством комбинирования ряда штаммов с известной деградирующей способностью (определенный консорциум). Второй подход, включающий получение так называемых неопределенных консорциумов -консорциумов с неизвестными характеристиками каждого из его членов. Это может быть особенно эффективно для деградации определенного загрязнителя, к которому данный консорциум заранее адаптирован (Жуков с соавт., 2007).

На основе выбранных десяти высокоактивных нефтеокисляющих монокультур были составлены искусственные ассоциации, состоящие из разного числа штаммов (табл. 3). В каждый из вариантов вошли по два, три, пять, семь и десять активных штаммов-деструкторов нефти. Ассоциации, состоящие из большего числа штаммов, обладали наибольшей деструктивной активностью. Вероятно, при биотрансформации нефти происходит как количественное снижение содержания нефти, так и качественное изменение его фракционного состава, т.е. наблюдается избирательная способность утилизировать отдельных ее компонентов.

Таблица 3

Ассоциация углеводородокисляющих микроорганизмов

№ Ассоциация, штамм

1. Г0611ВТ(№ 18) + Г0612ВТ(№ 19)

2. Г0611ВТ (№ 18) + Г0612ВТ (№ 19) + Г0616ВТ (№ 23)

3. Г0611ВТ (№ 18) + Г0612ВТ (№ 19) + Г0613ВТ (№ 20) + Г0614ВТ (№ 21)

4. Г0611ВТ (№ 18) + Г0612ВТ (№ 19) + Г0613ВТ (№ 20) + Г0614ВТ (№ 21) + Г0615ВТ (№ 22)

5. Г0611ВТ (№ 18) + Г0612ВТ (№ 19) + Г0613ВТ (№ 20) + Г0614ВТ (№ 21) + Г0615ВТ (№ 22) + Г0616ВТ (№ 23)

6. Г0611ВТ (№ 18) + Г0612ВТ (№ 19) + Г0613ВТ (№ 20) + Г0614ВТ (№ 21) + Г0615ВТ (№ 22) + Г0616ВТ (Кг 23) + Г0617ВТ (№ 24)

7. Г0611ВТ (X» 18) + Г0612ВТ (№ 19) + Г0613ВТ (№ 20) + Г0614ВТ (№ 21) + Г0615ВТ (№ 22) + Г0616ВТ (№ 23) + Г0617ВТ (№ 24) + Г0618ВТ (№ 25)

8. Г0611ВТ (№ 18) + Г0612ВТ (Кг 19) + Г0613ВТ (№ 20) + Г0614ВТ (№ 21) + Г0615ВТ (№ 22) + Г0616ВТ (№ 23) + Г0617ВТ (№ 24) + Г0618ВТ (№ 25) + Г0619ВТ (№ 26)

9. Г0611ВТ (№ 18) + Г0612ВТ (№ 19) + Г0613ВТ (№ 20) + Г0614ВТ (№ 21) + Г0615ВТ (№ 22) + Г0616ВТ (№ 23) + Г0617ВТ (№ 24) + Г0618ВТ (№ 25) + Г0619ВТ (№ 26) + Г0620ВТ (№ 27)

По результатам исследований микробные ассоциации № 1 (Г0611ВТ (№ 18) + Г0612ВТ (№ 19)) и № 2 (Г0611ВТ (№ 18) + Г0612ВТ (№ 19) + Г0616ВТ (№ 23)) не показали высокой эффективности окисления нефти, что, по-видимому, связано с конкуренцией штаммов за субстрат, хотя каждый из штаммов в монокультуре показал более высокую деструктивную активность нефти.

Из девяти проверенных вариантов ассоциаций для дальнейших исследований были выбраны два, состоящие из трех и десяти культур.

Определение и выбор носителей для иммобилизации клеток нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов

Одним из перспективных направлений очистки природных и сточных вод от нефти и ее персистентных соединений является изучение и дальнейшее практическое применение адгезионной или адсорбционной иммобилизации клеток НиУОМ на поверхности инертных или активных твердых материалов, являющихся одновременно биосорбционной поверхностью и биостимулятором деструкции нефти и ее производных до безвредных продуктов окисления, т.е. до С02 и НгО.

На следующем этапе работы, параллельно со свободными суспендированными клетками исследовали инертные носители

растительного происхождения - ГШ, ЯШ, с иммобилизованными на них штаммами-деструкторами нефти.

Изучение влияния аэрации на углеводородокисляющую активность ассоциации микроорганизмов-нефтедеструкторов

При культивировании исследуемых штаммов микроорганизмов в ассоциациях, состоящих из трех Г0611ВТ (№ 18) + Г0613ВТ (№ 20) + Г0616ВТ (№ 23) и десяти видов Г0611ВТ (№ 18) + Г0612ВТ (№ 19) + Г0613ВТ (№ 20) + Г0614ВТ (№ 21) + Г0615ВТ (№ 22) + Г0616ВТ (№ 23) + Г0617ВТ (№ 24) + Г0618ВТ (№ 25) + Г0619ВТ (№ 26) + Г0620ВТ (№ 27) в свободном и иммобилизованном состояниях, в течение двух недель, в условиях аэрации минеральной среды кислородом выяснено, что скорость разложения нефти находится в прямой зависимости от численности микроорганизмов, которые потребляют связанный молекулярный кислород для деструкции нефти до более простых форм углеводородов.

