Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка новой формы биопрепарата для очистки водных объектов от тонких нефтяных пленок

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка новой формы биопрепарата для очистки водных объектов от тонких нефтяных пленок"

На правах рукописи

□03054111

АУШЕВА Хадишат Ахметовна

РАЗРАБОТКА НОВОЙ ФОРМЫ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ ОТ ТОНКИХ НЕФТЯНЫХ ПЛЕНОК

03. 00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва - 2007

003054111

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета им. Д. И. Менделеева.

Научный руководитель: кандидат технических наук,

доцент

Марквичев Николай Семенович

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор

Винаров Александр Юрьевич

кандидат биологических наук научный сотрудник Ботвинко Ирина Васильевна

Ведущая организация:

Московский Государственный Университет инженерной экологии

is

Защита диссертации состоится « JU) » L 2007 г в № часов на

заседании Диссертационного совета ДМ 212 204 13 в РХТУ им. Д. И. Менделеева (125047, Москва, Миусская пл., д. 9) в 443 ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д. И Менделеева.

Автореферат диссертации разослан «_

Ученый секретарь Диссертационного совета

ДМ 212.204.13 /fr И. В. Шакир

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одним из основных и крупномасштабных загрязнителей акваторий является нефть и продукты ее переработки. Применение комплексных методов ремедиации воды подразумевает использование на последнем этапе микробиологических методов очистки, основанных на применении микроорганизмов - нефтедеструкторов, для которых нефтепродукты являются основным источником углерода и энергии. Большинство биопрепаратов, применяемых для биоремедиации водных поверхностей, представляют собой сухие порошки, содержащие высушенные клетки нефтедеструкторов, либо пастообразные формы микроорганизмов. В последние годы для биоремедиации водных поверхностей используются иммобилизованные формы микроорганизмов, обладающие рядом преимуществ по сравнению со свободными клетками, наиболее ценным из которых следует считать положительную плавучесть. В качестве носителей для иммобилизации могут быть использованы как материалы природного происхождения, так и синтетические носители различной природы с плотностью меньшей, чем плотность воды. В основном, во всех методах биоремедиации воды с использованием иммобилизованных микроорганизмов наряду с окислением нефти происходит её сорбция на самих носителях. Это свойство, с одной стороны, позволяет быстрее удалить загрязнения с поверхности воды, делая доступным растворение кислорода в приповерхностном слое. С другой стороны, возрастающая концентрация загрязнителя непосредственно в зоне окисления снижает скорость биодеструкции. Разработка новой формы биопрепарата для ремедиации водных поверхностей является актуальной задачей, при решение которой возможно улучшение многих экологических приемов очистки пресных и морских акваторий.

Дели и задачи исследования Основной целью работы явилась создание новой формы биопрепарата, обладающей положительной плавучестью, предназначенной для очистки водных поверхностей от тонких нефтяных пленок. Для достижения данной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Разработать метод иммобилизации клеток - нефтедеструкторов в

Са - альгинатных гранулах, обладающих положительной плавучестью.

2. Адаптировать данный метод к различным группам микроорганизмов: бактерий, дрожжей, а также микроводорослей.

3. Изучить свойства полученной препаративной формы: активность препарата, срок хранения и способность к разложению в естественной экосистеме.

4. Определить дозы вносимого препарата при различных концентрациях нефтяных загрязнений.

5. Провести опытные испытания по ликвидации нефтяных загрязнений в реальных условиях.

Научная новизна. Впервые применен для создания биопрепарата метод иммобилизации микроорганизмов-нефтедеструкторов в Са-альгинатных гранулах, позволяющий увеличить их деструкционный потенциал.

Показано, что н-алканы, эмульгированные в Са-альгинатные гранулы, позволяют придать гранулам положительную плавучесть.

Показано, что применение новой препаративной формы с эмульгированными н-алканами позволяет увеличить скорость биоремедиации за счет локализации иммобилизованных и свободных клеток в приповерхностном слое воды.

Установлено, что одновременная иммобилизация клеток микроводорослей с клетками нефтедеструкторов способствует интенсификации процесса биоремедиации за счет обогащения биогенным кислородом. Практическая значимость. Разработан новый метод удаления тонких нефтяных пленок с поверхности акваторий с помощью иммобилизованных клеток микроорганизмов-нефтедеструкторов. Определены параметры получения Са-альгинатных гранул с иммобилизованными клетками нефтедеструкторов, влияющие на характеристики биопрепарата. Наработана опытная партия новой препарата для удаления тонких нефтяных пленок с поверхности пресных водоемов и испытана в реальных условиях ЗАО «Транснефть». Показано, что применение нового биопрепарата позволяет снизить количество нефтяных углеводородов (НУГВ) за 21 сутки при температуре от 10 до 22°С в экспериментальном варианте до 95%. Получен патент Российской Федерации на способ получения биопрепарата для очистки водной среды от загрязнений нефтепродуктами и способ очистки водной среды от загрязнений нефтепродуктами.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на III Международном конгрессе по управлению отходами «ВэйсТэк-2003» (Москва, 2003), Ш Международной научно-технической конференции «Экология и научно - технический прогресс» (Пермь, 2005), Ш Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), IV Международной научно-технической конференции «Экология и научно -технический прогресс» (Пермь, 2005), Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе патент Российской Федерации и одна статьи.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на УЗ 0 страницах текста и включает 31Г рисунков и М- таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов, приложений и списка литературы, содержащего/У^ссылки, из которых на иностранных языках ёд .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили углеводородокисляющие штаммы из различных коллекций: Acinetobacter valentis (ВКГТМ, В-6727), Acinetobacter calcoaceticus (ВКПМ, В-5064), Yarrowia lipolytica (Звягильская Р. А.), штаммы бактерий, выделенные из различных образцов почв прибрежной зоны Каспийского моря, а также микроводоросли Platymonas viridis, Dunaliella tertiolecta (коллекция МГУ им. М.В. Ломоносова).

Для выделения и культивирования бактериальных культур использовали среды Ридера и Раймонда, для галотолерантных - модифицированные среды Раймонда и Ридера с добавлением 2% NaCl, для культивирования микроводорослей использовали среду Гольдберга, для культивирования дрожжей-среду следующего состава, г/л: NH4CI-I5; КН2Р04-5; Na2HPO,rlO; MgS04x 7Н20-0,5; NaCl-10; глюкоза 20; дрожжевой экстракт-5,0, pH 6,0-6,2. Идентификацию микроорганизмов проводили по культуральным, морфологическим и биохимическим признакам, используя определители бактерий Берджи, 1997; Вейант др., 1999; Смирнов, 1990. Дифференциацию бактерий по Граму проводили с использованием 3% раствора КОН. В качестве поллютанта и источника углерода использовали нефть Малгобекского и Краснодарского месторождений.

Количественный учет бактерий проводили чашечным методом Коха путем подсчета выросших на них колоний. Учет дрожжей и микроводорослей проводили, используя камеру Горяева. Для учета иммобилизованных клеток Са-альгинатные гранулы предварительно разрушали в фосфатном буфере (Райнина и ДР., 1986).

Иммобилизацию микроорганизмов проводили в 2% растворе альгиновой кислоты, к которому добавляли суспензию клеток в соотношении 1:1. Для придания положительной плавучести в растворе эмульгировали н-алканы фракции С12-С16. Для проведения процесса иммобилизации использовали инжекционную установку, состоящую из перистальтического насоса, инжектора и ротаметра для измерения расхода воздуха. Методика иммобилизации заключалась в следующем: смесь из колбы пропускали через иглу со скоростью 500 мл/ч; отрыв образующихся капель полимера осуществлялся под воздействием воздушной струи из компрессора, подаваемой в область инжектирования со скоростью 2-10'3 м3/мин; капли попадали в 2% раствор хлорида кальция, где происходила сшивка альгината катионами кальция. Полученные гранулы выдерживали в растворе хлорида кальция 30 минут, после чего промывали декантацией водопроводной водой и использовали для последующих экспериментов.

Исследования деструкции нефтяных загрязнений проводили на минеральной синтетической среде с добавлением 1% (по объему) нефти в динамических условиях (110 об./мин.) и 25° С. Длительность экспериментов составляла от 3 до 5 суток.

Лабораторные эксперименты по оценке эффективности способа очистки воды от нефтяных загрязнений заключались в следующем. Для каждого эксперимента готовили 7 стаканов объемом 1000 см3 с содержанием водопроводной (или соленой) воды 500 мл, на водную поверхность которых вносили нефть с концентрацией от 2,6 г/м2 до 10,6 г/м2. Непосредственно на нефтяное пятно вносили препарат, количество которого варьировалось от 0,5 мл до 1,5 мл. Содержание остаточных нефтепродуктов определяли методом извлечения суммы неполярных и малополярных углеводородов органическим растворителем - четыреххлористым углеродом (ССЦ). Интенсивность поглощения каждого раствора определяли на инфракрасном спектрометре «ИКФ-2» (Я, = 3,42 нм). Концентрация нефтепродуктов определялась по предварительно составленному калибровочному графику.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Биодеструкция нефти в периодических условиях микроорганизмами, иммобилизованными в Са - альгинатный гель

В качестве носителя для иммобилизации микроорганизмов был выбран кальций-альгинатный гель. Характерная черта методики включения микроорганизмов в такой гель - это простота операций по формированию гранул, в том числе задание любого требуемого размера, а также вполне удовлетворительные свойства иммобилизованных биокатализаторов после их получения. Задача заключалась в исследовании возможности применения Са-альгинатного геля в качестве носителя для иммобилизации микроорганизмов-нефтедеструкторов. Иммобилизацию проводили по оригинальной методике, где предварительно простерилизованный (20 мин., 120 °С) 2% раствор альгиновой кислоты смешивали с культурой микроорганизмов-нефтедеструкторов и культуральной жидкостью в объемном соотношении 1:1. В качестве микроорганизмов-нефтедеструкторов были использованы бактериальные штаммы Асте^Ьас(ег га!епШ и АстеЮЬаМег са\соасейсш в поздней экспоненциональной фазе роста, характеризующиеся широким спектром окислительной активности по отношению к углеводородам нефти. Исследование способности иммобилизованных микроорганизмов-нефтедеструкторов ассимилировать нефть проводили при периодическом культивировании их в аэробных условиях, в качестве контроля использовали нативную культуру. Сравнение полученных данных по культивированию в периодических условиях иммобилизованных и свободных клеток Асте1оЬас1ег \alentis и АстеШЬаЫег са1соасеНсш показало, что в случае использования иммобилизованных клеток интенсивность роста и процесс накопления биомассы в культуральной жидкости превышали аналогичные показатели для свободных клеток (табл.1). Результаты по степени биодеструкции нефти, полученные с использованием иммобилизованных клеток, также превосходили результаты для свободных клеток. При этом наиболее активным в отношении деструкции НУГВ был Асте^ЬаМег уакпИв, у которого

степень утилизации нефти иммобилизованными клетками составила 68%, в то время как для Асте^Ьа^ег са1соасеНсш она была 60%. АстеЮЬасгег \alentis был выбран для проведения последующих экспериментов.

Таблица 1. Рост иммобилизованных и нативных клеток микроорганизмов Асте^Ъа^ег уа1епй$ и Асте1оЬас(ег ссЛсоасейст на средах, содержащих нефть в качестве единственного источника углерода

Культура микроорганизмов Тип клеток Численность клеток в среде, кл/мл Содержание нефти, мг/л

начальная конечная начальное конечное

Асте1оЬа«сг уа1еп№ нативные 2,3x105 2,7x10* 8460 3981

иммобилизованные - 6,4х107 8472 2707

Асше1оЬас1ег сакоасеНсдо нативные 3,14х105 1,8х107 8468 4300

иммобилизованные - 4,5х107 8463 3356

Примечание: конц. 1% по объему, периодические условия, 96 ч.