80,17%

кшьная среда со свободными метками И. таш. Р. вЫЬЬ, М. адШ;

Минеральная е^реда с иммобвлнюванным? клетками И. таш, Р. ^а&оЬ, М- ад]ц на гранулах греяюи

0 Минеральная среда со свободными клетками И. тэге, Я. )шси5, Р. ¿«¡юл С. улагщоеа, р. афий1!е. М. арЬа. А. ^оЫйипйа. МусоЬасклщп ар., В. ацЫфа, Б Ьа1иаСтит □ Минеральная среда с иммобилюованкыми щипками Я тагн, К Ь)Есщ, Р. С.

и!ап1тт, Р. афШ11с, М. адЦв, А. ёЫиГотиа. МусоЬас(еяшг! ар., В зиЫЛи. Ьа1ш(тит яа грану лах госчихи

8,70 %

51,50 %

Рис. 2. Влияние аэрации на деструкцию нефти суспендированными и иммобилизованными клетками микроорганизмов на гранулах гречихи

В ходе эксперимента было показано, что в вариантах с тремя культурами биодеградирующая активность в окислении нефти свободными клетками составляла - 45,3 %, с десятью культурами - 51,5 %, а в варианте с иммобилизованными на гранулах шелухи гречихи тремя штаммами - 80,17 % а десятью - 98,17 % соответственно (рис. 2).

По мере уменьшения концентрации нефтяного загрязнения происходит снижение растворенного кислорода в среде со свободными клетками с 4,5 до 1,8 мг/л и с 4,2 до 1,1 мг/л; для иммобилизованных клеток с 4,2 до 1,0 мг/л и с 4,5 до 1,0 мг/л к периоду наименьшего количества микроорганизмов до 76,0 - 107 и 11,6 - I О7 кл/мл соответственно.

С шелухой ячменя (рис. 3) в тех же условиях при иммобилизации трех штаммов степень окисления нефти составляла - 75,34 %, а десяти - 88,0 %. В контрольном варианте без сорбентов степень деструкции не превышала - 8,7 %. Максимальное возрастание численности иммобилизованных клеток во всех вариантах наблюдалось на 4-5 сутки эксперимента и составляло от 11,7 • 10 до 12,0 • 107 кл/мл, со свободными клетками от 8,6 • 107 до 10,5 • 107 кл/мл.

51,50%

75,34 %

И Минеральная среда со свободными клетками R mans. Р gbdiob. М- agibs

□ М иверальная среда с иммобилизованными хлетками R maris, P. gadiob, М. agihs на гранулах ячменя

52 Минеральная среда со свободными

клетками R. mam, R. hitcus, P. gladioli, С. vilanuDtn, F. nguatile, M. agilis, A. gjobilormis, Mycobacterium sp._ B. subtilis., F. baiustinum (3 Минеральная среда с иммобилизованными клетками R. maxis; R. hitcus; P. gladioli. C. vitarumai; F. apatite; M. agfis; A. gjobtfonnis; Mycobacterium sp; B. subtilis; F. baKist mum на гранулах ячменя 83 Минеральна* среда с добавлением нефти

Рис. 3. Влияние аэрации на деструкцию нефти суспендированными и иммобилизованными клетками микроорганизмов на гранулах ячменя

При этом содержание в среде биологического потребления кислорода (БПК5), характеризующего наличие легкодоступной органики микроорганизмам, а также степень ее биотрансформации с тремя культурами уменьшилось с 6,5 до 4,0 мг/л и с 5,6 до 3,3, с десятью - с 5,7 до 3,1 и с 4,9 до 2,2 мг/л. В то же время значения химического потребления кислорода (ХПК) снизились со 171,2 до 124,4 и со 182,1 мг/л до 138,8 мг/л для трех культур и со 157,3 до 102,8 мг/л и со 152,1 до 101,0 мг/л для десяти культур, что указывает на более интенсивное биоокисление как нефти так и сопутствующих соединений в среде (воде) смешанной ассоциацией микроорганизмов.

Установлено, что в условиях аэрации наиболее высокие результаты деструкции нефти были достигнуты за счет применения иммобилизованных, т.е. прикрепленных к твердому носителю клеток микроорганизмов, что в основном объясняется возможностью достижения высокой концентрации биомассы на единице поверхности носителя, и, следовательно, высокой окислительной способности.

Изучение влияния температурных условий на нефтедеструктивную активность консорциума, выделенных штаммов микроорганизмов

Изучение влияния различных температурных условий от +4 °С до +28 °С на деятельность нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов показало, что интенсивность окисления нефти тем выше, чем выше температура (Морозов с соавт., 1978; Морозов, 2001).

Установлено, что температура в интервале 22-28 °С является наиболее благоприятной средой для развития микроорганизмов, что подтверждается высокой численностью клеток бактериальной суспензии и эффективностью деструкции нефти.

В зависимости от температуры культивирования степень утилизации нефти менялась от 17,7 % до 85,0 %.