Исходя из полученных результатов, предположили, что клетки нефтедеструкторов после иммобилизации в Са-альгинатный гель:

остаются жизнеспособными и активными в отношении деструкции нефтяных углеводородов, при этом наблюдается усиление степени биодеструкции;

- клетки выходят из гранул и участвуют в процессе биодеструкции нефти в свободном состоянии.

1.1. Разработка методики создания Са-альгинатных гранул, обладающих положительной плавучестью

С целью создания новой формы биопрепарата, способной в течение длительного времени удерживаться на поверхности воды, была модифицирована методика получения Са-альгинатных гранул с иммобилизованными микроорганизмами-нефтедеструкторами. Для придания Са-альгинатным гранулам положительной плавучести были рассмотрены различные методы, сущность которых заключалась в уменьшении удельной плотности получаемых гранул. Для этого была снижена концентрация альгината натрия, осуществлено эмульгирование в альгинат материалов, обладающих низкой удельной плотностью, а также наполнение Са-альгинатных гранул газовыми пустотами. В итоге в качестве материала, обладающего низкой удельной плотностью, были выбраны н-алканы фракции С12-С16. В результате проведения серий экспериментов была определена оптимальная концентрация н-алканов, необходимая для придания Са-альгинатным гранулам положительной плавучести, которая составила 10% от общего объема клеточной суспензии и альгината натрия. Включение бактериальных клеток в Са-альгинатный гель проводили в следующем порядке: в 100 мл 2% альгината натрия эмульгировали н-алканы (20 мл), после чего полученную эмульсию смешивали со 100 мл суспензии клеток

(108-109кл/мл). Полученные гранулы хранили в физиологическом растворе при температуре + 4 °С.

1.3. Деструкция пленочной нефти препаратом на основе иммобилизованных клеток Асше№Ьас1ег уакпйв

Были проведены модельные эксперименты с полученным препаратом по биодеструкции пленочной нефти в лабораторных условиях (2,4 г/м2). Результаты проведенного эксперимента показали целесообразность использования иммобилизованных в Са-альгинатный гель клеток АсиШоЪ^ег уа1епНя для ассимиляции пленочной нефти, а также преимущества иммобилизованных форм клеток перед свободными. Степень биодеструкции нефти за 30 дней экспозиции составила для иммобилизованных клеток 92%, для свободных 68% (рис. 1).

0 5 10 15 20 25 30 35 Время, сутки

—*— иммоб. кп —свобод кл Рис. 1. Динамика биодеструкции пленочной нефти препаратом на основе иммобилизованных в Са-альгинатных гранулах клеток АЫлек>Ьас(ег \'а1епйя.

2. Исследование параметров, влияющих на свойства препарата

2.1. Размер Са — альгинатных гранул

Для исследования влияния размера гранул на активность препарата были поставлены эксперименты для 3 серий гранул (300 мкм, 700 мкм, и 1200 мкм) с включенными микроэмульсиями н-алканов (10% по объему) и клетками АстеШЬаМег ха1епй$. Масса внесенных гранул была одинакова во всех вариантах и составляла 1 г. Было установлено, что с увеличением размера гранул уменьшается способность биопрепарата к деструкции нефти. Так, при использовании гранул со средним размером 300 мкм за 3 дня культивирования биодеструкции подверглось 52% нефти, в то время как увеличение размеров до 1200 мкм привело к замедлению процесса биодеградации нефти до 17% (рис.2). С увеличением размера гранул уменьшается удельная поверхность гранул,

отнесенная к единице ооъсма, что ведет к уменьшению численности клеток, выходящих из Са-агтьгинатных гранул. Возможно, также имеет место угнетение микроорганизмов, находящихся в более глубоких слоях гранул, вследствие диффузионных ограничений- Согласно полученным результатам, был предложен наиболее оптимальный режим иммобилизации, при котором ражмер Са-апьгинатных гранул не превышал 300 мкм. При максимальном расходе воздуха 0,002 м3/мин с использованием иглы диаметром 0,6 мм были получены [ранулы размером от 200 мкм до 500 мкм. Количество образующихся гранул в зависимости от их размера, при заданных условиях, описывалось кривой Гаусса и средний размер их составлял 300 мкм. (рис.3).

Рис, 3. Распределение Са-альгинатных гранул по размерам при выбранном режиме иммобилизации.

300 700 1200 Средний размер Са-альгина/пчых гранул, мкм

Рис. 2. Зависимость степени биодеструкции нефти от размера Са - альгинатых гранул.

2.2. Влияние концентрации иммобилизованных клеток

С цслыо определения оптимальной концентрации клеток в геле, необходимой для эффективного процесса био деградации углеводородов нефти, был поставлен эксперимент с использованием гранул, содержащих различный титр иммобилизованных клеток (106, 107, 10 , 109 к л/мл гранул). На основе результатов расчета остаточной концентрации нефти была рассчитана степень биодеструкции (рис.4).

При использовании препарата с наименьшим титром клеток (106 кл/мл гранул) в течение всего процесса биодеструкции окислению подверглось лишь 50% нефти. С увеличением концентрации иммобилизованных клеток до Ю7 кл/мл гранул степень биодеструкции углеводородов нефти существенно повысилась и составила к концу экспозиции 75%. При дальнейшем увеличении титра иммобилизованных клеток до 10й и 10Ч кл/мл гранул величина биодеструкции в обоих вариан тах была примерно одинакова и составляла 86% - 88%.

а zoo ж гъо ш зю жзбо «4М »4® ж5ое Размер гранул, мкм

Время, сутки

Рис. 4. Степень биодеструкции нефти препаратом на основе иммобилизованных клеток АстеюЬаМег усйепИв в зависимости от начальной концентрации иммобилизованных клеток: а - 109, б - 108, в - 107, г - 106 кл/мл гранул.

Таким образом, для эффективного процесса биодеградации нефти было предложено проводить иммобилизацию концентрированной супензии клеток для получения препарата с содержанием титра клеток не меньше 108 кл/мл гранул. Дальнейшее увеличение концентрации клеток в геле было нецелесообразно, так как это не приводит к увеличению степени биодеструкции.

2.3. Влияние биогенных элементов на процессы биодеградации нефти.

Для ускорения процесса утилизации углеводородов нефти была рассмотрена возможность иммобилизации в Са-альгинатные гранулы бактерий в суспензии с добавлением кукурузного экстракта в качестве стимулятора роста. Исследования динамики биодеструкции нефти препаратом, содержащим 5% кукурузного экстракта, проводили по стандартной методике, в качестве контроля использовались гранулы без содержания кукурузного экстракта. В ходе исследования было установлено, что при наличии кукурузного экстракта процесс окисления протекал практически без лаг - фазы, при этом в течение первой недели утилизации подверглось около 50% нефти (с 9,6 г/м2 до 5 г/м2). Но затем скорость процесса снизилась, и остаточная концентрация в контрольных и опытных образцах была практически одинакова.

Для исследования влияния кукурузного экстракта на срок хранения препарата гранулы, содержащие иммобилизованную культуру АстеЬоЬаМег уа1епй$ и кукурузный экстракт были заложены на хранение при температуре 4° С. В процессе хранения препарата, содержащего кукурузный экстракт, наблюдалось его вымывание из гранул. Также было выявлено заражение препарата посторонней микрофлорой по истечении 3 месяцев хранения.

Таким образом, использовать кукурузный экстракт целесообразно в том случае, когда предусматривается незамедлительное применение препарата.

2.4. Биоразложение Са - альгинатных гранул

Используемый нами метод иммобилизации предполагает разрушение гранул носителя при наличии в среде определенных концентраций ионов фосфора или натрия, которые, связывая кальций, способны разрушать структуру геля. Также в процессе проведенных исследований было выявлено, что Са-альгинатные гранулы способны разлагаться под действием аборигенной микрофлоры. Разрушение протекало с изменением структуры гранул: размыванием краев, разрыхлением, изменением плавучих свойств. Учитывая, что по окончании процесса биодеструкции носитель с иммобилизованными клетками представляет собой дополнительный источник загрязнения, данное свойство является несомненным достоинством препарата.

2.5. Хранение препарата

Полученный препарат с иммобилизованными микроорганизмами АстеЮЪааег \а1епНз и эмульгированными н-алканами был заложен на хранение в физиологическом растворе (100 мл физраствора на 100 мл препарата) при температуре +4 °С. Каждый месяц в течение полугода определяли степень биодеструкции пленочной нефти препаратом, а также численность клеток в Са-альгинатных гранулах. Опыты ставились параллельно в трех повторностях.

В результате проведенных исследований по определению удельной активности препарата установлено, что в процессе хранения в первые 2 месяца степень биодеструкции препарата снизилась лишь на 3%, при этом титр иммобилизованных клеток Асте(:оЬас1ег уакп^я существенно не изменился (табл.2).

Таблица 2. Определение активности препарата и титра иммобилизованных

клеток в процессе хранения.

Срок храпения препарата Численность клеток в 1 мл препарата Концентрация нефти в пленке, г/м2 Степень биодеструкции пефти, %

исходная конечная

1 сутки 8,7x10" 9,6 1,15 88

1 месяц 7,25x10" 9,64 1,15-1,25 87-88

2 месяца 5,64x10" 9,55 1,43 85

3 месяца 2,82x10' 9,63 1,73-1,92 80-82

4 месяца 2,16x10' 9,58 2,1-2,39 75-78

6 месяцев 6,38x10° 9,62 2,89 70

В дальнейшем наблюдалось постепенное снижение численности иммобилизованных клеток, и после 6 месяцев хранения их численность уменьшилась более чем в сто раз. Что касается величины биодеструкции нефти

препаратом, то после 4 месяцев она составляла 75-78% от первоначального значения, а после полугода хранения 70%, что на 18% меньше первоначальной величины.

Таким образом, разработанный биопрепарат, содержащий бактерии нефтедеструкторы, иммобилизованные путем включения в гранулы Са-альгинатного геля и эмульгированные н-алканы, способен стабильно сохранять свою деструктивную активность при длительном хранении в жидкой среде, что создает более широкие возможности его использования при ремедиации загрязненных объектов.

3. Применение препарата

Для разработки технологии удаления пленочных НУГВ в воде были проведены исследования в лабораторных условиях для определения следующих параметров:

- оптимального количества препарата на единицу поверхности;

- действия препарата на нефтяных пленках разной толщины.

3.1. Влияние количества вносимого препарата на процесс биодеструкции

Количество иммобилизованных клеток, вносимых на единицу загрязненной нефтью поверхности, является очень важным параметром, определяющим экономическую эффективность препарата. Для исследования влияния количества биопрепарата на скорость биодеструкции нефти были поставлены эксперименты, в которых оно варьировалось от 0,5 до 1,5 мл. При этом отношение площади, занимаемой иммобилизованными клетками, к площади нефтяного загрязнения составляло от 1:2 до 1:6. Анализ полученных данных (рис.5) показал, что изменение концентрации нефти в ходе процесса биодеструкции для всех вариантов было практически одинаково. Использование большего количества препарата с иммобилизованными клетками лишь незначительно сокращало остаточную концентрацию углеводородов к концу экспозиции. Учитывая, что увеличение количества вносимого препарата не приводило к возрастанию величины биодеструкции пленочных НУГВ, как наиболее оптимальный, был предложен расход препарата 0,5 мл (50 мл на м2 водной поверхности).

3.2. Влияние толщины нефтяной пленки на динамику биодеструкции.