Культивирование суспендированных и иммобилизованных клеток микроорганизмов в консорциумах, состоящих из трех и десяти штаммов при температуре +28 °С, привело к увеличению эффективности окисления нефти. Степень деструкции нефти при заданной исходной концентрации 0,5 % по объему, консорциумом микроорганизмов из 3 культур, иммобилизованных на гранулах шелухи гречихи, составляла 66 %, с адсорбированными 10 культурами - 85,0 %; со свободными 3 и 10 культурами соответственно -27,3 % и 35,7 % (рис. 4а).

Изучение динамики растворенного кислорода в опытах со свободными клетками показало, что его содержание постепенно уменьшалось, на 15-е сутки в 2,5-3,7 раза по сравнению с исходной, по мере биодеградации нефти к окончанию эксперимента, тогда как с иммобилизованными клетками уменьшилось в 3,8-4,0 раза.

При использовании ячменя в качестве адсорбента для консорциума, состоящего из 3 культур, численность клеток НиУОМ возросла до 10,4 • 107 кл/мл а степень деструкции нефти до 56,17 % (рис. 46).

ХПК при этом изменилось от 158,2 до 101,3 мг/л. С 10 культурами зафиксировано увеличение числа клеток до 12,3 • 107 кл/мл, а ХПК сократилось со 169,7 до 89,3 мг/л. Окисление нефти повысилось до 67,17 %. С меньшей эффективностью процесс деградации нефти происходит в контроле (среда без микроорганизмов) - 6,7 % с незначительными изменениями в среде растворенного кислорода, БПК5 и ХПК.

Увеличение эффективности окисления нефти в среде НиУОМ может быть связано с влиянием температуры на структуру клеточных компонентов, особенно белков и липидов и на температурные коэффициенты скоростей реакций, зависящих в свою очередь от энергии активации этих реакций. Повышение температуры служит причиной того, что все ферментативные реакции ускоряются, что приводит к высокой скорости разложения нефти.

А. на гранулах гречихи

I .Ммкфымм срел со слобооишн

□ Мкисралиаи сред! с ачмобаиооокатщмм «л

□ Мипсралми* среда со саободаоам ЮПШ Я таги, Я Ысш. Р. ¿МгоН. С чаиаасп. Р. «ринк. М. арЬи. А. /ЫМогт*. МуслЬкЮпп ч>..В. иЫЛи. К ЬЫпп

Я Ьаси». Р |Ым11 С \ iUJUmcn. К. «(ШиЬ. М. «р1н. Л. ((оЬЦопай, МусоЬкЮолп «р., В. аиЬсЛ*. р. ЬикЫшав

О \Ьшср«льк14 срс^р с добавлением исфтн

О Миисрашлм среда с гртутии оелухи грсчах*

на гранулах ячменя

О Минералы!** среда со добояшкм телами Я шяц К Ыет. Р. (Ы»и. С УАшшпсп, Г ауи|Цс, М. «р!ю. А £1оЫ1игшо. МусоЬасЩшт ар.. В. шЬЩп. И, ЬаЬмтиш

в Мкюрами среда с ымыобнлииныиымх т

К. ЬЯС05, Р. {ЫкоЬ. С уЦагигасо. р. а^шик, М- А. ¿¡оШогша. \fycobactenuot ар . В аЫ/кх. Р. ЬвкМвшт

и среда с грану ш«« иклухк писал

Рис. 4. Эффективность окисления нефти ассоциациями культур микроорганизмов в суспендированном и иммобилизованном состоянии

При заданных температурных условиях +20-22 °С, иммобилизация 3 культур на гранулах ячменя отражается на степени окисления нефти -46,16 %, и их численности до 9,5 • 107 кл/мл. С 10 культурами деструктивная активность равна - 54,90 % с числом клеток до 10,3 • 107 кл/мл.

При культивировании 3 культур, иммобилизованных на гранулах с шелухой гречихи на минеральной среде с нефтью микроорганизмы ассимилировали до 53,17 % этого субстрата. Показатели БПК5, ХПК и растворенного кислорода к концу эксперимента уменьшилось от 4,7; 198,3; 3,4 мг/л до 1,8; 140,0; 1,4 мг/л. С прикрепленными 10 культурами эти же параметры изменились от 4,8; 174,2; 3,7 мг/л до 1,8; 96,3; 1,2 мг/л соответственно и с деструктивной активностью в 69,4 %. Это связано, по всей вероятности, с активным очищением воды от лепсоокисляемых органических веществ. В контрольном варианте эффективность процесса биодеградации нефти не превышало 4,4 %. Характер окисления нефти при +20-22 °С незначительно отличается от биодеградации при +28 °С, что, по-видимому, указывает на принадлежность исследуемых культур к мезофилам. Вероятно, это объясняется также особенностью ферментных систем, способных к утилизации нефти в диапазоне температур от +20 °С до +28 °С. Это означает, что для культур микроорганизмов, выбранных для проведения исследований, изменение температурных условий в пределах +20-28 °С не приводит к большим изменениям активности их ферментативных реакций.