Была поставлена серия экспериментов по исследованию влияния концентрации нефти, находящейся на единице поверхности, на её биодеструкцию под воздействием иммобилизованных клеток. В процессе биодеструкции нефти иммобилизованными клетками Асте(оЬас(ег усйепИъ (рис.6) в первые 5 суток скорость ассимиляции нефти во всех вариантах была довольно низкая. С 5 по 20 сутки процесс окисления протекал интенсивно, и за этот период утилизировалось до 65% нефти при концентрации внесенной нефти 10,6 г/м2, для остальных вариантов степень утилизации достигла 75-80%. Далее процесс протекал с меньшей скоростью, и на 30 сутки степень биодеструкции для вариантов с содержанием нефти 2,6 г/м2 и 5,4 г/м2 составила 87-92% соответственно и 80% для концентрации нефти 10.6 г/м2. Как показали результаты

подсчета остаточной концентрации нефти на конец экспозиции, увеличение первоначального объема внесенной нефти приводило к возрастанию остаточной нефти, хотя объем нефти, подвергшейся биодеструкции, при этом возрастал. Таким образом, разработанный нами метод иммобилизации позволяет использовать иммобилизованные микроорганизмы Аст&оЬа&ег \alentis в процессах биоремедиации воды с содержанием нефтепродуктов до 10 г/м2, превышающей допустимое содержание нефти в тонкой нефтяной пленке в 4 раза.

Время, сутки —♦—0,5 мл —о— 1 мл —4—1,5 мл

Рис. 5. Динамика биодеструкции пленочной нефти при внесении различного количества препарата.

Время, сутки

Рис. 6. Кинетика биодеструкции нефти препаратом на основе иммобилизованных клеток Асте1оЬа&ег \alentis при содержании нефти в пленке:

а - 2,6 г/м ; 6-5,4 г/м2: в-10,6 г/м2.

33. Механизм биодеструкции

В результате проведения экспериментов по исследованию выхода клеток из гранул, а также изучения накопления клеток на определенной глубине моделированного водоема был предложен механизм биодеструкции пленочной нефти разработанной препаративной формой, согласно которому процесс ассимиляции нефти протекает, в основном, с участием свободных клеток, вышедших из Са - альгинатных гранул. Иммобилизованные микроорганизмы, внесенные в объем воды, имеют различные профили распределения клеток по глубине и по времени (рис.7), причем профиль изменения обусловлен одновременно несколькими параметрами, среди которых наибольшее значение имеют: выход клеток из гранул, рост в свободном состоянии и оседание клеток в глубь водоема. Высокая концентрация клеток непосредственно в зоне окисления нефти свидетельствует о том, что выход клеток из иммобилизованного состояния и рост клеток преобладают над скоростью их погружения, что обеспечивает наиболее эффективное удаление нефтяных загрязнений.

Ig концентрации свободных клеток О 123456789

Рис. 7. Распределение клеток Асте(оЬас1ег уа1епШ по глубине: 1 - на 5 сутки; 2 - на 10 сутки; 3 - на 15 сутки; 4 - на 20 сутки; 5 — на 30 сутки

3.4. Исследование динамики биодеструкции различных нефтей

Исследования проводилось для трех видов нефтей, различающихся по вязкости и содержанию серы. Во всех вариантах наблюдалось снижение содержания НУГВ на поверхности воды (табл.3). Было также установлено, что с увеличением вязкости и содержания сернистых соединений возрастает остаточное содержание нефтепродуктов в воде. Полученные данные открывают возможность использования препарата на основе иммобилизованных клеток для биоремедиации водных объектов при загрязнении различными типами нефтей.

Таблица 3. Физико — химические характеристики использованных нефтей

Месторождение нефти Вязкость, мм2/с Содержание общей серы, % Плотность, г/см3 Степень биодеструкции, % Содержание нефтепродуктов, г/м2

при 20°С при 50°С начальное конечное

1 Малгобек-Вознесснская (Республика Ингушетия) Скважина 550-7 186,53 40,92 0,28 0,928 79 10,68 2,24

2 Малгобек-Вознесенская (Республика Ингушетия) Скважина 861 3,27 2 одз 0,846 88,5 9,8 1,13

3 Троицко-Анасшевская (Краснодар, кр.) 4,45 2,57 0,15 0,809 86 9,54 1,34

3.5. Натурные испытания

С целью определения эффективности действия препарата в условиях, приближенных к естественным, были проведены натурные испытания разработанного биопрепарата. Работы проводились на территории промышленной площадки ООО «ЭКОсервис - НЕФТЕГАЗ» г. Жуковский, с 08 августа 2002 г. по 3 сентября 2002 г. Проведенные испытания подтвердили эффективность действия препарата при содержании НУГВ в пленочной нефти до 10 г/и2. Остаточное количество нефтепродуктов к концу испытаний (25 день) составило 5,4% от исходного количества.

4. Разработка препарата для биоремедиации морской воды

4.1. Выделение и отбор галотолерантных штаммов микроорганизмов

Методом накопительных культур из различных образцов почв прибрежной зоны Каспийского моря на минеральной среде Раймонда с нефтью и 2% NaCl были выделены наиболее активные штаммы микроорганизмов. Из общего числа выделенных штаммов для дальнейших исследований были оставлены два, которые проявили наибольшую нефтеокисляющую активность (табл.4):

- культура с желтой пигментацией: колонии гладкие, маслянистые, профиль слабовыпуклый, края ровные; размер колоний 2-3 мм . Клетки сферические, диаметром 0,5-2 мкм, попарно-соединенные или в виде скоплений неправильной формы, но не в цепочках. Грамположительные, неспорообразующие. Облигатные аэробы, каталазоположительные, галотолерантные, растут при 5% NaCl. По предварительной оценке отнесены к роду Micrococcus.

- культура с белой пигментацией: колонии гладкие, маслянистые, профиль слабовыпуклый. Размер колоний, полученных при рассеве на твердые питательные среды, составлял 1-2 мм. Клетки палочковидные, подвижные, размер клеток 0,3-0,5 х 1,2-2,0 мкм. Грамотрицательные, неспорообразующие. Оптимальная температура роста составляет 25°С. Идентифицирован как Pseudomonas sp.

Таблица 4. Рост галотолерантных микроорганизмов при культивировании на нефти в качестве единственного источника

Культура Биомасса, г Степень биодеструкции нефти, %

Yarrowia lipolytica 3,52 42

Pseudomonas sp. 2,85 48

Micrococcus sp 3,00 55,2

Примечание: конц. 1% по объему, периодические условия, 96 ч.

Также в работе была использована культура дрожжей Yarrowia lipolytica, любезно предоставленная Звягильской P.A. Данная культура способна развиваться в соленых средах и характеризуется достаточно высокой окислительной способностью по отношению к углеводородам нефти.

Культивирование данных штаммов микроорганизмов на искусственной морской воде, (концентрация солей 20 г/л), содержащей нефть в качестве единственного источника углерода показало, что наибольшей окислительной способностью по отношению к углеводородам нефти обладает штамм Micrococcus sp. (55,2%) (табл.4), наименьший результат был получен при культивировании дрожжей Yarrowia lipolytica (42%). Следует также отметить, что при культивировании бактериальные штаммы Pseudomonas sp. и Micrococcus sp. выделяли в среду ПАВ, что способствовало ускорению процесса деструкции нефти.

6. Биодеструкция пленочной нефти в морской воде иммобилизованной ассоциацией микроорганизмов

Для исследования процессов деградации пленочных нефтяных загрязнений в морской воде была проведена иммобилизация различных ассоциаций, составленных на основе данных культур. Дня получения сравнительных данных проводилась серия контрольных опытов с использованием иммобилизованных монокультур. Результаты анализа остаточной концентрации нефти показали, что все исследованные культуры, а также их ассоциации в иммобилизованном состоянии проявили достаточно высокую активность в отношении деструкции углеводородов нефти в морской воде. Степень биодеструкции нефти с использованием отдельных культур Pseudomonas sp. и Micrococcus sp. составила в этих опытах, в среднем, 59,6% и 64,5% соответственно. Под действием иммобилизованной ассоциации, созданной на основе данных штаммов, деструкции подверглось 73% нефти, что на 8,5% превышало результат, полученный для культуры Micrococcus sp. (рис.8).

Следует отметить, что для культуры дрожжей Yarrowia lipolytica получен худший результат: за весь период экспозиции деструкции подверглось лишь 45,8% нефти (рис 9). Так как в процессах биодеструкции нефти участвуют в основном свободные клетки, то данный результат объясняется низким выходом клеток дрожжей из Са-альгинатных гранул. Этот выход ограничен геометрическим размером клеток. В целом, наличие клеток дрожжей в ассоциациях способствует увеличению степени биодеградации нефти, при этом, максимальный результат получен при использовании ассоциации, состоящей из трех культур (рис.9).

Таким образом, для биодеструкции пленочной нефти в морской воде было рекомендовано использовать препарат, созданный на основе иммобилизованных штаммов Pseudomonas sp. Micrococcus sp. и Yarrowia lipolytica.

7. Микроводоросли

Процесс биодеструкции нефтей в тонких плёнках под воздействием иммобилизованных клеток - это процесс, на который влияет большое количество факторов, среди которых особо надо выделить диффузию кислорода в зону реакции. Особенно актуальна эта проблема в первое время после внесения препарата, когда нефтяная пленка максимальна по толщине и диффузия кислорода ограничена. Целью проведения экспериментов была попытка создания препарата, содержащего в своём составе кроме клеток нефтедеструкторов клетки микроводорослей для обогащения приповерхностного слоя кислородом и ассимиляции углекислого газа, образующегося при биологическом разрушении нефти.

Время, сутки

Рис. 8. Биодеструкция нефти в морской воде иммобилизованными Б Ca - альгинатный гель микроорганизмами: 1 - Pseudomonas sp.;2- Micrococcus sp.; 3 - Pseudomonas sp + Micrococcus sp

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Время, сутки

Рис. 9. Биодеструкция нефти в морской воде иммобилизованными в Са-альгинатный гель микроорганизмами: 1 - Yarrowia lipolytica;

2 - Yarrowia lipolytica + Pseudomonas sp.;

3 - Yarrowia lipolytica + Micrococcus sp.\

4 - Yarrowia lipolytica + Pseudomonas sp. + Micrococcus sp.

5.1. Культивирование микроводорослей при наличии нефтяной плепки.

Культивирование проводили в колбах на 100 мл с объемом среды 50 мл, без перемешивания в режиме свет-темнота в течение 60 дней. Исследования проводились для трех концентраций нефти (0,5%, 1% и 2%), рассчитанная высота нефтяного слоя для которых составила 0,179 мм, 0,358мм, 0,715мм, соответственно.

Проведенные модельные эксперименты по изучению воздействия нефти на динамику роста микроводорослей Platymonas viridis и Dunaliella tertiolecta показали, что присутствие нефтяной пленки снижало скорость роста клеток по сравнению с контролем в среднем на 30-60%, в зависимости от концентрации

нефти. Увеличение содержания нефти в экс л ер име нтат ьн ой среде приводило к уменьшению концентрации клеток во всех вариантах, хотя четкой линейной зависимости при этом не наблюдалось (рис.10,11).

Проведенный контроль физиологического состояния клеток микроводорослей по нескольким параметрам (форма, размер, окраска, движение) показал, что с увеличением содержания нефти интенсивность движения заметно снижалась, менялся тип движения клеток с поступательного на поступательно-вращательный. В вариантах с максимальным содержанием нефти клетки приобретали темно-зеленый цвет, а форма клеток была, в основном, крутая. Для дальнейших экспериментов была выбрана культура Platymonas viridis, как наиболее устойчивая к токсическому действию нефтепродуктов.

1

10 сутки 20 сутки 30 сутки <10 сутки 60 сутки 60 сутки Ш контроль. в 0,5% нефти. □ 1% нефти, U 2% нефти

Рис.Ш. Динамика роста численности клеток ми к ро водорослей Platymonas viridis.

10 сутки 20сутки 30 сутки 40 сутки 50 сутки ВО сутки Ш контроль, и 0.5% нефти, □ 1% нефти, в 2% лефти

Рис.11. Динамика роста численности клеток микр о водорослей Dunaliella tertiolecla.