При понижении температуры культивирования на минеральной среде до +4 °С интенсивность трансформации нефти 10 культурами микроорганизмов, иммобилизованных на гранулах шелухи гречихи, снижается в 2 раза и составляет 48,1 %, а степень нефтеокисления суспендированными - не более 22,3 %, что подтверждается уменьшением концентрации кислорода с 2,6 до 1,2 мг/л. Иммобилизация 3 культур повышает деструкцию нефти на 35,1 %, суспендированные - на 17,7 %. При этом численность клеток, по сравнению с исходным количеством, составляла 5,4 • 107 кл/мл и 2,1 • 107 кл/мл соответственно.

С консорциумом микроорганизмов 10 культур, иммобилизованных на гранулах шелухи ячменя нефтеокисление равно 36,0 %, с 3 культурами -29,70 %. С уменьшением концентрации нефтяного загрязнения показатели БПК5, ХПК и растворенного кислорода во всех вариантах опыта к концу эксперимента снижались.

Такое окисление нефти при температуре +4 °С в сравнении с температурой в диапазоне от +20 °С до +28 °С объясняется снижением биологической активности микроорганизмов, что приводит к уменьшению самоочищения воды.

Утилизация нефти иммобилизованными штаммами-деструкторами оказалась более эффективной по сравнению со свободными клетками.

Наилучшая трансформация нефти во всех вариантах опыта была достигнута клетками микроорганизмов, иммобилизованными на гранулах с шелухой гречихи (рис. 5, 6) с эффективностью деструкции до 98,17 %. Это означает, что шелуха гречихи является лучшим активатором и биостимулятором растительного происхождения для закрепления НиУОМ, чем шелуха ячменя (в состав шелухи ячменя входит меньшее количество углеводов, липидов).

Рис. 5. Нефтедеструктивная активность клеток микроорганизмов, иммобилизованных на органических субстратах

Шелуха гречихи содержит в себе множество питательных веществ: 23 элемента в разных концентрациях с преобладанием калия, магния, фосфора, бора, кремния и кальция. В составе имеются фосфолипиды и двенадцать кислот, среди которых превалируют пальмитиновая (16:0) и семейство С^ кислот, включающих стеариновую (18:0), олеиновую (18:1) и линолевую (18:2), необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов (Шкорина, 2007).

С Мийральам среда с иммобилизованы*» клетками JL mars, R. luteas» Р gbtboh, С. vjtaramen, F. agaade, M. ag&, A. gfcfcfannis, Mycdbaclatm sp., B. subtàs, F. bafasùium на грщъах гречихи

И Минеральная среда с иммобилизованными клетками R. maris, R. tatcœ, P. gfe<foS, С. vàaramen. F. ignatâe. M. agsb, A. gfabtfonras, Mycobacterium sp., B. subtib.F. babstmum m границах ячмега

Рис. 6. Нефтедеструктивная активность клеток микроорганизмов, иммобилизованных на органических субстратах

Органические сорбенты растительного происхождения на основе шелухи гречихи и шелухи ячменя имеют существенные преимущества (Степанова с соавт., 2007; Боковикова с соавт., 2009):

- экологическая чистота;

- высокая гидрофобность и нефтеемкость;

- содержат биологически ценные компоненты;

- не требуют затрат на регенерацию;

- низкая стоимость, так как являются отходами сельскохозяйственного производства.

Таким образом, полученные результаты позволяют рекомендовать сорбенты на основе шелухи гречихи и ячменя для интенсификации трансформации нефти и нефтепродуктов в сточных водах разной степени загрязнения.

В ходе проведенных исследований было показано, что в вариантах со свободными и иммобилизованными клетками микроорганизмов наибольшая эффективность деструкции нефти и нефтепродуктов достигалась в том случае, если в состав консорциума входило 10 культур (рис. 8, 9), что объясняется наибольшим разнообразием бактерий, обладающих разными ферментными системами, способных извлекать углеводороды из субстрата с большей эффективностью.

<< Ясс »чш;»» 44 йнгс йгг

Рис. 7. Деструкция нефти ассоциациями культур микроорганизмов в состояниях суспендированном и иммобилизованном на гранулах с шелухой гречихи

«т м-згс вг*' я***. ггс

Рис. 8. Деструкция нефти ассоциациями культур микроорганизмов в состояниях суспендированном и иммобилизованном на гранулах с шелухой ячменя

На основании полученных экспериментальных данных можно считать целесообразной возможность применения созданных ассоциаций микроорганизмов для интенсификации процессов деструкции нефтезагрязненной природных и сточных вод с различной степенью эффективности.

ВЫВОДЫ

1. Выполнена микробиологическая оценка загрязнения объектов окружающей природной среды нефтью и нефтепродуктами и на их основе выделена и идентифицирована аборигенная нефтеокисляющая микрофлора, принадлежащая к родам Rhodococcus, Pseudomonas, Corynebacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Arthrobacter, Mycobacterium и Bacillus.