5.2 Биодеструкция пленочной нефти иммобилизованной ассоциацией микроорганизмов-нефтедеструкторов и микроводорослей

Разработанным нами методом были протестированы в морской воде, иммобилизованные в Са-альгинатный гель альго-бактериальные ассоциации. Исследования проводились для трех ассоциаций: Pseudomonas sp. + Platymonas viridis; Micrococcus sp. + Platymonas viridis; Pseudomonas sp. + Micrococcus sp. + Platymonas viridis. Во всех исследованных вариантах присутствие микроводорослей ускоряло процесс биохимического окисления нефти. Наибольший эффект наблюдался с участием всех трех культур: степень биодеструкции в этом случае составляла 86%, что на 12,5% больше, чем результат, полученный при использовании той же ассоциации, но без микроводорослей (рис.13). Количество нефтепродуктов на единицу поверхности под воздействием иммобилизованной ассоциации Micrococcus sp. + Platymonas viridis снизилось на 73% (с 10,8 г/м2 до 2,88 г/м2), для ассоциации Pseudomonas sp. + Platymonas viridis эта величина составила 64 % (с 10,68 г/м2 до 3,6 г/м2).

Время, сутки

Рис.12. Биодеструкция пленочной нефти иммобилизованной ассоциацией микроорганизмов-нефтедеструкторов и микроводорослей: 1- Pseudomonas sp. + Platymonas viridis; 2 - Micrococcus sp. + Platymonas viridis; 3 - Pseudomonas sp. + Micrococcus sp. + Platymonas viridis

Таким образом, в результате исследований динамики трансформации нефтепродуктов в морской воде в лабораторных условиях установлено, что использование альго-бактериальных ассоциаций, иммобилизованных в Са-альгинатный гель, позволяет интенсифировать процесс биоремедиации.

Выводы

1. Показано, что иммобилизация клеток микроорганизмов-нефтедеструкторов в Са-альгинатном геле позволяет увеличить их потенциал в отношении деструкции НУГВ. Установлено, что включение в Са - альгинатные гранулах н -алканов (до 10%) способствует плавучести препарата и его локализации в приповерхностном слое воды.

2. Показано, что метод получения новой препаративной формы на основе гранул с положительной плавучестью можно использовать для иммобилизации бактерий, дрожжей, микроводорослей и их ассоциаций .

3. Изучена кинетика ассимиляции нефти из поверхностных пленок разной толщины (от 2,6 г/м2 до 10,6 г/м2) иммобилизованными микроорганизмами-нефтедеструкторами и показано преимущество применения данной препаративной формы перед аналогичными, содержащими свободные клетки. Определена доза препарата, необходимая для проведения эффективного процесса биоремедиации, составляющая 50 мл/м2.

4. Определены параметры, влияющие на свойства биопрепарата: условия хранения, положительная плавучесть, выход иммобилизованных клеток в свободное состояние, разрушение гранул.

5. Изучена иммобилизация микроводорослей по разработанной методике, а также коиммобилизация микроводорослей, с микроорганизмами-нефтедеструкторами. Показано положительное влияние совместной иммобилизации на процессы биодеструкции водных поверхностей.

6. Проведены испытания новой препаративной формы в реальных условиях с содержанием нефти на водной поверхности до 15 г/м2.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРАТЦИИ

1. Пат. 2003101274 A RU, С 02 F 3/34. Способ очистки водной среды от загрязнений нефтепродуктами и способ получения биопрепарата для очистки водной среды от загрязнений нефтепродуктами /Аушева Х.А., Марквичев Н,С., Нехаев С. А., Краюхин A.B., Нехаева И.В. Заявлено 17.01.2003; опубл. 27.12.2004

2. Аушева Х.А., Бабусенко Е.С., Султыгова З.Х., Марквичев Н.С. «Использование микроводорослей Platymonas viridis для интенсификации процесса биодеструкции нефти» // Успехи в химии и химической технологии. -2005. - Т. XIX, № 5. - С. 63-67.

3. Аушева Х.А., Султыгова З.Х., Бабусенко Е.С., Куклева Н.С., Марквичев Н.С. Препараты - нефтедеструкторы на основе иммобилизованных клеток // Материалы III Международного конгресса по управлению отходами «ВэйсТэк-2003». - Москва, 2003. - С. 163.

4. Аушева Х.А., Гончарук Д.А., Бабусенко Е.С., Султыгова З.Х., Марквичев Н.С. Исследования влияния концентрации иммобилизованных клеток Acinetobacter sp. на скорость биодеструкции нефтяных пленок // Материалы III Межд. конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития». - Москва, 2005. - С. 33.

5. Аушева Х.А., Марквичев Н.С. Изучение процессов биодеструкции нефти иммобилизованными дрожжами Yarrowia lipolytica // Материалы 1П Межд. научно - практич. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Экология и научно -технический прогресс». - Пермь, 2005. - С. 99-100.

6. Аушева Х.А., Марквичев Н.С. Ассимиляция пленочной нефти иммобилизованными клетками Acinetobacter calcoaceticus II Материалы IV Межд. научно - практич. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Экология и научно - технический прогресс». — Пермь, 2005. - С. 82-86.

7. Аушева Х.А., Гончарук Д.А., Бабусенко Е.С., Султыгова З.Х., Марквичев Н.С. Нефтебиодеструкция на водных поверхностях с использованием иммобилизованных клеток микроорганизмов // Материалы Межд. конф. «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды». -Саратов, 2005. - С. 53

Подписано в печать 16.02.2007 Формат 60x90 Гарнитура Тайме. Печать офсетная Бумага тип. Усл.печ.л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ № 4128

Отпечатано в типографии ООО «Мультипринт» 121360 г. Москва, ул. Верейская, д.29 Тел. 978-85-03; 237-17-60

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Аушева, Хадишат Ахметовна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Поступление и распределение нефтепродуктов в водных объек тах

1.2. Процессы самоочищения водных масс от нефтепродуктов

1.2.1. Биологическое самоочищение водных масс

1.2.2. Интенсификация процессов самоочищения водным 16 гидробионтом

1.3. Распространенность и некоторые особенности углеводоро-докисляющих микроорганизмов

1.3.2. Пути поступления углеводородов в клетку

1.3.3. Влияние некоторых небиологических факторов на степень деградации нефти

1.4. Иммобилизованные клетки микроорганизмов 28 1.4.1. Иммобилизация в Са-альгинатный гель

1.5. Опыт создания и применения биопрепаратов в России и странах СНГ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Выделение и идентификация углеводородокисляющих мик- 37 роорганизмов

2.2.1. Морфологические исследования

2.3. Культивирование микроорганизмов

2.4. Определение количества микроорганизмов

2.5. Иммобилизация микроорганизмов

2.6. Исследования деструкции нефти

2.6.1. Определение содержания остаточных нефтепродуктов

Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Применение альгината натрия для иммобилизации микроор- 44 ганизмов - нефтедеструкторов

3.1.1. Иммобилизация бактериальных клеток в Са-альгинатных 44 гранулах

3.1.2. Ассимиляция нефти иммобилизованными и свободными 45 клетками Acinetobacter valentis в периодических условиях

3.1.3. Ассимиляция нефти иммобилизованными и свободными 46 клетками Acinetobacter calcoaceticuss в периодических условиях

3.2. Разработка методики создания Са-альгинатных гранул, об- 49 ладающих положительной плавучестью

3.2.1. Использование различных концентраций альгината на- 52 трия для получения плавающих Са-альгинатных гранул

3.2.2. Применение веществ с малой плотностью для придания 52 Са-альгинатным гранулам положительной плавучести

3.3. Иммобилизация клеток нефтедеструкторов Acinetobacter 54 valentis в гранулы Са-альгинатного геля, обладающих положительной плавучестью

3.3.1. Биодеструкция пленочной нефти иммобилизованными клетками Acinetobacter valentis

3.4. Исследования параметров, влияющих на свойства препарата

3.4.1. Влияние размера Са-альгинатных гранул на скорость био- 63 деструкции нефти

3.4.2. Влияние концентрации иммобилизованных клеток на ско- 63 рость биодеструкции нефти

3.4.3. Влияние биогенных элементов на скорость биодеструкции 68 нефти

3.4.4. Исследования возможности биоразложения Саальгинатных гранул

3.5. Хранение полученного препарата

3.6. Механизм действия препарата

3.6.1. Рост и размножение микроорганизмов-нефтедеструкторов в Са-альгинатпых гранулах

3.6.2. Механизм биодеструкции пленочной нефти препаратом

3.6.3. Распределение клеток по глубине

3.7. Применение препарата

3.7.1. Влияние количества вносимого препарата на процесс биодеструкции

3.7.2. Влияние толщины нефтяной пленки на динамику биодеструкции нефти

3.7.3. Исследование динамики биодеструкции различных нефтей

3.8. Натурные испытания

3.9. Использование препарата для биоремедиации морской воды

3.9.1. Выделение и отбор галотолерантных штаммов микроорга-низмов-нефтедеструкторов

3.9.2. Деструкция нефти в морской воде галотолерантными штаммами

3.9.3. Биодеструкция нефти в морской воде ассоциациями микроорганизмов

3.9.4. Биодеструкция пленочной нефти в морской воде иммобилизованной ассоциациями микроорганизмов

3.9.5. Рост и размножение клеток дрожжей Yarrowia lipolytica в Са-альгинатпых гранулах 106 3. 10. Микроводоросли 109 3.10.1. Культивирование микроводорослей Platymonas viridis и Dunaliella tertiolecta на средах, содержащих нефть

3.10.2. Исследование влияния на жизнедеятельность микроводорослей наличия сплошной нефтяной пленки

3.10.3. Влияние различных фракций нефти на скорость роста микроводорослей Platymonas viridis 123 3.11. Иммобилизация микроводорослей 125 3. 12. Биодеструкция нефтяной пленки препаратом с совместно иммобилизованиыми микроорганизмами и микроводорослям

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка новой формы биопрепарата для очистки водных объектов от тонких нефтяных пленок"

Актуальность работы. Одним из основных и крупномасштабных загрязнителей акваторий является нефть и продукты ее переработки. Применение комплексных методов ремедиации воды подразумевает использование на последнем этапе микробиологических методов очистки, основанных на применении микроорганизмов - пефтедеструкторов, для которых нефтепродукты являются основным источником углерода и энергии. Большинство биопрепаратов, применяемых для биоремедиации водных поверхностей, представляют собой сухие порошки, содержащие высушенные клетки пефтедеструкторов, либо пастообразные формы микроорганизмов. В последние годы для биоремедиации водных поверхностей используются иммобилизованные формы микроорганизмов, обладающие рядом преимуществ по сравнению со свободными клетками, наиболее ценным из которых следует считать положительную плавучесть. В качестве носителей для иммобилизации могут быть использованы как материалы природного происхождения, так и синтетические носители различной природы с плотностью меньшей, чем плотность воды. В основном, во всех методах биоремедиации воды с использованием иммобилизованных микроорганизмов наряду с окислением нефти происходит её сорбция на самих носителях. Это свойство, с одной стороны, позволяет быстрее удалить загрязнения с поверхности воды, делая доступным растворение кислорода в приповерхностном слое. С другой стороны, возрастающая концентрация загрязнителя непосредственно в зоне окисления снижает скорость биодеструкции. Разработка новой формы биопрепарата для ремедиации водных поверхностей является актуальной задачей, при решение которой возможно улучшение многих экологических приемов очистки пресных и морских акваторий.

Цели и задачи исследования Основной целью работы явилась создание новой формы биопрепарата, обладающей положительной плавучестью, предназначенной для очистки водных поверхностей от тонких нефтяных пленок. Для достижения данной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Разработать метод иммобилизации клеток - нефтедеструкторов в Са-альгинатных гранулах, обладающих положительной плавучестью.

2. Адаптировать данный метод к различным группам микроорганизмов: бактерий, дрожжей, а также микроводорослей.

3. Изучить свойства полученной препаративной формы: активность препарата, срок хранения и способность к разложению в естественной экосистеме.

4. Определить дозы вносимого препарата при различных концентрациях нефтяных загрязнений.

5. Провести опытные испытания по ликвидации нефтяных загрязнений в реальных условиях.

Научная новизиа. Впервые применен для создания биопрепарата метод иммобилизации микроорганизмов-нефтедеструкторов в Са-альгинатных гранулах, позволяющий увеличить их деструкционный потенциал.

Показано, что н-алканы, эмульгированные в Са-альгинатные гранулы, позволяют придать гранулам положительную плавучесть.

Показано, что применение новой препаративной формы с эмульгированными н-алканами позволяет увеличить скорость биоремедиации за счет локализации иммобилизованных и свободных клеток в приповерхностном слое воды.

Установлено, что одновременная иммобилизация клеток микроводорослей с клетками нефтедеструкторов способствует интенсификации процесса биоремедиации за счет обогащения биогенным кислородом.

Практическая значимость. Разработан новый метод удаления тонких нефтяных пленок с поверхности акваторий с помощью иммобилизованных клеток микроорганизмов-нефтедеструкторов. Определены параметры получения

Са-альгинатных гранул с иммобилизованными клетками нефтедеструкторов, влияющие на характеристики биопрепарата. Наработана опытная партия новой препарата для удаления тонких нефтяных пленок с поверхности пресных водоемов и испытана в реальных условиях ЗАО «Транснефть». Показано, что применение нового биопрепарата позволяет снизить количество нефтяных углеводородов (НУГВ) за 21 сутки при температуре от 10 до 22°С в экспериментальном варианте до 95%. Получен патент Российской Федерации на способ получения биопрепарата для очистки водной среды от загрязнений нефтепродуктами и способ очистки водной среды от загрязнений нефтепродуктами.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на III Международном конгрессе по управлению отходами «ВэйсТэк-2003» (Москва, 2003), III Международной научно-технической конференции «Экология и научно - технический прогресс» (Пермь, 2005), III Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), IV Международной научно-технической конференции «Экология и научно - технический прогресс» (Пермь, 2005), Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе патент Российской Федерации и две статьи. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 149 страницах текста и включает 34 рисунка и 22 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов, приложений и списка литературы, содержащего 170 ссылок, из которых на иностранных языках 42 .

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Аушева, Хадишат Ахметовна

Выводы

1. Показано, что иммобилизация клеток микроорганизмов-нефтедеструкторов в Са-альгинатном геле позволяет увеличить их потенциал в отношении деструкции НУГВ. Установлено, что включение в Са -альгинатные гранулах н - алканов (до 10%) способствует плавучести препарата и его локализации в приповерхностном слое воды.

2. Показано, что метод получения новой препаративной формы на основе гранул с положительной плавучестью можно использовать для иммобилизации бактерий, дрожжей, микроводорослей и их ассоциаций .

3. Изучена кинетика ассимиляции нефти из поверхностных пленок разной

2 2 толщины (от 2,6 г/м до 10,6 г/м ) иммобилизованными микроорганизмами-нефтедеструкторами и показано преимущество применения данной препаративной формы перед аналогичными, содержащими свободные клетки. Определена доза препарата, необходимая для проведения эффективного процесса биоремедиации, составляющая 50 мл/м .

4. Определены параметры, влияющие на свойства биопрепарата: условия хранения, положительная плавучесть, выход иммобилизованных клеток в свободное состояние, разрушение гранул.

5. Изучена иммобилизация микроводорослей по разработанной методике, а также коиммобилизация микроводорослей, с микроорганизмами-нефтедеструкторами. Показано положительное влияние совместной иммобилизации на процессы биодеструкции водных поверхностей.

6. Проведены испытания новой препаративной формы в реальных условиях с содержанием нефти на водной поверхности до 15 г/м2.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Аушева, Хадишат Ахметовна, Москва

1. Алексеева, Т.П. Перспективы использования торфа для очистки нефтезагрязнённых почв // Биотехнология. 2000, № 1 .-С.58-64.

2. Антипчук А.Ф. О количестве гетеротрофных бактерий на некоторых высших растениях в карповых прудах // Гидробиологический журнал. 1974, № 1. - С. 63 - 64.

3. Аринбасарова А.Ю., Кощеенко К.А. Ковалентное связывание клеток с активированным силикагелем // Прикладная биохимия и микробиология. 1980. - Т. 16, вып. 6. - С. 854-961.

4. Афиногенова А.В., Маркелова П.Ю. очистка загрязненных вод иммобилизованными на волокнистом носителе бделловибрионами // Химия и технология воды. 1997. - Т. 19, №2. - С. 203-206.

5. Бамбалов Г., Цветанов О. // Хранительная промышленность. 1998. -Т. 37, №16.-С. 19-21.

6. Барышникова JI.M., Грищенков В.Г., Аринбасаров М.У. и др. Биодеградация нефтепродуктов штаммами-деструкторами и их ассоциациями в жидкой среде // Прикл. биохимия и микробиология. -2001.-Т. 37, №5.-С. 542-548.

7. Безель B.C., Позолотина В.Н., Вельский Е.А., Жуйкова Т.В. Изменчивость популяционных параметров: адаптация к токсическим факторам среды // Экология. 2001. Т. 36. - С. 447-453.

8. Белойваненко В.И., Миронов О.Г. Влияние нефтяных загрязнений на скорость поступления кислорода в воду // Водные ресурсы. 1979. -№6.-С. 127-131.

9. Белоусова Н.И., Барышникова JT.M., Шкидченко А.Н. // Прикл. биохимия и микробиология. 2002. - Т. 38, №5. - С. 513-517.

10. Бикюлов В.И., Коронелли Т.В., Красильников Н.А. Исследования методом парамагнитного зонда механизма взаимодействия ссубстратом клеток углеводородокисляющих микобактерий // ДАН СССР.- 1972.-Т. 2003, №2.

11. Биологические ресурсы моря и нефтяного загрязнения. М.: Изд-во Пищевая промышленность, 1972.-С. 105.

12. Биохимическое окисление сточных вод производства волокна нитрон / Константинова О.Б. и др. // Тез. докл. III Всесоюз. науч.- техн. конф. поев. 70-летию Моск. текс. ин-та. М., 1989. С. 151.

13. Бобров О.Г. Биоценоз биофильтра при очистке сточных вод производства салициловой кислоты // Гидробиологический журнал. -1974.-Т. X, № 2. С. 42-47.

14. Борзенков И. А., Беляев С. С., Матвеев Ю. И., Поспелов М. Е., Свитнев А. И. // Патент РФ. 1998. № 21042249.

15. Волокна с иммобилизованными бактериями-деструкторами для очистки СВ химических производств / Шамолина И.И. и др. // Хим. волокна и мат-лы на их основе. Тез. докл. науч.-техн. конф. JI. -1990.-С. 129-130.

16. Воропаева О.Г., Рублева И.М., Тюленева С.В.Изучение влияния фенола и метанола па развитие зеленых водорослей // Деп. ВИНИТИ. Ярославль. 1986, № 1009-86. - С. - 3-27.

17. Вослобойников Г.М., Зубова Е.Ю., Тыравская Д., Масликовская Б., Богданова JI. Влияние тяжелых металлов на подвижность спор Laminaria saccharina и клеток Platymonas viridis (Chlamydomanadiaceal) // Ботанический журнал. 1993. - Т. 78, №9. -С. 9-15.

18. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем: сб. науч. трудов / Под ред. М.А. Глазовской. М.: Наука, 1988. - С. 253.

19. Вредные химические вещества. Углеводороды. Галогенпроизводные углеводородов; Справ, изд. / A.JI. Бандман, Т.А. Войтенко, Н.В. Волкова и др.; Под ред. В.А. Филова и др. Л.: Химия, 1990. - С. 732.

20. Гапочка Л.Д. Об адаптации водорослей. М.: Изд-во МГУ, 1981. С.80.

21. Гвоздяк П.И. Перспективы использования электроудерживания для иммобилизации биологически активных частиц // Иммобилизованные клетки микроорганизмов. Пущино. Изд-во: Науч. центр библ. исследований АН СССР, 1978. - С. 80-84.

22. Гвоздяк П.И., Дмитриенко Г.Н., Куликов Н.И. Очистка промышленных сточных вод прикрепленными микроорганизмами // Химия и технология воды, 1985.-Т. 7, №1.-С. 64-68.

23. Гершкович В.Г., Калмыкова Г.Я., Коллерова Е.В. и др. Влияние структуры органических соединений, встречающихся в промстоках, на их биодеструкцию // Водные ресурсы. 1977, №4. - С. 113 - 120.

24. Гетко Н.В. Растения в техногенной среде: Структура и функция ассимиляц. аппарата. Мн.: Наука и техника, 1989. - С. 208.

25. Гмызина Н.Б. Решение проблемы загрязнения стока с территории центральной экипировки станции Свердловск-Сортировочный // Материалы III научно-технической конференции УрГУПС. -Екатеринбург, 2001. С. 75- 76.

26. Гоистонорова Л. Е., Щипанов В. П., Морозова Г. Н., Поденко Л. С. // Патент РФ. 1997, №2081854.

27. Громов Б.В., Павленко Г.В. Экология бактерий. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1989.-С. 160.

28. Девяткин В.Г. Динамика развития альгофлоры обрастаний в Рыбинском водохранилище // Труды ИБВВ АН СССР, 1974. Вып. 42. -С. 78-108.

29. Дехтяр М.Н. К экологии микрофауны обрастаний высших водныхрастений Киевского водохранилища // Гидробиологический журнал. — 1976.-Т. XII-С. 18-22.

30. Догадина Т.В., Чухлебова Н.А. Водоросли биологической пленки биофильтров и их роль в процессах самоочищения // Гидробиологический журнал. 1971. - Вып. 7, №6. - С. 56-60.

31. Дубовик И.Е. Влияние нефтепродуктов на почвенные водоросли // Актуальные проблемы современной альгологии. Тез. докл. I Всесоюзн. конф. Киев, 1997 С. 163.

32. Дудка И.А., Береговая В.И. Пена и пленка пресных водоемов как экологическая ниша водных гифомицетов // Гидробиологический журнал. 1975. - Т. XI, № 5. - С. 80 - 86.

33. Изжеурова В.В., Павленко Н.И., Хенкина JI.M., Карпова Т.Н. Влияние некоторых экологических факторов на биоокислительные процессы в нефтесодержащих водах // Химия и технология воды. -1993.-Т. 15,№5.- С. 393-397.

34. Израэль Ю.А., Цыбань А.В. // Антропогенная экология океана. JL: Гидрометеоиздат, 1989. С. 528.

35. Изъюкова А.И. Скорость распада нефтепродуктов в воде и в почве // Гигиена и санитария. -№1. 1980.

36. Иммобилизация деструктора алкилбензолсульфанатов Pseudomonas alcaligenes TR на синтетических волокнах / Никовская Р.Н. и др. // Биотехнология. 1990. - №2. - С. 53-56.

37. Иммобилизация дрожжей Saccharomyces cerevisiae на алюмоборосиликатных стекловолокнах / А.П. Синицин, Е.И.Райнина, А.Б. Ефремов и др.//Биотехнология. 1986. - Т.9, № 3. - С.66-69.

38. Инкина Г.А. Микрофлора в обрастаниях высших водных растений //Гидробиологический журнал. 1989. - Т. 25, № 4. - С. 54 - 57.

39. Интенсификация биотехнологии очистки высококонцентрированных сточных вод / Горбань Н.С. и др. // Экролог. и технол. аспектыобезвреживания пром. отходов. Тез. докл. семин., Черкассы. -1988. С.-89.

40. Исмаилов Н.М. Биодеградация нефтяных углеводородов в почве, инокулированными дрожжами // Микробиология. 1985. - Т. 54, №5. -С. 835-841.

41. Использование микроорганизмов при ликвидации нефтяных загрязнений почв/И.А. Борзенков, P.P. Ибатулин, Е.И. Милехина и др.//Интродукция микроорганизмов в окружающую среду: Тез. Докл., Москва, 17-19 мая1994. С.14-15.