2. Создан и отселектирован из идентифицированных нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов консорциум, состоящий из десяти видов нефтедеструкторов — Rhodococcus maris Г0611ВТ; Rhodococcus Iuteus Г0612ВТ; Pseudomonas gladioli Г0613ВТ; Corynebacterium vitarumen Г0614ВТ; Flavobacterium aguatile Г0615ВТ; Micrococcus agilis Г0616ВТ; Arthrobacter globiformis Г0617ВТ; Mycobacterium sp. Г0618ВТ; Bacillus subtilis Г0619ВТ; Flavobacterium balustinum Г0620ВТ, обладающий способностью окислять н-алканы и ароматические углеводороды. Культуры депонированы лабораторией-музеем штаммов микроорганизмов ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» «ФЦТРБ-ВНИВИ».

3. Установлено, что температура среды в интервале 22-28 °С является наиболее благоприятной для развития штаммов консорциума углеводородокисляющих микроорганизмов. Эффективность деструкции нефти и нефтепродуктов при этом находится в промежутке 19,6-35,7 %, а снижение температуры до 4 °С уменьшает окисление до 17,7 %. Дополнительная аэрация среды, при температуре 20-22 °С, увеличивает степень биологического окисления нефти и нефтепродуктов в пределах 45,3 %-51,5 %.

4. Выяснено, что иммобилизация ассоциаций штаммов нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов на шелухе гречихи повышает скорость процесса деструкции нефти, в вариантах с тремя культурами — до 80,17 %, а с десятью — до 98,17 %. С шелухой ячменя биодеградация нефти с углеводородокисляющими микроорганизмами в те же сроки достигает 75,34 % (три культуры) и 88,0 % (десять культур). В целом шелуха гречихи и ячменя, при использовании их в качестве сорбентов, повышает титр штаммов консорциума до 108-109 кл/см3 носителя. Выбранные субстраты, по-видимому, являются легкоокисляемыми

органическими веществами растительного происхождения, активаторами и источниками биостимуляции окисления нефти и ее производных. 5. Подтверждена возможность широкого применения органических сорбентов растительного происхождения для иммобилизации искусственно созданного консорциума углеводородокисляющих гетеротрофных микроорганизмов, обеспечивающих высокую степень биодеградации нефти. Это открывает путь использования нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов с сорбентами-носителями (шелухой гречихи, ячменя и др.) для интенсификации процессов очистки природных и сточных вод от нефтяных загрязнений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В изданиях, рекомендованных ВАК

1. Морозов, Н.В. Органические субстраты растительного происхождения и их использование для биостимуляции процессов микробиальной очистки / Н.В. Морозов, JL3. Хуснетдннова // Вестник 111 НУ. - 2010. -№ 4(22). - С. 82-86.

2. Морозов, Н.В. Использование иммобилизованных на органическом сорбенте нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки воды от нефти / Н.В. Морозов, Л.З. Хуснетдннова, О.В. Жукова // Фундаментальные исследования. - 2011. - №12. - С. 576-579.

В других изданиях

3. Морозов, Н.В. Создание консорциума микроорганизмов — промышленных биопрепаратов для применения в биотехнологии очистки нефтесодержащих стоков / Н.В. Морозов, JL3. Хуснетдннова // Актуальные экологические проблемы республики Татарстан: Тезисы докладов VI республиканской научной конференции. - Казань: Отечество, 2004.-С. 158-159.

4. Хуснетдннова, JI.3. Аборигенные микроорганизмы в природной среде и их роль в восстановлении естественных свойств среды / Л.З. Хуснетдннова // Экологические проблемы города Казани и прилегающих территорий: сборник материалов конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 1000-летию г.Казани. - Казань: КГТГУ, 2005. -С. 39-40.

5. Сидоров, A.B. Исследование окисления различных классов углеводородов нефти гетеротрофными микроорганизмами / A.B. Сидоров, JI.3. Хуснетдннова, Н.В. Морозов // Экологические проблемы города Казани и прилегающих территорий: сборник материалов конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 1000-летию г.Казани. -Казань: КГПУ, 2005. - С. 28-32.

6. Хуснетдинова, Л.З. Биодеградация углеводородов нефти природных и сточных вод аборигенными микроорганизмами / Л.З. Хуснетдинова, Н.В. Морозов // Современные наукоемкие технологии. - М.: Академия естествознания, 2005. - №11. - С. 93-94.

7. Хуснетдинова, JI.3. Управляемое самоочищение водных экосистем от нефти и нефтепродуктов углеводородокисляющими микроорганизмами / Л.З. Хуснетдинова // VI Всероссийская научная конференция молодых ученых «Наука. Образование. Молодежь». Т.Н. - Майкоп: АТУ, 2009 -С. 165-167.

8. Хуснетдинова, Л.З. Создание бактериальных препаратов -деструкторов углеводородов и их использование в восстановлении качества поверхностных вод / Л.З. Хуснетдинова, О.В. Жукова, Н.В. Морозов // Инновационные подходы к естественнонаучным исследованиям и образованию: материалы науч.-пракг. конф. - Казань: ТГГПУ, 2009. - С. 295-297.

9. Хуснетдинова, Л.З. Создание бактериальных препаратов для управляемой очистки от нефтяных загрязнений водной среды / Л.З. Хуснетдинова // X Международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии». Сборник тезисов докладов. -Казань: Отечество, 2009. - С. 364.

10. Zhukova, O.V. The group of sour carbon hydrogen microorganisms participating in biopreparatus for soil and water manage cleaning irom oil pollution 1 O.V. Zhukova, L.Z. Khusnetdinova // 17th International Environmental Bioindicators Conference. - Moscow: Trovant, 2009. - P. 97.

11. Жукова, O.B. Защита окружающей среды от нефтяных загрязнений. Технологическая схема очистки нефтесодержащих сточных вод / О.В. Жукова, Л.З. Хуснетдинова, Н.В. Морозов И Окружающая среда и устойчивое развитие региона: новые методы и технологии исследований. Т. IV: Экологическая безопасность, инноваций и устойчивое развитие. Образование для устойчивого развитая. / под ред. проф. Латыповой В.З. и доц. Яковлевой О.Г. - Казань: Отечество, 2009. - С. 380-384.

12. Хуснетдинова, Л.З. Биодеструкция нефтяных загрязнений иммобилизованными клетками микроорганизмов / Л.З. Хуснетдинова // Труды научной конференции, посвященной 85-летию кафедры органической и биологической химии и 90-летию со дня рождения почетного профессора Ml 11У Юрия Борисовича Филлиповича. Современные проблемы органической и биологической химии, молекулярной биологии, экологии и биотехнологии. - М.: МПГУ, 2009. -С. 115-117.

13. Хуснетдинова, Л.З. Применение органических субстратов для иммобилизации гетеротрофных микроорганизмов, участвующих в очистке природных и сточных вод от нефти / Л.З. Хуснетдинова, Н.В.

Морозов, O.B. Жукова // Сборник материалов Конгресса «Чистая вода. Казань». - Казань: 2010. - С. 110-113.

14. Жукова, О.В. Приложимость биополитаческих категорий к формам поведения микроорганизмов / О.В. Жукова, Л.З. Хуснетдинова, Н.В. Морозов II Природоохранные биотехнологии в XXI веке. Сборник научных статей. Под редакцией доктора биологических наук, профессора Н.В. Морозова. - Казань: ТГПТУ, 2010. - С. 106-124.

15. Хуснетдинова, JI.3. Использование иммобилизованных клеток углеводородокисляющих микроорганизмов для биодеградации нефтяных загрязнений / JI.3. Хуснетдинова, О.В. Жукова, Н.В. Морозов // Актуальные вопросы естествознания начала 21 века. - Казань: Печать-Сервис-XXI век, 2010. - С. 133-136.

16. Хуснетдинова, Л.З. Микробиологические методы очистки водной среды от нефтепродуктов / Л.З. Хуснетдинова, H.H. Габдулхаев // Актуальные вопросы естествознания начала 21 века. — Казань: Печать-Сервис-XXI век, 2011. - С. 74-76.

17. Жукова, О.В. К вопросу о биодеградации (биоремедиации) нефтяных загрязнений в окружающей среде, как фактор чистой экологии / О.В. Жукова, Л.З. Хуснетдинова // Актуальные вопросы естествознания начала 21 века. - Казань: Печать-Сервис-XXI век, 2011. - С. 110-112.

Подписано в печать 15.03.12 Бумага офсетная. Печать ризографическая. Формат 60x841/16. Гарнитура «Times New Roman». Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ 64/3

Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии Издательства Казанского университета

420008, г. Казань, ул. Профессора Нужина, 1/37 тел. 233-73-59,292-65-60

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хуснетдинова, Ландыш Завдетовна, Казань

е>1 12-3/1153

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

ИММОБИЛИЗАЦИЯ ОТСЕЛЕКТИРОВАННЫХ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ИНТЕНСИФИКАЦИИ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ОЧИСТКИ ВОД ОТ НЕФТЯНЫХ

ЗАГРЯЗНЕНИЙ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Г си

Хуснетдинова Ландыш Завдетовна

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Морозов Н.В.

Казань - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ........................................................................... 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Современное состояние загрязнения окружающей среды нефтью и нефтепродуктами......................................................... 12

1.1. Основные загрязнители окружающей среды нефтью..................... 12

1.2. Состав и свойства нефтяных углеводородов................................. 15

1.3. Микробиологическая деструкция нефти.................................... 20

1.4. Факторы, влияющие на активность деструкции нефти

микроорганизмами.................................................................... 32

Глава II. Применение иммобилизованных клеток микроорганизмов и перспективы их использования для очистки сточных вод от нефтяных загрязнений................................................................................... 41

2.1. Принципы иммобилизации клеток микроорганизмов..................... 41

2.2. Методы иммобилизации........................................................ 49

2.3. Механизмы иммобилизации клеток микроорганизмов.................. 51

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава III. Материал и методы исследований.................................... 67

3.1. Материал исследований........................................................ 67

3.2. Отбор проб.......................................................................... 67

3.3. Методы исследований............................................................ 68

3.3.1.Состав питательных сред....................................................... 68

3.3.2. Выделение и идентификация индивидуальных штаммов микроорганизмов....................................................................... 68

3.3.3. Сравнительная оценка культур микроорганизмов по степени деструкции нефти и нефтепродуктов............................................... 70

3.3.4. Определение и выбор носителей для иммобилизации клеток углеводородокисляющих микроорганизмов.................................... 71