42. Капотина Л. Н. Разработка технологии получения бактериального биопрепарата экологического назначения // Диссерт. на соиск. уч. степ, к.т.н. Москва. - 1998.

43. Квасников, Е.И. Влияние факторов внешней среды на деструкцию нефтепродуктов ассоциативными культурами / Е.И. Квасников // Микробиологический журнал. 1987. - №3. - С.33-38.

44. Кирстен М.П.Дж., Кафлен М.П. // Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. М.: Мир, 1998. С. 53-64.

45. Ковалева Н.Г., Ковалев В.Г. Биохимическая очистка сточных вод предприятий химической промышленности. М.: Химия, 1987. С. 160.

46. Кожанова Г.А.//Патент РФ. 1995. № 2031860.

47. Комиссаров СВ., Шапошникова В.А. Очистка шахтных вод с помощью высших водных растений // Водные ресурсы. — 1976, № 5. -С. 204.

48. Коронели Т.В., Дермичева С.Г., Семененко М.Н. Родококки как природный сорбент углеводородов // Микробиология. 1986. - Т. 55, №4. - С. 683-686.

49. Коронели Т.В., Комарова Т.И., Поршнева О.В., Ткебучева Л.Ф. Внеклеточные метаболиты углеводородокисляющих бактерий каксубстрат для развития сульфатредукции // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. - Т. 37, № 5. - С. 549-553.

50. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Игнатченко А.В. Роль эмульгирования в процессе поглощения углеводородов клетками Pseudomonas аепщепозаУ/Микробиология. 1983. - Т.52, № 1. - С.94-97.

51. Косолапов Д.Б., Намсараев Б.Б. Микробный метаболизм органического углерода в донных отложениях Рыбинского водохранилища // Гидробиологический журнал. 2000. - Т.36, №3. -С.44- 50.

52. Кощеенко К.А. // Прикл. биохимия и микробиология. 1981. Т. 17, № 4. - С. 477-482.

53. Кравченко М.Е., Гапочко Л.Д. Влияние нефти и нефтепродуктов на некоторые сине-зеленые водоросли // Изв. АН ТССР. Сер. Биол. Наук. 1977.-№2-С. 52-56.

54. Кудрявцев В.М. Численность бактерий в зарослях и обрастаниях высших водных растений // Гидробиологический журнал. 1977. - № 10.-С. 14-20.

55. Кузьменко М.И. Окисление экзогенных низкомолекулярных органических соединений фито- и бактериопланктоном // Гидробиологический журнал 1978. - С. 73-78.

56. Курсанов A.JI. Транспорт ассимилятов в растениях//М., 1976.

57. Ландау Н.С., Горнова И.Б., Егоров Н.С. Особенности биосинтеза протеиназ клетками Bacillis firmus, включенными с Са-альгинатный гель // Прикл. биохимия и микробиология. 1997. - Т.ЗЗ, №6. - С. 611-615.

58. Линевиц СЛ., Бахчевникова И.А., Стрелец Н.И. Современное состояние и перспективы развития биологических методов очистки промышленных сточных вод // Изв. вузов Сев.- Кав. регион, техн. п. 1998.-№3,-С. 61-64.

59. Магмедов В.Г., Стольберг Ф.В., Беличенко Ю.П. Биоинженерныесистемы для охраны водных объектов от загрязнения // Гидротехника и мелиорация. 1984. - № 1. - С. 68 - 69.

60. Манихин В.И., Овсянникова Т.В., Васильева О.Ю., Коновалов Г.С. Оценка содержания подвижных форм летучих фенолов и СПАВ в донных наносах Рыбинского водохранилища // Гидрохимические материалы. 1982. - Т. 80. - С. 43 - 46.

61. Матвеева Н.П., Клименко О.А., Пятницына Р.С. Лабораторное моделирование процессов самоочищения природных вод, загрязненных органическими веществами // Гидрохимические материалы. — 1989. Т. CVI. - С. 114-124.

62. Методы общей бактериологии / под ред. Ф. Герхарда и др., в 3-х томах. Т. 1.- 1998.-С. 535.

63. Миляхина Е.И., Сидоров Д.Г., Борзенков И.А. и др. Микробиологическая деструкция мазута в почве при использовании препарата «Деворойл» // Прикладная биотехнология и микробиология.- 1998. Т. 34, № 3. - С. 281-286.

64. Михайлова Л.В., Шорохова О.В. Особенности состава и трансформация водорастворимой фракции Тюменской нефти // Водные ресурсы. 1992, №2. - С. 130 - 139.

65. Михайлова В.Н. «Нефть на завтрак «Эконадину» // журн. «порты Украины». 1998,- №4.

66. Михайлова Л.В. Особенности поведения водорастворимой фракции нефти в модельных опытах // Водные ресурсы. 1986. - №2 - С. 125 -134.

67. Могилевич Н.Ф. // Микробиол. журн. 1995. Т. 57, №5. - С. 90105.

68. Могилевич Н.Ф., Гвоздяк И.П., Романова Е.А., Цинберг М.Б. // Микробиология. 1992. - Т. 61, № 3. - С. 431-437.

69. Морозов Н.В., Телитченко М.М. Ускорение очищения поверхностных вод от нефти и нефтепродуктов вселением в них макрофитов// Водные ресурсы. 1977. - №6. - С. 120 - 131.

70. Морозов Н.В., Петрова Р.Б., Петров Г.Н. Роль высшей водной растительности в самоочищении рек от нефтяного загрязнения // Гидробиологический журнал. 1969. - №4. - Т. 5. - С. 73-78.

71. Мочалова О.С., Антонова Н.М., Гурвич JT.M. Роль диспергирующих средств в процессах трансформации и окисления нефти в водной среде // Водные ресурсы. 2002. Т. - 29, №2. - С. 221-225.

72. Мухутдинов В.Ф., Павлюк Т.Е., Попов A.M. Экологическая роль перифитона и перспективы его использования для интенсификации процессов самоочищения рек // Водное хозяйство России. —2001.-Т. 3,№4. С. 364-383.

73. Никовская Г.Н. Адгезионная иммобилизация микроорганизмов в очистке воды // Химия и технология воды. 1989. - Т.П. №2. - С. 158-169.

74. Никовская Г.Н., Гвоздяк П.И., Шамолина И.И. и др. Иммобилизация деструктора алкилбензолсульфонов Pseudomonas alcaligenes NR на синтетических волокнах. 1990. - № 2. - С.53-56.

75. Об очистке сточных вод макрофитами и альгофлорой // Водные ресурсы. 1976.- №5. -С. 185-190.

76. Оборин Н.А. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем / А.А. Оборин и др. М.: Наука, 1988. - С.284.

77. Оптимальная среда для углеводородокисляющих бактерий Acinetobacter/Г.Н. Морщакова, М.Б. Биттеева, Л.И. Капотина, Б.Г. Мурзаков// Биотехнология. -1991. № 6. - С.67-69.

78. Остеров В.И. О применении цитохимических методов при изучении жизненной активности сине-зеленых водорослей // «Цветение» воды / Под ред. Топачевского А.В. Киев: Наукова думка, 1968.-С. 335-342.

79. Пальгунов П.П., Сумароков М.В. Утилизация промышленных отходов. -М: Стройиздат, 1990.-С. 352.

80. Панов Г.Е. Охрана окружающей среды на предприятиях нефтяной и газовой промышленности / Г.Е. Панов М.: Мир, 1986. - С. 244.

81. Первушин Ю.В., Куликов Н.И. // Биотехнология. 1990. № 4. С. 6468.

82. Петрикевич С.Б., Кобзев Е.Н., Шкидченко А.Н. Оценка углеводородокисляющей активности микроорганизмов // Прикл. биохимия и микробиология. -2003. Т. 39, №1. - С. 25-30.

83. ПНДФ 14.1:2:4.168-2000. « Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в пробах питьевых, природных и очищенных сточных вод методом ИК-спектрофотометрии с использованием концентраметра КН-2».

84. Погожев П.И. От стабильности модельных экосистем // Использование и охрана ресурсов флоры и фауны СССР. Докл. МОИП, 1985, Зоология и ботаника. М. - 1987. - С. 64-67.

85. Пожаров А.В., Шелемотов С.А. Использование экснресс-биотестирования для оценки антропологической ситуации // Дефектоскопия. 1992. - №4. - С. 88-90.

86. Половинко Г.П. Микробиологическое обследование воды и слизистых биообрастаний истока реки Оби в зоне загрязнения промышленными сточными водами //Гидробиологический журнал. —2000.-Т. 36, №3. С. 36-43.

87. Пономарев В.Г., Иоанилис Э.Р., Монгайт И.Л. Очистка сточных вод нефтеперерабатывающих заводов. М.: Химия, 1985. - С. 256.

88. Попов А.Н., Львов А.П., Сапугольцев К вопросу определенияконстант неконсервативности некоторых органических веществ // Водные ресурсы. 1974. - №4. - С. 175-178.

89. Протасов А.А. Перифитон: терминология и основные определения // Гидробиологический журнал, 1982. Т. XVIII, № 1. - С. 9-13.

90. Райнина Е.И., Бачурина Г.П., Махлис Т.А. и др. // Биотехнология -1986.- №4.-С. 65-70.

91. Ратушняк А.А., Андреева М.Г. Механизмы симбиотической связи высших водных растений с сопутствующей углеводородокисляющей микрофлорой // Гидробиологический журнал. 1998. - Т. 34, №5. -С.49-56.

92. Ратушняк А.А., Андреева М.Г., Латыпова В.З., Гарикова Л.Г. Токсическое действие нефти и продуктов ее переработки на Daphnia magna Straus // Гидробиологический журнал. 2000. - Т. 30, №6. - С. 92-100.

93. Ретко Н.В. Растения в техногенной среде: Структура и функция ассимиляции аппарата Мн.: Наука и техника, 1989. - С. 208.

94. Решение проблем промышленной экологии с помощью биотехнологически активных полимеров / Рязанцев Э.Г. и др. // Экология человека и природы. Сб. мат. 1 Межд. науч.-техн. конф. -Иваново, 1997. С. 212.

95. Рыбаков Ю.С., Бондаренко В.В., Гмызина Н.Б., Харисова К.Р. Предупреждение загрязнения вод при чрезвычайных ситуациях на железнодорожном транспорте // Материалы V Международного конгресса «Вода: экология и технология» М.: МПР, 2002.-С. 660-661.

96. Рыбаков Ю.С., Минухин JT.A., Савин С.В., Гмызина Н.Б. Разработка методов защиты водных объектов от дифференциального загрязнения // Мат-ы VI Межд. конф. Санкт-Петербург, 2001. - С. 160-161.

97. Сайка П. Механизмы реакций органической химии // Пер. с англ. / Под ред. В.Ф. Травеня. М.: Химия, 1991.

98. Ю1.Саришвили Н.Г., Панасюк A.JL, Столярова A.JI. // Хранение и переработка сельхозсырья. 1996. - № 3. - С. 40-44.

99. Ю2.Саришвили Н.Г., Рейблант Б.Б. Микробиологические основы технологии шампанизации вина. М.: Пищевая пром-ть, 2000. С. 364.

100. Семенов И.В., Тарасов М.Н. О кинетике биохимического окисления загрязняющих веществ // Гидрохимические материалы. 1974. - Т. LX. -С. 103-108.

101. Синельников В.Е. Механизм самоочищения водоемов. М.: Стройиздат, 1980.-С. 111.

102. Синельников В.Е., Ягодка H.JI. Об особенностях распада органических веществ в «концентрированных средах» // Водные ресурсы. 1977. - №4. - С. 129-139.

103. Ю7.Синицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М.: Изд-во МГУ, 1994. -С. 288.

104. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas Киев. Наукова думка, 1990. - С. 246.

105. Ю9.Спекторва Л. В. Морская флагеллата Platymonas viridis как объект длямассового культивирования. Доклады АН СССР, 1970. Т. 192, № 3. - С. 662-664.

106. Способ биохимической очистки воды от анион, поверх-но активных веществ / Лобова А.Б., Шамолина И.И., Ставская С.С. // А.с. 1623982 СССР, Л. Инст. текст, и легкой пром-ти.

107. Способ получения полимерных сорбентов. Патент РФ № 2184608 от 10.07.2002 / Мелнозеров В.М., Чупрова Н.А., Мелнозеров М.Г.

108. Справочник по очистке природных и сточных вод / Л.Л. Паль, Я.Я. Кару, X. А. Мельдер, Б.Н. Репин М.: Высшая шк., 1994. - С. 336.

109. Ставская С.С., Шамолина И.И., Никовская Г.Н., Севрук А.Г., Тугуши Л.А. // Химия и технол. воды. 1991. - Т. 13, № 6. - С. 548-554.

110. Стом Д.И., Тимофеева С.С., Белых Л.И., Буторов В.В. Роль харовых водорослей и других водных растений в процессах деструкции фенольных соединений//Водные ресурсы.— 1978.—№4. — С. 105 —111.

111. Стриж И.Г., Попова Л.Г., Балнокин Ю.В. Физиологические аспекты адаптации морской микроводоросли Tetraselmis (Platymonas) viridis к различной солености среды // Физиология растений. 2004. - Т. 51, №2. - С. 197-204.

112. Тархова Э.П., Ковальчук Ю.Л., Полтаруха О.П. Изучение биодеградации нефти в воде черного моря // Водные ресурсы. 2003. Т. - 30, №1. - С. 100-105.

113. Тимофеева С.С., Бейм A.M. Роль макрофитов в обезвреживании хлорированных фенолов // Водные ресурсы. 1992. - № 1. - С. 89 -94.

114. Ткаченко Н.В., Айвазова Л.Е. Влияние растворенных нефтепродуктов на морские и пресноводные одноклеточные водоросли // Труды ВНИИ морского рыбного хоз-ва и океанографии. 1974. Вып. 100. - С. 6873.

115. Угрехелидзе Д.Ш., Цевелидзе Д.Ш. // Сообщ. АН ГССР. 1967. №1. С. 91-95.

116. Урехилидзе Д.Ш., Цевелидзе Д.Ш. // Сообщ. АНГСССР, 1967. -№1.- С. 91-95.

117. Утилизация нефти в почве и воде микробными клетками/JI .Ф. Суржко, З.И.Финкельштейн, Б.П.Баскунов, М.И.Янкевич, и др.// Микробиология. 1995. - Т.64, №3. - С.393-398.

118. Федоров А.С., Галипова И.В. Использование иммобилизованных пурпурных бактерий для очистки сточных вод и получения водорода // 2 Откр. гор-науч. конф. мол. ученых г. Пущино, 1997. Сб. тез.-Пущино, 1997.-С. 145-152.

119. Цыбань А.В., Теплинская Н.Г. О методе изучения морских липолитических бактерий // Гидробиологический журнал. 1974. - № 2. - С. 116-121.

120. Чекалов В.П. Способ определения численности углеводородокисляющих бактерий. А. с. СССР № 1629318. 1991. -№7.-С. 63.

121. Шкидченко, А. Н. Оценка углеводородокисляющей активности микроорганизмов / А. Н. Шкидченко, И. А. Кошелева, С. Б. Петрикевич // Экология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды. Пущино: Изд - во НЦБИ РАН. - 2001. - № 3. -С. 31-33.

122. Шлыгин И. А. Нефтяные углеводороды в морских донных отложениях: химические и биологические процессы // Гидрометереология. 1986. - Вып. 4. - С. 1-45.

123. Экологическая биотехнология: Пер. с англ. / Под ред. К.Ф. Форстера, Д.А. Дж. Вейза. Л.: Химия, 1990. - Пер. с изд.: Великобритания, 1987.-С. 384.

124. Ягафарова Г. Г., Сухаревич М. Э., Барахнина В. Б., Ильиа Е. Г., Ягафаров И. Р., Яковлев В. И. // Патент РФ. 2001. № 2160718.

125. Aelion СМ., Widdowson M.A. Numerical modeling and lild application to the in situ bioremediation of subsurface contamination at a JP-4 jet fuel spiliy/Abstr.Gen.Meet. Am. Soc. Microbiol.-1991.-91 Meet- P. J12.

126. Ahn: Yong-Ho Physiochemical and microbial aspect of anaerobic granular biopellets //1. Envison. Sci. and Health. A. 2000. - V.35, № 9. - P. 16171635.

127. Aliakrinskaya I.O., Oceanology. 1966. V. - 6. - P. 71.

128. Anderson J. C. // Process Engineering Aspects of Immobilized Cells / Eds Webb C., Black G.M., Atkinson B. Rugby: Inst. Chem. Engineers, 1986. -P. 153-176.

129. Anselmo A.M., Mateus M., Cabral J.M.S., Novais L.M. // Biotechnol. Lett. 1985. V. 7.№12.-P. 889-894.

130. Bakterien reinigen Abluft von Formaldehyde / Galvanotechnik. 2000. -V. 91, №12.-P. 3462.135 .Barbotin J. -N. // Biofutur. 1994. № 3. - P. 22-27.

131. Bergey's manual of systematic bacteriology / Ed. T. James, I. Staley. -Baltimore and London: Willams and Wilkins, 1989. Vol. 3. - P. 2298.

132. Bont J. A. M. Phisiology of Immobilized Cells. Amsterdam: Elsevier. 1990. -P. 716.

133. Brodelius P., Mosbach K. Adv. Appl. Microbiol. 1982. -№1. - P. 29.

134. Dean R.A. In: The Biological Effect of oil Pollution on Littotal Communities (J. D. Carty and D.R. Arthur, Eds.) Field Studies Council London, 1968.

135. Degradation of pentachlorophenol in immobilized bacteria bioreactor / O'Reilly K., Steiert J., Kadakia R. // Abtr. Pap., 194 ACS Nat. Meet. (Amer. Chem. Sos), New Orleans, LA, Aug. 30 - Sept. 4, 1987. -Washington D.C. - 1987. - P. 442.

136. Divies Ch. //Bulletin de O.I. V. 1981. V. 54. - № 608. - P. 843-857.

137. Faissner W. // Biol. Unserer Zeit. 1991. - Bd. 21, № 6. - P. 326-328.

138. Falkentoft СМ., Harremoes P., Mosbak H. The significance of zonation in a denitrifying, phosphorus removing biofilm // Water Res. 1999. - V.3, № 15.-P. 3303-3310.

139. Fiestas J.A., Martin A., Borja R. Influence of immobilization supports on the kinetic constants of anaerobic purification of olive mill waste water // Biol. Wastes. 1990.-V. 33,No. 2.-P. 131-142.

140. Frank C.E. "Chem. Rev.", 1950.-46.-P. 155.

141. Gude H. // Curr. Microbiol. 1982. - V. 7, № 6. - P. 347-350.

142. Gunkrl W. In: The Biological Effects of oil Pollution on Littotal Communities (J. D. Carty and D.R. Arthur, Eds.) Field Studies Council London, 1968.

143. SO.Hilge В., Rehm H. J. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. - V. 33, № 1. - P. 54-58.

144. Keweloh H., Ileipieper H.-J., Rehm II.-J. // Appl. Microbiol. Biotechnol. -1985.-V. 31.-P. 383-390.

145. Keweloh H., Weyrauch G., Rehm H.-J. // Appl. Microbiol. Biotechnol. -1990.-V. 33.-P. 66-71.

146. Kluss W.M. "Tanker and Bulk Carrier". 1968. - V. 15. - P. 236.

147. Klut M.E., Bisalputra Т., Antia N.J. The Use of Fluorochromes in the Cytochemical Characterision of Some Phytoflagellates // Histochem. J. 1988.-V. 20.-P. 35-40.

148. Laszlo J.A. Regeneration of azo-dye-saturated cellulosic and anion anaerobic dye reduction // J. Environ. Sci. and Technol. 2000. — V. 34, No. l.-P. 167-172.

149. Ling L., Lo K.V. Brewery wastewater treatment using suspended and attached grouth sequencing batch reactors // J. Environ. Sci. and Health. Л. -1999. -V. 34, No. 2. P. 341-355.

150. Martin-Cereceda M., Serrano S., Guinea A. Biofilm communities and operational monitoring of a rotating biological contactor system // Water, Air and Soil. Pollut. 2001. - V . 126, No. 3-4. - P. 193-201.

151. Nixon A.C. In: Autaxidation and Antiaxidants, Vol.2, (W.O. Lundberg, Eg.), Wiley, N.Y., 1962.

152. Nyn E.J. "Rev. Questions Sci.". 1967. V. - 6. - P. 71.

153. Potapova M.C., Kvitko K.V. Algal components of the oil-polluted water ecosystems // "Proceedings of the Work-shop Microbiology of Polluted Aquatic Ecosystems" P.M.Beker (ed.) Leipzig. 1998. - P. 182-187.

154. Rosenberg M. Bacterial adhesion to hydrocarbons: a useful technique for studing cell surface hydrophobicity // Ibid. 1984. - V. 22, № 3. - P. 289295.

155. Rosenberg M., Gutnick D., Rosenberg E. Adherence bacteria to hydrocarbons; a simple method for measuring cell hydrophobicity // FEMS Microbiol. Lett. 1984. - V. 9, № 1. - P. 29-33.

156. Scott C.D. // Enzyme Microb. Technol. 1987. - V. 9, № 2. - P. 66-73.

157. Shapiro J.A.//J. Bacteriol. 1985. - V. 164, № 10. - P. 1171-1181.

158. Shapiro J. A. //J. Bacteriol. 1987. - V. 169, № l.-P. 142-156.

159. Terashima Y., Ozaki H. Utilization of microorganisms immobilized with magnetie particles for wasterwater treatment // Res. Activ., Civ., Eng. and Relat. Fields Koito Univ. 1993. - P. 117.

160. The Prokaryotes / Ed. A. Balows. N.Y.: Springer-Verlag, 1992. V. 4 - P. 3632-3675.

161. Trecanni V. "Prog. Ind. Microbiol". 1962. - V. - 4, №. 3.

162. Westmeier F., Rehm H.-J. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1985. - V. 22. -P. 301-305.

163. Zache G., Rehm H.-J. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. - V. 30. -P. 426-432.1. ПАСПОРТ штамм бактерийfakf*. ^ма^меим- H-I

164. Мурззков Б.Г.,Капсшша Л.Н.,11орщакоьа Г.Н.

165. Штамм бактерий 0Увыделен из почв Иркутской обл. и селекционирован в условиях длительного •.; непрерывного культивирования на карбамидных парафинах.

166. Штамм производственный (производство палрина). ': ! 4. Морфологические признаки.

167. В односуточной культуре клетки на МПА в виде кокков, диплококков, диплопалочек, в парах. Размер клеток 0,7x0,7; 0,7x1,4; 0,7x2,8; 0,8x1,4;®,7x2,1 оА'. Неподвижные.Спор не образуют. Окраска по Грану. Грамотрицательные. '{„ Нультуральные признаки.

168. На МПА образуют округлые, гладкие, кремоватые колонии сх блестящей поверхностью, с гладким краем # 2-4 ш. колонии.

169. При росте в МПБ пленки нет. Муть умеренная, однородная.t

170. Помутнение постоянное.' Осадок тягучий при встряхивании.1 б. Физиологические признаки.

171. Ассимилирует'глюкозу, лактозу, рамнозу, мальтозу, маннозу, маннит, арабинозу,.Не ассимилирует сахарозу, салицин, адонит,дульцит.62. Глюкозу не ферментирует.63. ф -галактоэидаза отрицательная.. 6.4. Лизин, орштин, аргинин отрицательный.