3.3.5. Определение количества клеток высевом на плотные питательные

среды (метод Коха)........................................................................... 73

3.3.6. Определение оптической плотности.......................................... 75

3.3.7. Аналитические методы......................................................... 75

3.3.8. Методика определения нефтепродуктов......................................... 75

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Глава IV. Выделение и идентификация штаммов культур нефте- и

углеводородокисляющих микроорганизмов...................................... 78

4.1. Характеристика выделенных штаммов бактерий........................... 83

Глава V. Изучение ассоциаций нефте- и углеводородокисляющих культур и их иммобилизация на сорбентах-носителях........................ 90

5.1. Выбор и создание искусственных ассоциаций активных нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов.................................... 90

5.2. Определение и выбор носителей для иммобилизации клеток углеводородокисляющих микроорганизмов......................................... 94

5.3. Влияние внешних факторов среды на нефтедеструктивную активность искусственной ассоциации свободных суспендированных и иммобилизованных клеток микроорганизмов................................. 95

5.3.1. Изучение влияния аэрации на углеводородокисляющую активность ассоциации микроорганизмов-нефтедеструкторов.............. 95

5.3.2. Изучение влияния температурных условий на нефтедеструктивную активность консорциума, выделенных штаммов микроорганизмов....................................................................... 99

5.4. Исследование эффективности деструкции нефти иммобилизованными культурами микроорганизмов.......................... 107

5.5. Оценка углеводородокисляющей активности ассоциациями культур

микроорганизмов...................................................................... Ю9

ВЫВОДЫ.............................................................................. 112

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 114

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БПК - биологическое потребление кислорода ВПМ - внеклеточный полимерный матрикс ГШ - гречишная шелуха МПА - мясопептонный агар

НиУОМ - нефте-и углеводородокисляющие микроорганизмы ПАУ - полициклические ароматические углеводороды ХПК - химическое потребление кислорода ЯШ - ячменная шелуха EPS - экзополисахариды

Культуры

R. maris - Rhodococcus maris R. luteus - Rhodococcus luteus P. gladioli - Pseudomonas gladioli C. vitarumen - Corynebacterium vitarumen F. aguatile - Flavobacterium aguatile M. agilis - Micrococcus agilis

A. globiformis - Arthrobacter globiformis

B. subtilis - Bacillus subtilis

F. balustinum - Flavobacterium balustinum

ВВЕДЕНИЕ

При современных объемах добычи потери нефти в мире достигают 50 млн. т/год (Орлов с соавт., 1991). В настоящее время от 1,0 до 16,5 % нефти и продуктов ее переработки теряется при добыче, подготовке, переработке и транспортировке. В атмосферу поступает ~ 65 % загрязнений, в воду ~ 20, в почву ~ 15 %. Примерно половина нефтяной органики из воздуха оседает в районах добычи и воздействует на природную среду через почву и воду (Соромотин, 2004). Своевременное удаление отходов и создание малоотходных технологий являются необходимыми условиями дальнейшего развития мировой цивилизации (Иванов с соавт., 1997).

соединений. Предпочтение отдается микробным ассоциациям, либо специализированным, адаптированным к определенному составу химических загрязнений, культурам гетеротрофных микроорганизмов (Морозов, 2001; Пирог с соавт., 2005). Изучение видового разнообразия и физиологических свойств (Драчук с соавт., 2002) микроорганизмов, участвующих в биоокислении различных классов углеводородов подтверждает мнение целесообразности использования их в восстановлении естественных качеств окружающей водной среды.

народнохозяйственное значение.

Связь темы диссертации с плановыми исследованиями. Тема диссертации связана с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» (на основании Приказа от 02.02.2011 г. № 156 Министерство образовании и науки Российской Федерации государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» реорганизован в форме присоединения к ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»), по теме «Эколого-биотехнологические пути регулирования управления качеством водных и земельных ресурсов» по приоритетному

направлению фундаментальных исследований технологической платформы «БиоТех 2030» в области экобиотехнологии и биоресурсных центров в РФ.

1. Выделение, идентификация и подбор индивидуальных штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов, участвующих в биодеградации нефтяных загрязнений.

2. Создание искусственного консорциума углеводородокисляющих микроорганизмов, эффективно ускоряющего процессы биоокисления нефти в природных и технологических водах.

3. Выбор сорбентов-носителей и получение иммобилизованных культур микроорганизмов-нефтедеструкторов.

4. Исследование роли свободных суспендированных и иммобилизованных клеток на сорбентах растительного происхождения штаммов-деструкторов нефти.

5. Изучение влияния абиотических факторов среды на деструктивную активность нефти углеводородокисляющими микроорганизмами.

6. Оценка эффективности деструкции нефти и ее компонентов искусственно созданными консорциумами углеводородокисляющих микроорганизмов, иммобилизованными на сорбентах-носителях.

7. Разработка рекомендаций по практическому применению иммобилизованных клеток микроорганизмов на органических сорбентах для интенсификации процессов биоремедиации нефтяных загрязнений в природных водах и производственных стоках.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выделенные и идентифицированные культуры микроорганизмов из сточных вод способны использовать нефть и нефтепродукты как единственный источник углерода и энергии.