172. Не нуждается в ростовых факторах при росте на минеральной : среде с углеводородами нефти. '

173. Оксидазоотрицательные и каталазоположительные. Сероводород, индол не образуют,67. Желатина разжижается.68. Аэроб.

174. Не растет на- среде с 5% /|/аС1.

175. Технологические характеристики. * >71. «шда бактерий оШ^&хЫразвивается в широком диапазоне температур 20-44°С на средах с углеводородами, нефти.

176. Шгаш Ф^УфШ^ЛлМ' VcUWwJb способен развиваться при рН 5,0-9,0.

177. Штамм морфологически устойчив в длительном непрерывном процессе выращивания.

178. Идентификация штаммов осуществлялась в лаборатории промышленных микроорганизмов под руководством докт.биол.наук Б.Г.Мурзакова.8. ШХранение штамма.

179. Штамм сохраняется в-лиофияизированном состоянии, а также путем периодических пересевов (3-4 раза в год) на МП&. После пересева рост штамма осуществляют при = 37°С в течение 1-2 дней, а затем хранят при комнатной температуре.

180. S. Юташ депонирован в В1ШМ под номером щс-fidi б-бш

181. Зам.директора по научной работе ■ ГосНИИсинтезбелок1. В.Луканин1. УТВЕРЖДАЮ1. Директо1. М.Смирн ОБ199^ г.1. ПРОТОКОЛрезультатов исследований по поред^ё^ю^р--' патогенности штамма бактерий f/-/ Ш&сНъ YCL&htH Juflp'pMAftjHJtaM.

182. Организация-исполнитель:ВНИИ ветеринарной санитарии,гигиены, и экологии. , . / /. /

183. Бид животных:белые мыши-с массой тела 16-20 г (10 мышей).

184. Методика проведения исследований'.определение патогенности проведено в соответствии с методическими указаниями,утвержденными Минздравом СССР (Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней.М.1973 г.с.595).

185. Результаты исследований.За время наблюдение отклонений от нормального физиологического состояния у мышей не наблюдали,изменений в паренхиматозных органах не выявлено,гибели ынией не было,из органов ретрокулыура не выделена.

186. Заключение.На основании проведенных исследований установлено, что штамм H'l Vfa'nch fatrht Yb&ttril не патогенен.

187. Зав.лабораторией д.в.н. 'i,'.-^f Е.Г.Иванов Ст.н.сотрудник к.б.н. D.К.Костин1. Справка

188. Всесоюзная коллекция промышленных микроорганизмов инсти-'тута „ВНИИгенетика* приняла на депонирование ,22. Декабря19§3 г.

189. Acinetobacter valentis subsp. paraffinicum культуру--------предложенную коллективом авторов 'ДУРЗЗКОВ Ь.j-

190. Кяттпнчгая JT-Н.д Уорптяурвя Г.Н.

191. Организация: ГОСНИИСИНТЕЗБЕЛЭК, лаб.№2011. Штамм-продуцент белка.уиименованке организации и фамшша авторов)

192. Принятая культура получила во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов коллекционный номер: -ЁКПМ В-672722. «декабря••. -■ v----'X/

193. М-Яроси.' тесограф^ .-'0325-30001. ВИТАХИМ"

194. Москва, Миусская пл. д.9. Телефон: 978-57-60,978-78-94 Лицензия Москомприроды N° 000607 Аттестат аккредитации RU.0001.5117091. Протокол анализа №

195. Наименование предприятия: "ЭКОСЕРВИСНЕФТЕГАЗ" Место отбора проб: промышленная площадка гЖуктсшй1. Результаты анализа

196. Москва, Миусская плд.9. Телефон: 978-57-60,978-78-94 Лицензия Москомприроды N° 000607 Аттестат аккредитации RU.0001.5117091. Протокол анализа №

197. Наименование предприятия.■ "ЭКОСЕРБИСНЕФТЕГАЗ" Место отбор! проб: промышленная площадка гЛСшовсют1. Результаты анализа

198. Количественный химический анализ выполнен согласно ПНД Ф14.1:2.168-2000. Руководитель лаборатории1. МЛ.1. В И Т А X И М «

199. Москва, Миусская пл д.9. Телефон.• 978-57-60, 978-78-94 Лицензия Москомприроды N° 000607

200. Аттестат аккредитации RU.0001.511709

201. АКТ № Т0б-о&с£ ОТБОРА ПРОБ от " ** " aJ-bf^ 2002 года

202. Место отбора пробы Ьм^^^^ис^

203. У (наамеяовамаеа расяаложеяяе) ^

204. Тип отбираемой пробы пй^М Хноб"*-* A^fa/^W

205. Метод отбора-по ГОСТ 17.1.4.01-80И4. Время отбора±z

206. Климатические условия окружающей среды при отборе пробы

207. Температура воды в испытательной емкостиi € С>

208. Площадь пробоотборника, см1 7Г| ^

209. Склянки, в которые отобрана проба:

210. N° на склянке Объем склянки, Емкость и материал Консервациясм3 склянки пробы1.csef iPp &асло. —id PS of 1 oo /СО См 3 ■lK Cfor ioo /COC^3 —

211. Л 08 cS loo c;tiCA.o -- joo cs«3 —

212. Отбор пробы произведен представителем ООО НИФ "ВИТАХИМ":йаяжматл, фамапя I eodnee» векимшпеля)в присутствии представителя Заказчика:должность, фаз/вы « юАмс*)1. В И Т А X И М «

213. Москва, Миусская пл д. 9. Телефон: 978-57-60,978-78-94 Лицензия Москомприроды № 000607 Аттестат аккредитации RU.ООО 1.511709

214. АКТ № W- /з*г ОТБОРА ПРОБ от "J32002 года1. Место отбора пробы "у— J-—.« " (наименование в раслаложтге) ^

215. Тип отбираемой пробы /yg/^j^fj/gW'

216. Метод отбора по ГОСТ 17.1.4.01-804. Время отбора££

217. Климатические условия окружающей среды при отборе пробы

218. Температура воды в испытательной емкости J 9 С

219. Площадь пробоотборника, см2

220. Склянки, в которые отобрана проба:на склянке Объем склянки, Емкость и материал Консервациясм* склянки пробы JK/3Pf Joti9i2'oS dec CSsiAO , J-PPC^t3 .—1. Joo /PO CA-*iZ OS lev /PO^lA —

221. Отбор пробы произведен представителем ООО НИФ "ВИТАХИМ": С. A. t jvyyUjJu.-eM, ^o/^e/uet" ^Ласмиет, финалом, .Uac илттлш)в присутствии представителя Заказчика:йпяжяостл, фамилия ш вадпась)1. В И Т А X И М «

222. Москва, Миусская пл. д.9. Телефон.■ 978-57-60, 978-78-94 Лицензия МоскомприроЬы № 000607 Аттестат аккредитации RU.0001.511709

223. АКТ N9 и* ОТБОРА ПРОБ от " ^ " 2002 года1. Место отбора пробы и-*. —fл О " (наименование я рююдожеяие) ^1. НсФ\сГАЬ g^afltf^, ■г-.

224. Тип отбираемой пробы trtCefauocT»*-*

225. Метод отбора-по ГОСТ 17.1.4.01-801. У/ ^4. Время отбора

226. Климатические условия окружающей среды при отборе пробы;- W:

227. Температура воды в испытательной емкости i£> С

228. Площадь пробоотборника, см1 1

229. Склянки, в которые отобрана проба:на склянке Объем склянки, Емкость и материал Консервациясм3 склянки пробы

230. JK/6Q? jpo С7Ьс+о , /сеслА —l&og Jo? cru*-o /ee>c**z 1./6 of ioo CTbt+C ipocaP —22 /6 ci fPt> cfte-M , /со см* —

231. Отбор пробы произведен представителем ООО НИФ "ВИТАХИМ": H/cfA С А(Аимгисдц, фышял а яобява вошяяяшяя)в присутствии представителя Заказчика:дажжя»со», faunae в моДаось)1. В И Т А X И М «

232. Тип отбираемой пробы WVW^^

233. Метод отбора-по ГОСТ 17.1.4.01-804. Бремя отбора//»-;

234. Климатические условия окружающей среды при отборе пробы^ = /Гс;оьеес

235. Температура воды в испытательной емкости

236. Площадь пробоотборника, см1 ^

237. Склянт, в которые отобрана проба:

238. Кг на склянке Объем склянки, Емкость и материал Консервация см3 склянки пробы1. SO CJUax, SPC*3ш/м So С?С4С-А.Ъ , g-O С-»1 —1. SO CfCtc-A-e , S~c> см2 —1. C/etcs.o, sro

239. Отбор пробы произведен представителем ООО НИФ "ВИТАХИМ":м• (Лажжяесяп, фамышл а ле&шп ваюлявтам) ""Ге присутствии представителя Заказчика:дпгжжеул, фамяяим в подпись)1. В И Т А X И М «

240. Москва, Миусская пл. д.9. Телефон: 978-57-60,978-78-94 Лицензия Москомприроды N2 000607 Аттестат аккредитации RU.0001.5117091. АКТ № ОТБОРА ПРОБот " я " cwsiU 2002 года

241. Место отбора пробы Р^^ "Р^О —.f г—г- п " (наямтманвеяраиавожаии) ^

242. НЬФ/t/Ai . ^CW'^'^^iC е-^АС^^ ^

243. Тип отбираемой пробы л^е^жг. А>е,/7

244. Метод отбора- по ГОСТ 17.1.4.01-804. Бремя отбора1.

245. Климатические^услоеия окружающей среды при отборе пробы5.

246. Температура воды в испытательной емкости

247. Площадь пробоотборника, см7

248. Склянки, в которые ото.брана проба:

249. Кг на склянке Объем склянки, Емкость и материал Консервациясм3 склянки пробыikC2t>3 So CfCtcj-ь егос^Ъ —iPo3Pf лК PI 03 Го С? ; SO —л? еЗРЗ S" (О СГ^е-лс —

250. Отбор пробы произведен представителем ООО НИФ "ВИТАХИМ": Ij/ifA^H J' -д-^А^А"*

251. Janutfm (Аллам а ялАш wi wuuowm I ^дсхжлвстъ, флмавя в ло4шхь аеяшвтш)в присутствии представителя Заказчика:д&жжжосдл, фамаяая в »iatci)-ОБЩЕСТВОХГОГРАтЧЕННОИ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ <гЭКОсервис-НЕФТЕГАЗ»окп &6590

252. СОВАНО е-президент 'рауснефты 1 Калинин В.В. 2002 г.группа1. УТВЕРЖДАЮ1. Директорвис-НЕФТЕГАЗ» КраюхинА.В. 2002 г.мч

253. БИОПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В БИОРАЗЛАГАЕМОМ ПОЛИМЕРЕ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЕСТРУКТОРОВ НЕФТИ

254. НЕПАТОГЕННЫХШТАММОВ РОДА ACINETOBACTER).

255. ТЕХНИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ ТУ 2. /6$012-40443658-20021. Срок действия2002 г.ъникотдела ИГР -ООО «Щ&ервиъНЕФТЕГАЗ»1. Иехаев С.А.2002 г.1. Москва 2002 г.1. ГОССТАНДАРТ РОССИИ

256. ВНИИ стандарт зЛреп стрнрсвлн каталожный лист6Д1СЕН 1 ■ ""•т. .ал» О / f\///f QCU

257. Изм. Лист № докуй. Подпись Дата

258. О Разраб. Нехаев СЛ. БИОПРЕПАРАТЫ ОСНОВЕ Лит. Лист Листов

259. Провер. Марквичее Н.С. ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В БИОРАЗЛАГАЕМОМ ПОЛИМЕРЕ МИКРООРГАНИЗМОВ I I 1 81. Реценз. Ф.И.О. ооо*:

260. По органолептическим, физико-химическим и микробиологическим показателям продукт должен соответствовать требованиям и нормам, указанным в таблице 1.