2. Мониторинг углеводородокисляющих культур деструкторов нефти способствовал получению консорциумов высокоэффективных, взаимно дополняющих культур известного состава с целью разработки биотехнологического направления восстановления качества водных ресурсов после нефтяного загрязнения.

3. Применение иммобилизованных ассоциаций углеводородокисляющих микроорганизмов на основе прикрепления их на органических сорбентах растительного происхождения обеспечивает высокую степень деструкции нефти и ее производных.

4. Абиотические условия среды воздействуют на эффективность биоокисления нефти и нефтепродуктов суспендированными и иммобилизованными клетками углеводородокисляющих микроорганизмов.

Практическая значимость. Получены отселектированные штаммы-деструкторы Rhodococcus maris Г0611ВТ (№ 18), Rainey F.A., Klatte S., Kroppenstedt R.M., Stackebrandt E. (1995); Rhodococcus luteus Г0612ВТ (№ 19), Nesterenko O.A., Nogina T.M., Kasumova S.A., Kvasnikov E.I., Batrakov S.G. (1982); Pseudomonas gladioli Г0613ВТ (№ 20), Severini (1913), Yabuuchi et al. (1993); Corynebacterium vitarumen Г0614ВТ (№ 21), Bechdel et al. (1928), Lan, elle et al. (1980); Flavobacterium aguatile Г0615ВТ (№ 22), Frankland and Frankland (1889), Bergey et al. (1923); Micrococcus agilis Г0616ВТ (№ 23), Koch C., Schumann P., Stackebrandt E. (1995); Arthrobacter globiformis Г0617ВТ (№ 24), Conn (1928); Mycobacterium sp. Г0618ВТ (№ 25), Lehmann and Neumann (1896); Bacillus subtilis Г0619ВТ (№ 26) Nakamura L.K., Roberts M.S., Cohan F.M. (1999); Flavobacterium balustinum Г0620ВТ (№ 27), Harrison (1929) на базе которых создан консорциум для очистки и доочистки нефтезагрязненных вод.

легкоокисляемые субстраты, оказывающие благотворное влияние на жизнедеятельность углеводородокисляющих микроорганизмов и стимуляцию всего процесса биоочистки. Так как данные приемы выгодно отличаются экономичностью вследствие использования сорбента из отходов местного сырья растительного происхождения, есть возможность ее применения для восстановления естественных свойств загрязненных нефтью водных ресурсов.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на VI республиканской научной конференции «Актуальные экологические проблемы республики Татарстан» (Казань, 2004), на конференции «Экологические проблемы города Казани и прилегающих территорий» посвященной 1000-летию г. Казани (Казань, 2005), на конференции «Современные наукоемкие технологии» (Москва, 2005), VI Всероссийской научной конференции молодых ученых «Наука. Образование. Молодежь» (Майкоп, 2009), на конференции «Инновационные подходы к естественнонаучным исследованиям и образованию» (Казань, 2009), X Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2009), на международной конференции 17th International Environmental Bioindicators Conference (Moscow, 2009), на конференции «Окружающая среда и устойчивое развитие региона: новые методы и технологии исследований» (Казань, 2009), на конференции «Современные проблемы органической и биологической химии, молекулярной биологии, экологии и биотехнологии» (Москва, 2009), на международном конгрессе «Чистая вода. Казань» (Казань, 2010), на конференции «Природоохранные биотехнологии в XXI веке» (Казань, 2010), на конференции «Актуальные вопросы естествознания начала 21 века» (Казань, 2010; 2011).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 17 работ, в том числе в 2 изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 141 страницах машинописного текста, включает 11 таблиц и 13 рисунков. Библиография содержит 248 наименований работ российских и зарубежных авторов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Современное состояние загрязнения окружающей среды нефтью и нефтепродуктами

1.1. Основные загрязнители окружающей среды нефтью

По литературным источникам (Карлович, 2005), главным загрязнителем рек и внутренних водоемов выступают геотехнокомплексы: города и промышленные предприятия. Состав техногенных потоков, загрязняющих реки, представлен твердыми частицами, нефтью, нефтепродуктами, полихлорированными буфенилами, полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ), детергентами, биогенными веществами и тяжелыми металлами. По загрязнению поверхностных водоемов сточными водами ведущее положение в течение последнего десятилетия занимают страны Америки (США, Канада, Мексика), затем Европа (без стран, отколовшихся от бывшего СССР), Япония и Россия (европейская часть, включая Урал). Вклад раличных отраслей промышленности России в общий сброс загрязненных стоков отражен на рис. 1.

Нефтедобыче 0,1В

Пищевая СЗ 1",14 Стройматериалы Я«»:' Нвфтепере^абот) з Атомигт Цветная ыетмпуцяуя Уголькат Мвшихострэвки* Черню» металлург»: Дерввеебрайгжа Химическач ' Электроэнергетика

" '.17,8

118.1

ГЦ

Информация о работе

Хуснетдинова, Ландыш Завдетовна
кандидата биологических наук
Казань, 2012
ВАК 03.01.06

Диссертация

Иммобилизация отселектированных углеводородокисляющих микроорганизмов для интенсификации биотехнологических процессов очистки вод от нефтяных загрязнений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы